CN1196482A - 生物传感器及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了不受试样溶液中固形成分的影响,能够对特定成分进行高精度定量的生物传感器。这种生物传感器具备电绝缘性基板、在前述基板上形成的具有作用电极和对电极的电极系、被配置于前述电极系上的至少含有酶的反应层、以及设在前述反应层上的能够抑制固形成分透过的阴离子性滤膜。

Description

生物传感器及其制造方法

本发明涉及能够对试样中的特定成分进行迅速且高精度定量的生物传感器及其制造方法。

历来，作为对试样中的特定成分，不经过稀释、搅拌试样溶液的简易定量方式，以下的生物传感器(日本专利公开公报平3-202764号)被揭示。

这种生物传感器是利用网版印刷等方法，在电绝缘性基板上由作用电极以及对电极组成电极系，然后在上述电极系上由亲水性高分子、氧化还原酶以及电子接受体组成酶反应层而形成的。

在用以上方法制成的生物传感器的酶反应层上滴加含有底物的试样溶液，使酶反应层溶解，底物与酶反应，底物被氧化的同时，电子接受体被还原。酶反应结束后，被还原的电子接受体进行电化学氧化反应，此时由得到的氧化电流值可以求出试样溶液中的底物浓度。

如上述构成的生物传感器中，即使试样溶液中的底物浓度相同，只要这种试样溶液中所含的成分不同，就会出现所得的氧化电流值存在差异的问题。

其中的一个原因是试样溶液中象血细胞那样大小超过1μm的固形物与酶以及底物进行反应时，存在与被还原的电子接受体的互相作用。当这种固形物与被还原电子接受体接近时，由于互相作用电子接受体被氧化，所以，得到的氧化电流值是不正确的。

作为缓解这个问题的方法，比较有效的是用一定的稀释液稀释试样溶液，以减小试样溶液中所含成分的性状差异的方法。但是，这种方法从操作性的方面考虑，并不是一种很好的方法。

本发明的目的是提供能够解决以上问题的生物传感器。

本发明提供了具备电绝缘性基板、在前述基板上形成的具有作用电极和对电极的电极系、被配置于前述电极系上的至少含有酶的反应层、以及设在前述反应层上的能够抑制固形成分透过的阴离子性滤膜的生物传感器。

作为本发明较好模式中的阴离子性滤膜由成膜性高分子形成的多孔性膜或纤维编织体以及被固定于其上的阴离子性高分子组成。

作为本发明其他较好模式的前述阴离子性滤膜是由成膜性高分子和阴离子性高分子的混合物形成的多孔性膜。

通过本发明，可以提供不受试样溶液中共存的底物之外的固形成分的影响，能够进行高精度定量的生物传感器。

图1表示的是本发明的一个实施例中除去生物传感器的反应层的分解斜视图。

图2表示的是生物传感器主要部分的纵截面图。

本发明的阴离子性滤膜由限制试样溶液中固形成分移动的滤膜与抑制反应层中的电子接受体向试样溶液中扩散的阴离子性高分子组成。

前述的滤膜较好的是使用成膜性高分子形成的多孔性膜；以及由玻璃纤维、纤维素以及树脂纤维等编织而成的编织体。

为了赋予滤膜阴离子性，较好的是在多孔性膜和编织体上固定阴离子性高分子。另一种较好的方法是将成膜性高分子与阴离子性高分子混合，形成多孔性膜的方法。

为了赋予滤膜阴离子性，形成阴离子性滤膜，对应于滤膜，阴离子性高分子的比例较好的是在5wt％以上。

阴离子性高分子为具有成膜性的高分子时，仅依靠这种高分子就能够形成阴离子性滤膜。

阴离子性滤膜有以下2个作用。

第1，由于阴离子性滤膜的孔径小于试样溶液中固形成分的大小，所以，能够抑制固形成分向反应层中渗透。

第2，由于阴离子性滤膜中的阴离子性高分子与反应层中的电子接受体(阴离子性化合物)发生静电排斥，所以，能够抑制电子接受体向滤膜以外的试样溶液中扩散。

通过以上的2种作用，阴离子性滤膜将反应层中的电子接受体与试样溶液中的固形成分隔离了。由此，试样溶液中的固形成分能防止酶反应中被还原的电子接受体的氧化，所以，对传感器的响应特性的影响较小。

为了发挥第1种作用，阴离子性滤膜的孔径较好的是在1μm以下，这样能够使包含在试样溶液中，而且对传感器的响应特性有影响的固形成分，例如血细胞等的透过性能丧失。

作为阴离子性滤膜构成材料的成膜性高分子，较好是使用至少一种以下的高分子材料，例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙酸纤维素、硝化纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚砜类、聚偏氟乙烯、聚酰胺以及聚酰亚胺。

