CN1226147A - 在分子诊断试剂的光激活检测中改进选择性的方法 - Google Patents

在分子诊断试剂的光激活检测中改进选择性的方法 Download PDF

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Abstract

一种用于对植物或动物组织的一个特定体积进行成像的方法,其中该植物或动物组织含有至少一种光活性分子试剂。本方法包括下列诸步骤:用足以激励包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该植物或动物组织的该特定体积,对包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进行光激活,由此产生至少一种已被光激活的分子试剂,其中该至少一种已被光激活的分子试剂发射能量,检测由该至少一种已被光激活的分子试剂所发射的能量,以及产生一个已检测的能量信号,它是该植物或动物组织的该特定体积的特征所在。本发明还提供一种对材料的一个特定体积进行成像的方法,其中该材料含有至少一种光活性分子试剂。

Description

在分子诊断试剂的光激 活检测中改进选择性的方法
本发明是在(美国)政府支持下，根据由美国能源部授予洛克希德马丁能源系统公司的第DE-AC05-84OR21400号合同而进行的。洛克希德马丁能源系统以及橡树岭联合大学已经向诸发明人放弃发明权。根据由美国能源部授予的第DE-AC05-84OR21400号合同，政府在此项发明中享有权利。
本发明一般地涉及用于从远方实现一种或多种分子试剂的空间选择光激活以及用于改进由此产生的诸诊断信号的检测的方法与装置。为了实现光激活而讲授的本方法利用非线性光学激发的诸特性，以便以高度的空间的和分子的特异性将一种试剂从一种分子能级推向另一种。本方法的诸特性可用于激活各种内源性和外源性的成像试剂，特别是在人和动物的疾病诊断中提供独特的优点。具体地说，在近红外到红外辐射的波长范围内，使用非线性激发方法有利于在深部组织中诸诊断试剂的受控激活，跟当前使用的各种方法和各种辐射相比，近红外和红外辐射在一个较小范围内被吸收和散射。将这些非线性激发方法与先进的信号编码和处理方法相结合，大大地增加了在诸诊断信号检测中的灵敏度。
在许多领域中，特别是在医学诊断领域中，迫切地需要一种能够选择性地控制各种分子试剂的远方激活，并且在激活过程中产生很少的副作用。在激发方面所期待的改进包括改进对激活部位和深度的空间的和时间的控制，减少对其他处于同一位置的或最接近的分子试剂或结构的不希望有的激活，并且在所希望的分子试剂与不希望的分子试剂的激活中增加前者的优先权。已经研制了各种线性的和非线性的光学方法，用以在非常特殊的条件下对某些这样的试剂提供某些这样的改进。然而，一般来说，这些方法的性能和可用性尚未达到所期望的程度。具体地说，需要这样的几种改进的光激活方法，它们可以被用来对多种分子诊断试剂进行选择性的光激活，并且在这种光激活的应用的控制上提供改进的性能。
将光辐射作为一种对分子探测器进行远方激活的手段来应用已经有很多年的历史了。具体地说，线性的光学激发方法已经作为一种对分子诊断试剂进行半选择性激活的手段而被广泛地应用。当一种目标试剂，例如一种分子诊断试剂，经受一种由单光子提供能量吸收的特定的光化学或光物理过程(例如荧光发射)时，便产生线性的光学激发。在许多情况下，这些过程是非常有效的，并且这些过程的使用对多种应用来说是有吸引力的。不幸的是，这些线性方法并不总是像所希望的那样成功。例如，已经强有力地证明，用紫外辐射来激发某些分子探测器会使人和动物产生疾病，诸如诱发皮肤癌，还有其他不希望的副作用。而且，主要是由于该入射的用于探测的辐射在接近这些试剂的线性吸收波长带的波长时出现光学散射和吸收，其结果是，在分子试剂的线性光学激发中，为了达到所期待的穿透深度，人们已经投入了最大的努力。作为一个例子，Wachter和Fisher(E.A.Wachter和W.G.Fisher，“用于在高分子基质合成物中评估结构弱点的方法与装置”，美国专利5,483,338号)讲授了一种在分子探测器试剂中能够灵敏地进行化学变化成像的快速光学方法；然而，由于该入射探测器辐射的散射和吸收，该方法仅适用于局部分析。Vo-Dinh和他的同事(T.Vo-Dinh,M.Panjehpour,B.F.Overholt,C.Farris,F.P.Buckley Ⅲ和R.Sneed，“在食管癌活体诊断中使用微分归一化荧光(Dnf)指标”，外科和医学中的激光，16(1995)41-47；以及M.Panjehpour,B.F.Overholt,J.L.Schmidhammer,C.Farris,P.F.Buckley，和T.Vo-Dinh，“食管癌的光谱学诊断：新的分类模型，改进的测量系统”，胃肠内窥术，41(1995)577-581)讲授了将类似的线性的光学探测器方法用于检测人体中的患病组织；然而，由于该入射探测器辐射的散射和吸收，这个方案也因为达不到所期望的穿透深度以及局限于检测表面损伤而受到困扰。同样，由于这种类型的激发与激发功率线性相关，这样的方法不能提供沿着该光学路径对探测器激发位置进行限制的有效手段。事实上，由于入射光辐射被周围的基质所散射和吸收，在探测器分子种类的激发中不良的特异性，以及缺乏用以精确地控制激活的范围和深度的适当的物理机制，使得所有使用线性光学激发的实例实质上都受到基本性能限制的困扰。
为了在某些应用中在光激活的选择性方面获得特定的改进，以及为了解除由线性激发方法所带来的种种限制，已经使用了各种非线性的光学激发方法。事实上，众所周知，该非线性过程包括由一个分子同时吸收两个光子的光，以实现等效于具有这两个光子的能量的两倍的一个单光子的吸收的激发，这个过程具有减少激发光子被基质吸收和散射，改进了的对激发区域的空间控制，以及降低了的导致样本光化学和光物理损伤的可能性等特殊的优点。在双光子激发方法的许多实例中，已经使用了从单模、连续波(CW)激光器到具有超过1GW的峰值功率的脉冲Q-开关激光器。例如，Wirth和Lytle(M.J.Wirth和F.E.Lytle，“在光密介质中的双光子激发荧光”，分析化学，49(1977)2054-2057)讲授了将非线性光学激发用作对存在于光密介质中的目标分子进行激发的一种手段；该方法在限制该探测器辐射跟该介质本身的不希望有的直接交互方面看来是有用的，并且提供了一种在强烈吸收或散射的基质中有效地激发目标分子试剂的有效手段。Wirth进一步地开发了对激活区域进行改进的空间控制的方法(M.J.Wirth和H.O.Fatunmbi，“在双光子光谱学中的非常高的可检测性”，分析化学，62(1990)973-976)；尤其是，Wirth讲授了使一种使用一个显微镜的成像系统在目标分子试剂的激发中获得极高的空间选择性的方法。
Denk等进一步地应用了类似的控制方法(W.Denk,J.P.Strickler和W.W.Webb，“双光子激光显微术”，美国专利第5,034,613号)，他讲授了一种利用非线性激光激发在细胞或亚细胞规模上对各种分子荧光试剂的光激活过程进行内部的高度三维控制的特殊的从上面照明的共焦激光显微镜。但是，Denk专注于显微术，其中一部显微镜被用来观察载玻片上的样本。这部显微镜被用来激发被添加到生物样品中的、形成一种光密介质的分子荧光试剂，在Denk看来，从激光器向下行进的光是作为被一面镜子反射到一个目标平面的结果。然后，荧光将沿着同一条光路反向行进，通过一个物镜，一系列的镜面，最后(到达)一个光电倍增管。因此，光仅仅聚焦到一个载玻片的该目标平面上并反射回来。非线性双光子激发被用来从实质上限制激发以及随后的荧光信号的检测，该荧光信号产生于一个物镜焦点处的一个共焦区域，由此，通过准确地控制焦点的深度使三维成像的对比度得以改善。通过使用一种从上面照明的配置，由该激发物镜收集所发出的荧光。通过控制光激发而产生的处于细胞和亚细胞水平上的基于照明的诸图像被显示于安装在一个镜台上的目标样本之中。而且，Denk讲授了这种显微镜方案的一个主要好处是，基于用损伤较小的近红外激发辐射来替代紫外激发辐射，减少了位于该焦平面上的由光诱发的坏疽。
在Denk等人后来的工作中(W.Denk,D.W.Piston，和W.W.Webb，“在激光扫描显微镜中的双光子分子激发”，载于生物共焦显微镜手册，第二版，J.B.Pawley编，Plenum出版社，纽约，1995，第445-458页)，讲授了一种用于收集从双光子激发荧光标记物产生的显微图像数据的外部全面积检测方法。这种被作者称为“迄今尚未试验过”的方法，不需要采用从上面照明的方法(见第452页)来收集反向散射的荧光。Denk指出，若该显微镜的物镜不让所发出的荧光波长通过，则这个方案可能是有用的，但它“易受到室内的环境光线的污染的影响”。在这项工作以及Denk早期的专利(第5,034,613号)中，尚未见到用于或参与降低来自环境光线或来自散射的激发光的背景干扰的明显的方法。
事实上，双光子激发过程的众所周知的低效率可以转化为散射的、不吸收的激发光对荧光发射的一个非常高的比值。使用各种用以降低来自散射的激发光，以及来自环境光线和来自其他环境的与仪器的背景噪声源的干扰的调制方法已有许多先例。在双光子激发荧光这个领域中，Lytle和他的同事(R.G.Freeman,D.L.Gilliland，和F.E.Lytle，“正弦调制的双光子激发荧光的二次谐波检测“，分析化学，62(1990)2216-2219；以及W.G.Fisher h1 F.E.Lytle，”空间滤波的双光子激发荧光的二次谐波检测“，分析化学，65(1993)631-635)讲授了通过使用二次谐波检测方法来抑制散射的激光器激发光的各种巧妙方法：当用一种频率进行激发光的正弦调制，并在两倍于该频率(这就是该激发调制频率的二次谐波)的频率上进双光子激发荧光的检测时，来自散射的激发光的各种干扰实质上被消除。并且通过适当地选择该调制频率以避免电子的和其他噪声频率(的干扰)，就能使对仪器的和环境的干扰的抑制能力达到极高的程度。
因此，众所周知，在实验室条件下，可以在波长约为线性单光子激发所用波长的两倍的条件下，用双光子激发的荧光去激发分子荧光团，并且，众所周知，由此实现的激发可以改进对激发部位的三维空间控制，可以减少由于激发光在光密介质中的吸收与散射而产生的干扰，以及减少沿着激发路径对经受显微镜观察的活细胞样本的附带损伤。
然而，被所列举的这些例子证明了的现有技术的实质清楚地说明了各种能用于诊断以及用于其他活体显微镜成像的光激活方法具有许多有吸引力的特征，一种以前从来没有被讲授过的用以获得一种或多种分子试剂的选择性光激活的通用方法，其高度的空间控制(能力)能满足医学诊断界多种多样的需求。具体地说，以前一直未讲授过可在医学诊断应用中有意义的尺度上达到这类控制的实用方法。
