CN1229436A - 特异性检测癌细胞的抗原结合片段、编码所述片段的dna、以及它们在预防和检测癌症上的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单克隆抗体H11和其抗原结合性片段,它们特异性地结合被H11识别的抗原即C抗原。C抗原发现特异性存在于肿瘤形成细胞上,而在正常细胞上则没有。本发明还展示了以H11为基础的聚核苷酸和多肽衍生物,包括单链V区分子和融合蛋白,以及各种药物组合物。用于个体时,H11抗体能够有效地诊断、定位和/或治疗新生肿瘤。本发明还提供治疗肿瘤形成疾病的方法,尤其是治疗黑色素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质细胞瘤、软组织肉瘤和小细胞肺癌。用传统癌症治疗方法处于缓解期的患者可以用本发明组合物治疗,以期降低复发的危险性。患者还可以同时用本发明抗体和传统抗肿瘤形成药物的治疗。

Description

特异性检测癌细胞的抗原结合片段、编码所述片段的DNA、 以及它们在预防和检测癌症上的用途
                         技术领域
本发明涉及在肿瘤细胞上发现但在正常细胞上没有的抗原的特异性抗体。所述抗原在此称为“C-抗原”。C-抗原为被称为“H11”的人单克隆抗体(Mab)所识别。本发明包含了许多抗体及其功能性衍生物，它们保留了H11的免疫特异性，它们被称为“αC”。本发明还包括包含H11和产生H11的杂交瘤的实例性抗体H11组合物。本发明还包括H11V区的聚核苷酸和由其编码的多肽，以及含有所述聚核苷酸的重组分子。本发明还包括αC抗体用于治疗和诊断的使用方法。
                           发明背景
尽管医学研究已取得许多进展，癌症仍然是美国第二大死亡原因。工业化国家大约每五人中就有一人死于癌症。传统的临床治疗，例如手术切除、放射治疗和化学治疗的失败率很高，尤其是对于实体瘤。失败或者是由于初期肿瘤对治疗无反应，或者是由于肿瘤的原位重新生长和/或转移造成的复发。即使象乳房癌等癌后的死亡率已有所下降，对癌症的成功干预仍有赖于对癌细胞的早期检测。癌症的病因学、诊断和切除仍然是医学研究和开发的重中之重。
导致良性瘤的肿瘤一般可通过手术切除肿块来完全治愈。如果肿瘤变成恶性，出现侵入周围组织的症状，就很难根除。一旦恶性肿瘤发生转移，那就几乎不可能根除。
就发病率和死亡率而言，三大主要癌症是结肠癌、乳房癌和肺癌。新的手术方法提高了结肠癌的存活率。改进的筛选方法提高了乳房癌的检出率，从而允许采取更早和伤害性较低的治疗方法。许多研究证明，早期检出提高了存活率和治疗方法的选择范围。然而肺癌一般仍难以治愈。
除基底细胞癌外，单美国每年就有100,000以上的新癌症病例，美国癌症死亡数每年50,000例以上。在全世界，5种最常见的癌症是肺癌、胃癌、乳房癌、结肠/直肠癌和子宫颈癌，每年新病例的总数超过600,000例，只有约一半的癌症患者死于癌症。
黑色素瘤是一种急需新治疗方法的人类疾病。它是一种特别的侵袭性皮肤癌，经常性无保护地遭受日晒者发病率上升。在此病早期，黑色素瘤的特征是表皮-上皮接壤处细胞增生，迅速侵入毗邻组织并广泛转移。一旦转移，一般不可能根除，结果是致死性的。
在全世界，70,000人被诊断患有黑色素瘤，据报道，每年造成25,000例死亡。美国癌症协会指出，到2000年，每75个美国人中将有1人被诊断患有黑色素瘤。
成神经细胞瘤是发生在婴儿期和幼儿早期的一种高度恶性肿瘤。除Wilm氏肿瘤之外，它是儿童中最常见的腹膜后肿瘤。这种肿瘤转移早，播散广，涉及淋巴结、肝、骨、肺和骨髓。虽然原发瘤可以手术切除，但复发率高。
估计在1997年，将诊断出178,100例肺癌，占癌诊断的13％。估计1997年将有160,400例死于肺癌，占癌症死亡总数的29％。肺癌的一年存活率已经由1973年的32％上升至1993年的41％，这主要是因为外科技术的改进。各阶段肺癌的5年存活率的总和只有14％。而尚局限于局部时就检出的病例存活率为48％，但是只有15％的肺癌能够在那么早被发现。
小细胞性肺癌是肺癌中最恶性和生长最快的，占肺癌新病例的20至25％。1996年美国将诊断出60,000例。原发瘤一般对化学疗法有反应，但随后会广泛转移。诊断后的平均存活时间约为1年，5年存活率是5％至10％。
乳房癌是最常见的癌症之一，是美国癌症死亡的第三大原因，1997年美国妇女新病例的年发病率约为180,200，1997年男性诊断乳房癌新病例1,400例。在工业化国家，8个妇女中约有1人发出乳房癌。自1930年以来，乳房癌的总死亡率保持不变。每年以平均0.2％的比例增长，但65岁以下妇女以平均0.3％的比例下降。初步桨料提示，乳房癌的死亡率也许正在开始下降，这可能是因为对局限性癌和原位癌的诊断率升高之故。参见，例如Marchant(1994)ContemporaryManagment of Breast Disease II：Breast Cancer，in：Obstetrics and Gynecology clinicsof North America 21：555-560；和Coldiz(1993)Cancer Suppl.71：1480-1489。据估计，1997年乳房癌造成的死亡将有44,190例(43,900例妇女，290例男性)。在妇女中，这是继肺癌之后的第二大癌症死因。局限性乳房癌的5年存活率已由40年代的72％上升至现在的97％。但是，如果癌症发生区域性扩散，存活率为76％，远处转移的妇女是20％。诊断出乳房癌之后的5年以上存活率逐渐下降。诊断为乳房癌的妇女65％活过10年，56％活过15年。
非何杰金氏(Hodgkin)B细胞淋巴瘤是免疫系统癌症，估计1996年美国有约225,000的患者。这类癌症的预后和治疗类型很多，通常分为三级。最低级的平均存活率为6.6年，更高级的癌症其存活期短得多。实际上，几乎所有的非何杰金氏B细胞淋巴瘤都是不可治愈的。在过去10年中，新诊断出的非何杰金氏淋巴瘤每年增加约7％，1996年新诊断病例估计为52,700。上述增加有一部分是因为AIDS患者群体该淋巴瘤的高发性。
结肠癌和直肠癌1997年估计将达131,200例，其中包括94,100例结肠癌和37,100例直肠癌。结肠直肠癌约占新诊断癌症的9％。1997年，结肠直肠癌据估计将造成54,900例死亡，约占癌症死亡的10％。在过去20年中，结肠直肠癌死亡率妇女下降了32％，男性下降了14％，反映出发病率下降和存活率上升。然而，非洲裔美国男性死亡率仍然持续上升。结肠癌和直肠癌患者的1年和5年存活率分别是82％和61％。如果在早期、局限性阶段诊断出结肠直肠癌，5年存活率是91％；但是，只有37％的结肠直肠癌在此阶段被发现。在癌症区域性扩散涉及毗邻器官或淋巴结后，5年存活率降至63％，远处转移患者的存活率为7％。5年以上的存活率逐渐下降，50％的患者活得过10年。
虽然困难，但人们一直试图用抗癌药物(单独或联用其它疗法)来有效治疗某些先前高度致死性的癌症。这些癌症中尤其值得注意的是何杰金氏淋巴瘤、睾丸癌、绒毛膜癌和部分白血病及其它儿童癌症。对于更为常见的几种癌症来说，早期诊断、合适的手术或局部放射治疗能使大部分患者康复。
目前的癌症治疗方法相对而言是非选择性的。手术切除患病组织，放射治疗使实体瘤收缩，化学疗法杀死迅速分裂的细胞。尤其是化疗，它引起许多副作用，在某些情况下严重到阻碍了潜在有效药物的应用。而且，癌瘤常会产生对化疗药物的抗药性。
人们正在进行各种努力加强癌症治疗方法的选择性。参见，Kohn和Liotta(1995)Cancer Res 55：1856-1862。尤其是，鉴定出仅仅或主要在某种肿瘤上表达的细胞表面抗原允许形成更具有选择性的治疗战略。针对这些抗原的抗体已经被用于几种癌症的免疫治疗。
脊椎动物系统中基本免疫球蛋白(Ig)结构单元由两条相同的多肽轻链(“L”)(约23KDa)和两条相同的多肽重链(“H”)(约53至70KDa)组成。这四条链通过二硫键连接成“Y”构型。在Y的基部，两条H链通过共价二硫键结合。
图1显示抗体的结构。L链和H链各由N末端的的可变区(V)和C末端的恒定区(C)构成。L链中，V区(称为“VLJL”)是由通过连接区(JL)与C区(CL)连接的V区(VL)构成。H链中，V区(VHDHJH)是由通过多变区(DH)和连接区(JH)与C区(CH)连接的可变区(VH)构成。L链和H链的VLJL和VHDHJH分别在Y的两顶端联合成抗原结合部位，决定了抗原结合特异性。
CH区决定同种型，即抗体的类或亚类。不同同种型的抗体其效应器功能，如激活补体的能力、与多种类型细胞上特异性受体(如Fc受体)结合的能力、穿过粘膜和胎盘屏障的能力、以及形成基本的四链IgG聚合物的能力，明显不同。
抗体按其免疫球蛋白分子所用的CH型分成几“类”(IgM，IgG，IgD，IgE或IgA)。至少有5种CH基因型(Cμ、Cγ、Cδ、Cε和Cα)，有些生物有多种CH亚型(如人有Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4)。人单倍体基因组总共有9种CH基因，小鼠和大鼠有8种，其它种动物略少。相反，L链C区(CL)通常只有两种：κ和λ，而且在一条L链蛋白中只有其中之一种(即，对于每一种形成的VLJL只可能有一个L链C区)。各类H链可以与两类L链中之一类相联合(即CHγ区可以与κ或者λL链存在于同一抗体中)，但是特定的一类免疫球蛋白的H链和L链的C区是不随抗原特异性而变化的(即不论抗原特异性如何，IgG抗体总是具有CγH链的C区)。
H和L链的V、D、J和C区是由不同的基因组序列编码的。抗体的多样性是由于H链不同的VH、DH和JH基因片段及L链的VL和JL基因片段之间的重组而产生。不同VH、DH和JH基因的重组是在B细胞分化阶段由DNA重组完成的。简而言之，H链首先重组产生DHJH复合体，然后经第二次重组产生VHDHJH复合体。功能性H链是在转录后由RNA转录产物剪接而产生的。功能性H链的生成引发L链序列内的重组，产生重排的VLJL区，接着形成功能性的VLJLCL区，即功能性L链。
本领域早已认识到抗体作为诊断和治疗剂的价值和潜力。但是，该领域的开发因大量生产所需特异性的抗体需要的过程缓慢而冗长而受阻。经典细胞融合技术通过将产生抗体的B细胞与可无限繁殖细胞系融合，能够高效地生产Mab。此法得到的细胞系是杂交瘤细胞系。
抗体及其功能性衍生物已经被广泛用于各种临床情况。例如，地高辛-特异性Fab抗体片段被用于治疗致死性的洋地黄药中毒。抗体被越来越常规地用于诊断技术，例如结肠癌的放射免疫诊断。Koda等(1995)，Am.J.Castroenterol.90：1644。许多过去被认为不确切的Mab用途最近已用于实践。例子参见Hall(1995)Science 279：915-916。
已发现许多的人的自身抗体(识别和结合自身抗原的抗体)。其中许多与特定的疾病有关，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、原发胆汁性肝硬变、多肌炎、系统性脉管炎、自发性坏死性和新月形肾小球性肾炎和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。参见Shattner(1986/1987)Immunol.Lett.14：143-153。其它自身抗体是天然存在的。Lutz和Wipp(1982)J.Immunol.128：1965；和Guilbert等(1982)J.Immunol.128：2779-2787。最近抗特定癌抗原的人自身抗体被检鉴定出来，在某些病例中，正利用杂交瘤技术进行生产。这类抗体也已用主动免疫方法来生产。美国专利5,474,755。最早，用Epstein-Barr病毒或鼠骨髓瘤令人B细胞无限繁殖。参见Buck等(1984)“Monoclonal Antibodies”NY.，Plenum Press。更新的技术已经能不用这种有潜在危害性的病毒来实现无限繁殖。例子参见美国专利4,618,477；和Glassy(1987)Cancer Res.47：5181-5188。在大多数情况下，抗体对一种，有时对数种癌症型具有特异性。例如，一种Mab据称只特异性识别神经胶质瘤细胞而不识别其它肿瘤或正常细胞。这类抗体被用于患者脑部的神经胶质瘤造影。Fischer等(1991)Immunobiol.Prot.Pep.VI(M.Atassi编辑)Plenum Press，NY.pp.263-270。还没有关于能识别多种肿瘤但不能或只能勉强识别正常的非癌细胞的抗体的报道。
基因重组技术已经能够克隆和表达抗体、其功能性片段和被其识别的抗原。这些工程抗体提供了新的生产方法和治疗方式。例如，已在细菌和转基因烟草种子和植株中表达了功能性免疫球蛋白片段。Skerra(1993)Curr.Opin.Immunol.5：256-262；Fiedler和Conrad(1 995)Bio/Technology 13：1090-1093；Zhang等(1993)Cancer Res.55：3384-3591；Ma等(1995)Science 268：916；另外，有关合成抗体，参见Barbas(1995)Nature Med.1：836-839。
已经生产并鉴定了几种抗肿瘤相关抗原的人Mab。被人Mab识别的肿瘤相关抗原包括细胞表面、细胞质和细胞核抗原。Yoshikawa等(1989)Jpn.J.CancerRes.(Gann)80：546-553；Yamaguchi等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2416-2420；Haspel等(1985)Cancer Res.45：3951-3961；Cote等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2959-2963；Glassy(1987)Cancer Res.47：5181-5188；Borup-Christensen等(1987)Cancer Detect.Prevent.Suppl.1：207-215；Haspel等(1985)Cancer Res.45：3951-3961；Kan-Mitchell等(1989)Cancer Res.49：4536-4541；Yoshikawa等(1986)Jpn.J.Cancer Res.77：1122-1133；和McKnight等(1990)Human Antibod.Hybridomas 1：125-129。
人Mab已被用于癌造影、诊断和治疗。Olsson(1985)J.Nat.Cancer Inst.75：397-404；Larrick和Bourla(1986)J.Biol.Resp Mod.5：379-393；McCabe等(1994)Cancer 73：858-863；和Alonso(1991)Am.J.Clin.Oncol.4：463-471。已经报道了具有肿瘤细胞高毒性的重组单链双特异性抗体。该抗体分子识别人T细胞的CD3抗原和EpCAM，能与残留有极少量结肠直肠癌的患者体内扩散的肿瘤细胞结合。Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025。
据报道，几种抗-GD2鼠单克隆抗体能抑制无胸腺(nu/nu)小鼠神经外胚层源(neuroectodermal origin)肿瘤的生长或引起转移性黑色素瘤患者的缓解。抗-GD2人-鼠嵌合抗体引起转移性成神经细胞瘤患者的缓解。抗体作用机制认为涉及到抗体依赖性细胞毒(ADCC)或补体介导细胞毒(CMC)。用抗GM2、GD2和GD3的Mab治疗黑色素瘤已获得了临床应答反应。Cheresh等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5155-5159。用含有GM2的神经节苷脂疫苗进行主动免疫，58个患者中有50人产生了抗-GM2抗体，其平均存活期比未测出该抗体者延长。
还发现抗GD2抗体特异性地与小细胞肺癌反应。Cheresh等(1986)CancerRes.46：5112-5118。对其它癌症(包括肺癌、黑色素瘤、胃癌、鳞状细胞癌、子宫颈癌和乳房癌)的特异性人Mab也已经生产出来。Murakami(1985)in Vitro CellDev.Biol.21：593；Schadendor(1989)J.Immunol.142：1621-1625；Yoshikawa等(1986)Jpn.J.Cancer Res.77：1122-1133；Pickering和Misra(1 984)Clin.Immunol.Immunopathol.32：253-260；Hagiwara和Sato(1983)Mol.Biol.Med.1：245-252；和Schlom等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：6841-6845。抗癌人Mab及其识别抗原还被提议用在疫苗中。例子参见Finn等(1995)Immunol.Rev.145：61-89。对恶性脑肿瘤的人Mab在I期临床试验中，没有不良副作用。Matsumoto等(1994)The Clinical Report 28：118-126。在转移性胃肠癌中用鼠Mab和集落刺激因子合用的II期临床结果也已有报道。Saleh等(1995)Cancer Res.55：4339-4346。还发现一种单链免疫毒素在大鼠模型中能够治愈癌性蛛网膜脑炎。Pastan等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：2765-2769。特异性识别卵巢癌细胞的人Mab已被证明能有效造影该癌瘤。Chaudhuri等(1994)Cancer 73：1098-1104。
如果有一种简单可靠的方案，可提供对各癌症共同抗原的免疫反应性而不是癌症特异性免疫力，癌症诊断治疗的临床前景将全面改善。本文参考了以上引用的所有参考文献。
                         发明内容
本发明包括含有抗体的抗原结合性片段组合物，所述抗体特异性识别的抗原可被H链V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：2和L链V区具有氨基酸序列SEQ IDNO：4的抗体所识别。较好的所述抗体是H11。本发明还包括含有H11的H链和L链V区(分别为SEQ ID NO：2和4)的抗体。H11特异性识别多种癌症的癌细胞，但不识别正常的非癌细胞。“不识别”指非癌细胞或者不与H11特异性结合，或者只被H11抗体勉强识别。这些抗体被称为αC，包括H11及任何具有H11“免疫学特异性”的抗体，即此类抗体识别H11所识别的抗原，而且至少对一种癌细胞具有特异性，但不识别正常细胞。这类抗原结合性片段包括(但不限于)完整的天然抗体，以H11为例；包括双特异性抗体；嵌合抗体；Fab，Fab’；单链V区片段(scFv)和融合多肽。
本发明还包括含有一个与H链C区连接的具有抗原性、治疗性、毒性或标记分子多肽区的H11抗体融合分子、其单链VH-VL或VH-VLV区，和编码所述多肽的聚核苷酸。
本发明还包括具有H11免疫特异性的多肽，此多肽含有来自αC抗体V区的至少5个连续氨基酸。V区可以是L链或是H链的。5个连续氨基酸最好是在免疫学特异性中起作用的，而且可以来自CDR(抗体的互补决定区)。完整H11、H11的功能性活性片段、融合蛋白、嵌合抗体、多价抗原蛋白和αC抗体其它多肽衍生物也包括在内。尤其重要的是其单链V区和融合蛋白。
本发明的化合物和组合物可以和其它药物一起用于检测和治疗癌症；包括对所述癌症的治疗和预防，特别是用于降低复发的危险性。
本发明还包括产生αC抗原结合性片段的细胞和细胞系。
本发明的另一实施方案是一种聚核苷酸，它包含编码具有H11免疫学特异性的多肽的序列，此被编码多肽含有来自H11V区的至少5个连续氨基酸，此V区可来自H11的L链或是H链的。5个连续氨基酸最好是在H11的免疫学特异性中起作用的，而且可来自CDR。H11的V区被发现具有一个与A6抗体有同源性的小区。需特别注意的是，只含这一同源性小区而没有其它H11-特有氨基酸残基的肽不包括在本发明范围内。A6在WO953574中有所说明。
本发明还包括至少有20个连续核苷酸的分离的聚核苷酸，它能够与H11H或L链的编码序列，但不与其它先前已描述过的免疫球蛋白分子的编码序列形成稳定的双链。任何这类聚核苷酸可以是克隆载体、表达载体或转染进入宿主细胞内的形式。
本发明另一实施方案包括用至少一种αC抗原结合性片段预防性治疗癌症患患者。较好的是，αC与治疗性分子融合而有效地将治疗性分子递送给癌细胞。个体可能患有临床可检测的肿瘤，或肿瘤已被治疗过而变得不可检测。该方法可以用来缓解疾病，或减少复发的危险性。
本发明的另一实施方案是提供检测和定量样品中αC识别抗原(后文称“C抗原”)的试剂盒，它包括合适包装的H11或本发明多肽。本发明还包括通过使用本发明试剂或试剂盒来检测C抗原或细胞表达的C抗原的方法。
附图简要说明
图1绘制了一般抗体的结构。
图2描述H11识别细胞的流式细胞计数分析。
图3描述H11识别细胞的流式细胞计数分析。
图4描述H11识别细胞的流式动细胞计数分析。A是A-375(黑色素瘤)，B是SKMG-1(神经胶质瘤)，C是SK-BR-3(乳房腺癌)，D是HT-29(结肠腺癌)，E是MB-468(乳房癌)，F是T47D(乳房癌)。
图5描述H11与肿瘤细胞提取物的结合。浅色柱表示H11，暗色柱表示对照抗体。
图6描述H11与肿瘤细胞提取物的结合。
图7通过固定细胞ELISA(cell-fixed ELISA)描述H11与人肿瘤细胞系的结合。浅色柱表示H11，暗色柱表示对照抗体。
图8描述表达载体pSJF1的图。
图9描述用固定细胞ELISA作Mab H11和H11-scFv之间抗原相似性测定。
图10描述生物素化、淋巴瘤细胞特异性H11-scFv(粗线)和BGA scFv(细线)的相对荧光强度。
图11描述用固定细胞ELISA测定生物素化H11-scFv与淋巴瘤细胞、RAMOS、Daudi、CA-46和CCRF-CEM细胞结合的活性效价。抗体浓度从起初的10微克/毫升(空心柱)降至5微克/毫升，然后降至2.5微克/毫升，最后降至1.25微克/毫升(双交叉线)。
图12描述与肿瘤细胞系结合的H11-scFv和对照scFv的相对荧光强度。A是A-375(黑色素瘤)，B是SK-BR-3(乳房腺癌)，C是HT-29(结肠腺癌)，D是CA-46(Burkitt氏淋巴瘤)、E是RAMOS(Burkitt氏淋巴瘤)、F是H9(T细胞淋巴瘤)、G是CCRF-CEM(急性淋巴母细胞淋巴瘤)。