另一种作为阴离子性滤膜构成材料的阴离子性高分子是在侧链上具有磺酰基、磺酸基或羟基的高分子，较好是使用至少一种以下的高分子材料，例如，全氟磺酸离子键聚合物、全氟羧酸离子键聚合物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯基硫酸、聚苯乙烯磺酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸以及羧甲基纤维素。

本发明的生物传感器的制造方法包括向被设置于电绝缘性基板上的电极系上滴加含有亲水性高分子的溶液，并使其干燥，形成亲水性高分子层的步骤；在亲水性高分子层上滴加至少含有酶的溶液，并使其干燥，形成反应层的步骤；以及形成覆盖前述反应层的阴离子性滤膜的步骤。

在形成反应层的步骤中，如果不搅拌滴加在亲水性高分子层上的含有酶的溶液，则亲水性高分子层不与含有酶的层混合。所以，电极系的表面就只被亲水性高分子层覆盖。因此，蛋白质对电极系表面的吸附、有时包含于反应层中的电子接受体之类具有氧化能力的物质的化学作用导致的电极系的特性变化就很难发生。而且，能够提高反应层的溶解性，获得高精度的传感器响应。

形成前述阴离子性滤膜的步骤有以下4种方法。

第一种方法由2个步骤组成：首先，在前述反应层上滴加溶解或分散了成膜性高分子的溶液，并使其干燥，形成滤膜；然后，将溶解或分散了阴离子性高分子的溶液浸渗到前述滤膜中，当阴离子性高分子浸透到滤膜中后使其干燥，赋予前述由成膜性高分子形成的滤膜以阴离子性，形成阴离子性滤膜。此种方法中，溶解或分散了阴离子性高分子的介质较好的是选择不溶解由成膜性高分子形成的滤膜的介质。

第二种方法是在前述反应层上滴加溶解或分散了成膜性高分子与阴离子性高分子的混合液，并使其干燥，形成阴离子性滤膜。

第三种方法也由2个步骤组成：首先，将纤维编织体剪成能够完全覆盖前述反应层的大小，接着将其压粘在反应层上，形成滤膜；然后，将溶解或分散了阴离子性高分子的溶液浸渗到前述滤膜中，当阴离子性高分子浸透到滤膜中之后使其干燥，赋予滤膜以阴离子性，形成阴离子性滤膜。

第四种方法是预先形成阴离子性滤膜，然后将此阴离子性滤膜剪成能够完全覆盖前述反应层的大小，接着将其压粘在反应层上。这里所用的阴离子性滤膜是用上述1～3的任何一种方法，在有别于前述基板的其他基体上预先形成的。此种方法中，溶解或分散了至少一种成膜性高分子以及阴离子性高分子的介质还可溶解反应层。

将上述各种溶液滴加在反应层上或使溶液浸渗到滤膜中的步骤较好的是使用将反应层和滤膜浸渍于各种溶液中的方法；以及将各种溶液滴加到反应层和滤膜上的方法。

溶解阴离子性高分子的溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、甲苯、二甲苯、乙醚等，这些溶剂可以单独使用，也可以2种以上混合使用。但是，较好的是选择那些不溶解滤膜和形成的反应层的溶剂。

反应层中所含的酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、果糖脱氢酶、半乳酸氧化酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇酯酶、醇脱氢酶、醇氧化酶、抗坏血酸氧化酶以及胆红素氧化酶等，可根据测定的对象进行选择。

所以，本发明的生物传感器被广泛地应用于葡萄糖传感器、醇传感器、蔗糖传感器、胆固醇传感器、乳酸传感器、果糖传感器等利用与酶有关的反应系的生物传感器。

电子接受体可至少选择以下的一种，例如，铁氰化钾、对苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、β-萘醌-4-磺酸钾、亚甲蓝、二茂铁及其衍生物。

所用的亲水性高分子可至少选择以下的一种，例如，羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧乙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶及其衍生物、丙烯酸及其盐、甲基丙烯酸及其盐的聚合物、淀粉及其衍生物、马来酸酐及其盐的聚合物。

溶解酶和电子接受体以及亲水性高分子的溶剂可以使用水、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等各种缓冲液。

酶与底物反应时，有时反应层溶解于试样溶液中，使酶与底物反应；有时使反应层固定化，而不浮游至试样溶液，只在反应层的表面使酶与底物发生反应。

此外，即使是根据所用的电极，将试样溶液中的溶解氧作为电子接受体使用的生物传感器，由本发明获得的阴离子性滤膜的效果也不会改变。

氧化电流的测定方法有测定电极与对电极组成的二极电极方式、还有再加入参照电极的三电极方式。利用三电极方式能更正确地测定。

以下，通过具体的实施例对本发明进行更加详细地说明。

图1表示的是除去反应层的生物传感器的分解斜视图。将形成电极系的绝缘性基板1、具备空气孔14的覆盖层12以及隔板11按照图1所示的点划线的位置关系放置、粘接，制成生物传感器。

