CN1258319A - 载体 - Google Patents

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Abstract

描述了包含编码目的产物(“POI”)的目的核苷酸序列(“NOI”)的载体。NOI和/或POI能够识别肿瘤,因此在使用中,该载体能够将NOI和/或POI传递至所述肿瘤。

Description

载体
本发明涉及一种优选用于医学中的载体。
正如本领域众所周知的，载体是允许或促进将一种实体从一种环境传递至另一种环境的工具。作为实例，用于重组DNA技术的某些载体允许诸如DNA区段(诸如异源DNA区段，诸如异源cDNA区段)的实体转移至靶细胞。可任选的是，一旦在所述靶细胞中，该载体则可以用来在该细胞中维持所述异源DNA，或可以用作DNA复制的单位。用于重组DNA技术的载体的实例包括质粒、染色体、人造染色体或病毒。
因此，载体可以用来将蛋白质和/或核苷酸序列传递至靶细胞，诸如肿瘤细胞。
然而，众所周知，核苷酸序列和蛋白质是复杂的分子，它们可以从生物来源生产，最通常从遗传工程生物或细胞培养物生产。此外，生产核苷酸序列和蛋白质的方法是复杂的、工作量大并且耗费成本。而且，某些蛋白质(诸如得自非人类生物来源的免疫球蛋白)的药理学性质和其它功能方面以及核苷酸序列，可以常常以重要的方式不同于在人类细胞中产生的相应的天然人免疫球蛋白的活性。作为背景信息，免疫球蛋白是相关多聚体蛋白家族的一个成员，它们在正常情况下由脊椎动物的B淋巴细胞谱系的细胞分泌，其典型功能是与鉴别为非自身的大分子区特异性结合。免疫球蛋白代表该生物免疫应答所有组成成分的一个重要组分，与“抗体”同义。
这类活性差异的一个主要原因是得自不同物种的蛋白质的糖基化模式不同(在Bebbington 1995中进行了综述；载于MonoclonalAntibodies：the second generation H.Zola编辑，第165-181页)。此外，系统给予蛋白质(尤其是含有毒素域的那些蛋白质)和核苷酸序列可能诱导产生另外的药代动力学和毒理学问题(在Scheinberg和Chapman1995中综述，载于Monoclonal Antibodies(Birch和Lennox编辑)的第2.1章)。
因此，本发明设法提供改进的载体系统，以用于传递目的核苷酸序列和/或所述核苷酸序列表达的产物。
按照本发明的第一个方面，提供一种载体，它包含一段编码肿瘤互作蛋白(“TIP”)的核苷酸序列(“NS”)和可任选地包含一段目的核苷酸序列(“NOI”)，所述NOI编码目的产物(“POI”)；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中，该载体能够将所述NOI和/或POI传递至肿瘤。
按照本发明的第二个方面，提供将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或所述NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤的方法，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中所述NOI和/或所述POI能够识别肿瘤；其中将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中该载体是按照本发明的载体。
按照本发明的第三个方面，提供载体将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或所述NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤的用途，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中当将所述NOI和/或所述POI传递至肿瘤时，所述NOI和/或所述POI能够识别所述肿瘤；并且其中该载体是按照本发明的载体。
按照本发明的第四个方面，提供治疗需要所述治疗的受治疗者的方法，该方法包括将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或所述NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤的方法，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中所述NOI和/或所述POI能够识别肿瘤；其中将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中该载体是按照本发明的载体。
按照本发明的第五个方面，提供基因载体将编码TIP的治疗基因的传递至肿瘤块内部的用途，所述TIP优选肿瘤结合蛋白(“TBP”)，更优选可分泌的TIP (最好为可分泌的TBP)。
按照本发明的第六个方面，提供基因传递系统将编码TIP(最好为TBP)的一种或多种基因导向肿瘤，所述基因传递系统包括编码TIP(最好为TBP)的基因载体和体内基因传递系统。
按照本发明的第七个方面，提供治疗癌症的方法，包括将按照本发明的基因传递系统中的一种或多种TIP(最好是TBP)或者系统或者直接给予肿瘤部位。
按照本发明的第八个方面，提供一种基因传递系统，用于将编码TIP(最好是TBP)的一种或多种基因或者体内或者体外引入造血(最好是骨髓造血)细胞谱系的细胞中。
按照本发明的第九个方面，提供治疗哺乳动物癌症的方法，包括将按照本发明的基因传递系统给予个体，所述基因传递系统能够在得自造血(最好是骨髓造血)来源的细胞中表达TBP。
按照本发明的第十个方面，提供一种基因载体，它包含一种或多种编码TIP(最好是TBP)的治疗基因，所述治疗基因与在肿瘤块中存在的细胞类型中选择性有功能的表达调节元件操作性地连接。
按照本发明的第十一个方面，提供包含待传递至所述肿瘤内部的一种或多种治疗基因的基因载体，其中所述治疗基因编码TIP(最好是TBP)，所述TIP还含有一个或多个效应域。
按照本发明的第十二个方面，提供治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括将一种细胞因子或细胞因子编码基因和按照本发明前述任一方面的一种或多种TIP(最好是TBP)基因的组合给予个体。
按照本发明的第十三个方面，提供将TIP(最好是TBP)编码基因传递至肿瘤部位。
该载体最好包含所述NOI。
在另一优选方面，该载体表达所述POI。
本发明的载体可用于特别是医学应用中，诸如诊断或治疗应用。
最好是，所述NOI是治疗NOI和/或所述POI是治疗POI。
有时在以下正文中，所述NS和NOI可以单独称为或统称为基因。
所述NS和NOI可以是任何合适的核苷酸序列。例如，它们可以独立地为DNA或RNA，它们可以合成制备，或可以利用重组DNA技术制备，或可以从天然资源中分离，或可以是这些方法的组合。所述NOI可以是有义序列或反义序列。
可以有多种NS或NOI或其组合物，所述NS或NOI相互之间可以直接或间接连接。因此，所表达的产物可以具有两个或多个效应域(它们可以相同或不同)和/或两个或多个TIP域(它们可以相同或不同)。
最好是，在使用中，该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至肿瘤块内部。
除癌细胞外，存在于肿瘤块中的细胞类型包括但不限于巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、上皮细胞等。
最好是，所述NS和/或所述TIP包含至少一个肿瘤结合域，该域能够与至少一种肿瘤相关细胞表面分子(“TACSM”)相互作用。
按照本发明，所述TACSM可以包括但不限于细胞表面分子，它在肿瘤细胞生长、迁移或转移中起作用；粘着蛋白受体，诸如整联蛋白玻联蛋白受体；生长因子受体(诸如表皮生长因子(EGF)受体、血小板源生长因子(PDGF)受体、成纤维细胞源生长因子(FDGF)受体、神经生长因子受体、胰岛素样生长因子(IGF-1)受体；血纤溶酶原激活剂；金属蛋白酶(诸如胶原酶)5T4抗原；肿瘤特异性糖类部分；癌胚抗原；粘蛋白；生长因子受体；糖蛋白；和其组织分布受限制的抗原。
最好是，所述TACSM选择性地在一种细胞类型或在有限数目的细胞类型上表达。
最好是，在使用中，该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至选择的肿瘤部位。
所述TIP最好是肿瘤结合蛋白(“TBP”)或包含一种肿瘤结合蛋白。
所述TIP最好是TBP。
TBP的实例包括：粘着分子，诸如胞内粘着分子ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、LFA-2、LFA-3、LECAM-1、VLA-4、ELAM、N-CAM、N-钙粘着蛋白、P-选择蛋白、CD44及其变异的同种型(特别是CD44v6、CD44v7-8)、CD56；生长因子受体配体，诸如表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞源生长因子(FDGF)、神经生长因子、血管升压素、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-1)、肝细胞生长因子、神经生长因子、人生长因子、脑源生长因子、睫状神经营养因子、神经胶质细胞系源生长因子；来自免疫球蛋白(Ig)可变区的重链和轻链序列(来自人类和动物来源)、工程改造的抗体或来自噬菌体呈现文库的抗体。噬菌体呈现文库是一种在噬菌体中表达免疫球蛋白基因的技术，已经发展为获得具有所需结合特异性的抗体的手段。已经开发出基于噬菌体λ的表达系统和新近基于丝状噬菌体的表达系统。可以设计所述噬菌体表达系统，使其允许重链和轻链形成随机组合，测试其结合所需抗原的能力。
所述TBP可以含有一个效应域，它在所述TBP结合于TACSM时被激活。所述一个或多个效应域可以在所述TBP结合于TACSM时被激活，导致抑制肿瘤细胞的增殖、存活或传播。所述效应域可以具有酶活性(诸如前体药物激活酶)，或该效应域可以包括一种毒素或免疫增强子，诸如以上所列的细胞因子/淋巴因子。
最好是，所述TBP包含一个或多个能够与存在于所述癌细胞上的一种或多种TACSM相互作用的结合域，所述TACSM可以相同或不同。
术语“相互作用”包括直接结合，由于这种结合产生生物效应。
所述TIP最好是一种抗体的一部分或包含至少抗体的一部分。
众所周知，抗体在免疫系统中起关键作用。简而言之，免疫系统以三种基本不同的方式运作：通过体液免疫、通过细胞免疫和通过称为淋巴因子的刺激蛋白的分泌。体液免疫依赖于统称为免疫球蛋白的蛋白，它构成血液中大约20％的蛋白。单个的免疫球蛋白分子称为一个抗体，但抗体也用来指许多均针对相同的靶分子的不同分子。体液免疫也涉及补体，这是被激活来非特异性地和结合抗体而杀伤细菌的一组蛋白。
在细胞免疫中，完整的细胞负责识别反应和排除反应。机体的第一道防线是识别并由吞噬细胞杀伤微生物，吞噬细胞是特化用于摄入并消化不想要的物质的细胞。运些细胞包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞。抗体的关键作用是帮助巨噬细胞识别并破坏外源物质。
为了执行这些功能，抗体分为两个区域：与抗原相互作用的结合(Fab)域和传递信号以起始诸如吞噬作用的过程的效应(Fc)域。每个抗体分子由两类多肽链组成：轻(L)链和重(H)链。单个抗体具有两个相同拷贝的L链和两个H链。每条链的N末端域形成可变区，它构成抗原结合位点。C末端域称为恒定区。H链(VH)和L链(VL)的可变域组成Fv单位，可以密切相互作用，以形成单链Fv(ScFv)单位。在大多数H链中，发现铰链区。铰链区具有柔性，允许Fab结合区相对于该分子的其余部分自由运动。铰链区也是该分子上对蛋白酶的作用最为敏感的位置，所述蛋白酶可以将抗体断裂为抗原结合位点(Fab)和效应(Fc)区。
抗体分子的结构域的结构适合于蛋白工程，促进携带抗原结合活性(Fab和Fv)或效应功能(Fc)的功能域分子之间的交换。抗体的结构也使得它可以容易地产生具有结合于诸如毒素、淋巴细胞或生长因子的分子的抗原识别能力的抗体。
单克隆抗体是具有相同抗原特异性的均质的抗体，代表抗体生产细胞单一克隆的产物。人们认识到，单克隆抗体提供人类治疗产品的基础。然而，尽管小鼠抗体与人抗体相似，但它们的差异足以被免疫系统识别为外源物体，由此产生免疫应答。这种人抗小鼠抗体(HAMA)应答限制了小鼠抗体作为人治疗产品的有用性。
嵌合抗体技术涉及将整个小鼠抗体可变域移植到人抗体恒定域上。嵌合抗体的免疫原性低于小鼠抗体，但它们保留其抗体特异性，并显示出HAMA应答降低。
在嵌合抗体中，可变区完全保留小鼠的可变区。然而，该抗体的结构使得可能产生特异性相当的可变区，它们在来源上主要是人类的。抗体的抗原结合位点由重链和轻链可变部分的6个互补决定区(CDR)形成。每个抗体结构域由7个反向平行β-折叠组成，形成具有连接β-链的环的β-折叠桶。在这些环中CDR区。从一个支架β-折叠桶至另一支架β-折叠桶有更多的CDR及其相关特异性是可行的。这称为CDR移植。CDR移植抗体在早期的研究临床研究中，其免疫原性似乎没有或者小鼠或者嵌合抗体那样强。此外，在CDR以外可以制造突变，以便提高其结合活性，如在所谓的人源化抗体中一样。
Fab、Fv以及通过多肽接头连接的具有VH和VL的单链Fv(ScFv)片段，表现出与原始单克隆抗体相似的抗原特异性和亲和性。可以用连接至或者氨基末端或者羧基末端的非抗体分子产生ScFv融合蛋白。在这些分子中，Fv可以用来特异性地将所连接的分子导向表达合适抗原的细胞。也可以通过将两种不同的结合特异性工程改造为单个抗体链，产生双功能抗体。双功能Fab、Fv和ScFv抗体可以包括工程改造的结构域，诸如CDR移植域或人源化域。
在病毒指导的酶疗法(VDEPT)中，通过病毒载体，诸如反转录病毒载体，将外源基因传递至正常细胞或癌细胞。所述外源基因编码一种酶，该酶可以将无毒的前体药物(例如5-氟胞嘧啶)转化为毒性代谢物(5-氟尿嘧啶)，后者杀伤制造其的细胞(Sikora等1994 Ann New YorkAcad Sci 71b：115-124)。如果所用的启动子是肿瘤特异性的，则该毒性产物仅在所述肿瘤细胞中合成。在动物模型中的研究已经表明，该类型的治疗可以传递比常规方法多高达50倍的前体药物(Connors和Knox 1995 1995 Stem Cells 13：501-511)。该技术的一种变化形式使用与前体药物转化酶缀合的肿瘤相关抗体，以提供导向肿瘤的特异性传递。该方法称为抗体定向酶前体药物疗法(ADEPT)(Maulid S和PatelSD“Molecular Biotechnology”1997 Wiley-Liss Inc第45页)。
已知大量的单克隆抗体和免疫球蛋白样分子特异性地结合存在于特定细胞类型(诸如肿瘤细胞)表面上的抗原。已经很好地建立了识别、特征鉴定、克隆和工程改造这些分子的方法，例如采用得自小鼠或转基因小鼠的杂交瘤、噬菌体呈现文库和scFv文库。编码免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子的基因可以在多种异源表达系统中表达。包括免疫球蛋白在内的大的糖基化蛋白有效地从真核细胞(特别是哺乳动物细胞)分泌并装配。
诸如Fab、Fv或scFv片段的小的非糖基化片段可以在哺乳动物细胞或细菌细胞中以功能形式生产。
免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子可以得自人类抗体，或得自工程改造的人源化啮齿动物抗体，诸如CDR移植抗体，或可以得自噬菌体呈现文库，或可以是合成的免疫球蛋白样分子。
抗原结合域可以包含由分离的基因表达的免疫球蛋白的重链和轻链，或可以使用一种免疫球蛋白的轻链和一种截短的重链，形成Fab或F(ab)’2片段。或者，可以使用截短形式的重链和轻链，装配形成Fv片段。也可以使用工程改造的scFv片段，在这种情况下，仅需要单个基因编码抗原结合域。在一个优选方面，由Fv或scFv形成所述抗原结合域。
当病原体侵入机体时，淋巴细胞以三种类型的反应应答。体液系统的淋巴细胞(B细胞)分泌可以结合该病原体的抗体，发送信号使巨噬细胞或其它细胞将该病原体降解。细胞系统的淋巴细胞(T细胞)执行两种主要类型的功能。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)发展出直接识别并杀伤病原体感染的细胞的能力。辅助T细胞(TH细胞)独立地识别该病原体，并分泌蛋白因子(淋巴因子)，刺激B细胞、T细胞和巨噬细胞的生长和应答性，由此大大增强了免疫应答的能力。
因此，在一个优选方面，所述TIP包括一种免疫球蛋白或其部分或其生物等排物。
在一个优选实施方案中，所述TIP包括IgG和/或IgE、或其部分、或其生物等排物。
在一个更优选实施方案中，所述TIP包括IgE、或其部分、或其生物等排物。
所述TIP最好识别滋养层细胞表面抗原。
所述TIP最好识别5T4抗原。
滋养层细胞表面抗原最初用单克隆抗体5T4限定(Hole和Stern1988 Br.J.Cancer 57：239-246)，在种类繁多的人类癌症细胞上高水平表达(Myers等1994 J.Biol.Chem.269：9319-9324)，但在非妊娠个体的正常组织中，基本上限于在少数特化上皮中低水平表达(Myers等，出处同上和其中引用的参考文献)。在导致发展转移潜力方面已经涉及到5T4抗原，因此特异性识别该分子的抗体在治疗表达该抗原的肿瘤中可能具有临床关联性。
也可以通过多种本领域已知的技术，将5T4单克隆抗体的可变域人源化，所述技术包括将CDR区序列移植到人骨架上。然后这些技术用来构建完整的人源化抗体或人源化单链抗体(Sab)，诸如偶联至Fc区的ScFv(参见Antibody Engingeering：a practical approach，McCafferty等编辑1996 OUP)。
这里，术语Sab不限于仅仅人类或人源化单链抗体。然而，所述Sab最好是人类单链抗体或人源化单链抗体或其部分，诸如偶联至Fc区的ScFv。
所述NS和NOI和/或所述TIP和POI最好连接在一起。
所述TIP和POI最好直接连接在一起。
所述NS、NOI、TIP和POI中的任何一种或多种最好还包含至少一种另外的功能组分。
最好至少所述TIP和/或POI还包含至少一种另外的功能组分。
最好是所述另外的功能组分以下的任何一种或多种：信号实体(诸如信号肽)、免疫增强子、毒素或生物活性酶。
在一个优选方面，所述POI是分泌型POI。因此，在本发明的该方面，所述另外的功能组分最好是至少一种能够引起所述POI分泌的实体，诸如信号实体。
另一种优选的另外组分是启动子。
术语“启动子”以本领域的正常含义使用，例如为Jacob-Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
该载体最好包含一个肿瘤特异性启动子增强子。