图13描述125I-H11-scFv与LS174T细胞的结合。
图14描述111I-H11-scFv与A-375细胞的结合。
图15描述用于转染和表达H11-IgG的哺乳动物表达载体pNB2。
图16描述用于转染和表达H11-IgG的哺乳动物表达载体pNB3。
图17描述125I-H11-scFv在P-2微型色谱柱上的纯化(A)和125I-H11-scFv在85％甲醇中的纸上色谱(B)分析。
图18描述125I-H11 IgM在Sephadex G-25微型色谱柱上的纯化(A)和125I-H11IgM在85％甲醇中的纸上色谱(B)分析。
图19描述111In-DTPA-H11-scFv在Sephadex G-50微型色谱柱上的纯化(A)和111In-DTPA-H11-scFv用ITLC-SG/0.1柠檬酸所作的分析(B)。
图20描述在裸鼠体内111In-H11-scFv与A375异种移植肿瘤的结合。
本发明最佳实施方案
本发明包括抗原结合性片段，例如一新鉴定的特异性识别癌细胞的人Mab。此特异性只扩展到癌细胞，所述抗体不识别非癌细胞。实例性抗体被称为H11，其可变区由SEQ ID NO：1和4编码(SEQ ID NO：3和6分别是1和4的互补链)，并且识别称为“C抗原”的抗原。H11的特异性包括(但不限于)对以下癌症的特异性：成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤、乳房腺癌、肺腺癌、小细胞肺癌、结肠腺癌和前列腺腺癌。
如本文实施例所述，H11和H11-scFv不识别来自被测正常组织的非癌细胞。H11和αC抗原结合性片段因此可以用来缓解与多种癌症相关的临床病症。本发明包括抗原结合性片段，该片段识别的抗原是H11特异性识别的抗原(称为C抗原)的抗原结合性片段。本发明还包括H11的多肽衍生物和将所述组合物用于诊断、治疗和制造新药的方法。本发明还包括编码αC、H11及它们的衍生物的聚核苷酸。本发明还包括该聚核苷酸的使用方法。
本发明还包括对C抗原具有免疫学特异性的αC衍生物。所述衍生物包含多肽序列区，后者包含部分H11的VDJ连接。本发明还包括横跨至少1个H11 CDR氨基酸序列的区域，跨2个为佳，跨3个更好。
没有测定H11 L链和H链C区的完整序列，但是估计与其它人免疫球蛋白的C区相同或近乎相同。而且，对V区氨基酸序列的认识使我们能用任何C区作亚克隆。所述的亚克隆技术是本领域所熟知的。用此类克隆技术产生的嵌合分子也包括在本发明之内。
用H11 IgM和scFv抗体克隆筛选一市售七肽噬菌体文库，证明在N末端有一段高度共有序列，具有以下氨基酸序列：Phe-His-Arg-Tyr-Ser/Thr。结果列于表1。
                             表1
H11 IgM筛选出的序列        M1 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
                           M2 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Asp-Tyr
                           M3 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
                           M4 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Pro-Thr
                           M7 Phe-His-Arg-Tyr-Thr-Pro-Gly
                           M8 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
                           M10 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Pro-Thr
scFv H11筛选出的序列       S2 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
                           S5 Met-His-Arg-Tyr-Thr-Pro-Leu
DNA序列使用多种密码子，表明来自差异较大的噬菌体。例如，Arg由三联密码子CGx和AGx族编码，此外，将H11五肽共有序列与序列数据库比较显示与Ca+2结合蛋白S100族有同源性。结果见表2。
                        表2
H11  五肽                  Phe-His-Arg-Tyr/Thr
S.griseus蛋白              Phe-His-Arg-Tyr-Ser(氨基酸251-255)
花生矮小病毒               Phe-His-Arg-Tyr-Ser(氨基酸540-544)
人钙细胞周期蛋白           Phe-His-Lys-Tyr-Ser(氨基酸16-20)
囊性纤维化Ag               Tyr-His-Lys-Tyr-Ser(氨基酸16-21)
在此所述的共有五肽序列属于本发明范围之内。
本申请所述的某些化合物、组合物和方法主要涉及αC及其衍生物，它们通常由经典免疫化学技术产生。其中包括经化学偶联与其它化合物交联的αC，或者与赋形剂或佐剂混合的αC。“抗原结合性片段”包括以癌细胞特异性方式与C抗原结合的肽。典型的是，所述衍生物包括诸如Fab、F(ab’)2、scFv(单体或聚合体形式)和分离的H和L链等免疫球蛋白片段。抗原结合性片段保留了H11的特异性，但是亲和力和/或亲和性可能改变。尤其是在此所述的H11-scFv。
抗原结合性片段(又称“衍生物”)通常由遗传工程产生，虽然它们也可以利用其它方法和将多种方法组合产生。这类片段包括但不限于H11 CDR的多肽片段、含有细胞因子效应成分的抗体融合蛋白，包含佐剂或药物的抗体融合蛋白，以及单链V区蛋白。
本发明还包括编码H11抗体V区及其衍生物的聚核苷酸。其中包括分离的聚核苷酸片段、重组聚核苷酸和包含聚核苷酸的治疗用质粒和载体例如牛痘载体。所述的聚核苷酸以SEQ ID NO：1、3、4、6、13、15、16和18为例。
本发明的药物组合物和治疗方法适用于激发抗瘤形成的免疫应答。特别适用的治疗对象包括但不限于成胶质细胞瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌症(包括小细胞肺癌)的癌症人患者。
由于H11已显示出能特异性地识别多种癌，它尤其适用于癌症的诊断、造影和治疗。合适的癌症包括肿瘤学领域已知的任何一种，包括但不限于星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、初级神经外胚层肿瘤(PNET)、胰管腺癌、小细胞和大细胞肺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、和上述癌症的肝转移、肝癌、胆管腺癌、乳房肿瘤(如导管性和小叶性腺癌)、子宫颈鳞状细胞癌和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移变性鳞状细胞癌、B细胞和T细胞淋巴瘤(淋巴结和扩散性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
患者可能处在疾病的弯曲，此时治疗目标可能包括减缓或逆转病情进展，以及改善副作用。患者可能有过该病病史并接受过治疗，此时治疗目标通常包括减少或延迟复发的危险性。
此外，本发明的抗原结合性片段可用作诊断和造影剂。对此，后文将作详细说明。
“H11”是将一患有低等级神经胶质瘤的64岁男性的外周血淋巴细胞融合而得到的，系与人骨髓细胞系融合产生的杂交瘤称为NBGM1/H11。实施例1对H11的产生和鉴定进行了说明。“αC”代表抗体或其抗原结合性片段，可以是单克隆的、多克隆的或者是它们的衍生物，它们特异性地识别C抗原并能够区别癌细胞和非癌细胞。αC包括H11。
αC的“免疫学活性”指与C抗原特异性结合的能力。所述的结合可能激发也可能不激发免疫应答。特异性免疫应答可能包含抗体、B细胞、T细胞和它们的各种形式组合、以及因此而产生的效应器功能。其中包括抗体介导的功能ADCC和补体介导的细胞溶解(CDC)。T细胞应答包括T辅助细胞功能、细胞毒性T细胞功能、炎性/诱导性T细胞功能和T细胞介导的抑制。能够诱导以上标准中任何一项特异性免疫应答的化合物被称为是“免疫原性的”。
αC“活性”或“功能”指本发明中所述αC的各种免疫活性，或者指H11的任何其它生物活性，其中包括H11在检测、改善或缓解癌症中的作用。
H11的“V区”指H11的L链或H链的V区，单独的或二者组合的。SEQID NO：2和5中有所描述；编码它们的DNA在SEQ ID NO：1和4对分别作了描述。
GM-CSF、IL-2和其它生物活性分子在此指包括以生物或生理功能相同的相应亲本分子为基础的片段和衍生物。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此相互替用，都表示各种长度的氨基酸残基聚合物。聚合物可以是直链或者是支链的，它可能包含修饰过的氨基酸或氨基酸类似物，而且，它可能被非氨基酸的其它化学基团间断。该术语还包括经天然修饰或人工修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其它操作或修饰，例如与标记性或生物活性成分交联。若非另作说明，αC或H11包括具有H11免疫学特性的任何多肽单体或聚合物，其中包括完整的αC抗体和比它小或大的功能相当的多肽。
“融合多肽”是所含若干区域在序列中的位置不同于天然的多肽。所述区域可能是在分开的蛋白质中，但在融合多肽中被放在一起；它们也可能通常存在于同一蛋白但在融合多肽中被重排了；或者，通过合成而被重排。例如，如下文所述，本发明由αC的功能性部分和某毒素构成的重组蛋白(及编码该蛋白的聚核苷酸)。产生此类融合蛋白的方法是本领域已知的，例子常见WO93/07286中有所说明。
αC多肽的“功能等价的片段”因各种添加、缺失或取代的联合运用而不同于天然序列，但是它至少保留了本文所用有关片段的一个功能。αC聚核苷酸的“功能等价的片段”或者编码表达系统产生的功能与H11相当的多肽，或者用在杂交测试中具有与H11聚核苷酸相同的杂交特异性。αC多肽“功能等价的片段”通常具有以下一项或多项特性：结合C抗原的能力；以特异性方式结合至少一种癌细胞的能力；和激发免疫应答反应的能力，所述的应答反应与H11激发的应答反应具有相同的抗原特异性。
“聚核苷酸”是各种长度核苷酸的聚合形式，含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其任何类似组合物。
聚核苷酸可能具有三维结构，并可能具有任何已知或未知的功能。“聚核苷酸”包括双链、单链和三螺旋分子。除非另作说明，在此所述的任何聚核苷酸实施例既包括双链形式，也包括两条互补的单链，所述单链形成已知的或预计会产生的DNA或RNA双链或杂交分子形式。
以下是聚核苷酸的非限制性举例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组聚核苷酸、分支聚核苷酸、质粒、载体、分离的各种序列的DNA、分离的各种序列的RNA、核酸探针和引物。聚核苷酸可能包含经修饰的核苷酸、如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶基(uracyl)、其它糖和连接基团如含氟核糖和硫酯(thioate)、和核苷酸支链。核苷酸序列可能被非核苷酸间断。聚核苷酸可以在聚合后(如与标记成分交联)作进一步修饰。其它修饰包括加帽、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、引入某种结构将核苷酸与蛋白质、金属离子、标记成分、其它聚核苷酸或固相支持物连接。
“重组”聚核苷酸指基因组、cDNA、半合成或合成的聚核苷酸，它们不是天然存在，或者以不同于天然的排列方式与其它聚核苷酸连接。
“载体”指重组DNA或RNA质粒或病毒，它们包有经体外或体内向靶细胞传递的异源聚核苷酸。异源聚核苷酸可含有对治疗目的有用的序列，并可选择表达盒形式。本文所用，载体不一定是能够在最终靶细胞或机体中复制的载体。该术语包括用于复制聚核苷酸的克隆载体，和用于翻译聚核苷酸编码序列的表达载体，还包括含有包裹在病毒粒子中的聚核苷酸的病毒载体。
“细胞系”或“细胞培养物”指体外生长或维持的细菌、植物、昆虫或较高等真核细胞。某细胞的子代可能与亲本细胞在形态上、基因型上或表型上不完全一样。Mab可以由杂交瘤细胞或其它细胞产生。制备小鼠或人的杂交瘤细胞的方法是该领域已知的。本发明描述和参考了具体的产生人杂交瘤的特殊方法。
“宿主细胞”指可用遗传方法改变，或通过给予外源性聚核苷酸(如重组质粒或载体)而遗传上改变的原核或真核细胞。遗传上改变的细胞指最初被改变的细胞及其后代。
“异源”指衍生自基因型与之不同的实体，与该实体相比有共同处，而其余部分则不同。例如，一段聚核苷酸可以通过基因工程技术植入不同来源的质粒或载体中，成为异源聚核苷酸。从其天然编码序列中分离出来并与不同于天然序列的另一编码序列连接的启动子就是异源启动子。
“信号肽”或“引导序列”指一段短氨基酸序列，它引导新合成的蛋白质通过细胞质膜(在真核细胞通常是内质网，而细菌是内膜或者内外壁膜)。信号肽通常位于多肽的N末端，而且通常在多肽生物合成到细胞分泌期间被酶切除。信号肽不存在于分泌蛋白质中，只存在于蛋白质产生期间。
“分离的”聚核苷酸或多肽，指基本上没有天然环境中与之结合的物质。“基本上没有”是指至少50％，较好是至少70％，更好是至少80％，最好是至少90％没有这种物质。
聚核苷酸的“稳定双螺旋”，或任何两或多个成份在生物化学反应中形成的“稳定复合体”，指从形成到以后的检测期间(包括各种选择的洗涤步骤或可能于此间发生的其它操作)持续存在足够久的双螺旋或复合体。
“生物样品”包括各种样品，包括生物来源的血液和其它液体样品，诸如组织活检样品或组织培养基等固体样品，或由其衍生的细胞或细胞的后代。该定义还包括在得到后用各种方式处理过(如用试剂、增溶或富集蛋白质或聚核苷酸等成份)的样品。该术语还包括从各种生物获得的临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清液和细胞裂解物。尤其是，就本发明目的而言，生物样品包括肿瘤组织或被认为是肿瘤性的组织，和通过手术切除、组织活检、抽吸等该领域已知方法获得的样品。
“免疫原”指用于人或动物的组分，其使用目的是使接受者对某特定抗原产生一定程度的特异性免疫反应性。免疫反应性由对目标或目标组合的具有免疫活性的抗体或细胞(具体是B细胞、浆细胞、T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞，及其前体细胞)来执行。就本发明目的而言，目标主要是与癌症相关的C抗原或其肿瘤特异性部分。免疫反应性可能是试验目的所需，治疗某病症所需，消除某物质所需，或预防所需。活性免疫原要求能激发在缺乏疫苗成份时也能持续存在的免疫应答。
“佐剂(可疑患者)(adjuvant)”在此具有几种含义，这取决于使用该词的上下文内容。就药物制备而言，佐剂指一些化学性或生物性物质当其和抗原一同给予或与抗原重组融合时能加强抗原的免疫原性。就癌症的诊断或治疗而言，可疑患者指这样一类患者，它们没有临床可测见的瘤块，但被怀疑有复发的危险。
当说到一般称为实体瘤的癌症时，“临床可检测的”肿瘤指对肿瘤块通过CAT扫描、X光或触诊之类方法可测知的肿瘤。而单用生物学、组织学或免疫学检测就不完全符合这个定义。
此地，“治疗”指为了改变接受治疗的个体或细胞的自然进程而进行的临床干预，可以为预防而进行，也可在临床病理期间进行。要求的治疗效果包括防止疾病的发生或复发，缓解症状、消除疾病的任何直接或间接病理结果、防止转移、减缓疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、以及消除或改善预后。
与某病症相关的“病理学”指包括患病个体的健康、正常生理或生活质量等各种情况。它包括但不限于病发组织向先前健康组织的破坏性入侵、以正常组织功能损失为代价的生长、生物活性的失调或抑制、炎性反应或免疫反应的加剧或抑制、对其它病原生物或因子易感性增加和护理医师即可确定的疼痛、发烧、恶心、疲倦、性格改变及其它不良临床症状。
“有效量”指足以引起有益或所需临床效果的量。有效量可一剂或多剂给予。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展或疾病病理结果的量。就佐剂而言，有效量是足以增强对抗原免疫应答的量。有效量通常由医师根据具体病例确定，属于该领域一般技术范围之内。在确定合适剂量时有几个因素通常需要考虑。这些因素包括患者的年龄、性别和体重，接受治疗的病症，病症的严重程度和所用抗体的形式。例如，为了达到治疗效果，scFv的浓度不必和天然抗体一样高。
“个体”，“患者”或“受治疗者”指脊椎动物，以哺乳动物为佳，最好是人。哺乳动物包括但不限于人、家畜、运动动物和宠物。
除非另作说明，本发明的实施运用了分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都属于本领域技术范围之内。这些技术在文献中有充分的解释，例如“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucliotide Synthesis”(M.J.编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)；“Handbook of Expeimental Immunology”(D.M.Wei & C.C.Blackwell编辑)；“Gene Transfer Vector for Mammalian Cells”(J.M.Miller & M.P.Calos编辑，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编辑，1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”(Mullis等编辑，1994)；“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等编辑，1991)。这些技术可用来生产本发明的聚核苷酸和多肽，并因此可以被考虑用于本发明的再现和实施。为了具体实施，特别有用的技术将在后文的段落中加以论述。
本发明还包括与化学功能性物质交联的αC。典型的是，此类物质是能够产生可检测信号的标记物。例如这种交联的αC可以用于检测系统，如肿瘤负荷的定量、转移病灶的造影和肿瘤造影。此类标记物是该领域已知的，包括但不限于放射性同位素、酶、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物底物辅助因子和抑制剂。例子参见讲述此类标记用途的专利：美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。此类物质可与αC共价连接、重组连接、或者通过第二抗体、蛋白质A或生物素-亲和素复合物与αC交联。
其它功能性物质包括信号肽，增强免疫反应性的物质，促进与固相支持物偶联的物质，疫苗载体，生物反应调节剂，顺磁性标记物和药物。信号肽前文已经说过，包括原核和真核形式。增强免疫反应性的物质包括但不限于细菌超抗原。促进与固相支持物偶联的物质包括但不限于生物素或亲和素。免疫原载体包括但不限于生理学上可接受的缓冲剂。生物反应调节剂包括细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)，白介素-2、白介素-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ干扰素。
合适的药物材料包括抗致瘤性物质，包括但不限于放射性同位素、长春花碱、长春新碱和硫酸长春地新等长春花生物碱、阿霉素、硫酸博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸duanorubicin、盐酸阿霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、洛莫斯汀、盐酸氮芥、美法仑、硫汞啉、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、喷司他丁、哌泊溴烷、盐酸procarbaze、链佐星、紫杉醇、硫尿嘌呤、和乌拉莫司汀。
包括单链分子在内的免疫毒素可用重组技术产生。各种免疫毒素的产生是该领域所熟知，例如此类方法见于“Monoclonal Antibody-toxin Conjugates：Aimingthe Magic Bullet”，Thorpe等，(1982)，Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine，Academic Press，pp.168-190；Vitatta(1987)Science 238：1098-1104；和Winter和Milstein(1991)Nature 349：293-299。合适的毒素包括但不限于蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、假单孢杆菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A链、真菌毒素(例如局限性曲酶素(restrictocin)和磷脂酶)。参见，“Chimeric Toxins”，Olsnes和Pihl，Pharma.Ther.15：355-381(1981)；和“Monoclonal Antidodies forCancer Detection and Therapy”，Baldwin和Byers编辑，PP.159-179，224-266，Academic Press(1985)。
