CN1168977A - 用于测定生物体液中镁的测试片 - Google Patents
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Abstract
一种用于测定生物体液中镁浓度的干测试片,它包括下列[i]至[iii]的试剂组分:邻甲酚酞配位酮;[ii]O,O’-双[2-氨基苯基]乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸;和[iii]一种pH为8.5至11.0的pH缓冲剂。
Description
本发明涉及一种用于简易测定生物体液,特别是如血清和血浆这样的体液中镁浓度的干测试片。
镁是一种在生物体内仅次于钙的最大含量的二价金属,并且是一种广泛影响体内各种酶的反应的重要的必需元素。血清和血浆的镁浓度在与钙浓度的竞争中发生变化,在中枢神经系统或心脏机能不全,肾功能不全,急性胰腺炎等疾病中能够观察到上述变化,这使得镁的测定成为重要的临床诊断项目之一。
人们已知用一种二价金属螯合指示剂在体液样品中进行比色测定和测定浓度的各种方法。最常用的螯合指示剂是4-甲基-1,3-苯二甲基蓝I。根据Dojin Kagaku Catalog第19版(1994年5月31日出版),用羊毛铬黑T,钙色素,偶氮胂羧,1-〔1-羟基-4-甲基-2-苯偶氮)-2-叶酚-4-磺酸,偶氮氯膦,甲基百里酚蓝,邻甲酚肽配位酮.,SPANS,二甲酚橙及类似物也可以实现镁的比色测定。
当用这些螯合指示剂在生物样品中进行镁的比色测定时,必须加入一种钙掩蔽剂以便避免共存的钙的干扰而不影响指示剂。在镁和钙的共存物中,所选择对钙的掩蔽剂实例包括:O,O’-双〔2-氨甲基〕乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸(下文常称作“GEDTA”〕,反式-1,2-环己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(下文常称作“CyDTA”〕,和O,O’-双〔2-氨基苯基〕乙二醇-N,N,N’,N’四乙酸(下文常称作“BAPTA”〕
作为一种用于掩蔽其它诸如铁,铜和锌这样的重金属的方法,加三乙醇胺或一种氰化物的化合物也是公知的。
用这些组合物制备一种用于测定镁的试剂组合物目前是一种本领域技术人员能够很容易推断出的设想,且已经发了大量用于测定镁的试剂组合物并将它们付诸实际应用。例如最常使用具有GEDTA的4甲基-1,3-苯二甲基蓝I组合物和目前在市场上出售的许多它们的试剂盒。再如,JP-A-4-120464公开了一种具有GEDTA或BAPTA的偶氮氯膦组合物〔本文中所用的术语“JP-A’意思是“未审公开的日本专利中请”),EP-A-597900公开了一种具有GEDTA或BAPTA的偶氮胂I组合物,且JP-A-5-11908公开了一种其中使用了一种甲衍生物的方法。
美国专利5,397,710中公开的组合物涉及了一种用于全血的干测试片,它具有分离血细胞的功能。它用羊毛铬黑T,1〔1-羟基-4-甲基-2-苯偶氮〕-2-萘酚-4-磺酸,1-偶氮-2-羟基-3-〔2,4-二甲基羧酸苯胺〕萘-1’-〔2-羟基〕苯,偶氮氯膦III,羟基萘酚蓝,偶氮胂I,SPANS或类似物作为指示剂,并使用GEDTA作为掩蔽剂。
在现有技术已使用的螯合指示剂中,除了甲衍生物以外,每种指示剂都具有一种烯丙基偶氮结构作为螯合作用的功能部分和一种茶酚结构作为色素的部分。
目前,当用一种干燥试剂分析液体样品时样品多数是未稀释的血清,血浆,尿或类似物并且在许多情况中,所测定的物质含有相当高的浓度。镁也不例外,它在人血清或血桨中的浓度通常是1.8至2.0mg/dl,而在异常情况中,有时达5.0至6.0mg/dl。测试片必须具有测定这类异常值的能力。
这就是说,当用一种金属螯合指示剂制备用于测定镁的干测试片时,对于样品中镁的浓度来说,在试剂中必须事先包括必需和足够用量的螯合指示剂(所预计测定范围的上限浓度包括异常值)。然而,当按照这样一种必需和足够的用量加入螯合指示剂时,在与镁形成一种复合体前,甚至在不需和未改进的条件下就可以观察到非常高水平的染色。换句话说,这些方面有一个缺陷,这就是由于较高的最初背景值,具有较低镁浓度样品的测定准确度变得很差。