此传感器中，在基板1与覆盖层12之间，隔板11的缝隙15部分形成构成试样溶液供给通道的空间，通过使试样溶液接触作为开口部位的缝隙15的端部13这样简易的操作就能够使试样溶液容易地经过试样溶液供给通道导入反应层部分。由于试样溶液的供给量依赖于由覆盖层和隔板形成的空间的容积，所以，没有预先定量的必要。而且，能够将测定中的试样溶液的蒸发限制在最小限度，提高测定精度。如果使用透明的高分子材料制成的覆盖层和隔板，则从外部就能够很容易地观察到反应层的状态以及试样溶液的导入状况。

图2表示的是本发明的生物传感器的纵截面图。

在基板1上利用网版印刷法印上银糊，形成导线2、3。在基板1上再次利用同样的印刷法形成由含有树脂粘合剂的导电性碳糊组成的包含作用电极4和对电极5的电极系以及由电绝缘性糊组成的电绝缘层6。电绝缘层6使作用电极4与对电极5的露出部分的面积一定，而且部分地覆盖导线。此外，在前述的电极系上形成亲水性高分子层7、更进一步形成含有酶的层8，这些层被阴离子性滤膜9(或滤膜9a)覆盖。含有酶的层8中通过使用的电极系材料包含电子接受体。

实施例1

在图2的基板1的电极系上滴加羧甲基纤维素的钠盐(以下略称为CMC)的0.5wt％的水溶液，将其置于50℃的温风干燥机中干燥10分钟，形成CMC层7。然后，制成含有10mg/ml葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4；以下略称为GOD)、16mg/ml铁氰化钾的混合水溶液。将这种混合水溶液滴加到CMC层7上，再将其置于50℃的温风于燥机中干燥10分钟，形成含有酶的层8。

然后，混合乙基纤维素的2wt％乙醇溶液和羟丙基纤维素的0.5wt％乙醇溶液，制成混合乙醇溶液A。在含有酶的层8上滴加5μl这种溶液A，于室温干燥10分钟，由成膜性高分子形成滤膜。接着，调制全氟磺酸离子键聚合物的1wt％丁醇溶液，在刚才制成的滤膜上滴加5μl这种溶液，于50℃干燥10分钟，赋予滤膜以阴离子性，制成阴离子性滤膜9。

最后，按照图1所示的点划线的位置将覆盖层12以及隔板11粘接在基板上，制成葡萄糖传感器。

此葡萄糖传感器的试样溶液为葡萄糖水溶液与血液，所含葡萄糖的浓度调整到等浓度。从试样溶液供给通道的开口部位13导入3μl这种溶液。

从试样溶液供给通道的开口部位13导入试样溶液时，试样溶液到达空气孔14，浸透到阴离子性滤膜9中，透过此阴离子性滤膜的溶液可以溶解反应层。在反应层中试样溶液中的葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化，于是，铁氰化钾被移动的电子还原，生成亚铁氰化钾。

在供给试样溶液1分钟后，在电极系的对电极5和作用电极4之间施加+0.5V的电压，测定5秒钟后的电流值。其结果是，血液试样的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的98％。

实施例2

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，在含有酶的层8上滴加5μl实施例1制成的混合乙醇溶液A，于室温干燥10分钟，制成由成膜性高分子形成的滤膜。接着，调制聚丙烯酸的1wt％水溶液，在刚才制成的滤膜上滴加5μl这种水溶液，于50℃干燥10分钟，赋予滤膜以阴离子性，制成阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的95％。

实施例3

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，将乙基纤维素的2wt％乙醇溶液和全氟羧酸离子键聚合物的0.2wt％乙醇溶液混合，调制成混合乙醇溶液B。在含有酶的层8上滴加5μl这种溶液B，于室温干燥10分钟，制成阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的97％。

实施例4

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，将玻璃纤维滤纸剪成能够完全覆盖反应层表面的大小，将其压粘在反应层上，形成滤膜。接着，调制全氟磺酸离子键聚合物的0.5wt％。乙醇溶液，在滤膜上滴加10μl这种溶液，于室温干燥10分钟，再将其放置在50℃的温风干燥机中干燥5分钟。这样就赋予了滤膜阴离子性，制成了阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的98％。

实施例5

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，除了使用纤维素滤纸来代替玻璃纤维滤纸之外，其他的都与实施例4相同，制成阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的95％。