其它优选的另外组分包括能够有效表达所述POI的实体。例如，所述另外组分可以是增强子。这里，术语增强子包括与转录起始复合物的其它蛋白组分结合、并由此促进其相连的启动子指导转录起始的DNA序列。
该载体最好用来将所述NOI和/或POI体外和/或体内传递至所述肿瘤。
本发明的载体可用于基因治疗中，用于将所述NOI和/或所述POI传递至选择位点。
基因治疗包括任何一种或多种：例如在一个或多个靶位点(诸如靶细胞)中加入、置换、缺失、添加、操作等一种或多种核苷酸序列。如果所述靶位点是靶细胞，则所述细胞可以是组织或器官的一部分。在Molecular Biology(Robert Meyers编辑，Pub VCH，诸如第556-558页)中发现基因治疗的一般内容。
作为再一实例，基因治疗也提供一种手段，利用该手段，任何一种或多种：核苷酸序列(诸如基因)可以用来置换或添加一种缺陷型基因；可以消除一种致病基因或基因产物；可以加入一种新基因，例如以产生更适合的表型；可以在分子水平上操作细胞，以治疗癌症(Schmidt-Wolf和Scmidt-Wolf，1994，Annals of Hematology 69：273-279)或其它病症，诸如免疫、心血管、神经、炎症或传染性疾病；可以操作和/或引入抗原，以诱出免疫应答，诸如基因疫苗。
本发明的载体可以是病毒载体或非病毒载体。非病毒传递系统包括但不限于DNA转染法。这里，转染包括采用非病毒载体将基因传递至哺乳动物靶细胞的方法。典型的转染法包括电穿孔、DNA生物发射(biolistics)、脂质介导的转染、致密的(compacted)DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子剂介导的、阳离子表面两亲物(CFA)(Natue Biotechnology 1996 14：556)和它们的组合。病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。其它载体的实例包括体外传递系统，它们包括但不限于DNA转染法，诸如电穿孔、DNA生物发射、脂质介导的转染、致密的DNA介导的转染)。
该载体最好是病毒载体。
该载体最好是反转录病毒载体。
在最近数年，已经提出将反转录病毒用于基因治疗。反转录病毒基本上是RNA病毒，其生活周期不同于裂解病毒。在该方面，当反转录病毒感染细胞时，其基因组转化为DNA形式。更略微详细地讲，反转录病毒是含有基因组RNA的一种病毒，在进入宿主细胞时，其基因组RNA由反转录酶转化为DNA分子。该DNA拷贝用作模板，产生新的RNA基因组和传染性病毒颗粒装配必需的病毒编码的蛋白。因此，反转录病毒是通过DNA中间体复制的传染性实体。
有许多反转录病毒，其实例包括：鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、Moloney鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBR MSV)、Moloney鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠类白血病病毒(A-MLV)、鸟类髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Sprig Harbour LaboratoryPress编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763页)中可以发现反转录病毒详细的一览表。
在本领域中可以找到某些反转录病毒基因组结构的细节。作为实例，可以从NCBI Genbank(即基因组登记号AF033819)发现HIV的细节。
所有反转录病毒含有三个主要的编码域，即gag、pol、env，它们编码必需的病毒体蛋白。然而，反转录病毒被广泛地分为两类：即“简单的”和“复杂的”。这些类别的区别在于其基因组结构。简单的反转录病毒通常仅携带这种基本信息。相反，复杂的反转录病毒也编码得自多重剪接信息的另外的调节蛋白。
反转录病毒甚至可以还分为7组。其中5组代表具有致癌潜力的反转录病毒。其余2组是慢病毒和spumavirus。这些反转录病毒的综述出现于“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE varmus第1-25页)。
除人T细胞白血病病毒-牛白血病病毒群(TLV-BLV)外的所有致癌成员均为简单的反转录病毒。HTLV、BLV和慢病毒以及spumavuruses是复杂的反转录病毒。某些研究最清楚的致癌反转录病毒是劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠类白血病病毒(MLV)和人T细胞白血病病毒(HTLV)。
慢病毒群甚至再分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒。灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”魅敌病病毒(VMV)以及相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒。
慢病毒家族和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力(Lewis等1992 EMBO.J 11：3053-3058，Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相反，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞。
在感染期间，反转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。在进入敏感性宿主细胞时，反转录病毒RNA基因组则由亲代病毒携带的病毒编码的反转录酶拷贝为DNA。该DNA转运到宿主细胞核，随后在核内整合入宿主基因组。在此阶段，它通常称为原病毒。在细胞分裂期间，原病毒稳定地在宿主基因组中，并同其它细胞蛋白一样被转录。原病毒编码制造更多病毒所需的蛋白和包装机器，原病毒可以通过有时称为“芽生”的过程离开细胞。
正如已经表明的，每个反转录病毒基因组包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白和酶。这些基因两端的侧翼为称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。它们也作为增强子-启动子序列起作用。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。反转录病毒RNA的包衣壳借助于位于病毒基因组5’端的psi序列而发生。
LTR本身是相同的序列，它们可以分为三种元件，它们称为U3、R和U5。U3得自所述RNA 3’端特有的序列。R得自于所述RNA两端的重复序列，而U5得自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反转录病毒中，这三种元件的大小可以显著变化。
为了易于理解，以下为显示LTR、gag、pol和env基本特征的反转录病毒基因组的简单的属的图解(未按比例制图)。
Figure A9880552900181
对于病毒基因组，转录起始位点位于左手端LTR(如上所示)中U3和R之间的边界处，而多聚A添加(终止)位点位于右手端LTR(如上所示)中R和U5之间的边界处。U3含有原病毒大多数的转录控制元件，它们包括启动子和对细胞蛋白以及在某些情况下对病毒转录激活蛋白应答的多个增强子序列。某些反转录病毒具有任何一种或多种以下基因：tat、rev、tax和rex，它们编码参与基因表达的调节的蛋白。
如以上图解所示，反转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)。在反转录病毒载体基因组基因中，gag、pol和env不存在或没有功能。该RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端特有的序列。这三组末端序列形成原病毒DNA中的长末端重复序列(LTR)，原病毒DNA是整合入所感染细胞基因组中的基因组形式。野生型反转录病毒的LTR由(5’)U3-R-U5-(3’)组成，因此U3和U5均含有对于原病毒整合重要的序列。基因组中对于正确功能所需其它必需序列包括第一链反转录的引物结合位点、第二链反转录的引物结合位点和包装信号。
对于结构基因gag、pol和env本身和略微更详细的细节，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)、NC(核壳)。基因pol编码反转录酶(RT)，它含有DNA聚合酶和相关的RNA酶H活性和整合酶(IN)，它介导基因组的复制。基因env编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用最终导致病毒膜与细胞膜的融合。
包膜蛋白是一种病毒蛋白，它包被病毒颗粒，并在允许病毒进入靶细胞中起主要作用。反转录病毒的包膜糖蛋白复合物包括两种多肽：一种外部糖基化疏水多肽(SU)和一种跨膜蛋白(TM)。这些蛋白一起形成病毒体表面上的低聚“隆起”或“隆起的突起”。两种多肽均由env编码，并以多蛋白前体的形式合成，所述多蛋白前体在其转运至细胞表面期间被蛋白水解切割。尽管未切割的Env蛋白能够结合于所述受体，但切割事件本身是激活该蛋白的融合潜力所必需的，而融合是病毒进入宿主细胞所必需的。通常，SU和TM蛋白均于多个位点被糖基化。然而，在某些病毒中，以MLV为例，TM不是糖基化的。
尽管包膜的病毒体颗粒的装配不总是需要SU和TM蛋白，但就这一点而论，它们在进入过程中的确起基本作用。在该方面，SU域结合于靶细胞表面的受体分子，通常是特异性受体分子。据信，这一结合事件激活TM蛋白膜融合诱导潜力，此后病毒膜和细胞膜融合。在某些病毒中，特别是MLV，人们认为导致TM胞质尾的短部分去除的切割事件在暴露该蛋白的全部融合活性中起关键作用(Brody等1994 J.Virol.68：4602-4627，Rein等1994 J.Virol.68：1773-1781)。TM跨膜区段远侧的该胞质“尾”仍在病毒膜内侧上，它在不同的反转录病毒中其长度显著不同。
因此，SU/受体相互作用的特异性可以限定反转录病毒的宿主范围和组织嗜性。在某些情况下，该特异性可以限制重组反转录病毒载体的转导潜力。这里转导包括用病毒载体将非病毒基因传递至靶细胞的方法。为此，许多基因治疗实验已经使用了MLV。具有称为4070A的包膜蛋白的特定MLV被称为兼嗜性病毒，它也可以感染人类细胞，因为其包膜蛋白与在人和小鼠中保守的磷酸转运蛋白“对接”。该转运蛋白是普遍存在的，因此这些病毒能够感染许多细胞类型。然而在某些情况下，从安全性的角度来看，这对于特异性地限制靶细胞是有益的。为此，已经工程改造了数组小鼠亲嗜性反转录病毒，它们与正常仅感染小鼠细胞的其兼嗜性反转录病毒不同，特异性地感染特定的人类细胞。红细胞生成素区段取代包膜蛋白片断，产生重组反转录病毒，所述重组反转录病毒特异性地结合于其表面表达红细胞生成素受体的人类细胞，诸如红细胞前体(Maulik和Patel 1997“MolecularBiotechnology：Therapeutic Applications and Strategies”1997.Wiley-Liss Inc.第45页)。
除gag、pol和env外，复杂的反转录病毒也含有“辅助”基因，它们编辑辅助蛋白。辅助蛋白定义为由通常的复制基因或结构基因gag、pol和env编码的蛋白以外的、由辅助基因编码的蛋白。这些辅助蛋白不同于参与基因表达的调节的蛋白，如由tat、rev、tax和rex编码的蛋白。辅助基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一个或多个。这些辅助基因可以发现于例如HIV(参见例如“Retroviruses”Coffin等编辑，Pub.CSHL 1997的第802和803页)。非必需辅助蛋白可以在特化的细胞类型中起作用，提供细胞蛋白提供的至少部分重复功能。通常，辅助基因位于pol和env之间，恰好在env下游，包括LTR的U3区或env和相互之间的重叠部分。
复杂的反转录病毒的调节机制已经进化了，所述调节机制使用病毒编码的转录激活蛋白以及细胞转录因子。这些反式作用的病毒蛋白用作由LTR指导的RNA转录的激活蛋白。慢病毒转录的反式激活蛋白由病毒tat基因编码。Tat结合于稳定的茎-环RNA二级结构，称为TAR，其一种功能是使Tat表观上最佳定位，以反式激活转录。
如先前所述的，已经提议反转录病毒作为传递系统(或者作为传递载体进行表达)，特别是将NOI或多个NOI传递至一个或多个目的位点。这种转移可以在体内、体外发生，或在体内或体外组合发生。当以该方式使用时，反转录病毒通常称为反转录病毒载体或重组反转录病毒载体。反转录病毒载体已经用来研究反转录病毒生活周期的各个方面，包括受体使用、反转录和RNA包装(由Miller综述，1992 Curr TopMicrobiol Immunol 158：1-24)。
在用于基因治疗的典型的重组反转录病毒载体中，可以从病毒除去至少gag、pol和env蛋白编码区的一种或多种的一部分。这使得反转录病毒载体为复制缺陷型。除去的部分甚至可以用一种NOI取代，以便产生能够将其基因组整合入宿主基因组的病毒，但其中修饰的病毒基因组由于缺乏结构蛋白而本身不能繁殖。当整合入宿主基因组中时，发生所述NOI的表达，导致例如治疗效应。因此，通常通过：将NOI整合入重组病毒载体中；将修饰的病毒载体包装入病毒体外壳中；并允许目的位点(诸如靶细胞或靶细胞群体)的转导，而将所述NOI转移至目的位点。
繁殖并分离大量反转录病毒载体(例如以制备合适滴度的反转录病毒载体)，以采用包装细胞系或辅助细胞系和重组载体的组合，用于后续的例如目的位点的转导，这是可能的。
在某些情况下，繁殖和分离可能需要将反转录病毒的gag、pol和env基因分离，并将其分别引入宿主细胞中，以产生“包装细胞系”。所述包装细胞系产生包装反转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区而不能导致包衣壳。然而，当将携带NOI和psi区的重组载体引入包装细胞系时，辅助蛋白可以包括psi阳性重组载体，产生重组病毒原种。这可以用来感染细胞，以将所述NOI引入细胞基因组中。其基因组缺乏制造病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒，仅可以感染一次，不能繁殖。因此，将所述NOI引入宿主细胞基因组，而不产生潜在有害的反转录病毒。在“Retroviruses”(1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第449页)中概述了可用的包装系。然而，在其滴度水平不总是为满意水平的意义上说，该技术可能有问题。然而，已经发展了反转录病毒包装细胞系的设计，以解决特别是早先设计通常遇到的自发产生辅助病毒的问题。因为同源性大大促进重组，所以降低或消除该载体和辅助病毒基因组之间的同源性已经减小了辅助病毒产生的问题。
新近，已经研制出包装细胞，其中在独立转染入包装细胞系的分离的表达质粒中，携带gag、pol和env病毒编码区，使得野生型病毒的产生需要三次重组事件。该策略有时称为三质粒转染法(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23：628-633)。
当研制载体时，瞬时转染也可以用来测量载体的产生。在该方面，瞬时转染避免产生稳定载体生产细胞系所需的较长时间，如果该载体或反转录病毒包装组分对细胞有毒性，则使用瞬时转染。通常用来产生反转录病毒载体的组分包括编码Gag/Pol蛋白的质粒、编码Env蛋白的质粒和含有NOI的质粒。载体的产生包括将这些组分中的一种或多种瞬时转染入含其它所需组分的细胞中。如果该载体编码毒性基因或编码干扰宿主细胞复制的基因，诸如细胞周期抑制剂或编码诱导细胞凋亡的基因，则可能难以产生稳定的载体生产细胞系，但瞬时转染可以用来在细胞死亡之前产生载体。此外，利用瞬时转染，已经开发出产生的载体滴度水平与得自稳定的载体生产细胞系的水平相当的细胞系(Pear等1993，PNAS 90：8392-8396)。
某些HIV蛋白的毒性，可能使得难以产生稳定的基于HIV的包装系，由于这种毒性，通常通过载体和辅助病毒的瞬时转染制备HIV载体。某些工作者已经用水泡性口膜炎病毒(VSV)的Env蛋白取代HIV的Env蛋白。VSV Env蛋白的插入促进载体作为HIV/VSV-G载体的浓缩，通过瞬时转染，其滴度为5×105(浓缩后为108)(Naldini等1996Science 272：263-267)。因此，HIV载体的瞬时转染可以提供有用的策略，以产生高滴度的载体(Yee等1994 PNAS.91：9564-9568)。
如果所述反转录病毒组分包括env核苷酸序列，则该序列的全部或部分可以可任选地用另一env核苷酸序列的全部或部分取代。用异源env基因取代该env基因是称为假型化(Pseudotyping)的技术和策略的一个实例。假型化不是一种新现象，可以在WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047和Mebatsion等1997 Cell 90，841-847中发现其实例。
假型化可以提供一个或多个优点。例如，对于慢病毒载体，基于HIV的载体的env基因产物可能限制这些载体仅感染表达称为CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因已经用来自其它RNA病毒的env序列取代，则它们具有更广泛的感染范围(Verma和Somia 1997Nature 389：239-242)。作为实例，工作者已经用来自VSV的糖蛋白将基于HIV的载体假型化(Verma和Somia 1997出处同上)。或者，可以修饰env，以影响(诸如改变)其特异性。
因此，术语“重组反转录病毒载体”描述一种实体(诸如DNA分子)，该实体含有足够的反转录病毒序列，以允许该载体的RNA转录物在必需反转录病毒蛋白的存在下，包装为能够感染靶细胞的反转录病毒颗粒。靶细胞的感染包括反转录和整合入靶细胞基因组中。
术语“重组反转录病毒载体”也包括含有由所述DNA分子编码的RNA基因组的反转录病毒颗粒。所述反转录病毒载体也含有非病毒基因，通过该载体将所述非病毒基因传递至靶细胞。重组反转录病毒载体不能独立地复制产生感染性反转录病毒颗粒。通常，重组的反转录病毒载体缺乏功能性gag-pol和/或env基因、或编码复制所需蛋白的其它基因。
