CN1286535C - 用于消除丙肝病毒的吸附剂、吸附器和吸附方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种清除丙肝病毒的吸附剂，它具有高度的安全性，利用它能够有效而且选择性地清除患者血液中的丙肝病毒，尤其是免疫复合形式的丙肝病毒，从而加强干扰素治疗的效果；并提供用上述吸附剂制成的吸附器；和清除丙肝病毒的吸附方法。所述的吸附剂包含固定在水不溶性载体上的能够吸附丙肝病毒的化合物。

Description

用于消除丙肝病毒的吸附剂、吸附器和吸附方法
技术领域
本发明涉及用于去除丙肝病毒的吸附剂，它能够选择性地吸附例如血液、血浆等体液中的丙肝病毒，加速丙肝患者的痊愈。本发明还涉及包含上述吸附剂的吸附设备，以及去除丙肝病毒的吸附方法。
现有技术
1989年人们成功地克隆了丙肝病毒的RNA病毒基因组(Q.L.Choo等：Science，244，359，1989)，用重组蛋白来检验抗丙肝病毒的抗体由此成为可能。结果发现，以往被认为非甲非乙肝炎中大多数是丙肝。由此估计，日本目前有约2,000,000HCV携带者，其中1,400,000患有慢性肝炎，300,000患有肝硬化(ShiroIino：Medical Practice in Gastroenterology-2，Hepatitis C，11-17，1993)。
根据卫生和公众福利部的人口统计数据，1992年原发性肝癌导致的死亡人数是27,000(1992年人口统计数据，卫生和福利部统计信息局，卷1，1993)，其中约70％死于与丙肝病毒感染相关的肝细胞癌，目前认为，这种癌发生于慢性肝炎发展为肝硬化之后(S.Kaneko等，Intervirology，37：108，1994；Eiki Matsushita等：Japanese Journal of Clinics，53：727，1995 Special Issue)。所以，可以说丙肝是一种难以治愈的疾病，会发展成肝硬化再发展为肝癌。
治疗丙肝的常规方法主要是围绕休息、饮食控制和使用护肝药和/或中药的药物治疗。但是，由于这些疗法都不能消除丙肝病毒，所以治愈率极低。这就是为什么临床上将重点放在通过缓解局部组织坏死来阻止慢性肝病的发展。所以，随着病程的拖延，如前所述，许多患者死于肝硬化的严重后果即肝细胞癌。
同时，最近已经能够大量生产干扰素，而且发现，这些蛋白不仅具有抗丙肝病毒活性和能够在体外识别RNA病毒(Yasuyuki Ninomiya等：The ClinicalReport，19，231，1985)而且对小鼠受RNA病毒感染具有保护活性(M.Kramer等：J.Interferon Res.，3：425，1983)。所以，干扰素在丙肝临床治疗中的应用变成了关注的焦点。
实际上，接受重组α干扰素治疗的有些非甲非乙肝炎病例(J，H.Hoofnagel等：N.Eng.J.Med.，315：1575，1986)和部分接受干扰素治疗的丙肝病例的血清转胺酶变得正常，有些病例对血液中的丙肝病毒RNA持续阴性(K.Chayama等：Hepatology，13，1040，1991；Hideki Ogiwara等：Japanese Journal of Gastroentology，88，1420，1991)。根据以上结果，干扰素开始被广泛用于临床。所以，丙肝治疗获得了从对症治疗向病因治疗这一决定性的进步。
但是，过去数年中在日本用干扰素治疗的约200,000例丙型慢性活性肝炎中，病毒消除并获得痊愈的只有约30％，而在其余的70％病例中，病毒仍然存活，或者证明治疗无效，或者发生复发(Migito Yano：Japanese Journal of Clinics，53：986，1995 Special Issue)。
