CN1238366C - 利用rna-蛋白融合体筛选蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了用于筛选蛋白分子的方法和试剂,所述方法和试剂利用了RNA-蛋白融合体。

Description

利用RNA-蛋白融合体筛选蛋白
                     发明背景
本发明涉及蛋白筛选方法。
本发明的完成得到了政府的支持,授权号为F32 GM17776-01和F32 GM17776-02。政府拥有对本发明的某些权利。
现在已经存在根据其功能提取RNA和DNA分子的方法。例如,Ellington和Szostak(自然346:818(1990);和自然355:850(1992))和Tuerk和Gold(科学249:505(1990);和分子生物学杂志222:739(1991))的实验业已证实,通过反复筛选和扩增可以从复杂的分子库中提取到极少的(即少于1/1013)具有所需特性的核酸分子。与传统遗传学筛选方法相比,上述方法的优点是(i)可以筛选极大的候选库(>1015),(ii)与宿主生活力和体内条件无关,和(iii)即使不存在体内遗传学筛选,也可以进行筛选。业已证实了所述方法在体外筛选特定的新型RNA和DNA序列的能力,所述新型RNA和DNA序列具有非常特异的蛋白结合功能(例如,参见Tuerk和Gold科学249:505(1990);Irvine等,分子生物学杂志222:739(1991);Oliphant等,分子细胞生物学9:2944(1989);Blackwell等,科学250:1104(1990);Pollock和Treisman,核酸研究18:6197(1990);Thiesen和Bach,核酸研究18:3203(1990);Bartel等,细胞57:529(1991);Stormo和Yoshioka,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5699(1991);和Bock等,自然355:564(1992)),小分子结合功能(Ellington和Szostak,自然346:818(1990);Ellington和Szostak,自然355:850(1992)),和催化功能(Green等,自然347:406(1990);Robertson和Joyce,自然,34:467(1990);Beaudry和Joyce,科学257:635(1992);Bartel和Szostak,科学261:1411(1993);Lorsch和Szostak,自然371:31-36(1994);Cuenoud和Szostak,自然375:611-614(1995);Chapman和Szostak,化学和生物学2:325-333(1995)和Lohse和Szostak,自然381:442-444(1996))。用于筛选和扩增蛋白的类似方法尚未得到证实。
                      发明概述
本发明的目的是,将所述体外筛选和体外进化的原理应用于蛋白。本发明有利于从由部分或完全随机的氨基酸序列组成的大的库中提取具有所需特性的蛋白。另外,本发明通过将所述mRNA编码序列共价连接到所述蛋白分子上解决了回收和扩增所需蛋白序列信息的问题。
一般,本发明的方法包括体外或原位转录/翻译方案,该方法能制备与其自身的mRNA 3’端共价连接的蛋白,即RNA-蛋白融合体。这一目的是通过合成和体外或原位翻译在其3’末端结合有肽受体的mRNA分子而实现的。一种优选的肽受体是嘌呤霉素,一种加在生长肽链C-末端并终止翻译的核苷酸类似物。在一种优选设计中,在所述信使和肽受体之间包括一个DNA序列,将该序列设计成导致核糖体停留在开放读框的末端,以便在所述肽基-tRNA键水解之前提供用于所述肽受体(例如,嘌呤霉素)接受新生肽链的额外时间。
如果需要,可以对所得到的RNA-蛋白融合体进行反复地筛选和扩增,因为可以通过逆转录和扩增(例如,通过PCR扩增以及任何其它扩增技术,包括基于RNA的扩增技术,如3SR或TSA)回收所述蛋白序列信息。然后可以对扩增的核酸进行转录、修饰、以及体外或原位翻译,以产生用于下一轮筛选的mRNA-蛋白融合体。所述进行多个轮次的筛选和扩增的能力可以富集和提取极其罕见的分子,例如,从由1015个成员组成的库中筛选出一个需要的分子。这样又可以提取新的或改进的蛋白,该蛋白实际上能特异识别所有目标,或能催化所需要的化学反应。
因此,第一方面,本发明的特征是一种用于筛选需要的蛋白的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供一群候选RNA分子,每一个分子包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3’末端可操作地连接一个肽受体;(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和(c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体,从而筛选所需要的蛋白。
因此,在一个相关的方面,本发明的特征是一种用于筛选编码一种需要的蛋白的DNA分子的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供一群候选RNA分子,每一个分子包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3’末端可操作地连接一个肽受体;(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;(c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体;和(d)由所述融合体的RNA部分制备一种编码所需要的蛋白的DNA分子。
因此,在另一个相关方面,本发明的特征是一种用于筛选相对参考蛋白而言具有改变了的功能的蛋白的方法,该方法包括以下步骤:(a)由一群DNA模板产生一群候选RNA分子,所述候选DNA模板各有一个不同于所述参考蛋白编码序列的候选蛋白编码序列,所述RNA分子各自包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且各自在其3’末端可操作地连接一个肽受体;(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和(c)筛选具有改变了的功能的RNA-蛋白融合体,从而筛选具有改变了的功能的蛋白。
在另一个相关方面,本发明的特征是一种用于筛选编码一种相对参考蛋白而言具有改变了的功能的蛋白的DNA分子的方法,该方法包括以下步骤:(a)由一群候选DNA模板产生一群候选RNA分子,所述候选DNA模板各自具有不同于所述参考蛋白编码序列的候选蛋白编码序列,所述RNA分子各自包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且各自在其3’末端可操作地连接一个肽受体;(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;(c)筛选具有改变了的功能的RNA-蛋白融合体;和(d)由所述融合体的RNA部分制备一种编码具有改变了的功能的蛋白的DNA分子。
在另一个相关方面,本发明的特征是一种用于筛选需要的RNA的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供一群候选RNA分子,其中的每一个RNA分子包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3’末端可操作地连接一个肽受体;(b)体外或原位翻泽所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和(c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体,从而筛选所需要的RNA。
在上述方法的优选实施方案中,所述肽受体是嘌呤霉素;所述每一个候选RNA分子还包括间歇序列(pause sequence)或还包括一个共价结合于所述RNA的3’末端的DNA或DNA类似物序列;所述候选RNA分子群体至少包括109,优选至少1010,更优选至少1011、1012或1013,以及最优选至少1014个不同的RNA分子;所述体外翻译是在用真核细胞或其部分制备的裂解物中进行的(而且,可以是,例如,在网织红细胞裂解物或小麦胚裂解物中进行的);所述体外翻译反应是在由原核细胞(例如,大肠杆菌)或其部分制备的提取物中进行的;所述筛选步骤包括将所需要的蛋白结合在一种固定化的结合配偶体上;所述筛选步骤包括测定所述需要的蛋白的功能活性;所述DNA分子被扩增;所述方法还包括重复上述筛选方法的步骤;所述方法还包括由所述DNA分子转录RNA分子,并重复步骤(a)-(d);在所述体外翻译步骤之后,该方法还包括一个在有50-100mM Mg2+的条件下进行的温育步骤;而且,所述RNA-蛋白融合体还包括一个靠近所述肽受体的核酸或核酸类似物序列,它能提高其柔性。
在另一个相关方面,本发明的特征是通过本发明任一种方法筛选的RNA-蛋白融合体;一个通过酰胺键共价连接于一个氨基酸序列上的核糖核酸,所述氨基酸序列是由所述核糖核酸编码的;以及一个包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于候选蛋白编码序列上的起始密码子的核糖核酸,所述核糖核酸通过所述候选蛋白编码序列的3’末端可操作地连接于一种肽受体(例如嘌呤霉素)上。
第二方面,本发明的特征是一种用于通过富集一种序列库筛选需要的蛋白或需要的RNA的方法。该方法包括以下步骤:(a)提供一群候选RNA分子,其中的每一个RNA分子包括一个翻译起始序列和一个可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的起始密码子,而且各自通过所述候选蛋白编码序列的3’末端可操作地连接于一个肽受体上;(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;(c)让所述RNA-蛋白融合体群体与一种对所述RNA-蛋白融合体的RNA部分或蛋白部分专一的结合配偶体接触,接触条件为基本上能将所述结合配偶体-RNA-蛋白融合体的复合体与所述群体的未结合的成员分离;(d)从所述复合体上释放出结合的RNA-蛋白融合体;和(e)让来自步骤(d)的RNA-蛋白融合体群体与一种对所需要的RNA-蛋白融合体的蛋白部分具有专一性的结合配偶体接触,接触条件为基本上能将所述结合配偶体-RNA-蛋白融合体的复合体与所述群体的未结合的成员分离,从而筛选需要的蛋白和需要的RNA。
在优选实施方案中,所述方法还包括重复步骤(a)-(e)。另外,在重复进行以上步骤时,可以任何顺序使用相同或不同的结合配偶体,以便选择性地富集需要的RNA-蛋白融合体。在另一种优选实施方案中,步骤(d)涉及使用对所述需要的融合体的蛋白部分具有专一性的结合配偶体(例如,单克隆抗体)。该步骤优选在对所述融合体的RNA部分进行逆转录之后进行,以制备一种能编码所需要的蛋白的DNA。如果需要,可以提取该DNA和/或进行PCR扩增。可将这种富集技术用于筛选需要的蛋白或用于筛选相对参考蛋白而言具有改变了的功能的蛋白。
在富集方法的其它优选实施方案中,所述肽受体是嘌呤霉素;所述每一个候选RNA分子还包括间歇序列或还包括一个共价结合于所述RNA的3’末端的DNA或DNA类似物序列;所述候选RNA分子群体至少包括109,优选至少1010,更优选至少1011、1012或1013,以及最优选至少1014个不同的RNA分子;所述体外翻译是在用真核细胞或其部分制备的裂解物中进行的(而且,可以是,例如,在网织红细胞裂解物或小麦胚裂解物中进行的);所述体外翻译反应是在由原核细胞(例如,大肠杆菌)或其部分制备的提取物中进行的;扩增所述DNA分子;将所述结合配偶体的至少一种固定在一种固体支持物上;在所述体外翻译步骤之后,所述方法还包括一个在有50-100mM Mg2+的条件下进行的温育步骤;而且,所述RNA-蛋白融合体还包括一个靠近所述肽受体的核酸或核酸类似物序列,它能提高其柔性。
在一个相关方面,本发明的特征是用于实施本文所披露的任一种筛选方法的试剂盒。
在第三方面,也是最后一个方面,本发明的特征是一种小嵌片,该嵌片包括一系列固定化的单链核酸,所述核酸能与RNA-蛋白融合体杂交。优选地,所述RNA-蛋白融合体的蛋白成分是由所述RNA编码的。
在本文中,“群体”是指一个以上的分子(例如,一个以上的RNA、DNA、或RNA-蛋白融合体分子)。因为本发明的方法有利于在必要时由大量的候选分子开始筛选,本发明的“群体”优选是指109以上的分子,更优选1011、1012或1013以上的分子,最优选1013以上的分子。
“筛选”是指将一种分子从一个群体中的其它分子中基本上分离出来。在本文中,在经过一个筛选步骤之后,该“筛选”步骤能使所需要的分子相对一个群体中不需要的分子富集2倍,优选30倍,更优选100倍,最优选1000倍。正如本文所述的,筛选步骤可以重复进行任意的次数,而且,在一种特定的方法中可以进行不同类型筛选步骤的组合。
“蛋白”是指所有通过一个或几个肽键连接的两个或两个以上天然存在的或修饰过的氨基酸。在本文中,“蛋白”和“肽”可以互换使用。
“RNA”是指两个或两个以上共价结合的天然存在的或修饰过的核糖核苷酸的序列。该术语所包括的修饰RNA的一种例子是硫代磷酸RNA。
“翻译起始序列”是指能够提供功能性核糖体进入位点的所有序列。在细菌系统中,该序列有时被称为SD序列。
“起始密码子”是指指示一种蛋白编码序列开始的三个碱基。一般,这些碱基是AUG(或ATG);不过,任何能以这种方式使用的其它碱基三联体均可取代。
与一种肽受体的“共价结合”是指所述肽受体通过一个共价键直接地或者通过另一个共价结合的序列(例如,相应于一个间歇位点的DNA)间接地连接于“蛋白编码序列”上。
“肽受体”是指能通过核糖体肽基转移酶功能的催化活性添加到一种生长肽链的C-末端的所有分子。通常,这种分子包括(i)一个核苷酸或核苷酸-样部分(例如,腺苷或腺苷类似物(在N-6氨基位置上二-甲基化是可以接受的)),(ii)一个氨基酸或氨基酸-样部分(例如,20种D-或L-氨基酸的任一种或其所有的氨基酸类似物(例如,由Ellman等在酶学方法202:301,1991中所披露的O-甲基酪氨酸或任一种类似物),和(iii)两者之间的连键,(例如,位于3’位置或不太理想的是位于2’位置的酯键、酰胺键、或酮键);优选地,所述连键不会明显影响具有天然核糖核苷酸构象的环的折叠。肽受体还可以具有一个亲核体,该亲核体可以是(但不限于)氨基,羟基或巯基,另外,肽受体可以由核苷酸模拟物、氨基酸模拟物,或组合的核苷酸和/或氨基酸结构的模拟物组成。
肽受体位于一种蛋白编码序列的“3’末端”是指该肽受体分子位于所述蛋白编码序列的最终的密码子之后。该术语包括,但不限于精确位于所述蛋白编码序列的3’末端的肽受体分子,以及通过间插编码或非编码序列(例如,相当于间歇位点的序列)与所述最终的密码子分离的肽受体分子。该术语还包括这样的结构,其中,编码或非编码序列位于所述肽受体分子之后(即位于所述肽受体分子的3’末端)。另外,该术语包括,但不限于共价结合于(直接地或通过间插核酸序列间接地)所述蛋白编码序列上的肽受体分子,以及通过某种非共价方式,例如,通过利用第二种核酸序列杂交的方式与所述蛋白编码序列结合的肽受体分子,所述第二种核酸序列结合于所述蛋白编码序列的3’末端或接近该末端,而且,它本身结合于一种肽受体分子。
“改变了的功能”是指一种分子的功能的任何定性或定量变化。
“间歇序列”是指能导致核糖体降低或停止其翻译速率的核酸序列。
本文所说的“结合配偶体”是指对一种需要的RNA-蛋白融合体的一部分具有特异的、共价的或非共价的亲和力的所有分子。结合配偶体的例子包括,但不限于抗原/抗体对、蛋白/抑制剂对、受体/配体对(例如,细胞表面受体/配体对,如激素受体/肽激素对)、酶/底物对(例如,激酶/底物对)、凝集素/碳水化合物对、寡聚蛋白或杂聚蛋白凝聚体、DNA结合蛋白/DNA结合位点对、RNA/蛋白对、核酸双链体、异源双链体、或连接的链,以及能够与RNA-蛋白融合体的任意部分形成一个或几个共价或非共价键(例如,二硫键)的所有分子。结合配偶体包括,但不限于图2中所示的筛选基序中的任一种。
“固体支持物”是指,但不限于可以直接或间接地(例如,通过诸如其它抗体或蛋白A的其它结合配偶体中间物)结合一种亲和性复合体、或者可以埋入亲和性复合体(例如,通过一种受体或通道)的任何柱(或柱材料)、玻璃珠、试管、微量滴定皿、固体颗粒(例如,琼脂糖或琼脂糖凝胶)、小嵌片(例如,硅、硅-玻璃、或金嵌片)、或膜(例如,脂质体或小泡)。
本发明具有多种突出的优点,首先,它是这一类型的用于筛选和扩增蛋白的第一个例子。该技术克服了由于需要回收相应于需要的、提取的蛋白的核苷酸序列而产生的障碍(因为只有核酸能够复制)。具体地讲,很多现有方法都可以通过体内步骤从部分或全部随机化的库中提取蛋白。这种类型的方法包括单克隆抗体技术(Millstein,美国科学243:66(1980)和Schultz等,J.Chem.Engng.News68:26(1990)),噬菌体展示(Smith,科学228:1316(9185);Parmley和Smith,基因73:305(1988);和McCafferty等,自然348:552(1990)),肽-乳糖阻抑物融合体(Cull等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865(1992)),以及经典的遗传学筛选。与本发明的方法不同,上述每一种方法依赖于蛋白和核酸之间的拓扑联系,因此,可以保留所述蛋白的信息,并能以可读的核酸形式回收。