术语“定向反转录病毒载体”是指其感染细胞或在靶细胞中表达的能力限于宿主生物的某些细胞类型的重组反转录病毒载体。定向反转录病毒载体的一个实例是遗传修饰包膜蛋白的定向反转录病毒载体，其中所述遗传修饰的包膜蛋白结合于仅在宿主生物的有限数目细胞类型中发现的细胞表面分子。定向反转录病毒载体的另一实例是这样一种载体，它含有允许一种或多种反转录病毒转录物仅在宿主生物的一定比例的细胞类型中表达的启动子和/或增强子元件。
因此，本发明提供一种有用的传递系统。该传递系统能够将NOI和/或POU导向肿瘤，即能够使NOI和/或POI归巢到肿瘤中。
该载体可以用来直接给予实体(诸如生物或其细胞)，诸如体外或体内给予。在该意义上，该载体可以直接传递至例如肿瘤部位。或者，该载体可以通过一种载体，诸如体外或体内给予一种实体。载体的一个实例是其中可以含有该载体的脂质体或细胞。稳定载体细胞的一个实例是造血细胞，诸如骨髓细胞。这些载体细胞可以提高该本发明载体的又一特异性。
将进一步详细说明本发明的这些方面和其它方面。
用于治疗肿瘤疾病的基于单克隆抗体疗法的可见潜力尚未被完全认识到(综述于Scheinberg和Chapman 1995，Monoclonal anitibodies(Birth和Lennox编辑)第2.1章；George等，1994 Immunol.Today 15：559-561)。结果，已经将单克隆抗体与放射性同位素、细胞毒性药物或毒素缀合，以试图提高效力。然而，用这类缀合物的临床实验通常产生令人失望的结果。抗体和抗体缀合物在治疗实体瘤中缺乏效力的其中一个主要原因，是免疫球蛋白和诸如高分子量的免疫毒素的其它蛋白对实体瘤的穿透性差(例如Juweid等1992，Cancer Res.52：5144-5153；Epenetos等1986 Cancer Res.46：3183-3191)。缺乏效力的其它原因包括引入系统循环中的许多免疫毒素和抗体-放射性核素缀合物的非特异性毒性、免疫原性和不合适的药代动力学(综述于Scheinberg和Chapman 1995，Monoclonal anitibodies(Birth和Lennox编辑)第2.1章)。
与一般缺乏体内效力相反，在某些体外测定中，许多单克隆抗体显示出出色的抑制肿瘤细胞生长的能力(综述于Sandlie和Michaelsen1996 Anitibody engineering：a practical approach，McCafferty等第9章)。人们已经很好地确立了，抗体对特定抗原的结合可以导致激活通过抗体重链的Fc部分介导的多种效应功能。不同类免疫球蛋白的Fc区介导不同的效应功能，包括激活补体级联和结合于不同免疫效应细胞上的Fc受体(Duncan等1988 Nature 332：563和738)。在体外测定中，存在于免疫效应细胞上的Fc受体被结合于肿瘤靶细胞的抗体占用，通过多种统称为抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的机制，可以导致破坏靶细胞。例如IgG1和IgG3的抗体、以及在程度较低的IgG2和IgG4亚类占用人类单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞和天然杀伤(NK)细胞上IgG的Fc受体，刺激ADCC(Munn等1991 Cancer Res.51：1117-1123；Primus等，1993 Cancer Res.53：3355-3361)。然而，这类抗体体内破坏肿瘤的能力相对差，提示ADCC在许多当前的基于抗体的疗法中不起重要作用(George等1994 Immunol.Today 15：559-561)。对此有几种可能的原因，包括抗体穿透入实体瘤的穿透性差(Yuan等1995 Cancer Res.55：3752-3756)和以下事实：巨噬细胞上的大多数高亲和性受体(FcgRI)分子正常情况下被血清IgG占用，特异性抗体的竞争性差(Munn等1991 CancerRes.51：1117-1123)。
先前已经表明，用编码单克隆抗体的基因转导的肿瘤细胞在体外可以参与异源NK细胞介导的ADCC反应(Primus等1993 Cancer Res.53：3355-3361)。然而，NK细胞在体内破坏肿瘤细胞中几乎不起作用，这部分是因为其杀伤功能由于在自体肿瘤细胞上存在自身MHC I类而受限制(Correa和Raulet 1995 Immunity 2：61-71)。
也已经假定，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)可以用作载体，以将抗体基因传递至肿瘤、以在该肿瘤部位分泌抗肿瘤抗体(Tsang等1993 J.Immunother.13：143-152)。然而，TIL的体外转导后采用标记基因进行自体移植，已经表明分离的TIL没有显示出允许其返回肿瘤沉积处(deposits)的特异性的归巢机制(Economou等1996 J.Clin.Invest.97：515-521)，所以这种方法具有有限的价值。本发明与这些发现相反，因为本发明提供可以将NOI和/或POI导向或传递至肿瘤块(或部位)的载体。
也已经报道了将编码单链免疫毒素的基因转导入人淋巴因子激活的T细胞(LAK细胞)(Chen等1997 Nature 385：78-80)。除将LAK细胞再引入所述肿瘤部位的问题外，这种方法也有与限于体外使用相关的潜在缺点。这些缺点包括必需在高水平的细胞因子(诸如IL-2)中培养所述T细胞，以产生LAK细胞，以及在产生足够细胞用于治疗方面具有后续问题。
一方面，本发明涉及使用基因载体，将编码分泌的肿瘤结合蛋白(TBP)的基因(诸如治疗基因)传递至肿瘤块内部，并确定将TBP的表达导向所述肿瘤内部的方法。编码所述TBP的一种或多种基因在所述肿瘤块中的表达，则导致局部产生TBP，随后由于多种机制使肿瘤生长、存活率或播散降低。因为分泌所述TBP，所以转导的细胞产生TBP可以不仅对所转导的细胞上起作用，而且也对相邻的肿瘤细胞上起作用，因此得到旁观者效应。
除癌细胞外，在肿瘤块中存在有许多细胞类型。这些细胞类型可以包括肿瘤脉管系统的细胞(例如内皮细胞)和浸润肿瘤的免疫细胞(诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和巨噬细胞(Normann 1985 CancerMetastasis Re.4：277-291；Leek等1996 Cancer Res.56：4625-4629)。任何这些细胞类型均可以被导向，以表达所述TBP，并可以用作肿瘤内生产BP的局部工厂。所述肿瘤块内用来生产所述TBP的细胞最好是癌细胞、内皮细胞或巨噬细胞。或者，可以导向单核细胞或内皮细胞的祖细胞，诸如CD34阳性外周血单核细胞(Asahara等1997 Science275：964-967)。
所述TBP最好包含一个或多个结合域，所述结合域能够结合于存在于癌细胞上的一种或多种TACSM。因此，由所述肿瘤块内的一种或多种细胞类型生产的TBP被分泌并由于其对所述TACSM的亲和性而被导向癌细胞。所述TACSM可以选择性地存在于有限数目的细胞类型上。因此，所述肿瘤块内的大多数癌细胞上存在的TACSM的量高于周围组织。所述TACSM优选可检测地仅存在于肿瘤细胞和带有该肿瘤的个体内有限数目的其它组织类型上。更优选的是，所述TACSM在带有所述肿瘤的个体中基本上是肿瘤特异性的。
所述TBP的一个或多个结合域可以由例如TACSM的天然配体(该天然配体可以是粘着分子或生长因子受体配体(例如表皮生长因子))或保留对TACSM的结合亲和性的天然配体的片段组成。或者，所述结合域可以得自免疫球蛋白(Ig)可变区的重链和轻链序列。这种可变区可以得自天然人抗体或来自另一物种的抗体(诸如啮齿动物抗体)。或者，所述可变区可以得自工程改造抗体，诸如人源化抗体，或来自免疫动物或非免疫动物的噬菌体呈现文库或突变的噬菌体呈现文库。作为第二种选择方法，所述可变区可以得自单链可变片段(scFv)。所述TBP可以含有其它序列，以达到多聚和或用作结合域之间的间隔区，或含有由于编码所述TBP的基因中插入限制性位点而产生的其它序列，包括Ig铰链序列或新的间隔区和工程改造的接头序列。
所述TBP除含有一个或多个免疫球蛋白可变区外，还可以含有全部或部分的Ig重链恒定区，所有可以含有一个天然的全Ig、一个工程改造的Ig、一个工程改造的Ig样分子、一个单链Ig或一个单链Ig样分子。或者或另外，所述TBP可以含有来自另一蛋白(诸如毒素)的一个或多个结构域。
在本发明的一个方面，提供用来将一种或多种编码TBP的基因导向肿瘤的基因传递系统，包括一种编码TBP的基因载体和一个体内基因传递系统。所述基因传递系统可以是诸如用DNA致密剂(compactionagent)致密(compact)的DNA的非病毒基因传递系统、或是含有用DNA致密剂(诸如聚赖氨酸)致密的DNA的脂质体或免疫脂质体。该载体可以是质粒DNA载体。或者，该载体可以是重组病毒载体，诸如腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或反转录病毒载体，在这些情况下，基因传递由病毒感染靶细胞而介导。该载体最好是重组反转录病毒载体，它可以是定向反转录病毒载体。该反转录病毒载体最好例如通过在人类细胞系中生产而抗人类补体。
通常，该载体将含有指导所述基因或每个基因(诸如治疗基因)表达的启动子，并可以含有TBP基因有效表达或受调节表达的另外的基因元件，包括增强子、翻译起始信号、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接信号和聚腺苷酸化信号。所述启动子和/或增强子的活性可以是组织限制性的。可以使用例如肿瘤特异性启动子-增强子，诸如5T4抗原基因的启动子-增强子或CEA基因的启动子-增强子。或者或另外，可以存在用于受调节表达的一个或多个元件，诸如低氧调节的增强子。低氧调节的表达元件(HRE)的一个实例是转录因子HIF1的结合元件。提供受调节表达的一种或多种增强子元件可以以多拷贝存在。该基因或一种基因(诸如治疗基因)的表达优选可由可以在肿瘤块中发现的低氧(或低氧供应)诱导。更优选的是，指导该基因(诸如治疗基因)表达的启动子和/或增强子含有低氧效应元件和在肿瘤细胞中达到的表达高于相邻非肿瘤细胞的元件。
另外的载体组分提供载体功能的其它方面，诸如采用本领域熟知的元件进行载体的维持、核定位、复制和合适时的整合。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，提供反转录病毒载体，用于将编码所述TBP的一种或多种基因体内传递至所述肿瘤。合适的反转录病毒载体是本领域已知的(参见例如Gunzberg和Salmons 1996Gene Therapy，Lemoine和Cooper Bios编辑；和Cosset等1995 J.Virol.69：7430-7436)。在特别优选的实施方案中，通过在该反转录病毒载体中包含低氧调节的基因元件，所述TBP的表达可以在该肿瘤的低氧区得到加强。在这种情况下，通过标准分子生物学技术，将所述低氧调节元件插入反转录病毒的一个或两个LTR中，取代LTR增强子，或插入该载体的另一位置中。编码所述TBP的一种或多种基因可以由启动子-增强子表达，所述启动子-增强子导致在肿瘤细胞中的表达高于相邻的非肿瘤细胞，或该表达最好基本上是肿瘤特异性的。合适启动子的实例包括5T4抗原基因的启动子-增强子、MUC1基因或CEA基因的启动子-增强子。
在本发明的另一方面，提供治疗癌症的方法，该方法包括将本发明第一方面的基因传递系统中的一种或多种所述TBP基因或者系统或者直接给予肿瘤部位。
在本发明的另一方面，提供用于将编码TBP的一种或多种基因或者体内或者体外引入造血(最好是骨髓造血)细胞谱系的基因传递系统。所述造血(最好是骨髓造血)细胞最好是单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞或诸如CD34阳性干细胞的细胞前体。对于体外传递，可以将所述基因插入质粒载体中，并通过多种DNA转染方法传递，所述DNA转染方法包括电穿孔、DNA生物发射、脂质介导的转染或致密DNA介导的转染。或者，可以用病毒载体来体外转导造血(最好是骨髓造血)细胞或CD34阳性干细胞，诸如腺病毒载体、反转录病毒载体或慢病毒载体。该载体将含有指导该基因或每个基因(诸如治疗基因)表达的启动子，并可以含有用于有效表达或受调节表达的另外的基因元件，包括增强子、翻译起始信号、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接信号或多腺苷酸化信号。所述启动子或增强子或剪接信号可以是组织限制性的，优先在诸如巨噬细胞的单核细胞巨噬细胞中有活性。所述启动子和/或增强子可以含有用于受调节表达的元件，诸如低氧调节的增强子。低氧调节的表达元件的实例为HIF1转录因子效应元件。这种元件可以以多拷贝存在。低氧调节的启动子和增强子的实例包括来自烯醇化酶基因、红细胞生成素基因和编码糖酵解酶的基因(诸如PGK基因)的启动子和增强子(Semenza等，1994 J.Biol.Chem 269：23757-23763)。分离的HRE可以多聚，以提高对低氧的应答。另外的载体组分可以提供载体功能的其它方面，诸如采用本领域已知的组分进行载体的维持、核定位、复制和合适时的整合。
将该载体体外引入所述细胞后，可以将所述细胞直接再引入患者体内，或在再引入患者之前，可以用细胞因子和生长因子的合适的组合刺激它们，以使其沿单核细胞-巨噬细胞分化途径分化。可以用包括IL-3、GMCSF和MCSF在内的细胞因子刺激CD34阳性细胞分化。或者通过粘着塑料的培养，或者用或单独的GMCSF或结合其它细胞因子(包括MCSF)，使单核细胞分化。
对于将基因(诸如治疗基因)体内引入造血(最好是骨髓造血)细胞或CD34阳性干细胞，可以使用合适的体内传递系统来传递上述转录单位。所述基因传递系统可以是诸如用DNA致密剂致密的DNA的非病毒基因传递系统、或含有用DNA致密剂致密的DNA的脂质体或免疫脂质体。或者，该载体可以是重组病毒载体，诸如定向腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或诸如慢病毒的反转录病毒载体。该载体最好是定向重组反转录病毒载体，它最好例如通过从人类包装细胞系中制备该载体而抗人类补体。
CD34阳性干细胞也可以分化为内皮细胞(Ashara等1997 Science275：964-967)。除分化形成单核细胞和巨噬细胞外，设计含有按照本发明的TBP编码基因的CD34阳性干细胞的这种分化途径。
另外的载体组分可以提供载体功能的其它方面，诸如采用本领域已知的组分进行载体的维持、核定位、复制和合适时的整合。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，可以将携带TBP编码基因的质粒载体或反转录病毒载体引入自身外周血单核细胞中，其中所述TBP编码基因在低氧调节启动子或优先在巨噬细胞中有活性的启动子控制之下。将所述转染的单核细胞再引入该患者体内，它们迁移至肿瘤的低氧区，使得在该肿瘤块内部TBP的产生增强。在再注射入所述患者前，可任选地用细胞因子处理所述巨噬细胞。或者或另外，该载体可以包含能够表达细胞因子基因(诸如IFNg、CSF-1或GM-CSF基因)的DNA序列，以便诱发出所转染细胞的分化。所述细胞因子基因也可以受在肿瘤部位显示活性增强的基因元件的调节。
在本发明的另一方面，提供治疗人类或非人类哺乳动物癌症的方法，该方法包括从患有癌症的个体中取出一定量的血液，由该血液制备富含单核细胞和巨噬细胞或其干细胞前体的细胞制备物，采用本发明第三方面的基因传递系统将TBP基因引入细胞制备物中，以便产生具有所述TBP基因的单核细胞和巨噬细胞或其干细胞前体的转染或转导，并且将所转染或转导的细胞或者系统或者直接再引入肿瘤部位。在所述细胞制备物再引入之前，可以可任选地用细胞因子处理，以便引发向活性巨噬细胞的分化。
在本发明的另一方面，提供治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予个体本发明的基因传递系统，所述系统能够在得自造血(最好是骨髓造血)来源的细胞中表达TBP。
在本发明的再一方面，提供包含编码TBP的一种或多种基因(诸如治疗基因)的基因载体，其中所述基因与在肿瘤块内的细胞类型中选择性有功能的表达调节元件操作性地连接。本发明该方面的TBP通过结合于在肿瘤细胞存活或扩散中有基本作用的TACSM，抑制肿瘤功能。本发明该方面的TACSM可以是在肿瘤细胞生长、迁移或转移中有作用的细胞表面分子，并存在于癌细胞或肿瘤块中的其它细胞类型上。所述TACSM最好存在于癌细胞或肿瘤脉管系统或巨噬细胞上，为诸如生长因子受体、血纤溶酶原激活蛋白、金属蛋白酶或5T4抗原的分子。通过本发明以上两个方面中描述的任一种途径，可以将编码所述TBP的一种或多种基因传递至所述肿瘤内部。所述TBP结合于相应的TACSM，阻断了所述TACSM的功能，并由此导致抑制所述肿瘤的生长、迁移或转移。
在本发明的又一方面，将包含一种基因(诸如治疗基因)的基因载体传递至该肿瘤内部，其中所述基因(诸如治疗基因)编码TBP，它还含有一个或多个效应域。所述一个或多个效应域可以在所述TBP结合于TACSM时被激活，导致抑制肿瘤细胞的增殖、存活或扩散。本发明该方面的TACSM是一种可得到特异性TBP的细胞表面分子，诸如肿瘤特异性糖类部分、癌胚抗原、粘蛋白、生长因子受体或另一种糖蛋白。所述TACSM最好是其组织分布有限的抗原，主要在所述肿瘤细胞或所述肿瘤内的大多数细胞上发现。或者，所述TACSM存在于肿瘤巨噬细胞或肿瘤脉管系统上。在某些情况下，所述TACSM不会在很好程度上从所述细胞表面脱落到循环中。然而，脱落可能发生。作为实例，5T4抗原脱落到基质中，可以用来进一步将所述NOI和/或所述POI定位至所述肿瘤环境。
本发明的效应域可以具有酶活性，可以是例如前体药物活化酶，或它可以是非酶域。含有具有酶活性的效应域的TBP实例包括抗体-酶缀合物或融合体。已经描述了抗体-酶缀合物，包括与碱性磷酸酶(Senter等，1988 Proc Natl.Acad.Sci.85：48424846)；羧肽酶G2(Bagshawe等1988 Br.J.Cancer 58：700703)；P-内酰胺酶(Shepherd等1991 Bioorg.Med.Chem.Left.1：21-26)；和青霉素-V-酰胺酶(Kerr等1990 Cancer Immunol.Immunother.31：202-306)的缀合物。也已经描述了抗体-酶融合体(Goshom等1993 Cancer Res.53：2123-2127；Wles等1992 Bio/Tehcnology 10：1128-1132)。这些实例中的每个均可以用于本发明的该方面。可以包含于TBP酶融合体的另外或其它的酶包括人羧肽酶A1或其突变体(Smith等1997 J.Biol.Chem.272：15804-15816)；胞嘧啶脱氨酶(Mullen等1994 Cancer Res.54：1503-1506)；HSV胸苷激酶(Borrelli等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：7572-7576)；硝基还原酶(nitroreductase)；P450-还原酶和P450。