可用重组法制造化学功能性物质，例如创造一融合基因，该基因编码其它抗原结合性片段或基因(例如酶)的功能区。在基因融合中，两种成分存在于同一多肽基因中。或者，αC抗原结合性片段可用各种已知化学方法与该物质化学结合。例如，当该物质是蛋白质时，可用异质双功能交联剂(例如SPDP、碳二亚胺戊二醛等)连接。这些物质可共价连接，或者通过第二抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物之类的第二反应剂连接。顺磁性物质及其与抗体的交联在该领域是熟知的。例子参见Miltenyl等，(1990)Cytometry 11：231-238。
本发明的αC抗体可以几种方法制备。最方便的是从表达含有SEQ ID NO：1和5的抗原结合性片段或编码αC结合性片段的其它聚核苷酸的工程化细胞来获得。例如，可将细胞培养在合适的培养液中，此培养液可作为抗体来源。可选择的是，用包被基质的管道或微珠，或细胞共培养物来加强抗体产生细胞的生长。为了产生大量的抗体，通常以获取腹水更为方便。产生腹水的方法一般包括将杂交瘤细胞注入给原初性组织相容性或免疫耐受性哺乳动物，具体是小鼠。为了产生腹水可以通过给予合适物质(如降植烷)对哺乳动物进行预处理。
或者，可以利用本文揭示的序列资料和其它信息，结合蛋白质合成的标准方法，化学合成αC。合适的方法指固相Merrifield技术。有市售的自动化肽合成仪，如Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)生产的此种仪器。
αC还可用Sambrook等(1989)所述的常规重组方法来获得。例如，用本文提供的氨基酸和聚核苷酸序列(SEQ ID NO：1-6和13-18)和信息，可将编码αC的H链或L链的聚核苷酸克隆到合适的表达载体(含转录调控序列，如启动子)中。然后将该表达载体导入宿主细胞。在合适的条件下宿主细胞，生长聚核苷酸被转录和翻译成蛋白质。可以分别产生αC的H和L链，然后通过二硫键重排来联合。或者，将携有分别编码αC两条链聚核苷酸的载体，或者将携有编码两条链(作为分开来的转录产物)聚核苷酸的载体转染到一个宿主细胞内，该细胞即会产生并组装出完整的αC分子。宿主细胞来自能提供正常糖补给的较高等真核生物为好。这样，产生的αC可用该领域的标准技术来纯化。然后，可从产生αC抗体的杂交瘤获得编码αC的聚核苷酸用于产生αC，或者根据本文提供的DNA序列通过合成或重组产生。
获得αC的另一方法是用C抗原免疫合适的宿主动物，然后按标准方法生产多克隆或Mab抗体。由此产生的Mab可用该领域已知技术“人源化”。人源化抗体的例子可参见美国专利5,530,101和5,585,089。
“人源化”抗体，是为了使它更象人免疫球蛋白，至少其部分序列经改变而不同于其原来形式的抗体。在一种人源化抗体中，H链和L链的C区被人序列取代。这是一种含有H11的V区和异源免疫球蛋白C区的融合多肽。在另一种人源化抗体中，CDR区含有H11的氨基酸序列，而V框架区被换成人的序列。例子参见，欧洲专利EP0329400。在第三种人源化抗体中，通过设计人和小鼠V区的共有序列，并换掉CDR区以外不同于共有序列的残基来将V区人源化。本发明包括人源化的Mab。
在制造人源化抗体时，框架残基的选择对保留高结合亲和性甚为关键。原则上，来自任何HuAb人抗体的框架序列都可作为CDR移植的模板；但是，业已证明，直接将CDR替换成这类框架可能严重损失对抗原的结合亲和性。Glaser等(1992)，J.Immunol.149：1606；Tempest等(1992)Biotechnology 9：266；和Shalaby等(1992)J.Exp.Med.17：217。HuAb与原muAb(小鼠抗体)越是同源，人框架扰乱鼠CDR降低亲和性的可能性越小。根据对抗体序列数据库进行的序列同源性检索发现，HuAb IC4与muM4TS.22具有良好的框架同源性，虽然其它高度同源性HuAb也适合，特别是人I亚群的κL链或人III亚群的H链。Kabat等(1987)。可得到各种计算机程序如ENCAD(Levitt等(1983)J.Mol.Biol.168：595)来预测理想的V区序列。所以，本发明包括具有不同V区的HuAb。确定合适的V区序列并优化这类序列属于该领域技术人员的一般技能。获得免疫原性降低的抗体的方法也可参见美国专利5,270,202和699,755。
产生和分离抗体的方法是该领域熟知的。例子参见，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbour Laboratory，NewYork。H11抗体是一种IgM亚类人免疫球蛋白，可用适合该型免疫球蛋白的技术来分离。纯化方法包括盐析(如用硫酸铵)、离子交换色谱(如阳离子或阴离子交换柱以中性pH上样。用离子强度梯级液洗脱)、凝胶过滤色谱(包括凝胶过滤HPLC)和蛋白A、蛋白G、羟基磷灰石和抗免疫球蛋白之类亲和树脂色谱。H11还可以在含有C抗原的亲和色谱柱上纯化；例如以纯化Ab1或Ab3的形式。较好的方法是，H11用蛋白A-CL-SepharoseTM4B色谱柱纯化，随后用DEAE-SepharoseTM4B离子交换色谱柱纯化。
本发明还包括杂交抗体，其一对H和L链来自第一抗体，而另一对H和L链来自不同的第二抗体。就本发明目的而言，一对L和H链系来自αC。在实施例之一中，各对L-H链结合C抗原的不同位点，这样的杂交体也可用人源化的H或L链形成。
本发明构想的另一种αC是H或L链经修饰后提供附加特性的抗体。例如，氨基酸序列变化可能导致所得多肽免疫原性降低。这种变化的范围从一个或几个氨基酸的改变到完全成重新设计某个区域(如C区结构域)。典型的变化包括但不限于与补体固定有关的变化、与膜受体相互反应有关的变化，和与其它效应器功能有关的变化。可设计重组抗体来帮助将某物质(如细胞因子)向肿瘤细胞特异性传递。本发明还包括各个免疫球蛋白结构域排列顺序不同于天然的肽。
如果αC用于人，宜至少80％纯，至少90％纯更好，至少95％纯还有好，而且应无热原和其它杂质。本文中，百分纯度是按制剂中总蛋白成份的重量百分比计算的，不包括在αC纯化后特地加入组合物中的组份。
αC抗体具有多种用途。包括激发产生ααC(抗αC)的抗体应答，ααC再用于激发对αC或C抗原的T细胞应答，和治疗各类癌症。后文将对这些用途进行更详细的说明。
本发明包括αC的多肽片段，它至少含有αCV区的一部分。优选的片段是具有H11免疫活性的片段。优选的还有含有实质上不同于其它免疫球蛋白的氨基酸序列的片段，和含有CDR的片段。在一个实施方案中，本发明包括一个αCH链V区的多肽片段，它含有SEQ ID NO：2的至少25个连续氨基酸(30个连续氨基酸更好)，或者其CDR1的5个连续氨基酸，或者其CDR2或CDR3的至少7个连续氨基酸，至少9个连续氨基酸更好。本发明还包括一段αCL链V区的多肽片段，它含有SEQ ID NO：5的至少25个连续氨基酸(30个连续氨基酸更好)，或者其CDR2的7个连续氨基酸，或CDR1或CDR3的至少8个连续氨基酸，10个连续氨基酸更好。
αC多肽的大小可以是仅仅提供所需功能的最小长度。多肽可根据需要或任选地含有αC原有的、或者异源来源的附加序列。αC多肽可以只含有不同于A6同源区的H11 V区序列内的5个连续氨基酸。含有αCL或H链V区内7个氨基酸，较好的是大约10个，更好的大约15个，还要好的是大约25个，再好的是大约50个，更加好的是大约75个氨基酸的多肽也包括在内。最好的是含有完整αCL链和H链V区的多肽。多肽来自H11为好。多肽是SEQ ID NO：14和17所描述的scFv更好。
本发明包括经修饰的αC多肽，它们与H11功能等价，或者具有虽有改变但可测的H11免疫活性。具有改进的H11免疫活性的修饰多肽为优。修饰多肽的例子包括显著损害H11免疫活性的氨基酸残基的保守性取代、一个或几个氨基酸的缺失或加入的那些。
实例之一是与原型H11序列相比，含有一个或几个被转换氨基酸的H11多肽。此种转换范围从改换或修饰一个或几个氨基酸残基到完全重新设计一个区域(例如V区)。如果存在氨基酸取代，以不损害肽的折叠或功能特性的保守性取代为佳。可作保守性取代的功能相关性氨基酸分组是：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷胺酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。本发明的多肽可以是糖基化形式或非糖基化形式，可以在翻译后修饰(例如，乙酰化和磷酸化)，或者通过合成来修饰(如连接标记基团)。
可以如下形成含有H11的L链和H链的H11多肽衍生物，即先形成单独的L链和H链然后组装，或者由表达两链的同一表达系统原位组装而成。这类表达系统可用含有分开的L链和H链各自转录区的质粒，转染合适的细胞，或者用各链的质粒共转染同一细胞来创建。第三种方法，将含有H链编码区的合适质粒转染到H链缺失的突变体中。
H链缺失的突变体可以通过用荧光标记的抗小鼠IgG(H链特异性，DAKOCorporation，Carprinteria，CA)按照供应商的说明处理约2×107个H11产生细胞来获得。着色和未着色细胞群用荧光激活细胞分析仪分析。将未着色细胞收集在一无菌试管中，  用有限稀释法置入96孔板中，每孔1个细胞。然后用山羊抗小鼠IgG(H链特异性)和山羊抗小鼠κELISA来测定培养上清液。将κ阳性和IgG阴性的克隆进行亚克隆至少3次以获得稳定的H11(-H)突变细胞。可分离出假定为H链缺失的H11(-H)克隆的mRNA，并确定其L链V区cDNA的序列。反向PCR用用于克隆H11(-H)cDNA两组5’-和3’-引物进行反向PCR(实施例7)。H链缺失的突变细胞不产生可测得的DNA条带。所述细胞的转染用合适的H链质粒进行。
本发明包括的另一种αC衍生物，是αCH或L链经修饰以提供附加功能的抗体。例如，氨基酸序列的改变可能使所得的多肽具有更大的免疫原性。这种改变的范围从一个或几个氨基酸的变化到完全重新设计一个区域(如C区结构域)。构想的变化影响到补体固定、与膜受体的相互作用和其它效应器功能。还可设计重组H11抗体来帮助将某物质(如细胞因子)向肿瘤细胞特异性传递。本发明还包括各个免疫球蛋白结构域排列顺序不同于天然的蛋白质。
本发明还包括H11的单链V区片段(scFv)。单链V区片段是通过用一段短连接肽将L链和/或H链的V区连接产生的。Bird等(1988)Science 242：423-426。具有足够柔性和长度的任何肽都可以用作scFv内的接头。通常，应选择几乎没有或完全没有免疫原性的接头。连接肽的一个实例是(GGGGS)3，它跨接在一个V区的羧基末端和另一V区的氨基末端，约3.5纳米长。其它接头序列也可以使用，并可能提供附图功能，例如用于连接药物或固体支持物的结构。
H或L链的所有或任何部分可以各种组合形式使用。典型的是，将整个V区被包含在scFv中。例如，L链的V区可以与H链的V区连接。或者，L链V区的一部分可以与H链的V区或其一部分连接。还考虑这样的scFv，其中H链的V区来自H11，而L链的V区来自另一免疫球蛋白。还可能构建这样的双相scFv，其中的一个组份是H11多肽，而另一组份是不同多肽(如T细胞表位)。
scFv可以任意顺序组装，例如VH-(接头)-VL或者VL-(接头)-VH。例如，SEQID NO：13和16显示具有VL-(接头)-VH形式的H11-scFv2结构。但是，SEQ IDNO：13中显示的结构形成了单体，而SEQ ID NO：16中显示的结构形成二聚体。在具体的表达系统中，这两种构型可能在表达水平上有差异，其中一种形式可能被优选表达。还可以形成串联scFv，例如(X)-(接头)-(X)-(接头)-(X)，其中的X是αC多肽，或αC多肽与其它多肽的组合体。在另一种实施方案中，单链抗体多肽没有接头多肽，或者只有一段很短的柔性接头。实例性构型包括VL-VH和VH-VL。连接键太短，以致于同一链中的VL与VH之间无法相互作用，故这两条链在两端由VL/VH的抗原结合位点形成同样的二聚体。这种分子在该领域中称为“孪生双体(diabody)”。
scFv可用重组法或合成法产生。scFv的合成产生，可使用自动化合成仪。scFv的重组产生，可将含有编码scFv的聚核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞(真核细胞如酵母、植物、昆虫或哺乳动物，或原核细胞如大肠杆菌)，并用标准蛋白质纯化技术分离聚核苷酸表达的蛋白质。
产生scFv的特别有用的系统是质粒pET-22b(+)(Novagen，Madison，WI)在大肠杆菌中表达。pET-22b(+)具有由6个连续组氨酸残基构成的镍离子结合区，这允许表达蛋白质可用合适的亲和性树脂纯化。另一例合适的载体是前文所述的pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)。
表达条件必须确保scFv具有功能，具有最佳的三级结构则更好。根据所用的质粒(特别是启动子的活性)和宿主细胞，可能需要调节产生速度。例如，使用较弱的启动子，或在低温下表达，可能是在原核系统中产生正确折叠的scFv进行条件优化所必需的。或者以在真核细胞中表达scFv为佳。
优选的scFv包含SEQ ID NO：2中的至少10个连续氨基酸和SEQ ID NO：5中的至少10个连续氨基酸，具体地说，SEQ ID NO：2中的氨基酸与SEQ ID NO：5中的氨基酸通过一个5至20个氨基酸接头多肽连接，或者是含有H11的L链V区和H链V区。
本发明还包括αC多肽的聚合物形式，它含有许多αC多肽。实例之一是αC多肽的线性聚合物，或选择与载体交联。这种线性聚合物可以包含同一αC多肽的多个拷贝，或者由不同的αC多肽组合而成，并且可以是串联的αC多肽，或者被其它氨基酸序列隔开的多个αC多肽。另一实例是αC多价抗原肽(MAP)。MAP具有一个小的免疫惰性核心，核心具有呈放射分枝状的赖氨酸树突，树突上共价连接了许多αC多肽。例子参见，Posnett等(1988)J.Biol.Chem.263：1719-1725；和Tam(1989)Meth.Enz.168：7-15。结果是形成一巨大分子，具有很高的αC多肽与核心之摩尔比。MAPs是免疫试验的有效免疫原和有用抗原。用于构建αC MAP的核心可用标准的肽合成技术来制造，或者购买。例如购自Quality ControlledBiochemicals，Inc.，Hopkinton，MA。一种典型的核心基质是由三层赖氨酸和8个氨基酸构成的。
在使用αC多肽作为免疫原时，多肽最好以与载体联接形式传递。各种载体均可使用，只要它对宿主无害。合适的载体一般是大的代谢清除慢的分子，如蛋白质、多糖(如功能化的乳胶Sepharose、琼脂糖、纤维素、纤维素珠之类)、聚氨基酸(如聚谷氨酸、聚赖氨酸等)、氨基酸共聚物和无活性病毒粒子或减毒细菌(如沙门氏菌)。尤其有用的载体蛋白是血清白蛋白、钥孔蓝血蛋白(KLH)、某些Ig分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和破伤风类毒素，特别以KLH为优。
本发明的αC多肽可用多种方法来鉴定。例如，可用下法筛选L和H链的V区，即制备一系列短的聚核苷酸，它们加起来覆盖了整个V区的氨基酸序列。使用长度为20或50个氨基酸的一系列多肽，可以检测出功能特性有用的各种αCV区。还可进行蛋白质序列的计算机分析，以鉴定出可能有用的多肽，例如那些具有D2形态的多肽，或与独特型-抗-独特型接触有关的多肽。
本发明还包括以各种形式联合的本节所述αC的各种版本，以产生具所需性能的其它αC多肽。例如MAP中可包含氨基酸残基被修饰的αC多肽。另一个例子是αC scFv与细胞因子(如IL-2)融合。设想到的所有这些联合均属于本发明范围之内。
本发明的多肽可用任何一种合适的方法来制备，包括αC抗体的蛋白水解、重组法或化学合成法。这些方法是该领域已知的，在此没有必要详细说明。蛋白水解酶的实例有但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、血纤蛋白溶酶和凝血酶。完整的αC可以同时或者先后与一种或多种蛋白酶一起孵育。或者还有，可用二硫键还原剂来处理完整抗体。然后可用该领域已知技术来分离肽，这些技术包括但不限于凝胶过滤、色谱、凝胶电泳和反向HPLC。
制备αC多肽，还可在合适的表达系统中以编码多肽(根据本申请其它部分所述的信息)的聚核苷酸来表达。通常，将编码αC多肽的聚核苷酸连到表达载体上，在合适的启动子控制下，并用在遗传上改变的所需宿主细胞。真核和原核宿主系统均可使用。然后从裂解的细胞或培养液中分离多肽，并纯化到使用所需的纯度。本发明适用的原核宿主细胞如大肠杆菌，真核细胞如禽类、昆虫、植物和动物细胞，包括但不限于COS7，HeLa和CHO细胞。
在某些应用中，例如在合适的保藏介质(例如植物种子)中表达H11多肽时，H11多肽可以不经纯化而使用。Fiedler等(1995)Biotechnology 13：1090-1093。就大多数应用而言，通常多肽从其它细胞组份中至少部分纯化为佳。较好的是，按总蛋白重量百分率计，多肽纯度至少约50％。更好的是，蛋白质纯度至少50-75％。对临床使用而言，多肽纯度宜至少约80％。
本发明还包括在生物样品中检测C抗原的方法。该方法包括获取生物样品，在允许抗体抗原结合的条件下将生物样品与αC接触，以及测定抗体与抗原的结合，如果有的话。
本发明还包括在生物样品中检测抗H11和抗αC的方法。抗αC一旦与H11交叉反应就可被检测到。具有此活性的抗αC会在肿瘤相关性疾病的病程中自发产生。有此活性的抗αC尤其可能存在于接受过一段αC治疗的个体中。这些方法可以在临床环境中进行，例如用于监测个体体内的抗体水平，也可以在工业生产环境中(如商品化生产抗H11或抗αC时)进行。
此种试验方法要求在允许靶抗原与H11形成稳定复合物的合适条件下，让本品中的抗H11或抗αC靶抗体与H11抗体或多肽相接触，并检测形成的稳定复合物。在测试前，以合适的方法制备样品，可以是抗体浓度进行富集。在使用完整的鼠αC时，通常宜消除样品中所有可能存在的抗鼠免疫球蛋白活性。例如用正常鼠IgG沉淀或用鼠Ig吸附剂吸附来去除样品中的抗鼠免疫球蛋白抗体。通过对测试试剂的经验性选择，可以将抗鼠免疫球蛋白抗体(特别是对Fc区特异性的)的结合减至最小。合适的试剂有鼠抗原决定基甚少的鼠αC的F(ab’)2或Fab片段，和人源化αC或H11等其它试剂。
在以合适的方法制备了样品后，在允许αC与可能存在的靶抗体之间形成复合物的条件下，将样品与过量αC混合。然后测定复合物的量，并与用标准样品(含有预计范围内已知量的靶抗体)形成的复合物比较。复合物的形成可通过各种该领域已知方法来观测，例如免疫沉淀或浊度法，但是，通常，使用标记(如125I等放射性同位素标记，过氧化物酶和β-半乳糖苷酶等酶，或荧光素之类荧光染料)试剂时的灵敏度更高。
本发明提供编码抗体H11或H11的片段的各种聚核苷酸，它们的根据是本文提供的聚核苷酸序列(SEQ ID NO：1和4)。本节所说各种实施方案，包括H11的H链或L链的V区序列的许多不同组合。简而言之，本发明的H11聚核苷酸编码了H11分子的至少一个专有特性(与其它免疫球蛋白，尤其是与A6抗体相比)。该特性在一定程度上与H11的反应性有关为好。
本发明包括编码H11的L链V区一部分的聚核苷酸，它含有SEQ ID NO：4中至少约70个连续核苷酸，较好的是至少约80个连续核苷酸，更好的是至少约100个连续核苷酸，还要好的是至少约150个连续核苷酸的聚核苷酸。本发明还包括编码H11 L链V区一部分的聚核苷酸，它包含CDR1编码序列的至少约25个连续核苷酸，较好的是至少约30个连续核苷酸，更好的是至少约35个连续核苷酸。本发明还包括编码H11 L链V区一部分的聚核苷酸，它包含CDR2或CDR3编码序列中至少约20个连续核苷酸，至少约25个连续核苷酸更好，至少约35个连续核苷酸则还有好。
本发明还包括编码H11的H链V区的一部分的聚核苷酸，它包含SEQ IDNO：1中的至少约70个连续核苷酸，至少约80个连续核苷酸为佳，至少约100个连续核苷酸更好，至少约150个连续核苷酸则还有好。本发明还包括编码H11L链V区一部分的聚核苷酸，它包含CDR1编码序列中的15个连续核苷酸。本发明还包括编码H11 L链V区一部分的聚核苷酸，它包含CDR2或CDR3编码序列中的至少约20个连续核苷酸，至少约25个连续核苷酸更好，至少约35个连续核苷酸则还有好。
本发明包括分离的编码具有H11免疫活性的多肽的H11聚核苷酸，其中的聚核苷酸编码SEQ ID NO：5中所示H11的VL链的至少5个氨基酸。本发明还包括分离的编码具有H11免疫活性的多肽的H11聚核苷酸，其中的聚核苷酸编码SEQ ID NO：2中所示H1 1的VH链的至少5个氨基酸。此聚核苷酸序列可能与SEQID NO：1或SEQ ID NO：4所示的相似，但是具有为了优化密码子的使用、稳定性、促进克隆或其它目的而设计了一些变化。根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5氨基酸的序列设计这类聚核苷酸属于该领域技术人员的一般技能。优选的聚核苷酸编码H11的CDR的至少5个氨基酸。
本发明还包括编码H11的功能等价的变异体和衍生物，以及它们的功能等价片段的聚核苷酸，它们可能加强、减弱或不明显影响由其编码多肽的特性。这些功能相当的变异体、衍生物和片段显示出特异性识别C抗原的能力。例如，不会改变由其编码氨基酸序列的一段DNA序列内的改变、以及导致氨基酸残基保守性取代的改变、一个或几个氨基酸残基的缺失或增加或以同类氨基酸取代氨基酸残基是不明显影响由其编码多肽性能的那类改变。保守性氨基酸取代有甘氨酸/丙氨酸、缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸、天冬酰胺/谷胺酰胺、天冬氨酸/谷氨酸、丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸、赖氨酸/精氨酸和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。
本发明的聚核苷酸可以包含其它序列，例如同一转录单元内的其它编码序列、调控元件(诸如启动子、核糖体结合位点和聚腺苷酸化位点)、处于相同或不同启动子调控下的其它转录单元、允许克隆、表达和转化宿主细胞的序列、和提供本发明实施方案所需的任何结构。
本发明包括与编码H11的L链或H链的V区的聚核苷酸，而不与本申请时限内已知的其它免疫球蛋白编码区形成稳定杂交体的聚核苷酸，它具有至少约15个连续氨基酸、至少约20个核苷酸为佳，至少约25个连续核苷酸更好，至少约35个连续核苷酸也较好，至少约50个连续核苷酸也较好，至少约75个核苷酸则更好，至少约100个核苷酸则还有好，至少约200个核苷酸更加好，至少约300个核苷酸则更好。为作上述测试也许要用一系列条件，只要有至少一组这样的条件存在，即可测试聚核苷酸是否表现出所要求的特异性。较好的是，测试聚核苷酸所结合的H11编码序列是SEQ ID NO：1和4中所示的那些序列。因为已知免疫球蛋白序列与H11的序列有一定程度的相似性，可以通过待测聚核苷酸与H11序列的杂交和与最密切相关序列的杂交相比较来进行这种测试。较好的是一组约10个与SEQ ID NO：1、3、4或5最密切相关的序列。