另外,本发明相对缓慢的翻译方法(Tuerk和Gold,科学249:505(1990);Irvine等,分子生物学杂志222:739(1991);Korman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1844-1848(1992);Mattheakis等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-9026(1992);Mattheakis等,酶学方法267:195(1996);和Hanes和Pluackthun,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937(1997))而言具有优点,所述方法是用于筛选仍然与核糖体及其mRNA配合的新生蛋白链的某种特性。与所述缓慢的翻译技术不同的是,本发明方法不依赖于保持mRNA:核糖体:新生链三元复合体的完整性,所述复合体是非常脆弱的,因此,被局限于那些技术上可行的类型的筛选。
本发明还具有优于由Drenner和Lerner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5381-5383(1992))提出的分支合成方法,在其中,制备DNA-肽融合体,并通过一轮筛选从理论上讲回收遗传信息。与所述分支合成方法不同的是,本发明方法不需要由一种融合体的DNA部分再生肽(该再生过程在分支合成方法中通常是通过一轮化学合成而实现的)。因此,本发明方法可以使用成群的候选分子进行重复地筛选。另外,与所述分支合成技术不同的是,该技术通常局限于筛选很短的序列,而本发明方法可用于筛选相当长度的蛋白分子。
另一个优点是,本发明的筛选及直接进化技术可以利用很大而且复杂的候选序列文库。相反,依赖于体内步骤的现有蛋白筛选方法通常局限于具有有限的复杂性的较小的文库。这一优点在筛选功能性蛋白序列,例如,从1013个可能的序列中筛选一个仅有10个氨基酸长的肽时显得特别重要。在经典的遗传学方法中,lac阻抑物融合方法,和噬菌体展示方法,最大复杂性通常是在1013个成员以下的范围内。大型文库还具有直接进化利用的优点,可以更深入地调查任何特定起始序列周围的序列空间。
本发明技术与现有方法的不同之处还在于其筛选步骤是与环境无关的。在很多其它筛选方法中,表达蛋白所存在的环境能显著影响所产生的文库的性质。例如,一种表达蛋白不能在一种特定系统中适当表达,或者不能适当展示(例如,展示在噬菌体颗粒的表面)。另外,一种蛋白的表达可能实际干扰筛选循环中的一个或几个关键步骤,例如,噬菌体的生活力或感染性,或lac阻抑物的结合。以上问题会导致功能性分子的丧失或对可以使用的筛选方法的性质的局限。
最后,本发明的优点还在于它能够对可以测定的蛋白的所有成分进行控制。在某些技术中(例如,抗体筛选),对起始库的性质有很小的控制或无控制。在另一种技术中(例如,lac融合和噬菌体展示),候选库必须在融合蛋白的环境中表达。相反,RNA-蛋白融合体结构能够控制可用于筛选的候选库的性质。另外,所述候选库的大小可能与RNA或DNA库一样大(大约1015个成员),仅受所进行的体外翻泽反应的大小的限制。而且,候选库的制备完全取决于实验设计;可以在提取时或在一种需要的融合蛋白环境中筛选随机裂片,而且大部分(如果不是全部的话)可能的序列能够在RNA-蛋白融合体候选库中表达。
通过以下详细说明和权利要求书可以了解本发明的其它特征和优点。
                      详细说明
首先对附图进行简要说明。
                  附图的简要说明
图1A-1C是生产RNA-蛋白融合体时有关步骤的示意图。图1A表示用于制备融合体的RNA部分的样品DNA结构。图1B表示RNA/嘌呤霉素缀合物的制备。图1C表示RNA-蛋白融合体的制备。
图2是本发明的一般化筛选方法的示意图。
图3是用于合成含有3’嘌呤霉素的最低翻译模板的合成方法的示意图。步骤(A)表示将保护基团添加到嘌呤霉素上的活性官能团(5’-OH和NH2)上;在经过修饰以后,上述基团受到适当的保护,以便用于亚磷酰胺基寡核苷酸合成。用标准方法通过2’OH基团将受到保护的嘌呤霉素连接在可控孔度玻璃(CPG)的氨己基上,以便通过其3’OH结合DNA(Gait,寡核苷酸合成,实用方法,实用方法系列(IRL出版社,牛津,1984))。在步骤(B)中,用标准RNA和DNA化学方法(Millipore,Bedford,MA)合成含有43个核苷酸的最低翻译模板(称为“43-P”),用NH4OH和TBAF去保护,并进行凝胶纯化。所述模板在其5’末端含有13个碱基的RNA,随后是29个碱基的DNA,该DNA通过其5’OH与3’嘌呤霉素连接。所述RNA序列包括(i)一个互补于16S rRNA的5个碱基的SD共有序列(Stormo等,核酸研究10:2971-2996(1982);Shine和Dalgarno Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71:1342-1346(1974);和Steitz和Jakes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:4734-4738(1975)),(ii)一个有5个碱基的间隔区,和(iii)一个AUG起始密码子。所述DNA序列是dA27dCdCP,其中,“P”是嘌呤霉素。
图4是用于制备受保护的CPG-结合的嘌呤霉素的优选方法的示意图。
图5是表示将甲硫氨酸插入本发明模板中的可行方案的示意图。如反应(A)所示,所述模板与核糖体结合,以便形成70S的起始复合体。Fmet tRNA结合于所述P位点,并且与所述模板碱基配对。位于所述模板的3’末端的嘌呤霉素以分子内方式进入A位点,并通过肽基转移酶中心与N-甲酰基甲硫氨酸形成酰胺键,从而对所述tRNA脱酰化。用苯酚/氯仿萃取所述反应物,得到甲硫氨酸共价连接的模板。反应(B)示出的是不希望有的模板与含有嘌呤霉素的寡核苷酸之间的分子间反应。与以前一样,所述最低模板能刺激含有fmet tRNA的70S核糖体与所述P位点的结合。随后进入一个反式的第二模板,以形成共价结合的甲硫氨酸。
图6A-6H是35S甲硫氨酸(35S met)掺入翻译模板的照片。图6A表示该反应对镁(Mg2+)的依赖性。图6B表示该产物的碱基稳定性;在该图中所示出的迁移率的变化相当于失去了43-P的5’RNA序列(也被称作“Met模板”),以生成DNA-嘌呤霉素部分,被称为30-P。在碱处理以后所保留的标记与在35S甲硫氨酸和所述模板的3’嘌呤霉素之间肽键的形成一致。图6C表示在有肽基转移酶抑制剂的条件下对产物形成的抑制。图6D表示35S甲硫氨酸掺入一个模板编码序列的依赖性。图6E表示35S甲硫氨酸掺入对DNA模板长度的依赖性。图6F表示用模板43-P和25-P形成的顺式与反式产物。图6G表示用模板43-P和13-P形成的顺式与反式产物。图6H表示用模板43-P和30-P在网织红细胞裂解物系统中形成的顺式与反式产物。
图7A-7C是用于检测肽融合体形成和筛选的结构的示意图。图7A表示LP77(“连接-产物”,“77”个核苷酸长)(又被称作“短myc模板”)(SEQ ID NO:1),该序列含有c-myc单克隆抗体表位标记EQKLISEEDL(SEQ ID NO:2)(Evan等,分子细胞生物学5:3610-3616(1985)),其旁侧为5’起始密码子和3’接头。所述5’区含有与43-P相同的细菌SD序列。对所述编码序列进行优化,以便在细菌系统中表达。具体地讲,43-P的5’UTRs和含有SD的LP77互补于16SrRNA的5个碱基(Steitz和Jakes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:4734-4738(1975)),并以类似于核糖体蛋白序列形式间隔(Stormo等,核酸研究10:2971-2996(1982))。图7B表示LP154(连接产物,154个核苷酸长)(又被称作“长的myc模板”)(SEQ ID NO:3)。该序列含有产生用于提取所述c-myc抗体的肽的密码。其5’末端含有截短形式的TMV上游序列(被命名为“TE”)。该5’UTR含有一个源于TMV5’UTR的22个核苷酸的序列,包括两个ACAAAUUAC直接重复(Gallie等,核酸研究16:883(1988))。图7C表示1号库(SEQ ID NO:4),用于肽筛选的一种典型序列。所述模板包括源于最初的myc肽的最后7个氨基酸,用作该模板PCR扩增所需要的3’恒定区。已知该序列不是所述抗体结合表位的一部分。
图8是验证利用模板43-P,LP77,和LP154以及网织红细胞(“Retic”)和小麦胚(“Wheat”)翻译系统合成RNA-蛋白融合体的照片。该图的左半部表示35S甲硫氨酸掺入3种模板中的每一种中的情况。该图的右半部表示用RNaseA处理所述3种模板中的每一种以除去RNA编码区后所得到的产物;示出了35S甲硫氨酸标记的RNA-蛋白融合体。各个DNA部分与寡聚30-P相同。因此,迁移率的差别与所述编码区的长度呈正比,与各种情况下不同长度的蛋白的存在一致。
图9是验证由LP154合成的RNA-蛋白融合体对蛋白酶的敏感性的照片,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。泳道1含有32P标记的30-P。泳道2-4,5-7和8-10含有35S标记的翻译模板,所述模板是从网织红细胞裂解反应物中回收的,所述反应物分别未经处理,用RNaseA处理或用RNaseA和蛋白酶K处理。
图10是表示使用体外翻译的33个氨基酸的myc-表位蛋白进行的免疫沉淀反应的结果的照片。泳道1和2分别表示myc-表位蛋白和β-珠蛋白模板的翻译产物。泳道3-5表示分别使用c-myc单克隆抗体和PBS,DB,和PBSTDS洗涤缓冲液进行的所述myc-表位肽的免疫沉淀的结果。泳道6-8表示相同的免疫沉淀反应,不过使用的是β-珠蛋白翻译产物。
图11是验证源于体外翻译反应的RNA-蛋白融合体的免疫沉淀的照片。标明了用于所述反应的模板的皮摩尔数。泳道1-4表示RNA124(融合体LP154的RNA部分),泳道5-7表示RNA-蛋白融合体LP154。用c-myc单克隆抗体和蛋白G琼脂糖凝胶进行免疫沉淀,然后用RNaseA和T4多核苷酸激酶处理样品,再加样到变性尿素聚丙烯酰胺凝胶上,以显示所述融合体。在泳道1-4中,其样品要么不含有任何样品,或者仅含有所述长的myc模板(RNA 124)的RNA部分,未发现融合体。在泳道5-7中,相应于所述融合体的带清晰可见。示出了32P标记的30-P的位置,并且在该图的顶部示出了所投入的模板量。
图12是表示由一种体外翻译反应所获得的融合材料的量的曲线。在磷显像板上对图11中的泳道5-7所示的融合体带和30-P带(以类似的方式在dT25上提取,未示出)的强度进行定量,并作为投放的LP154浓度的函数作图。所回收的修饰过的30-P(左侧y轴)与投入的模板(x轴)呈线性正比,而接头-肽融合体(右侧y轴)是恒定的。通过以上分析,可以计算出每毫升翻译反应样品产生了大约1012融合体。
图13是硫代丙基琼脂糖凝胶和dT25琼脂糖的示意图,以及这些底物与本发明的RNA-蛋白融合体的相互作用能力的示意图。
图14是表示顺序提取本发明融合体的结果的照片。泳道1含有32P标记过的30-P。泳道2和3表示从翻译反应物中提取的、并用RNaseA处理过的LP154。在泳道2中,LP154是用硫代丙基琼脂糖凝胶和dT25琼脂糖顺序提取的LP154。泳道表示仅用dT25琼脂糖提取。以上结果表明,所述产物含有游离的巯基,很可能是myc表位编码序列上的倒数第二个半胱氨酸。
图15A和15B是表示用β-珠蛋白模板形成融合产物的照片。通过STS-麦黄酮-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分析。图15A表示无模板(泳道1)、syn-β-珠蛋白模板(泳道2-4)、或LP-β-珠蛋白模板(泳道5-7)的35S掺入情况。图15B(泳道标记如图15A)表示通过寡核苷酸亲和层析提取的35S-标记的材料。在没有30-P尾的情况下(泳道2-4)未提取到材料。
图16A-16C是表示通过体外筛选富集myc dsDNA与库dsDNA的示意图和照片。图16A是所述筛选方案的示意图。在体外翻译myc和库模板的4种混合物,并在dT25琼脂糖和TP琼脂糖凝胶上分离,以便从未修饰过的模板中纯化所述模板融合体。然后对mRNA-肽融合体进行逆转录,以抑制存在于所述模板中的任何二级或三级结构。在亲和筛选之前(图16B)和之后(图16C)取每一种混合物的等分试样,在有标记引物的情况下通过PCR扩增,并用仅能裂解myc DNA的限制酶消化。所投入的模板混合物是纯的myc(泳道1)、或1∶20、1∶200、1∶2000的myc∶库(泳道2-4)。未筛选过的材料因为myc模板的优势翻译和逆转录作用而偏离其投入的比例。在筛选步骤中模板的富集作用是通过筛选之前和之后库∶myc比例的变化而计算出来的。
图17是表示myc RNA模板翻译的照片。使用了下列接头:泳道1-4,dA27dCdCP;泳道5-8,dA27rCrCP;和泳道9-12,dA21C9C9C9dAdCdCP。在每一个泳道中,RNA模板的浓度为600nM,并将35S-Met用于标记。反应条件如下:泳道1、5和9,30℃1小时;泳道2、6和10,30℃2小时;泳道3、7和11,30℃1小时,-20℃16小时;和泳道4、8和12,30℃1小时,-20℃16小时,具有50mM Mg2+。在该图中,“A”表示游离肽,而“B”表示mRNA-肽融合体。
图18是表示用32P标记的myc RNA模板的翻译的照片。所使用的接头是dA21C9C9C9dAdCdCP。翻译是在30℃下进行90分钟,而温育是在不添加Mg2+的条件下在-20℃下进行2天。mRNA模板的浓度为400nM(泳道3),200nM(泳道4)、100nM(泳道5)和100nM(泳道6)。泳道1表示用35S-Met标记的mRNA-肽融合体。泳道2表示用32P标记的mRNA。在泳道6上,所述反应是在由0.5mM cap类似物的条件下进行的。
图19是表示用获自Ambion(泳道1)、Novagen(泳道2)、Amersham(泳道3)的裂解物进行的myc RNA模板翻译的照片。所使用的接头是dA27dCdCP。模板的浓度为600nM。用35S-Met标记。翻译是在30℃下进行1小时,在有50mM Mg2+的条件下在-20℃下温育过夜。
本文所披露的是一种利用融合体筛选具有需要的功能的蛋白的方法,其中,所述蛋白与其自身的信使RNAs共价连接。这种RNA-蛋白融合体是通过在其3’末端含有肽受体的mRNA库的体外或原位翻译而合成的(图1B)。在一种优选实施方案中,在通读所述信使的开放读框之后,核糖体在到达设计的间歇位点之后停留,并由所述受体部分占据核糖体的A位点,接受来自P位点的肽基-tRNA的新生肽链,以产生RNA-蛋白融合体(图1C)。所述蛋白和RNA之间的共价连接(以所述mRNA的3’末端和它所编码的蛋白的C-末端之间的酰胺键的形式连接)使得所述蛋白上的遗传信息可以在通过所述RNA的逆转录进行的筛选之后得到回收和扩增(例如,通过PCR)。一旦产生所述融合体,就可以根据该mRNA-蛋白融合体的特性进行筛选或富集,或者用所述mRNA模板进行逆转录,同时该模板与所述蛋白结合,以避免所述单链RNA对筛选的一切影响。当使用mRNA-蛋白结构时,可以检验筛选的融合体,以确定哪一部分(蛋白、mRNA、或两者)具有所需要的功能。
在一种优选实施方案中,嘌呤霉素(它类似于酪氨酰腺苷)起着受体的作用,以便将生长肽连接在其mRNA上。嘌呤霉素是一种通过中止肽延伸而起作用的抗生素。作为氨酰基-tRNA的模拟物,它通过结合所述A位点、接纳生长肽链、和脱落核糖体(Kd=10-4M)而起着蛋白合成的通用抑制剂的作用(Traut和Monro,分子生物学杂志10:63(1964);Smith等,分子生物学杂志13:617(1965))。嘌呤霉素的一个最诱人的特征是,它能与生长肽链生成稳定的酰胺键,从而可以进行更稳定的融合,这种融合比能形成不稳定的酯键的潜在受体稳定。具体地讲,所述肽基-嘌呤霉素分子含有一种位于肽和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸部分之间的稳定的酰胺键。所述O-甲基酪氨酸又通过一个稳定的酰胺键与嘌呤霉素的修饰过的腺苷部分的3’-氨基结合。
受体的其它可行筛选包括位于所述mRNA的3’末端的tRNA-样结构,以及以类似于嘌呤霉素的方式起作用的其它化合物。这些化合物包括,但不限于具有一个与腺嘌呤或腺嘌呤-样化合物连接的氨基酸的所有化合物,如氨基酸核苷酸、苯丙氨酰-腺苷(A-Phe),酪氨酰腺苷(A-Tyr)和丙氨酰腺苷(A-A1a),以及酰胺-连接的结构,如苯丙氨酰3’脱氧3’氨基腺苷,丙氨酰3’脱氧3’氨基腺苷,和酪氨酰3’脱氧3’氨基腺苷;在上述任一种化合物中,可以使用任何天然存在的L-氨基酸或其类似物。另外,还可将组合的tRNA-样-3’结构-嘌呤霉素缀合物用于本发明中。
图2中示出了本发明的一种优选筛选方案。该筛选方案所涉及的步骤通常是按如下方式进行的。
步骤1:制备DNA模板。作为制备本发明的RNA-蛋白融合体的一个步骤,合成该融合体的RNA部分。这一目的可以通过直接化学RNA合成而实现,更常见的是,通过转录合适的双链DNA模板而实现。