所述一个或多个前体药物活化酶域最好遗传融合至免疫球蛋白的C末端，或融合至免疫球蛋白结构域，诸如scfv或单链抗体和Fab片段。在本发明该方面的特别优选的实施方案中，所述一个或多个免疫球蛋白结构域是人类的或是人源化的，所述酶是人类酶，诸如羧肽酶P450或P450还原酶。所述酶可以是突变酶，它比天然的人类酶更有效地转化前体药物。按照本发明，可以使用在ADEPT策略中有用的任何酶。
在所有情况下，将合适的前体药物用于结合合适的前体药物活化酶治疗该患者。前体药物的实例包括磷酸依托泊苷(与碱性磷酸酶一起使用Senter等，1988 Proc.Nat.Acad.Sci.85：4842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶一起使用，Mullen等1994 Cancer Res.54：1503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶一起使用(Kerr等1990 Cancer Immonol.Immunother.31：202-206)；对-N-双(2氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸头孢菌素氮芥(与P-内酰胺酶一起使用)；SR4233(与P450还原酶一起使用)；丙氧鸟苷(与HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：7572-7576)与硝基还原酶一起使用的芥子前体药物(Friedlos等1997 J Med Chem 40：1270-1275)和环磷酰胺(与P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 56：1331-1340)。
或者，所述效应域可以是非酶域。非酶效应域的实例包括诸如来自假单胞菌的内毒素的毒素、诸如IL-2或IFNγ的细胞因子的全部或部分、或来自免疫球蛋白重链的效应域。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述TBP含有一个能够激活巨噬细胞FcgRI、II或III受体的效应域。所述TBP结合于所述肿瘤细胞上的抗原时，所述肿瘤低氧区内的巨噬细胞被激活，直接通过吞噬作用或ADCC破坏所述肿瘤细胞，或所述巨噬细胞被激活分泌促炎细胞因子，所述促炎细胞因子用来增强对所述肿瘤的天然免疫应答。所述TBP可以含有一个来自免疫球蛋白的Fc区、一个突变的Fc区、一个Fc区的受体结合片段，或可以含有另一FcR结合域。
所述TBP最好含有一个实体，最好是效应域实体，它赋予蛋白质的体外和/或体内稳定性。
按照本发明，所述TBP可以包括IgG(诸如人IgG1或IgG3)的完整的Fc区，最好来自IgE(诸如人IgGE)或其部分。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述TBP是含有一个人IgG1恒定区和一个识别5T4抗原的结合域的Sab(单键抗体)。
在本发明该方面的特别优选的实施方案中，所述TBP是含有一个人IgE恒定区和一个识别5T4抗原的结合域的Sab(单链抗体)。
所述效应域可以由cDNA的一部分编码，所述cDNA的一部分在框内融合至编码肿瘤结合域的DNA。或者，可以使用含有内含子的基因组片段，诸如人IgG1重链恒定区基因组片段。
这里术语“内含子”以其通常意义使用-例如基因内的DNA间插序列，它通过RNA剪接去除，因此不存在于成熟信使RNA中，并且不编码蛋白质。内含子可以在不同细胞类型中条件剪接或替代剪接。
将编码TBP的基因引入单核细胞或巨噬细胞可以与其它治疗结合，以诱发巨噬细胞分化和激活。例如，在再引入所述患者中之前，体外维持的细胞可以用诸如IFNγ、CSF-1或GM-CSF的细胞因子处理。或者，可以体内或体外以得自所述TBP基因的相同或不同载体引入编码这些细胞因子的基因到所述单核细胞/巨噬细胞。因此，在本发明的再一方面，提供治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予个体细胞因子或细胞因子编码基因和一种或多种按照本发明任一前述方面的TBP基因的组合物。
按照本发明，可以使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术。在文献中全面地描述了这类技术。参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：a laboratory manual；Hames和Glover(1985-1997)DNA Cloning：a practical aprroach，第I-IV卷(第二版)。特别是在McCafferty等(1996)Antibody engineering：a practical approach中给出了工程改造免疫球蛋白基因的方法。
在一个优选方面，本发明涉及将TBP编码基因传递至肿瘤部位。这在医学应用方面(诸如治疗应用)具有相当多的优点，在所述医学应用中，由于TBP绕过许多与在人类中系统传递蛋白质相关的问题，因此TBP是适用的。
与产生和传递蛋白质相关的问题相反，本发明的方法允许将基因传递至所述肿瘤部位，因此绕过许多生产问题。所述TBP因此在自体人细胞中原位产生，所述自体人细胞用作生产基于基因的药物(诸如治疗)生产的局部工厂。这在减小系统毒性方面具有显著的优点。该蛋白的活性是最大的，因此该蛋白的糖基化显示适合于待治疗个体的人类模式。
可以结合直接直射入肿瘤部位或例如靶载体或工程改造的造血(最好是骨髓造血)细胞或其前体的系统传递，使用本发明的方法。系统传递在许多适应症中可能是特别有利的，特别是在治疗传播性疾病方面。在这些情况下，所述基因传递系统或工程改造的细胞可以通过大剂量注射或以合适的制剂输注静脉内给予。药用可接受的制剂可以包括等渗盐溶液、缓冲盐溶液或组织培养基。可以包括另外的配制剂，诸如防腐剂或稳定剂。
因此，本发明也包括通过基因治疗治疗一个或多个个体的药用组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的按照本发明的载体或其表达产物。所述药用组合物可以用于人或用于动物。通常，医师会确定最适于受治疗者个体的准确剂量，该剂量将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。
所述组合物可以可任选地包含药用可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。可以根据计划的给药途径和标准的药学实践，选择药用载体、赋形剂或稀释剂。所述药用组合物可以包含或除所述载体、赋形剂或稀释剂外包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、加溶剂和辅助或增强病毒进入靶位点的其它载体剂(诸如脂质传递系统)。
合适时，所述药用组合物的给药途径可以为以下任何一种或多种：吸入、以栓剂或阴道栓剂形式、以洗剂、溶液、乳膏、软膏或撒粉形式局部给予、以皮肤贴剂使用、以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂形式口服、或以单独或掺合赋形剂的胶囊或卵状小体、或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式给予，或它们可以胃肠外注射，例如空洞内、静脉内、肌肉或皮下注射。对于胃肠外给予，所述组合物最好以无菌水溶液形式给予，所述水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，以使得该溶剂与血液等渗。对于颊或舌下给予，所述组合物可以以可以以常规形式配制的片剂或锭剂的形式给予。
因此，本发明的一个优选方面涉及一种载体，它包含(a)编码TIP的NS和(b)编码POI的NOI；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中，该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤。
在本发明的一个实例实施方案中，TIP是IgG或IgE或其部分。
在本发明的另一实例实施方案中，TIP是EGF或其部分。
在本发明的另一实例实施方案中，TIP识别滋养层细胞表面抗原，而至少一个所述效应域是一种分泌的共同刺激分子。以下是关于该实施方案进一步的背景内容和细节。
本发明的后一提及的方面涉及用于激活淋巴细胞和使用激活的淋巴细胞治疗癌症的方法。它也涉及用于激活淋巴细胞的融合蛋白、涉及编码所述融合蛋白的核酸和携带所述核酸的载体。
淋巴细胞需要至少两种不同的信号，以通过激活效应物功能对抗原应答(Bretscher和Cohn 1970 Science 169：1042-1049；Crabtree 1989Science 243：355-361)。所述第一信号是对抗原特异性的。对于B淋巴细胞，所述B细胞抗原受体(表面免疫球蛋白)识别许多大分子上的三维表位。对于T淋巴细胞，T细胞受体(TCR)识别在抗原提呈细胞上由主要组织相容性(MHC)家族的蛋白呈现的肽抗原(Weiss等1986 Ann.Rev.Immnol.4：593-619)。
分离中的第一信号的激活通常导致淋巴细胞的凋亡(程序性细胞死亡)，或导致建立持续的无应答性或无反应性(Weiss等，见上述)。为了达到激活淋巴细胞，需要辅助信号，它可以通过细胞因子或通过抗原提呈细胞(APC)上存在的细胞表面共同刺激配体传递。
现在鉴定有许多这类共同刺激分子，包括粘着分子LFA-3、ICAM-1、ICAM-2。APC上存在的主要的共同刺激分子是B7家族的成员，包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。这些分子是淋巴细胞上共同刺激受体的配体，包括CD28(WO92/00092)，它可能是静息T细胞最重要的共同刺激受体。B7家族糖蛋白的不同成员可以精细地将不同信号传递至T细胞(Nunes等1996 J.Biol.Chem.271：1591-1598)。
尽管建立的肿瘤通常在其表面上表达异常抗原，但它们的免疫原性差。先前已经假定用于刺激免疫识别肿瘤细胞的方法在肿瘤抗原的环境中将增强抗原提呈和共同刺激淋巴细胞。编码B7-1和B7-2的基因单独或结合细胞因子的转染，已经表明增强对动物模型中实验性肿瘤免疫的发展(例如Leong等1997 Int.J.Cancer 71：476-482；Zitvogel等1996 Eur.J.Immunol.26：1335-1341；Cayeux等1997 J.Immunol158：2834-2841)。然而，在将这些结果翻译为对人类癌症的实际治疗中，有许多重要的问题有待解决。在这类研究中的一个主要问题是需要将B7基因体内传递至大量的肿瘤细胞，以获得效力。第二个问题是将B7的表达导向肿瘤细胞是重要的，以避免不适当的针对其它细胞类型的免疫细胞激活。
本发明的该方面通过传递编码分泌的对肿瘤抗原具有结合亲和性的共同刺激分子(“SCM”)的基因，解决了这些具体问题。这样，肿瘤内相对少量的转染细胞用作生产共同刺激分子的局部工厂，所述分子从生产细胞脱落，并结合于肿瘤中的其它细胞。本发明的该方面的另外的优点是，肿瘤细胞不需要是转染的靶。
本发明的SCM是一种新的工程改造的融合蛋白，它包含一个用于从哺乳动物细胞分泌的信号肽、至少一个来自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子的抗原结合域和至少一个用作免疫系统细胞的共同刺激信号的另外的结构域。也可以设计使用含有不同共同刺激域的SCM的组合物。通过在该治疗个体的自体细胞中表达SCM编码基因，而产生所述SCM，由此由该宿主细胞加入该蛋白中的任何翻译后修饰均是真实的，并且提供完整功能性的蛋白和合适的药代动力学。
WO-A-92/00092描述了截短形式的B7-1，它们通过将翻译终止密码子置于跨膜域之前，从哺乳动物细胞中分泌出来。在该特定的情况下，使用来自制癌蛋白M基因的异源信号肽。WO-A92/00092也描述了融合蛋白，它们含有融合于免疫球蛋白Fc区的B7-1的胞外域。这类分子可以结合于T细胞上的CD28，用来刺激T细胞增殖。然而，这种刺激仅在中等程度上发生，除非所述B7或B7衍生物固定于固体表面。
Gerstmayer等(1997 J.Immol.158：4584-4590)描述了一种B7-2的融合体，该融合体融合于对ErbB2特异性的scFv，后接一种myc表位标记和一个多组氨酸标记，所述多组氨酸标记当在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达时被分泌出来。该分子保留对抗原的结合和用PMA和IL-2预刺激的T细胞的共同刺激增殖。然而，这种分子的糖基化是酵母类型的糖基化，可能在人类中导致不当的药代动力学。
按照本发明，可以使用任何合适的共同刺激域。作为实例，共同刺激域可以选自以下蛋白的胞外部分：细胞表面糖蛋白B7家族，包括B7-1、B7-2和B7-3；或其它共同刺激细胞表面糖蛋白，诸如但不限于共同刺激受体配体分子，包括CD2/LFA-3、LFA-1/ICAM-1和ICAM-3。研究已经证明，单核细胞对T细胞的共同刺激依赖于两种受体配体途径CD2/LFA-3和LFA-1/ICAM-1中的每一种(Van Seventer等1991 Eur J Immunol 21：1711-1718)。另外，已经表明，第三种LFA-1反受体ICAM-3是一种静息的和激活的T淋巴细胞的共同刺激分子(Hemandez-Caselles等1993 Eur J Immunol 23：2799-2806)。
其它可能的共同刺激分子可以包括一个新的糖蛋白受体，命名为SLAM，已经鉴定它当被占用时，以不依赖于CD28的方式加强T细胞的扩增，并诱导Th0/Th1细胞因子产生分布型(Cocks等1995 Nature376：260-263)。
已经表明，一种细胞表面糖蛋白CD6作为T细胞上的共同刺激和附着受体起作用。已经描述了四种CD6同种型(Cd6a、b、c、d)(Kobarg等1997 Eur J Immunol 27：2971-2980)。也已经提出所述非常晚期的抗原(VLA-4)整联蛋白在人类记忆B细胞激活中的作用(Silvy等1997 Eur J Immunol 27：2757-2764)。内皮细胞也提供特有的共同刺激信号，它们影响激活的CD4+T细胞的表型(Karmann等1996 Eur JImmunol 26：610-617)。已经描述了脂多糖激活的B细胞表面上存在的B3蛋白，该蛋白可以提供对静息T细胞的共同刺激，导致主要释放白介素(IL)-4和IL-5和可忽略量的IL-2以及干扰素γ(Vinay等1995 J BiolChem 270：23429-23436)。T细胞和肿瘤细胞上一种新的共同刺激T细胞抗原(A6H)的共同表达，已经提示与这些细胞共同特性有关的可能的功能(Labuda等1995 Int Immunol 7：1425-1432)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述共同刺激域是B7-1或B7-2的一部分，更优选是B7-1或B7-2的完整的胞外部分。
通过表达编码一种融合蛋白的新基因，形成所述SCM，所述融合蛋白含有一个或多个抗原结合域以及一个或多个共同刺激域。如果所述抗原结合域由一条重链和一条轻链组成，则所述共同刺激域与一条或另一条免疫球蛋白链融合，最好与所述重链融合。如果所述抗原结合域是scFv，则所述共同刺激域与该scFv融合。可以将所述域以以下顺序(N末端至C末端)布置：抗原结合域后接共同刺激域；或共同刺激域后接抗原结合域。最好是，所述共同刺激域置于N末端，后接所述抗原结合域。信号肽包含于N末端，可以是例如所述共同胞外刺激域的天然信号肽。不同的结构域可以被数个另外的序列分开，其原因可能是在该新基因中包含便利的限制性酶酶切位点以便有利于其构建，或它用作所述结构域之间的肽间隔物，或它用作柔性的肽接头或提供另外的功能。所述结构域最好被柔性接头分开。
可以使用两种或多种编码不同SCM的不同基因，来获得改进的共同刺激，或获得天然T细胞的共同刺激和记忆反应的诱导。例如，可以将编码含B7-1胞外域的SCM的基因，与编码含B7-2胞外域的SCM的基因一起给予。
因此，在本发明的一个方面，提供一种或多种基因载体，它们能够在哺乳动物细胞中表达一种或多种分泌的共同刺激分子，每个分泌的共同刺激分子包含至少一个抗原结合域和至少一种来自细胞表面共同刺激分子的胞外部分的结构域。所述共同刺激域可以得自在抗原提呈细胞表面上表达的分子，诸如B7家族成员。所述共同刺激域最好来自B7-1、B7-2或B7-3。它最优选由B7-1氨基酸残基1至成熟B7-1分子的残基约215(描述于WO-A-96/00092)组成，或由成熟细胞表面形式的B7-2的氨基酸1至约225(描述于Gerstmeyer等1997 J.Immunol.158：4584-4590)组成。
按照本发明该方面的基因载体包含至少一个用于哺乳动物细胞中表达的启动子和增强子以及一个聚腺苷酸化位点。合适的启动子和增强子包括来自人类巨细胞病毒的MIE启动子-增强子或存在于该肿瘤中的细胞中优先表达的启动子。这类启动子-增强子包括来自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的启动子-增强子。如果表达两种或多个SCM，则可以将这些SCM的编码区插入两个分离的载体中，或可以使用单个载体来表达所述两种或多种基因。在后一种情况下，每种基因提供一个分离拷贝的启动子，或使用一个内部核糖体进入位点(IRES)来分离所述两种编码序列。
本发明也包括本文公开序列的突变体、变异体、同系物或片段的使用。
涉及核苷酸序列的术语“变异体”、“同系物”或“片段”包括对该序列的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加一个(或多个)核酸，提供的所产生的核苷酸序列编码或能够编码具有本文提出的相同功能的实体，最好是至少在生物活性上是相同的。具体地说，术语“同系物”包括在结构和/或功能方面的同源性，提供的所得核苷酸序列编码或能够编码功能与本文所提出的相同的实体。关于序列同源性，与本文所示序列的同源性最好至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％。与本文所示序列的同源性更优选至少为95％，更优选至少为98％。
具体地说，本文所用的术语“同源性”可以与术语“同一性”等同。可以通过市售的计算机程序确定相对的序列同源性(即序列同一性)，所述计算机程序可以计算两种或多种序列之间的同源性百分率。这种计算机程序的一个典型实例是CLUSTAL。
术语“变异体”，“同系物”或“片段”与所述序列的等位基因变异同义。