因此，本发明的一个目的是，提供一种通用方法，它以高度的空间控制(能力)对一种或多种分子试剂进行选择性的光激活。
本发明的另一个目的是，提供这样一种方法，它能满足医学诊断界多种多样的需求。
本发明的又一个目的是，提供一种实用的方法，用以实现对医学诊断应用有意义的尺度进行控制。
考虑到上述的和其他的诸目的和诸优点，本发明一般地提供一种用于对植物或动物组织的一个特定体积进行成像的方法，其中该植物或动物组织含有至少一种光活性分子试剂。本方法包括下列诸步骤：用光来处理该植物或动物组织的特定体积，上述光足以使得包含在该植物或动物组织的特定体积中的光活性分子试剂进入双光子同时激发状态，对处于该植物或动物组织的特定体积中的至少一种光活性分子试剂进行光激活，由此产生至少一种已被光激活的分子试剂，其中该至少一种已被光激活的分子试剂发射能量，检测由该至少一种已被光激活的分子试剂所发射的能量，并产生一个已检测的能量信号，它是该植物或动物组织的特定体积的特征所在。本发明还提供一种用于(某种)材料的一个特定体积的成像方法，其中该材料含有至少一种光活性分子试剂。
在本发明的一个优选实施例中，足以使至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光是激光。同样被推荐的是，足以使该光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的这种光是一束聚焦光束，并且更加受推荐的是，该聚焦光束是已聚焦的激光。
本发明的另一个优选实施例还包括用至少一种光活性分子试剂来处理该材料、植物或动物组织的第一步骤，其中该材料、植物或动物组织的特定体积保留该至少一种光活性分子试剂中的至少一部分。更加被推荐的是，该至少一种光活性分子试剂是从下列各种光活性分子试剂组成的组中选出的：它们是：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基补骨脂素〔8-MOP〕,4,5’,8-三甲基补骨脂素〔TMP〕,4’-氨甲基-4,5’,8-三甲基补骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素〔HMT〕，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素〔5-MIP〕,3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯并卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯类〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羟苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉单磺酸盐〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸盐〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MpyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁镁〔t4-PcMg〕，氯化铝酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐〔AlPcTS〕，单磺化的铝酞菁〔AlSPc〕，二磺化的铝酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的铝酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的铝酞菁〔AlS4Pc〕，硅酞菁〔SiPcⅣ〕，锌(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isobOSINC〕，锗Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噁嗪鎓盐〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯[a]吩硒嗪鎓盐〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，二氯化三(2,2’-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯-酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-乙酰丙酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰基二氢卟酚e6，以及吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物，以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4’-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)。同样，更加受推荐的是，至少有一种光活性分子试剂是至少一种对在该材料、植物组织或动物组织的特定体积中的特定材料或组织具有特异性的生物性光活性分子试剂，甚至更加受推荐的是，至少有一种生物性光活性分子试剂含有从下列各种光活性分子试剂组成的小组中选出的一个片段，它们是：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，碳水化合物受体或复合试剂，脂类受体或复合试剂，蛋白质受体或复合试剂，螯合剂，以及胶囊载体，并且还要更加受推荐的是，至少有一种生物性光活性分子试剂进一步地包括一种当受到足以使它进入双光子同时激发状态的光(的照射)时被光激活的光活性分子试剂的一个片段。
在本发明的又一个优选实施方案中，用足以激励包含在该材料、植物组织或动物组织的特定体积中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该材料、植物组织或动物组织的特定体积的步骤还包括从光源中用一种特定类型的调制(方式)对光进行调制的步骤，由此产生一束已调制光，以及用足以使包含在该材料、植物组织或动物组织的特定体积中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的该已调制光来处理该材料、植物组织或动物组织的特定体积的步骤。同样受推荐的是，本发明还包括对具有该特定类型的调制(方式)的已检测的能量信号进行解调的诸步骤，上述步骤产生一个已解调的能量信号，它是该材料、植物组织或动物组织的特定体积的特征所在。
更加受推荐的是，对具有该特定类型的调制(方式)的已检测的能量信号进行解调的步骤包括，在一个两倍于该特定类型的调制(方式)的频率上，对已检测的能量信号进行解调，由此检出该特定类型的调制(方式)的二次谐波。同样更加受推荐的是，作为该材料、植物组织或动物组织的特定体积的特征的该已解调的能量信号，代表了存在于该材料、植物组织或动物组织之中的至少一种光激活的分子试剂的寿命的变化。
通过以下结合诸附图对本发明的诸优选实施例的详细说明，本发明的上述的和其他的特征和优点将进一步地被人们所知晓，在诸附图中：
图1表示针对线性和非线性光学激发的示例性的诸能级图；
图2表示针对单光子和双光子激发的介于入射功率分布以及激发效率之间的关系；
图3表示一种覆盖着从紫外到近红外光谱区域的动物组织的示例性的吸收光谱；
图4表示一种覆盖着从紫外到近红外光谱区域的动物组织的散射光谱；
图5表示在入射短波长和长波长光时，组织的光学吸收和散射特性的总趋势；
图6对使用单光子和双光子两种激发方法时，在组织中由光学引起的诸激发区域进行比较；
图7表示一种在溶液中的诊断试剂的线性激发的各种典型特性；
图8表示一种在溶液中的诊断试剂的非线性激发的各种典型特性；
图9表示均匀地分布于一个组织模型中的染料分子香豆素480的双光子激发荧光的一张照片；
图10表示均匀地分布于一个肿瘤样本中的染料分子香豆素480的双光子激发荧光的一张照片；
图11表示用于使内源性的或外源性的诸成像试剂成像的本发明的一个特定的优选实施例的一张图；
图12表示用于使内源性的或外源的诸成像试剂成像的本发明的一个变通的优选实施例的一张图，其中使用调制来改善成像性能；以及
图13表示用于诸表面特征的视频图形成像的本发明的第二个变通的实施例的一张图。
在这里被说明的本发明利用诸分子试剂的非线性光学激发的独特的物理特性去实现对这些试剂的光激活的改进的空间控制。此外，已经表明，非线性光学激发在医学诊断试剂和其他试剂的光激活过程中还具有一些优点，包括：减少附带的激发以及沿着激发路径的损伤，减少在有害的光波波长中的暴露，以及减少起源于环绕该被激发的试剂的环境的吸收和散射过程所引起的干扰。
在本次公开中所讲授的本发明的基本的重要性在于使用非线性的、同时的双光子光学激发过程，以高度的空间控制和改进了的穿透深度对一种或多种分子诊断试剂进行远程光激活。这些分子试剂可以是被添加到待观察系统中的各种外源性试剂，或者它们也可以是该系统的内源性成分。示例性的外源性的诊断试剂包括各种补骨脂素类衍生物，而示例性的各种内源性试剂包括各种芳香族氨基酸以及各种核酸。双光子激发在一个约为对应的单光子吸收波长带的两倍的波长下进行。通过将一束光学辐射波束聚焦到一个待观察的样本之上，该诊断试剂可以在一个基本上被限制在该聚焦光束的共焦区域之内的一个位置上被激发。该共焦区域，Zc，被定义为延伸在一段距离2πw0 2/λ之内的区域，这里w0是光束腰部的最小直径，并且λ是该光学辐射的波长。与此相对比，当使用线性激发方法时，激发基本上沿着全部光学路径发生，使得激发的空间定位在很大程度上显得不确定。因此，使用双光子激发过程大大地增加了沿光学路径的激发的分辨率。还有，由于激发是在相对于对应的线性激发过程而言的长波长下进行的，所以激发能量的散射和吸收也大大地减少了。对于厚的、光学上稠密的各种样本，例如人体组织来说，这就意味着双光子激发方法可能达到的深度比使用线性激发方法时可能达到的深度要大得多。由于涉及所发出的光束的原点的空间信息已经被编码并且与该激发焦点相关，因此对从该诊断试剂发出的光不要求无散射地直接被检出或被成像。通过移动这个焦点相对于该样本的位置，就能显现出所发出的光的一个二维或三维图像。还有，通过调制该激发光并在检测装置中使用适当的解调方法，可以显著地改善对散射的激发光以及其他干扰的抑制。
