CN1254547C

CN1254547C - 具有酶活性的dna分子

Info

Publication number: CN1254547C
Application number: CNB951974408A
Authority: CN
Inventors: G·F·乔伊斯; R·R·布列克
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 2006-05-03
Anticipated expiration: 2015-12-01
Also published as: EP1700915A3; NO972483L; AU4595096A; DE69534855D1; JP2006136333A; EP0792375A4; FI972333A; EP0792375B9; ES2260766T3; RU2220204C2; DE69534855T2; US6326174B1; JPH10510165A; CN1173207A; RO120410B1; EP0792375B1; JP4001624B2; BR9510003A; BR9510003B1; HUT77576A

Abstract

本发明公开了能以位点特异性方式裂解核酸序列或分子，尤其是RNA的脱氧核糖核酸酶(催化性或具有酶活性的DNA分子)以及包括它的组合物。还公开了制备和使用所公开的酶和组合物的方法。

Description

具有酶活性的DNA分子

技术领域

本发明涉及能裂解其它核酸分子，特别是RNA的核酸酶或催化性(具有酶活性的)DNA分子。本发明还涉及含有所公开的具有酶活性的DNA分子的组合物以及制备和使用该酶和组合物的方法。

背景

对在其天然环境外部发挥作用或催化不代表天然条件的反应的催化剂的需要导致了“酶工程”技术的形成。在酶工程中采用的常规途径是“理性设计”研究，依靠对天然酶的了解来帮助构建新的酶。不幸的是，在蛋白质结构和化学领域的熟练状态不足以产生新的生物催化剂途径。

最近，对形成新催化剂进行了不同的探讨。该方法涉及构建大分子的异源库并应用体外选择程序从库中分离催化所需反应的分子。从大分子库中选择催化剂不依赖于对其结构和化学特性的深入了解。因此，该方法称为“非理性设计”(Brenner和Lerner，美国国家科学院院报89：5381-5383(1992))。

到目前为止涉及具有酶活性的DNA分子或核酶的理性设计的大多数努力未产生具有基本上新的或改进的催化功能的分子。然而，经过模仿自然界生物的达尔文进化的，我们描述为“定向分子进化”或“体外进化”的过程应用非理性设计方法具有导致产生具有所需功能特征的DNA分子的潜力。

应用该技术对溶液中的RNA分子(例如，见Mills，等，美国国家科学院院报58：217(1967)；Green，等，自然347：406(1990)；Chowrira等，自然354：320(1991)；Joyce，基因82：83(1989)；Beaudry and Joyce，科学257：635-641(1992)；Robertson andJoyce，自然344：467(1990))以及对结合于附着在固相支持物上的配体上的RNA(Tuerk等，科学249：505(1990)；Ellington，等，自然346：818(1990))取得了不同程度的成功。它还应用于直接附着于固相支持物的肽(Lam，等，自然354：82(1991))和在病毒衣壳蛋白内表达的肽抗原决定簇(Scott等，科学249：386(1990)；Devlin，等，科学249：249(1990)；Cwirla等，美国国家科学院院报87：6378(1990))。

催化性RNA的发现已超过十年(Kruger，等，细胞31：147-157(1982)；Guerrier-Takada等，细胞35：849-857(1983))。已知的天然存在的核酶数目不断增长(见Cech， RNA世界，Gesteland和Atkins(编辑)，pp 239-269，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约(1993)；Pyle，科学261：709-716(1993)；Symons，当今结构生物学评论4：322-330(1994))且最近几年经过体外进化获得的合成核酶得到扩大。(例如，见Joyce，当今结构生物学评论4：331-336(1994)；Breaker和Joyce，生物工程动向12：268-275(1994)；Chapman和Szostak，当今结构生物学评论4：618-622(1994))。

考虑到DNA含有大多数与RNA相同的官能基，似乎有理由假定DNA也具有催化活性。然而，除了某些病毒基因组和复制中间体外，在生物体中几乎所有的DNA均以完整的双螺旋存在，这妨碍了它形成复杂的二级和三级结构。因此不奇怪在自然界中未发现DNA酶。

在本发明出现前，具有核苷酸裂解能力的催化性DNA分子的设计，合成和应用尚未公开或证实。因此，本文公开的发现和发明特别有意义的是它们突出了体外进化作为设计越来越多的有效催化性分子，包括裂解其它核酸，特别是RNA的具有酶活性的DNA分子的方法的潜力。

发明概述

本发明因而包含能在限定的裂解位点裂解底物核酸(NA)序列的合成的或工程化的(即，非天然存在的)催化性DNA分子。本发明还包含具有核酸内切酶活性的具有酶活性的DNA分子。

在一个优选的变化中，核酸内切酶活性对底物核酸序列中包含单链核酸的限定的裂解位点的核酸序列具有特异性。在另一个优选的变化中，裂解位点是双链核酸。同样地，底物核酸序列可以是单链的，双链的，部分单链或双链的，环状的或其任意组合。

在另一个包含的实施方案中，底物核酸序列包括一个或多个核酸类似物。在一个变化中，底物核酸序列是较大分子的一部分或附着于其上。

在各种实施方案中，较大的分子选自RNA，修饰的RNA，DNA，修饰的DNA，核苷酸类似物或其组合。在另一实施例中，较大分子包含核酸序列和非核酸序列的组合。

在另一实施方案中，本发明包含的底物核酸序列包括一个或多个核苷酸类似物。进一步的变化包含单链核酸包括RNA，DNA，修饰的RNA，修饰的DNA，一个或多个核酸类似物，或其任意组合。在公开的发明的一个实施方案中，核酸内切酶活性包括在裂解位点水解磷酯键。

在各种优选的实施方案中，本发明的催化性DNA分子全部或部分是单链。这些催化性DNA分子可优选采取与其催化活性一致的各种形状。因此，在一个变化中，本发明的催化性DNA分子包括一个或多个发夹环结构。在另一个变化中，催化性DNA分子可呈与“锤头”核酶相似的形状。在其它实施方案中，催化性DNA分子可以呈与嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)核酶，例如来自I组内含子的核酶相似的构象。

同样地，本发明优选的催化性DNA分子能不管底物分子的原始取向而表现出位点特异性核酸内切酶活性。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子能裂解与具有酶活性的DNA分子分离的，即不联接到DNA酶(DNAzyme)上的底物核酸序列。在另一优选的实施方案中，具有酶活性的DNA分子能裂解附着的底物核酸序列，即，它能进行与自我裂解相似的反应。

本发明还包含具有核酸内切酶活性的具有酶活性的DNA分子(催化性DNA分子，脱氧核酸或DNAzymes)，其中核酸内切酶活性需要存在二价阳离子。在各种优选的，任选的实施方案中，二价阳离子选自Pb²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，和Ca²⁺。另一变化中包含的核酸内切酶活性需要存在单价阳离子。在这类任选的实施方案中，单价阳离子优选选自Na⁺和K⁺。

在本发明的各种优选的实施方案中，具有酶活性的DNA分子包含选自SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 14；SEQ ID NO 16；SEQ IDNO 17，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20；SEQ ID NO 21；和SEQ ID NO 22的核苷酸序列。在其它优选的实施方案中，本发明的催化性DNA分子包含选自SEQ ID NO 23；SEQ ID NO 24；SEQ ID NO 25；SEQ ID NO 26；SEQ IDNO 27；SEQ ID NO 28；SEQ ID NO 29；SEQ ID NO 30；SEQ ID NO 31；SEQ ID NO 32；SEQ ID NO 33；SEQ IDNO 34；SEQ ID NO 35；SEQ ID NO 36；SEQ ID NO 37；SEQ ID NO 38；和SEQ ID NO 39的核酸序列。

另一优选的实施方案涉及本发明的催化性DNA分子包括选自SEQID NO 50和SEQ ID NO 51的核酸序列。在另一优选的实施方案中，本发明的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NOS 52至101的核苷酸序列。正如本文所公开的，还包含具有基本上与本文公开的序列相似的序列的催化性DNA分子。因此可对本文描述的分子进行各种取代，缺失，插入，重复和其它突变以产生各种其它有用的具有酶活性的DNA分子，以及所说的分子表现出本文所公开的位点特异性裂解活性，它们在本说明书的范围内。

在本发明的另一变化中，本发明的具有酶活性的DNA分子优选具有大约1μM或更少的底物结合亲和力。在另一实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子结合具有K_D小于大约0.1μM的底物。

本发明还公开了具有有用的转换率的具有酶活性的DNA分子。在一个实施方案中，转换率小于5hr^-1；在一个优选的实施方案中，转换率小于大约2hr^-1；在一个更优选的实施方案中，转换率小于1hr^-1；在甚至更优选的实施方案中，转换率是大约0.6hr^-1或更少。

在另一实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子表现出有用的转换率，其中k_obs少于1min^-1，优选少于0.1min^-1，更优选少于0.01min^-1，甚至更优选少于0.005min^-1。在一个变化中，k_obs的值是大约0.002min^-1或更少。

本发明还包含所公开的DNA酶的催化率完全合适的实施方案。因此，在各种优选的实施方案中，由于存在Mg²⁺而提高的反应K_m大约是0.5-20mM，优选大约1-10mM，更优选大约2-5mM。

本发明还包含其中核苷酸序列限定的裂解位点包含至少一个核苷酸的实施方案。在各种其它优选的实施方案中，本发明的催化DNA分子能识别和裂解2个或更多个核苷酸的核苷酸序列限定的裂解位点。

在各种优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子包含两侧有一个或多个底物结合区的保守核心。在一个实施方案中，具有酶活性的DNA分子包括第一和第二底物结合区。在另一实施方案中，具有酶活性的DNA分子包括2个或多个底物结合区。

正如前面所提到的，本发明优选的催化性DNA分子也可包括一个保守核心。在一个优选的实施方案中，保守的核心包括一个或多个保守的区域。在其它优选的变化中，一个或更多个保守的区域包括选自CG；CGA；AGCG、AGCCG；CAGCGAT；CTTGTTT和CTTATTT的核苷酸序列(例如，见图3)。

在本发明的一个实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子进一步包括在保守核心中的保守区域间的一个或多个可变的或间隔子核苷酸。在另一实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子进一步包括在保守核心和底物结合区之间的一个或多个可变的或间隔子核苷酸。

在一个变化中，第一底物结合区优选包括选自CATCTCT；GCTCT；TTGCTTTTT；TGTCTTCTC；TTGCTGCT；GCCATGCTTT(SEQ ID NO 40)；CTCTATTTCT(SEQ ID NO41)；GTCGGCA；CATCTCTTC和ACTTCT的核苷酸序列。在另一优选的变化中，第二底物结合区包括选自TATGTGACGCTA(SEQ IDNO 42)；TATAGTCGTA(SEQ ID NO 43)；ATAGCGTATTA(SEQ ID NO 44)；ATAGTTACGTCAT(SEQ ID NO 45)；AATAGTGAAGTGTT(SEQ ID NO 46)；TATAGTGTA；ATAGCGGT；ATAGGCCCGGT(SEQ ID NO 47)；AATAGTGAGGCTTG(SEQ ID NO 48)和ATGNTG的核苷酸序列。

在本发明的各种实施方案中，底物结合区长度可改变。因此，例如底物结合区可包括单个核苷酸到几十个核苷酸。然而，据了解底物结合区大约3-25个核苷酸长，优选大约3-15个核苷酸长，更优选大约3-10个核苷酸长。在各种实施方案中，底物结合区中的单个核苷酸能与底物分子中的核苷酸形成互补碱基对；在其它实施方案中，形成非互补碱基对。还包含的互补及非互补碱基配对的混合物也在本发明公开的实施方案的范围内。

在另一优选的实施方案中，本发明的催化性DNA分子可进一步包括第三底物结合区域。在一些优选的实施方案中，第三区域包括选自TGTT；TGTTA和TGTTAG的核苷酸序列。本发明的另一优选的实施方案公开的具有酶活性的DNA分子进一步包含位于底物结合区之间的一个或多个可变的或“间隔子”区。

在另一公开的实施方案中，本发明包含从其它DNA分子和寡核苷酸中分离出的纯化的合成具有酶活性的DNA分子，该具有酶活性的DNA分子具有核酸内切酶活性，其中核酸内切酶活性对底物核酸序列中包含单链或双链核酸的核苷酸序列限定的裂解位点具有特异性。在一个变化中，公开了具有核酸内切酶活性的合成(或改造的)具有酶活性的DNA分子，其中，核酸内切酶活性对基本上由底物核酸序列的单链或双链区组成的核苷酸序列限定的裂解位点具有特异性。

在另一实施方案中，本发明包含的具有酶活性的DNA分子包含具有催化活性的脱氧核糖核苷酸多聚体以水解含核酸的底物以产生底物裂解产物。在一个变化中，水解以点特异性方式发生。如前面所述，多聚体可以是单链，双链或两者的某种组合。

本发明进一步涉及包含核酸序列的底物。在各种实施方案中，核酸序列底物包含RNA，修饰的RNA，DNA，修饰的DNA，一个或多个核苷酸类似物或前述的任意组合。一种实施方案涉及的底物包括单链片段；还有另一实施方案包含的底物是双链的。

本发明还涉及包含具有催化活性的脱氧核糖核苷酸多聚体的具有酶活性的DNA分子，它水解含核酸的底物以产生裂解产物。在一个变化中，具有酶活性的DNA分子具有对底物的有效结合亲和力并缺乏对裂解产物的有效结合亲和力。

在一个优选的实施方案中，本发明公开了一种非天然存在的具有酶活性的DNA分子，包含限定了保守核心的核苷酸序列及两侧的识别区，可变区和间隔区。因此，在一个优选的实施方案中，核苷酸序列限定了一个与分子5′端连续或相邻的第一可变区，位于第一可变区3′端的第一识别区，位于第一识别区3′端的第一间隔区，位于第一间隔区3′端的第一保守区，位于第一保守区3′端的第二间隔区；位于第二间隔区3′端的第二保守区，位于第二保守区3′端的第二识别区，位于第二识别区3′端的第二可变区。

在另一实施方案中，核苷酸序列优选限定与分子5′端连续或相邻的第一可变区，位于第一可变区3′端的第一识别区，位于第一识别区3′端的第一间隔区，位于第一间隔区3′端的第一保守区，位于第一保守区3′端的第二间隔子区，位于第二间隔子区3′端的第二保守区，位于第二保守区3′端的第二识别区；位于第二识别区3′端的第二可变区；位于第二可变区3′端的第三识别区。

在上述的一个变化中，该分子包括一个保守的核心区及侧翼的2个底物结合区；在另一变化中，保守核心区包含一个或多个保守区。在另一优选的实施方案中，保守核心区进一步包含一个或多个可变的或间隔子核苷酸。在另一实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子进一步包含一个或多个间隔子区域。

本发明进一步包含许多种组合物。例如，公开了包括上文所述的具有酶活性的DNA分子的组合物并在本文中涉及。在一个任选的实施方案中，根据本发明的组合物包括如上面所述的具有酶活性的DNA分子的2种或多种群体，其中各群体中的具有酶活性的DNA分子能识别不同的底物。在各种实施方案中，还优选包括单价或多价阳离子的组合物。

本发明进一步包含产生，选择和分离本发明的具有酶活性的DNA分子的方法。在一个变化中，选择在特异性位点裂解核酸序列(例如RNA)的具有酶活性的DNA分子的方法包括下列步骤：(a)获得推定的具有酶活性的DNA分子的群体，不管该序列是天然存在的还是合成的，且优选的是，它们是单链DNA分子；(b)将含核苷酸的底物序列与上述DNA分子的群体混合以形成混合物；(c)在预定反应条件下维持混合物足够长的时间使群体中推定的具有酶活性的DNA分子引起底物序列的裂解，从而产生底物裂解产物；(d)从底物序列和底物裂解产物中分离DNA分子群体；(e)从群体中分离在特异性位点裂解底物核酸序列(例如RNA)的DNA分子。

在上述方法的进一步变化中，在特异性位点裂解底物核酸序列的DNA分子用固定化试剂标记。在一个实施例中，该试剂包含生物素。

在上述方法的另一变化中，经过使用为这一目的构建的具有酶活性的DNA分子选择希望裂解的序列(例如，预定的“靶”核苷酸序列)开始。因此，在一个实施方案中，预选(或预定)的“靶”序列经过将它附着或标记到含一个或多个任选序列或片段的脱氧核糖核酸序列上用于产生能在特异性位点裂解底物核酸序列的DNA分子的群体。在一个变化中，任选的序列大约40个核苷酸长；在另一个变化中，任选的序列大约50个核苷酸长。本发明还包含任选的序列长1-40，40-50和50-100个核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，用于产生具有酶活性的DNA分子的群体的核苷酸序列选自SEQ ID NO 4，23，50和51。在另一实施方案中，“靶”或“底物”核苷酸序列包含1或多个核苷酸的序列，例如，见SEQ ID NOS 4和23及SEQ ID NO 49的相关部分。本发明还包含的有用的“靶”或“底物”核苷酸序列还包括DNA，RNA或其组合物。