决定治疗是否成功，丙肝病毒的基因类型、血液中的病毒数量和肝病的所处阶段是重要因素，但是血液病毒数量是所有因素中最重要的。例如，当1ml患者血液中的病毒数量少于1,000,000拷贝时，约80％这样的病例可以通过使用干扰素来消除体内病毒并获得痊愈，但是当病毒数量超过1,000,000拷贝时，治愈率仅为约9％(Fumio Imazeki等，Japanese Journal of Clinics，53，1017，1995)。
除了上述病毒数量外，本发明的发明人还发现，病毒颗粒在血液中的存在方式也是一个影响干扰素治疗效果的重要因素。已经有报道称，血液中的丙肝病毒颗粒可以根据其在血液中的悬浮密度分为高感染性低密度颗粒和低感染性高密度颗粒。所以，发明人对不同密度的病毒颗粒与疾病严重程度和干扰素疗法之间的关系进行了研究，发现，虽然干扰素治疗在低密度病毒颗粒比高密度病毒颗粒之比为10∶1的患者中有75％的治愈率，但是在该比为1∶10的患者中，治愈率仅为13％。
还发现，在血液中，低密度病毒颗粒与脂蛋白结合而高密度病毒颗粒与免疫球蛋白结合而以免疫复合物的形式存在(Akihito Skai等：Japanese Journal ofGastroenterology，92：(Special Issue)，1488，1995)。
所以，显然，目前干扰素治疗的缺点在于血液中病毒数量或免疫复合病毒数量越低，治疗反应就越高，相反，血液中病毒数量或免疫复合病毒数量越高，则治疗反应就越低。
发明概述
本发明的目的在于提供一种用于清除丙肝病毒的吸附剂，它能够安全、高效和高选择性地吸附患者体液中的丙肝病毒颗粒，尤其是免疫复合型丙肝病毒颗粒，由此加强干扰素疗法的效果；还提供一种包含所述吸附剂的丙肝病毒吸附设备，和清除丙肝病毒的吸附方法。
为了实现上述目的，本发明的发明人努力寻找这样一种化合物，这种化合物固定于水不溶性载体上与患者血液接触时必须表现出对丙肝病毒的高吸附亲和性，但是对白蛋白之类蛋白质则没有所述亲和性。结果，发明人发现，能够吸附丙肝病毒尤其是对免疫球蛋白和/或免疫复合物具有结合亲和性的化合物固定于水不溶性载体上构成的吸附剂表现出极高的丙肝病毒吸附性能。本发明就是基于这一发现形成的。
所以，本发明涉及用于清除丙肝病毒的吸附剂，它包括固定在水不溶性载体上能够吸附丙肝病毒的化合物。
附图说明
图1显示用各种水不溶性载体充填的玻璃柱的流速与压降之间的关系。纵坐标表示流速(cm/min.)，横坐标表示压降(kg/cm2)；
图2是本发明丙肝病毒吸附设备的剖面图；
图3显示的是pUCNTMK3P47载体。
数字符号表示：
1.出口
2.入口
3.吸附剂
4、5.防止吸附剂渗漏的装置
6.柱
7.设备
发明详述
以下是对本发明的详细说明。
本发明用于清除丙肝病毒的吸附剂包含水不溶性载体和固定于其上能够吸附丙肝病毒的化合物。
对于能够吸附HCV的化合物没有特殊的限定，只要它吸附丙肝病毒，但是优选的化合物具有对免疫球蛋白和/或免疫复合物的结合亲和性。
在能够吸附与免疫球蛋白和/或免疫复合物偶联的丙肝病毒的化合物中，优选的是这样的化合物：与丙肝病毒颗粒相比，它优先并且有效地吸附与免疫球蛋白和/或免疫复合物偶联的丙肝病毒。
更好的是，上述具有对免疫球蛋白和/或免疫复合物结合亲和性的化合物是免疫球蛋白结合蛋白。
这种免疫球蛋白结合蛋白包括但不限于蛋白A、蛋白G、蛋白H、蛋白L、蛋白M、类风湿因子和补体。
更好的是，具有对免疫球蛋白和/或免疫复合物结合亲和性的化合物是抗免疫球蛋白抗体。
更好的是，上述能够吸附丙肝病毒的化合物是所述免疫球蛋白结合蛋白和/或抗免疫球蛋白抗体的组成部分，即具有免疫球蛋白和/或免疫复合物结合位点的蛋白片段或肽，或者是所述蛋白片段或肽的衍生物。
