CN1245215C - 重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂 - Google Patents

重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组高效复合干扰素(Recombinant SuperCompound Interferon，rSIFN-co)作为乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂的应用。

Description

重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂
本发明涉及重组高效复合干扰素(Recombinant Super Compound Interferon，rSIFN-co)，的应用。
重组高效复合干扰素是将几种天然人α-干扰素亚型中最常见的保守性氨基酸结构用遗传工程的方法以建构而成的一种全新干扰素分子，美国专利4695623、4897471中对此种干扰素已经有所描述，已证明rSIFN-co具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤及天然杀伤细胞活性，美国专利5372808公开了用重组高效复合干扰素治疗疾病的方法，中国专利97193506公开了应用重组高效复合干扰素再次治疗丙型肝炎的方法，中国专利98114663公开了重组高效复合干扰素的制备方法和治疗乙型肝炎和丙型肝炎的用途。美国食品与药品管理局(FDA)已于1997年底批准了美国Amgen公司用大肠杆菌生产的rSIFN-co用于临床丙肝病人的治疗。
对于乙型肝炎病人的诊断，当检测出表面抗原(HBsAg)阳性和e抗原(HBeAg)阳性者即可判定为乙型肝炎患者，目前临床上采用各种类型的α-干扰素对慢性乙型肝炎患者进行治疗，其作用机理是：干扰素与细胞表面的特殊膜受体结合而发挥其抗DNA和RNA的作用。包括对某些酶的诱导作用阻止受病毒感染细胞中病毒的复制。
但用干扰素治疗乙型肝炎的疗效始终未被证实。
本发明惊奇的发现，重组高效复合干扰素对于乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原具有有效的抑制作用，从而证明重组高效复合干扰素可以通过抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原达到治疗乙型肝炎的目的。
本发明的目的是提供用于治疗乙型肝炎的重组高效复合干扰素药物，通过服用这种药物抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原，使之降低到正常水平，达到治疗目的。
本发明是通过以下方式实现的：
本发明首先通过基因重组技术制备出具有如图一序列的重组高效重组高效复合干扰素，本发明的重组技术利用大肠杆菌优先表达密码子，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行了重新设计，然后人工合成其rSIFN-co全长的cDNA基因。
本发明采用重组DNA技术将上述rSIFN-co全长cDNA序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，然后利用L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制激活载体中的强PBAD启动子介导下游的rSIFN-co基因高效表达。这一阿拉伯糖诱导/活化表达调控系统比通常遗传工程生产中所采用的温控、pH调控、IPTG诱导等系统有明显的优点：(1)通常采用的几种调控系统都是以“去阻遏”的形式解除对功能启动子的抑制作用，从而启动子可介导下游基因的表达。改变温度、pH值本身以及加入IPTG诱导物等都对启动子无直接激活作用。在我们采用的系统中，阿拉伯糖与阻遏蛋白(AraC)结合后，不仅解除了对PBAD启动子的抑制作用，同时“阿拉伯糖-AraC复合物”又可直接激活PBAD启动子介导下游基因的表达。所以阿拉伯糖诱导/活化调控系统是一种比其它几种系统更有效的大肠杆菌高效表达系统；(2)PBAD启动子活化的程度与加入的L-阿拉伯糖剂量成线性关系。这样可以直接通过改变阿拉伯糖浓度而调节外源基因产物的表达量。这一特性对改变包涵体的形成等非常有意义。加入阿拉伯糖比改变温度/pH等更容易直接控制外源基因产物在大肠杆菌中的表达；(3)L-阿拉伯糖来源丰富，价廉、无毒性，这克服其它诱导物如IPTG在这方面的缺点。
本发明用阿拉伯糖诱导/活化系统建立了高效、稳定的rSIFN-co表达大肠杆菌工程菌株，通过对该菌株在适宜的条件下的培养发酵获得了大量高纯度的rSIFN-co蛋白以用于本发明的研究和临床治疗。
本发明的应用方法是通过患者服用重组高效复合干扰素达到治疗目的，患者服用的重组高效复合干扰素可以制成各种剂型如：片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂，可皮下或静脉注射给药，药物组合物中的载体可使用任何一种适宜的药物可接受的载体，这些载体可以是糖类、纤维素制品、粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、配合剂和其他佐剂。
图一：为rSIFN-co的DNA编码序列以及推断的氨基酸序列
本发明通过以下实验验证了重组高效复合干扰素对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制作用，实验方法如下：
溶剂及配制方法：受试药物配制时向每支原料瓶内加入1ml生理盐水，溶解后，再根据所设不同剂量组浓度差异用MEM培养液调配。现用现配。
保存条件：4℃冰箱保存。
对照药品：先灵公司生产的IFN-α2b干扰能为冻干制剂，每支3×106U实验时用培养液配成3×106IU/ml溶液。2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的
2.2.15细胞系：美国Mount Sinai医学中心构建，我室引进后自行传代培养。
试剂
Eagles MEM干粉，美国Gibco公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；G-418(Geneticin)，MEM配制，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；Lipofectin，美国Gibco公司产品。
实验用品及仪器
培养瓶，丹麦Tunclon TM；培养板96孔板、24孔，美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；
细胞培养液及试剂配制
MEM培养液100ml：含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G418380μg/ml，卡那毒素50U/ml。
试验方法
2.2.15细胞培养
在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满。
药物对细胞毒性试验
实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度给药组。细胞消化，配制成每毫升10万个细胞，接种培养板，96孔板每孔200μl，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。高效重组高效复合干扰素用培养液配制成1.8×107IU/ml溶液，2倍稀释加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
TC 50 = Anti log ( B + 50 - B A - B × C ) .