本发明打算主要地用于各种组织的疾病和各种组织的其他特性、例如人的乳腺癌，的活体检测与成像。然而，一旦本发明被充分地公开之后，显而易见，所讲授的方法和装置将会有许多附加的应用，并且，正如Denk等所讲授的那样，这些方法和装置可以应用于双光子激光扫描显微术的领域，以便在这些仪器的性能特性方面获得实质性的改进。为了开始这种充分的公开，复习一下关于线性和非线性光学激发的物理学基础知识将是有用的。
线性与非线性激发的比较-能级图的形成：
图1表示几种线性与非线性光学激发过程的典型的分子能级图。在这种由简化的查布隆斯基(Jablonski)图组成的表示中，垂直方向对应于能量的变化，而水平方向则从左到右表示事件的序列。水平实线表示量子力学上允许的诸分子能级，而水平的虚线则表示不允许的、诸虚拟能级。量子力学上允许的诸分子能级是相当长寿命的，并且一个分子在吸收能量(例如由一个适当能量的光子所提供的能量)时的激发概率是很高的。可以通过各种激发过程来达到诸虚拟能级，但是跟被允许的分子能级跃迁相比，它们只有非常短的寿命(根据海森堡不确定性原理的预测，其量级为10-15秒)，只有在特定激发条件下，它们才会变得显著。在查布隆斯基图中的直箭头表示辐射能量的转移过程：朝上的箭头表示能量的吸收，而朝下的箭头则表示辐射的发射，例如一个光子的荧光或磷光的发射。波浪形的箭头表示非辐射的能量转移过程，例如振动弛豫。该直线的或波浪形的箭头的垂直长度跟在一个给定过程中吸收或发射的能量成正比。
对图1所示的第一份查布隆斯基图来说，在吸收一个具有足够的能量的光子4，使之能直接地引起该分子从一个第一被允许电子能级(通常是最低电子能级，或者基态，表示为S0)到达一个具有一个较高的总能级(在这里表示为S1状态)的第二被允许电子能级8的条件下，就出现单光子激发到一个被允许的能级2的情形。要注意的是，随着它们的能量的增加，通过激发可以到达多个被允许的较高的电子能级，这些能级通常被表示为S1,S2，等等。该名称S1表示一个符合于泡利不相容原理的单态的电子能级，其中所有电子的自旋都是成对的，并且这些成对的电子自旋都是方向相互相反的。对某些电子系统来说，还可能出现一个或多个三个一组的激发态(译者注：以下简称三态)10，在本例中表示为T1。三态与单态的区别在于，除了两个以外，所有的电子自旋都是成对的。每一个被允许的电子能级(单态或三态)可以进一步地被细分为离散的诸振动能级12的一个集合；接着这些离散的振动能级12中的每一个还可以被细分为离散的旋转的诸能级的一个集合。因此，由于大量的可能的振动的和旋转的能态(的存在)，每一个被允许的电子能级，S0,S1,T1，等等，都构成一个由被允许的诸能级组成的一个复合能带。在从一个光子4那里吸收能量时，该分子被推上一个特定的独特的电子与振动能级14，有时被称为一个振子能级。然后该分子从这个激发态出发，经历快速的内部转换16，到达于例如在第二被允许的电子能级8中的被允许的最低激发振子能级18。这种内部转换16典型地是非常快的，它出现在时间标尺上仅为10-12到10-15秒。最后，该受激分子可能经历进一步的弛豫，例如通过碰撞去激活过程20，回到该初始的能级6。可能发生的弛豫过程包括从S1直接地跃迁到S0时出现的一个光子21的荧光发射，以及在系统内部从一个单态跨越到一个三态10之后出现的磷光。要注意的是，从单态到三态的电子跃迁，例如那些表示为S1→S0的那样，构成了量子力学上允许的符合泡利不相容原理的各种跃迁。与此相对比，从一个单态到一个三态10的跃迁，例如S1→T1，由于诸电子自旋不保持成对，所以在量子力学上是被禁止的。然而，对某些分子系统来说，该S1状态的寿命跟这些系统内部恒定的跨越速率常数相比显得相当长，其结果是，内部转换的概率大于0。从该三态10跃迁回到一个单态，例如T1→S0，可以经由被称为一个光子24的磷光发射的辐射过程而发生。由于该过程的不被允许的性质，磷光与荧光相比，其特征通常在于前者具有一个相当长的辐射寿命。单光子激发到一个被允许的能级2的一个例子就是，在400nm波长下，通过一个单光子4的吸收，引起该染料香豆素的分子从一个基电子态跃迁到一个激发电子态，其后跟随着内部转换16，并且接着发生一个光子21在480nm(波长)下的荧光发射。在这个例子中，激发概率跟入射光的辐射功率是线性相关的，因此，单光子激发到一个被允许的能级2，被称为一个线性激发过程。
对图1所示的第二份查布隆斯基图来说，在吸收一个具有不充分的能量的光子28，因而无法直接地引起该分子跃迁到一个更高的被允许的电子能级8的条件下，就出现单光子激发到一个虚拟能级26的情形。或者，该分子被推上一个非常短寿命的虚拟能级30。这个虚拟能级30典型地将具有10-15秒量级的寿命。该被吸收的光子28从这个虚拟能级30出发的基本上在瞬间之内的再发射32将典型地经由例如弹性散射那样的过程而发生。这个过程的一个重要的例子就是用800nm的光激发香豆素时产生的在800nm波长下的瑞利散射过程。另一个例子是当该分子回到与基态相关联的各振动能级时的拉曼散射。在这些示例性的过程中，激发概率也是跟入射光辐射的功率线性相关的，因此，单光子激发到一个虚拟能级26也被称为一个线性激发过程。
对图1所示的最后一份查布隆斯基图来说，在同时吸收两个光子中的第一个36以及两个光子中的第二个38的条件下，出现两个光子同时激发到一个被允许的能级34的情况。在这种情况下，两个光子中的第一个36以及两个光子中的第二个38的组合能量足以引起该分子从一个被允许的第一能级6(跃迁到)一个被允许的第二能级8。典型地，两个光子中的第一个36、两个光子中的第二个38各自的能量不足以直接地引起这个或者任何其他的被允许的电子能级跃迁。相反，两个光子中的第一个36将该分子推上一个寿命非常短的虚拟能级30。这是跟第二份查布隆斯基图所示的能级相同的虚拟能级。在从该虚拟能级30发生再发射32之前，两个光子中的第二个38立即将该分子推上一个第二被允许的电子能级8。这种激发的结果等效于使用线性单光子激发达到一个被允许的能级2时所取得的结果。要注意的是，两个光子中的第一个36以及两个光子中的第二个38可以具有相等的或不相等的能量。同样地，在该虚拟能级30经历弛豫过程32回到初始的第一被允许电子能级6之前，该入射激发光束的瞬时辐照度，或Wm-2，必须相当高，以便在吸收两个光子中的第二个38时产生明显的效率。事实上，由于虚拟能级30的寿命仅为10-15秒的量级，所以通常使用具有非常高的峰值功率的诸脉冲激发源，以便有效地促进这些过程；由于这些激发源在该虚拟能级30的短促的寿命中能向该受激分子提供大量的光子，所以这样的激发源通常是优先的。一旦该分子已经被推上第二被允许的电子能级8，它随后经历快速的内部转换16，其后跟随着进一步的弛豫过程，例如通过碰撞去激活过程20，一个光子21的荧光发射，或者系统内部跨越22到达一个三态10。在最后一种情况下，经由一个光子24的磷光发射，从三态10返回到单态的基态6的跃迁可能发生。值得注意的是，双光子的同时激发具有到达于一个允许的能级2的单光子激发以及到达于一个虚拟能级26的单光子激发二者的诸特征，特别是，一个虚拟能级30在将该分子从基态推上激发态的过程中起着一种关键的作用，并且一旦被推上一个激发能级，该分子将经历跟到达于一个被允许的能级2的单光子激发所导致的结果相同的光化学和光物理过程。双光子同时激发过程的一个例子就是通过同时吸收波长为800nm的两个光子并随后发射一个波长为480nm的荧光光子，将该染料香豆素分子从一个电子基态推上一个电子激发态。由于众所周知的对瞬时光子辐照度的平方依赖性，到达于一个被允许的能级50的双光子同时激发也被称为一个非线性激发过程。线性与非线性激发过程的显著差别将在下一节中加以鉴别。
要注意的是，除了图1所示的示例性的诸能级图以外，许多其他的各种能级跃迁过程以及各种能级状态都是可能的，这取决于许多因素，包括分子系统的诸特性，它的环境，在能量的吸收和释放形式下的特定的能量，以及它们的时间和空间的相互关系。一旦一个分子已经被激发到激发态，就可能发生各种物理的或化学的过程，包括一个光子的发光发射，光化学转换，例如异构化或氧化，或光致电离。重要的是，正是该激发态的基本特性以及它的环境决定了该分子的最终结局。由于激发过程本身不会直接地影响该受激分子或者它的环境，所以一旦激发以后，负责将该分子推上激发态的那种机制对这个结局没有明显的影响。因此，一种在单光子激发条件下工作得很好的分子诊断试剂，可以期待在双光子激发条件下也显现出类似的特性。
线性与非线性的比较-功率依赖性和空间效应：
当光与一个分子系统相互作用时，它引起一个极化过程，该极化过程正比于线性磁化率与所施加的电场强度的乘积。若这个电场很强，则该系统变得难以描述，并且在所引起的极化的描述中，应当包括高阶的诸交互项。双光子的同时激发被称为一种非线性过程，这是因为它出现在来自两个光子的电磁场通过这些高阶项，特别是三阶磁化率的虚部x(3)”，合并到一起，以便引起一次电子能级跃迁的时候。这是描述双光子同时吸收的非线性的另一种方法。那就是，该分子系统非线性地响应该强电磁场。与此相对比，单光子激发过程可以用线性磁化率来描述，并且该激发过程与激发功率成正比。要注意的是，双光子同时激发的截面典型地比一次等效的单光子激发过程的截面大约小十万倍。这是由于在虚拟能级的极端短促的寿命时间内，两个光子同时跟一个分子进行相互作用的概率是很低的。但是，能够提供极高的峰值功率的光学激发源(例如各种锁模激光器)的可用性，通过增加瞬时入射功率并由此显著地提高双光子同时激发的效率，基本上能够改善这种低效率的影响。例如，当使用连续波激发时，对一个特定的分子系统来说，双光子激发的效率可以比单光子激发时所得到的效率低十万倍。然而，若以一系列非常短的脉冲的形式发出同样的平均光功率，则该峰值与平均功率的乘积的偏移将改变这个比值，使得它接近于1。
可以使用双光子同时激发的非线性性质来获得双光子同时激发与线性激发相比在空间激发特性上的重大差异。例如，图2表示当一束激光束46被聚焦48到一种材料50之上时，单光子激发效率曲线40以及双光子同时激发效率曲线42之间出现了显著的差异，二者之间的差异程度是该激光束亮度曲线44的一个函数。这种材料50可以是装在透明小容器52的两壁之间的一种激光染料溶液。这种材料50的另一个例子可以是人的皮下组织。用一块透镜54对激光束46进行聚焦48产生一束光束亮度曲线44，正如根据古典高斯光学理论所预测的那样，上述曲线44作为一个通过该样本的距离的函数而发生改变，在焦点56的中心处达到最大值。对于一个单光子过程来说，介于光束亮度(或者入射功率)以及激发效率之间的线性关系导致一单光子激发效率曲线40以线性规律跟随着光束亮度曲线44而改变。与此相对比，对于双光子同时激发过程来说，介于光束亮度(或者入射功率)以及激发效率之间的非线性关系导致一双光子同时激发效率曲线42跟随着光束亮度曲线44的平方而改变。因此，当使用双光子同时激发时，可以利用对激光束46的聚焦48将激发范围基本上限制在一个小的焦点区域，或共焦区域内。与此相对比，当使用线性激发时，基本上沿着整个光路产生激发，使得激发的空间定位在很大程度上显得不确定。