本发明还包含如上文所述的方法，其中分离步骤进一步包含将标记的DNA分子与具有抗生物素蛋白连接于其上的固相表面接触，从而标记的DNA分子附着到固相表面。如上所述，底物可以是RNA，DNA，两者的组合物或包括核苷酸序列的分子。

本发明还包含在特异性裂解位点专一性地裂解底物核酸序列的方法，包含的步骤是：(a)提供能在特异性裂解位点裂解底物核酸序列的具有酶活性的DNA分子；(b)将具有酶活性的DNA分子与底物核酸序列接触以引起在裂解位点特异性地裂解核酸序列。在一个变化中，具有酶活性的DNA分子是非天然存在的(或合成的)DNA分子。在另一变化中，具有酶活性的DNA分子是单链的。

在上述方法的另一变化中，底物包含核酸。在各种实施方案中，底物核酸包含RNA，修饰的RNA，DNA，修饰的DNA，一个或多个核苷酸类似物，或上述的任意组合物。在另一实施方案中，特异性裂解由具有酶活性的DNA分子的核酸内切酶活性引起。本文还包含反应条件的改变，如pH，温度，阳离子百分数，酶百分数，底物百分数和产物百分数的调整。

本发明还包含裂解磷酯键的方法，包括：(a)将能在限定的裂解位点裂解底物核酸序列的催化性DNA分子与含磷酯键的底物混合以形成反应混合物；(b)在预定反应条件下维持混合物以使具有酶活性的DNA分子裂解磷酯键，从而产生底物产物的群体。在一个实施方案中，具有酶活性的DNA分子能以位点特异性方式裂解磷酯键。在另一实施方案中，该方法进一步包括步骤(c)：从催化性DNA分子中分离出产物和(d)将另外的底物加入具有酶活性的DNA分子中以形成新反应混合物。

本发明还包含构建裂解磷酯键的具有酶活性的DNA分子的方法。一个举例性的方法包括下列步骤：(a)获得单链DNA分子的群体；(b)将遗传变化导入群体以产生变化的群体；(c)从变化的群体中选择符合预定选择标准的个体；(d)从变化群体的残留物中分离选择的个体及(e)扩增选择的个体。

附图简述

图1说明了用于分离裂解靶RNA磷酯的DNA的选择性扩增程序。如图所示，含一段50个随机核苷酸的双键DNA(上面以具有“N₅₀”的分子表示它)采用在3′端以腺嘌呤核糖核苷酸(rA)终止的5′生物素标记的DNA引物经PCR扩增。(生物素标记以带圈的字母“B”表示)。该引物经Taq聚合酶延伸以产生含单个包埋的核糖核苷酸的DNA产物。所得的双链DNA固定在链霉抗生物素蛋白基质上，经过用0.2N NaOH洗涤去掉未标记上生物素的DNA链。用缓冲液重新平衡柱后，用加有1mM PbOAc的相同溶液洗柱。进行Pb²⁺依赖性自我裂解的DNA从柱上释放出来，收集于洗脱液中并经PCR扩增。然后PCR产物用于开始下一轮的选择性扩增。

图2显示了在铅离子(Pb²⁺)存在的条件下，开始的DNA(GO)库和第一至第5轮选择(G1-G5)后获得的群体的自我裂解活性。标记Pre代表108个核苷酸前体DNA(SEQ ID NO 4)；Clv，28核苷酸5′裂解产物(SEQ ID NO 5)；M，引物3a(SEQ ID NO 6)相应于5′裂解产物的长度。

图3显示从五轮选择后的群体分离的单个变异体的序列对比。固定的底物区在顶部显示，带有用倒三角指定的靶核糖腺苷酸(adenylate)通常在推定的碱基配对相互作用中涉及的底物核苷酸用垂直棒表示。相应于50个最初任选的核苷酸的序列与底物区进行反向平行序列对比。所有的变异体以固定的序列5′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′(未显示；SEQ ID NO 1)作3′末端。推测与底物区形成碱基对的开始任选的区域内的核苷酸在图的右和左侧表示；具有酶活性的DNA分子推测的碱基对形成区分别位于各序列所示的盒中。保守区以两个大的，位于中央的盒表示。

图4A和4B显示随催化转换进行的分子间反应中RNA磷酯的DNA催化裂解。图4A是代表在19聚体底物(3′-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5′，SEQ ID NO 2)和38聚体DNA酶(5′-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA-3′，SEQ ID NO 3)之间形成的复合物的示意图。该底物含单个腺苷核糖核苷酸(“rA”，与箭头相邻)，侧翼为脱氧核苷酸。合成的DNA酶是图3所示的最频繁出现的变异体的38核苷酸部分。位于推测的催化区内的高度保守的核苷酸位于盒内。如图所示，一个保守的序列是“AGCG”，另一个是“CG”(按5′→3′方向阅读)。

图4B显示用于测定在与体外选择采用的相同的条件下DNA催化裂解[5′-³²P]标记的底物的K_m(负斜率)和V_max(y-截距)的Eadie-Hofstee标绘图。对于含有5nM DNA酶和0.125，0.5，1，2，或4μM底物的反应测定裂解的起始速率。

图5是显示聚丙烯酰胺凝胶的照片，显示了选择的催化性DNA 4个家族的特异性核酸内切酶活性。以平行的方式重复Pb²⁺依赖性分子家族的选择作为对照(第一组)。在第二组中，Zn²⁺用作阳离子；在第三组中，阳离子是Mn²⁺；在第四组中，阳离子是Mg²⁺。凝胶上的第5个位点仅由裂解产物组成，作为标记。

如上所述，在上述四组的每个内有3条泳道。在每组的3条泳道中，第一条泳道显示在缺乏金属阳离子的条件下选定的群体缺乏活性，第二条泳道显示在存在金属阳离子的条件下观察到的活性，第三条泳道显示起始库(GO)缺乏活性。

图6A和6B分别提供了“祖先”催化性DNA分子和本文公开的选择性扩增方法获得的一些催化性DNA分子之一的二维示意图。图6A显示了起始库的举例性分子，显示了由SEQ ID NO 23代表的分子的总的构象。如图所示，在随机(N₄₀)区的两侧是各种互补核苷酸。图6B代表一个经本文描述的方法产生的Mg²⁺依赖性催化性DNA分子(或“DNA酶”)的示意图。底物核酸中的核糖核苷酸位置在图6A和6B中以箭头表示。

图7显示了基本上按下文实施例5所述进行的10轮体外选择性扩增的一些结果。如图所示，出现的催化剂的两个位点和2个家族表现出最有效地裂解靶序列。裂解条件基本上如图7所示，即10mM Mg²⁺，pH7.5和37℃；反应进行2小时后得到的资料如图所示。裂解率(％)以对代数(0至10)的点表示。能在底物所示位点裂解靶序列的催化性DNA分子的数目/总数以垂直棒表示，在G↓UAACUAGAGAU位裂解以条纹棒表示，在GUAACUA↓GAGAU位裂解以空心棒(略带阴影)。

图8显示了本发明的2个催化性DNA分子，克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位点和转换率。反应条件如图所示，即，10mMMg²⁺，pH 7.5和37℃。以克隆8-17限定的DNA酶在左侧显示，RNA底物的裂解位点以箭头表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-与DNA酶分离(即，显示分子间裂解)-如此标记。同样，本文以10-23表示的DNA酶在右侧表示，RNA底物的裂解位点以箭头表示。还显示了底物序列。对于8-17酶，转换率大约为0.6hr^-1；对于10-23酶，转换率大约为1hr^-1。非互补性配对以实心环(·)表示，而互补性配对以垂直线(|)表示。

图9进一步显示了本发明的2个催化性DNA分子，克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位点和转换率。反应条件如图所示，即10mMMg²⁺，pH 7.5和37℃。与图8一样，鉴定为克隆8-17的DNA酶在左侧表示，RNA底物的裂解位点以箭头表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-与DNA酶分离(即，显示分子内裂解)-如此标记。同样，本文鉴定为10-23的DNA酶在右侧显示，RNA底物的裂解位点以箭头表示。还显示了底物序列。对于8-17酶，k_obs大约为0.002min^-1；对于10-23酶，k_obs值大约为0.01min^-1。非互补性配对用实心环(·)表示，而互补配对以垂直线(|)表示。

详细描述

A. 定义

本文使用的术语“脱氧核糖酶”用于描述能发挥酶的功能的含DNA的核酸。在本说明书中，术语“脱氧核糖酶”(deoxyribozymes)包括核糖核酸内切酶和脱氧核糖核酸内切酶，尽管特别优选具有核糖核酸内切酶活性的脱氧核糖酶。本文用于可与脱氧核糖酶互换的其它术语是“具有酶活性的DNA分子”，“DNA酶”或“催化性DNA分子”，这些术语应全部理解为包括其酶活性的部分，不管它们是经合成生产还是来自生物体或其它来源。

术语“具有酶活性的DNA分子”还包括在底物结合区与特异性寡核苷酸靶或底物具有互补性的DNA分子，该分子还具有对特异性地裂解寡核苷酸底物具活性的酶活性。换句话说，具有酶活性的DNA分子能裂解分子间的寡核苷酸底物。这一互补功能允许具有酶活性的DNA分子与底物寡核苷酸的充分杂交，使底物发生分子间裂解。尽管优选百分之百(100％)的互补性，但75-100％范围内的互补性也是有用的并在本发明中涉及。

本发明的具有酶活性的DNA分子可任选描述为具有核酸酶或核糖核酸酶活性。这些术语在本文中可互换使用。

本文所用的术语“具有酶活性的核酸”包含酶RNA或DNA分子、酶RNA-DNA多聚体，及其酶活性部分或衍生物，尽管具有酶活性的DNA分子是根据本发明特别优选的酶活性分子类型。

本文使用的术语“脱氧核糖核酸内切酶”是能裂解主要包含DNA的底物的酶。本文使用的术语“核糖核酸内切酶”是能裂解主要包含RNA的底物的酶。

本文使用的术语“碱基对”(bp)一般用于描述腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)间的配对关系，尽管可预料到碱基A，T，C和G(以及U)的罕见类似物可能偶尔掺入碱基对中，当DNA或RNA采用双链构象时正常配对的核苷酸在本文也称为“互补碱基”。

“互补核苷酸序列”一般指与另一单链寡核苷酸足够互补并因此以形成的氢键与其进行特异性杂交的DNA或RNA的单链分子或片段中的核苷酸序列。

“核苷酸”一般指由糖部分(戊糖)，磷酸基和含氮杂环碱基组成的DNA或RNA单体单位。碱基经糖苷碳(戊糖上的1′碳)连接到糖基上，碱基和糖的组合是“核苷”。当核苷含有一个结合到戊糖3′或5′位的磷酸基时，将它称为核苷酸。有效连接的核苷酸的序列本文典型地称为“碱基序列”或“核苷酸序列”和其语法上的相当物，本文以其从左到右方向是5′端至3′端的常规方向的通式代表，除非另有限定。

“核苷酸类似物”一般指结构上不同于A，T，G，C或U，但足以相似地取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。本文所用的术语“核苷酸类似物”包含改变的碱基，不同或不常见的糖类(即，不同于“通用”戊糖的糖类)，或两者的组合。在下文C部分中提供了碱基已改变的举例性的类似物目录。

“寡核苷酸或多核苷酸”一般指单链或双链核苷酸多聚体。本文使用的“寡核苷酸”和其语法上的相当物包括全部范围的核酸。寡核苷酸典型地指由核糖核苷酸的线型链组成的核酸分子。精确的大小取决于许多因素，而这些因素又取决于所用的最终条件，正如本领域所熟知的。

本文所用的术语“生理条件”指模仿在哺乳动物、尤其是人类中发现的建议的反应条件。尽管诸如温度，阳离子的可获得性和pH范围的变化可如下文的更详细的描述而变化，但“生理条件”一般包括大约35-40℃的温度，特别优选37℃，以及大约70-8.0的pH，特别优选7.5，进一步包含阳离子的可获得性，优选二价和/或单价阳离子，特别优选大约2-15mM浓度的Mg²⁺和0-1.0M Na⁺。本文所用的“生理条件”可任选包括存在自由核苷辅因子。如上文所述，优选的条件在下面作更详细的描述。

B. 具有酶活性的DNA分子

在各种实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子可组合一个或多个修饰或突变，包括添加，缺失和取代。在任选的实施方案中，可使用产生随机或特定突变或修饰的方法产生该突变或修饰。例如，这些突变可一个环，间隔子区域或识别序列(或结构域)的长度或改变其核苷酸。在一个催化活性具有酶活性的DNA分子内的一个或多个突变可与第二个催化活性具有酶活性的DNA分子内的突变组合以产生含两个分子都有突变的新具有酶活性的DNA分子。

在其它优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子可使用本领域的技术人员熟知的各种方法将随机突变导入其中。例如，Cadwell和Joyce所述的方法( PCR方法和应用2：28-33(1992))对于本文所公开的用途特别优选，其中一些修饰将在下面实施例中描述。(也见Cadwell和Joyce， PCR方法和应用3(增刊)：S136-S140(1994))。根据这一修饰的PCR方法，可将随机点突变导入克隆的基因。

例如，上述方法已用于诱变编码核酶的基因，经序列分析测定每位点突变率为0.66％±0.13％(95％置信区间)，关于碱基取代的类型观察不到较强的偏好性。这允许将随机突变导入本发明的具有酶活性的DNA分子的任意位点。

在导入限定或随机突变中有用的另一方法在Joyce和Inoue，核酸研究17：711-722(1989)中公开。随后的方法涉及切除双链DNA的模板(编码)链，用包含诱变寡核苷酸的模板链重建，及部分误配模板的随后转录。这允许在该分子的任意位置导入限定的或随机突变，包括在选定位置含已知或随机核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的具有酶活性的DNA分子可根据分子的类型和功能合适地改变长度和折叠方式。例如，具有酶活性的DNA分子可以是大约15到大约400或更多核苷酸的长度，尽管为了避免因使其太大或笨重而限制分子的治疗用途，优选长度不超过大约250个核苷酸。在各种优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子至少是大约20个核苷酸长，尽管有用的分子可能超过100个核苷酸长，但优选的分子一般不超过大约100个核苷酸长。

在各种治疗应用中，本发明的具有酶活性的DNA分子包含脱氧核糖酶的酶活性部分。在各种实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子优选包含不超过大约200个核苷酸。在其它实施方案中，本发明的脱氧核糖酶包含不超过大约100个核苷酸。在其它优选的实施方案中，本发明的脱氧核酶大约20-75个核苷酸长，更优选大约20-65个核苷酸长。其它优选的具有酶活性的DNA分子大约10-50个核苷酸长。

在其它应用中，具有酶活性的DNA分子可具有相似于“锤头”核酶的构象。该具有酶活性的DNA分子优选不超过大约75-100个核苷酸长，特别优选大约20-50个核苷酸长。

一般来说，如果试图合成按本文所公开的用途的分子，具有酶活性的核酸分子越大，合成越困难。本领域的技术人员显然可预料这些设计难度。尽管如此，这类较大的分子也在本发明的范围内。

还应明白本发明的具有酶活性的DNA分子可包含脱氧核糖酶的酶活性部分，或可包含具有一个或多个突变，例如，具有一个或多个碱基对形成序列或间隔子缺乏或修饰的脱氧核酶，只要该缺失，增加或修饰对该分子作为酶的能力无有害影响。

本发明的具有酶活性的DNA分子的识别区典型地包含在催化区两侧的2个核苷酸序列，典型地含有至少大约3到大约30个碱基的序列，优选大约6到大约15个碱基，由于具有酶活性的DNA分子的高度序列特异性，它能与底物核酸内的碱基互补序列杂交。以熟知的方法对识别位点进行的修饰或突变允许改变具有酶活性的核酸分子的序列特异性(例如，见Joyce等，核酸研究17：711-712(1989))。