A＝log＞50％药物浓度B＝log＜50％药物浓度C＝log稀释倍数
对HBeAg、HBsAg抑制试验
试验设HBeAg、HBsAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度给药组。每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下3倍稀释试验药液，5个稀释度分别为4.5×106IU/ml、1.5×106IU/ml、0.5×106IU/ml、0.17×106IU/ml、和0.056×106，每浓度1孔，37℃5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。试验重复三批，分别测定HBsAg和HBeAg。HBsAg和HBeAg测定采用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。
药物效果计算：计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P/N值如抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。
Figure C0110436700091
②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50)：
IC 50 = Anti log ( B + 50 - B A - B × C )
A＝log＞50％药物浓度  B＝log＜50％药物浓度  C＝log稀释倍数
③辉特福重组高效复合干扰素在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)，按其对细胞毒性指标细胞病变(SI)计算。
Figure C0110436700093
④以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm的差别。
对2.2.15细胞DNA抑制实验
2.2.15细胞上清中HBV-DNA提取：每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml接种于培养板，接种后24小时加入干扰素，每4天换原浓度药液培养，加药后培养8天，收取上清液，加入聚乙二醇沉淀，离心去上清，加入酵母t-RNA，加蛋白酶K裂解细胞，等体积苯酚：氯仿：异戊醇抽提2次，高速10,00g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作为样品。
斑点杂浆：←点样：取20ul(DNA含量25μg)，加变性液，变性，并用中和液将其中和，并以20×SSC缓冲液对倍稀释各点至1∶128倍稀释于硝酸纤维素膜上，膜置室温凉干后放置到80℃烤箱中干烤，以固定DNA↑预杂交：将硝酸纤维素膜装于塑料袋中加预杂交液6ml，置水浴中预杂交2小时。→杂交：加入5×107cpmα-32P-dCTP标记的变性HBV-DNA探针，于42℃水浴中杂交14-18小时。↓洗膜：以0.1×SSC/0.1％SDS分别在室温和65℃洗膜。放射自显影：吸干膜上流动水分，夹片、爆光。以常规方法冲洗X光片，扫描仪扫描光片，用gel-pro软件测定密度，计算抑制率及IC50。
2.2.15细胞培养液中
Figure C0110436700101
Southern blot：2215细胞内HBV——DNA提取：2215细胞加药后培养8天，吸除培养液收取细胞，加入细胞裂解液，裂解细胞，等体积苯酚：氯仿：异戊醇抽提2次，高速10,000g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE缓冲液中，加入6×DNA样品缓冲液，将样品加于1.5％琼脂糖胶上电泳，IV/cm，恒压，14-18小时。→变性、杂交：将胶分别浸于HCl、变性液、中和液中。↓转膜：按程序将DNA转至Hybond-N膜上。同斑点杂交一同进行烤膜、杂交、爆光。扫描仪扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC50。
统计与分析方法：
各组计量资料结果用算术平均数(7)±标准差(S)表示。根据中国《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的有关新药药效学研究中统计处理的指导原则，计数资料用Fisher精确检验，计量资料选择Student t检验进行各组均数差异显著性。
本发明通过几批实验的结果(表一、表二)证明，重组高效复合干扰素具有明显的抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原活性，而对照组干扰能组不具有上述活性。有限的临床病例也证实了慢性活动性乙型肝炎患者，通过服用重组高效复合干扰素使乙型肝炎表面抗原和e抗原阳性降低或恢复到正常水平。
本发明应用的重组高效复合干扰素制剂可通过如下实施例制备：
实施例一：冻干注射剂的制备
a.重组高效复合干扰素                      300万IU；
b.枸橼酸                                  0.2毫克；
c.磷酸氢二钠                              2.5毫克；
d.氯化钠                                  4.0毫克；
e.右旋糖酐                                20毫克；
f.聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯              0.1毫升；
g.注射用水                                适量加至1.0毫升。
制备工艺：
按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，除菌过滤用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于8±2℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于西林瓶中，单剂量装每瓶1.1ml。分装后放置到冻干机中冷冻干燥。
实施例二：水溶液注射剂的制备
a.重组高效复合干扰素                     300万IU；
b.枸橼酸                                 0.2毫克；
c.磷酸氢二钠                             2.5毫克；
d.氯化钠                                 4.0毫克；
e.右旋糖酐                               20毫克；
f.聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯             0.1毫升；
g.注射用水                               适量加至1.0毫升。
制备工艺：
按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，除菌过滤用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于8±2℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中。分装于西林瓶中，单剂量装每瓶1.1ml。分装后成品置2-10℃下暗处保存。
表一：测定rSIFN-con对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的实验结果：
第一批实验
  e抗原   细胞对照        16010   空白                0   稀释倍数          3   IC50          602.74446016
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   9026   8976   10476   0.436227   0.43935   0.345659   0.407079   0.945909   0.592921   0.614693546