杂交反应可以在不同“严谨”程度的条件下进行。提高杂交反应严谨度的条件是众所周知的。例子参见Sambrook和Maniatis。有关条件的实例包括(为了提高严谨度)：25℃、37℃、50℃和68℃的孵育温度；10×SSC，6×SSC，1×SSC，0.1×SSC的缓冲液浓度(其中的SSC是0.15M的NaCl和15mM柠檬酸缓冲液)以及与之用处相当的其它缓冲系统；0％。25％。50％个75％的甲酰胺浓度；5分钟至24小时的孵育时间；1次、2次或更多次的洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤孵育时间；和作为洗涤溶液的6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水。
可按下述方法鉴定有用的编码H11片段的H11聚核苷酸，即产生聚核苷酸片段(例如，根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4)并测试由其编码的多肽是否有所需功能。或者，可以制备由特定聚核苷酸编码的多肽片段，并测试是否有所需功能。或者，如果已知具有所需特性的αC多肽，可以设计出编码该多肽的聚核苷酸。
所有实施方案包括具有以下多肽的编码区的聚核苷酸，这些多肽有H11聚合体、融合蛋白、人源化免疫球蛋白、单链V区和其它有意义的特定多肽。前文已对上述多肽进行了说明。
本发明还提供共价连接可测标记物的聚核苷酸。例如，这种聚核苷酸可用作探针来检测相关核苷酸序列。
本发明聚核苷酸可以通过化学合成、重组克隆方法、PCR或它们的联合应用来获得。聚核苷酸化学合成法是该领域熟知的，在此没有必要详细说明。使用DNA合成仪或向商业机构购买，该领域技术人员可以利用本文提供的序列资料获得所需的聚核苷酸。
或者，可以从产生αC抗体的细胞系、αC克隆载体或αC表达载体来获得αC聚核苷酸序列。编码所需序列的RNA或DNA可用标准重组技术来分离、扩增和加工。这些技术包括用限制性核酸酶消化和用聚合酶链反应(PCR)扩增、或它们的适当联用。PCR技术可参见美国专利4,683,195，4,800,159，4,754,065和4,683,202，以及PCR；The Polymerase Chain Reaction，Mullis等编辑，Birkauswer Press，Boston(1994)。
可以将含所需序列的聚核苷酸插入到适当载体内，然后将载体引入合适的宿主细胞来复制和扩增。聚核苷酸可用该领域的已知方法引入宿主。细胞通过直接摄取、胞吞作用、转染、f-交配或电穿孔引入外源聚核苷酸而被转化。外源聚核苷酸一旦被引入可以非整合载体如质粒维持在细胞内，或者整合到宿主细胞的基因组内。可用标准方法将扩增的DNA从宿主细胞分离。例子参见，Sambrook等(1989)。RNA可以取自转化的宿主细胞，或者可用依赖于DNA的RNA聚合酶直接从DNA获得。
本发明还包括许多含有H11聚核苷酸的载体。这些载体可用来表达重组多肽，也是H11聚核苷酸的来源之一。克隆载体可用来获取所含H11聚核苷酸的复制拷贝，或者作为聚核苷酸保存备用的一种保藏手段。表达载体(和含这些表达载体的宿主细胞)可用来获得所含聚核苷酸产生的多肽。它们还可在需要时(如在基因疗法时)，用来在个体内表达H11，从而具有能够合成多肽的完整细胞。合适的克隆和表达载体包括该领域已知的任何一种，例如用作细菌、哺乳动物、酵母和昆虫表达系统中的那些。具体的载体和合适的宿主细胞是该领域已知的，在此不再详细说明。例子参见，Gacesa和Ramji，Vectors，John Wiley & Sons(1994)。
克隆和表达载体通常含有一个选择标记(例如，编码载体转化宿主细胞存活或生长所需蛋白质的基因)，虽然这样的选择标记基因可以携带在共同导入宿主细胞中的另一个聚核苷酸序列上。只有引入了选择标记的宿主细胞才能够在选择性培养基上生长。典型的选择基因或者是：(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤的抗性基因；(b)补充自养缺陷性基因；或者是(c)提供复合培养基中没有的关键营养素的基因。正确的标记基因的选择取决于宿主细胞，适合不同宿主细胞的基因在该领域是已知的。载体通常还含有宿主识别的复制系统。
合适的克隆载体可以根据标准方法来构建，或者从该领域已有的大量克隆载体中挑选。所选的克隆载体可根据要用的宿主细胞而不同，有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可能具有一个某特定限制性核酸内切酶的靶位，或者带有标记基因。合适的实施例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4、噬菌体DNA和pSA3和pAT28等穿梭载体。上述和其它克隆载体可以从BioRad，Stratagene和Invitrogen等供应商处购买。
表达载体通常是含有编码有用αC多肽聚核苷酸的可复制性聚核苷酸结构。编码αC多肽的聚核苷酸与合适的转录调控元件(如启动子、加强子和终止子)操作性连锁。为了表达(即翻译)，通常还要求的一个或多个转录调控元件例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。调控元件(转录和翻译调控元件)可以来自H11基因，或是异源的(即来自其它基因或其它生物)。还可以包含编码信号肽的聚核苷酸序列，以让αC多肽穿越或进入细胞膜或由细胞分泌出来。许多适合在酵母、禽类和哺乳动物细胞等真核细胞中表达的表达载体是该领域已知的。表达载体的实例之一是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，在其中，转录由巨细胞病毒(CMV)早期启动子/加强子驱动。该载体还含有多种限制性酶的识别位置，用于插入有用的αC聚核苷酸。表达载体(系统)的另一实例是杆状病毒/昆虫系统。
本发明还包括适用于抗体导向(antibody-targeted)基因治疗的表达系统、它含有αC聚核苷酸。有关合适系统的说明可参见Brown等(1994)Virol.198：477-488；和Miyamura等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8507-8511。
包含有用的聚核苷酸的载体可用许多合适的方法引入宿主细胞内，其中包括电穿孔，用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质转染；微粒轰击；脂质转染；和感染(载体是下文诉述的感染性物质，如牛痘病毒)。载体或αC聚核苷酸引入方法的选择一般取决于宿主细胞的性质。
一旦引入了合适的宿主细胞，可用该领域已知的任何一种试验来测定αC多肽的表达。例如，可以通过对培养上清液(如果H11多肽被分泌出来)或细胞裂解液的RIA或ELISA来测定αC多肽的存在。
特别有用的H11聚核苷酸表达载体是可用于制备疫苗的含有H11聚核苷酸序列的牛痘病毒。Moss(1991)Science 252：1662-1667。为了将编码H11多肽(包括H11多肽片段)的聚核苷酸序列导入牛痘苗，先将有用的聚核苷酸序列插入含有牛痘病毒启动子的质粒和与牛痘DNA同源的而非复制所需的侧翼序列的质粒内。然后用牛痘病毒感染含质粒细胞，造成了质粒与病毒之间低水平的同源性重组，结果是牛痘启动子和编码H11多肽的聚核苷酸序列进入牛痘病毒的基因组。通常，H11聚核苷酸插入病毒TK(胸腺嘧啶激酶)基因内。在TK位置内的插入使得病毒与其野生型相比毒性减低了10,000倍以上。Flexner等(1980)Vaccine88(Cold Spring Harbor Laboratory)，pp.179-184。根据TK-表型鉴定出重组病毒。较好的是，H11聚核苷酸的表达处于牛痘早期/晚期启动子(7.5K)的调控之下，由此所得的H11多肽可在病毒的整个生命周期中在其感染的细胞内得以表达。然而，该领域已知的其它启动子或合成启动子也可以使用，例如pH6。H11多肽的表达发生在重组牛痘感染的细胞内，或用活的重组牛痘病毒免疫的个体内。多种牛痘病毒株均可使用，包括但不限于WR、ALVAC和NYVAC。
本发明的载体可含有一个或多个编码αC多肽的聚核苷酸，也可含有编码加强、促进或调节所需结果的其它多肽的聚核苷酸序列，例如淋巴因子，包括(但不限于)IL-2，IL-4，GM-CSF，TNF-α和IFN-γ。优选的淋巴因子是GM-CSF。优选的GM-CSF结构是这样的，它们缺失了3’非翻译区的富含AU的元件和5’非翻译区能够形成发卡环的的序列。本发明还包括编码重组αC变异体如scFv、嵌合体和聚合体的牛痘载体。
本发明的其它实施方案是用上述αC聚核苷酸和含有αC聚核苷酸序列的载体转化的宿主细胞。原核和真核宿主细胞均可使用。原核宿主包括细菌细胞，如大肠杆菌和分枝杆菌。真核宿主包括酵母、昆虫、禽类、植物和哺乳动物细胞。宿主系统在该领域是已知的，在此不必详细说明。哺乳动物宿主细胞实例包括CHO和NSO，可向欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture)(英国)获取。例如用受CMV启动子驱动的质粒转染NSO细胞，然后用谷胺酰胺合成酶扩增细胞中的该质粒，提供了生产蛋白质的有用系统。Cockett等(1990)Bio/Technology 8：662-667。
本发明的宿主细胞还可以用来保藏αC聚核苷酸，或者用作产生αC聚核苷酸和多肽的媒体。它们还可以被用作体内表达αC多肽的媒体。本发明的H11聚核苷酸可以用来在表达系统中产生H11多肽、完整的H11或H11的重组形式，例如下文所述。
本发明的聚核苷酸具有多种用途。例如，它们可以用来在表达系统中产生αC。它们还可以用作杂交探针用该领域熟知的方法检测样品中有否αC聚核苷酸或其相关序列的存在。而且，所述的聚核苷酸还可用作引物来引发所需聚核苷酸的扩增。本发明的聚核苷酸还可以用于疫苗等药物组合物和基因疗法。
所述聚核苷酸还可以用作检测αC编码序列的杂交探针。合适的样品包括用于基因疗法的体外转化细胞。在有关说明中，从样品中提取DNA或RNA，或选性地进行凝胶电泳和/或用限制性核酸内切酶消化。处理后的样品聚核苷酸按常规转移到适合洗涤的介质中。然后，如果样品中含有配对αC序列在可形成稳定双螺旋的条件下，样品聚核苷酸与H11聚核苷酸探针接触。用合适的方法检测所形成的稳定双螺旋。例如，可以提供标记形式的αC聚核苷酸探针，洗涤后样品上留存的标记将直接反映出所形成的稳定双螺旋的量。在另一说明中，杂交是原位进行的。在以合适方法制备的组织样品上铺以标记探针，以显示αC编码序列的位置。
一段短αC聚核苷酸还可以用作PCR反应的引物，具体地说，是用以扩增含有可与引物杂交区域的较长聚核苷酸序列。扩增可以制备规模进行，为了产生用于将来基因操作的聚核苷酸。也可以分析规模进行，例如用于测定待诊断样品中是否存在编码αC的聚核苷酸。
聚核苷酸的另一用途是疫苗和基因疗法。总的原则是，使用聚核苷酸，结果要么促进要么减弱其编码多肽的表达。这样，本发明就包括诱导免疫应答的方法和治疗的方法，包括给予个体有效量的αC聚核苷酸。在这些方法中，编码αC多肽的αC聚核苷酸被直接或者通过用αC聚核苷酸转染的细胞给予个体。所用αC聚核苷酸是环状质粒形式的较好，以超螺旋构型为佳。αC聚核苷酸在细胞内复制更好。所以，αC聚核苷酸应与合适的启动子(例如在靶组织细胞内具有天生活性的异源启动子)操作性连锁。较好的是，一旦进入细胞核，质粒保持为环状非复制性游离基因分子。例如，用质粒结构进行体外突变来编码具有更高亲和性和亲合力的分子。
为了确定含有αC聚核苷酸的质粒是否能够在真核细胞内表达αC，可以用质粒转染COS-7，CHO或HeLa等细胞。然后用免疫试验，如用Western印迹法来测定αC的表达。较小的αC多肽可用下法测定，例如，构建质粒使所得αC多肽与一标记(如靶表位或酶标记)融合。通过纯化此肽，然后用本文所述的一种功能性试验可进一步鉴定所表达的αC多肽。
在一种基因疗法中，用本发明的聚核苷酸在体外从遗传上改变细胞。在这种方法中，用编码αC多肽的载体转染或转导自供体取出或由细胞系获得的细胞，然后给予接受者。适合转染的细胞包括外周血单核细胞。
在另一种基因疗法中，本发明的聚核苷酸被用来在体内从遗传上改变细胞。其目的包括但不限于治疗各种类型的癌症。
αC多肽可用几种方法鉴定。例如，可测试αC多肽与癌细胞特异性结合的能力，测试其特异性抑制癌细胞与完整H11结合的能力。αC多肽还可与抗CDR3多肽反应。还可测试αC多肽缓解或改善瘤形成性疾病(如癌症)的能力。可以理解，虽然具有上述特性中一种以上特性的多肽为佳，但只要有其中一种，就可认定该多肽属于本发明范围。
可用免疫试验来测试αC多肽结合癌细胞或其抗原性片段的能力。任何形式的直接结合试验都合适。在所述测试之一中，癌细胞或推定αC多肽是经标记的。合适的标记包括放射性同位素例如125I，酶例如过氧化物酶，荧光标记例如荧光素和化学发光标记。通常，为了方便洗涤，另一结合配对体是不可溶的(例如包被在微滴板上)。将标记组份与不可溶组份结合后，洗涤固定相，并测定与之结合的标记物量。另一种试验是夹心试验。试验中，推定αC多肽被固定相上的第一抗免疫球蛋白捕获，并利用αC抗体来显现。在上述两个例子中，αC的结合程度都和与固相结合的标记物量直接相关。
为了进行抑制试验，对推定αC多肽减少H11与癌细胞结合的能力进行了滴定。反应中结合的对中被抑制的那一个是标记的，而另一个通常是不可溶的以方便洗涤。推定αC多肽按常规与标记组份混合，然后此混合物与固相结合。与对照多肽相比，具有H11特性的多肽将视固相连接的标记物量按比例减少。这个试验可能比测定直接结合的灵敏度更高，因为αC和C抗原之间的低亲和性结合反应太弱以致于不能形成稳定的键，但在足够高浓度时，却足以干扰其它配体-受体对的结合。
本发明包括单单含有αC的或αC与其它物质结合的药物组合物和免疫原性组合物。这些药物组合物和疫苗要么单独使用要么与其它治疗形式(如化疗或放疗)联用，以激发免疫应答和治疗肿瘤疾病。
含αC抗体、或其聚核苷酸或多肽衍生物作为活性成份的药物组合物的制备是根据广泛认可的药物制剂制备方法来进行的。例子参见，Remington’sPharmaceutical Science第18版(1990)，E.W.Martin编辑，Mack Publishing Co.，PA。根据目的用途和使用方式，在制备药物组合物时，活性成分可能需要进一步处理。合适的处理包括稳定化、与合适的无毒且非干扰性成份混合、分成剂量单元并包装在传递装置中。
例如，液体的药学上可接受的组合物可通过将本文所述多肽溶解或分散在液体赋形剂中来制备，诉述的赋形剂如水、盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇或乙醇。组合物还可以含有其它药物、药剂、佐剂、载体和辅料(例如润湿剂或乳化剂，和pH缓冲剂)。
本发明的药物组合物用与组合物形式相合适的方式来使用。典型的给药途径包括皮下、肌内、腹膜内、透皮、口腔、鼻内和肺内(例如用气雾剂)。本发明的人用药物组合物通常是肠胃外途径给药，最常用的是皮内、皮下或肌内。
口鼻或局部使用的药物组合物可以以固体、半固体或液体形式使用，包括片剂、胶囊、粉剂、液剂和悬浮液。注射用组合物可以以液体溶液或悬浮液的形式、以乳液的形式、或以适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式使用。经呼吸道给药，较好的组合物是用合适的喷雾装置提供固体、粉末或液体喷雾的组合物。虽然不是必需的，药物组合物最好以适合准确量给予的单应剂型提供。而且，本发明构思的还有缓释或持续释放形式，利用上述剂型可以在更长的时间内提供相对恒定水平的活性化合物。
还可以测定本发明组合物特异性识别肿瘤的能力。为此，测试化合物被制备成合适的药物组合物，给予受试者。初步研究最好在鼠或兔之类小动物中进行，可以接着在非人灵长目动物中进行，然后最终在人体内进行。免疫原性宜在过去没有抗体应答的个体中进行。根据合适的治疗方案，给予合适剂量的待测组合物。可能需要在预定范围内比较不同的剂量和方案。上述测试是该领域技术人员的一般技能。
本发明的组合物尤其适合给患有肿瘤疾病的人使用。特别相关的是黑色素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、淋巴瘤和小细胞肺癌。
本发明还包括治疗癌症的方法。这些方法包括给予有效量的含αC药物组合物来获得所需效果(如缓解存在的肿瘤或防止复发)。癌症的治疗，给予药物组合物的量是能有效产生所需效果的量。有效量可以一次给予或多次给予。
所用αC抗原结合性片段的有效量将取决于几种因素，如给药途径、个体状况和所需目的。“治疗有效”指所用抗原结合性片段的量足以缓解癌症。“缓解”指癌症对个体的损伤减少。通常，如果直接给药，每次给药的量约为10微克至20毫克，以250微克至10毫克为佳，300微克至5毫克更好，500微克至2.5毫克则还有好。给药通常每周或两周一次，直至检测到所需的、可测的参数(如疾病症状的减轻)。根据需要，然后可以较低的频度继续给药，例如两周或每月一次。
本发明各种组合物可以单独使用，也可以与其它活性药剂合用，此种活性药剂促进所需的目的，或者提供所需的辅助治疗。合适的活性药剂包括前文所述的抗瘤药和生物反应调节剂和效应细胞(例如Douillard等(1986)在Hybridomas(同上，1：5139)中描述的那些)。
当用于免疫治疗时，αC可以是非标记的或如前文所述用治疗药物标记的。这类药物可以直接或间接地与本发明多肽偶联。间接偶联的例子之一是用臂结构。这类臂结构可以是不溶性或可溶性的(Diener等，(1986)Science 231：148)，并可以挑选能使药物在靶部位从αC上释放出来的。或者，αC和治疗药物可以被翻译、合成、连接或以其它方式产生成单一分子，该分子具有C和治疗药物的两种功能。可以与αC偶联用于免疫治疗的治疗药物的实例，包括但不限于生物反应调节剂、药物、放射性同位素、凝集素和毒素。生物反应调节剂包括淋巴因子，后者包括但不限于肿瘤坏死因子、白介素1、2和3、淋巴毒素、巨噬细胞活化因子、移动抑制因子、集落刺激因子和干扰素。可以用于标记αC的干扰素包括干扰素、β干扰素和干扰素(IFN-γ)，以及它们的亚型。
放射性同位素交联的αC用于免疫治疗时，根据白细胞的分布和同位素的稳定性和放射性，某些同位素可以比其它的更好。如需要，可用下文的体内诊断技术来评价恶性细胞的分布。根据恶性程度，某些放射体可能优于其它。一般讲，免疫治疗选发射α和β粒子的放射性同位素为好。例如，如果动物有实体瘤病灶(例如在癌症中那样)，能够穿透几毫米厚组织的高能β放射体可能较好，例如90Y。另一方面，如果恶性瘤由简单的靶细胞组成(如白血病)，短程高能α放射体可能较好，例如212Bi。可以与本发明的抗原结合性片段结合用于治疗目的的放射性同位素包括但不限于125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、211At、212pb、47Sc、109Pd和188Re。
凝集素通常是从植物性材料分离的蛋白质，它们结合特定的糖基。许多凝集素还能够凝集细胞和刺激淋巴细胞。但是，蓖麻毒蛋白是一种已被用于免疫治疗的毒性凝集素。免疫治疗宜将产生毒性的蓖麻毒蛋白的α肽链与抗体分子结合，使毒性作用可定位特异性传递(给癌细胞)。
毒素是由植物、动物或微生物产生的有毒物质，其在足够剂量时常是致命的。白喉毒素是一种由白喉棒状杆菌产生的可以用于治疗的物质。这种毒素由α和β亚基构成，在合适的条件下二亚基可以相互分开。毒性的A链可以与抗体结合并用于向瘤细胞作定位特异性传递。
例如，这样αC可以与α干扰素合用。这种治疗方式通过增加黑色素瘤细胞表达的Mab反应性抗原增强了Mab的黑色素瘤定向作用。Greiner等(1987)Science 235：895。或者，例如αC可与IFN-γ合用来激活和增加效应细胞的Fc受体表达，继而加强抗原结合性片段与效应细胞的结合并杀死恶性靶细胞。该领域技术人员能够从多种生物反应调节剂中选择出能构建出增强αC效果的所需效应器功能。
当αC如与前文所述的各种治疗药物合用时，两种物质的给药通常基本上是同时的。“基本上同时”指就时间而言，它们的给药相当靠近。通常，治疗药物宜先于αC给药。例如，治疗药物可以比αC早1至6天给药。治疗药物的给药可以逐日，或任何合适的间隔，这取决于恶性瘤的特性、患者状况和药物半衰期之类因素。
使用αC，可以设计联合治疗方法。在与效应细胞或相同治疗药物、或不同治疗药物合用的αC给药之前，可能需要先给以某种治疗药物。例如，患者可以先每日给以IFN-γ和白介素2(IL-2)，治疗3至5天，在第5天给予与效应细胞、IFN-γ和白介素2合用的αC。
本发明还包括以下脂质体的使用，脂质体其膜上结合αC后，它将脂质体特异性地送至表达C抗原的肿瘤或瘤形成性细胞。这类脂质体可制造成含有除αC之外的其它免疫治疗药物，该种药物如前文所述能够在恶性瘤部位释放。Wolff等(1984)Biochem.Biophys.Acta.802：259。Brown等(1994)Virology 198：477-488；和Miyamura等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8507-8511所述的另一种此类传递系统利用嵌合性细小病毒B19衣壳来提呈抗原结合性片段。此类嵌合系统被包括在本发明的用途权利要求中。
αC的给药剂量范围大到足以产生所需的效果，即恶性肿瘤疾病的症状得到缓解，但是不引起不希望的交叉反应、过敏反应等过度的副作用。剂量根据患者的年龄、状况、性别和疾病程度而不同，而且可以由该领域技术人员来确定，由医生根据并发症来校正，剂量为约0.1毫克/千克(体重)至约2000毫克/千克，约0.1毫克/千克至约500毫克/千克更好，可以每日一次或多次给药，持续数天。通常，将αC与治疗药物交联后使用时，可以使用低于在体内免疫诊断造影中所用的剂量。
αC治疗组合物可以注射或逐步灌注来给药。αC抗原结合性片段可经静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、鞘内或透皮给药，可以单独给药或与效应细胞合用。