本发明的具有酶活性的核酸分子还包括改变的识别位点或区域。在各种实施方案中，这些改变的识别区赋予包括该识别区的具有酶活性的核酸分子单一的序列特异性。存在于识别区的精确的碱基确定了发生裂解的碱基序列。底物核酸的裂解在识别区发生。该裂解在底物裂解序列上产生2′，3′，或2′，3′-环磷酸基及在开始位于原始底物的底物裂解序列3′的核苷酸上产生5′羟基。经过改变存在于识别序列(内部指导序列)的碱基可将裂解改向到选定的碱基。见Murphy et al.，美国国家科学院院报86：9218-9222(1989)。

而且，为了利于在具有酶活性的DNA分子和其底物间的识别和结合，加入多胺可能有用。有用的多胺的例子包括亚精胺，腐胺或精胺。大约1mM的亚精胺浓度在具体实施方案中有效，而从大约0.1mM到大约10mM的浓度范围也可能有用。

在各种任选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子已增强或优化了裂解核酸底物，优选RNA底物的能力。正如本领域的技术人员可预料到的，酶催化的反应的速率随底物和酶浓度而变化，一般来说，在高底物或酶浓度时达到平衡。考虑到这些影响，在下面限定反应的术语中描述酶催化的反应的动力学。

本发明的具有酶活性的DNA分子增强的或优化的裂解RNA底物的能力可在存在具有酶活性的DNA分子的条件下随标记的RNA底物量的改变在裂解反应中测定。裂解底物的能力一般以催化速率(k_cat)除以米氏(Michaelis)常数(K_M)来限定。符号k_cat代表当底物接近饱和值时的酶反应的最大速率。K_M代表反应速率是最大值的一半时的底物浓度。

例如，K_M和k_cat的值可在本发明中以底物浓度[S]超过具有酶活性的DNA分子浓度[E]的实验来确定。从起始线性期估测在一个底物浓度范围内的反应起始速率(v_o)，一般是在反应的前5％或更少的时期。以最小二乘方法使数据点回归到等式：v＝-K_M(v_o/[S]+V_max给出的理论直线上。因此，以反应起始速率v_o和底物浓度[S]测定k_cat和K_M。

在各种任选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子增强或优化了裂解核酸底物，优选RNA底物的能力。在优选的实施方案中，增强的或优化的具有酶活性的DNA分子裂解RNA底物的能力显示出比未催化的速率提高大约10-10⁹倍。在更优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子能以比“祖先”种类提高大约10³-10⁷倍的速率裂解RNA底物。在更优选的实施方案中，增强的或优化的裂解RNA底物的能力以相对祖先种类提高10⁴-10⁶倍来表达。本领域的技术人员可预料到增强的或优化的具有酶活性的DNA分子裂解核酸底物的能力可根据在本发明的体外进化程序期间所用的选择条件而改变。

本发明修饰脱氧核酶和其它具有酶活性的DNA分子和核酸酶的各种优选的方法在下文实施例1-3中进一步描述。

C. 核苷酸类似物

如上所述，本文使用的术语“核苷酸类似物”一般指结构上不同于A，T，G，C或U但足以对核酸分子中的该“正常”核苷酸进行相似取代的嘌呤或嘧啶核苷酸。本文使用的术语“核苷酸类似物”包含改变的碱基，不同(或不常见)糖类，改变的磷酸主链或这些改变的任意组合。根据本发明有用的核苷酸类似物的例子包括下表中所列的那些，其中大多数在37CFR§1.822的批准的修饰碱基表中发现(本文引用以供参考)。

表1

缩写	核苷酸类似物描述
缩写	核苷酸类似物描述	ac4cchm5ucmcmnm5s2udfmgalqgmIi6am1am1fm1gml1m22gm2am2gm3cm5cm6am7gmam5umam5s2umanqmcm5s2umo5ums2i6a	4-乙酰胞苷5-(羧羟基甲基)尿苷2′-O-甲基胞苷5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷二氢尿苷2′-O-甲基假尿苷β，D-半乳糖苷2′-O-甲基鸟苷肌苷N6-异戊烯基腺苷1-甲基腺苷1-甲基假尿苷1-甲基鸟苷1-甲基肌苷2，2-二甲基鸟苷2-甲基腺苷2-甲基鸟苷3-甲基胞苷5-甲基胞苷N6-甲基腺苷7-甲基鸟苷5-甲基氨基甲基尿苷5-甲氧氨甲基-2-硫尿苷β，D-甘露糖基甲基尿苷5-甲氧羰基甲基尿苷5-甲氧尿苷2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷

表1，续

缩写	描述
缩写	描述	ms2t6amt6amvo5uosywpqs2cs2ts2us4utt6aumywxaraUaraT	N-((9-β-D-呋喃核糖苷-2-甲硫嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸N-((9-β-D-呋喃核糖苷嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸尿苷-5-草酸甲酯尿苷-5-草酸(v)wybutoxosine假尿苷queosine2-硫胞苷5-甲基-2-硫尿苷2-硫尿苷4-硫尿苷5-甲基尿苷N-((9-β-D-呋喃核糖苷嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸2′-O-甲基-5-甲基尿苷2′-O-甲基尿苷wybutosine3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷，(acp3)uβ，D-阿拉伯糖基β，D-阿拉伯糖基

其它有用的类似物包括在公开的国际申请号WO 92/20823(本文引用其说明书以供参考)中描述的那些或根据其公开的方法制备的类似物。根据本发明公开的内容在DeMesmaeker等， Angew.Chem.Int.Ed. Engl.33：226-229(1994)；DeMesmaeker等， Synlett：733-736(Oct.1993)；Nielsen，等，科学254：1497-1500(1991)和Idziak等，四面体通讯 (Tetrahedron Letters)34：5417-5420(1993)中描述的类似物也有用且所述的文献在本文引用以供参考。

D. 构建具有酶活性的DNA分子的方法

本发明还包含产生具有预定活性的核酸分子的方法。在一个优选的实施方案中，核酸分子是具有酶活性的DNA分子。在另一变化中，所需活性是催化活性。

在一个实施方案中，本发明包含合成可随后构建成对预定反应具有催化特异性的具有酶活性的DNA分子的方法。制备具有酶活性的DNA分子的方法在本文描述，例如，见下面实施例1-3。在另一实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子可构建成可结合小分子或配体，如腺苷三磷酸(ATP)。(例如，见Sassanfar，等，自然364：550-553(1993))。

在另一实施方案中，本发明包含使用具有酶活性的DNA分子的群体在诱变条件下产生突变具有酶活性的DNA分子的各种各样的群体(可任选称为“脱氧核酶”或“DNA酶”)。此后，从群体中选择和/或分离具有所需特征的具有酶活性的DNA分子或随后扩增。

另外，可经过改变具有酶活性的DNA分子识别区的长度将突变导入具有酶活性的DNA分子中。具有酶活性的DNA分子识别区与底物核酸序列内的碱基互补序列相关。改变识别区长度的方法是本领域已知的，例如，包括PCR，有用的技术在下面实施例中进一步描述。

具有酶活性的DNA分子识别区的长度的改变对具有酶活性的DNA分子的结合特异性具有合适的影响。例如，识别区长度的增加可增加具有酶活性的DNA分子与底物寡核苷酸的互补碱基序列间的结合特异性，或可在杂交底物中增强对特定序列的识别。另外，识别区长度的增加也可增加其结合底物的亲和力。在各种实施方案中，具有酶活性的DNA分子改变的识别区提供了具有酶活性的DNA和其底物间增加的结合特异性和亲和力。

最近已注意到某些寡核苷酸能识别和结合不同于具互补序列的寡核苷酸的分子。这些寡核苷酸常称为“aptamers”。例如，Ellington和Szostak描述了能结合许多有机染料的RNA分子( 自然346：818-822(1990))，而Bock等描述了结合人凝血酶的ssDNA分子( 自然355：564-566(1992))。同样，Jellinek等描述了碱性成纤维细胞生长因子的RNA配体( 美国国家科学院院报90：11227-11231(1993))。因此，本文进一步包含可根据本文描述的方法加工成表现出与aptamers典型相关的各种能力的本发明的催化活性DNA酶。

因此，本领域的技术人员应预料到本发明的具有酶活性的DNA分子可用本文公开的各种方法，包括PCR和3SR(自我持久序列复制-见下面实施例1)在任意核苷酸序列，如识别区进行改变。例如，经过在引物中包含增加的核苷酸可将增加的核苷酸加到具有酶活性的DNA分子的5′端。

本发明的具有酶活性的DNA分子经过使用诸如定点诱变的方法也可以更非随机的方式进行制备或改造。例如，可基本上按Morinaga等，生物工程2：636(1984)所述并按本文所述改良进行应用于脱氧核酶的定点诱变。构建具有酶活性的DNA分子的有用的方法在下面实施例中进一步描述。

在一个公开的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子包含一个保守的核心和侧翼的通过碱基对相互作用与底物相互作用的2个底物结合(或识别)区或序列。在各种实施方案中，保守的核心包含一个或多个保守的区域或序列。在另一变化中，具有酶活性的DNA分子进一步包含涉及碱基配对的区域(或序列)之间的“间隔子”区(或序列)。在另一个变化中，保守核心被一个或更多保守性较小的可变的或“间隔子”核苷酸以各种间隔“打断”。

在各种实施方案中，具有酶活性的DNA分子的群体由至少2种不同类型的脱氧核酶分子组成。例如，在一个变化中，该分子具有不同的序列。在另一变化中，脱氧核酶是具有与核酸序列5′端相连续或相邻的核酸序列限定的识别区的核酸分子。在各种任选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子可进一步包含位于识别区3′端的一个或多个间隔子区，位于识别区和/或间隔子区3′端的一个或多个环。在其它变化中，本发明的脱氧核酶包含能与相同分子其它区杂交的一个或多个区域。根据这里公开的方法产生的具有酶活性的DNA分子的其它特征在本文的其它部分描述。

在其它实施方案中，诱变条件包括在具有酶活性的DNA分子内诱导限定的或随机的核苷酸取代的条件。典型的诱导条件的实施例包括在本说明书的其它部分公开的条件和Joyce等，核酸研究17：711-722(1989)；Joyce，基因82：83-87(1989)；和Beaudry and Joyce，科学257：635-41(1992)描述的方法。

在还有一个实施方案中，本发明的突变的具有酶活性的核酸分子的不同群体是含至少2种不具有完全相同的核酸序列的核酸分子。在其它变化中，根据其实现预定活性的能力从这些不同的群体中选择具有预定活性的具有酶活性的DNA分子或其它具有酶活性的核酸。在各种实施方案中，预定的活性包含但并不局限于增强的催化活性，减少的K_M，增强的底物结合能力，改变的底物特异性等。

可认为是酶效能特征的其它参数包括催化活性或能力，底物结合能力，酶转换率，酶对反馈机制的敏感性等。在某些情况下，底物特异性可认为是酶效能的一个方面，特别是在酶能识别和结合2个或多个竞争性底物，每一个均影响酶对其它底物的效能的情况下。

本文使用的底物特异性指本文描述的具有酶活性的核酸分子对特定底物，如仅包含核糖核苷酸，仅包含脱氧核糖核苷酸或两者的组合物的分子的特异性。底物分子也可含有核苷酸类似物。在各种实施方案中，本发明的具有酶活性的核酸分子可优选与杂交或非杂交的底物的特定区域结合。

本文以“底物特异性”鉴定的术语或参数也可包括序列特异性；即，本发明的具有酶活性的核酸分子可“识别”和结合具有特定核酸序列的核酸底物。例如，如果本发明的具有酶活性的核酸分子的底物识别区仅结合具有在一排中的一系列的一个或两个核糖核苷酸(例如，rA)的底物分子，那么，具有酶活性的核酸分子将不会识别或结合缺乏该序列的核酸底物分子。

关于选择方法，在各种实施方案中，选择包括从突变具有酶活性的核酸的不同群体中物理分离具有预定活性的突变具有酶活性的核酸的各种方法。通常，选择包括以大小，催化活性的有无，或将突变核酸与存在于溶液中或附着于固相基质的另一核酸，多肽或某些其它分子杂交来分离。

在各种实施方案中，预定活性是使具有该预定活性的突变具有酶活性的核酸经其活性特征以其中方式被标记。例如，预定活性可以是具有酶活性的DNA分子活性，其中对其底物的突变具有酶活性的核酸活性使突变具有酶活性的核酸共价结合于其上。然后以共价连接特征选择突变的具有酶活性的核酸。

在其它实施方案中，选择具有预定活性的突变具有酶活性的核酸包括突变具有酶活性的核酸的扩增(例如，见Joyce，基因82：83-87(1989)；Beaudry和Joyce，科学257：635-41(1992))。选择具有预定特征或活性的具有酶活性的核酸分子的其它方法在实施例部分描述。

E. 组合物

本发明还包含含有本发明的一种或多种类型或群体的具有酶活性的DNA分子的组合物；例如，不同类型或群体可识别和裂解不同的核苷酸序列。组合物可进一步包括含核糖核酸的底物。根据本发明的组合物可进一步包含铅离子，镁离子或其它二价或单价阳离子，如本文所述。

优选的是，具有酶活性的DNA分子以大约0.05μM到大约2μM的浓度存在。典型的是，具有酶活性的DNA分子以具有酶活性的DNA分子与底物的浓度比从大约1∶5到大约1∶50的浓度存在。更优选的是，具有酶活性的DNA分子以大约0.1μM到大约1μM的浓度存在于组合物中。还有更优选的是，组合物含大约0.1μM到大约0.5μM浓度的具有酶活性的DNA分子。优选的是，底物以大约0.5μM到大约1000μM的浓度存在于组合物中。

本领域的技术人员将明白含核酸的底物有许多来源，包括天然来源和合成来源。合适的底物来源包括但不限于各种病毒和逆转录病毒试剂，包括HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HTLV-II。

其它合适的底物包括，但不限于病毒和逆转录病毒试剂，包括由小RNA病毒，嗜肝DNA病毒科(例如，HBV，HCV)，乳头瘤病毒(例如，HPV)，γ-疱疹病毒(例如，EBV)，淋巴隐病毒，白血病病毒(例如，HTLV-1和-II)，黄病毒，披膜病毒，疱疹病毒(包括α-疱疹病毒和β-疱疹病毒)，巨细胞病毒(CMV)，流感病毒和引起免疫缺陷疾病和综合症(例如，HIV-1和-2)的病毒和逆转录病毒所产生或包含的试剂。另外，合适的底物包括感染非人类灵长动物和其它动物的病毒和逆转录病毒试剂，包括但不限于猿猴和猫免疫缺陷病毒和牛白血病病毒。

如前所述的镁离子，铅离子，或其它合适的单价或双价离子可以大约1-100mM的浓度范围存在于组合物中。更优选的是，预选的离子以大约2mM到大约50mM的浓度存在于组合物中，特别优选是大约5mM的浓度。本领域的技术人员将明白离子浓度仅受水溶液中其来源的可溶性极限(例如镁)和使具有酶活性的DNA分子在相同组合物中以活性构象存在的需要的约束。

本发明还包含含有本发明的具有酶活性的DNA分子，杂交的脱氧核糖核苷酸-核糖核苷酸分子，及上文所述浓度的镁或铅离子的组合物。如前面所述，其它单价或双价离子(例如，Ca²⁺)可用于代替镁。

本发明还包含含有本发明的具有酶活性的DNA分子，含核酸的底物(例如，RNA)和浓度大于大约1毫摩尔的预选离子的组合物，其中所说的底物长度大于存在于具有酶活性的DNA分子中的识别区。

在一个变化中，组合物包含具有酶活性的DNA分子底物复合物，其中具有酶活性的DNA分子和其底物间的碱基对是连续的。在另一实施例中，具有酶活性的DNA分子和其底物间的碱基对被一个或多个非互补对打断。在各种任选的实施例中，本发明的组合物可进一步包含单价阳离子，双价阳离子或两者都含。

在另一变化中，本发明的具有酶活性的DNA分子在存在或缺乏二价阳离子时能有效地发挥功能。在一个变化中，存在二价阳离子且包含Pb²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，或Ca²⁺。另外，本发明的具有酶活性的DNA分子在存在或缺乏单价阳离子时能有效发挥功能。可预料到与本文对Pb²⁺或Mg²⁺所述相似的单价或二价阳离子浓度按本文所公开的将会有用。

任选的是，单价阳离子也可以额外地或作为二价阳离子的替代存在。例如，诸如钠(Na⁺)或钾(K⁺)的单价阳离子可作为解离离子或以诸如NaCl或KCl的可解离的化合物的形式存在。