由于通过相当强的体内平衡来控制生物体液〔诸如血清和血浆〕中镁的浓度,所以将正常值限制在一个极其窄的范围。从而,由于在疾病的诊断中,检测一个稍微偏离这个较窄范围的值是很重要的,所以较差的测定准确度是一个致命的缺陷。
另外,当本发明的发明人已经尝试过用干法加工可想到的现有技术的镁螯合指示剂和钙掩蔽剂组成的组合物来制备来制备各种用于测定镁浓度的干测试片时,发现在大多数组合物(包括现有技术的组合物)中都不能避免钙的干扰。
此外,甚至在冷藏条件(4至8℃〕下,许多这样获得的干测试片仍表现出较差的储藏稳定性。
本发明的一个目的是提供一种表现出较低背景值的干测试片来测定镁的浓度,所述的干测试片在整个测定范围内具有非常好的测定准确度,且不受共存的钙的干扰,还具有一种非常好的储藏稳定性并能够容易和方便地使用。
本发明的这一目的和其它目的已经通过用一种于测试片来测定生物体液中镁的浓度而实现,所述的干测试片包括下列〔i〕至〔iii〕的试剂组分:〔i〕邻甲酚酞配位酮(下文常称作“OCPC”〕;〔ii〕O,O’-双〔2-氨基苯基〕乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA);和〔iii〕一种pH为8.5至11.0的pH缓冲剂。
这种干测试片可以进一步含有一种离子型去污剂作为试剂组分〔iv〕。
此外,本发明的这一目的和其它目的已经通过上述干测试片而实现,
其中这种干测试片包括一种不透水的支持体,该支持体上有一个检测区;
其中检测区包括一种含有不溶于水的多孔材料的样品保留层和一种含有水溶性聚合物的粘合层,且
其中试剂组分存在于样品保留层和粘合层中的至少一层中。
图1是本发明测试片的检测区和周围区的一个截面图,其中参数1表示样品的保留层,参数2表示粘合层,参数3表示不透水的支持体,和参数4表示基底膜。
图2是用本发明测试片进行镁的光学测定的一个标准曲线。
图3表示用在发明测试片测定镁时共存钙的干扰。
图4表示本发明测试片的储藏稳定性。
尽管用OCPC测定钙或镁的技术是一种已经公知的方法,但是对镁进行的特殊测定使用OCPC和BAPTA的组合物还是一种在现有技术中没被发现的技术。本发明人已经发现当用OCPC以及作为钙掩蔽剂的BAPTA制备测试片时,不需降低镁的测定灵敏度,就完全可以避免钙的干扰。
由于OCPC和BAPTA都是二价金属的螯合剂,所以它们与镁和钙都形成螯合物。然而,OCPC具有的对镁的整合作用稳定常数比BAPTA所具有的更大,且BAPTA具有的对钙的螯合作用的稳定常数比OCPC所具有的更大。应用这一原理,通过一种OCPC和BAPTA的特定组合物已经完成了本发明。
由于主要用光学法来测定干测试片,所以在检测区的背景值较低是当然优选的。含有OCPC的本发明测试片具有极低的背景值,在制备一种测试片的过程中,甚至大量加入它时,反应前它就具有淡粉红色。因此,可以制成一种具有较高准确度的测试片。
因为pH值变高(因为碱性变强〕,所以用OCPC进行镁测定的灵敏度变高。此外,甚至在没有镁存在的情况下,当变成碱性时,OCPC也可以显色。由于下面的一个难题,还没有把加工成的干测试片付诸实际应用,这一难题就是当调整至强碱性端以便增加灵敏度时,背景值变高,而反之,当调整到中性端时,灵敏度降低。然而,通过用一种能够将反应系统调整到pH为8.5至11.0的缓冲剂,不需降低灵敏度就能获得一种具有低背景值的测试片,这能同时防止制备过程中因空气含有的二氧化碳而导致的pH值降低。
人们还已知,当用包括OCPC的一般螯合反应系统测定生物体液〔诸如血清或血浆样品〕中的镁时,测定会受到样品中的蛋白质〔特别是白蛋白的干扰。由于白蛋白吸收镁的特性而导致的这一现象不会产生实际问题,因为在血清或血浆中白蛋白所吸收的镁的部分有一个几乎是恒定的比例,约是30%,从而用一种简单的数值处理就可以消除它。