所述DNA模板可以通过任何标准技术(包括重组DNA技术、化学合成的任一种技术或两种技术)制备。原则上讲,能产生一种或几种含有一种已知的、随机的、随机化的或诱变的序列的模板的方法均可用于这一目的。在一种具体方法中,在转录前合成并扩增(例如,通过PCR)一种寡核苷酸(例如,含有随机碱基)。化学合成还可用于产生随机框,然后将该框插入已知蛋白编码序列的中央(例如,参见Ausubel等所著的“现代分子生物学方法”的第8.2章,JohnWiley&Sons和Greene出版公司,1994)。后一种方法能在所述蛋白的感兴趣的特定位点附近产生高密度的突变。
DNA模板序列的完全随机化的替代方案是部分随机化,而且,用这种方法合成的一种库通常被称作“掺杂库”。例如,在RNA序列上进行的该技术的一个例子由Ekland等披露(核酸研究23:3231(1995))。部分随机化可以通过偏离所述合成反应而以化学方法完成,使得每一种碱基添加反应混合物含有过量的一种碱基和少量的每一种其它的碱基;通过小心控制所述碱基的浓度,可以用该方法获得理想的突变频率。还可以利用易错PCR技术制备部分随机化的库,例如,由Beaudry和Joyce(科学257:635(1992))和Bartel和Szostck(科学261:1411(1993))所披露的。
还有用于制备DNA结构的多种方法,该方法由一个已知序列开始,产生一种突变的DNA库。所述方法的例子披露于Ausubel等的著述(同上,第8章)和Sambrook等的著述中(分子克隆:实验室手册,第15章,冷泉港出版社,纽约,第2版(1989))。还可以通过披露于Stemmer的著述中的(自然370:389(1994))的“改组”技术制备随机序列。
为了优化本发明的筛选方案,还可以改变一个模板的5’和3’末端的序列和结构。优选地,这一目的是通过两次独立的筛选实现的,每一次筛选包括将随机区插入所述模板的接近合适的末端的部位,然后进行筛选。所述筛选可以起到以下作用:(i)将制备的融合体的量最大化(并因此使得文库的复杂性最大化)或(ii)提供优化的翻译序列。另外,所述方法具有通用性,可以与诱变PCR结合,以便优化翻译模板的编码和非编码区。
步骤2:制备RNA。如上文所述,可以用标准寡核苷酸合成技术,通过化学方法合成RNA-蛋白融合体的RNA部分。另外,特别是在使用较长的RNA序列时,所述RNA部分是通过DNA模板的体外转录而制备的。在一种优选方案中,将T7聚合酶用于酶促制备所述RNA链。适用于上述目的的其它RNA聚合酶包括,但不限于SP6、T3和大肠杆菌RNA聚合酶(例如,披露于Ausubel等的著述(同上,第3章))。另外,所合成的RNA可以是全部或部分修饰的RNA。在一个具体例子中,可以使用修饰的核糖核苷酸和标准技术产生硫代磷酸RNA(例如,通过T7转录)。上述修饰的RNA具有对核酸酶稳定的优点。
步骤3:将嘌呤霉素连接到所述模板上。接着,将嘌呤霉素(或任何其它合适的肽受体)共价连接在所述模板序列上。这一步骤可以是通过利用T4 RNA连接酶将所述嘌呤霉素直接连接在所述RNA序列上,或者优选通过利用T4 DNA连接酶或任何其它能够将两个核苷酸序列连接在一起的酶将所述嘌呤霉素与DNA“裂片”连接的方式而实现(参见图1B)(例如,同样参见Ausubel等,同上,第3章,第14和15节)。还可将tRNA合成酶用于将嘌呤霉素-样化合物连接在RNA上。例如,苯丙氨酸合成酶能将苯丙氨酸连接在含有3’氨基的苯丙氨酰-tRNA分子上,产生具有嘌呤霉素-样3’末端的RNA分子(Fraser和Rich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:2671(1973))。可以使用的其它肽受体包括,但不限于具有连接于腺嘌呤或腺嘌呤-样化合物上的氨基酸的所有化合物,如氨基酸核苷酸、苯丙氨酰-腺苷(A-Phe)、酪氨酰-腺苷(A-Tyr)、和丙氨酰-腺苷(A-Ala)、以及腺苷-连接的结构,如苯丙氨酰3’脱氧3’氨基腺苷、丙氨酰3’脱氧3’氨基腺苷、和酪氨酰3’脱氧3’氨基腺苷;在上述任一种化合物中,可以使用任何天然存在的L-氨基酸或其类似物。例如,在Krayevsky和Kukhanova的著述中(核酸研究和分子生物学进展23:1(1979))披露了多种肽受体。
步骤4:RNA-蛋白融合体的制备和回收。为了制备RNA-蛋白融合体,任何体外或原位翻译系统均可使用。如下文所述,优选真核系统,两种特别优选的系统包括小麦胚和网织红细胞裂解物系统。不过,原则上讲,任何能够生成RNA-蛋白融合体,而且不会明显降解该融合体的RNA部分的翻译系统均可用于本发明中。另外,为了减少上述任何系统中的RNA降解,可将降解-抑制反义寡核苷酸加入所述翻译反应混合物中;所述寡核苷酸能与所述分子中引起降解作用的RNA部分的序列特异杂交并覆盖该序列(例如,参见Hanes和P1uckthun,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937(1997))。
如上文所述,可将多种真核翻译系统中的任一种用于本发明中。所述系统包括,但不限于源于酵母、腹水、肿瘤细胞(Leibowitz等,酶学方法194:536(1991))、和非洲爪蟾卵母细胞的裂解物。源于细菌系统的体外翻译系统包括,但不限于披露于以下文献中的系统:Zubay(遗传学年度综述7:267(1973));Chen和Zubay(酶学方法101:44(1983));和E11man(酶学方法202:301(1991))。
另外,翻译反应可以原位进行。在一种特定实施例中,翻译可以通过用标准技术将mRNA注入非洲爪蟾卵中而实现。
一旦产生了RNA-蛋白融合体,就可以通过任何标准的蛋白或RNA纯化技术从所述翻译反应混合物中回收该融合体。通常,使用蛋白纯化技术。例如,如下文所示,可以通过使用合适的层析试剂,如dT25琼脂糖或硫代丙基琼脂糖凝胶实现融合体的纯化。不过,纯化还可以涉及基于所述融合体的RNA部分的纯化;例如,所述纯化技术披露于Ausubel等的著述中(同上,第4章)。
步骤5:筛选需要的RNA-蛋白融合体。需要的RNA-蛋白融合体的筛选可以通过任何可用于从一群候选融合体中选择性地分离或提取需要的融合体的方法实现。提取技术的例子包括,但不限于,与诸如结合配偶体的选择性结合,所述配偶体直接或间接固定在柱、珠、膜、或其它固体支持物上。并用一种对所述融合体的蛋白部分特异的抗体进行免疫沉淀。所述技术的第一种利用了一种固定筛选基序,该基序可以由任何类型的分子组成,其可以发生结合。在图2中示出了一系列可以筛选的基序分子。筛选还可以基于连接在一种亲和标记物(例如,底物-生物素)上的底物分子的利用,所述标记物能与候选分子起反应,或者基于与融合分子的任何其它类型的相互作用。另外,还可以按照类似于由Bartel和Szostak所披露的用于提取RNA酶(同上)的方法根据其催化活性筛选蛋白;按照特定的技术,根据其将靶分子连接在它本身上面的能力筛选需要的分子,然后根据靶分子的存在提取功能性分子。本发明可以利用相同的方法或任何其它功能性筛选的筛选方法,筛选新型或改进的催化蛋白。
另外,如本文所述,可以通过在一种候选分子库中富集融合体来筛选所需要的RNA-蛋白融合体(或其DNA拷贝)。为了进行这样一种任选的富集,将一群候选RNA-蛋白融合体与-种结合配偶体(例如,上述结合配偶体之一)接触,所述结合配偶体对所述融合体的RNA部分或蛋白部分专一,接触条件为能基本上将该结合配偶体-融合体从样品中未结合的成员里分离出来。这一步骤可以重复,而且该技术优选包括至少两个连续的富集步骤,一个步骤是用一种对RNA部分专一的结合配偶体筛选融合体,另一个步骤是用对蛋白部分专一的结合配偶体筛选融合体。另外,如果重复针对融合体的相同部分(例如,蛋白部分)的富集步骤,优选使用不同的结合配偶体。在本文所披露的一种具体例子中,首先通过使用对融合体的RNA部分专一的结合配偶体从一群分子中富集所需要的融合体,然后在两个连续的步骤中使用两个不同的结合配偶体,这两种结合配偶体都对所述融合体的蛋白部分具有专一性。另外,还可以通过任何标准分离技术从样品成分中分离,这些技术包括,但不限于柱亲和层析、离心、或免疫沉淀。
另外,还可以通过多种方法实现从一种富集(或筛选)复合物中洗脱RNA-蛋白融合体。例如,如本文所述,可以利用一个变性或非特异性化学洗脱步骤分离需要的RNA-蛋白融合体。这样一个步骤有利于将复合的成分彼此分离或者与结合的固体支持物分离,这种分离是通过破坏所述成分之间和/或所述成分与固体支持物之间的非共价键而以相对非特异的方式实现的。如本文所述,一种典型的变性或非特异化学洗脱试剂是4%HOAc/H2O。其它典型的变性或非特异化学洗脱试剂包括鸟嘌呤、尿素、高盐、洗涤剂、或任何一般能除去非共价加成物的其它方法。另外,可以使用一种特殊的化学洗脱方法,其中,利用一种化合物引起融合分子的特异释放。在一种具体实例中,如果所需要的融合蛋白的连接臂含有一个或几个二硫键,可以通过添加诸如DTT导致二硫键减弱并释出结合的靶分子,而将结合的融合aptamers洗脱。
另外,洗脱还可以通过特异破坏亲和性复合体而实现;这种技术能通过添加过量的该复合物的一种成分而选择性地分离该复合物的成分。例如,在ATP-结合筛选中,洗脱是通过将过量的ATP加入温育混合物中而实现的。最后,还可以进行一个酶促洗脱步骤。在该方法中,结合分子本身或外源添加的蛋白酶(或其它合适的水解酶)能裂解并释放出所述靶或酶。在一种具体例子中,蛋白酶靶位点可以包含在任一种复合成分中,并通过添加蛋白酶洗脱结合分子。另外,在催化筛选中,可将洗脱作为一个筛选步骤,以便分离能够将其本身从固体支持物上释出(例如,裂解)的分子。
步骤6:利用逆转录酶制备所述RNA序列的DNA拷贝。如果需要,通过使用任何标准技术(例如,使用Superscript逆转录酶)对RNA序列进行逆转录可以方便地获得特定RNA融合序列的DNA拷贝。这一步骤可以在筛选或富集步骤之前(例如,如图16所示)或之后进行。另外,所述逆转录过程还可以在将所述融合体从体外或原位翻译混合物中提取出来之前进行。
然后,作为部分或完整长度的双链序列扩增所述DNA模板。优选地,在该步骤中,产生完整长度的DNA模板,利用合适的寡核苷酸和PCR扩增。
下面将采用具体实例的形式详细说明上述步骤以及用于完成这些步骤的试剂和技术。提供这些实例是为了说明本发明,不应视为对本发明的限定。
             制备RNA-蛋白融合体的模板
如图1A和2所示,本发明的筛选方案优选利用包括若干设计元件的双链DNA模板。所述因子的第一个是启动子,它与所需要的RNA聚合酶一起使用,以便合成mRNA。如图1A所示,而且如这里所披露的,尽管能够指导由线性双链DNA进行的合成的任何启动子均可使用,但优选T7启动子。
图1A所示模板的第二个因子被称为5’非翻译区(或5’UTR),它相当于翻译起始位点的RNA上游,图1A中示出了一种优选的5’UTR(称为“TE”),它是烟草花叶病毒5’非翻译区的缺失突变型,具体地讲,相当于TMV翻译起点的5’碱基;该UTR的序列如下:rGrGrGrArCrArArUrUrArCrUrArUrUrUrArCrArArUrUrArCrA(其头三个G核苷酸被插入以增强转录)(SEQ ID NO:5)。任何其它合适的5’UTR均可使用(例如,参见Kozak,微生物学综述47:1(1983))。
图1A中所示的第三个因子是翻译起始位点。一般,它是一个AUG密码子。不过,存在着将除AUG之外的密码子用于天然存在的编码序列中的例子,这些密码子也可被用于本发明的筛选方案中。
图1A的第四个因子是编码所述蛋白序列的蛋白的开放读框(称作ORF)。该开放读框可编码任何天然存在的、随机的、随机化的、诱变的、或完全合成的蛋白序列。
图1A所示的第五个因子是3’恒定区。该序列有利于所述库序列的PCR扩增,以及含有嘌呤霉素的寡核苷酸与mRNA的连接。如果需要,该区还可以包括一个间歇位点,该位点是一个能引起核糖体停留,并因此使得受体部分(例如,嘌呤霉素)具有接受来自肽基-tRNA的新生肽链的额外时间;该间歇位点将在下面作更详细的讨论。
为了完成本发明的方法,首先利用高度简化的含有1-2个密码子的mRNA模板制备RNA-蛋白融合体。实施上述方法是出于两种考虑。首先,这种大小的模板容易通过化学合成制备。其次,小的开放读框使得所述反应的重要特征,包括连接的效率、末端异质性、模板依赖性、和翻译精确性能够方便地加以测定。
结构设计。将一种基本结构用于制备试验RNA-蛋白融合体。所述分子由含有用于启动翻译的SD序列的mRNA组成,该分子包括源于核糖体蛋白L1的SD序列的三个碱基的缺失,而且它互补于16S rRNA的5个碱基(即rGrGrArGrGrArCrGrArA)(SEQ ID NO:6)(Stormo等,核酸研究10:2971-2996(1982);Shine和Dalgarno,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71:1342-1346(1974);和Steitz和Jakes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:4734-4738(1975)),(ii)一个AUG起始密码子,(iii)一个用作间歇位点的DNA接头(即5’-(dA)27),(iv)dCdC-3’,和(v)一个3’嘌呤霉素(P)。选择poly dA序列是因为已知它在A位点作为tRNA的模板的能力较差(Morgan等,分子生物学杂志26:477-497(1967);Ricker和Kaji,核酸研究19:6573-6578(1991)),并将其设计成良好的间歇位点。选择所述寡聚dA接头的长度,使其跨过解码位点和所述核糖体的肽基转移中心之间的大约60-70埃的距离。所述dCdCP模拟tRNA的CCA末端,设计它是为了有利于嘌呤霉素与核糖体的A位点的结合。
最低模板43-P的化学合成。为了合成结构43-P(如图3所示),首先将嘌呤霉素连接在一种固体支持物上,使其适用于标准亚磷酰胺寡核苷酸合成化学。在图3中示意性地示出了这种寡聚物的合成方案,并将在下文作更详细的说明。为了将嘌呤霉素连接在可控孔度玻璃(CPG)固体支持物上,用三氟乙酰基保护氨基,如在DNA合成仪380型的Applied Biosystem用户简报#49(9188)中所披露的。然后,用标准的DMT-Cl方法对5’OH进行保护(Gait,寡核苷酸合成,实用方法,实用方法系列(IRL出版社,牛津,1984)),并通过2’OH连接在氨己基CPG上,其连接方式与将3’OH用于连接脱氧核苷的方式相同(参见图3和Gait,同上,p.47)。5’DMT-CPG-连接的保护嘌呤霉素适合于用亚磷酰胺单体进行链的延伸。所述寡聚物的合成沿3’→5’方向以以下顺序进行:(i)3’嘌呤霉素,(ii)pdCpdC,(iii)大约27个单位的dA作为接头,(iv)AUG,和(v)SD序列。43-P结构的序列如下文所示。
CPG嘌呤霉素的合成。保护的CPG嘌呤霉素的合成遵循上文所述的用于脱氧核苷合成的一般途径(Gait,寡核苷酸合成,实用方法,实用方法系列(IRL出版社,牛津,1984))。主要差别包括筛选合适的N封闭基团,结合在固体支持物的2’OH,以及与该固体支持物的连接反应。在后一种情况下,反应是在极低浓度的活化核苷酸中进行的,因为该材料显著优于所述固体支持物。就所述稀释反应条件而言,所得到的产量(大约20μmol/g支持物)是十分理想的。
合成N-三氟乙酰嘌呤霉素。首先将267mg(0.490mmol)嘌呤霉素*HCl溶于水中,加入pH11的碳酸缓冲液,并萃取(3X)到氯仿中,以便将其转化成游离碱的形式。将有机相蒸发干燥,并称重(242mg,0.513mmol)。然后将所述游离碱溶解在11ml无水吡啶和11ml无水乙腈中,并搅拌添加139μl(2.0mmol)三乙胺(TEA)和139μ1(1.0mmol)三氟乙酸酐(TFAA),然后将TFAA加入20μl等分试样的浑浊溶液中,直到不再有原始材料,通过薄层层析(tlc)(93:7,氯仿/MeOH)(共280μl)测定。让所述反应进行1小时。此时,通过薄层层析发现了两条带,这两条带的迁移率均高于原始材料的。用NH4OH和水调节所述反应,将其产物还原成一条带。硅层析(93∶7氯仿/MeOH)得到293mg(0.515mmol)的产物N-TFA-Pur。该反应的产物示意性地示于图4中。
合成N-三氟乙酰5’-DMT嘌呤霉素。等分来自上述反应的产物,并与无水吡啶共蒸发2次,以除去水。准备多个试管,以便实验多种反应条件。在一种小规模反应中,将27.4mg(48.2mmol)N-TFA-Pur溶解在480μl含有0.05当量DMAP和1.4当量TEA的吡啶中。将20.6mg的三苯甲基氯(60μmol)加入该混合物中,并搅拌让反应进行到结束。通过向该溶液中添加等体积的水(大约500μl)中止该反应。因为该反应似乎是成功的,进行大规模的反应。具体地讲,将262mg(0.467mmol)N-TFA-Pur溶解在2.4ml吡啶中,然后添加1.4当量的TEA,0.05当量的DMAP,和1.2当量的三苯甲基氯。大约2小时之后,再添加50mg(0.3当量)二甲氧基三苯甲基*C1(DMT*C1),让反应再继续进行20分钟,通过添加3ml的水中止反应,CH3CN共蒸发3次。在2mm直径的100ml硅(干燥)柱上通过95∶5氯仿/MeOH纯化所述反应物。由于纯化不彻底,在第二个相同的柱上用97.5∶2.5的氯仿/MeOH进一步纯化。总产量为325mg或0.373mmol(或产率为72%)。该反应的产物示意性地示于图4中。