在一个实施方案中，单价阳离子浓度以0-1.0M的范围存在于组合物中。在另一实施方案中，单价阳离子以大约0-200mM的浓度范围存在。在其它实施方案中，单价阳离子以大约1-100mM的浓度范围存在。另外，单价阳离子的浓度范围从大约2mM-50mM。在其它实施方案中，浓度范围从大约2mM-25mM。

F. 使用具有酶活性的DNA分子的方法

使用本文所公开的具有酶活性的DNA分子的方法有很多。如前面所讨论的，能裂解连接相邻核酸的键(例如磷酯键)的分子有许多包含广泛应用的用途。例如，具有本文公开的能力，结构和/或功能的具有酶活性的DNA分子在药用和医用产品(例如，伤口清除，血块溶解，等)，以及在家庭用品(例如，去污剂，牙卫生产品，肉变嫩剂)中有用。也包含本文公开的化合物，组合物和方法的工业用途并且在本发明的范围内。

本发明还描述了裂解任何单链，环状，部分或全部双链的核酸的有用方法；这些方法的大多数采用了本发明的新的酶活性核酸分子。在各种实施方案中，底物的单链核酸片段或部分(或其全部底物)包含DNA，修饰的DNA，RNA，修饰的RNA或其组合物。优选的是，核酸底物仅仅需要在或靠近底物裂解序列处是单链的，以便本发明的具有酶活性的核酸分子由于酶识别序列的特征能与底物裂解序列杂交。

以本发明的方法可裂解的核酸底物可以是化学合成的或酶促生产的，或它可从各种来源，如噬菌体，病毒，原核细胞或真核细胞，包括动物细胞，植物细胞，酵母细胞和细菌细胞中分离。化学合成的单链和双链核酸可从许多途径以商品的形式买到，包括但不限于ResearchGenetics(Huntsville，AL)。

RNA底物也可使用应用生物系统(Applied Biosystem)(FosterCity，CA)寡核苷酸合成仪根据厂家说明书来合成。单链噬菌体也是核酸底物的来源(例如，见Messing等，美国国家科学院院报74：3642-3646(1977)，和Yanisch-Perron等，基因33：103-119(1985))。含单链噬菌体的细菌细胞也是合适的单链核酸底物的简便来源。

也可以用诸如小RNA病毒，披膜病毒，正粘病毒，副粘病毒，杆状病毒，冠形病毒，沙粒病毒或逆转录病毒的任意RNA病毒提供以本发明的方法可裂解的单链RNA。如上文所述，许多原核和真核细胞也是合适的核酸底物的极好的来源。

本发明的方法可用于存在于细胞内的单链核酸或具环的或双链核酸的单链部分，包括真核，原核，植物，动物，酵母或细菌细胞。在这些条件下本发明的具有酶活性的核酸分子(例如，具有酶活性的DNA分子或脱氧核酶)可充当抗病毒剂或基因表达的调节剂。本发明的具有酶活性的DNA分子的这类用途的实施例在下文进一步描述。

在本发明的大部分方法中，单链核酸的裂解发生在预定碱基序列的3′-端。该预定的碱基序列或底物裂解序列典型地含1到10个核苷酸。在其它优选的实施方案中，本发明的具有酶活性的DNA分子能识别裂解位点上游或上游及下游的核苷酸。在各种实施方案中，具有酶活性的DNA分子能识别裂解位点上游大约2-10个核苷酸，在其它实施方案中，具有酶活性的DNA分子能识别裂解位点上游大约2-10个核苷酸和下游大约2-10个核苷酸。其它优选的实施例包含的具有酶活性的DNA分子能识别高达大约30个核苷酸长的核苷酸序列，更优选长达大约20个核苷酸。

本文公开的方法允许经过改变具有酶活性的DNA分子识别区的核苷酸序列在任意核苷酸序列上裂解。这允许在缺乏限制性核酸内切酶位点的条件下在选定的位置裂解单链核酸。

本发明的具有酶活性的DNA分子可从经过在合适的裂解位点进行点特异性杂交而附着到具有酶活性的DNA分子上的单链核酸底物的任意部分上分离。具有酶活性的DNA分子从底物(或“裂解产物”)上的分离允许具有酶活性的DNA分子进行另一裂解反应。

一般来说，在合适的核酸裂解条件下，优选在生理条件下用有效量的本发明的具有酶活性的DNA分子处理核酸底物。如果核酸底物包含DNA，裂解条件可包括存在大约2-10mM浓度的二价阳离子。

具有酶活性的DNA分子的有效量指需要裂解单链核酸内预定碱基序列的量。优选的是，具有酶活性的DNA分子以DNA分子与底物裂解位点摩尔比为1比20存在。该比率可根据在采用的具体核酸裂解条件下特定具有酶活性的DNA分子的处理长度和效率而变化。

因此，在一个优选的实施方案中，处理典型地包含在水溶液中混合含RNA的底物和酶以形成裂解混合物，然后在RNA裂解条件下维持由此形成的混合物一段足以使具有酶活性的DNA分子在RNA中任意预定的核苷酸序列上裂解RNA底物的时间。在各种实施方案中，还提供了离子来源，即单价或双价阳离子，或二者都有。

在本发明的一个实施方案中，预测了具有酶活性的DNA分子裂解单链核酸所必须的时间量。时间量从大约1分钟到大约24小时，并根据反应物的浓度和反应温度而变化。通常，该时间期限是从大约10分钟到大约2小时，具有酶活性的DNA分子在任意预测的核酸序列上裂解单链核酸。

本发明进一步包含的核酸裂解条件包括存在大约2-100mM浓度的二价阳离子(例如，PbOAc)来源。典型的是，核酸裂解条件包括大约2mM至大约10mM浓度的二价阳离子，特别优选大约5mM的浓度。

核酸裂解条件中包括的最佳阳离子浓度可经过测定在给定阳离子浓度下裂解的单链核酸的量来较容易的测定。本领域的技术人员将明白最佳浓度可根据采用的具体具有酶活性的DNA分子而变化。

本发明进一步包含的核酸裂解条件包括大约pH 6.0到大约pH 9.0的pH。在一个优选的实施方案中，pH范围从大约pH 6.5到pH 8.0。在另一优选的实施方案中，pH模仿生理条件，即，pH为大约7.0-7.8，特别优选大约7.5的pH。

本领域的技术人员将预料到本发明的方法可在广泛的pH范围内进行，只要用于核酸裂解的pH使该具有酶活性的DNA分子保持活性构象。活性构象的具有酶活性的DNA分子以其裂解预定核酸序列上的单链核酸的能力而易于被检测。

在各种实施方案中，核酸裂解条件还包括许多温度范围。如上所述，特别优选与生理条件一致的温度范围，尽管本文也包含与工业应用一致的温度范围。在一个实施方案中，温度范围从大约15℃到大约60℃。在其它变化中，核酸裂解条件包括大约30℃到大约56℃的温度范围。在另一变化中，核酸裂解条件包括从大约35℃到大约50℃的温度。在优选的实施方案中，核酸裂解条件包含大约37℃到大约42℃的温度范围。与核酸裂解条件一致的温度范围仅受所需裂解率和特定具有酶活性的DNA分子在该特定温度下的稳定性限制。

在各种方法中，本发明包含包括存在多胺的核酸裂解条件。实施本发明有用的多胺包括精亚胺，腐胺，精胺等。在一个变化中，多胺以大约.01mM到大约10mM的浓度存在。在另一个变化中，多胺以大约1mM到大约10mM的浓度存在。核酸裂解条件也可包括存在大约2mM到大约5mM浓度的多胺。在各种优选的实施方案中，多胺是精亚胺。

G. 载体

本发明的特征还有包含位于载体内的编码本发明的具有酶活性的DNA分子的核酸片段的表达载体，优选以允许该具有酶活性的DNA分子在靶细胞(例如，植物或动物细胞)内表达的方式存在。

因此，一般来说，根据本发明的载体优选包括质粒，粘粒，噬菌粒，病毒或噬菌体载体。优选的是，合适的载体包含单链DNA(ssDNA)-例如，环形噬菌粒ssDNA。也可预料到根据本发明的有用的载体不必是环形。

在一个变化中，优选提供在每个增加的具有酶活性的DNA分子编码序列侧翼的核苷酸序列，该序列可被第一具有酶活性的DNA分子识别。插入或侧翼序列优选包含至少一个核苷酸，更优选的是，插入或侧翼序列大约2-20个核苷酸长，特别优选长大约为5-10个核苷酸的序列。

多核苷酸尾巴的增加对于保护根据本发明的具有酶活性的DNA分子的3′端也是有用的。这些可经过采用末端转移酶附着一个多聚体序列来提供。

根据本发明的载体包括2个或多个具有酶活性的DNA分子。在另一实施方案中，第一具有酶活性的DNA分子具有分子内裂解活性，并能够识别和裂解核苷酸序列以释放其它具有酶活性的DNA序列；即，它能发挥从载体中“释放”其它具有酶活性的DNA分子的功能。例如，载体优选构建成当第一具有酶活性的DNA分子表达时，第一分子能裂解编码第二具有酶活性的DNA分子，第三具有酶活性的DNA分子等的其它核苷酸序列侧翼的核苷酸序列。假定所说的第一具有酶活性的DNA分子(即，“释放”分子)能裂解分子内的寡核苷酸序列，其它的(例如，第二，第三等)具有酶活性的DNA分子(即，“被释放”的分子)不必具有与“释放”分子相同的特征。例如，在一个实施方案中，“被释放”的(即，第二，第三等)具有酶活性的DNA分子能裂解特定的RNA序列，而第一(“释放性”)具有酶活性的DNA分子具有使其裂解为“被释放的”分子的核酸酶活性。在另一实施方案中，“被释放的”具有酶活性的DNA分子具有酰胺键裂解活性，而第一(“释放性”)具有酶活性的DNA分子具有核酸酶活性。

作为选择，第一具有酶活性的DNA分子可被与第二(和第三，第四，等)具有酶活性的DNA分子独立的载体编码，并且可具有分子内裂解活性。如本文所述，第一具有酶活性的DNA分子可以是自我裂解性具有酶活性的DNA分子(例如，脱氧核酶)，第二具有酶活性的DNA分子可以是任意所需的具有酶活性的DNA分子类型。当载体引起从这些核酸序列表达DNA时，该DNA具有在合适条件下裂解各侧翼区的能力，从而释放第二具有酶活性的DNA分子的一个或多个拷贝。如果需要，一些不同的第二具有酶活性的DNA分子可放入相同细胞或载体以产生不同的脱氧核酶。还包含的任意一个或多个载体可包括以“释放性”和“被释放”的具有酶活性的核酸分子的任意组合的一个或多个核酶或脱氧核酶，只要该组合能达到所需的结果：释放能裂解预定核酸序列的具有酶活性的核酸分子。

还包含分离和纯化本发明的具有酶活性的DNA分子的方法。除了本文所述的方法外，各种纯化方法(例如，使用HPLC的方法)和色谱分离技术是本领域可获得的。例如，见公开的国际申请号WO 93/23569中所述的方法，其公开内容编入本文以供参考。

还应明白本文描述的实施例的各种组合包括在本发明的范围内。本发明的其它特征和优势从上文说明书，下面的实施例和权利要求书来看将是显而易见的。

实施例

下面的实施例用来说明但不限制本发明。

实施例I

具有酶活性的DNA分子的体外进化

综述

体外选择和体外进化技术允许分离对其组成或结构无背景技术的新催化剂。该方法用于获得具有新催化特征的RNA酶。例如，已从随机tRNA^phe分子库中产生了与铅离子一起进行自体裂解的核酶(Pan和Uhlenbeck，生物化学31：3887-3895(1992))。已分离的I型核酶能裂解DNA(Beaudry和Joyce，科学257：635-641(1992))或改变金属依赖性(Lehman和Joyce，自然361：182-185(1993))。以一组随机RNA序列开始，已获得了催化聚合酶样反应的分子(Bartel和Szostak，科学261：1411-1418(1993))。在本实施例中，描述了在体外进化过程中经过改变选择条件精制进化酶的特定催化特征。

达尔文进化需要三个过程的重复操作：(a)遗传变异的诱导；(b)根据某种适应性标准选择个体；和(c)选定个体的扩增。每一过程可在体外实现(Joyce，基因82：83(1989))。基因可经过化学修饰，随机诱变的寡脱氧核苷酸的掺入或以聚合酶进行不准确的拷贝来诱变(例如，见Cadwell and Joyce， RCR方法和应用2：28-33(1992)；Cadwell和Joyce， RCR方法和应用3：(增刊)：S136-S140(1994)；Chu，等，病毒学98：168(1979)；Shortle等，酶学方法100：457(1983)；Myers，等，科学229：242(1985)；Matteucci等，核酸研究11：3113(1983)；Wells，等，基因34：315(1985)；McNeil，等，分子细胞生物学5：3545(1985)；Hutchison，等，美国国家科学院院报83：710(1986)；Derbyshire，等，基因46：145(1986)；Zvkour，等，自然295：708(1982)；Lehtovaara等，蛋白质工程2：63(1988)；Leung等，技术1：11(1989)；Zhou等，核酸研究19：6052(1991))。

例如，可用其结合配体或进行化学反应的能力选择基因产物(例如，见Joyce，同前(1989)；Robertson和Joyce，自然344：467(1990)；Tuerk等，科学249：505(1990))。与选定基因产物相应的基因可用交互引物方法，如聚合酶链式反应(PCR)扩增，(例如，见Saiki，等，科学230：1350-54(1985)；Saiki等，科学239：487-491(1988))。

作为选择，核酸扩增可使用自我持续序列复制(3SR)进行。(例如，见Guatelli等，美国国家科学院院报87：1874(1990)，其公开内容引入本文以供参考)。根据3SR方法，靶核酸序列可经过使用对逆转录病毒复制所必须的三种酶活性：(1)逆转录酶，(2)RNase H，和(3)DNA-依赖性RNA聚合酶在体外等温条件下典型地扩增(复制)。借助于cDNA介质经过模仿RNA复制的逆转录方法，该反应积累原始靶的cDNA和RNA拷贝。

总的来说，如果期望具有酶活性的DNA分子的群体进化，一个连续的逆转录和转录反应系列可借助于cDNA中间体复制RNA靶序列。该设计的关键性成份为：(a)寡核苷酸引物限定该靶并含有编码T7RNA聚合酶结合位点的5′延伸部分，使所得的cDNA是活性转录模板；(b)可进行cDNA合成以完成由于RNase H对中间体RNA-DNA杂交体中模板RNA的降解而产生的两条链；(c)反应产物(cDNA和RNA)可作为随后步骤的模板发挥功能，使能进行指数复制。

如果进化具有酶活性的DNA分子，本设计的各种关键成份有些不同，正如在这些实施例中所公开的。例如，(1)寡核苷酸引物限定靶并且优选以某种方式标记-例如，以生物素标记-，因此所得的活性模板链易于鉴定；(2)使用的体外选择方法优选取决于最有利的释放机制的鉴定。

实现体外达尔文进化的主要障碍是需要整合突变和扩增，两者都与基因型相关，选择时，它是表型相关的。对于核酸酶，基因型和表现型体现在相同的分子中，因此工作得到简化。

A. 具有酶活性的DNA分子的设计

已知单链DNA可呈有趣的三级结构。例如“tDNA”的结构与相应tRNA非常相似。(见Paquette等，欧洲生物化学杂志189：259-265(1990))。而且，在锤头状核酶内取代35个核糖核苷酸中的31个，而至少保留某些催化活性是可能的。(见Perreault等，自然344：565567(1990)；Williams等，美国国家科学院院报89：918-921(1992)；Yang等，生物化学31：5005-5009(1992)。)。

体外选择技术已应用于随机序列DNA的大量群体中，导致回收以高亲和力结合靶配体的特定DNA“aptamers”。(Bock，等，自然355：564-566(1992)；Ellington & Szostak，自然355：850852(1992)；Wyatt和Ecker，美国国家科学院院报91：1356-1360(1994))。最近，两个小组进行了一个aptamer的一级NMR结构测定，它是一个形成G-四重峰(G-quartet)结构和以高亲和力结合蛋白质凝血酶的15聚体DNA(Wang等，生物化学32：1899-1904(1993)；Macaya等，美国国家科学院院报90：3745-3749(1993))。这些发现以X-射线晶体照片分析来证实(Padmanabhan等，生物化学杂志268：17651-17654(1993))。