另一种给药方法是损伤区内给药，例如直接注入肿瘤。对癌症患者进行各种免疫治疗的损伤区内给药不会导致免疫药物全身给药那样的毒性。Fletcher等(1987)Lymphokine Res.6：45；Rabinowich等(1987)Cancer Res.47：173；Rosenberg等(1989)Science 233：1318；和Pizz等(1984)Int.J.Cancer 34：359。
αC尤其适用于脑癌的治疗和造影。当传递部位是脑时，治疗药物必须能被传递到脑。血脑屏障限制了脑和脊索从总循环中吸收许多药物。穿越血脑屏障的分子主要用两种机制：自由扩散；和促进转运。由于血脑屏障的存在，要获得某特定治疗药物在CNS内的有效浓度可能需要使用特殊的药物传递方法。治疗药物向CNS的传递可以通过几种方法实现。
方法之一依赖于神经外科技术。如果是重症患者，尽管有风险，但是外科方法是可行的。例如，治疗药物可以通过直接物理引导(例如心室内、损伤区内或鞘内注射)传递到CNS内。心室内注射可用与容器(例如Ommaya容器)连接的心室内导管。引入方法还可用可重复充电或生物降解的装置。另一种方法是用提高血脑屏障通透性的物质破坏血脑屏障。实施例包括动脉输注扩散性较差的药物(如山梨醇)、提高脑血管透性类药物(如依托泊甙)、或者作用于血管的药物(如白三烯)。Neuwelt和Rappoport(1984)Fed.Proc.43：214-219；Baba等(1991)J.Cereb.bloodFlow Metab.11：638-643；和Gennuso等(1993)Cancer Invest.11：638-643。
此外，可能需要在有治疗需要的区域局部使用组合物；例如，在手术中局部灌注、注射、利用导管、或用植入物来进行。所述植入物是一种有孔性、非孔性或凝胶样物质，它包括膜(如硅化橡胶膜)或纤维，一种此类合适的膜是Gliadel，由Guilford Pharmaceuticals Inc.提供。
另一种方法涉及αC的修饰或选择等药物技术以提供可穿越血脑屏障的类似物。实施例包括，提高分子的疏水性、降低分子的净电荷或分子量、或者修饰分子(例如接上通常能穿越血脑屏障的分子)。Levin(1980)J.Med.Chem.23：682-684；Pardridge(1991)：Peptide Drug Delivery to the Brain；和Kostis等(1994)J.Clin.Pharmacol.34：989-996。
将αC包裹在疏水性环境(如脂质体中)也可有效地将药物传递到CNS。例如，WO91/04014说明了一种脂质体传递系统，药物被包在脂质体中，脂质体上加入了通常能够穿越血脑屏障的分子。
另一种制备能通过血脑屏障的αC制剂的方法是将其包裹在环糊精中。任何能通过血脑屏障的合适环糊精都适用，包括但不限于β-环糊精、γ环糊精及其衍生物。参见，美国专利5,017,566，5,002,935和4,983,586。此类组合物还可以包含乙二醇衍生物，如美国专利5,153,179所述。
还有其它方法，利用生理技术来产生新的嵌合型可转运αC，例如将αC与可转运物质交联。例如，作用于血管的肠肽类似物(VIPa)只有在与特定的载体分子运铁蛋白受体的Mab交联后才发挥其血管作用，这将刺激VIPa-Mab交联物通过血脑屏障的吸收。Pardridge(1991)；和Bickel等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2618-2622。已鉴定了其它几种特异性转运系统，它们包括但不限于用于传递胰岛素或I型和II性类胰岛素生长因子的系统。其它合适的非特异性载体包括但不限于吡啶鎓、脂肪酸、肌醇、胆固醇和葡萄糖衍生物。已报告了几种前药，利用前药，药物在进入中枢神经系统后与载体分离释放成活性药物。美国专利5,017,566。
合适的受治疗者包括被怀疑处于肿瘤(特别是癌)病理作用危险中的人，他们适合接受本发明药物组合物的治疗。有癌症病史的患者尤其合适。适合用此疗法的人按照临床标准区分，包括两类。患有“晚期疾病”或“肿瘤高负荷”的人指有着临床可测见肿瘤的患者。临床可测见肿瘤即瘤体可被检测到(例如通过触诊、CAT扫描、或X光；生化或组织病理学标记阳性本身可能并不足以确定该患者群)。为了缓解它们的病情，本发明的药物组合物被用于此类患者来激发抗肿瘤应答。理想的是引起瘤体减小，但是有益效果包括任何临床改善。临床改善包括肿瘤引起的病理后果的风险减小、发展速度减慢和减弱。
另一类合适的受治疗者在该领域被称为“可疑患者组(adjuvant group)”。这类个体有癌症病史，但对其它治疗已有过效果。先前的治疗可能包括但不限于手术切除、放疗、和常规化疗。结果这些个体没有临床可测见的肿瘤。但是，它们被怀疑有癌症发展的危险性，或者在原肿瘤部位附近，或由于转移。
这类人可进一步分为高危和低危个体。该次级分类是根据最初治疗前后观察到的特征。这类特征在临床上是众所周知的，根据各种癌症有相应的规定。高危亚组病人的典型特征是肿瘤已经侵入邻近组织，或涉及淋巴结。
另一类合适的受治疗者是具有遗传癌症易患性但是还没有癌症临床症状证据的。例如，乳房癌相关性基因突变测试呈阳性的育龄妇女，他们可能希望接受预防性αC治疗以防止癌症的发生，不至于发展到实施预防性手术。
为了激发抗癌应答，对可疑患者组患者，或两亚组病人使用本发明的药物组合物。理想的是，组合物延迟了癌症的复发，更好的是，消除了复发的危险性(即提高了治愈率)。此类参数可以通过与其它患者群及其它治疗方式的比较来确定。
当然，两亚类患者之间有重叠，而本发明化合物可以在任何合适的时候使用。例如，αC治疗可在高肿瘤负荷患者进行常规治疗之前或期间进行，并在肿瘤变为临床不可测之后继续进行。αC治疗可在最初属于可疑患者组但正呈现复发迹象的患者中持续进行。护理医师将决定如何以及何时使用本发明组合物。
本发明的各种化合物和组合物还有其它临床适应征，对此下文只是一个综述。
适应征之一是体外细胞治疗。这可能是因试验目的，或是为了治疗肿瘤患者。一个实施例中，给予培养细胞αC，此种培养细胞为献血者的外周血细胞或合适的细胞系。为此目的H11的有效剂量约为0.5至2微克/毫升。第二个实施例中，献血者细胞用本发明的表达载体作遗传改变，将细胞给于接受者后提供αC的不断分泌。
本发明还包括体内检测癌细胞的方法。给予需要肿瘤造影的人诊断有效量的带有可测性标记的αC。“诊断有效量”指带有可测性标记的αC的用量足以使得肿瘤被检出。
带可测性标记αC的使用浓度必须足以与带有C抗原的细胞结合，与背景比较，可被测出。而且，为了提供最佳的目标-背景信号比，要求带可测性标记的αC从循环系统中被迅速清除。
原则上，用于体内诊断的带可测性标记的αC剂量在某种程度上是患者特异性的，取决于年龄、性别和疾病严重程度等因素。αC的剂量可以从0.01毫克/平方米至约500毫克/平方米不等，0.1毫克/平方米至约200毫克/平方米为佳，约0.1毫克/平方米至约100毫克/平方米最好。这种剂量可根据该领域技术人员已知的输注次数、肿瘤负荷及其它因素而变化。例如，用花青苷交联的Mab体内标记肿瘤。Ballou等(1995)Cancer Immunol.Immunother.41：257-263。
就体内诊断性造影而言，在放射性同位素选择中，检测仪器的类型是主要考虑因素。所选的放射性同位素必须具有可以被给定类型仪器测中的衰变类型。体内诊断选择放射性同位素的另一个重要因素，是放射性同位素的半衰期必须长到足以在被目标最大吸收时仍能被测出，但又短到足以对个体的有害辐射减至最低。理想的是，用于体内造影的放射性同位素没有粒子发射，但是产生大量140-250keV范围内的光子，它们很容易被常规的γ摄影仪检测到。就造影而言，111In-H11-scFv(例如2毫克用5毫居里111铟标记的scFv)的剂量范围是每个患者约0.01毫克至20毫克，约0.1至10毫克为佳，约1至5毫克则更好。
为了进行体内诊断，放射性同位素可以直接与αC结合，或者利用一个中间官能团与之间接结合。常被用来将金属离子放射性同位素与免疫球蛋白连接的中间功能性基团是双功能螯合剂，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)以及类似分子。可以与αC结合的金属离子典型例子有111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Y和201Tl。
为了体内诊断(例如在磁共振造影(MRI)或电子自旋共振(ESR)中)的目的，αC还可以用顺磁性同位素来标记。总之，为了显示诊断造影的任何常规方法均可使用。通常，将发射γ和正电子的放射性同位素用于摄影造影，而将顺磁性同位素用于MRI。此类技术中特别有用的元素包括157Gd、55Mn、162Dr、152Cr和56Fe。αC还可以用荧光染料标记用于体内诊断。
αC还可在体外测试中用来检测瘤形成。从患者获取样品，然后用αC进行合适的免疫测试，以检测C抗原的存在。这在检测携C抗原的肿瘤细胞在患者血流中循环的淋巴瘤和白血病中特别适用。
αC还可以用来监测个体内恶性肿瘤的缓解过程。所以，通过测定表达C抗原的细胞数量的增加或减少，或者各种体液中C抗原浓度的改变，可能确定以缓解恶性肿瘤为目标的特定治疗方法是否有效。
本发明包括包含αC的试剂盒。使用αC的诊断程序可由诊断实验室、使用实验室、医师或私人进行。临床样品可以但不必须为了富集待测物而进行预处理。然后，用户使用盒内试剂检定诊断组份的变化水平。
每个试剂盒包括用于检测样品C抗原的αC。或选的是，试剂与标记交联，使得能检测出样品中与C抗原形成的复合物。在另一种选择中，提供第二试剂，它能够在第一试剂找到目标后与第一试剂结合从而提供可测标记。例如，标记的抗鼠IgG可作为第二试剂与完整αC合用。如果基本试剂已经用生物素标记，则可将标记的亲和素作为第二试剂。
试剂盒可以用来测试包括液体样品、细胞悬浮液和组织样品在内的各种生物样品。本文所述的试验都属于可以试剂盒形式提供的使用αC的合适试验。各种试剂均以适合保存的固体或溶解/悬浮在缓冲液形式提供，在测试时交换或加入反应介质中。试剂盒具有合适的包装。试剂盒还可以但不必须提供用于测试过程的其它组分。这些任选的组分包括但不限于缓冲剂、捕俘剂、显影剂、标记、反应表面、检测装置、对照样品、说明书和解释资料。
以上提供了制备H11、以及编码H11的聚核苷酸、H11多肽片段及其它衍生物的详细说明。参照本文提供的H11的序列资料，本领域一般技术人员能够实施本发明的方案。以下实施例用于说明而非限制本发明范围。
                          实施例1 获取Mab H11的方法
Mab NBGM1/H11(“H11”)是一种人单克隆IgM抗体，它可与以下人肿瘤组织和相应的肿瘤细胞系反应：神经胶质瘤、恶性黑色素瘤、结肠腺癌和乳房腺癌。实施例2说明了Mab NBGM1/H11的体外鉴定。
H11融合细胞是将取自一64岁低等级神经胶质瘤男性患者的8×106外周血淋巴细胞与TM-H2-SP2人骨髓细胞系融合得到的。TM-H2-SP2细胞系是IgG(κ)亲本细胞系TM-H2的一个免疫球蛋白非分泌性亚系，是一未知的人骨髓瘤样细胞系的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(EC 2.4.2.8)缺陷型衍生细胞，它选择性生长在6-硫代鸟嘌呤(6微克/毫升)抗性的0.8％甲基纤维素培养基上但是不能生长在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶培养基中。TM-H2-SP2的核型是46±2，XX。
将所得的活的杂交瘤细胞分散在40个微格中，密度为2×105细胞/格即0.2毫升/格。融合H11的生长率为40个可能含有杂交瘤的格中有12个(30％)。持续生长的生长定义为培养物不断增加，持续生长3个月以上；杂交瘤生长失败的情况发生为融合3个月后未见细胞生长。
用抗原俘获酶联免疫吸附测试(ELISA)在微滴板上进行杂交克隆的筛选，使用多克隆抗人IgM或IgG作为包被抗原。如果测得的光密度(O.D.)值超过对照培养上清液平均本底水平2标准离差(standard deviation)以上，则认为杂交瘤培养上清液呈阳性。
NBGM1/H11杂交瘤克隆的选择是通过固定细胞ELISA进行的。对6个(经测定具有高IgM或IgG分泌)微滴格的培养物上清液用预先附着固定的人肿瘤细胞系(成胶质细胞瘤(SKMG-1和D-54MG)；黑色素瘤(A-375)；结肠腺癌(SK-CO-1))进行筛选。如果测得的O.D.值超过对照培养上清液平均本底水平2标准离差以上，则认为杂交瘤上清液呈阳性。由NBGM1/H11杂交瘤产生的Mab持续与上述肿瘤细胞系反应。“H11”抗体是IgM(κ)。
对NBGM1/H11杂交瘤种子库的鉴定由微生物学协会(MicrobiologicalAssociates)(Rockville，MD)进行。这些细胞对以下测试呈阴性：(1)细菌和真菌污染，(2)支原体污染，(3)HIV-1和HIV-2抗原和(4)HTLV-1和HTLV-2抗原。
用于鉴定Mab NBGM1/H11的方法包括：抗原捕获ELISA，抗原ELISA，固定细胞ELISA，流式细胞计数，人肿瘤细胞系的免疫过氧化物酶染色和人肿瘤或正常组织的免疫组织化学(参见后文实施例)。
                         实施例2
Mab H11与人成胶质细胞瘤(SKMG-1)和黑色素瘤(A375)细胞系结合
                    的流式细胞计数分析
为了测定Mab H11与肿瘤细胞的结合，通过与PBS-EDTA孵育使生长在T形瓶中的肿瘤细胞脱下。低速离心收集细胞，用冰冷却的PBS-1％FBS洗涤，再离心，吸弃上清液。沉淀细胞重悬在分别添加了以下成分的培养液中：对照人黑色素瘤IgM；杂交瘤NBGM/H11培养上清液；或含有纯化Mab H11的PBS；在冰上孵育30分钟。孵育后，离心收集细胞，重悬在PBS-FBS中进行洗涤，离心。然后沉淀细胞再与FITC交联的山羊抗人IgM孵育30分钟。孵育后，细胞用PBS-FBS洗涤。最后，将细胞重悬在PBS-FBS中，加入碘化丙锭(PI)，并洗涤细胞。对PI阳性和FITC阳性的细胞作流式细胞计数。
流式动细胞计数分析的结果列于图2、3和4。这些结果显示，粗制和纯化形式的Mab H11与活的人肿瘤细胞系(包括成胶质细胞瘤、黑色素瘤、乳房腺癌和结肠腺癌)上表达的细胞表面相关抗原结合。
                        实施例3
           Mab H11与人肿瘤细胞系的冻融提取物结合
                    的ELISA分析
为了测定H11特异性结合人肿瘤抗原的能力，ELISA测试板被用人肿瘤细胞提取物包被，提取物是通过反复冻融成胶质细胞瘤(SKMG-1)、乳房腺癌(BT-20，MB-468和MB-453)、结肠腺癌(SK-CO-1和HT-29)细胞制备的。
包被的ELISA测试板在2至8℃孵育16至18小时，室温下用PBS-3％BSA封闭1小时。然后，测试板在室温下用Mab H11的PBS溶液、或对照IgM的PBS溶液、或培养液孵育2小时。洗涤测试板，用生物素化的抗人IgM孵育，接着用链霉亲和素交联的碱性磷酸酶孵育1小时。洗涤后，在各测试板上加入磷酸对硝基苯底物，孵育后，在ELISA测试板读数仪中于405纳米处读数。
Mab H11与人肿瘤细胞提取物的结合显示在图5和6中。这些结果表明，Mab H11以剂量依赖性方式，与由成胶质细胞瘤、乳房腺癌和结肠腺癌细胞制备的肿瘤细胞提取物结合。
                        实施例4
             用免疫过氧化物酶染色法测定
             Mab H11与人肿瘤细胞系的结合
为了测定H11的免疫反应性，进行了以下实验。肿瘤细胞在24格测试板中在盖玻片上培养48至96小时。用PBS洗涤细胞，用甲醛固定、用5％正常山羊血清的PBS溶液孵育30分钟。洗涤后，细胞与杂交瘤NBGM1/H11培养上清液或纯化的Mab H11(10微克/毫升)或加有对照的人骨髓瘤IgM培养液一起孵育2小时。然后，洗涤细胞，并与抗人IgM交联HRP孵育。最后洗涤细胞，与DAB底物孵育以显示Mab H11的结合，用苏木精反染色，并在GVA中计数。
Mab H11免疫反应性的结果显示在表3中，其中反应性以阴性(--)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)表示。这些结果显示，根据免疫过氧化物酶染色法测定，被Mab H11识别的表位可由多种不同类型的人肿瘤细胞和细胞系表达。
                           表3细胞系/肿瘤种类                                     反应性
                                  对照IgM                   Mab H11人成胶质细胞瘤SKMG 1                                   --                       +++U-118 MG                                 --                       ++U-87 MG                                  --                       ++人恶性黑色素瘤A-375                                    --                       +++SK-MEL-5                                 --                       ++人结肠腺癌SK-CO-1                                  --                       ++人乳房腺癌MG-468                                   --                       ++MB-453                                   --                       +BT-20                                    --                       ++BT-474                                   --                       ++人肾腺癌SW-839                                   --                       ++人成骨肉瘤SAOS-2                                   --                       ++人卵巢腺癌SK-OV-3                                  --                       ++
                            实施例5
      用固定细胞ELISA测定的Mab H11与人肿瘤细胞系的结合
也用固定细胞ELISA测定了H11与人肿瘤细胞和细胞系的结合。通过与EDTA-PBS的孵育将生长中的肿瘤细胞从T形瓶上脱附。离心收集细胞，用PBS洗涤，重悬在培养液中，计数，在96格ELISA测试板的每格中加入含5,000-10,000个细胞的50微升细胞悬液。在细胞附着测试板后，去除培养物上清液，测试板用PBS-BSA封闭。然后，细胞与不同浓度(1-20微克/毫升)的Mab H11或对照人骨髓瘤IgM孵育2小时。孵育后，洗涤测试板，与生物素交联山羊抗人IgM孵育，再次洗涤，然后与链霉亲和素交联碱性磷酸酶孵育。最后，洗涤测试板，与磷酸对硝基苯底物一起孵育，在ELISA测试板读数仪中于405纳米处读数。
用固定细胞ELISA测得的MabH11对人肿瘤细胞系的反应性结果显示在表4和图7中。在表4中，用对照IgM 10微克/毫升和H11 10微克/毫升来检测反应性，所得值以405纳米处的吸光度±标准偏差表示。这些结果显示：1)Mab H11即使在1微克/毫升低浓度仍与成胶质细胞瘤细胞(SKMG-1)强烈反应，而20微克/毫升的对照IgM不与SKMG-1细胞反应；2)Mab H11识别多种肿瘤(乳腺癌、结肠腺癌、恶性黑色素瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺腺癌、小细胞肺癌和前列腺腺癌)细胞系上的肿瘤抗原。Mab反应性的程度随肿瘤和肿瘤细胞系种类而不同。MabH11对癌和肿瘤细胞的的反应性比对照IgM高3至10倍。
                          表    4细胞系/肿瘤种类                         反应性(405纳米处的O.D.)