线性与非线性激发的比较-吸收与散射效应：
双光子同时激发的截面可以比在单光子激发下所看到的小很多，在许多情况下，由于较长波长光辐射具有较低的基质吸收和光散射，因此，使用双光子同时激发比使用单光子激发可能更有利。例如，图3表示动物组织，例如人的真皮或肝脏的吸收光谱，它覆盖着从紫外(UV)到近红外(NIR)的光谱范围。图4表示动物组织，例如人的真皮或肝脏，在类似诸条件下的散射光谱66。具体地说，图3说明，诸高能光子60(例如那些用于诊断试剂的线性激发的诸光子)，跟诸低能光子62(例如那些用于诊断试剂的非线性激发的诸光子)相比，经受多麽大的组织吸收。例如，人的皮肤强烈地吸收在400nm下的诸高能光子60，但对于在800nm下的诸低能光子62则是相对地透明的。这是由于皮肤中的各种色素、各种蛋白质以及各种遗传物质，以及其它各种自然成分，对具有紫外光或可见光诸波长的诸高能光子60进行相当高的自然吸收的结果。还要注意到介于诸激发能量以及该诊断试剂的发光波长64之间的关系。不管使用诸高能光子60或者使用诸低能光子62来激发该试剂，其发光波长64将对应于由该试剂所决定的能量，而与施加于该试剂的那种激发方法无关。图4进一步说明诸高能光子68与诸低能光子70相比，前者可能要经受多麽大的组织散射。任何一种光密介质，例如人的皮肤，都将在可见光或紫外光的各种波长上，例如400nm，强烈地散射高能光子68，但在近红外(NIR)或红外(IR)的各种波长上，例如800nm，呈现出针对低能光子70的很弱的散射。请注意，正如前面在图3中所示的那样，图4表示该诊断试剂的发光波长72将典型地落在诸高能光子60以及诸低能光子62的波长之间。
在光学特性上的这些差异具有若干重要结果。首先，(机体)组织对波长较短的诸高能光子60的吸收可能导致不希望有的组织损伤。与此相对比，即使在该近红外光的光功率比紫外光或可见光辐射的功率大许多倍的情况下，在诸低能光子62(例如近红外光)的辐射下，所受到的各种影响都可以忽略不计。其次，(机体)组织对诸高能光子68的固有的高吸收和散射可能导致非常浅的组织穿透深度，而诸低能光子70通常具有更大的穿透深度。由于散射的诸高能光子60将引起诊断试剂沿着它们的散射路径发光，所以准备穿透组织的诸高能光子60倾向于产生一个沿着与激发路径相垂直的方向而延伸的漫射的发光区域；但由于对双光子激发的平方依赖关系，采用低能光子62的辐射将产生一个被更准确地限定的激发图形，它并没有因为散射的低能光子62的出现而被明显地弄模糊。因此，当使用例如那些处于紫外光或可见光光谱区域之内的高能光子68时，照明以及随后的诸表面下特性的检出就是困难的或者是不可能的。与此相对比，当使用例如那些处于近红外或红外光谱区域之内的低能光子70时，照明以及随后的诸表面下特性的检出就容易得多。还要注意到，从该诊断试剂发出的光可以被待观察的该组织或者其他光密介质高度地吸收和散射。然而，为了满意地检测所发出的光，仅需将这种光的一小部分送往一个检测器。所发出的光的散射范围越大，就意味着越需要使用各种巧妙的方法，才能从散射光以及其他光学的或仪器的噪声源中将被激发的试剂所发射的光区分出来。后一种考虑将成为下文的论题。
图5概略地表示高能和低能光在吸收和穿透深度特性方面的重大差别。当紫外光或可见光74，例如波长为400nm的光，照射到人体组织之上时，在其最外层82，例如表皮和真皮，大部分光能将被立即吸收78和散射80。由于在这种组织76的诸细胞中的某些分子(例如在细胞核中组成遗传物质的那些)的激发可能导致吸收78，并且在产生吸收78的部位上的诸细胞中，可能引起多种附带的光化学变化。这些附带的光化学变化可能含有不可逆的基因损伤并且诱发癌。因此，对于使用紫外光或可见光74(例如通常用于诊断试剂的线性激发的那些)来说，光学穿透深度较浅，并且诱发附带损伤的可能性较高。与此相对比，近红外或红外光84，例如波长为800nm的光，在组织76中所经受的吸收和散射80就小得多。其总的穿透深度将更深，并且对诸细胞的附带的损伤范围实质上将缩小。因此，若在双光子激发过程中使用长波长激发光来代替较高能量的单光子激发，则有可能使用相对地无损伤的具有高穿透深度的诸波长，对存在于深部组织中的特定诊断试剂进行光激活。
而且，在使用近红外光的条件下，与固有的无损伤性质和高的穿透深度相结合，示于图2的非线性激发的显著特性具有附加的含意。例如，图6针对存在于一块皮下肿瘤90之中的成像试剂，对单光子激发86以及双光子同时近红外激发88所期望的穿透深度和空间定位特性进行比较。单光子激发86产生一个基本上沿着整个光路延伸并且没有显著的特异性的激发区域92。要注意的是，由于吸收和散射，使得单光子激发86的效率将沿着该光路发生变化，在靠近光辐射的引入点处为最高94，并且沿着该光路迅速地降下来96。还要注意到，诱发附带的光损伤的可能性也具有这种相同的趋势。因此，单光子激发产生一个延伸的激发区域92，它不能被有效地限制在一个有限的体积之内，特别是在深层组织中。同样地，在所有的周围组织98中，都可能出现明显的附带损伤，特别是在表层组织100中。若该单光子激发86被聚焦，则在其焦点102处，激发区域92将有所增强。然而，要注意的是，若用于单光子激发86的紫外光或可见光在到达该肿瘤90之前已被明显地吸收或散射，则这个激发区域92甚至无法延伸到该肿瘤90(所在的位置)。与此相对比，使用近红外双光子同时激发88将产生一个被精确地限定的远方激发区域104，作为这种激发方法的内在的非线性特性的一个结果，上述激发区域104基本上被定位于焦点106处。而且，由于对近红外光的吸收有所降低，其对周围组织98，特别是对表层组织100的附带损伤被减到最小。并且作为对近红外光的低吸收和低散射的综合结果，跟那些使用紫外光或可见光诸波长的情况相比，有可能有效地探测到更深的深部位置。
各种典型的诊断成像试剂的线性和非线性激发的实例：
一种在溶液中的诊断试剂的线性激发示于图7。在这个实例中，波长为442nm的激光辐射被用来激发染料分子FITC在甲醇中的稀溶液。从一个连续波氦-镉激光器发出的激光束通过一个20倍的显微物镜被聚焦到装有该染料溶液的一个透明小容器上，并且在该染料中激起一个漫射的、延长的发光图形。这个实例清楚地表明，沿着整个光路出现发光，并且由于散射激光对该染料的激发而环绕着原始激发路径出现了一个漫射的光晕。与此相对比，图8表示使用双光子同时激发的一种诊断试剂的高度定位的远程光激活。在这个实例中，波长为730nm的激光辐射被用来激发染料分子香豆素480在甲醇中的稀溶液。具体地说，以78MHz的脉冲重复频率、在一个直径约为1mm的光束中，发出波长为730nm、光脉冲(宽度)短于200fs的连续序列的锁模钛兰宝石激光器的近红外输出，通过相同的20倍显微物镜被聚焦到一个装有该染料溶液的透明小容器上。图8清楚地表明，来自该染料分子的荧光响应被限制在该近红外光束的焦点处。由于双光子激发以及瞬时激光功率之间的平方关系，使得沿着该激发路径在焦点之前和之后的诸位置上的激发变为可忽略不计。同样，虽然在这张照片上，环绕该发光区域可以看到由于照相底片的过分曝光导致少许伪迹，但是仍然观察不到光晕的存在。
图9说明存在于一种光密介质中的一种诊断试剂的高度定位的远程光激活。这里展示一张照片，表示均匀地分布于含有一块琼脂糖凝胶的组织模型之中的染料分子香豆素480的双光子激发荧光。以78MHz的脉冲重复频率、在一个直径约为1mm的光束中，发出波长为730nm、光脉冲(宽度)短于200fs的连续序列的锁模钛兰宝石激光器的近红外输出，用一个扩散光束的望远镜将其扩散，以便产生一个直径约为50mm的准直光束。然后使用一块100mm焦距、50mm直径的双凸单玻璃透镜，将这个已扩散的光束聚焦到该凝胶块上。然后，该凝胶块被这样定位，使得这个100mm焦距的透镜的焦点落在深入该块内部40mm的一个位置上。图9清楚地表明，只有在该近红外光束的焦点处才激发出来自香豆素480的荧光响应。由于介于双光子激发以及瞬时激光功率之间的平方关系，使得沿着该激发路径在焦点之前和之后的诸位置上的激发变为可忽略不计。因此，在焦点区域以外，可能出现的激发或导致损伤的附带的光激活很小，甚至没有。同样，由于该近红外激发光在该凝胶中仅受到微弱的散射，使得在该凝胶块内部很深的穿透深度上，仍能保持清晰的焦点。要注意的是，该焦点的清晰度取决于高斯光学特性；因此，通过改变用于光束扩散以及其后的重新聚焦的光学参数，就能很容易地调整共焦区域的长度。
如图10所示，若将一个等效的激发过程施加于一个加有标记的肿瘤样本，则也能得到类似的结果。这里展示一张照片，表示均匀地分布于一块小鼠癌变组织中的染料分子香豆素480的双光子激发荧光。如图9所示，图中说明了一个被严格地定位的激活部位，即使该样本具有极端高的光学密度。
用于诊断成像试剂的双光子激发的激发源：
双光子同时激发的截面积相当小，典型地它比一次等效的单光子激发过程大约小10万倍，这就意味着典型地应当使用各种特定的光学激发源，以便有效地激发各种诊断试剂。通过增加瞬时入射功率并保持适度的平均功率水平，就能使用能提供高的峰值功率的光源，以便从实质上改善这种低效率的影响。事实上，准连续波锁模激光器，例如锁模钛兰宝石激光器，对于激发在光密样本(例如生物组织)中的分子诊断试剂来说是很理想的。具体地说，这样的激光器能提供超过10kW的近红外峰值功率，但其形式为非常高的重复频率(＞25MHz的脉冲重复频率)，超短(≈200fs的脉冲宽度)，低能量(每个脉冲≈1nJ)的脉冲系列；将平均激光功率(约为10mW到2W量级)分割为高频的超短脉冲系列产生一束激发光束，它对于激发双光子荧光是极其有效的，但对各种生物材料基本上是无害的。锁模的或其他高重复频率的激光器的准连续输出跟各种调制方法也是高度兼容的，特别是在调制频率大大地低于该激光器的脉冲重复频率的情况下，因为在后继的解调过程中，该光源的脉冲性质可以被忽略。
锁模钛兰宝石激光器的一个特例大约从690nm到1080nm的波长范围内连续可调，这很好地符合于对生物样本而言的一个最小散射与吸收的区域。在这个波长范围内的双光子吸收也符合于这样一个重要的单光子吸收区域，对许多可能的诊断成像试剂来说，是从345nm到540nm；尽管双光子的选择规则有时跟单光子的选择规则很不一样，但对单光子过程的强烈吸收可能预示着在波长为单光子波长的两倍处，会出现显著的双光子吸收。