具有高亲和力和特异性结合底物分子的能力是好酶的前提。而且，酶必须利用自身或辅因子内的定位好的功能基团以启动特定的化学转化。而且，酶必须在反应过程中保持不发生变化并且能以催化转换进行操作。一些额外的要求是它是由亚基组成的信息大分子，亚基的特定顺序决定催化活性。尽管这些标准对语义的和化学的基础的思考是开放的，它们用于区分从简单的溶解效应到在底物扩散极限时生物学酶操作变化中化学速率增强的表型(Albery和Knowles，生物化学15：5631-5640(1976))。

正如在下面所进行的更详细的描述，我们试图从随机序列开始，形成快速获得DNA催化剂和DNA酶的一般方法。作为起始靶，我们选择了我们认为完全在DNA能力范围内的反应：以二价金属辅因子的帮助水解RNA磷酸二酯。这是由各种天然存在的RNA酶，包括锤头和发夹部分所进行的相同反应(例如，见Forster A.C.和Symons R.H，细胞 49：211-220(1987)；Uhlenbeck，自然328：596-600(1987)；Hampel和Tritz，生物化学28：4929-4933(1989))。

最近表明，以tRNA分子随机文库开始，可获得在中性pH下具有Pb²⁺依赖性，位点特异性RNA磷酸酯酶活性的核酶(Pan和Uhlenbeck，生物化学31：3887-3895(1992)；Pan和Uhlenbeck，自然358：560-563(1992))。这与酵母tRNA^phe的偶然自我裂解反应类似(Dirheimer和Werner， Biochimie 54：127-144(1972))。它依赖于Pb²⁺离子在tRNA内限定位点的特异性协作。(见Rubin和Sundaralingam，生物分子结构和动力学杂志 (J.Biomol.Struct.Dyri.) 1：639-646(1983)；Brown等，生物化学24：4785-4801(1985))。

正如本文所公开的，我们的目的包括形成能对特定RNA磷酯进行Pb²⁺依赖性裂解的DNA，该RNA磷酯开始位于附着于该DNA分子5′端的一段短先导序列内，最终位于以分子间方式用快速催化转换能裂解的分离分子内。如下面所进行的进一步的描述，已成功地达到了这些目标。

对于该DNA如何与靶磷酯和周围的核苷酸相互作用没有给出假设。以一组大约10¹⁴随机50聚体序列开始，体外选择允许进行该过程。进行5轮选择4天后，该群体作为一个整体达到了在1mM Pb²⁺存在的条件下以大约0.2min^-1的速率裂解靶磷酯的能力。这与在相同反应条件下的自发裂解速率相比大约增加10⁵倍。

从群体中分离个体，测序并测定催化活性。根据这些信息，反应转变成分子间形式，然后在1mM PbOAc存在的条件下，在23℃和pH 7.0中以1min^-1的转换率进行的反应中简化成允许38聚体DNA酶点特异性裂解19聚体底物。

B. 体外选择方法

产生大约10¹⁴单链DNA分子的起始库，均含有5′生物素部分，接着相连续的是包括单个核糖核苷酸的固定区，由50个随机脱氧核糖核苷酸组成的有效催化区和位于3′端的第二固定区(图1)。

由嵌套PCR(聚合酶链式反应)技术构建该群体，以含50个随机核苷酸，两侧为引物结合位点的合成DNA开始。嵌套PCR引物是具有3′端腺嘌呤核糖核苷酸的5′-生物素标记的合成寡脱氧核苷酸。核糖核苷酸终止的寡核苷酸在PCR环境中有效地引发模板指导的延长(L.E.Orgel.私人交流)，在这种情况下产生含单个包埋的核糖核苷酸的延伸产物。

图1显示了分离裂解靶RNA磷酯的DNA的选择性扩增方案。含50个随机核苷酸链的双链DNA经PCR，采用在3′端以腺嘌呤核糖核苷酸(由符号“N”或“rA”代表，其中N和rA均代表腺嘌呤核糖核苷酸)终止的5′生物素标记的DNA引物(例如，引物3-3a或3b)进行扩增。该引物以Taq聚合酶延伸以产生含单个包埋的核糖核苷酸的DNA产物。所得的双链DNA固定于链霉抗生物素蛋白质基质上，经过用0.2NNaOH洗涤去掉未标记生物素的DNA。用缓中液重新平衡柱后，用加有1mM PbOAc的相同溶液洗柱。进行Pb²⁺依赖性自我裂解的DNA从柱上释放，收集于洗脱液中，以PCR扩增。然后PCR产物用于起动下一轮选择性扩增。

PCR产物经过链霉抗生物素蛋白亲和基质，导致双螺旋DNA 5′-生物素标记的链非共价附着。经过用0.2N NaOH简单洗涤去掉未标记生物素的链。结合链在含0.5M NaCl，0.5M KCl，50mM MgCl₂和50mM HEPES(pH 7.0)的缓冲液中23℃平衡。接着，在相同缓冲液中提供1mM PbOAc，使在靶磷酯上发生Pb²⁺依赖性裂解，从而从链霉抗生物素蛋白基质中释放DNA亚基。原则上，个体DNA以各种方式帮助其自身的释放，如破坏生物素与链霉抗生物素蛋白间的相互作用或裂解一个脱氧核糖核苷酸键。根据键的相对不稳定性认为核糖核苷酸3′-O-P键的裂解是释放的最可能的机制，且Pb²⁺依赖性水解允许发生最迅速的释放。然而，原则上体外选择程序应鉴定最有利的释放机制以及那些能最佳完成该机制的个体。

加入Pb²⁺时从基质中释放的DNA分子收集在洗脱液中，用乙醇沉淀浓缩并进行嵌套式PCR扩增。与构建开始的分子群体一样，第一次PCR扩增所利用的引物(引物1和2)在随机区的两侧，第二次利用具有3′端核糖腺苷酸的5′生物素标记的引物(引物3b)，从而再次导入靶RNA磷酯。完整的选择扩增程序需要3-4小时进行。

在该程序的每一轮中以3种方式纯化分子：第一：PCR扩增后，用酚提取2次并用氯仿/异戊醇提取一次，然后用乙醇沉淀；第二，将DNA附着到链霉抗生物素蛋白上后，在强变性条件下洗去全部未标记生物素的分子；第三，用Pb²⁺洗脱后，用乙醇沉淀。没有凝胶电泳纯化步骤，因此没有限制分子到特定长度的选择压力。

C. 催化性DNA的选择

我们进行了5轮连续的体外选择，在加入Pb²⁺后逐步减少反应时间以逐步增强选择的严格性。在1轮到3轮中，反应时间为1小时，在第4轮中，反应时间为20分钟，在第5轮中，反应时间为1分钟。单链DNA的起始库与每轮选择后获得的分子群体一起在与体外选择中所用的相同的条件下测定自我裂解活性(见图2)。

对该测定，用不同于5′-生物素部分的5′-³²P制备分子，允许检测起始物质和5′裂解产物。培养5分钟后，在起始库(GO)或第一和第2轮选择后获得的群体中无可检测的活性。第三轮(G3)后获得的DNA表现出稳定的活性水平，该活性稳定增加，在第5轮选择(G5)后获得的DNA中达到大约50％的自我裂解。即使在延长培养时间后，仅在靶磷酯上检测到裂解。如果在反应混合物中省去Pb²⁺则活性丧失。

图2显示了DNA开始库(GO)和第一至第五轮选择(G1-G5)后获得的群体的自我裂解活性。反应混合物含50mM MgCl₂，0.5MNaCl，0.5M KCl，50mM HEPES(pH 7.0，23℃)和3nM[5′-³²P]标记的DNA，在存在或缺乏1mM PbOAc的条件下23℃保温5分钟。符号Pre代表108核苷酸前体DNA(SEQ ID NO 4)；Clv代表28核苷酸5′裂解产物(SEQ ID NO 5)；M代表引物3a(SEQ IDNO 6)，相应于5′裂解产物的长度。

28核苷酸5′裂解产物(Clv)显示优选具有序列5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3′，其中“N”代表在3′端具有额外2′，3′-环形磷酸的腺嘌呤核糖核苷酸(SEQ ID NO5)。在另外的实施方案中，“N”代表在分子3′端具有额外2′或3′磷酸的腺嘌呤核糖核苷酸。

在图2中，“GO”泳道“Pre”带包含各包括50个随机核苷酸的108核苷酸前体DNA样品。因此，任一给定的“Pre”样品含许多前体DNA，各样品很可能不同于以前的和随后的样品。“G1”到“G5”泳道含为催化性DNA分子不断富集的“Pre”带，但还含有大量不同DNA序列(即，在50核苷酸随机区有区别)。这些与“G5 Pre”DNA不同的序列样品在图3中提供。

鸟枪法克隆技术用于从G5群体中分离个体然后测定了20个这类亚克隆的完整核苷酸序列(见图3)。(例如，也见Cadwell和Joyce在PCR方法和应用2：28-33(1992)；Cadwell和Joyce， PCR方法和应用3(增刊)：S136-S140(1994))。在20个序列中，5个是单一的，2个出现2次，1个出现3次，1个出现8次。所有这些独立的变异体在DNA起始库的随机的50核苷酸区域内具有共同的序列成份。它们都含有2个推测的模板区，一个与刚好位于裂解位点上游的核苷酸链具有互补性，另一个与位于至少四个核苷酸下游的核苷酸具有互补性。在这两个假定的模板区之间有一个1-11核苷酸的可变区，接着是固定序列5′-AGCG-3′，然后是3-8个核苷酸的第二可变区，最后是固定序列5′-CG-3′或5′-CGA-3′。位于两个假定模板区外侧的核苷酸在序列和长度上高度可变。在所有测序的亚克隆中，与50个起始随机化核苷酸相应的区域保持总共50核苷酸的长度。

图3显示了5轮选择后从群体中分离的个体变异体的序列对比。固定的底物区(5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC-3′或5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3′，其是N代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ IDNO 13)在顶部显示，靶核糖腺苷酸用倒三角限定。在推定的碱基配对相互作用中通常涉及的底物核苷酸以垂直棒表示。与50个起始的随机核苷酸相应的序列与底物区进行反向序列对比。所有变异体3′端均为固定序列5′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′(SEQ ID NO 1)(“引物位点”；未显示)。推测与底物区形成碱基对的起始随机区域内的核苷酸在图右侧和左侧表示；具有酶活性的DNA分子推测的碱基对形成(或底物结合)区分别位于显示的各序列的盒内。推定的催化性区域内的高度保守核苷酸在2个盒形柱中表示。

尽管预期其它资料可能对构建催化区的有意义的二级结构模型有用，但我们注意到，与锤头和发夹核酶一样，具有酶活性的DNA分子的催化区似乎含一个保守核心，两侧为2个通过碱基对相互作用与底物作用的底物结合区(或识别区)。与锤头和发夹核酶相似，催化性DNA似乎也需要碱基配对的两个区域之间的未配对底物核苷酸短链(在本例中是5′-GGA-3′)。

有趣的是还注意到9个不同变异体中每个都表现出与底物区有不同方式的推定互补性。在某些例子中，碱基配对是连续的，而在其它例子中被一个或多个非互补性配对打断。一般的倾向似乎是与裂解位点上游的核苷酸形成的相互作用比下游更牢固。结合研究和定点诱变分析使我们获得了进一步的见解并进一步证实了该推测。

为了对催化功能所需的序列获得进一步的了解，在本文描述的选择条件下试验并评估了9个变异体中6个的自我裂解活性(见图3)。意料之中的是，在20个亚克隆中的8个中出现的序列证明反应性最强，第一级速率常数为1.4min^-1。所有研究的变异体在自我裂解试验中具有活性且产生相应于靶RNA磷酸酯裂解的单个5′-标记的产物。

在各种反应条件下进一步分析显性亚克隆。其自我裂解活性取决于Pb²⁺，但如果从反应混合物中省去Mg²⁺却不受影响。也需要单价阳离子，可用Na⁺或K⁺来满足。在0-1.0M的范围内随单价阳离子浓度的增加反应速率呈线性增加(r＝0.998)。可影响反应的其它可变因素如pH，温度和其它二价金属的存在在进一步评价中。

实施例2

材料和方法

A. 寡核苷酸和寡核苷酸类似物

从Operon Technologies购买了合成的DNA和DNA类似物。使用模板5′-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA-3′(SEQ IDNO 9)，按以前所述(Breaker，Banerji，和Joyce，生物化学33：11980-11986(1994))，经逆转录酶催化延伸5′-pTCACTATrA-3′(或5′-pTCACTATN-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ ID NO 8)制备19核苷酸底物，5′-pTCACTATrAGGAAGAGATGG-3′(或5′-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)。引物3，5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA-3′(或5′GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3′，其中“N”代表腺嘌呤核苷酸)(SEQ ID NO 6)，用[γ-³²P]ATP和T4多核苷酸激酶进行5′标记(引物3a)或用[γ-S]ATP和T4多核苷酸激酶使5′端硫磷酸化并随后用N-碘乙酰-N′-生物素己二胺进行生物素标记(引物3b)。

B.DNA库制备

使用合成寡聚体5′-GTGCCAAGCTTACCG-N₅₀-GTCGCCATCTCTTCC-3′(SEQ ID NO 4)，其中N是G，A，T和C的等摩尔混合物，经PCR制备DNA起始库。一个2ml的PCR，含500pmole的随机寡聚体，1000pmole引物1(5′-GTGCCAAGCTTACCG-3′，SEQ ID NO 10)，500pmole引物2(5′-CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3′，SEQ ID NO 11)，500pmole引物3b，10μCi[α-³²P]dATP和0.2Uμl^-1 Taq DNA聚合酶，在50mM KCl，1.5mM MgCl₂，10mM Tris-HCl(pH 8.3，23℃)，0.01％明胶，各0.2mM的dNTP存在的条件下92℃保温1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟，然后92℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟进行5个循环。所得的混合物用酚提取2次，用氯仿/异戊醇提取1次，经过用乙醇沉淀分离DNA。

C. 体外选择

DNA起始库重悬于500μl缓冲液A(1M NaCl和50mM HEPES(pH 7.0，23℃))中并重复通过链霉抗生物素蛋白柱(AffiniTip Strep20，Genosys，The Woodlands，TX)。用5个100μl体积的缓冲液A洗柱，接着用5个100μl体积的0.2N NaOH洗柱，然后用5个100μl体积的缓冲液B(0.5M NaCl，0.5M KCl，50mM MgCl₂，50mMHEPES(pH 7.0，23℃))平衡。在1小时内用3个20μl体积的加有1mM PbOAc的缓冲液B洗脱固定的单链DNA。全部固定和洗脱过程在23℃进行。在等体积的缓冲液C(50mM HEPES(pH 7.0，23℃)，80mM EDTA)中收集洗脱液并用乙醇沉淀DNA。

所得的DNA在含20pmole引物1，20pmole引物2，0.05Uμl^-1 Taq聚合酶，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，10mM Tris-HCl(pH8.3，23℃)，0.01％凝胶和各0.2mM的dNTP的100μl PCR以92℃ 10秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒循环30次进行扩增。反应产物用酚提取2次并用氯仿/异戊醇提取一次，经过用乙醇沉淀回收DNA。大约4pmole的扩增的DNA加入含100pmole引物1，100pmole引物3b，20μCi[α-³²P]dATP，0.1Uμl^-1Taq聚合酶，总体积为200μl的第二个嵌套PCR中，在92℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟扩增10个循环。PCR产物再次提取和沉淀，所得的DNA重悬于50μl缓冲液A中，然后用于开始下一轮选择。

按上面所述进行第二和第三轮，除了在第三轮嵌套式PCR在100-μl体积中进行。在第4轮中，加入Pb²⁺后洗脱时间减少到20分钟(2个20-μl洗脱体积)，回收DNA的一半用于仅含15个温度循环的第一PCR。在第4轮中，洗脱时间减少到1分钟(2个20-μl洗脱体积)，仅仅1/4的回收DNA用于包含15次温度循环的第一PCR。亚克隆和测序第5轮后获得的DNA，如以前所述(Tsang和Joyce，生物化学33：5966-5973(1994))。

D. 催化性DNA的动力学分析

在如上所述的条件下，在含10pmole引物3a，0.5pmole输入DNA和0.1Uμl^-1Taq聚合酶的25μl反应混合物中以92℃ 1分钟，50℃ 1分钟和72℃ 1分钟循环10次进行不对称PCR，用5′-³²P标记制备DNA群体和各种亚克隆个体。所得的[5′-³²P]标记的扩增产物在10％聚丙烯酰胺/8M凝胶中经电泳纯化。