实施例6

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，与实施例4同样地将纤维素滤纸压粘到反应层上，形成滤膜。接着，调制聚丙烯酸的1％水溶液，在滤膜上滴加10μl这种溶液，于50℃干燥10分钟，制成阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的97％。

实施例7

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，在玻璃板上滴加5μl实施例3制成的混合乙醇溶液B，于室温干燥10分钟，制成由成膜性高分子和阴离子性分子的混合物形成的阴离子性滤膜。接着，从玻璃板上剥下滤膜，并将其剪成能够完全覆盖含有酶的层8的大小，然后将其压粘在含有酶的层8上。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的95％。

实施例8

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，将玻璃纤维滤纸浸渍到全氟磺酸离子键聚合物的2％乙醇溶液中，于室温干燥10分钟，再将其放置在50℃的温风干燥机中干燥5分钟。这样就赋予了玻璃纤维滤纸阴离子性，形成阴离子性滤膜。接着，将阴离子性滤膜剪成能够完全覆盖反应层的大小，并压粘在反应层上。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的95％。

比较例1

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。但不形成阴离子性滤膜9。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的70-80％。

比较例2

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，在含有酶的层8上滴加5μl乙基纤维素的2wt％乙醇溶液，于室温干燥10分钟，制成滤膜9a。对这种由成膜性高分子形成的滤膜9不赋予阴离子性。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的83％。

比较例3

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，在含有酶的层8上滴加5μl全氟磺酸离子键聚合物的0.1wt％乙醇溶液，于室温干燥10分钟，使含有酶的层8上附着阴离子性高分子。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的73％。

比较例4

与实施例1同样的，在图2的绝缘性基板1的电极系上制成亲水性高分子层7以及含有酶的层8。

然后，与实施例4同样地将玻璃纤维滤纸压粘到反应层上，形成滤膜9a。对这种滤膜9a不赋予阴离子性。

这样就与实施例1同样地制得了葡萄糖传感器，测定葡萄糖溶液与血液试样溶液的电流响应值。其结果是，血液试样溶液的电流响应值约为葡萄糖水溶液的电流响应值的80％。

Claims (10)

1.一种生物传感器，其特征在于，具备电绝缘性基板、在前述基板上形成的具有作用电极和对电极的电极系、被配置于前述电极系上的至少含有酶的反应层、以及设在前述反应层上的能够抑制固形成分透过的阴离子性滤膜。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，前述的阴离子性滤膜由成膜性高分子形成的多孔性膜或纤维编织体、以及被固定于其上的阴离子性高分子组成。

3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，前述的阴离子性滤膜为成膜性高分子和阴离子性高分子的混合物形成的多孔性膜。

4.如权利要求2或3所述的生物传感器，其特征还在于，前述的成膜性高分子可从以下的高分子材料中至少选择一种，例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙酸纤维素、硝化纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚砜类、聚偏氟乙烯、聚酰胺以及聚酰亚胺；前述的阴离子性高分子为具有至少一种选自侧链上带有磺酰基、磺酸基或羟基等官能团的高分子。

5.一种生物传感器的制造方法，其特征在于，由3个步骤组成：第1，向被设置于电绝缘性基板上的电极系上滴加含有亲水性高分子的溶液，并使其干燥，形成亲水性高分子层；第2，在上述亲水性高分子层上滴加至少含有酶的溶液，并使其干燥，形成反应层；以及第3，形成覆盖前述反应层的阴离子性滤膜。

6.如权利要求5所述的生物传感器的制造方法，其特征还在于，前述的形成阴离子性滤膜的步骤由2步组成：第1，在前述反应层上滴加溶解或分散了成膜性高分子的溶液，并使其干燥，形成滤膜；第2，让溶解或分散了阴离子性高分子的溶液浸渗到前述滤膜中，并使其干燥，赋予前述滤膜阴离子性，形成阴离子性滤膜。

7.如权利要求6所述的生物传感器的制造方法，其特征还在于，溶解或分散了阴离子性高分子的介质是不溶解前述成膜性高分子的介质。

8.如权利要求5所述的生物传感器的制造方法，其特征还在于，前述的阴离子性滤膜是在前述反应层上滴加溶解或分散了成膜性高分子与阴离子性高分子的混合液，并使其干燥后形成的。

9.如权利要求5所述的生物传感器的制造方法，其特征还在于，前述的形成阴离子性滤膜的步骤由2步组成：第1，将纤维编织体压粘在前述反应层上，形成滤膜；第2，将溶解或分散了阴离子性高分子的溶液浸渗到前述滤膜中，并使其干燥，赋予滤膜以阴离子性，形成阴离子性滤膜。

10.如权利要求5所述的生物传感器的制造方法，其特征还在于，前述的阴离子性滤膜是将预先形成的阴离子性滤膜压粘在前述反应层上形成的。

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