很明显，除了锁模钛兰宝石激光器以外，各种其他的光源也可用于激发诊断成像试剂。尤其重要的是二极管激光器，Nd:YAG和Nd:YLF激光器，以及光参数振荡器、放大器和发生器。脉冲二极管激光器以其极端高的运行效率提供了诱人的性能，并可用于多种近红外波长。锁模的Nd:YAG和Nd:YLF激光器分别在1064以及1047或1053nm的波长上，提供一种用以产生近红外激发光的有效的、可靠的装置。锁模的光参数振荡器、放大器和发生器能产生覆盖着从大约500nm到大于3000nm的波长带的光辐射；波长从1000nm到1800nm的可用性提供了一种实用装置，它使用处于格外低的组织散射和吸收的波长带内的光来激发诸诊断试剂，并且对于激活各种近红外诊断试剂(即，那些具有超过500nm波长的单光子吸收带)是特别有用的。同样，其他各种脉冲的或锁模的激光器也都具有实用性，包括：氩离子激光器；氪离子激光器；氦-氖激光器；氦-镉激光器；红宝石激光器；Nd:YAP，Nd:YVO4，Nd:Glass以及Nd:CrGsGG激光器；再生放大激光器；Cr:LiSF激光器；Er:YAG激光器；F-中心激光器；Ho:YAF与Ho:YLF激光器；以及铜蒸气激光器。也可以使用各种连续波激光器，但与使用脉冲激光器时所获得的效率相比，前者的效率是很低的。
来自诊断成像试剂的双光子激发发光的检测：
来自一种双光子激发诊断成像试剂的涉及该发光原点的空间信息由该激发焦点进行编码，并且可能与该激发焦点相关。这跟单光子激发成像方法包括那些基于光子迁移的方法在内相比是完全相反的，在单光子激发成像方法中，应当从沿着整个激发路径产生的发光中，以及从散射的激发光所产生的发光中，小心地分离出该诊断成像信号。因此，对于从双光子激发诊断试剂发出的光来说，没有必要直接地和无散射地被检测或成像。事实上，仅需以这样一种方式来收集和检测这种已发射的光的一部分，使得该收集和检测过程不致于使介于检测信号和发光原点之间的相关性发生畸变。
为了了解介于信号检测以及双光子激发发光原点之间的关系的重要性，考虑紧接着发光瞬间之后，所发出的光遇到什么情形是有用的。当在一个光密样本(例如生物组织)中成像时，来自双光子激发诊断成像试剂的光将以一种基本上各向同性的方式发射出去。所发出的光的某些部分将直接地行进到安装在远离发光点处的一个检测装置那里，与此同时，作为在发光和检测之间出现的一个或多个散射事件的一个结果，某些其他部分将沿着一条迂回的路径行进到该检测装置。如果打算在一块生物样本中深度为10cm处成像，对于一个无散射的，或者弹道的已发射的光子来说，其渡越时间(这就是说，从发光瞬间算起到从该样本的一个表面退出为止的总的渡越时间)将约为0.3ns；对于一个高度地散射的已发射的光子来说，这个渡越时间可以高达3-10ns。因此，为了得到在本例中的最高效率，人们希望在一段足以俘获多数或全部的弹道的和高度散射的诸光子的时间内，对所有的已发出的光进行积分。这就意味着对于深度在10cm以内的成像来说，一个大约10ns的积分周期将是适当的，
若通过移动或扫描该激发焦点相对于该样本的位置来产生一幅图像，则前面的分析意味着该激发点不应当以短于每10ns一次的频度被移动。事实上，对扫描过程和机制的实际限制，结合涉及最小延迟时间以及附加的诸调制方法的可能应用的信噪比论点，要求使用超过1μs的延迟(dwell)时间来进行扫描。这样一来，对于使用超过1μs的延迟时间以及1MHz以下的可能的调制频率的基于亮度的成像来说，只要该检测器被这样放置，使得它能收集到该弹道的和散射的发光的一个重要的部分，那末它被定位于何处都没有什么差别(选择检测器相对于发光原点的位置，由此确定由于光学延迟所引入的时间长度，由于相对于其他测量参数来说，其渡越时间是很短的，所以对该检测信号跟它的原点互相关联的能力没有什么影响)。相应地，很明显，该检测器应该这样来定位，使得它包括一种用该激发光束从外面照明(epi-illumination)的配置，或者它可能从外部被定位于该激发光束。要注意的是，该从外面照明的配置(或者其他各种可能的共线性激发与检测配置)在检测表面的或近表面的诸目标时，能将可能的视差损失减到最小，但这样一种配置更容易受到来自弹性散射光或反射的激发光的干扰。在外部检测配置中，通过主动地对该检测系统进行定向，使之与该激发点保持对准，通过使用多个检测器的组合，其中每一个检测器都个别地进行优化，以便从该样本内部的不同区域收集所发出的光，或者通过将该检测系统定位于离样本足够远的地方，使得视差损失为最小，通过采取以上这些措施，可以使视差损失减到最小。
关于对来自双光子激发诊断成像试剂的发光的检测的讨论已经集中到基于亮度的诸方法这一点上来，其中，通过将被检测到的发光亮度跟一个样本中的多个激发点中的激发位置互相关联，就能建立一幅图像。然而，基于亮度的诸方法并不总是最佳的，因为它们容易受到多种复杂化因素的影响，包括：
●由于样本中的异质性使得激发光的散射与吸收发生变化-异质性，例如定位于该激发源以及预期的激发点之间的不正常的光学密度，可能转化为在该预期的激发点上的有效激发水平中的不可预测的差异。通过沿着在不同程度上受到这种异质性的影响的若干激发路径来获得数据，随后从所得到的多个数据集中进行反卷积滤波，可以改善由这种现象引起的各种伪迹，但对某些样本来说，这将是困难的或者是不可能的。
●由于样本中的异质性使得激发光的散射与吸收发生变化-异质性，例如定位于该发光点以及该检测系统之间的不正常的光学密度，可能转化为对从该激发点发出的光的收集效率的不可预测的差异。通过沿着在不同程度上受到这种异质性的影响的若干收集路径来获得数据，随后从所得到的多个数据集中进行反卷积滤波，可以改善由这种现象引起的各种伪迹，但对某些样本来说，这将是困难的或者是不可能的。
●由于跟形式或功能不直接相关的诊断成像试剂在浓度或局部环境方面的变化-在基于亮度的成像系统中，假设在整个样本中发光水平的变化跟该样本中的结构上的或生理学上的组织相关。然而，若该成像试剂在整个样本内没有被适当地分布，或者若其他诸因素，例如在该样本内的局部环境中的异质性，以一种不能跟形式或功能相关的方式影响该成像试剂的发光，则从该样本中获得有意义的数据就变得更为困难。通过使用或通过设计不易受这些因素影响的成像试剂，可以改善由这种现象引起的各种伪迹，但对某些样本来说，这将是困难的或者是不可能的。
一种不易受到样本的光学异质性的影响的检测方案可能是基于对激发态寿命的变化进行测量，而不是基于对发光亮度进行测量。激发态寿命是一种分子试剂的激发状态及其最接近的环境的一种内在属性，并且幸运地，寿命的精确测量的激发水平和收集效率除最粗大的变化之外不受其它影响。一种用于测量激发态寿命的简便装置使用相位光度计方法，以便将介于一个受调制的激发源以及所得到的发光信号之间的相位移跟寿命互相关联。具体地说，前面关于光子渡越时间的讨论意味着相位光度计方法适用于在光密介质中成像，尤其适用于寿命超过1-10ns的各种试剂。因此，若所用的诊断成像试剂具有跟该样本内部的形式或功能相关的发光寿命，例如在一种结构内部存在氧或一种成像试剂的浓度时，会使该成像试剂的荧光淬灭，则基于寿命变化而不是基于发光亮度的成像就成为实际可行的。这样一种基于寿命的方法对于激光扫描显微术以及对于延长的目标(例如一个病人的肿瘤)的远程成像，都具有同等的适用性。
用于转换亮度或基于相位的发光数据的适当的收集器件包括，但不局限于，光电倍增管，微通道平板器件，光电二极管，雪崩光电二极管，电荷耦合器件和电荷耦合器件阵列，电荷注入器件和电荷注入器件阵列，以及照相胶卷。
用于从诊断成像试剂中恢复双光子激发发光的隆噪方法-调制与二次谐波检测：
双光子激发过程所固有的低效率可以转化为散射的、不吸收的激发光对双光子激发荧光发射的一个非常高的比率。而且，归因于这个非常高的激发水平的其他可能的线性干扰的重要性包括以下因素：该试剂或者存在于待观察样品内的其他种类的单光子激发荧光，拉曼散射，以及其他现象，此外还有消除从环境光以及其他光学的或电子的噪声源中各种干扰的需求，所有这些都表明，一种受调制的激发方法，结合该检测器信号的适当的解调将提供对干扰的最佳鉴别，并改进对分析信号的恢复。事实上，若采用合适的调制和解调方法，包括在该激光器的脉冲重复频率上进行解调，则由Denk等人(见美国专利第5,034,613号)所报道的来自背景噪声的干扰可能被大大地免除；使用这样的方法将显著地改进他们的显微镜的信噪比(SNR)性能。一般来说，对实际上的采用一种或多种方法的任何测量来说，调制可以改进检测性能：
(1)抑制连续背景噪声或噪声源-在Denk的双光子激光扫描显微镜的实例中，使用一种诸如锁定放大器(LIA)或者一种外差式解调器的装置，对激发源进行调制，并在其后对该检测器信号进行解调，将对检测系统产生限制，使其响应于与该调制频率紧密相关的一个频带。通过控制该解调过程的相位灵敏度，将对那些不联系于或紧密地匹配于该调制模式的诸信号产生附加的鉴别力。因此，通过适当选择调制频率以及解调相位，来自诸如处于特定频率上的室内灯光或电子噪声，例如来自附近的电动机，的噪声源的干扰，将受到强有力的抑制。这个方案对于延长的诸目标(例如一个病人体内的肿瘤)的远成成像，也是同等地有效的。
(2)抑制宽带或“粉红色噪声”源-该测量环境，以及用于任何测量的电子设备和其他装置，将宽带噪声，有时被称为粉红色噪声，加入到任何测量。通过使用限制带宽的检测方法，就能大大地减少这种内部噪声的影响。具体地说，对一次给定的光学测量来说，被观测的信号电压VSIGNAL被联系于由光子跟一个检测器交互作用而产生的一个检测器输入电流iINPUT乘以输入阻抗ZINPUT以及该检测系统的增益G，根据下列公式：
VSIGNAL=iINPUT·ZINPUT·G,
                                     (1)
而被观测的噪声电压VNOISE，可以近似地表示为该噪声电流iNOISE，该输入阻抗，该检测系统的电子的或光学的带宽B的平方根，以及该增益的乘积，根据下列公式：
VNOISE=iNOISE·ZINPUT·B1/2·G.          (2)
由此，可以从这两个电压的比值(VSIGNAL/VNOISE)来估计信噪比(SNR)。当一个典型的光学检测器，例如一个光电倍增管(PMT)，被用来检测一个未调制的荧光信号时，这个检测器将产生一个确定的信号电平，此外还有一个噪声电流。对一个示例性的PMT来说，例如型号为Hamamatsu R928这一种(7.4×105A/W辐射阳极灵敏度)，一个10pW水平的光输入将产生7.4μA的iSIGNAL。若这个信号电流在一个具有一个100的增益，一个50Ω的输入阻抗，一个5 nV/√Hz的输入噪声电平，以及一个1MHz的带宽的低噪声放大器中被转换为电压，则将产生下列诸信号：
   VSIGNAL=7.4μA·50Ω100=37mV；
   VNOISE=5nV/√Hz·(107Hz)1/2·100=1.6mV.