术语“变异体”也包括与能够与本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。最好是，术语“变异体”包括与能够在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015柠檬酸钠pH7.0})与本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明也包括可以与本发明的核苷酸序列(包括与本文所示序列互补的序列)杂交的核苷酸序列。在一个优选方面，本发明包括可以在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本文所示核苷酸序列(包括与本文所述序列互补的序列)杂交的核苷酸序列。
涉及氨基酸序列的术语“变异体”、“同系物”或“片段”包括对该序列的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加一个(或多个)氨基酸，提供的所得氨基酸具有本文提出的相同功能，最好是至少在生物活性上是相同的。具体地说，术语“同系物”包括在结构和/或功能方面的同源性，提供的所得氨基酸序列具有与本文所提出的相同的功能。关于序列同源性，与本文所示序列的同源性最好至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％。与本文所示序列的同源性更优选至少为95％，更优选至少为98％。
概括而言，本发明涉及包含(a)编码TIP的NS和可任选的b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤。
本发明的一个优选方面涉及包含(a)编码TIP的NS和(b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤。
本发明的再一优选方面涉及包含(a)编码TIP的NS和(b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中所述TIP和POI相互融合。
本发明的该方面是有利的，因为它允许产生例如包含一个效应组分和一个导向组分的融合产物，并将其传递。
本发明的再一优选方面涉及包含(a)编码TIP的NS和(b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；其中所述TIP和POI相互融合；并且其中所述POI能够被分泌。
本发明的该方面是高度有利的，因为它提供一种手段，用于例如由少数细胞原位产生POI，以随后将至少所产生的POI的一部分传递至至少一个相邻细胞。因此，仅需要感染少数细胞以获得有益的治疗效果。
因此，换一种说法，本发明提供按照本发明的载体作为所述NS、NOI、POI和TIP中的任何一种或多种的原位生产工厂的用途。
另外，本发明提供按照本发明的载体存在于细胞内时将NOI和/或POI传递至相邻细胞的用途。
本发明的更优选方面涉及包含(a)编码TIP的NS、(b)编码POI的NOI和(c)编码分泌实体的核苷酸序列的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中该载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；其中所述TIP和POI相互融合；并且其中所述POI能够被分泌。
现在通过实施例进一步描述本发明，这些实施例是用来帮助本领域技术人员实施本发明，不以任何方式限制本发明的范围。参考以下附图：
图1a-显示编码5T4 scFv的DNA序列，该序列命名为5T4scFv.1。给出了所述成熟分泌蛋白的序列。
图1b-显示编码5T4Sab1的cDNA序列。该序列开始于一个HindIII限制性位点，后接一个翻译起始信号和一个信号肽。
图2显示B7-1.5T4.1的序列。
图3显示基于B7-1共同刺激域的两个SCM的图解；图3a显示SCM B7-1.5T4.1，而图3b显示其中共同刺激域和肿瘤结合域的顺序反转的B7-1.5T4.2。Sp＝信号肽；B7 ec＝B7-1的胞外域；Vl＝5T4的轻链可变域；Vh＝5T4的重链可变域。
图4显示人B7-2胞外域的序列，包括信号肽序列。成熟蛋白开始于氨基酸17。B7-2衍生序列后接一个柔性接头gly-gly-gly-gly-ser。
实施例实施例1-5T4 Sab的构建和反转录病毒载体至肿瘤的传递
用标准技术(Antibody engineering：a practical approach McCafferty等编辑1996 OUP)，克隆编码鼠类5T4单克隆抗体的cDNA并对其测序。使用该抗体的可变区序列构建多种免疫球蛋白样分子，包括scFv。5T4scFv、5T4scFv.1的编码序列示于图1a。在该分子中，该DNA序列编码来自小鼠5T4单克隆抗体的Vh，后接一个15个氨基酸的柔性接头和小鼠5T4抗体的V1区。所述柔性接头编码3个拷贝的氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，而所述重复序列之间的DNA序列相似性已经被减小，以避免当含有所述序列的质粒在大肠杆菌中生产时所述重复序列之间重组的风险。
示于图1a的DNA序列也可以用来通过将scFv编码序列与编码Fc区的序列融合形成框内融合体，而构建多种单链抗体(Sab)。用可以独立改变以适于特定目的的一系列DNA盒构建Sab。盒1-翻译起始信号和信号肽。
为了获得正确的翻译起始和从哺乳动物细胞分泌，使用以下序列：aagcttCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC
这含有一个用于克隆入表达载体的方便的HindIII限制性位点(lower case)、哺乳动物细胞的共有翻译起始信号(ANNATGPu)和免疫球蛋白基因信号肽序列的编码序列。盒2-scFv
5T4scFv.1的分泌部分的序列示于图1a。该分子可以表示为Vh-(gly4-ser)3接头-V1。
5T4 scFv2由以顺序V1-柔性接头Vh连接的5T4可变区序列组成。在这种情况下，所述接头编码20个氨基酸的肽(gly4-ser)4。当V区区段为该顺序时，较长的接头改进所述scFv的装配。(Pluckthun等Antibody Engineering：a practical approach，McCafferty等编辑1996OUP)。盒3-重链恒定区
在Ellison等1982 Nucl.Acids res.10：4071-4079中给出了人g1恒定区基因组克隆的序列。该序列除含有该编码序列外，还含有恒定区内含子。该序列符合读框地与盒2的scFv序列之一的3’端融合。描述了用于这种构成物方便装配的载体(Walls等1993 Nucl.Acids Res.21：2921-2929。
命名为5T4Sab1的一个5T4 Sab的cDNA示于图1b，它含有盒1、2和3。
为了在人细胞中表达5T4特异性scFv或Sab，将该编码序列插入载体pCIneo(Promega)中，置于强启动子和聚腺苷酸化信号的控制之下。所述翻译起始信号和来自盒1、位于所述编码区5’端的免疫球蛋白前导序列(信号肽)，确保所述scFv或Sab从哺乳动物细胞中有效分泌。
为了表达完整的Ig，构建两个分离的翻译盒，一个用于重链，一个用于轻链。这些盒被来自细小核糖核酸病毒FMDV的内部核糖体进入位点(IRES)(Ramesh等1996 Nucl.Acids Res.24：2697-2700)分开。或者，从分离拷贝的hCMV启动子表达每种cDNA(Ward和Bebbington1995 Monoclonal Antibodies Birth和Lennox编辑，Wiley-Liss)。
为了产生能够表达具有5T4特异性的5T4抗体或免疫球蛋白样分子的反转录病毒，将编码基于5T4的Sab的基因或编码重链和轻链的双顺反子信息插入反转录病毒中，其中反转录病毒基因组转录物由强启动子(诸如hCMV-MIE启动子)产生。一个合适的质粒是pHIT111(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23：628-633)，用标准技术插入所需基因，以取代LacZ基因。然后，所得的质粒pHIT-5T4.1转染入FLYRD18或FLYA13包装细胞系(Cosset等1995 J.Virol.69：7430-7436)，根据对1mg/ml G418的抗性选择转染子。G418抗性包装细胞产生高滴度的能够感染人细胞的重组反转录病毒。然后，用该病毒制备物感染人癌细胞，并且可以体内注射入肿瘤。然后表达所述5T4Sab，并从所述肿瘤细胞分泌。
在pHIT111中，MoMLV LTR启动子-增强子用来在所述靶细胞中表达所述治疗基因。也可以修饰该载体，使得所述治疗基因从一个内部启动子-增强子转录，所述内部启动子-增强子诸如主要在所述肿瘤细胞中有活性的启动子-增强子、或含有低氧调节元件的启动子-增强子。一个合适的启动子是具有3个拷贝小鼠PGKHRE的截短的HSVTK启动子(Firth等1994Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500)。实施例2-用编码TBP的表达载体转染巨噬细胞/单核细胞
用标准技术方法(Sandlie和Michaelsen 1996 Antibody engineering：a practical approach.McCafferty等编辑，第9章)以实验室规模，以及通过淘析(例如CellPro的Ceprate)以大规模，从人外周血分离外周血单核细胞。通过过夜附着于塑料，富集贴壁细胞(基本上是单核细胞)，可以通过培养贴壁细胞1-3周，让细胞沿巨噬细胞分化途径分化。
用能够在人细胞中表达TBP的表达载体转染单核细胞和巨噬细胞。为了进行组成型高水平表达，在利用hCMV-MIE启动子-增强子的载体pCI(Promega)中表达所述TBP。为了进行低氧诱导的表达，用含有至少一个HRE的启动子取代hCMV启动子。一个合适的启动子是具有3拷贝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK启动子(Firth等1994Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500)。
可以用多种转染法将载体引入单核细胞和巨噬细胞，所述转染法包括粒子介导的DNA传递(生物发射)、电穿孔、阳离子剂介导的转染(例如用Superfect，Qiagen)。这些方法中的每个均按照生产商的说明进行，并按照各个生产商具体说明，考虑待改变的参数以获得最佳结果。或者，可以使用诸如缺陷型腺病毒载体(Microbix Inc或QuantumBiotechnologies Inc.)的病毒载体。实施例3-巨噬细胞介导的ADCC的测定
将已经用表达TBP的反转录病毒转导的来自原发性人类肿瘤或肿瘤细胞系的细胞，与按实施例2所述制备的自体或异源人巨噬细胞混合，用于分析由所述TBP介导的ADCC活性。或者，按实施例2所述工程改造以产生TBP的巨噬细胞可以用来将ADCC导向非转导的肿瘤细胞。
按照标准步骤(Sandlie和Michaelsen 1996 Antibody engineering：apractical approach.McCafferty等编辑，第9章)，进行适当修改，进行该测定。简而言之，将效应细胞(巨噬细胞或新分离的单核细胞)以3×106细胞/ml悬浮于合适的组织培养基(DMEM/Hepes，得自LifeTechnologies，含有1％胎牛血清)中。将用51Cr标记的3×105肿瘤靶细胞置于圆底微量滴定板每孔的0.1ml培养基中。(注意培养基可以包含来自生产所述TBP细胞的用过的培养基)。将50ml效应细胞加入各孔中，将该板以300g离心2分钟，并在组织培养箱中于37℃温育不同时间(例如4小时)。然后，离心收集上清液，并在γ计数器中计数。以相对于从用0.1％Tween-20裂解的相同靶细胞样品中释放的总铬的裂解百分率表示结果。在该测定中，可以改变效应细胞：靶细胞之比，以产生滴度曲线。
对于先前的巨噬细胞分化或引发的刺激，将细胞因子加入培养物中。加入100-5000U/ml的IFNg(Sigma)。也可以以合适的浓度加入CSF-1或GM-CSF(Santa Cruz Biotechnology)。实施例4-在动物模型中的效力的分析
按照很好建立的技术(参见例如Strobel等1997 Cancer Res.57：1228-1232；McLeod等1997 Pancreas 14：237-248)，在遗传免疫缺陷的“裸”小鼠中体内培养人肿瘤衍生细胞系和组织。也可以使用将同系肿瘤系引入有免疫能力的小鼠品系的同系小鼠模型。这些用作合适的动物模型，以评估本发明的基因传递系统。将载体或工程改造的细胞系统或直接给予所述肿瘤内，在治疗或未治疗的动物中监测肿瘤的生长。该系统用来限定本发明治疗的有效剂量范围和最适给药途径。
实施例5-B7-scFv融合蛋白的构建
B7-1的胞外域由天然人B7-1蛋白的氨基酸残基1-215限定。该序列与其信号肽序列一起用来构建分泌的融合蛋白，该融合蛋白也含有得自5T4单克隆抗体的scFv。所述5T4 scFv的序列在图1a中给出。
用标准分子生物学技术，构建编码融合蛋白的DNA编码序列，在所述融合蛋白中，5T4 scFv的N末端在人B7-1的氨基酸215后融合。该编码序列B7-1.5T4.1的序列示于图2。该融合蛋白在所述B7-1和5T4 scFv序列之间含有一个柔性(gly-gly-gly-gly-ser)间隔区。于该接头插入末端(始于核苷酸733)引入一个方便的BamH1限制性位点，也提供其它接头，以根据双功能融合蛋白的最佳表达来进行筛选。图3图示该融合蛋白。同样可能构建所述scFv为N末端、而所述B7胞外域为C末端的B7-1.5T4.2(图3b)。在这种情况下，仅需要成熟B7-1(没有信号肽)的编码序列。在这种情况下，可以将诸如免疫球蛋白前导序列的信号肽加至所述scFv的N末端。
对于使用B7-2共同刺激胞外域的融合蛋白，用B7-2的信号肽和胞外域代替B7-1的序列。图4显示SCM B7-2.5T4.1共同刺激域的编码序列。它编码前接其信号肽的人B7-2前225个氨基酸和一个柔性接头(gly4-ser)。可以用该序列末端的BamHI位点插入5T4scFv.1下游的结构域(参见图3)。该序列包括所述B7-2信号肽，它可以用来允许该融合蛋白分泌，在该融合蛋白中，所述B7-2域位于该融合蛋白的N末端。
将每种工程改造的cDNA插入哺乳动物表达载体pCI中，以允许在哺乳动物组织培养细胞中表达。为此，将一个接头序列加至该编码序列5’端，该接头序列引入一个用于插入pCI多接头的方便的限制性位点，并紧邻第一个ATG密码子加入翻译起始信号CCACC。将pCI中的构成物转染入合适的哺乳动物宿主细胞系，诸如COS-1，以证实所述SCM的分泌。随后将来自pCI的转录盒或所述转录盒的合适区段亚克隆入待用作治疗用途的基因传递系统的表达载体中。实施例6-用编码SCM的表达载体转染巨噬细胞/单核细胞
用标准技术方法(Sandlie和Michaelsen 1996 Antibody engineering：a practical approach.McCafferty等编辑，第9章)以实验室规模，以及通过淘析(例如CellPro的Ceprate)以大规模，从人外周血分离外周血单核细胞。通过过夜附着于塑料，富集贴壁细胞(基本上是单核细胞)，可以通过培养贴壁细胞1-3周，让细胞巨噬细胞分化途径分化。
用能够在人细胞中表达SCM的表达载体转染单核细胞和巨噬细胞。为了进行组成型高水平表达，在利用hCMV-MIE启动子-增强子的载体pCI(Promega)中表达所述SCM。为了进行低氧诱导的表达，用含有至少一个HRE的启动子取代hCMV启动子。一个合适的启动子是具有3拷贝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK启动子(Firth等1994Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500)。
可以用多种转染法将载体引入单核细胞和巨噬细胞，所述转染法包括粒子介导的DNA传递(生物发射)、电穿孔、阳离子剂介导的转染(例如用Superfect，Qiagen)。这些方法中的每个均按照生产商的说明进行，并按照各个生产商具体说明，考虑待改变的参数以获得最佳结果。或者，可以使用诸如缺陷型腺病毒载体(Microbix Inc或OuantumBiotechnologies Inc.)的病毒载体。实施例7-SCM结合于表达CTLA-4和5T4抗原的细胞的分析
预期所述B7-1或B7-2域特异性地结合于人T细胞上存在的CD28和CTLA-4。用如下FACS分析，测定与T细胞或用人CTLA-4或CD28转染的中国仓鼠卵巢细胞的结合。将5×105的表达CTLA-4的靶细胞或缺乏CTLA-4的相当细胞(未转染的CHO细胞)与0.1ml来自用SCM基因瞬时转染的COS-1细胞的培养上清液一起于4℃温育1小时。洗涤所述细胞，并与1mg对所述B7域特异性的单克隆抗体(例如Mab 9E10)一起温育，然后与FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Pharmingen)一起温育，并通过FACS分析。
用表达5T4抗原的靶细胞(5T4转染的A9细胞)或对照细胞(A9)，同样评价scFv与5T4抗原的结合。实施例8-共同刺激活性的分析
用插入表达载体pCIneo的编码人5T4抗原的cDNA(Myers等1994 J.Biol.Chem.269：9319-9324)，转染建立的Balb/c来源的小鼠细胞系，诸如HC11细胞。
通过标准方法(Johnstone和Thorpe 1996 Immunochemistry inPractice.Blackwell.第4章)分离来自Balb/c小鼠的脾T细胞。通过在含10ng/ml PMA(Sigma)和100U/ml人IL-12(Boehringer Mannheim)的培养基中培养1-2天，预刺激T细胞。将96孔组织培养盘中104细胞/孔的HC11-5T4细胞与高达0.1ml用SCM基因转染的COS细胞的上清液一起温育2小时。将高达105预刺激的T细胞加入每孔中，用0.25mCi/孔3H-胸苷脉冲处理所述细胞，24小时后，用液闪计数器测量3H-胸苷的掺入。
预期3H-胸苷的掺入将因SCM的存在而加强。实施例9-动物模型中共同刺激的分析
用人5T4抗原基因(实施例4)转染的HC11细胞作为Balb/c小鼠中的肿瘤培养。在植入前，将SCM基因B7-1.5T4.1或B7-2.5T4.1或这两种基因的组合引入所述肿瘤细胞中，并监测所述肿瘤和体内不表达SCM基因的对照肿瘤的生长。
相信SCM基因的表达导致肿瘤生长的显著降低。实施例10-B7-1/ScFv(对人5T4特异性的)融合蛋白的构建