合成N-三氟乙酰,5’-DMT,2’琥珀酰嘌呤霉素。在小规模反应中,将上面合成的32mg(37mmol)的产物与1.2当量的DMAP混合溶解在350μl的吡啶中。将溶解在44μl的无水CH3CN中的1.2当量的琥珀酸酐加入该溶液中,并搅拌过夜。薄层层析发现仅存很少的原始材料。在大规模的反应中,将292mg(336mmol)的上述产物与1.2当量的DMAP混合于3ml的吡啶中。将403μl的1M溶于无水CH3CN中的琥珀酸酐加入该混合物中,并将该混合物搅拌过夜。薄层层析再次发现了仅存很少的原始材料。合并以上两种反应物,再添加0.2当量的DMAP和琥珀酸盐。该产物与甲苯共蒸发1次,并在高真空中干燥成黄色泡末。加入CH2Cl2(20ml),用15ml的10%的冰镇柠檬酸萃取2次,然后再用纯水萃取2次。干燥该产物,重新溶解在2ml CH2Cl2中,并通过搅拌添加50ml的己烷沉淀。然后对该产物进行涡旋搅拌,并在临床离心机上以600rpm的速度离心10分钟。排出大部分洗脱液,并干燥其余的产物,首先在低真空下干燥,然后在干燥器中以高真空干燥。该反应的产量大约为260μmol,分级产率为大约70%。
合成N-三氟乙酰5’-DMT,2’琥珀酰,CPG嘌呤霉素。随后将来自上一步骤的产物溶解在1ml的二噁烷中,随后用0.2ml二噁烷/0.2ml吡啶溶解。将40mg对-硝基苯酚和140mg的二烷己基碳二亚胺(DCC)加入该溶液中,并让该反应进行2小时。通过离心除去由该反应产生的不可溶的环己基尿素,将该产物溶液加入悬浮在22ml无水DMF中的5g氨己基可控孔度玻璃(CPG)中,并搅拌过夜。然后用DMF、甲醇、和乙醚洗涤该树脂,并干燥。分析证实,所得到的树脂每克含有22.6μmol三苯甲游基,处于这种类型的支持物的可接受的范围内。然后,通过与15ml吡啶、1ml乙酸酐、和60mg的DMAP一起温育30分钟封闭该支持物。所得到的柱材料能产生一种负的(无色)水合茚三酮实验,与封闭之前获得的结果相反,在封闭之前所获得的结果中,所述材料能产生一种深兰色反应。该反应的产物示意性地示于图4中。
合成mRNA-嘌呤霉素缀合物。如上文所述,可将嘌呤霉素固定的寡聚物用于由两种方法中的任一种制备能起着翻译模板作用的mRNA-嘌呤霉素缀合物。对于极短的开放读框来说,通常通过化学方法用RNA或DNA单体延伸嘌呤霉素寡聚物,以产生完全合成的模板。当需要较长的开放读框时,通常利用DNA裂片和T4DNA连接酶将RNA或DNA寡聚物连接在mRNA的3’末端,如Moore和Sharp所披露的(科学256:992(1992))。
            RNA-蛋白融合体的体外翻译和测定
用如下的细菌和真核体外翻译系统体外翻译上面制备的模板。
最低模板的体外翻译。将43-P和相关的RNA-嘌呤霉素缀合物加入几个不同的体外翻译系统中,所述系统包括:(i)源于大肠杆菌MRE600的S30系统(Zubay,遗传学年度综述7:267(1973);Collins,基因6:29(1979);Chen和Zubay,酶学方法101:44(1983);Pratt,转录和翻译:实践方法,B.D.Hammes,S.J.Higgins著(IRL出版社,牛津,1984)pp.179-209;和Ellman等,酶学方法202:301(1991)),通过Ellman等所披露的方法制备(酶学方法202:301(1991));(ii)源于相同菌株的核糖体部分,通过Kudlicki等所述的方法制备(分析化学206:389(1992));和(iii)源于大肠杆菌BL21的S30系统,通过Lesley等所述方法制备(生物学化学杂志266:2632(1991))。在每一种情况下,所使用的预混合物是Lesley等的混合物(生物学化学杂志266:2632(1991)),温育持续30分钟。
测定所述融合体的性质。首先用源于大肠杆菌S30的翻译提取物检验43-P模板。图5(反应“A”)证实了希望的分子内(顺式)反应,其中,43-P结合核糖体,并起着fMet的模板和受体的作用。首先测定35S-甲硫氨酸的掺入及其在所述模板中的位置,结果示于图6A和6B中。用苯酚/氯仿萃取所述体外翻译反应混合物,并通过SDS-PAGE分析该产物,然后,一个35S标记的带以与43-P模板相同的迁移率出现。所合成的该材料的量取决于Mg2+的浓度(图6A)。最佳Mg2+浓度为9-18mM,这一浓度类似于在该系统中进行翻译的最佳浓度(Zubay,遗传学年度综述7:267(1973);Collins,基因6:29(1979);Chen和Zubay,酶学方法101:44(1983);Pratt,转录和翻译:实践方法,B.D.Hammes,S.J.Higgins著(IRL出版社,牛津,1984)pp.179-209;Ellman等,酶学方法202:301(1991)));Kudlicki等(分析化学206:389(1992));和Lesley等(生物学化学杂志266:2632(1991))。另外,结合的标记物在用NH4OH处理时是稳定的(图6B),表明该标记物位于该分子的3’半边(碱稳性DNA部分),并通过碱稳性键连接,这正是嘌呤霉素和fMet之间的酰胺键所出现的情形。
核糖体和模板依赖性。为了证实上面所观察到的发生在核糖体上的反应,检验核糖体的肽基转移酶功能的特异抑制剂的作用(图6C),并检验改变编码甲硫氨酸的序列的作用(图6D)。图6C清楚地表明所述反应受到肽基转移酶抑制剂维及尼霉素、谷氏菌素、和氯霉素的有效抑制(Monro和Vazquez,分子生物学杂志28:161-165(1967);和(Vazquez和Monro,生物化学和生理学学报142:155-173(1967))。图6D表明,所述模板中发生的一个碱基由A到C的变化,可破坏35S甲硫氨酸在9mM Mg2+下的掺入,并在18mM下大大减弱其掺入(这一结果与高浓度的Mg2+容许信息的错读的事实一致)。上述实验表明,所述反应以模板依赖形式发生在核糖体上。
接头长度。还试验了所述反应对接头长度的依赖性(图6E)。将原始模板设计成使得所述接头跨越从解码位点(由该模板的AUG占据)到受体位点(由嘌呤霉素部分占据)的距离,该距离的长度大约与tRNA上的反密码子环和受体臂之间的距离相同,或者大约为60-70埃。试验过的第一个接头为30个核苷酸长,基于每个碱基最少3.4埃(≥102埃)。在30-21个核苷酸的长度范围内(n=27-18;长度≥102-71埃),在所述反应的效率上很少出现变化。因此,接头长度可以改变。尽管21-30个核苷酸的接头代表优选的长度,短于80个核苷酸,优选短于45个核苷酸的接头也可用于本发明中。
分子内与分子间反应。最后,我们检验了所述反应是否如希望的那样以分子内方式发生(图5,反应“A”)或以分子间方式发生(图5,反应“B”)。这一试验是这样进行的:将具有3’嘌呤霉素,但没有核糖体结合序列的寡核苷酸(模板25-P,13-P,和30-P)加入含有43-P模板的翻译反应物中(图6F、6G、和6H)。如果该反应是通过分子间机制发生,则较短的寡聚物也会被标记。如图6F-H所示,掺入3种较短寡聚物中的35S甲硫氨酸很少,这表明该反应主要是以分子内方式进行。下面示出了序列25-P(SEQ ID NO:10)、13-P(SEQ ID NO:9)、30-P(SEQ ID NO:8)。
网织红细胞裂解物。图6H表明,除了上面所使用的大肠杆菌裂解物之外,还可在将35S-甲硫氨酸掺入43-P之前,利用兔网织红细胞裂解物(参见下文)进行体外翻译。该反应主要是以希望的分子内机制进行。
         含有c-myc肽标记的融合体的合成和试验
还制备了代表性的融合体,该融合体在其蛋白部分含有c-myc单克隆抗体9E10的表位标记(Evan等,分子细胞生物学5:3610(1985))。
模板设计。设计了三种原始表位标记模板(即LP77、LP154和1号库),如图7A-C所示。前两个模板含有c-myc表位标记序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:2),而第三个模板被设计成用于合成随机筛选库。LP77编码12个氨基酸的序列,将其密码子优化用于细菌翻译。LP154及其衍生物含有33个氨基酸的mRNA序列,其中,将其密码子优化用于真核翻译。其所编码的氨基酸序列MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:7),相当于用于提取9E10抗体的原始肽。1号库含有NNG/C的27个密码子(用于产生随机肽),其后是一个相当于myc肽的最后7个氨基酸的序列(这7个氨基酸不是myc表位序列的一部分)。上述序列如下文所示。
网织红细胞与小麦胚体外翻译系统。在兔网织红细胞和小麦胚提取物(Promega,Boehringer Mannheim)翻译系统中试验43-P、LP77、和LP154模板(图8)。翻译是在30℃的条件下进行60分钟,模板是用dT25琼脂糖在4℃下提取的。用15mM NaOH、1mM EDTA将模板从琼脂糖上洗脱,用乙酸钠/乙酸缓冲液中和,立即用乙醇沉淀(2.5-3体积),洗涤(用100%的乙醇),并在真空离心蒸发浓缩器上干燥。图8表示在小麦胚和网织红细胞系统中35S甲硫氨酸掺入到所有三种模板中。在源于网织红细胞系统的融合反应物中观察到较少的模板降解作用,因此,该系统被优选用于制备RNA-蛋白融合体。另外,一般真核系统优于细菌系统。因为真核细胞倾向于含有较低水平的核酸酶,在这种细胞中mRNA的寿命通常比在细菌细胞中的寿命长10-100倍。在使用一种特定大肠杆菌翻译系统的试验中,使用编码c-myc表位的模板未观察到融合体的产生;通过在不同的位点标记该模板证实了这可能是由于模板的RNA和DNA部分的降解所致。
为了检验所述融合体的肽部分,用RNase处理样品,以除去编码序列。在该处理之后,43-P产物大体上以与32P标记的30-P寡聚物相同的迁移率运动,这一结果与很小的肽(也许仅有甲硫氨酸)添加到30-P上一致。对于LP77来说,除去编码序列所产生的产物具有低于30-P寡聚物的迁移率,这一结果与发现有12个氨基酸的肽添加到嘌呤霉素上一致。最后,对于LP154来说,除去编码序列产生一种具有更低迁移率的产物,这一结果与有33个氨基酸序列连接到30-P寡聚物上一致。由于加样误差,在RNase-处理过的LP154网织红细胞泳道上未发现寡聚物。在图9中,证实该产物的迁移率与在小麦胚提取物中所产生的产物的迁移率相同。总之,以上结果表明能抗RNase的产物被添加到30-P寡聚物的末端,该产物的大小与所述编码序列的长度成正比,而且,该产物的大小相当一致。另外,尽管两种系统都能产生类似形式的产物,但由于网织红细胞系统具有较高的模板稳定性,该系统是优选的。
对RNase A和蛋白酶K的敏感性。在图9中用LP154融合体试验了对RNase A和蛋白酶K的敏感性。如泳道2-4所示,在LP154模板上证实了35S甲硫氨酸的掺入。当用RNase A处理该产物时,该融合体的迁移率降低,但明显高于32P标记的30-P寡核苷酸的迁移率,这一结果与33个氨基酸的肽添加到其3’末端一致。当同样用蛋白酶K处理该材料时,35S的信号完全消失,这一结果同样与发现该标记物存在于位于30-P片段的3’末端的一个肽上的事实一致。在使用43-P和LP77融合体的等同实验中获得了类似结果。
为了证实35S Met对所述模板的标记是由翻译造成的,更具体地讲,是由核糖体的肽基转移酶活性造成的,试验了各种抑制剂对标记反应的影响。真核肽基转移酶的特定抑制剂茴香霉素、谷氏菌素、和稀疏霉素(Vazquez,蛋白合成的抑制剂(Springer-Verlag,纽约),pp.312(1979)),以及转运抑制剂环己酰亚胺和吐根碱(Springer-Verlag,纽约),pp.312(1979))均能降低利用长的myc模板和网织红细胞裂解物翻译提取物形成RNA-肽融合体大约95%。
免疫沉淀实验。在设计用于说明免疫沉淀一种mRNA-肽融合体效力的实验中,试图免疫沉淀通过体外翻译产生的游离c-myc肽。图10表示在SDS-PAGE肽凝胶上测定的上述实验的结果。泳道1和2表明源于翻译反应的标记材料含有RNA124(LP154的RNA部分)或β-珠蛋白mRNA。泳道3-8表示在几个不同的缓冲条件下(如下文所述)使用c-myc单克隆抗体9E10的上述反应样品的免疫沉淀。泳道3-5表示源于RNA124的肽能有效进行免疫沉淀,最好的结果出现在第四泳道,其中,提取了总TCA可沉淀部分的大约83%。泳道6-8显示很少的β-珠蛋白,表明纯化程度>100倍。以上结果表明由RNA124以及LP154编码的肽可以通过该免疫沉淀方法定量提取。
融合体的免疫沉淀。随后,我们用LP154翻译反应物和c-myc单克隆抗体9E10试验了对嵌合RNA-肽产物进行免疫沉淀的能力(图11),通过免疫沉淀提取源于网织红细胞反应的翻译产物(如本文所披露的),并用1μg RNaseA在室温下处理30分钟,以除去编码序列。由此产生的5’OH通过T4多核苷酸激酶用32P标记,并通过变性PAGE测定。图11表明,提取到的产物具有类似于用RNase处理LP154融合体所产生的c-myc表位与30-P的融合体的迁移率(参见上文),不过,当仅翻译所述模板的RNA部分(RNA124)时,不能产生相应的产物。在图12中,测定了所提取的融合蛋白的量,并相对未修饰的30-P的量(在该图中未示出)作图。未修饰的接头与接头-myc融合体的比例的定量表明,0.2-0.7%的输入信息被转化成了融合产物。在存在较高的核糖体/模板比例的情况下,有较大比例的输入RNA转化成融合产物;在试验过的输入mRNA浓度范围内,每毫升的翻译提取物大约产生0.8-1.0×1012融合分子。
另外,我们的结果表明,连接在所述类型RNA上的肽是由其mRNA编码的,即新生肽未转移到某些其它mRNA的嘌呤霉素上。当接头(30-P)与长的myc模板以高达20∶1的比例在翻译提取物中共温育时,未发现交叉转移的迹象,而且游离接头的存在也不会明显降低所产生的长myc融合体的量。类似的,短模板43-P和长模板LP154的共翻译仅产生所述模板单独翻译时出现的融合产物,而未发现具有中间迁移率的产物,这种产物是预计中的短模板与长myc肽的融合体。以上结果表明,融合体的形成主要出现在与同一个核糖体结合的新生肽和mRNA之间。
顺序提取。为了进一步证实体外翻译的LP154模板产物的性质,我们在两种不同类型的层析介质上检验了上述产物的特征。硫代丙基(TP)琼脂糖凝胶可以分离含有游离半胱氨酸的产物(例如,LP154产物,该产物具有一个靠近其C末端的半胱氨酸残基)(图13)。类似地,dT25琼脂糖可以分离含有poly dA序列的模板(例如,30-P)(图13)。图14表明依次在TP琼脂糖凝胶上和在dT25琼脂糖上分离所产生的产物与仅在dT25琼脂糖上分离的产物相同。所述体外翻译产物含有poly-A尾和游离巯基的事实有力地说明,该翻译产物是需要的RNA-肽融合体。
上述结果与合成mRNA-肽融合体并从体外翻译提取物中回收完整的融合体的能力吻合。所合成的融合体的肽部分似乎具有需要的序列,这一点通过免疫沉淀和利用合适的层析技术进行提取得到了证实。根据上述结果,上述反应是分子内的,而且以模板依赖形式发生。最后,即使模板的修饰低于1%,该系统也有利于基于大约1013个分子的候选复杂性的筛选。
C-Myc表位回收筛选。为了筛选其它的c-myc表位,制备一个含有随机化区域(参见图7C和后述)的大的翻译模板文库(例如,1015个成员)。将该文库用于制备大约1012-1013融合体(如本文所披露的),用抗-c-myc抗体处理所述融合体(例如,通过免疫沉淀或使用固定在柱上或其它固体支持物上的抗体),以便通过反复的体外筛选富集c-myc-编码模板。
融合体生成模型。在不囿于具体理论的前提下,我们提出了一种融合体形成机制的模型,其中,翻译正常开始,并且延伸进展到开放读框的末端。当核糖体到达该模板的DNA部分时,翻译停止。此时,所述复合体面临两种结果:解离新生肽,或将新生肽转移到位于该模板3’-末端的嘌呤霉素上。转移反应的效率很可能受到多种因素的控制,这些因素影响停止翻译的复合体的稳定性,并使得3’-嘌呤霉素残基进入肽基转移酶中心的A位点。在转移反应之后,mRNA-肽融合体很可能仍然与核糖体配合,因为已知的释放因子不能水解RNA和肽结构域之间的稳定的酰胺键。
延伸的经典模式(Watson,Bull.Soc.Chim.Biol.46:1399(1964))和中间状态模式(Moazed和Noller,自然342:142(1989))需要A位点空出,以便嘌呤霉素进入肽基转移酶中心。为了让嘌呤霉素进入空的A位点,所述接头必须是环绕核糖体外面的环或者直接由解码位点通过A位点到达肽基转移酶中心。本文所披露的资料不能清楚地区分这些不同模式,因为试验过的最短的接头(21个核苷酸)仍然长到足于环绕核糖体的外面。在核糖体结构的某些模式中(Frank等,自然376:441(1995)),mRNA穿过沿所述解码位点的任一侧分布的通道,在这种情况下,有必要不让接头穿过上述通道,以便嘌呤霉素能通过A位点到达肽基转移酶中心。
连接在所述接头上的肽的同质性和长度,证实了新生肽向嘌呤霉素的转移似乎比延伸过程慢。如果在延伸期间嘌呤霉素能与氨酰基tRNAs有效竞争,出现在融合产物中的接头-肽融合体在大小方面将会不一致。另外,Met-融合体和未修饰的接头之间在凝胶迁移率方面的相似性表明,核糖体似乎没有读入接头区。dA3n应当编码(赖氨酸)n,这肯定能降低接头的迁移率。未穿过的mRNA的较慢的速率可以解释融合体形成的速率慢于翻译速率。初步结果表明,在低温下延长翻译后温育之后,所产生的融合体量明显增加,这也许是因为增加了用于将新生肽转移到嘌呤霉素的时间。
                   详细材料和方法
下面披露了与体外翻译和试验包括具有myc表位标记的融合体在内的RNA-蛋白融合体相关的详细材料和方法。
序列。上面将多种寡核苷酸用于制备RNA-蛋白融合体。这些寡核苷酸具有如下序列。
名称                      序列
30-P    5′AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP(SEQ ID
NO:8)
13-P    5′AAA AAA AAA ACC P(SEQ ID NO:9)