要注意的是，已经用公式2所示的噪声电流和阻抗来代替欧姆定律，或V=i*R。因此，对这个宽带的实例来说，SNR=23。若这个激发能量受到调制，例如采用1MHz的正弦波并具有一个100％的调制深度，则该VSIGNAL的数值将降低到18.5mV(假设通过周期的衰减或其他基于损耗的调制方法来引入这种调制，导致平均功率的总损耗为50％，而峰值激发功率不变)。但若该检测系统采用具有1kHz带宽的在1MHz频率上的限制带宽解调方法，则该粉红色噪声的减小比信号快很多：
  VNOISE=5nV/√Hz·(103Hz)1/2·100=16μV，
并且总的信噪比(SNR)增加到大约1200。因此，当使用多种调制方式时，虽然损失了某些信号强度，但是在信噪比方面总的增加用来补偿这个损失已显得绰绰有余。还有，若在该检测器的响应中存在任何线性干扰，例如来自漏到该检测器的环境光，则该宽带检测方案将把这个当作一个附加的噪声源加以检测，而该受调制的、限制带宽的方案将抑制这种干扰。假设环境漏光在PMT上产生1μA的背景信号，它转化为5mV的背景信号。对于未调制的情形来说，来自这个背景的光学散弹噪声B，等于被检测到的总光子的平方根，并且SNR≈S/(S+B)1/2；这产生一个约为5.7的SNR估计值。值得注意的是，这个信噪比数值对于受调制的情况基本上是不变的。这个分析对于激光扫描显微术以及对于延长的诸目标(例如一个病人体内的肿瘤)的远程成像，都是同等地有用的。
(3)在调制频率上抑制线性干扰-作为双光子激发过程所固有的低效率的一个结果，散射的、不吸收的激发光对双光子激发荧光发射的比值通常很高。这包括在该调制频率上的线性干扰，它们来自弹性的和非弹性的散射，也来自单光子激发荧光。在用频谱方法将双光子发光从这些光学背景现象中区分出来的努力中，光学过滤器(滤色镜)被频繁地使用。不幸的是，单纯地使用频谱方法，要消除这些干扰是格外困难的，甚至是不可能的。作为一种忽略这些残留的干扰源的变通方案，一种用于恢复纯粹双光子信号的常用方案，利用在几种激发功率水平上该检测信号对激发功率水平的回归，使得可以用数学方法从各种线性干扰中抽取该二次的双光子激发荧光分量；这里利用了一个总荧光响应If的模型，它由下式给出：
    If=αIL+βI2 L                   (3)
式中，IL为瞬时激发亮度，α为针对各种线性效应的一个比例常数，β为针对双光子激发荧光的一个比例常数。这种基于回归的方法适于在实验室使用，在那里每单位时间所需进行测量的次数是很少的，但例如在多点扫描光学成像的情况下，它就显得很费时、复杂和不实用，因此总的数据采集时间应当减到最小。通过使用时间抑制方法，例如二次谐波检测，它不需要在几种功率水平上进行多次测量，这样就能得到更快的结果。Freeman等人(R.G.Freeman,D.L.Gililand以及F.E.Lytle，“正弦调制的双光子激发荧光的二次谐波检测”，分析化学，62(1990)2216-2219)讲授了用于化学样本分析的二次谐波检测方法，其中，该激发源的正弦调制被用来产生一个仅跟双光子激发荧光有关的、频率为调制频率两倍的信号。一个参考于该调制频率的锁定放大器被用来在该调制频率的二次谐波上恢复该纯粹的双光子信号。该二次谐波荧光信号仅占所产生的全部双光子荧光的大约12％，改进了的对线性干扰的抑制用来补偿绝对信号电平的损失是绰绰有余的，这将导致总的信噪比的增加。因此，作为它在抑制散射(信号)方面的内在效率以及它的高的数据带宽潜力的一个结果，这种二次谐波检测方法在用于激光扫描显微术和用于延长的目标(例如一个病人体内的肿瘤)的远程成像时是很理想的。这些优点意味着，一个使用二次谐波检测方法的成像系统可以在每一点上以最小的延迟时间，并且在每一点上针对每一次测量使用最大激发功率来获得纯粹的双光子激发发光信号。
不管是基于发光亮度的测量，还是基于激发态寿命的测量来获得数据，前面所列举的在双光子激发诊断成像中使用调制方法的优点都同样地得到很好的应用。事实上，采用相位光度计方法进行寿命测量是最现成和最灵敏的，这个方法基于对介于一个调制波形以及该检测信号之间的相位移的测定。因此，很明显，各种调制方法，包括那些基于二次谐波检测的方法，在双光子激发荧光的有效检测中具有重要的用途，在这里它们被用来消除来自环境的和仪器的噪声源的干扰，以及来自在被观察的样本内部所出现的散射和其他现象的干扰。对于诸如人体组织这样的光密介质来说，散射的、不吸收的激发光对双光子激发荧光发射的极端高的比值使得这种方法的应用成为不可缺少的。因此，对于临床的影像应用或者对于双光子激光扫描显微术来说，使用这里所描述的各种调制方法通常是有利的。
在双光子激发成像中的对照试剂-内源的和外源的诸试剂：
前面的讨论已经表明，可以使用非线性的双光子激发来实现存在于光密介质中的可用光学方法激发的分子试剂在特异性和穿透深度方面的重大改进，还表明，通过在各自的激发和检测过程中使用各种编码和解码方法可以改进检测性能。当使用双光子方法时，可能的激发的特别好的空间定位可以被用来显著地改进在该激发点处的对比度。一旦实现了这种局部化的激发，就可以用多种检测装置来检测由此发出的分析光。若这个激发点相对于待观察的样品发生移动，例如通过扫描该焦点相对于该样品的位置，或者通过扫描该样品相对于该焦点的位置，则借助于在激发点位置以及由此产生的光发射之间建立相关，就能产生该样品的一个二维或三维图像。然而，在这个图像中，有用的对比度也依赖于用于发光的该分子试剂或诸试剂在浓度或局部环境方面的差异的存在。这些试剂对该样品而言可以是内源性的或外源性的，并且最后基于在它们的局部化的发光特性中的对比度来成像，上述局部化的发光特性可以跟该样品内部在结构上或功能上的异质性相关。因此，重要的是，在非线性诊断成像中还要仔细地考虑这些对照试剂的作用。
各种内源性的生色试剂可用于诊断成像，特别是用于患病组织的诊断成像。由于介于患病的和未患病的诸组织之间，在高等动物中介于各种内部的基础结构以及各种器官之间，或者介于健康或亚健康组织的不同范围之间的结构上或生理学上的差异，使得各种天然生色试剂，例如芳香族氨基酸、蛋白质、核酸、细胞能量交换补给物(例如三磷酸腺苷)、酶、激素或者其他试剂的浓度或局部环境，能够以一种对探测结构上或功能上的异质性有用的方式发生改变。因此，可以用双光子激发方法无损伤地探测到异质性的这些内源性的指示剂。
不幸的是，在许多情况下，用这样的试剂可能得到的特异性不适于获得有意义的诊断图像，因此必须将各种外源性的试剂加入到该样品中去。传统的各种外源性试剂在给药之后半选择性地分配到一件样品的特定组织、器官或其他诸结构单元中去。这些试剂的给药路线典型地是局部的敷用或者经由系统的给药。在理想条件下，这些试剂将分配到、或聚集于感兴趣的结构之上或之中，或者可以优先地排除在这些结构之外。这种聚集可能是直接在表面结构上孤立地局部敷用(某种试剂)的结果，或者是导致将该试剂分配到该结构之中的该结构在物理或化学诸特性上的内在差异的结果。由此，介于高浓度区域和低浓度区域之间的对比可以被用来作为探测结构上或生理学上的异质性的一个基础。另一方面，外源性试剂可以弥漫于整个样品之中；若它们的发光特性，例如颜色变换、淬灭、或者寿命，对生理学上的异质性敏感的话，则该对照试剂的这些参数可以被用来作为成像对比的基础。
由于一种分子试剂的发光特性取决于该激发态及其环境的基本特性，所以，负责使该试剂达到激发态的这种机制对该激发态的发光特性没有显著的影响。因此，在单光子激发条件下工作得很好的一种分子诊断或对照试剂，可以被期待在双光子激发条件下也展现出类似的表现。一般来说，对单光子激发有用的任何对比试剂都可以用于双光子激发，在这里，对激发部位的强化控制将用于改进图像的分辨率。适当的对比试剂包括许多用作生物染料或着色剂、以及那些用于光能疗法(PDT)的分子试剂。标准的PDT试剂具有组织特异性，一般来说，它们基于该试剂和该组织(例如一种癌变损伤)的综合化学与物理特性。这些试剂是光能的有效吸收剂，并且在许多情况下是发光的。例如，
●补骨脂素及其衍生物(包括5-甲氧基补骨脂素〔或5-MOP〕；8-甲氧基补骨脂素〔8-MOP〕；4,5’,8-三甲基补骨脂素〔TMP〕；4’-氨甲基-4,5’,8三甲基补骨脂素〔AMT〕；4’-羟甲基-4,5’,8三甲基补骨脂素〔HMT〕；5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素，当归根素(异补骨脂素)；5-甲基当归根素〔5-MIP〕；以及3-乙氧基酰基基补骨脂素)；
●各种卟啉以及血卟啉衍生物(包括血卟啉衍生物〔HPD〕；PhotofrinⅡ；苯并卟啉衍生物〔BPD〕；原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕；染料血卟啉醚〔DHE〕；多血卟啉酯类〔PHE〕；原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PHl008〕；四(3-羟苯基)-卟啉〔3-THPP〕；四苯基卟啉单磺酸盐〔TPPS1〕；四苯基卟啉二磺酸盐〔TPPS2a〕；二血卟啉醚；meso-苯基卟啉；以及meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉〔T4MPyP〕，还有各种四氮杂卟啉(包括八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕；四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕；以及四(4-叔丁基)酞菁镁〔t4-PcMg〕；
●各种酞菁衍生物(包括氯化铝酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕；氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐〔AlPcTS〕；单，二，三和四磺化的铝酞菁〔包括AlSPc,AlS2Pc,AlS3Pc和AlS4Pc〕；硅酞菁〔SiPcⅣ〕；锌(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕；双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁〔isoBOSINC〕；以及锗(Ⅳ)-八丁氧基酞菁；
●各种若丹明衍生物(包括若丹明101〔Rh-101〕；若丹明110〔Rh-110〕；若丹明123〔Rh-123〕；若丹明19〔Rh-19〕；若丹明560〔Rh-560〕；若丹明575〔Rh-575〕；若丹明590〔Rh-590〕；若丹明610〔Rh-610〕；若丹明640〔Rh-640〕；若丹明6G〔Rh-6G〕；若丹明700〔Rh-700〕；若丹明800〔Rh-800〕；若丹明B〔Rh-B〕；磺基若丹明640或101；以及磺基若丹明B)；
●各种香豆素衍生物(包括香豆素1,2,4,6,6H,7,30,47,102,106,,120,151,152,152A,153,311,307,314,334,337,343,440,450,456,460,461,466,478,480,481,485,490,500,503,504,510,515,519,521,522,523,535,540,540A,548)；
●各种苯并吩噁嗪衍生物(包括5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噁嗪鎓盐〔EtNBA〕；5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐〔EtNBS〕；以及5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐〔EtNBSe〕)；
●氯丙嗪及其衍生物；
●各种叶绿素以及细菌叶绿素衍生物(包括细菌二氢卟酚a〔BCA〕)；
●各种金属-配基络合物，例如二氯化三(2,2’-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)；
●脱镁叶绿甲酯-酸a〔Pheo a〕；部花青540〔MC 540〕；维生素D；5-氨基-乙酰丙酸〔ALA〕；photosan；二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，以及单-L-天冬氨酰基二氢卟酚e6；脱镁叶绿甲酯-酸-a〔Ph-a〕；吩噁嗪尼罗蓝衍生物(包括各种吩噁嗪染料)；
●各种电荷转移和辐射转移试剂，例如芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4’-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)；以及
●许多其他光活性试剂。
一般来说，这些试剂将积累在或接近于一个敷用点或者半选择性地处于一个特定的组织之中，这是由于该组织在物理和化学特性方面的差异，从而导致该PDT试剂分配到该组织之中；一旦积累起来，这样的试剂将容易受到双光子激发，并且它们的发光和其他的发射特性可以用于采集图像数据。也可以使用其他能吸收光并且随后能将能量转移到一种或多种其他试剂的光活性试剂，这些试剂可以单独使用，也可以跟一种或多种反应性试剂配合使用，后者能够接受被转移过来的能量，并将它转换为一种辐射的发光。
在双光子激发成像中的生物性对照试剂：
在理想条件下，标准的对照试剂基于对特定组织的化学的或者物理的亲和力导出目标特异性。这样一来，对照试剂将分配到或聚集于感兴趣的组织之上或之中。不幸的是，这种目标特异性通常是不完全的。事实上，人们希望建立一种改进的方法，用以增加在寻找试剂目标时的特异性。一种在特异性方面获得这样的改进的方法是基于利用在结构、功能或者疾病方面的特定的生物学的特征。例如，通过将反义寡核苷酸试剂结合到一个或多个光活性部分，例如FITC，就可以产生新的生物性对照试剂，它们仅能选择性地标记含有互补的遗传密码的特定细胞(例如癌细胞)。而且，通过改变用于该生物性探测器的寡聚密码，就能很容易地将这个基本方案推广应用到多种基于遗传的疾病或者其他紊乱症状。使用双光子激发使得这个强有力的方案在应用中，将起源于生物的探测器的生物特异性跟双光子同时光激活过程所固有的高度的空间定位能力结合起来。因此，使用针对一种特定的器官、组织或损伤具有特异性的各种试剂，在基因水平上获得非常高的对比度、非常高的分辨率的图像将成为可能。