DNA在缓冲液B中预保温10分钟后进行自我裂解试验。经过加入终浓度1mM的PbOAc开始反应，经过加入等体积的缓冲液C终止反应。经过在10％聚丙烯酰胺/8M凝胶中电泳分离反应产物。在包含50μgml^-1BSA以防止物质吸附到管壁上的缓冲液B中进行多个转换条件下的动力学试验。底物和酶分子分别在缺乏Pb²⁺的反应缓冲液中预保温5分钟，然后混合，并经过加入PbOAc至终浓度为1mM起动反应。

实施例3

进行分子间裂解的脱氧核酶的进化

A. 转变成分子间形式

根据所研究的变异体催化区和底物区之间预测的碱基对相互作用的可变方式，有理由认为直接将DNA催化的反应转变为分子间方式。在该转变中，我们希望简化催化剂的2个底物结合区以便能与底物各形成78个碱基对的不间断链。另外，我们希望提供最小的底物，限制到2个碱基对区和间隔序列5′-GGA-3′(图4A)。

图4A和4B显示了在进行催化转换的分子间反应中DNA催化的RNA磷酯裂解。图4A是在19聚体底物和38聚体DNA酶之间形成的复合物的图示。该底物含单个腺嘌呤核糖核苷酸(“rA”或“N”，靠近箭头)，两侧是脱氧核糖核苷酸。合成的DNA酶是在图3中所示的最常出现的变异体的38核苷酸部分。位于推断的催化区内的高度保守的核苷酸是“盒内”。如图所示，一个保守序列是“AGCG”，另一个是“CG”(按5′→3′方向阅读)。

图4B显示了用于测定在与体外选择中所用的相同的条件下DNA催化裂解[5′-³²P]-标记的底物的K_m(负斜率)和V_max(y-截距)的Eadie-Hofstee布点图。测定了在含5mM DNA酶和0.125，0.5，1，2，或4μM底物的反应中裂解的起始速率。

在设计催化区时，我们主要依赖于大多数反应变异体的组合物，其5′端的2个核苷酸和在3′端的11个核苷酸被截断。位于2个模板区之间的15个核苷酸未变化，且单个核苷酸插入3′模板区形成能与底物形成碱基对的核苷酸的连续链。底物简化成序列5′- TCACTATrA·GGA AGAGATGG-3′(或5′- TCACTATN·GGA AGAGATGG-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ ID NO 12)，划线核苷酸相应于涉及与催化性DNA分子进行碱基配对的2个区。

采用38聚体催化性DNA分子(催化剂)，完全由脱氧核糖核苷酸和含包埋于其它全部为DNA序列中的单个核糖核苷酸的19聚体底物组成的简化的反应系统允许以快速转换有效地由DNA催化磷酯裂解。在存在0.01μM催化剂和1μM底物时保温90分钟后，46％的底物裂解，相应于催化剂的46次转换。进行了该反应的初步动力学分析，在多个转换条件下进行评价。DNA催化剂表现出Michaelis-Menten动力学，k_cat和K_m的值分别为1min^-1和2μM(见图4B)。K_m的值比根据Watson-Crick相互作用预期的催化剂和底物间的解离常数大得多。在相同反应条件(但缺乏催化剂)下保温底物，获得4×10^-6min^-1的k_uncat值。这与在0.5mM Pb²⁺存在下更易变的1-硝基苯基-1，2-丙二醇在pH 7.0和37℃下的水解的报道值5×10^-3分^-1一致(Breslow和Huang，美国国家科学院院报88：4080-4083(1991))。

现在推测磷酸酯裂解反应经过包括邻位磷酸上的核糖核苷酸2′-羟基攻击，产生具有末端2′(3′)-环磷酸的5′产物和具有末端5′羟基的3′产物的水解机制进行。在该机制的证据中，3′-裂解产物用T4多核苷酸激酶和[γ-³²P]ATP有效磷酸化，与游离5′-羟基的可用率一致(资料未显示)。

B. 讨论

5轮体外选择后，获得催化靶RNA磷酯有效进行Pb²⁺-依赖性裂解的单链DNA分子的群体。根据从这一群体中分离的代表性个体的共同特征，构建了催化区和底物区的简化形式，用于证实在分子间环境中的快速催化的转化。因此，38聚体催化区提供了DNA酶(或可称为“脱氧核酶”)的一个例子。

至于该分子作为一种酶，根据它是一种能加速在以快速转换并遵守Michaelis-Menten动力学的反应中的化学转化的信息大分子的事实，不可能满足构成一种酶的普遍接受的概念。有人可能坚持认为酶从定义上讲必须是一种多肽。然而，如果接受了RNA酶的概念，那么似乎有理由采纳关于DNA酶的相似观点。考虑到不论我们能多快地从随机序列DNA组中产生该分子，我们仍会漏过在不久的将来会出现的合成DNA酶的许多其它例子。

选择RNA磷酸酯的Pb²⁺依赖性裂解作为DNA催化的起始靶是因为它是一种简单地需要协同的Pb²⁺-羟基的合适位置以利于与裂解位点相邻的2′羟基脱质子的直接反应。(例如，见Pan等， The RNA World，Gesteland和Atkins(编辑)，pp 271-302，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993))。已知Pb²⁺与嘌呤的N7位，鸟嘌呤的O6位，尿嘧啶的O4位，胞嘧啶的N3位配价(Brown等，自然303：543-546(1993))。因此，与RNA相比DNA在糖组成和构象上的区别似乎不可能防止DNA形成完全限定的Pb²⁺结合袋。

选择含有在其它均为DNA序列内的一个单一的核糖核苷酸的底物，因为它提供了唯一有用的裂解位点并保证任何所得的催化活性仅对DNA有用。底物识别似乎取决于催化剂和底物之间的碱基配对相互作用的2个区。然而，位于这两个区域之间的未配对的底物核苷酸5′-GGA-3′可能在底物识别，金属配价或催化功能的其它方面中起重要作用。

进一步预期全部RNA分子，其它RNA-DNA组合物，含一个或多个核苷酸类似物的分子是可接受的底物。如本文所公开的，本文描述的体外进化方法可成功地用于产生具有所需特异性的具有酶活性的DNA分子，对这些系统的进一步分析在下文提供。

另外，使用本文描述的方法测定酶和底物之间推定碱基配对相互作用是否对序列是可概括的研究取得了进展。本文公开的Pb²⁺依赖性脱氧核酶也可认为是具有DNA结构和酶特征的模型化合物。

本说明书用于迅速形成DNA催化剂的方法具有相当大的普遍性，允许我们利用其它辅助因子触发附着到有效催化区的靶连接的裂解。关于这点，在生理条件下特异性裂解靶RNA的Mg²⁺-依赖性DNA酶的形成是所感兴趣的，正如形成在其它阳离子存在的条件下发挥功能的DNA酶(见实施例4)。该分子提供了用于特异性灭活靶mRNA的传统反义和核酶研究的另一选择。

因此，DNA与RNA和蛋白质一起加入了能表现出酶活性的生物学大分子的行列。DNA催化能力的完全程度有待于开发，但这些开发应根据诸如本研究所用的体外选择方法迅速进行。

与其它大分子催化剂相比，DNA酶具有一些重要的优势。首先，在大多数实验室拥有自动DNA合成仪且DNA磷酰亚胺的价格十分便宜的时代，它们易于制备。第二，它们是非常稳定的化合物，尤其是与RNA相比，从而利于其在生物物理研究中的应用。第三，我们预期它们可适应于在目前利用无RNA裂解活性的反义DNA的治疗应用。体外选择应使用DNA类似物进行，包括具有核酸酶抗性的化合物，如含硫代磷酸酯的DNA，只要这些类似物可以脱氧核苷酸5′-三磷酸的形式制备且作为DNA依赖性DNA聚合酶的底物可接受。最后，DNA酶为我们了解大分子催化功能的基础提供了一个新的窗口。例如，有趣的是对催化相同化学转化的以蛋白质，RNA和DNA为基础的酶进行比较分析。

实施例4

催化生DNA的其它家族

基本上按上面实施例2.B所述经PCR制备DNA的起始库，除了DNA的起始库包含含有40个随机核苷酸的分子。因此，本文描述的DNA起始库使用合成寡聚体5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TATrA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N₄₀GT GAC GGT AAG CTT GGCAC 3′(SEQ ID NO 23)，其中N是G，A，T和C的等摩尔混合物，经PCR制备，并选择具有裂解靶rA后磷酯之能力的DNA分子(也见图6A)。

在Pb²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺，或Mg²⁺存在的条件下进行选择性扩增，从而产生催化性DNA分子的至少4个“家族”。如图5所示，在各种阳离子存在的条件下产生显示特异性活性的催化性DNA分子。

图5是显示聚丙烯酰胺凝胶的照片，证实了四个家族的选定催化性DNA的特异性核酸内切酶活性。以并列的方式重复Pb²⁺-依赖性家族的分子的选择作为对照。在各组的3个泳道中，第一泳道显示在缺乏金属阳离子的条件下选定群体缺乏活性，第二泳道显示在金属阳离子存在的条件下观察到的活性，第三泳道显示起始库(GO)缺乏活性。目前观察到的反应活性顺序是Pb²⁺＞Zn²⁺＞Mn²⁺＞Mg²⁺，反应了相应金属氢氧化物的pKa。

在预选的二价阳离子存在的条件下，经过5(G5)或6(G6)轮选择性扩增后，获得所需核酸内切酶活性。在Mg²⁺存在的条件下，下面描述的选择性扩增试图作为一个例子。

按照上文实施例2描述的方法进行6轮体外选择性扩增，除了使用的二价金属是1mM Mg²⁺而不是1mM Pb²⁺(也见Breaker和Joyce，Chem.& Biol.1：223-229(1994)，本文引用以供参考，它描述了基本上相同的方法)。

第6轮后分离单个克隆，测定24个这些克隆的核苷酸序列，全部序列以5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGATGG CGA CA(SEQ ID NO 23，从位置1至44)开始并以CGG TAAGCT TGG CAC 3′(SEQ ID NO 23，从位置93到107)结尾。

在起始库中部相应于TCTC N₄₀ GTGA(SEQ ID NO 23，从位置45至92)的片段变化如下：

(13)CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TTG

TTA GTA T(SEQ ID NO 24)

(5) TCT C TT CAG CGA TGC ACG CTT GTT TTA ATG TTG CAC CCA TGT

TAG TGA(SEQ ID NO 25)

(2) TCT CAT CAG CGA TTG AAC CAC TTG GTG GAC AGA CCC ATG TTA

GTG A(SEQ ID NO 26)

(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG TTC TTG

TTA GTA T(SEQ ID NO 27)

(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TCG

TTA GTA T(SEQ ID NO 28)

(1) TCT CAG ACT TAG TCC ATC ACA CTC TGT GCA TAT GCC TGC TTG

ATG TGA(SEQ ID NO 29)

(1) -CT CTC ATC TGC TAG CAC GCT CGA ATA GTG TCA GTC GAT GTG A

(SEQ ID NO 30).

圆括号内的起始数表示具有特定序列的克隆号。注意一些突变(以粗体字标明)出现在不同于开始任选的那些核苷酸位置。

上面列出的第二个序列(即SEQ ID NO 25)在24个克隆的5个中出现，选择它作为用于进一步研究的先导(即，原始)化合物。在1mM浓度的各种二价金属和1M NaCl存在的条件下在pH 7.0和23℃下测量其裂解活性：

金属 k_obs(min^-1)

无未作

Mg²⁺ 2.3×10^-3

Mn²⁺ 6.8×10^-3

Zn²⁺ 4.2×10^-2

Pb²⁺ 1.1×10^-2

因此，在所有4种二价金属存在的条件下，该先导化合物具有活性，即使在Mg²⁺存在的条件下选择活性。相反，在Mn²⁺，Zn²⁺或Pb²⁺存在的条件下选择活性的DNA分子不显示出在存在Mg²⁺时的任何活性。

另外，在Mg²⁺存在下，经过6轮体外选择后获得的DNA群体，当作为全部含硫代磷酸DNA类似物制备时，显示出观察速率为～10^-3min^-1的Mg²⁺依赖性裂解活性。以酶法制备含硫代磷酸酯的类似物以便在各立体中心具有R_P构象。与未修饰的DNA相比该化合物对细胞核酸酶降解具有相对的抗性。

先导化合物在40个核苷酸位置(下面划线)再次任选，以15％的频率(每3个可能的碱基取代有5％的概率)导入突变。对再次任选的群体再进行7轮体外选择。在最后四轮中，在1mM Pb²⁺存在下有反应性的分子从群体中取出，然后剩余物在1mM Mg²⁺存在下进行竞争性反应。7轮后分离出单个克隆，测定14个这些克隆的核苷酸序列。所有这些序列以5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAGAGA TGG CGA CAT CTC(SEQ ID NO 23，从位置1到48)开始并以GTG ACG GTA AGC TTG GCA C 3′(SEQ ID NO 23，从位置89至107)结束。

在中部，相应于40个部分任选的位置(N₄₀，SEQ ID NO 23，从位置49到88)的片段变化如下：

(4)TAC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG GGT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 31)

(2)ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT CAA TGT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 32)

(2)TTC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 33)

(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TGC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 34)

(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG CGT TAC ACC CAT GTT G

(SEQ ID NO 35)

(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 36)

(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 37)

(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT TAG TGT TGC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 38)

(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CAT TAC ACC CAT GTT A

(SEQ ID NO 39).

在圆括号中的数字表示具有特定序列的克隆号。以黑体字表示的核苷酸是与先导序列相比有区别的核苷酸。

对这些克隆的裂解活性进行了正式的分析。该群体作为一个整体表现出观察到的速率为～10^-2min^-1的Mg²⁺依赖性裂解活性，与在Pb²⁺存在下的水平相当。

图6A和6B分别提供了“祖先”催化性DNA分子和经本文所公开的方法进行选择性扩增获得的7个催化性DNA分子之一的2维图示。图6A显示了起始库的一个举例性分子，显示以SEQ ID NO：23代表的分子的总构象。如图所示，各种互补性核苷酸位于随机(N₄₀)区的两侧。

图6B是经本文描述的方法产生的一个Mg²⁺依赖性催化性DNA分子(或DNA酶)的图示。底物核酸中核糖核苷酸的位置以箭头表示。(所示的分子包括本文以SEQ ID NO 25鉴定的序列，以及SEQ ID NO23的“开始”和“结尾”的序列)。

经过本文所公开的体外进化后每个上述“家族”的核酸内切酶活性继续增强，因此预期使用本文所公开的指导思想可成功地产生所需特异性不断增强的具有酶活性的DNA分子。

实施例5

较大RNA序列的裂解

作为上述内容的延伸，我们形成了裂解全部RNA底物而不是如上所示的包埋于其它全部为DNA中的单个核糖核苷酸的底物的DNA酶(也见R.R.Breaker & G.F.Joyce， Chem.& Biol.1：223-229(1994)；R.R.Breaker和G.F.Joyce， Chem.& Biol.2：655-660(1995))。作为靶序列，我们选择了HIV-1 RNA U5LTR区内12个高度保守的核苷酸链，具有序列5′GUAACUAGAGAU 3′(SEQ ID NO 49)。

按照上面实施例所述的方法，我们产生了具有下列组成的1014个DNA分子的一组：

5′-GGAAAA r(GUAACUAGAGAU)GGAAGAGATGGCGAC N₅₀

CGGTAAGCTTGGCAC-3′(SEQ ID NO 50)，

其中N是脱氧核糖核苷酸G，A，T和C的等摩尔混合物，鉴定为“r(GUAACUAGAGAU)”的序列由核糖核苷酸组成。(可任选的是，可改变起始5′核苷酸序列，例如，在5′端核糖核苷酸位置前的序列中加入一个额外的dA残基，从而导致起始序列阅读“GGAAAAA”并使SEQID NO 50为99个核苷酸长。很清楚，这并不是为了按本文详细所述改造特定具有酶活性的DNA分子可做出的修饰的唯一的例子。)

选择由此产生的具有酶活性的DNA分子裂解位于包埋的RNA靶序列内的磷酯的能力。根据在10mM Mg²⁺存在时pH 7.5和37℃下具有酶活性的DNA分子的活性进行10轮体外选择性扩增。在选择过程中，对“优选的”裂解位点以及对在各优选的位点裂解的“最佳”催化剂存在竞争。2个位点和2个家族的催化剂表现出具有最有效的裂解能力(见图7)。