然而,当样品具有一种极低或极高的白蛋白水乎时,在有些情况中不能忽略这样的干扰。通过向反应系统中加入一种具有蛋白质变性功能的离子型去污剂,本发明已经能够防止和避免大量受检测样品〔包括具有极低或极高白蛋白水平的样品)中的偏差。
本发明中的这测试片可以在几分钟之内准确地测定血清和血桨中镁的浓度,使得将它广泛用于临床诊断。此外,作为一种干燥型测试片,可以将它非常简便而容易地进行操作。
当浓度不足时,因为不能在测定范国的上限周围进行测定,所以有必要加入一种高浓度的螯合指示剂。然而,太过量的这种添加可以产生背景值。与其它螯合指示剂相比,由于甚至以高浓度加入时,OCPC也不会产生高背景值,所以它能保持测定的准确度。按检测区的干重计,优选加入的OCPC在0.05至0.3%的范围内,更优送在0.07互0.15%的范围内。检测区能干重意思是含有试剂组分,样品保留层和粘合层的检测区的干重。
对于所预计的钙的浓度来说,可以加入足量的BAPTA。在血清或血浆样品的测定中,按检测区的干重计,优选BAPTA的用量是0.3至5.0%,更优选0.5至1.5%。
在这类的测试片中,pH缓冲剂可以选自常规使用的公知缓冲剂,条件是将它在pH8.5至11.0的范围内使用并且当干燥时组分不会蒸发。pH缓冲剂的实例包括:硼酸-氢氧化钠缓中剂,碳酸氢钠-碳酸钠缓冲剂,甘氨酸-氢氧化钠缓冲剂,CHES缓冲制和CAPSO缓冲剂。尽管当pH值在8.5至11.0的范围内时足以实现镁的测定,但是pH的范围可以优选9.5至10.0。按检测区的干重计,可以使用的缓冲剂的浓度优选0.3至5.0%,更优选1.0至3.0%。
用于本发明干测试片中的不透水支持体是一种表面不光滑的白色薄膜,它含有一种塑料,诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯,聚苯乙烯或类似物,它具有的厚度是50μm至1mm,优选100μm至300μm。
检测区包括一种水溶性粘合层和一种含有不溶于水的多孔材料的样品保留层,它们叠加在不透水的支持体上。
如果粘合层含有试剂组分,那么在生产检测区时,通过将试剂组分均匀涂布在支持体上来制备粘合层,因比,当将样品保留层进行叠加时,它用作一种粘合剂,并且在测定时,它还可以作为一种保持均匀显色的层。
因为所测定的样品是生物体液,诸如血清、血浆及类似物,所以将一种水溶性聚合物用作粘含层的材料,可以将所述的水溶性聚合物进行选择,条件是它基本上不含镁和钙。它的实例包据聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮。可以将这些材料以一种具有适当粘性的涂渍溶液的方式加入。在材料是聚丙烯酰胺的情况下,涂渍溶液的浓度是4至6%,或在材料是聚乙烯吡咯酮的情况下,涂渍溶液的浓度是10至15%。用于适当粘性调整中的聚合物浓度在0.5至20%的范围内变化很大,优选5.0至10%(干燥后),这取决于它的种类。上述粘合层中可以不包括试剂组分并且仅在下述样品保留层中包括饱和形式的试剂组分。
将样品保留层在应用时用来均匀地展开试剂表面上的样品,而当与试剂反应时用它来保留样品并将反应后的试剂置于光学上可检测到的条件中。作为用于样品保留层中的不溶于水的多孔材料,在洗涤和干燥后,如果必要,可以使用含有纤维素的滤器或膜滤器,含有天然或化学纤维的纤维素衍生物或玻璃纤维或纺织材料。在优选的实例中,将湿或干的纺织材料〔诸如一块布)压制并叠加在粘合层上。如果是干燥的材料,按样品保留层的重量计,它的百分比占检测区的65至95%,优选75至85%。
用已在美国专利3,992,158、4,042,335和4,258,001中公开(例如〕的公知的涂渍法,可以在不透的支持体上均匀地涂渍粘合层的涂渍溶液,所涂渍的厚度范围是50至300μm,优选100至200μm。通过喷40℃至60℃的热空气而将这样涂渍的粘合层进行干燥。
当将样品保留层叠加在粘合层上时,有时可以将粘合层中的试剂组分连同聚合物一起转入样品保留层中,使得在有些情况下,在本发明所定义的检测区中两层都不能明显地相互分离。
在任何情况下,检测区中的样品保留层和粘合层两者都可以含有本发明中所用的OCPC和BAPTA和pH缓冲剂的组合物。