用标准分子生物学技术，构建一融合蛋白，该融合蛋白由通过柔性接头与对人5T4特异性的鼠类Mab 5T4的VH和VL融合的B7-1前导序列和胞外域组成。
通过将具有用以下寡核苷酸工程改造的5’SmaI和3’Spe I位点的两个同源寡核苷酸退火，构建用来连接B7.1的胞外域和所述scFv的柔性接头，所述寡核苷酸为：上游5’GGG GGT GGT GGG AGC GGT GGT GGC GGC AGT GGC GGCGGC GGA A 3’和下游5’CTA GTT CCG CCG CCG CCA CTG CCG CCA CCA CCG CTCCCA CCA CCC CC 3’。
将该接头通过Sma I和Spe I克隆入pBluescript(Stratagene)，产生pLINK。通过PCR，从pLK444-mB7.1(由R.Germain NIH，USA供应)通过引入5’EcoRI和3’Sma I位点的引物，扩增鼠类B7.1的信号肽(sp)和胞外域，所述引物为：正向5’C TCG AAT TCC ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C3’反向5’CTC CCC GGG CTT GCT ATC AGG AGG GTC TTC 3’。
将所述B7.1 PCR产物通过Eco RI和Sma I克隆入pLINK，形成pBS/B7Link。
通过以下引物从pHEN1-5T4 ScFv扩增所述5T4特异性ScFv的VH和VL：正向引物5’CTC ACT AGT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TC 3’反向引物5’CTC GCG GCC GCT TAC CGT TTG ATT TCC AGC TTG GTGCCT CCA CC 3’，所述引物引入5’Spe I和3’Not I位点。PBS/B7Link用Spe I和Nor I消化，并与所述ScFv连接形成由表示为SEQ ID No.5：B7 Link scFv序列的序列组成的OBM 233。
该融合体用来构建重组载体，例如反转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒。这类载体可以用来直接注射患者的肿瘤。为了将所述融合蛋白传递至肿瘤细胞，巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞在注射回患者之前，用所述重组载体体外转导。这些细胞将转运至肿瘤。所述ScFv将结合于肿瘤细胞表面上表达的特异性肿瘤抗原，诸如5T4(Myers等1994 JBC)。在专门的抗原提呈细胞(例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞)表面上发现B7。它与其位于CD4和CD8细胞上的配体CD28和CTL-A4相互作用。B7/CD28/CTL-A4和MHC-肽/T细胞受体的同时相互作用，导致IL-2的显著增加，这促进CD8(细胞毒性T细胞)的扩增(Linsley PS，Brady W，Grosmaire L，Aruffo A，Damle NK，Ledbetter JA J Exp Med 1991年3月1日；173(3)：721-730，B细胞激活抗原B7与CD28的结合共同刺激T细胞增殖和Il-2 mRNA的累积)。在动物模型中，已经用B7转染的肿瘤细胞已经显示出延滞发育(Townsend SE，Allison JP Science 1993 15；259(5093)：368-370)。实施例11-B7-1/ScFv和LScFv的瞬时表达及纯化
为了进行B7-1/ScFv的瞬时表达，使用人CMV表达质粒pCIneo(Promega)。通过用EcoR I/Not I消化从OBM 233切下B7/ScFv，并将其克隆入已经用EcoRI/Not I消化的pCIneo。采用磷酸钙(Profectin，Promega)，通过用相关质粒转染293T细胞，进行重组蛋白的瞬时表达。所用的条件与生产商建议的条件相似。为了减少牛血清污染，使用无血清optimen培养基(Gibco BRL)。36-48小时后，收获转染上清液，通过Centriprep(Amicon，Glos.UK)10滤膜(filter)(纯化/浓缩大于10kDa的所有蛋白)和Centricon(Amicon)10滤膜离心。上清液浓缩约30倍。
对于生物活性的B7-1，它必须能够表现出与T细胞特定群体(例如CD4+)表面上发现的其天然配体(或者CTLA-4或者CD28)之一结合。分析生物活性的B7-1/ScFv融合蛋白与其天然配体CTLA-4(Ancell，MN，USA供应的CTLA4-Ig形式)和表达人5T4的A9细胞的同时相互作用。简而言之，在U形底96孔板中，将约5×105A9-h5T4细胞与100ul或者B7.1/ScFv或LScFv上清液于4℃温育1小时。洗涤后，细胞与CTLA4-Ig(Ancell)一起温育1小时。洗涤后，用FITC缀合的抗小鼠Ig(Dako)检测结合的CTLA4-Ig。
结果显示CTLA4-Ig与B7-1胞外域的明显结合，通过所述ScFv结合至人5T4阳性A9细胞表面。缺乏与5T4阴性A9细胞的结合活性，进一步说明B7与CTLA4-Ig以及ScFv与5T4的相互作用是特异性的。实施例12-ScFv-IgG融合蛋白实例ScFv-IgG的构建
将编码翻译起始序列和人免疫球蛋白κ轻链信号肽的序列作为两条互补的单链寡核苷酸合成，所述单链寡核苷酸退火时，也含有5’端的一个内部Xho I位点以及另外留下一个Xba I匹配的5’突出端和一个Pst I匹配的3’突出端，所述寡核苷酸为：ctagactcgagCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTCTTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAGctgca和g CTG GAC CTC GGA GTG GAC ACC TGT AGC TGT TGC TACCAA   GAA  GAG  GAT  GAT  ACA  GCT  CCA  TCC  CATGGTGGctcgagt。
然后，将该序列克隆入用Xba I和Pst I限制的pBluescript II(Stratagene)中，产生pBSII/Leader。
通过PCR，用以下于该产物5’端掺入一个Pst I位点和于3’端掺入一个Hind III的寡核苷酸从pHEN1扩增所述5T4scFv：GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG和CG TTT GAT TTC AAG CTT GGT GC。
然后将其用那些酶限制，并插入用相同酶限制的pBRII/Leader中，产生pBRII/Leader/scFv。
通过PCR，用以下于5’端掺入一个Hind III位点和于3’端掺入一个Xho I位点的寡核苷酸从所克隆的基因扩增HIgG 1恒定区：gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACC AAG GGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG。
然后将其用那些酶限制，并插入用相同酶限制的pBRII/Leader/scFv中，产生pBRII/Leader/scFv/HG1。该构成物的序列示于附图中。
该融合体用来构建重组载体，例如反转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒。这类载体可以用来直接注射患者的肿瘤。为了将所述融合蛋白传递至肿瘤细胞，巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞在注射回患者之前，用所述重组载体体外转导。这些细胞将转运至肿瘤。所述ScFv将结合于肿瘤细胞表面上表达的特异性肿瘤抗原，诸如5T4(Myers等1994 JBC)。结合的IgG将通过集合统称为抗体依赖性细胞的细胞毒性促进特定肿瘤的破坏(Munn等Can res 1991出处同上，Primus等1993 Cancer Res出处同上)。实施例13-ScFv-IgE1(人IgE1重链恒定区)的构建
制备由作为SEQ ID No.6所示的序列组成的相似的5T4 scFv-人IgE重链恒定区的融合构成物。
通过PCR，通过RT并随后用以下于5’端掺入一个Hind III位点和于3’端掺入一个Xho I位点的寡核苷酸，扩增得自人B细胞RNA的人IgE1重链恒定区cDNA，制备该融合构成物，所述寡核苷酸为：gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACA CAG AGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC GGG ATT TAC AGA。
然后将其用那些酶限制，并插入用相同酶限制的pBSII/Leader/scFv中，产生pBSII/Leader/scFv/HE1。
如上所述，可以将所述ScFv-IgE构成物加入重组病毒载体中，以用于癌症的基因治疗，例如直接注射患者组织，或体外转导得自患者的巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞。该融合蛋白将被分泌，并结合于带有所述ScFv对其特异性的抗原的肿瘤细胞。IgE结合于肿瘤细胞应该通过激活肥大细胞而促进强的组胺反应。该将导致强的炎症反应并破坏肿瘤细胞，正如报道的IgE对寄生虫(例如蠕虫幼虫)的细胞毒性破坏一样(Capron M 1988疾病中的嗜酸性粒细胞：受体和介质.载于：变态反应和临床免疫学进展(progress in allergy and clinical immunology)(Proc.13th Int.Congress of Allergy and Clinical Immunology)Hogrefe和Huber Toronto 第6页)。这种炎症和肿瘤破坏应该启动其它免疫效应细胞的募集。过去的报道指出，用MMTV抗原特异性IgE Mab处理，导致抵抗表达MMTV抗原的肿瘤的保护(Nagy E Istanvan B，SehonAH 1991 Cancer Immunol.Immunotherapy第34卷：63-69)。实施例14-B7/EGF的构建B7-EGF合成基因
通过将从编码成熟EGF肽(参见登记号X04571)的基因区域扩增的PCR产物，插入pBS/B7 Link，制备B7-EGF的融合构成物。该构成物具有作为SEQ ID No.7所示的序列。
通过对从诸如293人肾系的细胞系(ATCC：CRL1573)分离出的RNA进行RT而得到cDNA，采用该cDNA通过PCR，用以下于N末端含有一个Spe I限制性酶切位点和于C末端含有一个终止密码子和一个Not I位点的寡核苷酸，扩增所述DNA，所述寡核苷酸为：GG ACT AGT AAT AGT GAC TCT GAA TGT CCC和ATT AGC GGC CGC TTA GCG CAG TTC CCA CCA CTT C。
所得产物用那些酶限制，并连接入已经用相同酶限制的pBS/B7Link中，产生pBS/B7 Link EGF。然后用Eco RI和NotI切下所述B7Link EGF盒，将其插入不再携带LacZ基因的pHIT111的衍生物(Soneoka等，1995，Nucl Acid Res 23：628)中。
使用ScFv的另一方法是使用对其相应受体具有高亲和性的生长因子，例如表皮生长因子，它结合于几种受体，包括与肿瘤发生高度相关的erb-2。
如上所述，可以将所述融合构成物加入重组病毒载体中，以用于基因治疗，例如直接注射患者组织，或体外转导得自患者的巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞。该融合蛋白将被分泌，并结合于带有所述erb-2抗原的肿瘤细胞。
表皮生长因子(EGF)将结合于其配体erb-2(一种EGF受体)，由此消除了ScFv的需要。erb-2与肿瘤细胞高度相关(Hynes NE SeminCancer Biol 1993 Feb；4(1)：19-26，erb-2基因在人肿瘤中的扩增和过量表达：它参与肿瘤发展、作为预后因子的重要性和作为癌症治疗的靶的潜力)。在专门的抗原提呈细胞(例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞)表面上发现B7。它与位于CD4和CD8细胞上的其配体CD28和CTL-A4相互作用。B7-CD28/CTL-A4和MHC-肽/T细胞受体的同时相互作用，导致IL-2的显著增加，这促进CD8(细胞毒性T细胞)的扩增(Linsley PS，Brady W，Grosmaire L，Aruffo A，Damle NK，LedbetterJA J Exp Med 1991年3月1日；173(3)：721-730，B细胞激活抗原B7与CD28的结合共同刺激T细胞增殖和白介素-2mRNA的累积)。在动物模型中，已经用B7转染的肿瘤细胞已经显示出延滞发育(Townsend SE，Allison JP Science 1993 15；259(5093)：368-370 B7 CD8+T细胞直接共同刺激后B7转染的黑素瘤细胞的肿瘤排斥)。已经报道了，B7将增强对肿瘤细胞特异性的肿瘤抗原的CTL应答，由此导致所有这些细胞的破坏。实施例15-表达融合构成物的细胞系的产生
通过Xho I消化，从pBSII/L/ScFv/hIgG1切下所述ScFv-IgG基因，将其通过Xho I位点克隆入pLXSN，产生pLXSN/ScFv-IgG，使得染色体整合后，它处于所述LTR的转录控制之下。通过采用三质粒HIT系统(Landau和Littman 1992 J Virol 66 5510，Soneoka Y等1995NAR 23：628-633)，共同转染含所述MLV gap-pol基因的质粒(pCIEGPPD)和含有VSV G包膜的质粒(pRV67)，在人肾细胞系293T中制备病毒。48小时后收获病毒，用来转导BHK-21细胞(ATCC#CCL-10)。转导后约24小时，通过将1mg/ml G418(Gibco BRL)加入培养基中，选择转导的细胞。收获来自阳性菌落的上清液，通过Centriprep(Amicon，Glos.UK)10滤膜(纯化/浓度大于10kDa的所有蛋白)和Centricon(Amicon)10滤膜离心进行浓缩。上清液浓缩约30倍。
采用相似的方案，将其它融合蛋白通过Xho I位点克隆入pLXSN，表达并浓缩。融合蛋白与表达特定配体的细胞结合的FACS分析
为了确定所述ScFv-IgG融合蛋白是否对其抗原人5T4是特异性的，对人膀胱癌肿瘤系(EJ)或表达h5T4的稳定的鼠类细胞系A9-h5T4(Myers等1994 JBC)和5T4阴性系A9-neo进行FACS分析。在圆底96孔板(Falcon)中，将约5×105A9或EJ细胞与100ul浓缩上清液(如上所述)的1∶5稀释液一起于4℃温育1小时。洗涤后，用抗人IgG/FITC缀合的抗体(Dako)检测结合的蛋白。在Becton Dickinson FACS仪上分析细胞。FACS结果表明，与仅由所述ScFv蛋白组成的阴性对照构成物相比，在用所述ScFv-IgG构成物处理的那些5T4阳性细胞中，荧光活性至少变化10倍。A9 neo FACS表明，没有该融合蛋白ScFv组分的非特异性结合。
与以上相似地进行ScFv-IgE的FACS分析，只是使用抗人IgE-FITC(Dako)监测该融合蛋白的结合。
用FACS和HC11-erb-2阳性细胞(Hynes等1990)，分析所述B7/EGF融合蛋白的结合。用CTLA4-Ig(Ancell，USA)分析结合的融合蛋白的B7组分的生物活性。用抗小鼠IgG-FITC显示CTLA-4的结合。总结
因此，本发明提供将例如治疗化合物传递至肿瘤部位的手段。
在以上说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中。不脱离本发明的范围和精神的本发明所述方法和系统的各种修改和变化，对本领域技术人员是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，要求保护的本发明应该不过度限于这类具体实施方案。实际上，实施本发明的所述模式的各种修改对分子生物学领域或相关领域的技术人员是显而易见的，它们将属于以下权利要求书的范围。序列表SEQ ID NO.1
参见图1a。SEQ ID NO.2
参见图1b。SEQ ID NO.3
参见图2。SEQ ID NO.4