  300   9616   12082   10098   0.3993754   0.245347   0.369269   0.337997   0.5388299   1.254924   0.300392321
  100   9822   16002   12800   0.386508   0.0005   0.2005   0.195836   0.200833   2.059088   0.08867188
  33.33333   15770   19306   16824   0.014991   0   0   0.004997   0.0049969   3.054091   0.001633453
  11.11111   19172   22270   18934   0   0   0   0   0   4.054091   0
  表面抗原   细胞对照        11714   空白                0   稀释倍数          3   IC50          641.7736749
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   7706   7240   7114   0.342155   0.381936   0.392693   0.372261   0.922258   0.627739   0.595006426
  300   8856   7778   9476   0.2439816   0.336008   0.191053   0.257014   0.5499972   1.370724   0.286349225
  100   10818   10720   10330   0.07649   0.084856   0.118149   0.093165   0.292983   2.27756   0.113977019
  33.33333   10744   11114   10570   0.082807   0.051221   0.097661   0.07723   0.1998179   3.20033   0.058767408
  11.11111   10672   9352   10810   0.088953   0.201639   0.077173   0.122588   0.122588   4.077742   0.02918541
第二批实验
  e抗原   细胞对照      16962   空白                 0   稀释倍数         3   IC50        365.9357846
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   7818   8516   9350   0.554378   0.514592   0.467054   0.512008   1.371181   0.487992   0.737521972
  300   10344   10628   9160   0.4103967   0.394209   0.477884   0.427497   0.8591731   1.060496   0.447563245
  100   12296   14228   13262   0.299134   0.18901   0.244072   0.244072   0.4316577   1.816423   0.19201839
  33.33333   15364   17414   16188   0.124259   0.00741   0.77291   0.069653   0.1876045   2.74677   0.063933386
  11.11111   17386   13632   15406   0.009006   0.222982   0.121865   0.117951   0.117951   3.628819   0.03148073
  表面抗原   细胞对照   空白                 0   稀释倍数         3   IC50        611.0919568
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   5784   6198   5792   0.498265   0.462353   0.497571   0.486063   0.893477   0.513937   0.634835847
  300   7150   8534   8318   0.379771   0.259715   0.278452   0.30598   0.4074138   1.207957   0.252210647
  100   9830   11212   10210   0.147294   0.027412   0.11433   0.096345   0.101434   2.111612   0.04583464
  33.33333   13942   12368   13478   0   0   0   0   0.0050891   3.111612   0.001632835
  11.11111   12418   11634   11352   0   0   0.015267   0.005089   0.005089   4.106523   0.001237728
第三批实验
  e抗原   细胞对照       17544   空白                   0   稀释倍数        3   IC50        382.0496935
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   9702   9614   8110   0.428016   0.433204   0.521872   0.461031   1.316983   0.538969   0.709599543
  300   8914   10032   8870   0.4744723   0.40856   0.477066   0.453366   0.8559525   1.085603   0.440859127
  100   16312   12688   13934   0.038321   0.251975   0.178517   0.156271   0.402586   1.929332   0.172641621
  33.33333   15080   12814   13288   0.110954   0.244547   0.216602   0.190701   0.2463153   2.738631   0.082519158
  11.11111   21928   15366   15728   0   0.094093   0.072751   0.0055615   0.055615   3.683017   0.014875633
  表面抗原   细胞对照       11528   空白                   0   稀释倍数        3   IC50        694.7027149
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   5616   6228   5346   0.496864   0.442035   0.521054   0.486651   0.763125   0.513349   0.597838293
  300   8542   8590   7096   0.234725   0.230425   0.364272   0.276474   0.2764738   1.236875   0.182690031
  100   11420   11360   11394   0   0   0   0   0   2.236875   0
  33.33333   12656   11582   13110   0   0   0   0   0   3.236872   0