图7显示了基本上按本文所述进行的10轮体外选择性扩增的一些结果。如图所示，2个位点和2个家族的催化剂表现出对靶序列的最有效的裂解。裂解条件基本上如图7所示，即，10mM Mg²⁺，pH 7.5和37℃；显示了反应进行2小时后收集的资料。裂解率(％)以对代数(这里是0到10)的布点图表示。能在底物所示位点裂解靶序列的催化性DNA分子的代数/能力(prevalence)以垂直棒表示，在G↓UAACUAGAGAU裂解以带条纹的棒表示，在GUAACUA↓GAGAU位的裂解以空白(略带阴影)棒表示。在本文图7中，箭头(↓)表示发生裂解的2个相邻核苷酸之间的位点。

克隆第8和第10轮选择性扩增后获得的群体的各个体。然后测定第8轮的29个个体和第10轮的32个个体的核苷酸序列(分别见表2和3)。

在表2和3中开头的“核苷酸序列”表示各鉴定的克隆相应于起始库任选的50个核苷酸(即N₅₀)的部分；因此，给定克隆的完整核苷酸序列一般包括“N₅₀”片段之前，之后和包含它的核苷酸序列，假定底物序列已附着且未发生自我裂解。例如，一个(非自我裂解的)克隆的完整序列一般包括SEQ ID NO 50的1-33号残基，随后是代表任选的N₅₀区的残基，随后是SEQ ID NO 50的84-98号残基或SEQ IDNO 51的1-34号残基，随后是代表任选的N₅₀区的残基，随后是SEQID NO 51的85-89号残基。然而，据信各克隆N₅₀(或N₄₀)区(或其部分)在测定特定具有酶活性的DNA分子的特异性和/或活性中特别重要。在底物和DNA酶是分离的分子的反应中这是具体证据(例如，见图8和9)。

第8或第10轮后获得的个体的克隆号分别命名为8-x或10-x。SEQ ID NOS也被列出且相应于各克隆的“N₅₀”区。

表2

第8轮扩增后克隆的个体

克隆号	SEQID NO	″N₅₀″核苷酸序列(5′-3′)
克隆号	SEQID NO	″N₅₀″核苷酸序列(5′-3′)	8-28-48-5¹8-148-17²8-38-68-88-108-228-118-218-128-138-238-40	52535455565758596061626364656667	CCA ATA GTG CTA CTG TGT ATC TCA ATG CTG GAA ACA CGG GTTATC TCC CGCCA AAA CAG TGG AGC ATT ATA TCT ACT CCA CAA AGA CCA CTTTTC TCC CGATC CGT ACT AGC ATG CAG ACA GTC TGT CTG CTT TTT CAT TACTCA CTC CCCAA TTC ATG ATG ACC AAC TCT GTC AAC ACG CGA ACT TTT AACACT GGC ACTT CCA CCT TCC GAG CCG GAC GAA GTT ACT TTT TAT CAC ACTACG TATTGGGC AAG AGA TGG CAT ATA TTC AGG TAA CTG TGG AGA TAC CCTGTC TGC CACTA GAC CAT TCA CGT TTA CCA AGC TAT GGT AAG AAC TAG AATCAC GCG TACGT ACA CGT GGA AAA GCT ATA AGT CAA GTT CTC ATC ATG TACCTG ACC GCCAG TGA TAC ATG AGT GCA CCG CTA CGA CTA AGT CTG TAA CTTATT CTA CCACC GAA TTA AAC TAC CGA ATA GTG TGG TTT CTA TGC TTC TTCTTC CCT GACAG GTA GAT ATA ATG CGT CAC CGT GCT TAC ACT CGT TTT ATTAGT ATG TCCCC TAC AAC ACC ACT GGG CCC AAT TAG ATT AAC GCT ATT TTATAA CTC GCCA AAC GGT TAT AAG ACT GAA AAC TCA ATC AAT AGC CCA ATCCTC GCC CCAC ATG TAT ACC TAA GAA ATT GGT CCC GTA GAC GTC ACA GACTTA CGC CACAC AAC GAA AAC AAT CTT CCT TGG CAT ACT GGG GAG AAA GTCTGT TGT CCCAC ACG AAC ATG TCC ATT AAA TGG CAT TCC GTT TTT CGT TCTACA TAT GC

8-248-268-278-288-298-348-358-368-378-39

68697071727374757677

CAG AAC GAG GGT CTT GTA AGA CTA CAC CTC CTC AGT GAC AATAAT CCT GCAC TAC AGC CTG ATA TAT ATG AAG AAC AGG CAA CAA GCT TATGCA CTG GGGG TAC ATT TAT GAT TCT CTT ATA AAG AGA ATA TCG TAC TCTTTT CCC CACCA AAG TAC ATT CCA ACC CCT TAT ACG TGA AAC TTC CAG TAGTTT CCT ACTT GAA GAT CCT CAT AAG ACG ATT AAA CAA TCC ACT GGA TATAAT CCG GACGA ATA GTG TCC ATG ATT ACA CCA ATA ACT GCC TGC CTA TCATGT TTA TGCCA AGA GAG TAT CGG ATA CAC TTG GAA CAT AGC TAA CTC GAACTG TAC CACCA CTG ATA AAT AGG TAA CTG TCT CAT ATC TGC CAA TCA TATGCC GTACCC AAA TTA TAA ACA ATT TAA CAC AAG CAA AAG GAG GTT CATTGC TCC GCCAA TAA ACT GGT GCT AAA CCT AAT ACC TTG TAT CCA AGT TATCCT CCC CC

¹与10-4，10-40相同

²与8-20，8-32，8-38，10-1，10-34相同，1突变成10-11；3突变成10-29

表3

第10轮扩增后克隆的个体

克隆号	SEQID NO	″N₅₀″核苷酸序列(5′-3′)
克隆号	SEQID NO	″N₅₀″核苷酸序列(5′-3′)	10-3³10-1010-1210-14	78798081	CCG AAT GAC ATC CGT AGT GGA ACC TTG CTT TTG ACA CTA AGAAGC TAC ACCCA TAA CAA ATA CCA TAG TAA AGA TCT GCA TTA TAT TAT ATCGGT CCA CCCAG AAC AAA GAT CAG TAG CTA AAC ATA TGG TAC AAA CAT ACCATC TCG CACCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTT CCC TGC TTG GCAACG ACA C

10-1510-1910-3910-2310-27⁴10-3110-1810-2010-610-710-810-1610-2110-2410-2810-3310-3510-3610-37

828384858687888990919293949596979899100

CTC CCT ACG TTA CAC CAG CGG TAC GAA TTT TCC ACG AGA GGTAAT CCG CACGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTT TTC CCCCGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTT TAG CCT ACC ATAGTC CGG TCCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTT TCC CTG CTT GAATTG TACCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTT TCC CTG CTT GACCTG TTA CGACCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTT CCC TGC TTG GAACGA CACCAT GGC TTA ATC ATC CTC AAT AGA AGA CTA CAA GTC GAA TATGTC CCC CCCAA CAG AGC GAG TAT CAC CCC CTG TCA ATA GTC GTA TGA AACATT GGG CCTAC CGA CAA GGG GAA TTA AAA GCT AGC TGG TTA TGC AAC CCTTTT CGC ACTC GAA ACA GTG ATA TTC TGA ACA AAC GGG TAC TAC GTG TTCAGC CCC CCCA ATA ACG TAA CCC GGT TAG ATA AGC ACT TAG CTA AGA TGTTTA TCC TGCAA TAC AAT CGG TAC GAA TCC AGA AAC ATA ACG TTG TTT CAGAAT GGT CCGCA ACA ACA AGA ACC AAG TTA CAT ACA CGT TCA TCT ATA CTGAAC CCC CACCT TTG AGT TCC TAA ATG CCG CAC GGT AAG CTT GGC ACA CTTTGA CTG TACAA AGA TCT CAC TTT GGA AAT GCG AAA TAT GTA TAT TCG CCCTGT CTG CCCA CGT AGA ATT ATC TGA TTT ATA ACA TAA CGC AGG ATA ACTCTC GCC CACAC AAG AAA GTG TCG TCT CCA GAT ATT TGA GTA CAA GGA ACTACG CCCCAT GAA GAA ATA GGA CAT TCT ACA GGC TGG ACC GTT ACT ATGCCT GTA GGCAT AGG ATA ATC ATG GCG ATG CTT ATG ACG TGT ACA TCT ATACCT T

10-38

101

CAG ATG ATC TTC CTT TAA AGA CTA CCC TTT AAA GAA ACA TAAGGT ACC CC

³1突变成10-5

⁴1突变成10-30

随后测量了各克隆的自我裂解活性。发现克隆8-5，8-17和10-3在5′GUAACU↓AGAGAU 3′位点有效裂解，而发现克隆10-14，10-19和10-27在5′G↓UAACUAGAGAU 3′位有效裂解。当分子的RNA部分延长为序列5′GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3′(SEQID NO 51的残基号1-24)时，克隆8-17，10-14和10-27达到全部活性，而克隆8-5，10-3和10-19显示出活性减小。随后，发现克隆10-23在包含延伸RNA区的自我裂解反应中表现出高水平的活性。

还应注意到，在该事件中，相关领域的技术人员不会预料到这种情况，即根据本发明说明书的教导构建的多核苷酸分子“N₅₀”片段之前和之后的核苷酸序列可以各种方式改变以产生特定特异性的具有酶活性的DNA分子。例如，尽管SEQ ID NO 51的残基号1-24在本文以RNA核苷酸描述，但它们可任选包含DNA，RNA或其组合。(因此，可较容易地改变SEQ ID NO 51，以便核苷酸残基号1-7包含DNA，残基号8-19包含RNA，残基号20-99包含DNA，等)。同样，“N₅₀”区域之后的核苷酸可包含RNA，DNA或其组合。按本文所述，也可改变“N₅₀”(或“N₄₀”-见实施例4)之前和之后的区域长度。而且，N₅₀或N₄₀区域之前和/或之后的序列可在其全长上缩短，延伸或缺失。

而且，如上所述，我们选择HIV-1 RNA的特定区域作为本实施例描述的方法中的靶序列；该序列不是可用作靶的唯一序列。很明显，相关领域的技术人员可按照本文的教导构建和设计对其它靶序列具有特异性的具有酶活性的DNA分子。如本文所述，该靶序列可构建或插入包含DNA，RNA或其组合的较大序列中，如SEQ ID NO 50和51所示。

自我裂解反应经过将酶和底物区分成分离的分子易于转变成分子间裂解反应。选择克隆8-17和10-23作为原型分子。两者都在以多个转换进行的反应中作为裂解分离的纯RNA底物的DNA酶(图8)。该底物结合臂在分开裂解位点的未配对核苷酸的每一侧随后减少到7个碱基对(图9)。

图8显示了本发明的2个催化性DNA分子克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位点，和转换率。反应条件如图所示，即10mM Mg²⁺，pH 7.5和37℃。鉴定为克隆8-17的DNA酶在左侧显示，RNA底物的裂解位点用箭头表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-与DNA酶分离(即，显示分子间裂解)-如此标记。同样，本文以10-23鉴定的DNA酶在右侧显示，RNA底物的裂解位点用箭头表示。另外，显示了该底物序列。对于8-17酶，转换率大约为0.6hr^-1，对于10-23酶，转换率大约为1hr^-1。

如图8所示，能裂解分离的底物分子的克隆8-17催化性DNA分子的核苷酸序列如下：5′-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT-3′(SEQ ID NO 56的残基号1-34)。在该图中，能裂解分离的底物分子的克隆10-23催化性DNA分子的核苷酸序列如下：5′-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′(SEQ IDNO 85的残基号3-33)。

图9进一步显示了本发明的2个催化性DNA分子的克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位点，和转换率。反应条件如图所示，即10mM Mg²⁺，pH 7.5和37℃。如图8所示，以克隆8-17鉴定的DNA酶在左侧显示，RNA底物的裂解位点以箭头表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-与DNA酶分离(即，显示分子间裂解)-如图进行标记。同样，本文以10-23鉴定的DNA酶在右侧显示，RNA底物裂解位点以箭头表示。另外，显示了底物序列。对于8-17酶，k_obs为大约0.002min^-1；对于10-23酶，k_obs值大约为0.01min^-1。

如图9所示，能裂解分离的底物分子的克隆8-17催化性DNA分子的核苷酸序列如下：

5′-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3′(SEQ IDNO 56的残基号4-30)。在相同图中，能裂解分离的底物分子的克隆10-23催化性DNA分子的核苷酸序列如下：5′-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′(SEQ ID NO 85的残基号5-33。在5′端用“CTA”取代“TTG”)。

裂解RNA的DNA酶的催化速率还有待充分优化。如上面所公开及如在前面研究中所报道的，我们已经过部分任选原型分子并进行多轮选择性扩增能增加催化速率。然而，我们发现，在pH 7.5和37℃测量时，对于8-17和10-23DNA酶，Mg²⁺的K_m分别为大约5mM和2mM，这当然与细胞内条件相容。

上面说明书，包括具体实施方案和实施例是试图说明本发明而不是用于限制。在不背离本发明的实质和范围的条件下可产生许多其它的变化和修改。

序列表

(1)一般信息：

(I)申请人：The Scripps Research Institute

(ii)发明题目：具有酶活性的DNA分子

(iii)序列数：101

(iv)联系地址：

(A)联系人：The Scripps Research Institute

(B)街道：10666 North Torrey Pines Road，TPC-8

(C)城市：La Jolla

(D)州：加利福利亚

(E)国家：美国

(F)邮编：92037

(v)计算机可读形式

(A)媒体类型：Floppy软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25

(vi)一般申请资料：

(A)申请号：PCT/US95/

(B)申请日：01-12-1995

(C)分类：

(vii)优先申请资料：

(A)申请号：US 08/472,194

(B)申请日：07-6-1995

(vii)优先申请资料：

(A)申请号：US 08/349,023

(B)申请日：02-12-1994

(viii)委托/代理人资料：

(A)姓名：Logan，April C.

(B)登记号：33,950

(C)参考/档案号：463.2PC

(ix)电讯资料：

(A)电话：(619)554-2937

(B)电传：(619)554-6312

(2)SEQ ID NO：1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

CGGTAAGCTT GGCAC 15

(2)SEQ ID NO：2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(8，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

TCACTATNAG GAAGAGATGG 20

(2)SEQ ID NO：3资料：

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

ACACATCTCT GAAGTAGCGC CGCCGTATAG TGACGCTA 38

(2)SEQ ID NO：4资料：

(i)序列特征：

(A)长度：80个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

GTGCCAAGCT TACCGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60

NNNNNGTCGC CATCTCTTCC 80

(2)SEQ ID NO：5资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_特征

(B)位置：28

(D)其它信息：/标准_名称＝“2′3′环磷酸酯”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(28，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN 28

(2)SEQ ID NO：6资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(28，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN 28

(2)SEQ ID NO：7资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(8，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TCACTATNGG AAGAGATGG 19

(2)SEQ ID NO：8资料：

(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(8，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TCACTATN 8

(2)SEQ ID NO：9资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

CCATCTCTTC CTATAGTGAG TCCGGCTGCA 30

(2)SEQ ID NO：10资料：

(i)序列特征：

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GTGCCAAGCT TACCG 15

(2)SEQ ID NO：11资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

CTGCAGAATT CTAATACGAC TCACTATAGG AAGAGATGGC GAC 43

(2)SEQ ID NO：12资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(8，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

TCACTATNGG AAGAGATGG 19

(2)SEQ ID NO：13资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(28，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GAC 43

(2)SEQ ID NO：14资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

TCACACATCT CTGAAGTAGC GCCGCCGTAT GTGACGCTAG GGGTTCGCCT 50

(2)SEQ ID NO：15资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

GGGGGGAACG CCGTAACAAG CTCTGAACTA GCGGTTGCGA TATAGTCGTA 50

(2)SEQ ID NO：16资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

CGGGACTCCG TAGCCCATTG CTTTTTGCAG CGTCAACGAA TAGCGTATTA 50

(2)SEQ ID NO：17资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

CCACCATGTC TTCTCGAGCC GAACCGATAG TTACGTCATA CCTCCCGTAT 50

(2)SEQ ID NO：18资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

GCCAGATTGC TGCTACCAGC GGTACGAAAT AGTGAAGTGT TCGTGACTAT 50

(2)SEQ ID NO：19资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

ATAGGCCATG CTTTGGCTAG CGGCACCGTA TAGTGTACCT GCCCTTATCG 50

(2)SEQ ID NO：20资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

TCTGCTCTCC TCTATTCTAG CAGTGCAGCG AAATATGTCG AATAGTCGGT 50

(2)SEQ ID NO：21资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

TTGCCCAGCA TAGTCGGCAG ACGTGGTGTT AGCGACACGA TAGGCCCGGT 50

(2)SEQ ID NO：22资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

TTGCTAGCTC GGCTGAACTT CTGTAGCGCA ACCGAAATAG TGAGGCTTGA 50

(2)SEQ ID NO：23资料：

(i)序列特征：

(A)长度：107个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(28，″″)