参见图4。SEQ ID NO.5ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCT80GCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTT160GCCGTTACAACTCTCCGCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTC240ATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCT320GGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACT400TGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACT480AAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGG560CATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCA640ACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGAC720CCTCCTGATAGCAAGCCCGGGGGTGGTGGGAGCGGTGGTGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGAACTAGTGAGGTCCAGCTTCA800GCAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCT880ACTACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTAACAATGGTGTTACT960CTCTACAACCAGAAATTCAAGGACAAGGCCATATTAACTGTAGACAAGTCATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAG1040CCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCTACTATGATTACGAACTATGTTATGGACTACTGGGGTC1120AAGTAACTTCAGTCACCGTCTCTTCAGGTGGTGGTGGGAGCGGTGGTGGCGGCACTGGCGGCGGCGGATCTAGTATTGTG1200ATGACCCAGACTCCCACATTCCTGCTTGTTTCAGCAGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAG1280TAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTCATATCCTATACATCCAGTCGCTACGCTG1360GAGTCCCTGATCGCTTCATTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTTTGCAGGCTGAAGACCTG1440GCAGTTTATTTCTGTCAGCAAGATTATAATTCTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA 1518SEQ ID NO.6CTCGAGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTCCAGCTG80CAGCAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGG160CTACTACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTAACAATGGTGTTA240CTCTCTACAACCAGAAATTCAAGGACAAGGCCATATTAACTGTAGACAAGTCATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCGC320AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCTACTATGATTACGAACTATGTTATGGACTACTGGGG400TCAAGTAACTTCAGTCACCGTCTCTTCAGGTGGTGGTGGGAGCGGTGGTGGCGGCACTGGCGGCGGCGGATCTAGTATTG480TGATGACCCAGACTCCCACATTCCTGCTTGTTTCAGCAGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTG560AGTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTCATATCCTATACATCCAGTCGCTACGC640TGGAGTCCCTGATCGCTTCATTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTTTGCAGGCTGAAGACC720TGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAAGATTATAATTCTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTTGAAATCAAACGGGCC800TCCACACAGAGCCCATCCGTCTTCCCCTTGACCCGCTGCTGCAAAAACATTCCCTCCAATGCCACCTCCGTGACTCTGGG880CTGCCTGGCCACGGGCTACTTCCCGGAGCCGGTGATGGTGACCTGGGACACAGGCTCCCTCAACGGGACAACTATGACCT960TACCAGCCACCACCCTCACGCTCTCTGGTCACTATGCCACCATCAGCTTGCTGACCGTCTCGGGTGCGTGGGCCAAGCAG1040ATGTTCACCTGCCGTGTGGCACACACTCCATCGTCCACAGACTGGGTCGACAACAAAACCTTCAGCGTCTGCTCCAGGGA1120CTTCACCCCGCCCACCGTGAAGATCTTACAGTCGTCCTGCGACGGCGGCGGGCACTTCCCCCCGACCATCCAGCTCCTGT1200GCCTCGTCTCTGGGTACACCCCAGGGACTATCAACATCACCTGGCTGGAGGACGGGCAGGTCATGGACGTGGACTTGTCC1280ACCGCCTCTACCACGCAGGAGGGTGAGCTGGCCTCCACACAAAGCGAGCTCACCCTCAGCCAGAAGCACTGGCTGTCAGA1360CCGCACCTACACCTGCCAGGTCACCTATCAAGGTCACACCTTTGAGGACAGCACCAAGAAGTGTGCAGATTCCAACCCGA1440GAGGGGTGAGCGCCTACCTAAGCCGGCCCAGCCCGTTCGACCTGTTCATCCGCAAGTCGCCCACGATCACCTGTCTGGTG1520GTGGACCTGGCACCCAGCAAGGGGACCGTGAACCTGACCTGGTCCCGGGCCAGTGGGAAGCCTGTGAACCACTCCACCAG1600AAAGGAGGAGAAGCAGCGCAATGGCACGTTAACCGTCACGTCCACCCTGCCGGTGGGCACCCGAGACTGGATCGAGGGGG1680AGACCTACCAGTGCAGGGTGACCCACCCCCACCTGCCCAGGGCCCTCATGCGGTCCACGACCAAGACCAGCGGCCCGCGT1760GCTGCCCCGGAAGTCTATGCGTTTGCGACGCCGGAGTGGCCGGGGAGCCGGGACAAGCGCACCCTCGCCTGCCTGATCCA1840GAACTTCATGCCTGAGGACATCTCGGTGCAGTGGCTGCACAACGAGGTGCAGCTCCCGGACGCCCGGCACAGCACGACGC1920AGCCCCGCAAGACCAAGGGCTCCGGCTTCTTCGTCTTCAGCCGCCTGGAGGTGACCAGGGCCGAATGGGAGCAGAAAGAT2000GAGTTCATCTGCCGTGCAGTCCATGAGGCAGCGAGCCCCTCACAGACCGTCCAGCGAGCGGTGTCTGTAAATCCCGGTAA2080ATGAGAGCTC 2090SEQ ID NO. 7ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCT80GCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTT160GCCGTTACAACTCTCCGCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTC240ATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCT320GGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACT400TGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACT480AAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGG560CATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCA640ACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGAC720CCTCCTGATAGCAAGCCCGGGGGTGGTGGGAGCGGTGGTGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGAACTAGTAATAGTGACTCTGA800ATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCA880ACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC 945

Claims (39)

1.载体，它包含编码肿瘤互作蛋白(“TIP”)的核苷酸序列(“NS”)和可任选地包含目的核苷酸序列(“NOI”)，所述NOI编码目的产物(“POI”)；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中所述载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤。
2.按照权利要求1的载体，其中所述载体包含所述NOI。
3.按照权利要求2的载体，其中所述NOI为治疗NOI和/或所述POI为治疗POI。
4.按照任一前述权利要求的载体，其中在使用中所述载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至肿瘤块内部。
5.按照任一前述权利要求的载体，其中所述TIP是肿瘤结合蛋白(“TBP”)或包含肿瘤结合蛋白。
6.按照任一前述权利要求的载体，其中所述TIP是TBP。
7.按照任一前述权利要求的载体，其中所述NS和/或所述TIP包含至少一种肿瘤结合域，所述肿瘤结合域能够与至少一个肿瘤相关细胞表面分子(“TACSM”)相互作用。
8.按照权利要求7的载体，其中所述TACSM选择性地在一种细胞类型或有限数目的细胞类型上表达。
9.按照任一前述权利要求的载体，其中在使用中所述载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至选择的肿瘤部位。
10.按照任一前述权利要求的载体，其中所述TIP至少是抗体的一部分或至少包含抗体的一部分。
11.按照任一前述权利要求的载体，其中所述TIP识别一种滋养层细胞表面抗原。
12.按照权利要求11的载体，其中所述TIP识别5T4抗原。
13.按照任一前述权利要求的载体，其中所述NS和NOI和/或所述TIP和POI相互连接。
14.按照权利要求13的载体，其中所述TIP和POI直接连接在一起。
15.按照任一前述权利要求的载体，其中所述NS、NOI、TIP和所述POI中的任何一种或多种还包含至少一种另外的功能组分。
16.按照任一前述权利要求的载体，其中至少所述TIP和/或POI还包含至少一种另外的功能组分。
17.按照权利要求15或16的载体，其中所述另外的功能组分选自以下的任何一种或多种：信号实体(诸如信号肽)、免疫增强子、毒素或生物活性酶、或编码其中任一上述物质的序列。
18.按照任一前述权利要求的载体，其中所述反转录病毒载体包含一种肿瘤特异性启动子增强子。
19.按照任一前述权利要求的载体，其中所述载体是反转录病毒载体。
20.将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或由NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤的方法，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中所述NOI和/或所述POI能够识别肿瘤；其中将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中所述载体是任一前述权利要求的载体。
21.按照权利要求20的方法，其中所述载体用来将所述NOI和/或POI体外和/或体内传递至所述肿瘤。
22.载体将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或由NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤的用途，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中当将所述NOI和/或所述POI传递至肿瘤时，所述NOI和/或所述POI能够识别所述肿瘤；并且其中所述载体是任一前述权利要求的载体。
23.按照权利要求22的用途，其中所述载体用来将所述NOI和/或POI体外和/或体内传递至所述肿瘤。
24.治疗需要治疗的受治疗者的方法，所述方法包括将目的核苷酸序列(“NOI”)和/或由NOI编码的目的产物(“POI”)传递至肿瘤，其中利用包含所述NOI和/或表达所述POI的载体将所述NOI和/或POI传递至所述肿瘤；其中所述NOI和/或所述POI能够识别肿瘤；其中将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中所述载体是任一前述权利要求的载体。
25.按照权利要求24的方法，其中所述载体用来将所述NOI和/或POI体外/或体内传递至所述肿瘤。
26.基因载体的用途，即将编码可分泌的TIP(最好是TBP)的治疗基因传递至肿瘤块内部。
27.基因传递系统，用来将编码TIP(最好是TBP)的一种或多种基因导向肿瘤，所述系统包括编码TIP(最好是TBP)的基因载体和体内基因传递系统。
28.治疗癌症的方法，包括将按照权利要求27的基因传递系统中的至少一种TIP(最好是至少一种TBP)基因或者系统或者直接给予肿瘤部位。
29.基因传递系统，用于将编码TIP(最好是TBP)的一种或多种基因或者体内或者体外引入造血(最好是骨髓造血)细胞谱系的细胞中。
30.治疗哺乳动物癌症的方法，包括将按照权利要求29的基因传递系统给予个体，所述基因传递系统能够在得自造血(最好是骨髓造血)来源的细胞中表达TIP(最好是TBP)。
31.基因载体，它包含一种或多种编码TIP(最好是TBP)的治疗基因，所述治疗基因与在肿瘤块中存在的细胞类型中选择性有功能的表达调节元件操作性地连接。
32.基因载体，它包含待传递至所述肿瘤内部的一种或多种治疗基因，其中所述治疗基因编码TIP(最好是TBP)，所述TIP还含有一个或多个效应域。
33.治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括将一种细胞因子或细胞因子编码基因和一种或多种TIP(最好是TBP)基因结合给予个体。
34.TIP(最好是TBP)编码基因至肿瘤部位的传递。
35.包含(a)编码TIP的NS和b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中所述载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；并且其中所述TIP和POI相互融合。
36.包含(a)编码TIP的NS和(b)编码POI的NOI的载体；其中所述TIP能够识别肿瘤，使得在使用中所述载体能够将所述NOI和/或所述POI传递至所述肿瘤；其中所述TIP和POI相互融合；并且其中所述POI能够被分泌。
37.按照任一前述权利要求的载体的用途，即作为所述NS、NOI、POI和TIP中的任何一种或多种的原位生产工厂。
38.按照任一前述权利要求的载体的用途，即当存在于细胞内时将所述NS、NOI、POI和TIP中的任何一种或多种传递至相邻细胞。
39.大致如本文所述的载体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148905A (zh) * 2018-02-13 2018-06-12 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) 一段可作为抑郁症标记物的序列

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9709421D0 (en) 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
US7635687B2 (en) * 1997-06-04 2009-12-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7276488B2 (en) 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
DK1012259T3 (da) * 1997-06-04 2010-01-18 Oxford Biomedica Ltd Tumorrettet vektor
KR20020049054A (ko) * 1999-11-18 2002-06-24 찰스 굿맨 항체
GB2371803A (en) * 1999-11-18 2002-08-07 Oxford Biomedica Ltd Antibodies
AU1290001A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Antibodies
US7575924B2 (en) 2000-11-13 2009-08-18 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
WO2003012054A2 (en) 2001-08-02 2003-02-13 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
RU2305708C2 (ru) 2001-10-02 2007-09-10 Энститю Клейтон Де Ля Решерш Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение
EP1450857B1 (en) * 2001-10-16 2010-09-15 The Government of the United States of America, represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus selected by env-cd4-co-receptor complexes
US20040241703A1 (en) * 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
US7939059B2 (en) * 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US7803913B2 (en) * 2002-05-06 2010-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries
US7566451B2 (en) * 2002-05-06 2009-07-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human immunodeficiency virus-neutralizing human antibodies with improved breadth and potency