25-P    5′CGC GGT TTT TAT TTT TTT TTT TCC P(SEQ ID NO:10)
43-P    5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArArU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA
AAA AAA AAA ACC P(SEQ ID NO:11)
43-P[CUG]   5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA
AAA AAA AAA AAA ACCP(SEQ IDNO:12)
40-P    5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA
AAA AAA ACC P(SEQ ID NO:13)
37-P    5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA
AAA ACC P(SEQ ID NO:14)
34-P    5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAA
ACC P(SEQ ID NO:15)
31-P    5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA ACC P
(SEQ ID NO:16)
LP77    5′rGrGrG rArGrG rArCrG rArArA rUrGrG rArArC rArGrA rArArC
rUrGrA rUrCrU rCrUrG rArArG rArArG rArCrC rUrGrA rArC AAA AAA AAA
AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP(SEQ ID NO:1)
LP154    5′rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA
rArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA
rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG
rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC
rUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP
(SEQ ID NO:3)
LP160    5′5′rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA
rArUrG rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS
rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS
rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rCrArG rCrUrG
rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA
AAA AAA CCP(SEQ ID NO:17)
所有寡核苷酸是沿5’→3’方向排列的。核糖核苷酸碱基通过在该核苷酸符号前面加上小写“r”表示的;P是嘌呤霉素;rN表示相同量的rA、rG、rC和rU;rS表示相同量的rG和rC;而且,所有其它碱基符号都表示DNA寡核苷酸。
化合物。盐酸嘌呤霉素、长链烷基胺可控孔度玻璃、谷氏菌素、氯霉素、维及尼霉素、DMAP、二甲基三苯甲基氯、以及乙酸酐获自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。吡啶、二甲基甲酰胺、甲苯、琥珀酸酐、和对硝基苯酚获自Fluka Chemical(Ronkonkoma,NY)。β-珠蛋白mRNA获自Novagen(Madison,WI)。TMV RNA获自Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)。
酶。蛋白酶K获自Promega(Madison,WI)。无DNase的RNase酶通过Sambrook等的方法(同上)生产或者从Boehringer Mannheim公司购买。T7聚合酶是通过由Zawadzki和Gross改进的(核酸研究19:1948(1991))、由Grodberg和Dunn公开的方法(细菌学杂志170:1245(1988))制备的。T4 DNA连接酶获自New EnglandBiolabs(Beverly,MA)。
放射性标记物掺入的定量。对于放射性凝胶带来说,通过在一台Betagen 603印迹分析仪(Betagen,Waltham,MA)上定量或使用磷成像板(分子动力学,Sunnyvale,CA)测定每一条带中所存在的放射性标记物(35S或32P)的量。对于液体和固体样品而言,通过闪烁计数(Beckman,Columbia,MD)测定存在的放射性标记物35S或32P的量。
凝胶成像。通过放射自显影(使用柯达XAR胶片)或使用磷成像板(分子动力学)获得凝胶图象。
CPG嘌呤霉素的合成。合成CPG-嘌呤霉素的详细方案如上文所述。
酶促反应。一般,利用大肠杆菌提取物制备激酶、转录、PCR、和翻译反应的核酸的方法是相同的。每一种制备方法均由用等体积的1∶1的苯酚-氯仿萃取开始,然后离心并分离水相。分别以300mM和1mM的最终浓度加入乙酸钠(pH5.2)和亚精胺,添加3倍体积的100%乙醇,并在-70℃下温育20分钟以使所述样品沉淀。以大于12,000g的速度离心样品,除去上清液,用过量的、温度为0℃的95%乙醇洗涤沉淀。然后在真空条件下干燥所得到的沉淀,并重新悬浮。
寡核苷酸。合成的所有DNA和RNA都是在一台MilliporeExpedite合成仪上使用由生产商(Milligen,Bedford,MA)提供的各自的标准化学法合成的。含有3’嘌呤霉素的寡核苷酸是使用装有30-50mg固体支持物的CPG嘌呤霉素柱合成的(大约20μmol嘌呤霉素/克)。含有3’生物素的寡核苷酸是使用购自Glen Research(Sterling VA)的1μmol bioteg CPG柱合成的。含有5’生物素的寡核苷酸是通过添加bioteg亚磷酰胺(Glen Research)作为5’碱基而合成的。待连接到RNA分子3’末端的寡核苷酸要么在去保护之前通过化学方法将其5’末端磷酸化(使用购自Glen Research的化学磷酸化试剂),要么在去保护之后使用ATP和T4多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)酶促磷酸化。通过添加25%的NH4OH并在55℃下温育12小时将仅含有DNA(以及3’嘌呤霉素或3’生物素)的样品去保护。通过将乙醇(25%(v/v))添加到NH4OH溶液中并在55℃下温育12小时将含有RNA单体(例如,43-P)的样品去保护。在室温下,用溶解在THF(Sigma)中的1M TBAF将2’OH去保护48小时。用NAP-25Sephadex柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)除去TBAF。
然后,通过使用变性PAGE纯化去保护的DNA和RNA样品,然后浸泡或使用E1utrap(Schleicher和Schuell,Keene,NH)从凝胶中电洗脱,并使用上述的NAP-25 Sephadex柱或乙醇沉淀方法脱盐。
Myc DNA构建。构建两种含有c-myc表位标记的DNA模板。第一种模板是通过以下两种寡核苷酸的组合制成的:64.27(5’-GTT CAGGTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATAGTG AGT CGT ATT A-3’)(SEQ ID NO:18)和18.109(5’-TAA TACGAC TCA CTA TAG-3’)(SEQ ID NO:19)。用该模板转录产生的RNA47.1能编码肽MEQKLISEEDLN(SEQ ID NO:20)。将RNA47.1连接到30-P上得到图7A所示的LP77。
首先,以单链寡核苷酸的形式制备第二种模板,该模板长99个碱基,名称为RWR99.6,序列为5’-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTCCAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTCTTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3’)(SEQ ID NO:21)。通过PCR构建含有该序列的双链转录模板,PCR是使用寡聚物RWR21.103(5’-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3’)(SEQ ID NO:22)和RWR63.26(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTATTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3’)(SEQ ID NO:23)按照公开的方案进行的(Ausubel等,同上,第15章)。用该模板转录产生的RNA被称为RNA124,它编码肽MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:24)。该肽含有用于制备(与载体蛋白结合)单克隆抗体9E10的序列(癌基因科学技术公报)。RNA124的长度为124个核苷酸,将RNA124与30-P连接产生如图7B所示的LP154。RNA124的序列如下(SEQ ID NO:32):
5′-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG
rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA
rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG
rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU
rUrCrC rGrCrU-3′
随机化库的构建。以单链寡核苷酸的形式构建随机化库,其长度为130个碱基,并命名为RWR130.1。从3’末端开始,其序列为3’-CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC(NNS)27GTC GAC GCA TTG AGA TACCGA-5’(SEQ ID NO:25)。N表示随机位点,该序列是通过标准合成方法产生的。S表示dG和dC碱基的等量混合物。PCR是使用寡核苷酸42.108(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTTACA ATT ACA)(SEQ ID NO:26)和21.103(5’-AGC GCA AGA GTTACG CAG CTG)(SEQ ID NO:27)进行的。该模板转录所产生的RNA被命名为库130.1。将库130.1与30-P连接得到图7C所示的1号库(也被称作LP160)。
按照公开的方法(Ausubel等,同上)进行7轮PCR,仅有以下例外:(i)RWR130.1的起始浓度为30纳摩尔,(ii)每一种引物的使用浓度为1.5μM,(iii)每一种碱基的dNTP浓度为400μM,和(iv)Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的使用浓度为每100μl五个单位。在非变性PAGE上纯化双链产物,并通过电洗脱提取。通过260nm波长下的UV吸收值和与已知的标准物进行溴化乙啶荧光比较测定DNA的量。
RNA的酶促合成。由双链PCR DNA进行的转录反应和寡核苷酸的合成是按照以前披露的方法进行的(Milligan和Uhlenbeck,酶学方法180:51(1989))。按照上述方法通过变性PAGE纯化完整长度的RNA,电洗脱,并脱盐。估算库RNA浓度时使用的消光系数为1300O.D./μM;RNA124,1250 O.D./μM;RNA47.1,4800.D./μM。由双链库DNA转录产生大约90纳摩尔的库RNA。
RNA嘌呤霉素缀合物的酶促合成。通过类似于由Moore和Sharp(科学250:992(1992))所披露的方法,用被称为19.35(5’-TTTTTT TTT TAG CGC AAG A)(SEQ ID NO:28)的DNA裂片将myc和库mRNA序列连接到含有嘌呤霉素的寡核苷酸上。反应物由摩尔比为0.8∶0.9∶1.0的mRNA、裂片、和嘌呤霉素寡核苷酸(30-P,dA27dCdCP)组成,并且,每皮摩尔库mRNA含有1-2.5单位的DNA连接酶。反应在室温下进行1小时。为了构建库RNA融合体,mRNA的浓度为大约6.6μM。在连接之后,按照上述酶促反应的方法制备RNA-嘌呤霉素缀合物。重新悬浮沉淀,在变性PAGE上纯化全长融合体,并通过上述电洗脱提取。使用1650 O.D./μM的消光系数估算库RNA浓度,并用1600 O.D./μM的消光系数估算myc模板的浓度。这样,制备了2.5纳摩尔的缀合物。
制备dT25链霉抗生物素琼脂糖。 在室温下,在TE(10mM Tris-HClpH8.2,1μM EDTA)中以1-10μM的浓度将含有3’生物素的dT25(在bioteg亚磷酰胺柱(Glen Resesarch)上合成)与链霉抗生物素琼脂糖浆体(体积为50%的琼脂糖,Pierce,Rockford,IL)一起温育1小时,并洗涤。然后通过生物素-dT25从溶液中的消失和/或通过用已知量的互补寡核苷酸滴定所述树脂,通过光学方法估计所述琼脂糖的结合能力。
用大肠杆菌产生的提取物和核糖体进行的翻译反应。一般,翻译反应是用购买的试剂盒(例如,用作线性模板的的大肠杆菌S30提取物,Promega,Madison,WI)进行的。不过,也可使用大肠杆菌MRE600(获自ATCC,Rockville,MD)按照公开方法(例如,Ellman等,酶学方法202:301(1991))制备S30提取物,并通过Kudlicki等所披露的方法(分析生物化学206:389(1992))制备核糖体部分。标准反应是在以20-40μCi的35S甲硫氨酸为标记的50μl体积中进行的。该反应混合物包括30%的提取物v/v,9-18mM MgCl2,40%的无甲硫氨酸预混合物(Promega)v/v和5μM模板(例如,43-P)。为了进行共温育试验,以5μM的浓度添加寡聚物13-P和25-P。对于使用核糖体的试验来说,将3μl核糖体溶液加入每一个反应中,取代所述裂解物。所有反应物均在37℃下温育30分钟。在酶促反应下按上述方法纯化模板。
小麦胚翻译反应。图8所示的翻译反应是使用购买的缺少甲硫氨酸的试剂盒(Promega),按照生产商的推荐进行的。对于43-P来说,模板浓度为4μM,而对于LP77和LP154来说,模板浓度为0.8μM。反应是在25℃下进行,在总体积为25μl的反应物中含有30μCi的35S甲硫氨酸。
网织红细胞翻译反应。用购买的试剂盒(Novagen,Madison,WI)或使用按照公开方案(Jackson和Hunt,酶学方法96:50(1983))制备的提取物进行翻译反应。富含网织红细胞的血液获自Pel-FreezBiologicals(Rogers,AK)。在以上两种情况下,反应条件为推荐用于Red Nova裂解物(Novagen)的方法。反应物包括100mM KCl,0.5mM乙酸镁,2mM DTT,20mM HEPES pH7.6,8mM磷酸肌酸,25μM的每一种氨基酸(甲硫氨酸例外,如果使用35S Met的话),和40%v/v的裂解物。在30℃下温育1小时。模板浓度取决于试验,但通常在50nM-1μM的范围内,43-P除外(图6H),它的浓度是4μM。
为了制备随机化库,以大约0.1μM的模板浓度(1.25纳摩尔的模板)进行10ml的翻译反应。另外,在该反应中包括32P标记的模板,以便确定在纯化和筛选过程的每一个步骤中所存在的材料的量。在30℃下翻译1小时,然后将反应物在冰上冷却30-60分钟。
用dT25链霉抗生物素琼脂糖提取融合体。 温育之后,将翻译反应物用提取缓冲液(1.0M NaCl,0.1M Tris-HCl pH8.2,10mM EDTA,1mM DTT)稀释大约150倍,该缓冲液含有摩尔数超过10倍以上的dT25-生物素-链霉抗生物素琼脂糖,其dT25浓度为大约10μM(浆体的体积等于或大于裂解物的体积),并在4℃下搅拌温育1小时。然后通过过滤(Millipore ultrafree MC滤器)或离心从该混合物中除去琼脂糖,并用冷却的提取缓冲液洗涤2-4次。然后用50-100μl的15mM NaCl,1mM EDTA反复洗涤,将所述模板从dT25链霉抗生物素琼脂糖上释出。将洗脱液立即中和在3M乙酸钠pH5.2,10mM亚精胺中,并用乙醇沉淀。对于所述库反应来说,回收到的总的放射性表明,大约回收到了50-70%的投入模板。