  11.11111   13142   12336   13342   0   0   0   0   0   4.236875   0
E抗原：   IC50均值 450.2434    标准差 132.315179
表面抗原：IC50均值 649.1894    标准差 42.29580
表二：干扰能(IFN-α2b)第一批实验
  e抗原   细胞对照       17544   空白                  0   稀释倍数       3   IC50         FALSE
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  300   14918   11724   9950   0   0.029711   0.176529   0.068747   0.068747   0.931253   0.068746724
  100   14868   16890   15182   0   0   0   0   0   1.931253   0
  33.33333   16760   21716   16400   0   0   0   0   0   2.931253   0
  11.11111   20854   15042   16168   0   0   0   0   0   3.931253   0
  3.703704   12083   12083   12083   0   0   0   0   0   4.931253   0
  表面抗原   细胞对照       10886   空白                  0   稀释倍数       3   IC50         FALSE
  浓度   第一孔   第二孔   第三孔   第一抑制率   第二抑制率   第三抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  300   9226   8196   9658   0.152489   0.247106   0.521054   0.1708   0.189295   0.8292   0.185857736
  100   10946   10340   10828   0   0.050156   0.364272   0.018495   0.0184947   1.810705   0.010110817
  33.33333   12250   12980   13934   0   0   0   0   0   2.810705   0
  11.11111   12634   12342   12000   0   0   0   0   0   3.810705   0
  3.703704   10886   10886   10886   0   0   0   0   0   4.810705   0

Claims (6)

1.重组高效复合干扰素在制备对乙型肝炎病毒DNA、HBsAg、HBeAg均有抑制作用的药物中的应用，所述重组高效复合干扰素是由如下的cDNA序列编码：
 5′           11         21         31         41         51
 +1  N  C  D   L  P  Q  T   H  S  L   G  N  R   R  A  L  I   L  L  A
  1 ATGTGTGATT TACCTCAAAC TCATTCTCTT GGTAACCGTC GCGCTCTGAT TCTGCTGGCA
    TACACACTAA ATGGAGTTTG AGTAAGAGAA CCATTGGCAG CGCGAGACTA AGACGACCGT
 5′           71         81         91         1          11
 +1  Q  M  R   R  I  S  P   F  S  C   L  K  D   R  H  D  F   G  F  P
 61 CAGATGCGTC GTATTTCCCC GTTTAGCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGCTTTCCG
    GTCTACGCAG CATAAAGGGG CAAATCGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCGAAAGGC
 5′           31         41         51         61         71
+1   Q  E  E   F  D  G  N   Q  F  Q   K  A  Q   A  I  S  V   L  H  E
121 CAAGAAGAGT TCGATGGCAA CCAATTCCAG AAAGCTCAGG CAATCTCTGT ACTGCACGAA
    GTTCTTCTCA AGCTACCGTT GGTTAAGGTC TTTCGAGTCC GTTAGAGACA TGACGTGCTT
 5′           91         1          11         21         31
 +1  M  I  Q   Q  T  F  N   L  F  S   T  K  D   S  S  A  A   W  D  E
181 ATGATCCAAC AGACCTTCAA CCTGTTTTCC ACTAAAGACA GCTCTGCTGC TTGGGACGAA
    TACTAGGTTG TCTGGAAGTT GGACAAAAGG TGATTTCTGT CGAGACGACG AACCCTGCTT
 5′           51         61         71         81         91
 +1  S  L  L   E  K  F  Y   T  E  L   Y  Q  Q   L  N  D  L   E  A  C
241 AGCTTGCTGG AGAAGTTCTA CACTGAACTG TATCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCATGC
    TCGAACGACC TCTTCAAGAT GTGACTTGAC ATAGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGTACG
 5′           11         21         31         41         51
 +1  V  I  Q   E  V  G  V   E  E  T   P  L  M   N  V  D  S   I  L  A
301 GTAATCCAGG AAGTTGGTGT AGAAGAGACT CCGCTGATGA ACGTCGACTG TATTCTGGCA
    CATTAGGTCC TTCAACCACA TCTTCTCTGA GGCGACTACT TGCAGCTGAG ATAAGACCGT
并且所述cDNA序列的表达是通过利用L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制，激活载体中的强PBAD启动子而实现的。
2、权利要求1的应用，其特征在于，所述复合干扰素可制成任何适合服用的剂型。
3、权利要求1的应用，其特征在于，所述复合干扰素可制成片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂。
4、权利要求1的应用，其特征在于，所述复合干扰素在制成药物制剂时可使用任何适宜的药物可接受的载体。
5、权利要求1的应用，其特征在于，所述复合干扰素通过口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻内、粘膜给药。
6、一种cDNA序列，其特征在于，可以编码权利要求1中的对乙型肝炎病毒DNA、HBsAg、HBeAg均有抑制作用的重组高效复合干扰素。
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