根据本发明,当制备一种用于测定镁的浓度的干燥试剂时,通过进一步加入一种离子型去污剂可以获得一种具有高性能的测试片,所述的离子型去污剂使蛋白质变性,从而避免了血清或血浆中白蛋白的影响。离子型去污剂的实例包括作为阴离子去污剂的十二烷基硫酸钠和作为阳离子去污剂的十四烷基三甲铵溴化物,但是对于本领域技术人员来说,显然可以使用任何其它的化合物.条件是它是一种具有类似功能的离子型去污剂。按检测区的干重计,离子型去污剂的浓度优选0.3至20.0%,更优选5.0至15.0%。
可以向检测区中加入其它组分,诸如一种用于掩蔽金属(不外乎是钙)的氰化物化合物和一种金属螯合指示剂的稳定剂,但在本发明的干燥试剂组合物中,这些附加组分不见持别需要的。
将这样获得的本发明干测试片检测区的原片插入一种小片中并将它粘合在一种可以用手指固定的基底膜上,从而获得一种用于测定镁的测试片。截面图在图1中表示(1:样品保留层;2:粘合层,3:不透水的支持体;4:可以用手指固定的基底膜)。由于基底膜4仅是一个手柄,所以它不是本发明的主要组成部分。通过将检测区的原片插入一种条状物中可以获得没有基底膜的本发明测试片。
将合适量的液体样品应用在测试片的检测区上,并且从检测区端或支持体端测定反应完成后的反射率(当从支持体端测定时,主要是支持体和手柄的材料是透光性的〕。在接近OCPC和镁的螯合物的吸收峰的较长处测定反射率,优选在565至575nm处。
通过在恒定水平时控制所用液体样品的体积、反应温度和反应时间,可以进行高准确度的测定。
现在参照实施例来更进一步的解释本发明,但不应理解成认为它们用来限制本发明。
实施例粘合层涂渍溶液的制备〔配方〕邻甲酚肽配位酮1.50mmol/1%(Dojinkagaku〕O,O’-双〔2-氨基苯基〕乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸四盐16mmol/l(Dojinkagaku)硼酸钠缓冲剂〔pH9.5〕 300mmol/l(Wako Pure Chemical)十二烷基硫酸钠 10.0%〔w/w〕(Wako Dure Chemical)10%丙烯酸胺〔聚合物〕 5.0%〔w/w〕(Nakalai Tesque)检测区原片的制备
将这样制备的溶液以120μm的厚度(湿态〕涂渍在一种白色聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上,该薄膜具有的厚度是200μm,通过喷45℃的热空气15分钟表进行干燥。
向这种薄膜上加压粘合一块约250μm厚的纺织材料,所速的纺织材料已经用0.1%TritonX-100〔Nakalai Tesque〕的水溶液进行了均匀湿润,接着用喷45℃热空气的方法干燥15分钟。
干燥后检测区原片每1M含有下列组分。邻甲酚酞配位酮 94.3mg〔0.09%〕O,O’-双〔2-氨基苯基〕乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸四钾盐
1.21g〔0.08%〕硼酸 2.23g〔1.80%〕氢氧化钠 0.74g〔0.78%〕十二烷基硫酸钠 1.20g〔10.85%〕丙烯酰胺 6.0g〔0.71%〕TritonX-100 143mg〔0.03%〕纺织材料 120g〔84.86%〕
括号内的数值代表按检测区干重计的%。测试片的制备
通过下述方法将这样获得的检测区原片插入一种5mm×7mm的小片中并将它制成一种测试片,所述的方法是用一种压敏粘合剂的双面涂层胶带将检测区的原片粘合在一种白色聚对苯二甲酸乙二醇酯基底薄膜上端,所述的基底膜用作一种具有0.5mm厚的条形(5mm×80mm)手柄。将这一阶段处的检测区和周围区的载面图在图1中表示。测定过程将由Kyoto Dai-ichi Kagaku Co·Ltd制造的台式反射率测定仪SPOTCHEM@SP4410用作测定仪器。将测试片放在控制在37℃的仪器台上面,然后在测试片上使用5.0μl的血清样品,在预定的一段时间后,在575nm的波长处测定样品的反射率〔R〕。将反射率〔R〕用Kubelka-Munk公式换算成k/s值。