用硫代丙基琼脂糖凝胶分离融合体。如图13所示,可以使用硫代丙基琼脂糖凝胶6B(Pharmacia)纯化含有半胱氨酸的融合体。在本文所披露的实验中,分离是直接用翻译反应物进行的或者在初步分离所述融合体之后(例如,用链霉抗生物素琼脂糖)进行的。例如,直接纯化时使用比例为1∶10(v/v)的裂解物和琼脂糖凝胶。对于所述库来说,将0.5ml的琼脂糖凝胶浆体用于从5ml反应混合物中分离所有的融合材料。将样品稀释到溶解在1XTE8.2(10mM Tris-Cl,1mM EDTA,pH8.2)中的硫代丙基琼脂糖凝胶的50∶50(v/v)浆体中,所述缓冲液含有无RNase的DNase(Boehringer Mannheim),并在4℃下旋转温育1-2小时,以便充分反应。除去多余的液体,用含有20mM DTT的提取缓冲液反复洗涤琼脂糖凝胶,并通过离心或过滤回收。用溶解在10mM Tris-Cl pH8.2,1mM EDTA的25-30mM二硫苏糖醇(DTT)溶液将融合体从琼脂糖凝胶上洗脱。然后通过上述在高真空下蒸发和乙醇沉淀的组合方法浓缩该融合体。对于库反应来说,所回收到的总的放射活性表明,大约1%的模板被转化成融合体。
对某些用途来说,将dT25加入该洗出物中,并在4℃下旋转温育1小时。用冰镇的提取缓冲液漂洗琼脂糖3次,通过过滤分离,并按照上述方法洗脱结合材料。加入载体tRNA,并用乙醇沉淀融合产物。将样品重新悬浮在含有无RNaseA的DNase的TE pH8.2中,以除去所述模板的RNA部分。
免疫沉淀反应。从翻译反应物中分离肽的免疫沉淀(图10)是这样进行的:将4μl网织红细胞翻译反应物、2μl正常小鼠血清、和20μl蛋白G+A琼脂糖(Calbiochem,La Jolla,CA)与200μl的PBS(58mM磷酸氢二钠、17mM磷酸二氢钠、68mM氯化钠)、稀释缓冲液(10mM Tris-ClpH8.2,140mM氯化钠,1%v/v TritonX-100)、或PBSTDS(PBS+1%Triton X-100,0.5%脱氧胆酸,0.1%SDS)混合。然后在4℃下转动样品1小时,接着以2500rpm的速度离心15分钟。除去洗脱液,加入10μl c-myc单克隆抗体9E10(Calbiochem,La Jolla,CA)和15μl蛋白G+A琼脂糖,并在4℃下转动2小时。然后用1ml体积的PBS、稀释缓冲液、或PBSTDS洗涤样品2次,将40μl的凝胶加样缓冲液(Calbiochem产品简报)加入所述混合物中,并将20μl混合物加样到变性PAGE上,如Schagger和von Jagow所披露的(分析生物化学166:368(1987))。
将8μl网织红细胞翻译反应物与300μl稀释缓冲液(10mMTris-Cl pH8.2,140mM氯化钠,1%v/v Triton X-100),15μl蛋白G琼脂糖凝胶(Sigma),10μl(1μg)c-myc抗体9E10(Calbiochem)混合,然后在4℃下转动数小时。分离之后洗涤样品,用无RNase A的DNase处理,用多核苷酸激酶和32PγATP标记,并通过变性尿素PAGE分离(图11)。
融合体库的逆转录。按照Superscript II的生产商的推荐进行逆转录反应,所不同的是,模板、水和引物仅在70℃下温育2分钟(Gibco BRL Grand Island,NY)。为了监测延伸反应,将50μCiα32P dCTP加入某些反应物中。在其它反应中,用5’32P-标记的引物监测逆转录,所述引物是用32PαATP(New England Nuclear,Boston,MA)和T4多核苷酸激酶(New England Biolabs,Beverly,MA)制备的。
制备蛋白G和抗体琼脂糖凝胶。用稀释缓冲液(10mM Tris-HClpH8.2,140mM NaCl,0.025%的NaN3,1%v/v Triton X-100)洗涤2份50μl的蛋白G琼脂糖凝胶浆体(体积百分比为50%的固体)(Sigma),并通过离心分离。保存第一份样品,以便用作筛选基质之前预装柱。将第二份样品重新悬浮在稀释缓冲液里,然后加入40μg c-myc AB-1单克隆抗体(Oncogene Science),在4℃下旋转温育该反应物过夜。在微量离心机中以1500-2500rpm的速度离心15分钟,纯化抗体琼脂糖凝胶,并用稀释缓冲液洗涤1-2次。
筛选。提取融合体并合成互补链,然后将整个逆转录反应物直接用于筛选过程。本文披露了两种方法。第一轮,将逆转录反应物直接加入按上述方法制备的抗体琼脂糖凝胶中,并温育2小时。在随后的轮次中,将所述反应物与洗涤过的蛋白G琼脂糖凝胶温育大约2小时,然后再加入抗体柱上,以减少与蛋白G而不是固定化抗体相互作用的结合体的数量。
为了从所述基质上洗脱所述库,可以采用几种方法。第一种方法是用4%的乙酸洗涤所述筛选基质。该方法能将肽从所述基质上释出。另外,可以用更严格的洗涤(例如使用尿素或其它变性剂)取代所述乙酸方法或者与该方法一起使用。
筛选的融合体的PCR。用上文所述的用于构建所述库的标准方法,通过PCR扩增筛选的分子。
          β-珠蛋白融合体的合成和测试
为了合成β-珠蛋白融合体结构,按照生产商推荐的方法通过用200皮摩尔引物18.155(5’GTG GTA TTT GTG AGC CAG)(SEQ ID NO:29)和Superscript逆转录酶(Gibco BRL)进行逆转录,由2.5μg珠蛋白mRNA制备β-珠蛋白cDNA。引物的序列互补于β-珠蛋白的5’终止密码子的18个核苷酸。为了增加一个T7启动子,取出20μl逆转录反应物,并用引物18.155和40.54(5’TAA TAC GAC TCA CTATAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C)(SEQ ID NO:30)进行6个轮次的PCR。然后按照Milligcn和Uhlenbeck披露的方法(酶学方法180:51(1989)),通过T7失控转录制备“合成-β-珠蛋白”mRNA,按照本文所披露的方法对该RNA进行凝胶纯化,电洗脱,并脱盐。然后按照Moore和Sharp的方法(科学256:992(1992))使用引物20.262(5’TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G)(SEQ ID NO:31)作为裂片,通过将合成-β-珠蛋白结构连接到30-P上产生“LP-β-珠蛋白”。然后对连接反应的产物进行上文所述的凝胶纯化,电洗脱,以及脱盐。通过其在260nm波长下的吸收值测定最终产物的浓度。
然后如表1所示各自在25μl的总体积中体外翻译上述β-珠蛋白模板。添加25mM的Mg2+母液。所有反应均在30℃下温育1小时,并放在-20℃下过夜。然后用6μl的裂解物和平均负背景测定可由dT25沉淀的CPM’s两次。
                              表1
用β-珠蛋白模板进行的翻译反应
反应    样品        Mg2+    35S-Met           TCA CPM     dT25CPM
                    (mM)     (μl)              (2μl)      (6μl)
1       ---         1.0      2.0(20μCi)        3312        0
2       2.5μg      0.5      2.0(20μCi)        33860       36
合成-β-珠蛋白
3       2.5μg      1.0      2.0(20μCi)        22470       82
合成-β-珠蛋白
4       2.5μg      2.0      2.0(20μCi)        15696       86
合成-β-珠蛋白
5       2.5μg      0.5      2.0(20μCi)        32712       218
LP-β-珠蛋白
6       2.5μg      1.0      2.0(20μCi)        24226       402
LP-β-珠蛋白
7       2.5μg      2.0      2.0(20μCi)        15074       270
LP-β-珠蛋白
为了制备凝胶分析所使用的样品,将6μl的每一种翻译反应物与1000μl的提取缓冲液(1M NaCl 100mM Tris-Cl pH8.2。10mMEDTA,0.1mM DTT),1μl RNase A(无Dnase,Boehringer Mannheim),和20μ1的20μM的dT25链霉抗生物素琼脂糖混合。在4℃下旋转温育样品1小时。除去过量的提取缓冲液,将该样品加入Millipore MC滤器中,以除去所有残留的提取缓冲液。然后用50μl的水洗涤样品4次,用50μl的15mM NaOH,1mM EDTA洗涤两次。用100μl TE pH6.8(10mM Tris-Cl,1mM EDTA)中和样品(300μl),加入1μl的1mg/mlRNaseA(同上),在37℃下温育样品,然后加入10μl的2XSDS加样缓冲液(125mM Tris-Cl pH6.8,2%SDS,2%β-巯基乙醇,20%甘油,0.001%溴酚兰),将该样品冻干,并重新悬浮在20μl水和1%β-巯基乙醇中。然后按照Schagger和von Jagow所披露的方法(分析生物化学166:368(1987))将样品加样到肽分离凝胶上,并通过放射自显影观察。
以上实验的结果示于图15A和15B中。如图15A所示,35S-甲硫氨酸结合到了合成-β-珠蛋白和LP-β-珠蛋白融合体的蛋白部分中。该蛋白是不一致的,不过一条强的带表明了预期的β-珠蛋白mRNA的迁移率。另外,如图15B所示,在dT25分离和RNaseA消化之后,在合成-β-珠蛋白泳道上不再有35S-标记的材料(图15B,泳道2-4)。相反,在LP-β-珠蛋白泳道上,观察到了大小一致的35S-标记的产物。
上面的结果表明,只有当模板含有3’嘌呤霉素时才能通过寡核苷酸亲和层析提取到融合产物。这一结果得到了闪烁计数(参见表1)的证实。所获得的材料预计含有与β-珠蛋白的某一部分融合的30-P接头。通过凝胶分析判断该融合产物的大小似乎十分均匀。不过,由于该产物具有非常类似于天然β-珠蛋白的迁移率(如15A和15B,对照泳道),难于确定该融合产物的蛋白部分的确切长度。
进一步优化RNA-蛋白融合体的形成
业已发现某些因素能进一步提高RNA-肽融合体形成的效率。融合体的形成,即新生肽链由其tRNA向位于mRNA 3’末端的嘌呤霉素的转移是一种缓慢的反应,该反应是继最初的、较快的开放读框的翻译之后进行的,所述翻译过程产生新生肽。通过翻译后在高Mg2+条件下(优选地,在50-100mM范围内)温育和/或在RNA和嘌呤霉素部分之间使用更有柔性的接头可明显加强融合体形成的程度。另外,在低温下(优选-20℃)长时间(12-48小时)温育,也能导致融合体产量的提高,与在30℃下温育相比,有较少的mRNA降解。通过综合以上因素,可将高达40%的投入的mRNA转化成mRNA-肽融合产物,如下文所述。
mRNA-嘌呤霉素缀合物的合成。在这些优化实验中,在有互补DNA裂片的条件下用噬菌体T4 DNA连接酶将含有嘌呤霉素的接头寡核苷酸连接到mRNA的3’末端,基本上如上文所述,因为T4 DNA连接酶倾向于在连接接点附近的精确碱基配对,T7、T3、或SP6 RNA聚合酶的失控转录产物在其3’末端通常是不一致的(核酸研究15:8783(1987)),仅有含有正确的3’-末端核苷酸的RNA能有效地连接。当使用标准DNA裂片时,大约有40%的失控转录产物连接到嘌呤霉素寡聚物上。使用过量的RNA可以提高连接产物的量,但使用过量的嘌呤霉素核苷酸不能提高连接产物的量。并不囿于特定的理论,连接的限制因素似乎是完全互补于所述DNA裂片的相应部分的RNA的量。
为了连接其3’末端具有一个额外的非模板核苷酸的转录物(被称为“N+1产物”),使用标准DNA裂片和在连接结合点处具有一个额外的随机碱基的新的DNA裂片的混合物。在有上述混合DNA裂片的情况下,可将一种代表性myc RNA模板(即RNA124)的连接效率提高到高于70%。
除了上述改进的DNA裂片方法之外,通过考虑以下3个因素可进一步优化mRNA-嘌呤霉素缀合物形成的效率。首先,优选设计或使用这样的mRNAs:它缺少具有任何明显的稳定二级结构的3’末端,这种结构会干扰与裂片寡核苷酸的退火。另外,由于高浓度的盐有时会导致连接反应的失败,该方法优选包括一个用NAP-25柱对所述寡核苷酸进行彻底脱盐的步骤。最后,由于连接反应比较迅速,而且,在室温下通常在40分钟之内结束,一般不会使用较长的温育时间,而且,较长的温育时间通常会导致RNA的不必要降解。
使用上述条件按如下方法合成了mRNA-嘌呤霉素缀合物。用标准DNA裂片(例如,5’-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA)或在连接点处含有随机碱基(N)的裂片(例如,5’-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA)将myc RNA序列(RNA124)连接到含有嘌呤霉素的寡核苷酸上。反应物包括mRNA、DNA裂片、和嘌呤霉素寡核苷酸,其摩尔比为1.0∶1.5-2.0∶1.0。首先将上述成分的混合物在94℃下加热1分钟,然后在冰上冷却15分钟。连接反应是在室温下,在50mM Tris-HCl(pH7.5),10mMMgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25μg/ml BSA、15μM嘌呤霉素寡聚物、15μM mRNA、22.5-30μM DNA裂片、浓度为1U/μl的RNase蛋白抑制剂(Promega)、和每皮摩尔嘌呤霉素寡聚物1.6单位的T4 DNA连接酶中进行的。在温育之后,将EDTA以30mM的终浓度加入,并用苯酚/氯仿萃取反应混合物。通过变性PAGE纯化完整长度的缀合物,并通过电洗脱提取。
通用网织红细胞翻译条件。除了改善mRNA-嘌呤霉素的缀合物的合成之外,还要对翻译反应作如下进一步的优化。反应是在由不同商业渠道获得的兔网织红细胞裂解物中进行的(Novagen,Madison,WI;Amersham,Arlington Heights,IL;Boehringer Mannheim,Indinapolis,IN;Ambion,Austin,TX;和Promega,Madison,WI)。典型的反应混合物(25μl终体积)包括20mM HEPES pH7.6,2mM DTT,8mM磷酸肌酸,100mM KCl。0.75mM乙酸镁,1mMATP,0.2mMGTP,25μM的每一种氨基酸(如果使用35S-Met的话,0.7μM的甲硫氨酸),浓度为1U/μl的RNase蛋白抑制剂,和60%(v/v)裂解物。模板的终浓度在50-800nM的范围内。对于每一种温育来说,将除裂解物之外的所有成分在冰上仔细混合,并在使用之前将冰冻的裂解物解冻。在添加裂解物之后,通过温和的移液重复混合该反应混合物,并在30℃下温育以便开始翻译。对于不同的mRNAs来说,Mg2+和K+的最佳浓度分别在0.25-2mM和75-200mM的范围内变化,并且优选通过预备实验确定。特别地,对于翻译较差的mRNAs来说,有时也要优化氯高铁血红素、磷酸肌酸、tRNA、和氨基酸的浓度。对于融合反应来说,KCl通常要优于乙酸钾,不过,氯化钾和乙酸钾的混合物有时能产生更好的效果。
在30℃下翻译30-90分钟,然后将该反应物放在冰上冷却40分钟,并加入Mg2+。将在这一步骤中加入的Mg2+终浓度相对不同的mRNA模板优化,不过,通常在50-100mM范围内(对于混合模板库来说优选使用50mM)。将所得到的混合物在-20℃下温育16-48小时。为了观察标记过的融合产物,将2μl反应混合物与4μl加样缓冲液混合,并将该混合物在75℃下加热3分钟。然后将所得到的混合物加样到6%甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶上(32P-标记的模板)或加样到8%麦黄酮SDS-聚丙烯酰胺凝胶上(35S-Met-标记的模板)。除了该方法之外,还可以用dT25链霉抗生物素琼脂糖或硫代丙基琼脂糖凝胶(或同时用这两种材料)分离所述融合产物,基本上如本文所披露的。
为了除去RNA-接头-嘌呤霉素-肽缀合物的RNA部分,以便随后通过SDS-PAGE进行分析,在翻译后温育之后添加适量的EDTA,并用microcon-10(或microcon-30)柱将所述反应混合物脱盐。将所得到的混合物(大约共25μl)与18μl RNaseH缓冲液(30mMTris-HCl,pH7.8,30mM硫酸铵,8mM氯化镁,1.5β-巯基乙醇,和适量的互补DNA裂片)混合,并将该混合物在4℃下温育45分钟。然后加入RNaseH,并在37℃下消化20分钟。
嘌呤霉素寡聚物的质量。对于有效制备融合产物来说,嘌呤霉素寡核苷酸的质量同样是重要的。5’-DMT,2’-琥珀酰,N-三氟乙酰嘌呤霉素与CPG的连接不如标准寡核苷酸的连接有效。因此,要仔细监测连接反应,以避免CPG与太低浓度的偶联嘌呤霉素的形成,而且将CPG上的未反应的氨基完全淬火,以避免随后合成缺少3’-末端嘌呤霉素的寡核苷酸。避免使用含有极细目数的颗粒的CPG同样很重要,因为这种颗粒会导致在随后的自动寡核苷酸合成步骤中出现堵塞阀的问题。
另外,优选在大规模使用之前试验合成的嘌呤霉素寡聚物,以确保嘌呤霉素在3’-末端的存在。在我们的实验中,如果嘌呤霉素被主要在其3’-末端含有氨基的脱氧腺苷所取代,则监测不到融合体。为了监测3’羟基的存在(即缺少3’-末端嘌呤霉素的不希望的寡核苷酸的合成),可以首先用放射性标记嘌呤霉素寡聚物(例如,通过5’-磷酸化),然后将其用作引物,由末端脱氧核苷酸基转移酶进行延伸。在有3’-末端嘌呤霉素部分存在的情况下,不会出现延伸产物。