                    对照IgM               Mab H11人成胶质细胞瘤SKMG 1                 0.21±0.01             0.95±0.06D-54-MG                0.13±0.02             0.43±0.07U-87 MG                0.13±0.02             0.60±0.01成神经细胞瘤SK-N-SH                0.14±0.02             0.96±0.06SK-N-MC                0.17±0.03             1.00±0.05恶性黑色素瘤SK-MEL-5               0.18±0.03             1.42±0.04SK-MEL-28              0.19±0.03             1.79±0.05乳房腺癌MB-453                 0.68±0.18             2.85±0.14MB-468                 0.60±0.03             2.39±0.10SK-BR-3                0.60±0.03             2.14+0.13T47D                   0.58±0.01             2.13±0.04BT-20                  0.57±0.02             2.70±0.13BT-474                 0.61±0.03             2.20±0.17肺腺癌SW-900                 0.20±0.02             0.68±0.10SK-LU-1              0.19±0.02              0.57±0.07A-427                0.22±0.01              0.88±0.07小细胞肺癌NCI-H69              0.25±0.04              1.42±0.20NCI-H82              0.20±0.09              1.16±0.13结肠腺癌SK-Co-1              0.27±0.03              0.98±0.11HT-29                0.37±0.02              1.78±0.20前列腺腺癌PC-3                 0.17±0.01              0.60±0.01DU-145               0.15±0.01              0.52±0.01肾腺癌SW-839               0.2±0.01               1.43±0.01成骨肉瘤SAOS-2               0.24±0.02              1.22±0.07U-2OS                0.13±0.0               1.93±0.05膀胱细胞癌T-24                 0.13±0.01              1.25±0.03卵巢腺癌SK0-OV-3             0.12±0.01              1.14±0.02喉癌HEP-2                0.25±0.01              1.25±0.01正常人成纤维细胞GM-8333              0.13±0.01              0.39±0.01
                       实施例6
          H11的免疫解剖学分布和免疫病理学分析
免疫组织化学被用来确定H11对组织和肿瘤内显微解剖学细节和异质性的特异性。该技术的局限性在于可能因被研究的分子表达水平低而造成假阴性结果，和由于抗体结合类似表位或其它抗原所共有的表位而造成假阳性结果(交叉反应性)。为了克服此局限性，本研究以不含出现非特异性结合的高抗体浓度进行。这可以测出不同组织中交叉反应性。此外，固定分析确立了抗原染色强度和形态保存之间的最佳组合。本实施例提供了IMPATH公司，New York的结果，系在一组选定的正常和肿瘤组织冷冻切片上对H11的细胞特异性和抗原表达进行的研究。该研究使用了直接免疫过氧化物酶技术。
从手术和解剖标本获取组织学正常的人组织。在低温模具中将这些新鲜的组织包埋在OCT(Miles Laboratories，Inc.，Naperville，IL)中，在异戊烷中迅速冷冻，用液氮冷却。将来自IMPATH冷冻组织库的组织切成5微米，放在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上，自然风干，-70℃保存。
非生物素化的H11在冰水中提供并于2至8℃保存的，浓度为200微克/毫升，总体积为3.0毫升。用Novopharm提供的人骨髓瘤IgM(Pierce目录号：#31146)作为阴性对照。两种抗体都用磷酸盐缓冲液稀释至相同的工作浓度(抗体H11滴定实验所指)。过氧化物酶标记的第二抗体是山羊抗人IgM(American Qualex，SanClemente，CA，批号#A112PN)，用PBS稀释至1∶500。
免疫过氧化物酶技术：用间接免疫过氧化物酶法进行免疫组织化学研究。从-70℃的冰箱中取出冷冻切片，自然风干，并按固定方案(固定化细节如下文所述)进行固定。组织切片用5％正常山羊血清的PBS稀释液封闭10分钟，然后与第一抗体(primary antibody)4℃孵育过夜。载玻片用PBS洗涤，再用0.5％的吐温PBS溶液洗涤，然后再用PBS洗涤。用3％过氧化氢/甲醇孵育30分钟封闭内源性过氧化物酶活性，然后用PBS洗涤3次。切片然后与山羊抗人IgM(以过氧化物酶标记的)第二抗体室温孵育15分钟，并如前所述用PBS洗涤。
将组织切片与四氯3，3-二氨基联苯胺(DAB)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)孵育2至5分钟来显示过氧化物酶反应。彻底洗涤组织切片，用通过梯级醇脱水的改良Harris苏木精反染色(Fisher Scientific.Fairlawn NJ)，在二甲苯中洗涤，加上盖玻片。阴性对照抗体背景染色重的组织应反复彻底洗涤。IMPATH提供的人乳房癌(F95-036)是H11的阳性对照。用纯化的人骨髓瘤IgM替代第一测试抗体作为阴性对照。
固定分析的目的是确定具有抗原染色强度和形态保持之间最佳组合的条件。对阳性对照组织用了包括不固定在内的5种固定方案进行测试。测试的固定方案为10％中性缓冲福尔马林(23-25℃)，丙醇(2-8℃)，甲基/丙酮(1∶1V/V，2-8℃)和95％乙醇(23-25℃)。就此研究而言，对H11来说，10％中性缓冲福尔马林具有最佳效果。
使用10％NBF作为固定剂，在阳性对照、人乳房癌组织上测试了一系列抗体稀释度(20.0微克/毫升至0.1微克/毫升)。10.0微克/毫升的抗体浓度具有最佳效果-染色强度最大，阴性对照背景染色不明显。
所得的结果见表5和表6。表5说明H11在正常组织上的反应性，表6说明H11在人肿瘤组织上的反应性。
                       表5组织                  测得的阳性/总数             反应性范围(0-3+)肾上腺                     0/3                           0膀胱                       0/3                           0骨髓                       1/3                           1+脑                         0/3                           0乳房                       0/3                           0子宫颈                     0/3                           0食道                       0/3                           0眼睛                       0/3                           0心脏                       0/3                           0肾                         0/3                           0大肠                       0/3                           0肝                         0/3                           0肺                         0/3                           0淋巴结                     0/3                           0肌肉                       0/3                           0卵巢                       0/2                           0胰腺                       0/3                           0腮腺                       0/3                           0垂体                       0/1                           0前列腺                     0/3                           0皮肤                       0/3                           0小肠                       0/3                           0脊索                       0/3                           0脾                         0/3                           0胃                         0/3                           0睾丸                       0/3                           0胸腺                       0/3                           0甲状腺                   0/3                        0扁桃腺                   1/3                        1+子宫                     0/3                        0WBC                      0/3                        0
                      表6肿瘤       测得的阳性/总数     肿瘤细胞染色％     反应性范围(0-3+)乳房癌           2/3               30-90                1-3+结肠癌           3/3               40-70                1-2+神经胶质瘤       4/6               30-90                1-2+胃癌             3/3               30-50                1-2+肺腺癌           3/4               10-70                1-2+肺鳞癌           3/3               10-95                1-3+小细胞肺癌       1/2                 30                  1+淋巴瘤           8/8               10-95                1-3+黑色素瘤         3/3               20-95                1-2+卵巢癌           3/3               20-30                1-3+前列腺癌         3/3               20-95                1-2+肉瘤             0/3                 0                    0
所得的结果表明，在70％以上的阳性对照样品中观察到了弱(1+)至强(3+)的反应性。被H11识别的抗原具有限制性分布方式。在IMPATH系统中，H11-般不与被测正常人组织反应。发现不同器官的所有简单上皮细胞，以及分层的上皮细胞和鳞状上皮细胞无反应性。在神经外胚层细胞(包括脑、脊索和外周神经中的那些)也没有发现反应性。中胚层成分例如骨骼、平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞阴性。淋巴起源的组织(包括骨髓、淋巴结、脾脏和胸腺)一般不与抗体H11反应。在被测的一份骨髓样品中的少数细胞和三份扁桃腺样品中一份的生发中心观察到弱(1+)的反应性。
在几乎所有被测的肿瘤(包括乳房、结肠、神经胶质瘤、胃、肺(腺性、鳞性和小细胞性))样品中都观察到了阳性免疫反应性。在这些样品中10％至95％以上的肿瘤细胞中观察到了反应性；染色强度从弱(1+)到强(3+)。但是，抗体H11与被测的三份肉瘤样品都不反应。当样品中存在肿瘤细胞的对应正常细胞时，其中有些但非全部与H11反应。乳房癌、胃癌和前列腺癌中的少数正常细胞与抗体H11反应。具有与抗体H11反应性的大颗粒细胞被认为是嗜伊红性肥大细胞谱系的炎性细胞。
总之，H11一般不与正常人组织反应，但是肿瘤中的某些正常组织除外。H11抗体检测的抗原在几乎所有肿瘤内表达。实施例7 H11的克隆、表达和免疫反应性
为了确定H11-scFv抗体片段特异性结合癌细胞的能力进行了以下实验。
按下法制备单链抗体结构。在Applied Biosystems DNA合成仪上合成H11κ和muV区5’和3’端的特异性引物。所有引物均含有一个用于克隆的限制性核酸内切酶位点。引物5和6还另含有编码(SGGGG)3接头的核苷酸。表7列出了所用的引物，限制性核酸内切酶位点加以下划线。
                    表    7引物                  序列(5’-3’)                 引入的位置1 TAT GAAGACACCAGGCCGATATTGTGTTGACGCAG                 Bbs1(SEQ ID NO：7)2  TA TCCGGATGCAGCCACAGTTCGTTT                         BspE1SEQ ID NO：8)3  TAT TCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG                       BspE1(SEQ ID NO：9)4  TAT GGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT                      BamH1(SEQ ID NO：10)5  TATATA TCCGGAGGTGGTGGATCAGGTGGAGGTGGCTCC            BspE1CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT   (SEQ ID NO：11)6  ACC TCCGGAACCGCCACCGCCAGAGACAGATGGTGCAGC            BspE1
CACATTC                (SEQ ID NO：12)
用引物1和2进行PCR反应合成κ二聚体，用引物3和4合成mu二聚体，用引物1和6合成κ单体，用引物4和5合成mu单体。然后纯化PCR片段，并用它们相应的限制性核酸内切酶消化。SEQ ID NO：13和16描绘了编码核苷酸，SEQ ID NO：15和18则分别描述了互补核苷酸。
用Bbs1和BamH1切割制备含有核糖体结合位点、OmpA信号肽序列、c-myc(9E10)检测标记和组氨酸尾的表达载体pSJF1(参见图8)。通过将相应的κ和mu片段连接到pSJF1中并转化到感受态的TG1大肠杆菌中来组装单体和二聚体结构。利用菌落PCR和限制性核酸内切酶消化筛选所得的菌落以确认大小准确的插入片段，并利用双脱氧荧光测序来验证序列。
含有H11单体或二聚体表达质粒的转化TG1在26℃振荡培养24小时，然后加入IPTG至最终浓度0.1微摩尔。细胞再培养16小时，然后离心收获。通过先用蔗糖缓冲液(25％蔗糖，1毫摩尔浓度EDTA，10毫摩尔浓度pH8.0的Tris)处理再用冰冷的休克缓冲液(10毫摩尔浓度pH8.0的Tris，0.5毫摩尔浓度MgCl2)处理来释放含有H11抗体的周质蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹法来验证表达。用载镍色谱柱(Pharmacia HiTrap螯合柱)纯化抗体，用渐进梯度的咪唑洗脱被结合的抗体。纯化后的抗体以PBS/0.02％叠氮化钠进行透析，浓缩至0.5毫克/毫升。
还用固定细胞ELISA测定了Mab H11和H11-scFv片段间的抗原相似性。ELISA板以A375细胞包被，与Mab H11、对照IgM、H11-scFv或对照BGA-scFv孵育，然后根据需要与兔抗人IgM抗体或兔抗-scFv抗体孵育。先加入山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶然后加入底物来进行检测。结果(如图9所示)证明H11 IgM和H11-scFv都具有高亲和性，而对照IgM和BGA-scFv具有低亲和性。
为了确定生物素化的H11-scFv对生物素化的对照scFv的相对特异性，进行以下实验。将人肿瘤细胞固定到ELISA测试板上，如前所述地与生物素化的H11-scFv或生物素化的对照scFv孵育。
在固定细胞ELISA中，生物素化的H11-scFv表现出对肿瘤细胞系的亲和力大大高于对照(8至50倍)。表8和图10显示了浓度为2.5微克/毫升的H11-scFv或BGA-scFv的相应数据。
图11说明的是表8中与滴定生物素化的H11-scFv结合以下细胞的反应性有关的部分：淋巴瘤细胞Daudi、Ramos、CA-46和CCRF-CEM细胞。H11-scFv在每一被测浓度(1.25至10微克/毫升)均表现出与淋巴瘤细胞的高亲和性，但BGAscFv不这样。
                         表8肿瘤细胞系                  反应性(450纳米处的O.D.±标准偏差)
                     生物素化BGAscFv          生物素-H11-scFv人成胶质细胞瘤SKMG 1                     0.01±0.01               0.56±0.04U-118 MG                   0.01±0.02               0.47±0.03D-54 MG                    0.01±0.00               0.50±0.02成神经细胞瘤SK-N-MC                    0.01±0.00               0.50±0.02恶性黑色素瘤SK-MEL-5                   0.02±0.01               0.61±0.04A-375                      0.12±0.03               0.97±0.03SK-MEL-28                  0.02±0.00               0.71±0.04乳房腺癌T47D                       0.02±0.00               0.64±0.03MB-468                     0.01±0.00               0.65±0.01SK-BR-3                    0.01±0.00               0.58±0.02BT-20                      0.01±0.00               0.54±0.06BT-474                     0.01±0.00               0.60±0.01肺腺癌SW-900                     0.01±0.00               0.41±0.02SK-LU-1                    0.01±0.00               0.45±0.03A-427                      0.01±0.00               0.40±0.05结肠腺癌SK-Co-1                    0.01±0.00               0.56±0.01HT-29                      0.01±0.00               0.53±0.06LS17T                      0.01±0.00               0.57±0.02成骨肉瘤SAOS-2                     0.02±0.00               0.88±0.06U-2OS                      0.02±0.00               0.93±0.01膀胱细胞癌T-24                       0.02±0.01               0.97±0.05卵巢腺癌SK-V-3                 0.01±0.00                 0.77±0.02喉癌HEP-2                  0.02±0.00                 0.08±0.04前列腺癌DU-145                 0.01±0.00                 0.42±0.02PC-3                   0.01±0.00                 0.36±0.01小细胞肺癌NCI-H82                0.01±0.00                 0.44±0.02NCI-69                 0.01±0.00                 0.44±0.01淋巴瘤细胞系慢性骨髓性白血病K-562                  0.02±0.00                 0.65±0.00急性成淋巴细胞性白血病CEM                    0.04±0.00                 1.4±0.03Burkitt淋巴瘤CA-46                  0.02±0.00                 1.2±0.02RAMOS                  0.04±0.00                 1.3±0.02DAUDI                  0.02±0.00                 1.38±0.01