*Kubelka-Munk公式:K/s=〔1-R〕2/2R
通过测定已知浓度的样品来事先绘制k/s值-镁的浓度标准曲线。该标准曲线在图2中表示。用这种曲线计算出每份样品中的铁的浓度。在各次操作间再现性的评价
为了评价本发明测试片在各次操作间的再现性,取三份血清样品,分别是低浓度〔样品〕,常规浓度〔样品2〕和高浓度〔样品3〕,将每份样品都连续测定12次。如表1中所示,每份样品中的偏离系数〔CV〕都是3%或更低。
表1
样品1 样品2 样品3Mg(mg/dl) 1.52 2.05 5.09
1 1.5 2.0 5.1
2 1.5 2.1 5.2
3 1.5 2.0 5.1
4 1.5 2.1 5.1
5 1.6 2.1 5.0
6 1.5 2.1 5.0
7 1.5 2.0 5.1
8 1.5 2.1 5.0
9 1.5 2.1 5.110 1.5 2.2 5.111 1.5 2.1 5.212 1.4 2.1 5.0AVG(mg/dl)1.50 2.08 5.08STD(mg/dl)0.043 0.058 0.072CV(%) 2.84 2.77 1.41共存钙的干扰、
为了证明本发明测试片对钙的干扰的耐受性向常规和高镁浓度的血清样品中加入不同量的钙,并检验对镁的测定值的影响。如图3中所示,这种测定完全不受最高达20mg/dl钙的干扰。储藏稳定性的证明
将本支明的测试片与一种干燥剂一起密封在玻璃瓶中并在冷冻条件〔4℃〕下进行保藏以检验稳定性。在图4中所示的一段时(开始阶段和6,12和18个月)后,用这样保藏的测试片测定常规和高镁浓度的血清样品,每份样品都测6次。如图4中所示,很难观察到灵敏度的改变,它证明本发明的测试片是相当稳定的。
因此,如上具体所述,根据本发明,可以获得在血清和血浆样品中快速并干燥测定镁中使用的干测试片,它在整个测定范围内具有极好的测定准确度,它表现出较低的背景值,它不受共存的钙的干扰,它具有较高的储藏稳定性并且可以简单而容易地操作。
尽管本发明已经参照它的特定实施例作了具体描述,但是对于一个本领域技术人员来说,显然可以在其中做各种变化和修改,而不会脱离它的内容和范围。
本申请以在日本提出的Hei8-112908号申请为主,将其内容引入本文中作为参考。
Claims (7)
1、一种用于测定生物体液中镁浓度的干测试片,它包括下列〔i〕至〔iii〕的试剂组分:
〔i〕邻甲酚酞配位酮;
〔i 〕O,O’-双(2-氨基苯基〕乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸;和
〔iii〕一种pH为8.5至11.0的pH缓冲剂。
2、如权利要求1中所要求的测试片,它还含有一种离子型去污剂作为试剂组分〔iv〕。
3、如权利要求2中所要求的测试片,其中离子型去污剂选自由丁二烷基硫酸钠和十四烷基三甲铵溴化物组成的物质组。
4、如权利要求1中所要求的干测试片,其中干测试片包括一种不透水的支持体,该支持体上有一个检测区;其中检测区包括一种含有不溶于水的多孔材料的样品保留层和一种含有水溶性聚合物的粘合层;且试剂组分存在于样品保留层和粘合层中的至少一层中。
5、如权利要求4中所要求的测试片,其中干测试片还含有一种离子型去污剂作为试剂组分〔iv〕。
6、如权利要求5中所要求的测试片,其中离子型去污剂选自由十二烷基硫酸钠和十四烷基三甲铵溴化物组成的物质组。
7、如权利要求5中所要求的测试片,其中按检测区干重的百分比计,试剂组分、水溶性聚合物和不溶于水的多孔材料具有下述比例:邻甲酸肽配位酮:0.05至0.3%;O,O’-双〔2-氨基苯基)乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸:0.3至5.0%;pH为8.5至11.0的pH缓冲剂:0.3至5.0%;离子型去污剂:0.3至20.0%;水溶性聚合物:0.5至20%;和不溶于水的多孔材料:65至95%。
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