翻译和翻译后温育的时间过程。翻译反应比较迅速,而且,通常在30℃下在25分钟内完成。不过,所述融合反应比较慢。当在30℃下使用标准接头(dA27dCdCP)时,再用45分钟融合体的合成会达到最高水平。翻译后温育可以在低温度下进行,例如在室温、0℃、或-20℃下进行。在-20℃下发现mRNA模板的降解较少,在-20℃下温育两天之后,获得了最佳的融合效果。
Mg2+ 浓度的作用。在翻译后温育中,高浓度的Mg2+可大大促进融合体的形成。例如,对于上述mycRNA模板来说,在-20℃下进行的16小时的温育中,在有50mM Mg2+的条件下,用标准接头(dA27dCdCP)可提高融合体形成3-4倍(图17,比较泳道3和4)。类似地,当所述反应是在室温下进行30-45分钟时,在有50-100mM Mg2+的浓度下进行的翻译后温育中也会出现有效的融合体形成。
接头长度和序列。还实验了接头长度对融合反应的影响。在21-30个核苷酸(n=18-27)的范围内,观察到了融合反应效率的较小的变化(如上文所述)。接头越短(例如,13个核苷酸长),效率越低。另外,尽管特定的较大长度的接头(即,45个核苷酸和54个核苷酸)有时也会导致较低的效率,但仍然有可能将较长的接头用于优化融合反应的效率。
就接头序列而言,用核糖核苷酸残基取代靠近3’末端的脱氧核糖核苷酸不会显著改变其融合效率。不过,位于接头3’末端dCdCP(或rCrCP)序列对于融合体形成来说很重要。用dUdUP取代dCdCP明显较低融合体形成的效率。
接头柔性。还实验了接头柔性对融合反应的影响。在这些实验中,如果所述接头的刚性因为与位于其3’末端的互补核苷酸退火而提高,则测得的融合效率低。类似地,当使用柔性更大的接头(例如,dA27C9C9C9 dAdCdCP,其中,C9表示HO(CH2CH2O)3PO2),可明显提高其融合效率。与标准接头(dA27dCdCP),采用柔性更大的接头(dA27C9C9C9dAdCdCP)可以提高RNA124的融合效率4倍以上(图17,比较泳道1和9)。另外,与具有标准接头的模板相反,这种模板在缺少高浓度Mg2+的条件下其翻译后融合进行的很差(图17,比较泳道3和4),具有柔性接头的模板不需要高浓度Mg2+以便在-20℃下进行的延长的翻译后温育中产生高产量的融合产物(图17,比较泳道11和12)。因此,如果不需要翻泽后添加高浓度的Mg2+的话,这种接头是非常有用的。另外,柔性接头也能在有高浓度Mg2+的条件下产生最佳的融合产率。
融合效率的定量。融合效率可以用翻译肽转化成融合产物的比率或投入的模板转化成融合产物的比率表示。为了测定翻译肽转化成融合产物的比率,使用35S-Met标记的翻译肽。在这些实验中,当使用dA27dCdCP或dA27rCrCP接头时,在30℃下进行1小时的翻译温育之后,有大约3.5%的翻译肽与其mRNA融合。在-20℃下进行温育过夜之后,这一数值可提高到12%。当翻译后温育是在有高浓度的Mg2+的条件下进行时,50%以上的翻译肽与所述模板融合。
对于具有柔性接头的模板来说,在30℃下翻译温育1小时之后,大约25%的翻译肽与模板融合。在-20℃下进行温育过夜之后,这一数值可提高到超过50%,而且如果翻译后温育是在有50mM Mg2+的条件下进行,可提高到超过75%。
为了测定所投入的模板转化成融合产物的百分比,用32P-标记的mRNA-接头模板进行翻译。当使用柔性接头,而且翻译后温育是在不添加Mg2+的条件下在-20℃下进行的时,当投入的RNA模板的浓度分别为800、400、200、100、和50nM时,所投入的模板的大约20%、40%、40%、35%、和20%被转化成mRNA-肽融合体(图18)。当翻译后温育是在有50mM Mg2+的条件下进行时,获得了类似结果。用获自Novagen、Amersham、或Ambion的裂解物获得了最佳结果(图19)。
如果mRNA模板较长的话,通过SDS-PAGE测定的mRNAs和mRNA-肽融合体之间的迁移率差别很小。在这种情况下,可以用32P标记模板的接头的5’末端。然后在翻译/温育之后,在有互补DNA裂片的条件下,用RNaseH消化长的RNA部分,并通过定量未修饰过的接头与接头-肽融合体的比率测定融合效率。与RNaseA消化相比,这种酶的消化能产生3’-P和5’-OH,该方法所具有的优点是,位于接头5’末端的32P不会被除去。
在翻译后温育中进行的分子内与分子间融合。除了上述实验之外,我们还试验了在有Mg2+的条件下在-20℃下进行的融合反应是分子内性质的还是分子间性质的。在上述翻译和翻译后温育条件下,将游离接头(dA27dCdCP或dA21C9C9C9 dAdCdCP,其中C9是-O(CH2CH2O)3PO2)与含有一个DNA接头但在其3末端没有嘌呤霉素的模板共温育。在这些实验中,没有可检测量的(即低于正常水平的2%)35S-Met掺入接头-肽产物中,表明翻译后融合主要是发生在新生肽与结合于相同核糖体上的mRNA之间。
优化结果。如上文所述,通过使用柔性接头和/或在有高浓度Mg2+的条件下进行翻译后温育,融合效率可提高到大约为投mRNA的40%。以上结果表明,每1毫升的体外翻译反应混合物可以产生多达1014个mRNA-肽融合体分子,产生用于体外筛选实验中的具有极高复杂性的mRNA-肽融合体库。
RNA-蛋白融合体的筛选富集
我们业已证实了通过基于其所编码的肽将一种特定的RNA-肽融合体从随机序列融合体的复合库中富集起来而将RNA-肽融合体用于筛选和进化实验的可行性。具体地讲,我们制备了一系列混合物,其中,将少量的已知序列(在这种情况下是长myc模板LP154)与某种量的随机序列库(即LP160)混合。翻译该混合物,并通过本文所披露的寡核苷酸和二硫亲和层析筛选RNA-肽融合产物。用抗-myc单克隆抗体选择性地免疫沉淀myc-模板融合体(图16A)。为了测定在该筛选步骤中获得的富集程度,在有放射性标记的引物的条件下通过PCR扩增来自免疫沉淀之前和之后的cDNA/mRNA-肽融合体混合物的等分试样。用能裂解myc模板序列不能裂解所述库的限制性内切酶消化扩增的DNA(图16B和16C)。对裂解和非裂解DNA的比例的定量表明,通过免疫沉淀使myc序列相对随机文库富集了20-40倍。
以上实验是按如下方法进行的。
翻译反应。翻译反应的进行大体上如上文所述。具体地讲,是按照生产商的说明(Novagen)在30℃下进行反应1小时,并在-20℃下冷冻过夜。制备了两种形式的六个样品,一种含有35S甲硫氨酸,而另一种含有以52μM的终浓度添加的冷却甲硫氨酸。反应物1-6含有表2所示量的模板。表2中的所有数字表示每25μl反应混合物中的模板的皮摩尔数。
                         表2
              用于掺杂筛选中的模板比例
反应                    LP154                    LP160
1                       ---                      ---
2                       5                        ---
3                       1                        20
4                        0.1                     20
5                        0.01                    20
6                        ---                     20
dT25链霉抗生物素琼脂糖的制备。 用TE8.2(10mM Tris-ClpH8.2,1mM EDTA)洗涤链霉抗生物素琼脂糖(Pierce)3次,并以1∶1(v/v)浆液的比例重新悬浮于TE8.2中。然后加入用Bioteg CPG(Glen Research)合成的3’生物素酰T25至需要的最终浓度(通常为10或20μM),并在搅拌条件下温育1小时。然后用TE8.2洗涤dT25链霉抗生物素琼脂糖3次,并在4℃下保存待用。
从翻译反应物中纯化模板。为了从翻译反应物中纯化模板,取出每一种反应物25μl,并加入7.5ml的提取缓冲液(1M NaCl,100mMTris-Cl pH8.2,10mM EDTA,0.1mM DTT)和125μl的20μM dT25链霉抗生物素琼脂糖中。在4℃下旋转温育该溶液1小时。对所述试管进行离心,并除去洗脱剂。添加1ml的提取缓冲液,重新悬浮该浆体,并将该混合物转移到1.5ml的微量离心管中。然后用1ml的冰镇提取缓冲液的等分试样洗涤所述样品4次。将来自相同反应的热的和冷的样品合并在Millpore MC过滤装置中,并通过用2体积的100μ1水,0.1mM DTT和2体积的15mM NaOH,1mM EDTA从dT25琼脂糖上洗脱。
向该洗脱液中添加40μl洗涤过的50%硫代丙基琼脂糖凝胶(Pharmacia)浆体,并在4℃下旋转温育1小时。然后用1ml体积的TE8.2洗涤所述样品3次,除去洗脱液。将1μl的1MDTT加入固体中(总体积大约为20-30μl),并温育该样品若干小时,取出,并用20μl的水洗涤4次(总体积90μl)。通过UV吸收值判断洗脱液中含有2.5mM的硫代吡啶酮。通过加入6μl 3M乙酸钠pH5.2,10mM亚精胺,1μl糖原(10mg/ml,Boehringer Mannheim),和170μl 100%的乙醇,并在-70℃下温育30分钟对50μl的上述样品进行乙醇沉淀,并在微量离心机中以13,000pm的速度离心30分钟。
逆转录酶反应。按如下方法对乙醇沉淀的和硫代吡啶酮洗脱的样品进行逆转录反应。对于乙醇沉淀的样品来说,向30μl的再悬浮模板中加水至48μl,并让200皮摩尔的引物21.103(SEQ ID NO:22)在70℃下退火5分钟,并在冰上冷却。向该样品中加入16μl的第一链缓冲液(250mM Tris-Cl pH8.3,375mM KCl,和15mM MgCl2;购自Gibco BRL Grand Island,NY),8μl 100mM DTT和4μ1 10mMNTP,并在4℃下平衡,加入4μl Superscript II逆转录酶(GibcoBRL Grand Island,NY)。将水(13μl)加入TP琼脂糖凝胶洗脱液(35μl)中,并按上述方法进行反应。温育1小时,然后合并相同数目的样品(总体积160μl)。保存每一种未筛选样品的10μl样品,用于PCR,并保存150μl的样品用于免疫沉淀。
免疫沉淀。为了进行免疫沉淀,将170μl的逆转录反应物加入1ml的稀释缓冲液(10mM Tris-Cl,pH8.2,140mM NaCl,1%v/v TritonX-100)和20μl蛋白G/A缀合物(Calbiochem,La Jolla CA)中,并在4℃下旋转温育1小时进行预澄清。除去洗脱液,加入20μl G/A缀合物和20μl单克隆抗体(2μg,12皮摩尔),并将该样品在4℃下旋转温育2小时。通过以2500rpm的速度离心5分钟对该缀合物进行沉淀,除去洗脱液,并用1ml等分试样的冰镇稀释缓冲液洗涤该缀合物3次。然后用1ml的冰镇10mM Tris-Cl pH8.2,100mM NaCl洗涤该样品。用3倍体积的冷冻4%乙酸除去结合的片段,并将该样品冻干。
筛选过的和未筛选过的样品的PCR。通过将20μl的浓缩NH4OH添加到10μl的未筛选的材料和全部筛选材料中并分别在55℃和70℃下温育5分钟进行PCR反应,并在90℃温育以分解存在于该样品中的所有RNA。并用真空离心蒸发浓缩器蒸发干燥该样品。向每一种样品中添加200μl的PCR混合物(1μM引物21.103和42.108,200μM溶解在PCR缓冲液+Mg2+中的dNTP(Boehringer Mannheim),和2μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim))。对未筛选过的样品2进行16个轮次的PCR,而对所有的其它样品进行19个轮次的PCR。
然后按照表3所示,在有5’32P-标记的引物21.103的条件下对样品进行扩增,并用Wizard直接PCR纯化试剂盒(Promega)分别纯化2次,以便除去所有引物和较短的片段。
                             表3
               筛选过的和未筛选过的PCR样品的扩增
样品            类型                 体积                  轮次
1               未筛选过的           20μl                 5
2               未筛选过的           5μl                  4
3               未筛选过的           20μl                 5
4               未筛选过的           20μl                 5
5               未筛选过的           20μl                 5
6               未筛选过的           20μl                 5
1               筛选过的             20μl                 5
2               筛选过的             5μl                  4
3               筛选过的             20μl                 5
4               筛选过的             20μl                 7
5               筛选过的             20μl                 7
6               筛选过的             20μl                 7
限制性消化。将由上述每一种PCR反应制备的’32P标记的DNA以相同的量(以样品的cpm计)加入表4所示的限制消化反应物中。每一个反应的总体积为25μl。将0.5μl的AlwnI(5个单位,NewEngland Biolabs)加入每一种反应物中。在37℃温育样品1小时,通过在65℃下温育20分钟使酶失活。然后将该样品与10μl的变性加样缓冲液(1ml超纯甲酰胺(USB),20μ1 0.5M EDTA和20μl 1MNaOH)混合,加热到90℃保持1分钟,冷却,并加样到含有8M尿素的12%的变性聚丙烯酰胺凝胶上。电泳以后,用10%(v/v)乙酸,10%(v/v)甲醇,水固定所述凝胶。
                                   表4
                         限制性消化条件w/AlwnI
样品            类型              加入反应中的DNA的体积        总体积
1               未筛选过的        20μl                        25μl
2               未筛选过          4μl                         25μl
3               未筛选过的        20μl                        25μl
4               未筛选过的        20μl                        25μl
5               未筛选过的        4μl                         25μl
6            未筛选过的            20μl            25μl
1            筛选过的              20μl            25μl
2            筛选过的              8μl             25μl
3            筛选过的              12μl            25μl
4            筛选过的              12μl            25μl
5            筛选过的              20μl            25μl
6            筛选过的              20μl            25μl
消化物的定量。用磷成像仪(Molecular Dynamics)对存在于样品中的myc与库DNA的量进行定量。存在于每一条带中的材料量通过凝胶带周围的相同的矩形的总体积确定。存在于每一条带中的总的cpm通过所述体积减去背景来计算。使用了背景的三个数值:(1)在凝胶上进行计数的部位外面的相同方形的平均数;(2)可能出现myc带的(在凝胶上的这一位置上不会出现带)未筛选的库的泳道中的cpm数;和(3)可以再现未筛选的泳道之间的10倍模板增量的近似值的归一化值。图16B和16C中的泳道2、3、和4表示靶序列与库序列的富集。由于所述信号与该样品的噪声比的优化,在泳道3中可证明的富集(未筛选过的/筛选过的)产生了最大值(用方法1-3分别为17、43和27倍)。以上结果归纳于表5中。
                          表5
                  Myc模板与库的富集
方法        泳道2(20)        泳道3(200)        泳道4(2000)
1           7.0              16.6              5.7