GB0300718D0 (en) 2003-01-13 2003-02-12 Ares Trading Sa Proteins
CA2525181A1 (en) 2003-05-21 2004-12-02 Ares Trading S.A. Tnf-like secreted protein
EP1621550A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-01 Dompé S.P.A. Tumor-homing cells engineered to produce tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
TW200621282A (en) * 2004-08-13 2006-07-01 Wyeth Corp Stabilizing formulations
SV2007002227A (es) * 2004-09-10 2007-03-20 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/calicheamicina ref. 040000-0317637
US20080038280A1 (en) * 2004-10-14 2008-02-14 Government Of The United States Of America A32 Monoclonal Antibody Fusion Proteins For Use As Hiv Inhibitors And Vaccines
AU2005302416A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly cross-reactive HIV-1 neutralizing human monoclonal antibodies
GB0426960D0 (en) 2004-12-08 2005-01-12 Ares Trading Sa TGR-3 like protein receptor
WO2007106744A2 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Wyeth Anti-5t4 antibodies and uses thereof
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2064325B1 (en) 2006-09-01 2011-12-07 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
JP2010506839A (ja) * 2006-10-12 2010-03-04 ワイス エルエルシー 乳光の低減を伴う方法および組成物
ES2535613T3 (es) * 2008-07-15 2015-05-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Método inmunoterapéutico
US20100166808A1 (en) * 2008-11-17 2010-07-01 Giovanni Marco Pauletti Method of Facilitating Intracellular Uptake or Transcellular Transport of Cargo Using Nanocarriers Containing Optimal Surface Densities of Integrin-Specific Ligands
EP2419143B8 (en) 2009-04-13 2018-06-27 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Hpv particles and uses thereof
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
KR101832937B1 (ko) * 2009-07-27 2018-02-28 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
RU2533619C2 (ru) 2009-07-27 2014-11-20 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Гликополисиалирование белков, не являющихся белками свертывания крови
HUE049352T2 (hu) 2010-12-22 2020-09-28 Baxalta GmbH Anyagok és módszerek egy vízoldható zsírsavszármazéknak egy fehérjéhez való konjugálására
WO2013041687A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
US9265969B2 (en) * 2011-12-21 2016-02-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Methods for modulating cell function
CA2861437C (en) 2012-01-24 2018-08-21 Pfizer Inc. Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
US20150224181A1 (en) 2012-09-14 2015-08-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Se Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use
GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
ES2917573T3 (es) 2013-09-18 2022-07-08 Aura Biosciences Inc Método de producción de moléculas fotosensibles
EP3215522B1 (en) 2014-11-03 2021-12-01 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Leids Universitair Medisch Centrum T cell receptors directed against bob1 and uses thereof
WO2016142783A2 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Leiden University Medical Center T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof
JP7048482B2 (ja) 2015-08-03 2022-04-05 アメリカ合衆国 Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ欠失変異体、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ欠失変異体をコードする非酵母ベクター、及びそれらの使用
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
MA43135A (fr) 2015-10-30 2018-09-05 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et méthodes pour le du traitement du cancer
MA43134A (fr) 2015-10-30 2018-09-05 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et méthodes de transduction tumorale
EP3368656A4 (en) 2015-10-30 2019-07-17 The United States of America, as represented by the secretary, Department of Health and Human Services TARGETED CANCER THERAPY
EP3585431A4 (en) 2017-02-24 2020-12-16 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC BINDING MOLECULES CAPABLE OF BINDING TO CD137 AND TUMOR ANTIGENS, AND THEIR USES
KR20230166145A (ko) 2017-03-15 2023-12-06 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 방법
EA202092122A1 (ru) 2018-03-08 2020-12-03 Фейнз Терапьютикс, Инк. Антитела против tip-1 и их применения
EP3765493A2 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Genmab A/S Antibodies

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
EP0403559A1 (en) * 1988-03-04 1990-12-27 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
US5591624A (en) * 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
JPH04500308A (ja) 1989-05-17 1992-01-23 リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 組換え型生成物のレトロウィルス媒介分泌
WO1991000047A1 (en) 1989-06-30 1991-01-10 The Regents Of The University Of California Retrovirus detection
JPH06508501A (ja) 1990-07-02 1994-09-29 ブリストル―マイアーズ　スクイブ　カンパニー Ｂ細胞上のｃｄ２８レセプターに対するリガンドおよび該リガンドを用いた細胞間相互作用の調節方法
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9223816D0 (en) 1992-11-13 1993-01-06 Medical Res Council Heat shock proteins and the treatment of tumours
EP0621338A3 (en) * 1993-04-21 1997-10-29 Ajinomoto Kk The interleukin-2 response blocking immunosuppressor.
GB9324807D0 (en) * 1993-12-03 1994-01-19 Cancer Res Campaign Tech Tumour antibody
US5439654A (en) 1994-03-10 1995-08-08 Steris Corporation Cutter for opening sterilant reagent cups
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
AU3635695A (en) 1994-09-19 1996-04-09 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for genetically modifying hematopoietic stem cells
GB9423085D0 (en) 1994-11-16 1995-01-04 Stringer Bradley M J Targeted T lymphocytes
US5824762A (en) * 1994-11-28 1998-10-20 Dow Corning Toray Silicone Co., Ltd. Organopolysiloxane and method for the preparation of the same
WO1996030504A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 Genetic Therapy, Inc. Modified viral envelope polypeptide
FR2732348B1 (fr) * 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Systeme d'expression conditionnel
US20030026789A1 (en) 1995-05-03 2003-02-06 Richard J. Gregory Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors
EP0857217B1 (en) * 1995-10-16 2005-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
WO1997017090A1 (en) * 1995-11-07 1997-05-15 Baylor College Of Medicine Adenovirus-mediated production of bioactive proteins by mammalian cells and animals
WO1997017457A2 (en) 1995-11-08 1997-05-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Stable packaging cell line producing pseudotyped retroviruses
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
US5739018A (en) 1996-08-07 1998-04-14 The Regents Of The University Of California Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
US6133027A (en) 1996-08-07 2000-10-17 City Of Hope Inducible expression system
US6348584B1 (en) * 1996-10-17 2002-02-19 John Edward Hodgson Fibronectin binding protein compounds
DK1012259T3 (da) * 1997-06-04 2010-01-18 Oxford Biomedica Ltd Tumorrettet vektor
DE19724502C1 (de) 1997-06-11 1998-10-08 Webasto Thermosysteme Gmbh Heizgerät
IL141061A0 (en) * 1998-08-10 2002-02-10 Urogenesys Inc Bpc-1 a secreted brain specific protein expressed and sectreted by prostate and bladder cancer cells
AU1290001A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Antibodies
KR20020049054A (ko) * 1999-11-18 2002-06-24 찰스 굿맨 항체

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148905A (zh) * 2018-02-13 2018-06-12 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) 一段可作为抑郁症标记物的序列

Also Published As

Publication number Publication date
DK1012259T3 (da) 2010-01-18
US7531648B2 (en) 2009-05-12
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US7718627B2 (en) 2010-05-18
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ES2332435T3 (es) 2010-02-04
JP2009153524A (ja) 2009-07-16
US6852703B1 (en) 2005-02-08
CA2292760A1 (en) 1998-12-10
US8084249B2 (en) 2011-12-27
EP1717248A1 (en) 2006-11-02
NO995901L (no) 2000-02-04
US20090017532A1 (en) 2009-01-15
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EP1012259A2 (en) 2000-06-28
NO995901D0 (no) 1999-12-02
US20050032216A1 (en) 2005-02-10
US20030018004A1 (en) 2003-01-23
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