(D)其它信息：/标准_名称＝“腺嘌呤核糖核苷酸”

/标记＝rA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GACATCTCNN NNNNNNNNN 60

NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNGT GACGGTAAGC TTGGCAC 107

(2)SEQ ID NO：24资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT TGTTAGTAT 49

(2)SEQ ID NO：25资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

TCTCTTCAGC GATGCACGCT TGTTTTAATG TTGCACCCAT GTTAGTGA 48

(2)SEQ ID NO：26资料：

(i)序列特征：

(A)长度：46个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

TCTCATCAGC GATTGAACCA CTTGGTGGAC AGACCCATGT TAGTGA 46

(2)SEQ ID NO：27资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGTTCT TGTTAGTAT 49

(2)SEQ ID NO：28资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT CGTTAGTAT 49

(2)SEQ ID NO：29资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

TCTCAGACTT AGTCCATCAC ACTCTGTGCA TATGCCTGCT TGATGTGA 48

(2)SEQ ID NO：30资料：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

CTCTCATCTG CTAGCACGCT CGAATAGTGT CAGTCGATGT GA 42

(2)SEQ ID NO：31资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：

TACAGCGATT CACCCTTGTT TAAGGGTTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：32资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：

ATCAGCGATT AACGCTTGTT TCAATGTTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：33资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：

TTCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：34资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：

ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTGC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：35资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：

ATCAGCGATT CACCCTTGTT TAAGCGTTAC ACCCATGTTG 40

(2)SEQ ID NO：36资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：

ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：37资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：

ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：38资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：

ATCAGCGATT AACGCTTGTT TTAGTGTTGC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：39资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：

ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCATTAC ACCCATGTTA 40

(2)SEQ ID NO：40资料：

(i)序列特征：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：

GCCATGCTTT 10

(2)SEQ ID NO：41资料：

(i)序列特征：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：

CTCTATTTCT 10

(2)SEQ ID NO：42资料：

(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：

TATGTGACGC TA 12

(2)SEQ ID NO：43资料：

(i)序列特征：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：

TATAGTCGTA 10

(2)SEQ ID NO：44资料：

(i)序列特征：

(A)长度：11个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：

ATAGCGTATT A 11

(2)SEQ ID NO：45资料：

(i)序列特征：

(A)长度：13个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：

ATAGTTACGT CAT 13

(2)SEQ ID NO：46资料：

(i)序列特征：

(A)长度：14个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：

AATAGTGAAG TGTT 14

(2)SEQ ID NO：47资料：

(i)序列特征：

(A)长度：11个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：

ATAGGCCCGG T 11

(2)SEQ ID NO：48资料：

(i)序列特征：

(A)长度：14个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：

AATAGTGAGG CTTG 14

(2)SEQ ID NO：49资料：

(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：

GUAACUAGAG AU 12

(2)SEQ ID NO：50资料：

(i)序列特征：

(A)长度：98个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_特征

(B)位置：7..18

(D)其它信息：/注＝“位置7-18是RNA；残余序列是

DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：

GGAAAAGUAA CUAGAGAUGG AAGAGATGGC GACNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60

NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCGGTAAG CTTGGCAC 98

(2)SEQ ID NO：51资料：

(i)序列特征：

(A)长度：99个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(ix)特征：

(A)名称/键misc_特征

(B)位置：1..24

(D)其它信息：/注＝“位置1-24是RNA；残余序列是

DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：

GGAAAAAGUA ACUAGAGAUG GAAGAGATGG CGACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60

NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNCGGTAA GCTTGGCAC 99

(2)SEQ ID NO：52资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：

CCAATAGTGC TACTGTGTAT CTCAATGCTG GAAACACGGG TTATCTCCCG 50

(2)SEQ ID NO：53资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：

CCAAAACAGT GGAGCATTAT ATCTACTCCA CAAAGACCAC TTTTCTCCCG 50

(2)SEQ ID NO：54资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：

ATCCGTACTA GCATGCAGAC AGTCTGTCTG CTTTTTCATT ACTCACTCCC 50

(2)SEQ ID NO：55资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：

CAATTCATGA TGACCAACTC TGTCACACG CGAACTTTTA ACACTGGCA 49

(2)SEQ ID NO：56资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：

CTTCCACCTT CCGAGCCGGA CGAAGTTACT TTTTATCACA CTACGTATTG 50

(2)SEQ ID NO：57资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：

GGCAAGAGATGGCATATATT CAGGTAACTG TGGAGATACC CTGTCTGCCA 50

(2)SEQ ID NO：58资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：

CTAGACCATTCACGTTTACC AAGCTATGGT AAGAACTAGA ATCACGCGTA 50

(2)SEQ ID NO：59资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：

CGTACACGTG GAAAAGCTAT AAGTCAAGTT CTCATCATGT ACCTGACCGC 50

(2)SEQ ID NO：60资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：

CAGTGATACA TGAGTGCACC GCTACGACTA AGTCTGTAAC TTATTCTACC 50

(2)SEQ ID NO：61资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：

ACCGAATTAA ACTACCGAAT AGTGTGGTTT CTATGCTTCT TCTTCCCTGA 50

(2)SEQ ID NO：62资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：

CAGGTAGATA TAATGCGTCA CCGTGCTTAC ACTCGTTTTA TTAGTATGTC 50

(2)SEQ ID NO：63资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：

CCCTACAACA CCACTGGGCC CAATTAGATT AACGCTATTT TATAACTCG 49

(2)SEQ ID NO：64资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：

CCAAACGGTT ATAAGACTGA AAACTCAATC AATAGCCCAA TCCTCGCCC 49

(2)SEQ ID NO：65资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：

CACATGTATA CCTAAGAAAT TGGTCCCGTA GACGTCACAG ACTTACGCCA 50

(2)SEQ ID NO：66资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：

CACAACGAAA ACAATCTTCC TTGGCATACT GGGGAGAAAG TCTGTTGTCC 50

(2)SEQ ID NO：67资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：

CACACGAACA TGTCCATTAA ATGGCATTCC GTTTTTCGTT CTACATATGC 50

(2)SEQ ID NO：68资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：

CAGAACGAGG GTCTTGTAAG ACTACACCTC CTCAGTGACA ATAATCCTG 49

(2)SEQ ID NO：69资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：

CACTACAGCC TGATATATAT GAAGAACAGG CAACAAGCTT ATGCACTGG 49

(2)SEQ ID NO：70资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：

GGGTACATTT ATGATTCTCT TATAAAGAGA ATATCGTACT CTTTTCCCCA 50

(2)SEQ ID NO：71资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：

CCAAAGTACA TTCCAACCCC TTATACGTGA AACTTCCAGT AGTTTCCTA 49

(2)SEQ ID NO：72资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：

CTTGAAGATC CTCATAAGAC GATTAAACAA TCCACTGGAT ATAATCCGGA 50

(2)SEQ ID NO：73资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：

CGAATAGTGT CCATGATTAC ACCAATAACT GCCTGCCTAT CATGTTTATG 50

(2)SEQ ID NO：74资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：

CCAAGAGAGT ATCGGATACA CTTGGAACAT AGCTAACTCG AACTGTACCA 50

(2)SEQ ID NO：75资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：

CCACTGATAA ATAGGTAACT GTCTCATATC TGCCAATCAT ATGCCGTA 48

(2)SEQ ID NO：76资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：

CCCAAATTAT AAACAATTTA ACACAAGCAA AAGGAGGTTC ATTGCTCCGC 50

(2)SEQ ID NO：77资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：

CAATAAACTG GTGCTAAACC TAATACCTTG TATCCAAGTT ATCCTCCCCC 50

(2)SEQ ID NO：78资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：

CCGAATGACA TCCGTAGTGG AACCTTGCTT TTGACACTAA GAAGCTACAC 50

(2)SEQ ID NO：79资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：

CCATAACAAA TACCATAGTA AAGATCTGCA TTATATTATA TCGGTCCACC 50

(2)SEQ ID NO：80资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：

CAGAACAAAG ATCAGTAGCT AAACATATGG TACAAACATA CCATCTCGCA 50

(2)SEQ ID NO：81资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：

CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG CAACGACAC 49

(2)SEQ ID NO：82资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：

CTCCCTACGT TACACCAGCG GTACGAATTT TCCACGAGAG GTAATCCGCA 50

(2)SEQ ID NO：83资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：

CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TTCCCC 36

(2)SEQ ID NO：84资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：

CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TAGCCTACCA TAGTCCGGT 49

(2)SEQ ID NO：85资料：

(i)序列特征：

(A)长度：47个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：

CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG AATTGTA 47

(2)SEQ ID NO：86资料：

(i)序列特征：

(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：

CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG ACCTGTTACG A 51

(2)SEQ ID NO：87资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：

CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG AACGACAC 48

(2)SEQ ID NO：88资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：

CATGGCTTAA TCATCCTCAA TAGAAGACTA CAAGTCGAAT ATGTCCCCCC 50

(2)SEQ ID NO：89资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：

CAACAGAGCG AGTATCACCC CCTGTCAATA GTCGTATGAA ACATTGGGCC 50

(2)SEQ ID NO：90资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：

TACCGACAAG GGGAATTAAA AGCTAGCTGG TTATGCAACC CTTTTCGCA 49

(2)SEQ ID NO：91资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：

CTCGAAACAG TGATATTCTG AACAAACGGG TACTACGTGT TCAGCCCCC 49

(2)SEQ ID NO：92资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：

CCAATAACGT AACCCGGTTA GATAAGCACT TAGCTAAGAT GTTTATCCTG 50

(2)SEQ ID NO：93资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：

CAATACAATC GGTACGAATC CAGAAACATA ACGTTGTTTC AGAATGGTCC 50

(2)SEQ ID NO：94资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：

GCAACAACAA GAACCAAGTT ACATACACGT TCATCTATAC TGAACCCCCA 50

(2)SEQ ID NO：95资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：95：

CCTTTGAGTT CCTAAATGCC GCACGGTAAG CTTGGCACAC TTTGACTGTA 50

(2)SEQ ID NO：96资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：96：

CAAGATCTC ACTTTGGAAA TGCGAAATAT GTATATTCGC CCTGTCTGC 49

(2)SEQ ID NO：97资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：

CCACGTAGAA TTATCTGATT TATAACATAA CGCAGGATAA CTCTCGCCCA 50

(2)SEQ ID NO：98资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：98：

CACAAGAAAG TGTCGTCTCC AGATATTTGA GTACAAGGAA CTACGCCC 48

(2)SEQ ID NO：99资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：99

CATGAAGAAA TAGGACATTC TACAGGCTGG ACCGTTACTA TGCCTGTAGG 50

(2)SEQ ID NO：100资料：

(i)序列特征：

(A)长度：46个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：100：

CATAGGATAA TCATGGCGAT GCTTATGACG TGTACATCTA TACCTT 46

(2)SEQ ID NO：101资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假定：无

(iv)反义：非

(xi)序列描述：SEQ ID NO：101：

CAGATGATCT TCCTTTAAAG ACTACCCTTT AAAGAAACAT AAGGTACCCC 50

Claims

1.一种具有位点特异性核酸内切酶活性的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包含两侧有第一和第二底物结合区的一个保守核心；

其中所说的保守核心包含一个或多个保守区，所说的一个或多个保守区包括选自 CG；

CGA；

AGCG；

AGCCG；

CAGCGAT；

CTTGTTT；和

CTTATTT.的核苷酸序列；

其中所说的第一底物结合区包括选自

TTGCTTTTT；

TGTGTTCTC；

TTGCTGCT；

GCCATGCTTT；

CTCTATTTCT

GTCGGCA；

CATCTCTTC；和的核苷酸序列； ACTTCT.

其中所说的第二底物结合区包括选自

TATGTGACGCTA；

TATAGTCGTA；

ATAGCGTATTA；

ATAGTTACGTCAT；

AATAGTGAAGTGTT；

TATAGTGTA；

ATAGTCGGT；

ATAGGCCCGGT；

AATAGTGAGGCTTG；和

ATGNTG.的核苷酸序列。

2.权利要求1的催化性DNA分子，进一步包含位于所说的保守核心和所说的底物结合区之间的一个或多个间隔子核苷酸。

3.权利要求1的催化性DNA分子，进一步包含位于所说的保守核心的所说的保守区之间的一个或多个可变的或间隔子核苷酸。

4.权利要求1的催化性DNA分子，进一步包含第三底物结合区，其中所说的第三区包括选自TGTT；TGTTA和TGTTAG的核苷酸序列。

5.权利要求4的催化性DNA分子，进一步包含位于所说的底物结合区之间的一个或多个间隔子区域。

6.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括RNA，DNA，修饰的RNA，核酸类似物或其组合。

7.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的核酸底物包括RNA，DNA，修饰的RNA，核酸类似物或其组合。

8.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NO 3和SEQ ID NOS 14到22的核苷酸序列。

9.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NOS 23到30的核苷酸序列。

10.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NOS 31到39的核苷酸序列。

11.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NOS 52到101的核苷酸。

12.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子包括选自SEQ ID NO 56或SEQ ID NO 85的核苷酸。

13.权利要求9，10，11或12的催化性DNA分子，其中所说的核酸内切酶活性在Mg²⁺存在下得到增强。

14.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子具有大约1μM或更少的底物结合亲合性。

15.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的催化性DNA分子以少于大约0.1μM的K_D结合底物。

16.权利要求1的催化性DNA分子，其中所说的核酸内切酶活性由于存在二价阳离子而增强。

17.权利要求16的催化性DNA分子，其中所说的二价阳离子选自Pb²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，和Ca²⁺。

18.包含权利要求1的2个或多个催化性DNA分子群体的组合物，其中各催化性DNA分子群体能裂解底物中的不同核苷酸序列。

19.包含权利要求1的催化性DNA分子的2个或多个群体的组合物，其中各催化性DNA分子的群体能识别不同的底物。

20.一种选择在特异性位点裂解底物核酸序列的催化性DNA分子的方法，包括下列步骤：

a.获得单链DNA分子的群体；

b.将含核苷酸底物的分子与所说的单链DNA分子的群体混合以形成混合物；

c.在预定的反应条件下维持所说的混合物足够长的一段时间使所说的群体中的单链DNA分子裂解所说的底物序列，从而产生底物裂解产物；

d.将所说的单链DNA分子从所说的底物序列和底物裂解产物中分离；和

e.从所说的群体中分离在特定位点裂解含核苷酸的底物的单链DNA分子。

21.权利要求20的方法，其中所说的底物包含RNA。

22.权利要求20的方法，其中所说的在特定位点裂解所说的底物的DNA分子用固定化试剂标记。

23.权利要求22的方法，其中所说的试剂包含生物素。

24.权利要求22的方法，其中所说的分离步骤进一步包含将所说的标记的DNA分子与具有抗生物素蛋白连接其上的固相表面接触，从而使所说的标记的DNA分子附着于所说的固相表面上。

25.一种裂解核酸底物中的磷酯键的方法，包括：

a.将能在限定的裂解位点裂解底物核酸序列的催化性DNA分子与含磷酯键的底物混合以形成反应混合物；和

b.在预定反应条件下维持所说的混合物使所说的催化性DNA分子裂解所说的磷酯键，从而产生底物产物的群体。

26.权利要求25的方法，进一步包括下列步骤：

a.从所说的催化性DNA分子中分离所说的产物；

b.向所说的催化性DNA分子中加入额外的底物以形成新的反应混合物。

27.权利要求25的方法，其中所说的底物包含RNA。

28.权利要求25的方法，其中所说的预定的反应条件包括存在单价阳离子，二价阳离子或二者均有。

29.一种构建能裂解核酸底物中磷酯键的催化性DNA分子的方法，包括下列步骤：

a.获得单链DNA分子的群体；

b.将遗传变异导入所说的群体以产生变异群体；

c.从符合预定选择标准的所说变异群体中选择个体；

d.从所说变异群体的残留物中分离所说的选定个体；和

e.扩增所说的选定个体。