一种用于起源于生物性探测器的最佳设计利用具有随着生物性试剂以及该目标部位之间的复合而变化的发光特性的一个或多个光活性部分。具体地说，基于复合的发光波长或寿命的变化可以被用来增加该一般方法的灵敏度，因为这样的变化有助于增加介于含有复合试剂的区域以及含有未复合试剂的区域之间的对比度。一个例子是，一种基于一个光活性部分的生物性试剂，在复合发生之前它一直是淬灭的，基于其上的发光将变为不淬灭的。另一个例子是，一种基于一个添加的光活性部分的试剂，例如补骨脂素，它被束缚到一个反义基因序列之中；当在该反义序列以及它的目标序列之间发生复合时，由于添加了光活性部分，使得该光活性部分在发光特性上出现颜色偏移。
从前面的讨论中很清楚地看出，基于其他的生物特异方法(例如免疫学方法)，而不是单纯地基于基因方法的导向方法，也被本发明的范围所涵盖。具体地说，基于各种抗原-抗体方法(在这里，一个抗体探测器被结合到一个光活性组)的试剂特异性，为疾病和感染的诊断提供了一种强有力的新方法。在试剂导向的过程中用于获得生物特异性的附加方法包括，但不局限于，使用配基、半抗原、碳水化合物、脂类、蛋白质受体或者各种复合试剂、螯合剂、以及胶囊载体，例如脂质体、fullerenes、冠醚，以及环糊精。
本发明的第一个示例性实施例：
因此，本发明的一个特定的优选实施例就是使用波长约为通常的单光子光激活所需波长两倍的近红外光源输出，对存在于一个样品中的内源性或外源性诊断成像试剂进行双光子同时光激活。这个优选的实施例示于图11。近红外光源108产生一束近红外辐射光束110，它由一系列的快速的高峰值功率的近红外辐射脉冲组成。例如，标准的市售锁模钛兰宝石激光器就能够输出宽度＜200fs、脉冲能量约为20nJ、脉冲重复频率超过75MHz的锁模脉冲；这个光源产生一束准连续光束，它具有相当低的平均功率(仅为几个瓦特)和高的峰值功率(为100kW量级)，其波长可以在大约690-1080nm的近红外波长带内连续地调谐。由该近红外光源108发出的脉冲序列构成了一束近红外辐射光束110，使用标准的光学装置，例如反射的或折射的光学装置112，就能容易地使之聚焦。随后，已聚焦的近红外光束114就被投射到一个待成像的样品116之上。由于仅出现于焦点处的高的瞬时辐射水平，使得该诊断成像试剂的双光子同时光激活基本上将被限制在该聚焦光束114的共焦区域118之内。被该样品116所散射的激发光120将不具有为显著地激发处于该共焦区域118以外的区域中的任何诊断成像试剂所需的足够的瞬时辐射水平。位于该共焦区域118中的诊断成像试剂分子所发出的光122将以一种基本上各向同性的方式从该共焦区域118射出。所发出的光124中的一部分被一个检测装置126(例如一个被安装在该样品116内侧或外侧一个位置上的光电倍增管)所俘获。这个检测装置126配有一个波长选择装置128，例如一个光学带通滤波器，该滤波器用来以这样一种方式对该发射光124的被俘获部分进行预处理：该选择装置128拒斥弹性的散射光中的大部分，但允许符合于该诊断试剂的原理特性所规定的波长或诸波长的光的大部分得以通过。由此，从该检测装置126发出的信号130被一个处理器装置132所俘获，其主要用途就是将来自诊断成像试剂的发光响应作为该共焦区域118的位置的一个函数加以记录。通过在该样品116的整个体积内对该共焦区域118的位置进行扫描，并通过将该处理器装置132的内容作为该共焦区域118的位置的一个函数来观察，就能获得该样品116的一个完整的图像。这个图像可以被用来识别感兴趣的区域134，例如皮下肿瘤或者其他患病区域。
本发明的第二个示例性的实施例：
作为对这个优选实施例的一种变通方案，可以将一个调制装置纳入到图11所示的一般的实施例之中；这样的调制装置可以被用来改进该成像系统总的性能，例如改进对环境的或仪器的噪声源的抑制，在二次谐波上恢复纯粹的双光子激发发光，或者使用相位光度计方案使发光的检测易于进行。具体地说，图12表示一个调制装置136，例如一个电-光或声-光调制器，一个斩波器，或者其他装置，它被这样定位，使得它能跟由该近红外光源108所发出的近红外辐射光束110交互作用，该调制装置可以被用来按照一种调制模式对该近红外辐射光束110进行编码，而该调制模式则被寄存在向该调制装置136提供一个驱动信号140的调制器驱动器138的输出端处。随后，正如前面针对图11所描述的那样，将由此产生的近红外辐射142的调制光束投射到样品上。由此产生的该双光子激发发光144将以一种基本上各向同性的方式从该共焦区域118射出。然而，跟前面针对图11所描述的类似的发光122相对照，这个发光144将展现出一种调制现象，它基本上同步于该被调制的近红外辐射光束142的调制，而该光束142又依次地同步于由该调制器驱动器138所发出的驱动信号140。已调制的发射光146中的一部分被一个检测装置126(例如一个被安装在该样品116内侧或外侧一个位置上的光电倍增管)所俘获。这个检测装置126配有一个波长选择装置128，例如一个光学带通过滤器，该滤波器用来以这样一种方式对该已调制的发射光146的被俘获部分进行处理：使得该选择装置128拒斥弹性的散射光中的大部分，但允许符合于该诊断试剂的原理特性所规定的波长或诸波长的光的大部分得以通过。由此，从该检测装置126发出的已调制信号148被一个处理器装置150所俘获。该处理器装置150服务于两个主要用途，其一是用由该调制器驱动器138发出的解调参考输出信号152去解调由该检测装置126所发出的已调制信号148，其二是将已解调的来自该诊断成像试剂的发光响应作为该共焦区域118的位置的一个函数加以记录。因此，通过在该样品116的整个体积内对该共焦区域118的位置进行扫描，并通过将该处理器装置150的内容作为该共焦区域118的位置的一个函数来观察，就能获得该样品116的一个完整的图像。这个图像可以被用来识别感兴趣的区域134，例如皮下肿瘤或者其他患病区域。
本发明的第三个示例性的实施例：
作为对这个优选实施例的第二个变通方案，可以用一束未经聚焦的近红外辐射光束去照射一个样品的表面特征以便提供一种用于检测的直接成像装置。这示于图13。具体地说，使用一个近红外光源的输出，例如锁模钛兰宝石激光器，使用波长约为通常单光子光激活所需波长的两倍的光，可以对位于或靠近一个样品表面的内源性或外源性诊断成像试剂进行双光子同时光激活。该近红外光源108产生一束由一系列快速的高峰值功率近红外辐射脉冲组成的近红外辐射光束110。用一个调制装置136对这个光束进行调制，该调制装置被这样定位，使得它能跟由该近红外光源108所发出的近红外辐射光束110交互作用。该调制装置136可以被用来按照一种调制模式对该近红外辐射光束110进行编码，而该调制模式则被寄存在向该调制装置136提供一个驱动信号140的调制器驱动器138的输出端处。随后，使用标准的光学装置，例如反射的或折射的光学装置154，对由此产生的该已调制的近红外辐射光束142进行去聚焦，以便产生一束发散的激发光束156，它被投射到待成像的一件样品116之上。位于或靠近该样品116的表面的诊断成像试剂的双光子同时光激活产生已调制的双光子激发发光144，它具有这样一种调制方式，即它基本上同步于该被调制的近红外辐射光束142的调制，而该光束142又依次地同步于由该调制器驱动器138所发出的驱动信号140。已调制的发射光146中的一部分被一个图像检测装置158(例如一个被安装在该样品116外侧一个位置上的电荷耦合器件阵列)所俘获。这个图像检测装置158配有一个波长选择装置128，例如一个光学带通过滤器，该滤波器用来以这样一种方式对该已调制的发射光146的被俘获部分进行处理：使得该选择装置128拒斥弹性的散射光中的大部分，但允许符合于该诊断试剂的原理特性所规定的波长或诸波长的光的大部分得以通过。从该图像检测装置158发出的已调制信号160被一个处理器装置162所俘获。该处理器装置162服务于两个主要用途，其一是用由该调制器驱动器138发出的解调参考输出信号152去解调由该图像检测装置158所发出的已调制信号160，其二是将已解调的来自该诊断成像试剂的发光响应作为发光位置的一个函数加以记录。因此，这个变通的实施例基于跨越该样品116的被照射表面的双光子激发发光中的空间差异，就能实现表面特征164(例如皮肤癌损伤)的直接视频图形成像。
应当这样理解，以上所描述的诸要素中的每一个，或者两个或者更多个加在一起，也可以在不同于上述诸类型的其他结构或应用类型中，找到有用的用途。
本发明作为一种用以改进分子诊断成像试剂的光激活的选择性的一般方法而加以实施，对此已经作了图解和说明，但不打算将它局限于所示的诸细节之内，因为人们应当懂得，专业人士在不以任何方式背离本发明的精神实质的前提下，可以对所说明的本方法的形式以及细节及其运作作出各种省略、修改、替代以及改变。例如，在第三个示例性的实施例中，为了生成一个更简单的成像装置，可以省略有关调制与解调的诸细节，虽然这种示例性的修改会导致在成像性能方面的整体降低。
用不着进一步的分析，上文已经如此充分地揭示了本发明的要点，使得他人，通过运用现有知识，就能现成地将它用于各种用途，并且从现有技术的观点来看，不致于遗漏那些清楚地构成本发明的一般或特殊方面的重要特征的特点。
在所附的权利要求书中，陈述了那些新的并且希望受到专利保护的各项权利要求。

Claims (48)

1．一种用于对植物或动物组织的一个特定体积进行成像的方法，其中该植物或动物组织含有至少一种光活性分子试剂，该方法包括下列诸步骤：
(a)用足以激励包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该植物或动物组织的该特定体积；
(b)对包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进行光激活，由此产生至少一种已被光激活的分子试剂，其中该至少一种已被光激活的分子试剂发射能量；
(c)检测由该至少一种已被光激活的分子试剂发射的能量；
(d)产生一个已检测的能量信号，它是该植物或动物组织的该特定体积的特征所在。
2．如权利要求1所述方法，其中该足以激励至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光是激光。
3．如权利要求1所述方法，其中该足以激励光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光是一束聚焦光束。
4．如权利要求4所述方法，其中该聚焦光束是聚焦的激光束。
5．如权利要求1所述方法，还包括用至少一种光活性分子试剂来处理该植物或动物组织的第一步骤，其中，该植物或动物组织的该特定体积保留该至少一种光活性分子试剂中的至少一部分。
6．如权利要求5所述方法，其中该至少一种光活性分子试剂是从由下列各种光活性分子试剂组成的小组中选出的，它们是：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基补骨脂素〔8-MOP〕,4,5’,8-三甲基补骨脂素〔TMP〕,4’-氨甲基-4,5’,8-三甲基补骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素〔HMT〕，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素〔5-MIP〕,3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯并卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯类〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羟苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉单磺酸盐〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸盐〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MPyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁镁〔t4-PcMg〕，氯化铝酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐〔AlPcTS〕，单磺化的铝酞菁〔AlSPc〕，二磺化的铝酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的铝酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的铝酞菁〔AlS4Pc〕，硅酞菁〔SiPcⅣ〕，锌(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isoBOSINC〕，锗Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噁嗪鎓盐〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓盐〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，三氯化二(2,2’-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯-酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-乙酰丙酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰基二氢卟酚e6，吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物，4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4’-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)，以及标准的生物染料和着色剂。