2           10.4             43                39
3           8.7              27                10.2
在第二组实验中,用Wizard直接PCR纯化试剂盒将这些相同的PCR产物纯化一次,通过上面的方法(2)定量消化物。在这些实验中,获得了类似结果;测出相应于上面的泳道2、3和4的样品分别富集了10.7、38和12倍。
                   蛋白筛选系统的应用
本发明的筛选系统在很多领域具有商业用途,其中,蛋白质技术被用于解决治疗、诊断或工业问题。这种筛选方法可用于改进或改变现有蛋白,并用于提取具有需要的功能的新的蛋白。所述蛋白可以是天然存在的序列,可以是天然存在的序列的改变形式,或者是部分或完全合成的序列。
新型结合试剂的提取。在一种具体用途中,本文所披露的RNA-蛋白融合技术可用于提取具有特定结合(例如,配体结合)特征的蛋白。具有高度特异的结合相互作用的蛋白可被用作非抗体识别剂,使得RNA-蛋白融合技术超过传统的单克隆抗体技术。通过该方法提取的抗体-型试剂可用于使用传统抗体的任何领域,包括诊断和治疗目的。
人抗体的改进。本发明还可以用于改进人或人源化抗体,以便治疗多种疾病中的任一种。在这种用途中,形成抗体文库,并在体外筛选,消除了对诸如细胞融合或噬菌体展示技术的需要。在一种重要用途中,本发明可用于改善单链抗体文库(Ward等,自然341:544(1989);和Goulot等,分子生物学杂志213:617(1990))。为了这一用途,其可变区可以由人源构建(以便降低受体不利的免疫反应的可能性)或者可以含有完全随机化的框(以使该文库的复杂性最大)。为了筛选改进的抗体分子,检验候选分子库对一种靶分子(例如,如图2所示的固定化抗原)的结合能力。随着筛选从一轮进行到下一轮,对结合步骤施加越来越高的严格条件。为了提高严格性,改变诸如洗涤步骤的次数、过量竞争剂的浓度、缓冲条件、结合反应的时间长度、以及固定化基质筛选的条件。
可将单链抗体直接用于治疗或者间接用于标准抗体的设计。这种抗体具有多种潜在用途,包括提取抗-自身免疫抗体,免疫抑制,以及开发诸如Aids的病毒性疾病的疫苗。
新型催化剂的提取。本发明还可用于筛选新型催化蛋白。以前,业已将体外筛选和进化用于提取新型催化RNAs和DNAs,而在本发明中,将其用于提取新型蛋白酶。在该方法的一种具体实例中,可以通过筛选对催化剂转变状态的化学类似物的结合,间接提取催化剂。在另一种具体实例中,可以通过筛选与一种底物(例如,使用与一种亲和标记连接的底物)形成的共价键或通过裂解(例如,通过筛选裂解特殊键并因此从固体支持物上释放出一个文库中的催化性成分的能力)进行直接提取。
这种提取新型催化剂的方法与催化性抗体技术相比至少具有两个重要优点(参见Schultz等的综述,J.Chem.Engng.News68:26(1990))。首先,在催化抗体技术中起始库通常被局限于免疫球蛋白折叠;相反,RNA-蛋白融合体的起始文库可以是完全随机的或者可以包括,但不限于已知酶结构或蛋白支架的变体。另外,催化抗体的提取通常取决于首先筛选对转变态反应类似物的结合,随后是对活性抗体的费劲的筛选;同样,相反,可以用RNA-蛋白融合体文库方法直接筛选催化剂,正如早先用RNA文库所证实的。在提取蛋白酶的另一种方法中,可以组合使用转变-态-类似物和直接筛选方法。
通过该方法获得的酶具有很高的价值。例如,目前就存在着需要新型、有效的工业催化剂的压力,这种催化剂可以改进化学过程。本发明的一个主要优点是,所述筛选可以在任意的条件下进行,而且举例来说,并不局限于体内条件。因此,本发明有利于提取新型酶或现有酶的改进的变体,这种酶能进行高度特异的转化(因此降低不需要的副产物的形成),同时可以在预定的环境下起作用,在高温、高压、或高溶质浓度环境下工作。
体外相互作用阱。RNA-蛋白融合技术还可用于筛选cDNA文库和根据蛋白-蛋白相互作用克隆新的基因。通过该方法,可以从需要的来源制备cDNA文库(例如,通过Ausubel等的方法,同上,第5章)。对每一种候选cDNAs分子来说,连接(例如,使用上文所技露的用于制备LP77、LP154和LP160的技术)一个肽受体(例如,嘌呤霉素尾)。然后按照本文所披露的方法制备RNA-蛋白融合体,并按照上述方法测定该融合体(或该融合体的改进形式)与特定分子的相互作用的能力。如果需要,可以通过以下方法在上述过程中避免终止密码子和3’UTR区:(i)添加抑制剂tRNA,以便能通读其终止区,(ii)通过免疫沉淀除去翻译反应物中的释放因子,(iii)组合(i)和(ii),或(iv)除去所述DNA序列上的终止密码子和3’UTR。
由于相互作用步骤是在体外进行的,这样可以利用非特异竞争剂、温度、和离子条件仔细控制反应严格性。具有非可水解类似物(例如ATP与ATPgS)的正常小分子的改变,提供了筛选相同分子不同构象子的区别特征。由于筛选的结合配偶体的RNA序列是共价连接的,该方法可用于许多蛋白的克隆和功能性鉴定,并因此便于提取。另外,该技术可用于鉴定大约50-100,000个人基因的功能和相互作用,所述基因的序列目前正通过人类基因组工程进行测定。
          将RNA-蛋白融合体用于小嵌片方案
“DNA嵌片”包括固定化寡核苷酸或cDNA或基因组DNA的克隆片段的空间特定排列,并可具有诸如快速测序和转录仿型的用途。通过让RNA-蛋白融合体的混合物(例如,由细胞DNA或RNA库制备)与这样的DNA嵌片退火,可以产生一种“蛋白展示嵌片”,其中,相应于一个固定化序列的每一个点能够与所述RNA-蛋白融合体库中的其相应的RNA序列退火。通过该方法,相应的蛋白因为其与自身mRNA的连接被以空间限定的方式固定,而含有DNA序列组的嵌片展示相应的蛋白组。另外,如果所述融合体文库是由cDNAs或基因组DNAs的较小片段产生的,可以展示这些蛋白的肽片段。
这种级别的蛋白和肽的展示具有很多用途。例如,它是一种用于鉴定以前未知的蛋白-蛋白相互作用的有效工具。在一种具体方案中,对一种探针蛋白进行可检测的标记(例如,用荧光染料标记),并将标记过的蛋白与蛋白展示嵌片一起培养。通过该方法,能够确定能与探针蛋白结合的蛋白,所述测定是根据所述嵌片上由于结合了所述探针而被标记的斑点的位置而作出的。另一种用途是快速测定通过修饰酶的作用(例如,蛋白激酶,乙酰转移酶,和甲基转移酶)而被化学修饰过的蛋白。通过与感兴趣的酶和放射性标记过的底物一起培养所述蛋白展示嵌片,然后进行洗涤和放射自显影,可以方便地确定作为所述修饰过的酶的底物的蛋白的位置和性质。另外,该方法在有序展示小的肽的方面的应用,可以进一步定位所述修饰位点。
蛋白展示技术可以用固定在任何合适的固体支持物上的一系列核酸(包括RNA,但优选DNA)进行。典型的固体支持物可以由诸如玻璃(例如,玻璃板)、硅或硅玻璃(例如小嵌片)、或金(例如,金板)的材料制成。用于将核酸连接在上述固体表面的特定部位上的方法,例如,光能无机营养方法在本领域中是众所周知的,并可将其用于制备本发明使用的固体支持物(如DNA嵌片)。用于这一目的的典型方法包括,但不限于Schena等,科学270:467-470(1995);Kozal等,自然医学2:753-759(1996);Cheng等,核酸研究24:380-385(1996);Lipshutz等,生物技术19:442-447(1995);Pease等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5022-5026(1994);Fodor等,自然364:555-556(1993);Pirrung等,美国专利US5,143,845;和Fodor等,WO92/10092。

Claims (43)

1.一种用于筛选需要的蛋白的方法,包括以下步骤:
a)提供一群候选RNA分子,每一个分子包括可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3′末端可操作地连接一个肽受体;
b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和
c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体,从而筛选所需要的蛋白。
2.一种用于筛选编码一种需要的蛋白的DNA分子的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一群候选RNA分子,每一个分子包括可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3′末端可操作地连接一个肽受体;
b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;
c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体;和
d)由所述融合体的RNA部分制备一种编码所需要的蛋白的DNA分子。
3.一种用于筛选相对参考蛋白而言具有改变了的功能的蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
a)由一群DNA模板产生一群候选RNA分子,所述候选DNA模板各有一个不同于所述参考蛋白编码序列的候选蛋白编码序列,所述RNA分子各自包括可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3′末端可操作地连接一个肽受体;
b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和
c)筛选具有改变了的功能的RNA-蛋白融合体,从而筛选具有改变了的功能的蛋白。
4.一种用于筛选编码一种相对参考蛋白而言具有改变了的功能的蛋白的DNA分子的方法,该方法包括以下步骤:
a)由一群候选DNA模板生产一群候选RNA分子,所述候选DNA模板各自具有不同于所述参考蛋白编码序列的候选蛋白编码序列,所述RNA分子各自包括可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且各自在其3′末端可操作地连接一个肽受体;
b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群RNA-蛋白融合体;
c)筛选具有改变了的功能的RNA-蛋白融合体;和
d)由所述融合体的RNA部分制备一种编码具有改变了的功能的蛋白的DNA分子。
5.一种用于筛选需要的RNA的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一群候选RNA分子,其中的每一个RNA分子包括可操作地连接于所述候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且在所述每一个候选蛋白编码序列的3′末端可操作地连接一个肽受体;
b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;和
c)筛选所需要的RNA-蛋白融合体,从而筛选所需要的RNA。
6.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述肽受体是嘌呤霉素。
7.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述每一个候选RNA分子还包括一个间歇序列或还包括一个共价连接于该RNA分子3′末端的DNA或DNA类似物序列。
8.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述候选RNA分子群至少包括1013个不同的RNA分子。
9.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述体外翻译反应是在由真核细胞或其部分制备的裂解物中进行的。
10.如权利要求9中的方法,其中,所述体外翻译反应是在网织红细胞裂解物中进行的。
11.如权利要求9中的方法,其中,所述体外翻译反应是在小麦胚裂解物中进行的。
12.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述体外翻译反应是在由细菌细胞或其部分制备的裂解物中进行的。
13.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述筛选步骤包括将所述需要的蛋白结合到一种固定的结合配偶体上。
14.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述筛选步骤包括测定所述所需蛋白的功能活性。
15.如权利要求2或4的方法,其中,所述DNA分子是扩增的。
16.如权利要求1、3或5的方法,其中,所述方法还包括重复步骤(a)-(c)。
17.如权利要求2或4的方法,其中,所述方法还包括由所述DNA分子转录RNA分子,并重复步骤(a)-(d)。
18.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述RNA通过一个酰胺键共价连接于所述RNA-蛋白融合体中的蛋白上。
19.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述RNA共价连接于所述RNA-蛋白融合体中的蛋白上,所述共价键能够抗核糖体的裂解。
20.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,在体外翻译步骤之后,在有50-100mM Mg2+的条件下进行培养。
21.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,所述RNA-蛋白融合体还包括一个靠近所述肽受体的核酸或核酸类似物序列,它能提高其柔性。
22.一种通过权利要求1-5中任一项的方法筛选的RNA-蛋白融合体,其中RNA-蛋白融合体中的蛋白部分通过肽受体共价连接于RNA-蛋白融合体中的RNA部分上,并且所述蛋白部分是由RNA-蛋白融合体中的RNA部分编码的。
23.一种分子,包括通过酰胺键共价连接于蛋白上的核糖核酸,其中酰胺键位于所述蛋白和可操作地连接于该核糖核酸的肽受体之间。
24.如权利要求23分子,其中,所述蛋白是由所述核糖核酸编码的,并且所述肽受体可操作地连接于所述核糖核酸的3′末端。
25.如权利要求23分子,其中,所述核糖核酸是mRNA。
26.一种分子,包括通过肽受体共价连接于蛋白上的核糖核酸,所述蛋白完全是由所述核糖核酸编码的,其中所述肽受体连接于所述核糖核酸的3′末端。
27.如权利要求26分子,其中,所述核酸是mRNA。
28.一种分子,包括通过肽受体共价连接于蛋白上的核糖核酸,其中所述肽受体选自嘌呤霉素、与腺嘌呤连接的氨基酸和与腺嘌呤样化合物连接的氨基酸,所述共价键能抗核糖体的裂解。
29.如权利要求28分子,其中,所述核糖核酸是mRNA。
30.一种核糖核酸,包括可操作地连接于候选蛋白编码序列上的翻译起始序列和起始密码子,所述核糖核酸于所述候选蛋白编码序列3′末端共价连接于肽受体上。
31.一种筛选需要的蛋白或需要的RNA的方法,该方法包括以下步骤:
(a)提供一群候选RNA分子,其中的每一个RNA分子包括可操作地连接于一个候选蛋白编码序列上的一个翻译起始序列和一个起始密码子,而且各自通过所述候选蛋白编码序列的3′末端可操作地连接于一个肽受体上;
(b)体外或原位翻译所述候选蛋白编码序列,以产生一群候选RNA-蛋白融合体;
(c)让所述RNA-蛋白融合体群体与一种对所述RNA-蛋白融合体的RNA部分或蛋白部分专一的结合配偶体接触,接触条件为基本上能将所述结合配偶体-RNA-蛋白融合体复合体与所述群体的未结合的成员分离;
(d)从所述复合体上释放出结合的RNA-蛋白融合体;和
(e)让来自步骤(d)的RNA-蛋白融合体群体与一种对所需要的RNA-蛋白融合体的蛋白部分具有专一性的结合配偶体接触,接触条件为基本上能将所述结合配偶体-RNA-蛋白融合体的复合体与所述群体的未结合的成员分离,从而筛选需要的蛋白和需要的RNA。
32.如权利要求31的方法,其中,所述方法还包括重复步骤(a)-(e)。
33.如权利要求31的方法,其中,所述肽受体是嘌呤霉素。
34.如权利要求31的方法,其中,所述每一个候选RNA分子还包括一个间歇序列或还包括一个共价连接于所述RNA分子的3′末端的DNA或DNA类似物序列。
35.如权利要求31的方法,其中,所述候选RNA分子群体至少包括1013种不同的RNA分子。
36.如权利要求31的方法,其中,所述体外翻译反应是在由真核细胞或其部分制备的裂解物中进行的。
37.如权利要求36的方法,其中,所述体外翻译反应是在网织红细胞裂解物或小麦胚裂解物中进行的。
38.如权利要求31的方法,其中,所述体外翻译反应是在由原核细胞或其部分制备的提取物中进行的。
39.如权利要求31的方法,其中,将所述结合配偶体中的至少一个固定在固体支持物上。
40.如权利要求31的方法,其中,在体外翻译步骤之后,在有50-100mMMg2+的条件下进行培养。
41.如权利要求31的方法,其中,所述RNA-蛋白融合体还包括一个靠近所述肽受体的核酸或核酸类似物序列,它能提高其柔性。
42.一种小嵌片,包括一系列固定化的单链核酸,所述核酸能与RNA-蛋白融合体杂交,其中RNA-蛋白融合体中的蛋白部分通过肽受体共价连接于RNA部分上,并且所述蛋白部分是由所述RNA部分编码的。
43.如权利要求42的小嵌片,其中,所述蛋白是由所述RNA编码的。
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