为了验证生物素化的H11-scFv对癌细胞的特异性，进行以下实验。如前所述，制备恶性肿瘤和正常组织的样本，并与生物素化H11-scFv孵育。
用H11-scFv来染色肿瘤和正常组织的切片。表8显示正常组织的结果，表9显示肿瘤组织的结果。
图12描述的是H11-scFv和对照scFv结合肿瘤细胞系的相对荧光强度。
表9中的数据证明，生物素化的H11-scFv一般不与正常组织反应。几乎所有被测正常组织都显示无可测反应性，只有正常的胰腺和外周神经组织产生一个弱阳性信号。在表9中，-ve表示没有可测反应性，+/-表示弱阳性活性。
                       表    9正常组织                      生物素化的H11-scFv的反应性
                          (50微克/毫升)外皮层                         -ve乳房                           -ve结肠                           -ve心脏                           -ve肝                             -ve淋巴结                         -ve前列腺                         -ve甲状腺                         -ve肾上腺                         -ve小脑                           -ve肺                             -ve胰腺                           +/-外周神经                       +/-皮肤                           -ve脾                             -ve平滑肌                         -ve胃                             -ve胸腺                           -ve
                        表10组织类型        阳性数量/         肿瘤细胞染色       反应性范围
           被测样品总数          百分比            (0-+3)乳房癌            27/31              40/60              1-3+结肠癌            23/26              80/100             1-3+黑色素瘤          13/14              50/70              1-3+前列腺癌          17/20              20/70              1-2+子宫颈鳞状细胞癌  22/24               nd                1-2+子宫颈腺癌         9/9                nd                1-2+Kaposi肉瘤         7/8                nd                1-2+良性结肠           0/2                0                  0
nd：没有测定
表10中的结果表明，在大多数被测的乳房癌(27/31)和结肠癌(23/26)和前列腺癌(17/20)样品中发现了阳性染色。阳性染色被发现于用25微克/毫升浓度的H11-scFv时。虽然发现染色主要存在于肿瘤细胞中，但是在健康和邻近组织上也发现了不同程度的反应性。还测试了H11-scFv对正常组织的特异性。所得的结果列于表11，其中概括了H11-scFv与正常人组织切片的免疫组织化学染色情况。
                        表    11组织                 H11-scFv(25微克/毫升)         3B1 scFv(25微克/毫升)肾上腺                ±                            -～±小脑                  -                             -外皮层                -                             -结肠                  ±                            -乳房                  -～±                         -肾                    ±                            -～±大动脉                -～±                         -心脏                  ±                            -～±肝                    ±～+                         ±肺                    -                             -淋巴结                -                             -胰腺                  -～±                         -垂体                  ±～+                         -前列腺                -(病灶±)                     -(病灶±)外周神经              -～±                         -皮肤                  -(汗腺±)                     -(汗腺±)脾脏                  -～±                         -小肠                  -～±                         -胃                    -～±                         -St.肌(骨骼肌)         -～±                         -～±胸腺                  -～±                         -甲状腺                -～±                         -S94-7474-2(结肠Car.对照)        ++                            -
                          实施例8
         用流式细胞计数测定H11-scFv与活的肿瘤细胞的反应性
为了测试H11-scFv与活的肿瘤细胞的反应性，如实施例2所述制备用于流式细胞计数的各肿瘤细胞系的细胞。如前所述，肿瘤细胞与生物素酰化的H11-scFv或生物素酰化的对照scFv孵育，其蛋白质浓度为100微克/毫升或200微克毫升。测定平均荧光强度和阳性细胞百分比作为反应性。如前所述，制备蛋白质浓度为100微克/毫升或200微克/毫升的生物素酰化的H11-scFv。平均荧光强度和阳性细胞百分比列于表12，#是作为对照scFv的生物素酰化的3B1；*是作为对照scFv的生物素酰化的BGA SL-6；**是作为对照的PBS5％FCS；***是作为对照scFv的生物素-5B1。
                                    表12
    平均荧光强度     阳性细胞％
细胞系 蛋白质浓度(微克/毫升) 生物素酰化的3B1scFv# 生物素酰化的H11-scFv 生物素酰化的3B1scFv# 生物素酰化的H11-scFv
 SK-BR-3(乳房腺癌)     200     149     233     11     36
MB-468(乳房腺癌)     200     144     156     9     11
A-375(黑色素瘤)     200     111     207     10     80
A-375(黑色素瘤)     200     161*     235     28     76
LS-174T(结肠腺癌)     200     182     233     24     37
HT-29(结肠腺癌)     200     141     179     12     18
SKMG-1(神经胶质瘤)     100100     148**149**     206224     914     3127
H9(T淋巴细胞瘤)     100     185***     145     20     13
WI-38(人二倍体肺细胞)     100     293***     255     26     15
125I标记的H11-scFv显示与LS174T细胞的结合亲和力为3×108升/摩尔(Ka)(如图13所示的特异性结合)。111In-H11-scFv显示与A-375细胞结合亲和力为3.6×108升/摩尔(Ka)，与SKMG1细胞结合亲和力为1.4×109升/摩尔(Ka)。结果列于图14。A-375细胞约有24,000结合位点/细胞，SKMG1约有5000结合位点/细胞。
以上结果表明，纯化形式的Mab H11结合于乳房腺癌(SK-BR-3)、成胶质细胞瘤(SKMG-1)和黑色素瘤(A-275)淋巴细胞瘤细胞系上表达的细胞表面相关抗原。
为了进一步测试生物素酰化的H11-scFv与活的淋巴瘤细胞的反应性，如实施例2所述制备来自肿瘤细胞系的细胞，并与蛋白质浓度为100微克/毫升或200微克/毫升生物素酰化的H11-scFv孵育，并用流式细胞计数分析。用流式细胞计数测定平均荧光强度和阳性细胞百分比。scFv结合的对照是生物素酰化的BGAscFv。结果列于表13。
                                     表13
    细胞系     样品 浓度 平均荧光强度 平均荧光强度的增强％ 阳性细胞％
Burkitt氏淋巴瘤CA-46 PBS生物素-BGA scFv生物素-H11-scFv 200100200100     123126133262221 10866     109147658
T细胞淋巴瘤H9 PBS生物素-BGA scFv生物素-H11-scFv 200100200100     150155149186171 2015     687139
急性成淋巴细胞性白血病CCRF-CEM PBS生物素-BGA scFv生物素-H11-scFv 200100200100     151171159231242 3552     814103438
Burkitt氏淋巴瘤RAMOS PBS生物素-BGA scFv生物素-H11-scFv 200100200100     151174169423316 14387     1015139567
                          实施例9
                  用免疫过氧化物酶染色法测定
              生物素酰化的H11-scFv与人肿瘤细胞的结合
为了测定H11-scFv的免疫反应性，进行以下实验。将肿瘤细胞培养在T形瓶中，制备cytospins，并与生物素酰化的H11-scFv或PBS孵育，由此确定结合情况。
H11-scFv的免疫反应性结果列于表14，反应性以阴性(-)，弱阳性(±)，阳性(+或++)表示。以上结果说明，根据免疫过氧化物酶染色测定，有多种不同类型的人肿瘤细胞和细胞系表达了Mab H11识别的表位。
                          表14细胞系/肿瘤种类                               反应性
                              PBS    H11-scFv(50微克/毫升)人成胶质细胞瘤SKMG1                             --               +U-87 MG                           --               +人恶性黑色素瘤A-375                             --               +SK-MEL-5                          --               ++人结肠腺癌SK-CO-1                           --               +HT-29                             --               +174T                                               +人乳房腺癌SK-BR-3                           --               +BT-20                             --               +人淋巴瘤细胞系U-937组织细胞性淋巴瘤             --               ±H9 T细胞性淋巴瘤                  --               +CEM急性成淋巴细胞样白血病         --               -MOLT-3急性成淋巴细胞样白血病      --               ±HL-60前髓细胞性白血病             --               +KG-1急性髓性白血病                --               +K-562慢性骨髓性白血病                   --              +胃癌KATO III                                --              ++人成骨肉瘤SAOS-2                                  --              ±人卵巢腺癌SK-OV-3                                 --              ±膀胱细胞癌T-24                                    --               +喉癌Hep-2                                   --               +
                      实施例10
               重组法产生的H11 gG1的反应性
按下法在中国仓鼠卵细胞(CHO)中产生H11 IgG1。制备几种含有编码H11轻链和重链序列的cDNA的载体。表15显示了这些结构的取向、DNA插入片段和抗生素选择标志，其中，CMV是巨细胞病毒；DHFR是二氢叶酸还原酶；HC是重链；LC是轻链。
                                表15
  载体 DNA插入片段   HC+LC启动子 启动子取向   抗生素选择性     扩增
ppNB1     cDNA重链和轻链     CMV* HC-顺时针LC-逆时针   新霉素   DHFR
pNB2     cDNA重链和轻链     CMV HC-顺时针LC-逆时针   zeocin   DHFR
PNB3     cDNA重链和轻链     CMV HC-顺时针LC-逆时针   zeocin   DHFR
这些表达载体对抗体轻链和重链的编码序列具有相互隔开的插入位点。重链和轻链的高水平组成型表达都是由巨细胞病毒介导的早期(CMV)加强子/启动子指导的。在这个已被证明常能加强基因表达水平的启动子的下游有一嵌合内含子，该内含子含有人β球蛋白第一内含子的5’供体位置和免疫球蛋白基因内含子3’受体位置(重链可变区)。由来自猿病毒40(SV40)的聚腺苷酸化信号提供mRNA的聚腺苷酸化作用。
质粒中还含有编码二氢叶酸还原酶的基因，因而能够培养在中国仓鼠卵巢(CHO)DHFR缺陷型细胞中生长。用氨甲蝶呤、叶酸类似物和强DHFR抑制剂进行的扩增导致DHFR基因及其侧翼序列(即，结构中抗体的轻链和重链)扩增。逐步增加氨甲蝶呤的浓度(从0.01纳摩尔浓度至约800纳摩尔浓度)可以从目标基因产生高水平的蛋白质。该结构中还含有作为选择标记的提供抗生素抗性的基因，所述抗生素或者使用新霉素或者使用zeomycin。载体参见图15和16。
表16显示了重组法产生的H11 IgG1的流式细胞计数分析结果，表明，可以在CHO细胞中生产与乳房癌细胞SK-BR-3上的抗原结合的H11 IgG1。
                           实施例11
                        H11与癌细胞系的结合
用放射性碘或放射性铟标记H11，测定H11 IgM和H11-scFv与各种人肿瘤细胞系的结合亲和力。125I-H11-scFv制备成比放射性为7、20或150微居里/微克，125I-H11 IgM的比放射性为0.6微居里/微克。此外，如实施例12所述制备比放射性为13和38微居里/微克的111In-H11-scFv。不识别C抗原的scFv 3B1被用作对照来指示非特异性结合，它以150微居里/微克进行标记。
如图17所示，用P-2微柱纯化125I-H11-scFv，并在85％甲醇中进行纸上色谱分析。如图18所示，用Sephadex G-50微色谱柱(Pharmacia)纯化125I-H11 IgM，并在85％甲醇中进行纸上色谱分析。如图19所示，111In-H11-scFv用SephadexG-50色谱柱纯化，然后在0.1摩尔浓度的柠檬酸中进行ITLC-SG分析。
图13和14显示了H11结合的结果。图13显示125I-H11-scFv与LS174T人结肠癌细胞的特异性结合。图14显示111In-H11-scFv与A375细胞的总结合。
所获结果表明：H11特异性结合LT174和人黑色素瘤细胞，但以较低亲和力与乳房癌细胞系结合。
                              表12
                 用 111 In-DPTA-H11-scFv的肿瘤造影
以10∶1(DTPA∶H11-scFv)摩尔比将H11-scFv与二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的二环酸酐交联，形成每摩尔H11-scFv 2摩尔DTPA的取代水平。在SephadexG-25(Pharmacia)微色谱柱上从过量的DTPA中纯化DTPA-H11-scFv并用Centricon-30微型浓缩仪(Amicon)再浓缩至10毫克/毫升。用乙酸111In放射性标记DTPA-H11-scFv，至25毫居里/毫克比放射性。用Sephadex G-25微色谱柱去除没有被结合的111In。乙酸111In是由氯化111In(Nordion)和1摩尔浓度pH6.0的乙酸缓冲液制备的。根据100毫摩尔浓度pH5.0的柠檬酸钠中的薄层硅胶柱色谱测定，最终111In-DTPA-H11-scFv的放射化学纯度为99％以上。图19描述了纯化过程和TLC。
给一雌性裸鼠尾静脉注射100微居里的111In-DTPA-H11-scFv，该鼠右侧有皮下有A375黑色素瘤异种移植物，中腹部区皮下有HT-29人结肠癌异种移植物。马上将该鼠置于以一台GE Star 4000i计算机为界面的γ摄影仪之下(SeimansZL3700)，进行120分钟的动态摄影，总共480幅，每幅15秒。然后将所有照片并成12×10分钟图象。早至注射后30分钟就可以在鼠的右侧看见A375肿瘤。
对两种肿瘤的目标区分析显示，A375肿瘤在120分钟的研究全程中累积放射性，而HT-29肿瘤在第一个小时内累积放射性，然后放射性强度则保持相对恒定。图20显示了12幅照片，右下方照片(摄于第120分钟)中的两个箭头指示的是两种肿瘤中的放射性累积。细箭头指示的是A375，粗箭头指示的是HT-29肿瘤。可以在图象上看到的正常组织包括心脏、肝、肾和膀胱。心脏可以看到是因为血循环中的放射性量，肾和膀胱可以看到是因为111In-DTPA-H11-scFv的肾排除。肝的少量吸收可能是因为流向肝脏的血液或111In-DTPA-H11-scFv与肝脏的部分结合。
虽然以上通过说明和实施例对本发明进行了较为详细的描述，目的是清楚说明和使人理解，但是对本领域技术人员来说显而易见的是，可以进行某些改变和修饰。因此，说明和实施例不能理解成是对本发明范围的限定，本发明范围仅由所附的权利要求限定。
                            序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Dan，Michael D.
                Maiti，Pradip K.
                Kaplan，Howard A.
(ii)发明名称：特异性检测癌细胞的抗原结合片段H11、编码所述片段
              的DNA、以及它们在预防和检测癌症上的用途(iii)序列数量：18
(iv)联系地址：
     (A)地址：Morrison & Foerster
     (B)街道：755 Page Mill Road
     (C)城市：Palo Alto
     (D)州：CA
     (E)国家：USA
     (F)邮政编码：94304-1018
(v)计算机可读形式：
     (A)媒质类型：软盘
     (B)计算机：IBM PC兼容机
     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
     (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申请信息：
     (A)申请号：US
     (B)申请日：
     (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
        (A)姓名：Lehnhardt，Susan K.