7．如权利要求5所述方法，其中该至少一种光活性分子试剂是对处于该植物或动物组织的特定体积之中的一种特定组织具有特异性的至少一种生物性光活性分子试剂。
8．如权利要求7所述方法，其中该至少一种生物性光活性分子试剂包括从由下列各种光活性分子试剂组成的小组中选出的一个片段，它们是：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，碳水化合物受体或复合试剂，脂类受体或复合试剂，蛋白质受体或复合试剂，螯合剂，以及胶囊载体。
9．如权利要求8所述方法，其中该至少一种生物性光活性分子试剂还包括当受到足以激励它进入一种双光子激发状态的光(的照射)时被光激活的一个片段。
10．如权利要求1所述方法，用足以激励包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该植物或动物组织的该特定体积的步骤包括下列诸步骤：
(a1)用一种特定类型的调制(方式)从光源对光进行调制，由此产生一束已调制光；以及
(a2)用足以激励包含于该植物或动物组织的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的已调制光来处理该植物或动物组织的该特定体积；
还包括下列诸步骤：
(e)对具有该特定类型的调制(方式)的该已检测的能量信号进行解调；以及
(f)产生一个已解调的能量信号，它是该植物或动物组织的特定体积的特征所在。
11．如权利要求10所述方法，其中对具有该特定类型的调制(方式)的该已检测的能量信号进行解调的步骤包括在一个两倍于该特定类型的调制(方式)的频率上对已检测的能量信号进行解调，由此检出该特定类型的调制(方式)的二次谐波。
12．如权利要求10所述方法，其中作为该植物或动物组织的特定体积的特征的该已解调的能量信号，代表了存在于该植物或动物组织的特定体积之中的至少一种光激活分子试剂的寿命的变化。
13．一种用于对材料中的一个特定体积进行成像的方法，其中该材料含有至少一种光活性分子试剂，该方法包括下列诸步骤：
(a)用足以激励包含于该材料的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该材料的该特定体积；
(b)对处于该材料的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进行光激活，由此产生至少一种已被光激活的分子试剂，其中该至少一种已被光激活的分子试剂发射能量；
(c)检测由该至少一种已被光激活的分子试剂所发射的能量；以及
(d)产生一个已检测的能量信号，它是该材料的该特定体积的特征所在。
14．权利要求13中，该材料是从由植物组织和动物组织所组成的小组中选出的。
15．如权利要求13所述方法，其中该足以激励至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光是激光。
16．如权利要求13所述方法，其中该足以激励至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光是一束聚焦光束。
17．如权利要求16所述方法，其中该聚焦光束是聚焦的激光束。
18．如权利要求13所述方法还包括用至少一种光活性分子试剂来处理该材料的一个第一步骤，其中，该材料的特定体积保留该至少一种光活性分子试剂中的至少一部分。
19．如权利要求18所述方法，其中该至少一种光活性分子试剂是从由下列各种光活性分子试剂组成的小组中选出的，它们是：补骨脂素，5-甲氧基补骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基补骨脂素〔8-MOP〕,4,5’,8-三甲基补骨脂素〔TMP〕,4’-氨甲基-4,5’,8-三甲基补骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基补骨脂素〔HMT〕，当归根素(异补骨脂素)，5-甲基当归根素〔5-MlP〕,3-羧基补骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯并卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯类〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羟苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉单磺酸盐〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸盐〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MpyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁镁〔t4-PcMg〕，氯化铝酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化铝酞花青酞菁四硫酸盐〔AlPcTS〕，单磺化的铝酞菁〔AlSPc〕，二磺化的铝酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的铝酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的铝酞菁〔AlS4Pc〕，硅酞菁〔SiPcⅣ〕，锌(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，双(二异丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isoBOSINC〕，锗Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噁嗪鎓盐〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓盐〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯[a]吩硒嗪鎓盐〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，叶绿素衍生物，细菌叶绿素衍生物，金属-配基络合物，二氯化三(2,2’-双吡啶)钌(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铑(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2’-双吡啶)铂(Ⅱ)(PtBPY)，脱镁叶绿甲酯-酸a，部花青540，维生素D,5-氨基-乙酰丙酸，photosan，二氢卟酚e6，二氢卟酚e6亚乙基二酰胺，单-L-天冬氨酰基二氢卟酚e6，吩噁嗪尼罗蓝衍生物，芪，芪衍生物，4-(N-(2-羟乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4’-(6-羟基己基磺酰基)芪(APSS)，以及标准的生物染料和着色剂。
20．如权利要求18所述方法，其中该至少一种光活性分子试剂是对处于该材料的特体积之中的一种特定物质具有特异性的至少一种生物性光活性分子试剂。
21．如权利要求20所述方法，其中该至少一种生物性光活性分子试剂包括从由下列各种光活性分子试剂组成的小组中选出的一个片段，它们是：DNA,RNA，氨基酸，蛋白质，抗体，配基，半抗原，碳水化合物受体或复合试剂，脂类受体或复合试剂，蛋白质受体或复合试剂，螯合剂，以及胶囊载体。
22．如权利要求21所述方法，其中该至少一种生物性光活性分子试剂还包括当受到足以激励它进入一种双光子激发状态的光(的照射)时被光激活的一个片段。
23．如权利要求13所述方法，其中用足以激励包含于该材料的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的光来处理该材料的该特定体积的步骤包括下列诸步骤：
(a1)用一种特定类型的调制(方式)从光源对光进行调制，由此产生一束已调制光；以及
(a2)用足以激励包含于该材料的该特定体积之中的至少一种光活性分子试剂进入双光子同时激发状态的已调制光来处理该材料的该特定体积；
还包括下列诸步骤：
(e)对具有该特定类型的调制(方式)的该已检测的能量信号进行解调；以及
(f)产生一个已解调的能量信号，它是该材料的特定体积的特征所在。
24．如权利要求23所述方法，其中对具有该特定类型的调制(方式)的该已检测的能量信号进行解调的步骤包括在一个两倍于该特定类型的调制(方式)的频率上对已检测的能量信号进行解调，由此检出该特定类型的调制(方式)的二次谐波。
25．如权利要求23所述方法，其中作为该材料的特定体积的特征的该已解调的能量信号，代表了存在于该材料的特定体积之中的至少一种光激活分子试剂的寿命的变化。
26．如权利要求1所述成像方法中，该处理步骤包括：
在一个焦距的范围内聚焦一束光束，使得该光束的一个焦平面延伸到介于该组织的一个表面以及基本上远离该组织表面的一个点之间的一个位置上，由此，该处理步骤可以延伸以便穿透该组织的深部。
27．如权利要求26所述成像方法，还包括，当该光束是现存的时，在该组织内部改变该焦距位置，使得所述光激活、检测、以及产生一个已检测的能量信号的诸步骤沿着介于该组织表面以及一个基本上定位于该组织表面之外的一个位置之间的诸位置而发生，因此该图像是三维的。
28．如权利要求27所述方法，其中所述处理步骤包括运行一个激光器以产生一系列的脉冲输出，该脉冲系列具有高于大约75MHz的脉冲重复频率以及一个亚纳秒的脉冲宽度。
29．如权利要求28所述方法，包括运行该激光器以产生近红外光。
30．如权利要求29所述方法，其中该激光器产生的脉冲能量约为20nJ。
31．如权利要求29所述方法，其中该光激活步骤包括对至少一种光活性分子试剂进行一次双光子同时激发。
32．如权利要求31所述方法，其中所述检测步骤包括检测那些不按照来自该激光器的该入射光的一条光路折返的发射光。
33．如权利要求31所述方法，其中所述处理步骤还包括对该激光束进行调制；
并且其中该检测步骤以及诸产生步骤中被选定的一个包括使用一个波长选择步骤。
34．如权利要求31所述方法，其中所述处理和光激活诸步骤被这样安排，以便产生来自该分子试剂并基本上同步于该激光的调制(频率)的发射光。
35．用于对含有至少一种光活性分子试剂的植物或动物组织中的一个特定体积进行成像的装置，该装置包括：
一个准直光源，所述光具有一个实质上能穿透该组织的频率，所述光被这样调适，使之能激励包含于该组织之中的该分子试剂进入双光子同时激发(TPE)状态；
聚焦装置，用于通过一个从所述组织表面延伸到基本上远离所述表面的一个深部的一个位置的焦距范围内对该准直光进行聚焦，所述光源以及聚焦装置协同工作以激励该分子试剂的TPE，
其中一个焦点或焦平面相对于所述组织是可调的；以及
一个位于该组织附近的检测器，它被这样定位，以便检测由该分子试剂所发出的、并且沿着一条与入射到该组织的光的光路不重复的路径行进的光，所述检测器被这样配置，以便产生一个检测信号，它是该光源曾经聚焦于其上的该特定体积的特征。
36。如权利要求35所述装置，其中所述光源产生一系列的脉冲输出，该脉冲系列具有高于大约75MHz的脉冲重复频率以及一个亚纳秒的脉冲宽度。
37．如权利要求36所述装置，其中所述光源产生近红外光。
38．如权利要求37所述装置，其中所述光源产生的脉冲能量约为20nJ。
39．如权利要求37所述装置，其中所述光源包括一个激光器。
40．如权利要求35所述装置还包括一个被连接到所述检测器的处理器。
41．如权利要求40所述装置还包括一个跟所述光源相连接的调制系统，所述处理器被连接到所述调制系统。
42．一种用于医学诊断成像的方法包括下列诸步骤：
将一种光活性分子试剂引入到一个组织之中，以对感兴趣的该组织具有特异性为标准来选择所述试剂，所述试剂对双光子激发(TPE)是敏感的，
允许所述试剂在感兴趣的特定组织中积累；
将光引导到该组织内部感兴趣的特定区域，包括基本上位于一块组织表面下方的区域，所述光按照频率和能量来选择，使之能穿透该组织，并且基本上仅在一个共焦区域内激励TPE；
在所述组织内部一个深度范围内，控制一个共焦区域的位置；
在所述组织内部一个深度范围内，使用TPE对所述试剂进行光激活，由此在该共焦区域内产生已被光激活的诸试剂，其中该已被光激活的分子试剂发射能量；
检测所发射的能量；以及
产生一个已检测的能量信号，它是在该共焦区域内的组织的特征所在。
43．如权利要求42所述方法，其中所述引导光的步骤包括使用一个工作于短脉冲宽度以及一个高的脉冲重复频率的脉冲激光器来产生近红外光，并将所述激光聚焦到所述组织内。
44．如权利要求42所述方法，其中所述控制该位置的步骤包括改变该共焦区域相对于待观察的该组织的位置，或者改变该待观察的组织相对于一个固定的共焦区域的位置。
45．如权利要求42所述方法，还包括在该光入射到该组织之前对它进行调制，并且在检测到该发射光之后对它进行解调。
46．用于医学诊断成像的装置包括：
光源装置，用于将一束受限的光束引导到以及进入到待成像的深部组织之中，所述光按照频率和能量来选择，使之能穿透到一块组织表面的下方，并且基本上仅在一个共焦区域内激励TPE；
用于在待成像的该组织的一个深度范围内改变该光的一个共焦区域的位置的装置；以及
检测装置，它被这样定位，以便在用双光子激发方法来激发所述试剂之后，接收和检测由处于该组织内部的一种已被光激活的分子试剂所发出的各向同性的辐射。
47．如权利要求46所述装置：
其中，该光源装置包括产生一束准直光束的装置；以及
其中，该光源装置包括聚焦装置，用于将该准直光束聚焦到定位于该组织表面下方一个点上的一个共焦区域。
48．如权利要求47所述装置，其中用以产生一束准直光束的装置包括一个工作于近红外光谱区域的脉冲激光器。
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