        (B)登记号：33,943
        (C)参考文献/档案号：31608-20001.20
  (ix)通讯信息：
        (A)电话：(415)813-5600
        (B)传真：(415)494-0792
        (C)电传：706141
(2)SEQ ID NO：1的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：543碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
        (A)名称/代码：CDS
        (B)位置：1..543
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CAAGCTATTT AGGTGACACT ATAGAATACT CAAGCTATGC ATCCAACGCG TTGGGAGCTC     60TCCCATATGG TCGACCTGCA GGCGGCCGCA CTAGTGATTT CAAGCTTCAT CACTGAACAC    120AGAGGACTCA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC TGGGTTTTCC TCGTTGCTCT TTTAAGAGGT    180ATCCAGTGTC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT GGGGGAGGCG TGGTCCAGCC TGGGAGGTCC    240CTGAGACTCT CCTGTGCAGC CTCTGGATTC CCCTTCAGAA GCTTTGCTAT GCACTGGGTC    300CGCCAGGCTC TAGGCAAGGG GCTGGAGTGG GTGGCAGTTA TATCATATGA TGGAAGCACT    360AAATACTACG CAGACTCCGT GAAGGGGCGA TTCACCATCT CCAGAGACAC TTCCAAGAAC    420ACGGTGTATC TAAAAATGAA CAGGCTGAGA ACTGAGGACA CGGCTGTCTT TTACTTGTGC    480GAAAGACAGA GCCTGCTGGG TGACTATGAC CACTACTACG GNTTGGACGC TTGGGGAAAG    540GGA                                                                  543
(2)SEQ ID NO：2的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：179氨基酸
          (B)类型：氨基酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线性
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Gln Ala Ile Val Thr Leu Asn Thr Gln Ala Met His Pro Thr Arg Trp
1                5                  10                  15
Glu Leu Ser His Met Val Asp Leu Gln Ala Ala Ala Leu Val Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Phe Ile Thr Glu His Arg Gly Leu Thr Met Glu Phe Gly Leu Ser
        35                  40                  45
Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly Ile Gln Cys Gln Val Gln
    50                  55                  60
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met His
                85                  90                  95
Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
            100                 105                 110
Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
        115                 120                 125
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys Met
    130                 135                 140
Asn Arg Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Leu Cys Glu Arg
145                 150                 155                 160
Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Ala Trp
                165                 170                 175
Gly Lys Gly(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
     (A)长度：543碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TCCCTTTCCC CAAGCGTCCA ANCCGTAGTA GTGGTCATAG TCACCCAGCA GGCTCTGTCT     60TTCGCACAAG TAAAAGACAG CCGTGTCCTC AGTTCTCAGC CTGTTCATTT TTAGATACAC    120CGTGTTCTTG GAAGTGTCTC TGGAGATGGT GAATCGCCCC TTCACGGAGT CTGCGTAGTA    180TTTAGTGCTT CCATCATATG ATATAACTGC CACCCACTCC AGCCCCTTGC CTAGAGCCTG    240GCGGACCCAG TGCATAGCAA AGCTTCTGAA GGGGAATCCA GAGGCTGCAC AGGAGAGTCT    300CAGGGACCTC CCAGGCTGGA CCACGCCTCC CCCAGACTCC ACCAGCTGCA CCTGACACTG    360GATACCTCTT AAAAGAGCAA CGAGGAAAAC CCAGCTCAGC CCAAACTCCA TGGTGAGTCC    420TCTGTGTTCA GTGATGAAGC TTGAAATCAC TAGTGCGGCC GCCTGCAGGT CGACCATATG    480GGAGAGCTCC CAACGCGTTG GATGCATAGC TTGAGTATTC TATAGTGTCA CCTAAATAGC    540TTG                                                                  543
(2)SEQ ID NO：4的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：450碱基对
         (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
     (A)名称/代码：CDS
     (B)位置：1..450
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：CTCGAGATGG ACATGGAGTT CCAGGCGCAG CTTCTCTTCC TCCTGCTACT CTGGCTCCCA     60GATATCACCG GAGATATTGT GTTGACGCAG TCTCCAGGCA CCCTGTCTTT GTCTCCAGGG    120GAAAGAGCCA CCCTCTCCTG CAGGGCCAGT CAGAGTGTTA GTAGCAGCTA CTTAGCCTGG    180TACCAGCAGA AACCTGGCCA GGCTCCCAGG CTCCTCATCT ATGGTGCATC CACCAGGGCC    240ACTGGCATGC CAGACAGGTC CAGTGGCAGT GGGTCCGGGA CAGACTTCAC TCTCACCATC    300AGTAGACTGG AGCCTGAAGA TTTTGCAGTG TATTACTGTC AGCAGTATGG TAGCTCACCT    360CAGACACCTC AGATCACTTT CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT    420GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT                                     450
(2)SEQ ID NO：5的信息：
     (i)序列特征：
         (A)长度：150氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线性
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Leu Glu Met Asp Met Glu Phe Gln Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu
1               5                    10                  15
Leu Trp Leu Pro Asp Ile Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
             20                  25                  30
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
         35                  40                  45
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
     50                  55                  60
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Thr Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
    130                 135                 140
Phe Ile Phe Pro Pro Ser
145                 150(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
     (A)长度：450碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AGATGGCGGG AAGATGAAGA CAGATGGTGC AGCCACAGTT CGTTTGATCT CCACCTTGGT     60CCCTCCGCCG AAAGTGATCT GAGGTGTCTG AGGTGAGCTA CCATACTGCT GACAGTAATA    120CACTGCAAAA TCTTCAGGCT CCAGTCTACT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCGGACCC    180ACTGCCACTG AACCTGTCTG GCATGCCAGT GGCCCTGGTG GATGCACCAT AGATGAGGAG    240CCTGGGAGCC TGGCCAGGTT TCTGCTGGTA CCAGGCTAAG TAGCTGCTAC TAACACTCTG    300ACTGGCCCTG CAGGAGAGGG TGGCTCTTTC CCCTGGAGAC AAAGACAGGG TGCCTGGAGA    360CTGCGTCAAC ACAATATCTC CGGTGATATC TGGGAGCCAG AGTAGCAGGA GGAAGAGAAG     420CTGCGCCTGG AACTCCATGT CCATCTCGAG                                      450(2)SEQ ID NO：7的信息：
  (i)序列特征：
      (A)长度：34碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TATGAAGACA CCAGGCCGAT ATTGTGTTGA CGCA                                 34(2)SEQ ID NO：8的信息：
  (i)序列特征：
      (A)长度：26碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：TATCCGGATG CAGCCACAGT TCGTTT                                         26(2)SEQ ID NO：9的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：26碱基对
      (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线性
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TATTCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG                                            26
(2)SEQ ID NO：10的信息：
     (i)序列特征：
         (A)长度：27碱基对
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线性
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TATGGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT                                          27
(2)SEQ ID NO：11的信息：
     (i)序列特征：
         (A)长度：60碱基对
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线性
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：TATATATCCG GAGGTGGTGG ATCAGGTGGA GGTGGCTCCC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT     60
(2)SEQ ID NO：12的信息：
    (i)序列特征：
       (A)长度：46碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ACCTCCGGAA CCGCCACCGC CAGAGACAGA TGGTGCAGCC ACATTC                   46
(2)SEQ ID NO：13的信息：
    (i)序列特征：
       (A)长度：918碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
    (ix)特征：
       (A)名称/代码：CDS
       (B)位置：连接(1..906，913..918)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GAA TTC ATG AAA AAA ACC GCT ATC GCG ATC GCA GTT GCA CTG GCT GGT    48Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly1               5                  10                  15TTC GCT ACC GTT GCG CAG GCC GAT ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC    96Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
         20                  25                  30ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC    144Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
     35                  40                  45AGT CAG AGT GTT AGT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT    192Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
 50                  55                  60GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC ACC AGG GCC ACT    240Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr65                  70                  75                  80GGC ATG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCC GGG ACA GAC TTC ACT    288Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
             85                  90                  95CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT    336Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT CAG ACA CCT CAG ATC ACT TTC GGC GGA    384Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
    115                 120                 125GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TCT    432Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ser
130                 135                 140GGC GGT GGC GGT TCC GGA GGT GGT GGA TCA GGT GGA GGT GGC TCC CAG    480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln145                 150                 155                 160GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC    528Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
            165                 170                 175CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC CCC TTC AGA AGC TTT GCT    576Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala
        180                 185                 190ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CTA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA    624Met His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
    195                 200                 205GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGC ACT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG    672Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210                 215                 220GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC ACT TCC AAG AAC ACG GTG TAT CTA    720Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu225                 230                 235                 240AAA ATG AAC AGC CTG AGA ACT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT GCG    768Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
            245                 250                 255AGA GAT CAG AGC CTG TTG GGT GAC TAT GAC CAC TAC TAC GGT TTG GAC    816Arg Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp
        260                 265                 270GTC TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGA TCC GAA CAA    864Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln
    275                 280                 285AAA CTG ATC AGC GAA GAA GAT CTG AAC CAT CAC CAT CAC CAT            906Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His
290                 295                 300TAGTGA AAG CTT                                                     918
   Lys Leu(2)SEQ ID NO：14的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：304氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly1               5                  10                  15Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
         20                  25                  30Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
     35                  40                  45Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
 50                  55                  60Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr65                  70                  75                  80Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
             85                  90                  95Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
    115                 120                 125Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ser
130                 135                 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln145                 150                 155                 160Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
            165                 170                 175Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala
        180                 185                 190Met His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
    195                 200                 205Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210                 215                 220Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu225                 230                 235                 240Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                245                 250                 255
Arg Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp
            260                 265                 270
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln
        275                 280                 285
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu
    290                 295                 300
(2)SEQ ID NO：15的信息：
    (i)序列特征：
       (A)长度：918碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：AAGCTTTCAC TAATGGTGAT GGTGATGGTT CAGATCTTCT TCGCTGATCA GTTTTTGTTC     60GGATCCTGAG GAGACGGTGA CCGTGGTCCC TTTGCCCCAG ACGTCCAAAC CGTAGTAGTG    120GTCATAGTCA CCCAACAGGC TCTGATCTCT CGCACAGTAA TAGACAGCCG TGTCCTCAGT    180TCTCAGGCTG TTCATTTTTA GATACACCGT GTTCTTGGAA GTGTCTCTGG AGATGGTGAA    240TCGGCCCTTC ACGGAGTCTG CGTAGTATTT AGTGCTTCCA TCATATGATA TAACTGCCAC    300CCACTCCAGC CCCTTGCCTA GAGCCTGGCG GACCCAGTGC ATAGCAAAGC TTCTGAAGGG    360GAATCCAGAG GCTGCACAGG AGAGTCTCAG GGACCTCCCA GGCTGGACCA CGCCTCCCCC    420AGACTCCACC AGCTGCACCT GGGAGCCACC TCCACCTGAT CCACCACCTC CGGAACCGCC    480ACCGCCAGAG ACAGATGGTG CAGCCACAGT TCGTTTGATC TCCACCTTGG TCCCTCCGCC    540GAAAGTGATC TGAGGTGTCT GAGGTGAGCT ACCATACTGC TGACAGTAAT ACACTGCAAA    600ATCTTCAGGC TCCAGTCTAC TGATGGTGAG AGTGAAGTCT GTCCCGGACC CACTGCCACT    660GAACCTGTCT GGCATGCCAG TGGCCCTGGT GGATGCACCA TAGATGAGGA GCCTGGGAGC    720CTGGCCAGGT TTCTGCTGGT ACCAGGCTAA GTAGCTGCTA CTAACACTCT GACTGGCCCT    780GCAGGAGAGG GTGCCTCTTT CCCCTGGAGA CAAAGACAGG GTGCCTGGAG ACTGCGTCAA    840CACAATATCG GCCTGCGCAA CGGTAGCGAA ACCAGCCAGT GCAACTGCGA TCGCGATAGC    900GGTTTTTTTC ATGAATTC                                                  918
(2)SEQ ID NO：16的信息：
    (i)序列特征：
       (A)长度：867碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
    (ix)特征：
       (A)名称/代码：CDS
       (B)位置：连接(1..855，862..867)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GAA TTC ATG AAA AAA ACC GCT ATC GCG ATC GCA GTT GCA CTG GCT GGT    48Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly1               5                  10                  15TTC GCT ACC GTT GCG CAG GCC GAT ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC    96Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
         20                  25                  30ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC   144Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
     35                  40                  45AGT CAG AGT GTT AGT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT   192Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
 50                  55                  60GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC ACC AGG GCC ACT   240Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 65                  70                  75                  80GGC ATG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCC GGG ACA GAC TTC ACT    288Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
             85                  90                  95CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT    336Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT CAG ACA CCT CAG ATC ACT TTC GGC GGA    384Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
    115                 120                 125GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA TCC GGA CAG GTG    432Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Ser Gly Gln Val
130                 135                 140CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG    480Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu145                 150                 155                 160AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC CCC TTC AGA AGC TTT GCT ATG    528Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met
            165                 170                175CAC TGG GTC CGC CAG GCT CTA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GTT    576His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
        180                 185                 190ATA TCA TAT GAT GGA AGC ACT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC    624Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
    195                 200                 205CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC ACT TCC AAG AAC ACG GTG TAT CTA AAA    672Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys
210                 215                 220ATG AAC AGC CTG AGA ACT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT GCG AGA    720Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg225                 230                 235                 240GAT CAG AGC CTG TTG GGT GAC TAT GAC CAC TAC TAC GGT TTG GAC GTC    768Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
            245                 250                 255TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGA TCC GAA CAA AAA    816Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys
        260                 265                 270CTG ATC AGC GAA GAA GAT CTG AAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG TGA AAG    864Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His         Lys
    275                 280                 285CTT                                                                867Leu(2)SEQ ID NO：17的信息：
    (i)序列特征：
       (A)长度：287氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly
  1               5                  10                  15
Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
             20                  25                  30
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
         35                  40                  45
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
     50                  55                  60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
 65                  70                  75                  80Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
            85                  90                  95Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
        100                 105                 110Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
    115                 120                 125Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Ser Gly Gln Val
130                 135                 140Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu145                 150                 155                 160Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met
            165                 170                 175His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
        180                 185                 190Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
    195                 200                 205Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys
210                 215                 220Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg225                 230                 235                 240Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
            245                 250                 255Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys
        260                 265                 270Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu
    275                 280                 285(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：867碱基对
    (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：AAGCTTTCAC TAATGGTGAT GGTGATGGTT CAGATCTTCT TCGCTGATCA GTTTTTGTTC     60GGATCCTGAG GAGACGGTGA CCGTGGTCCC TTTGCCCCAG ACGACCAAAC CGTAGTAGTG    120GTCATAGTCA CCCAACAGGC TCTGATCTCT CGCACAGTAA TAGACAGCCG TGTCCTCAGT    180TCTCAGGCTG TTCATTTTTA GATACACCGT GTTCTTGGAA GTGTCTCTGG AGATGGTGAA    240TCGGCCCTTC ACGGAGTCTG CGTAGTATTT AGTGCTTCCA TCATATGATA TAACTGCCAC    300CCACTCCAGC CCCTTGCCTA GAGCCTGGCG GACCCAGTGC ATAGCAAAGC TTCTGAAGGG    360GAATCCAGAG GCTGCACAGG AGAGTCTCAG GGACCTCCCA GGCTGGACCA CGCCTCCCCC    420AGACTCCACC AGCTGCACCT GTCCGGATGC AGCCACAGTT CGTTTGATCT CCACCTTGGT    480CCCTCCGCCG AAAGTGATCT GAGGTGTCTG AGGTGAGCTA CCATACTGCT GACAGTAATA    540CACTGCAAAA TCTTCAGGCT CCAGTCTACT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCGGACCC    600ACTGCCACTG AACCTGTCTG GCATGCCAGT GGCCCTGGTG GATGCACCAT AGATGAGGAG    660CCTGGGAGCC TGGCCAGGTT TCTGCTGGTA CCAGGCTAAG TAGCTGCTAC TAACACTCTG    720ACTGGCCCTG CAGGAGAGGG TGGCTCTTTC CCCTGGAGAC AAAGACAGGG TGCCTGGAGA    780CTGCGTCAAC ACAATATCGG CCTGCGCAAC GGTAGCGAAA CCAGCCAGTG CAACTGCGAT    840CGCGATAGCG GTTTTTTTCA TGAATTC                                        867

Claims (50)

1.一种组合物，其中含有抗体的抗原结合性片段，所述的抗体特异性识别C抗原，所述的C抗原是被所含H链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：2而所含L链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的抗体特异性识别的抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中的抗原结合性片段选自天然全抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、F(ab)2、单链V区片段(scFv)和融合多肽，所述的融合多肽包含与化学功能团融合的抗原结合性片段。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中的天然全抗体是αC抗体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中的αC抗体被称为H11，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的H链和具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的L链。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中的scFv与SEQ ID NO：14和17基本相同。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中的功能团选自信号肽、加强免疫反应性的制剂、有助于与固体载体偶联的制剂、疫苗载体、生物反应调节剂、毒素、可检测标记、顺磁性标记和药物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中的信号肽是原核生物的或是真核生物的。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中的信号肽是真核生物的。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中的加强免疫反应性的试剂是细菌超抗原。
10.根据权利要求6所述的方法，其中有助于与固体载体偶联的试剂选自生物素和亲和素。
11.根据权利要求6所述的组合物，其中的免疫原载体选自任何生理学上可接受的缓冲剂。
12.根据权利要求6所述的组合物，其中的生物反应调节剂是细胞因子。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中的细胞因子选自肿瘤坏死因子、白介素-2、白介素-4、白介素-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ干扰素。
14.根据权利要求6所述的组合物。其中的抗肿瘤药物是选自放射性同位素、长春花生物碱、阿霉素、硫酸博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸duanorubicin、盐酸阿霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、洛莫斯汀、盐酸氮芥、美法仑、硫汞啉、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、喷司他丁、哌泊溴烷、盐酸procarbaze、链佐星、紫杉醇、硫尿嘌呤、和乌拉莫司汀。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中的长春花生物碱选自硫酸长春花碱、硫酸长春新碱和硫酸长春地新。
16.根据权利要求6所述的组合物，其中的毒素选自蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、假单孢杆菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A链、真菌毒素例如局限曲霉素(restrictocin)和磷脂酶。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中的可检测标记选自放射性同位素、荧光化合物、胶质金属、化学发光化合物、生物发光化合物、酶、底物、辅因子和抑制物。
18.一种多肽，它包含SEQ ID NO：2或5中至少5个连续氨基酸。
19.根据权利要求18所述的多肽，其中的5个连续氨基酸残基来自CDR。
20.根据权利要求18所述的多肽，它还包含异源免疫球蛋白C区。
21.一种人源化抗体，它包含权利要求18所述的多肽。
22.一种聚合肽，它包含大量权利要求18所述的肽。
23.根据权利要求1所述的组合物，还包含药学上可接受的赋形剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中的赋形剂是脂质体制剂。
25.一种免疫原性组合物，其中包含权利要求1中的抗原结合性片段，还包含药学上可接受的赋形剂和加强免疫应答有效量的佐剂。
26.一种基本上分离的聚核苷酸序列，它编码抗体的抗原结合性片段，所述抗体特异性识别C抗原，所述的C抗原是被所含H链的V区具有氨基酸序列SEQ IDNO：2而所含L链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的抗体特异性识别的抗原。
27.一种基本上分离的聚核苷酸序列，它编码SEQ ID NO：2或5中至少5个连续氨基酸残基。
28.根据权利要求32所述的聚核苷酸，其中的编码序列包括在SEQ ID NO：1中。
29.根据权利要求28所述的聚核苷酸、其中的编码序列包括在SEQ ID NO：4中。
30.根据权利要求28所述的聚核苷酸，其中的聚核苷酸编码CDR的至少5个连续氨基酸。
31.一种分离的聚核苷酸，其中包含一个至少有20个核苷酸的区域，该区域能够选择性地与具有SEQ ID NO：1或3的聚核苷酸形成稳定的双螺旋。
32.一种分离的聚核苷酸，其中包含一个至少有20个核苷酸的区域，该区域能够选择性地与具有SEQ ID NO：4或6的聚核苷酸形成稳定的双螺旋。
33.根据权利要求26所述的聚核苷酸，所述的聚核苷酸是克隆载体。
34.根据权利要求26所述的聚核苷酸，所述的聚核苷酸是表达载体。
35.根据权利要求34所述的表达载体，所述的表达载体是牛痘苗。
36.一种宿主细胞，它包含权利要求32所述的聚核苷酸。
37.一种药物组合物，其中包含权利要求26所述的聚核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
38.一种免疫组合物，其中包含权利要求26所述的聚核苷酸序列和药学上可接受的赋形剂。
39.一种治疗肿瘤形成疾病患者的方法，它包括给予患者有效量的权利要求1所述的抗原结合性片段。
40.根据权利要求39所述的方法，所述的患者患有临床可测见的肿瘤。
41.根据权利要求39所述的方法，所述的方法用于缓解肿瘤形成。
42.根据权利要求39所述的方法，患者体内曾测得的所述肿瘤已经接受过治疗，在给予抗原结合性片段时临床上已不可测见肿瘤。
43.根据权利要求39所述的方法，它是减少临床可测见肿瘤复发危险的方法。
44.根据权利要求39所述的方法，其中抗原结合性片段的给予是选用皮下、肌内、腹膜内、腔内、鞘内、透皮或静脉注射的肠胃外给药方法。
45.根据权利要求39所述的方法，给药剂量从约0.01毫克/千克/剂至约2000毫克/千克/剂。
46.根据权利要求39所述的方法，其中的抗原结合性片段用治疗性物质标记。
47.根据权利要求46所述的方法，其中的治疗性物质选自放射性同位素、抗肿瘤形成药物、免疫调节剂、生物反应调节剂、凝集素和毒素。
48.一种组合物，其中包含基本上纯化的C抗原，所述的C抗原是被所含H链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：2而所含L链的V区具有氨基酸序列SEQ IDNO：5的抗体特异性识别的抗原。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中的C抗原以免疫原性量存在，组合物还包含加强对C抗原免疫应答有效量的佐剂。
50.检测样品中C抗原的方法，它包括以下步骤：
a)将样品与权利要求1所述的抗原结合性片段在允许形成稳定的抗体-抗原复合物的条件下接触；和
b)检测步骤a)中形成的任何稳定复合物；
所述的C抗原是被所含H链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：2而所含L链的V区具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的抗体特异性识别的抗原。
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