至于水不溶性载体，较好的例子是多孔性载体。
更好的是，平均孔径为10至1500nm的多孔性水不溶性载体。
水不溶性载体的另一种较好形式是基本无孔的载体。而且，水不溶性载体最好是亲水性的。
本发明用于清除丙肝病毒的吸附剂可以用于从包括血液和血浆在内的体液中清除丙肝病毒。
用于清除丙肝病毒的吸附剂还可以用于从包括血液和血浆在内的体液中清除免疫复合物形式的丙肝病毒。
本发明用于清除丙肝病毒的吸附设备包括一个容器，该容器具有入口和出口供液体进出并装有上述吸附剂中的任意一种，还包括防止丙肝病毒吸附剂从容器中渗漏的装置。
清除丙肝病毒的吸附方法包括上述吸附剂与含丙肝病毒体液接触的步骤。
本发明清除HCV方法中使用的含HCV体液包括血液和血浆，以及其它体液。
以下说明本发明的优选实施方式，但是本发明的范围不局限于这些具体的实施方式。
本发明使用的吸附丙肝病毒的化合物是能够吸附大部分丙肝病毒的化合物，所以在种类上没有限制。但较好的是特异性结合免疫球蛋白重链或轻链和/或免疫球蛋白复合物的物质。
上述能够结合免疫球蛋白重链或轻链和/或免疫复合物的物质具体包括一般称为免疫球蛋白结合蛋白的化合物和抗免疫球蛋白抗体，前者例如能够结合免疫球蛋白G重链中的Fc结构域的蛋白A、蛋白G、蛋白H、蛋白M、类风湿因子和补体，以及具有轻链结合特异性的蛋白L(L.Bjorck：J.Immunol.140，1194，1988；H.Gomi等：J.Immunol.，144，4046，1990；Hisayuki Doi：MenekiRinsho(Clinical Immunology)23，896，1991)。
本文还可能提到上述物质的片段，它们对免疫球蛋白和/或免疫复合物有着实质性的结合亲和性，例如对应于蛋白A中从A至E结构域-免疫球蛋白结合位点-的58个残基的肽(M.Uhlen等，J.Biol，Chem.，259：1965，1984)，FB29肽-蛋白A中B结构域的进一步节略形式(J.S.Huston等：Biophysical J.，62：87，1992)，对应于蛋白G中C1至C3结构域的55个残基的肽(B.Guss等：EMBO J.，5，1567，1986)，蛋白H的A结构域肽(H.Gomi等：ibid)，蛋白L的B1至B5结构域肽(Bjorck，Laruth等，日本专利公开平成-7-506573)和补体C1q的CBP2肽(M.A.Baumann等：J.Biol.Chem.，265，18414(1990))，和所谓免疫球蛋白结合蛋白的其它免疫球蛋白结合结构域肽，以及它们的衍生物。
而且，类风湿因子或抗免疫球蛋白抗体的Fab和F(ab)2片段、单链Fv多肽等也可以作为代表性实施例。
对可以用于本发明的水不溶性载体没有特殊的限定，包括玻璃珠和硅胶等无机载体，合成的聚合物如交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等有机载体，和晶体纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等聚多糖，以及由上述材料构成的有机-有机或有机-无机复合载体。
特别优选的是亲水性载体，因为这类载体的特征在于非特异性吸附量较小而对丙肝病毒的特异性吸附量很高。“亲水性载体”表示组成载体的化合物在被制成平片层形式时，其水接触角不超过60度。
对载体的种类没有特殊限定，包括用以下材料制成的载体：纤维素、几丁质、琼脂糖、葡聚糖等聚多糖，聚乙烯醇，皂化的乙烯乙酸乙烯酯聚合物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚丙烯酸-聚乙烯合体，聚丙烯酰胺-聚乙烯合体，玻璃等。
尤其是，含有OH基团的载体具有更好的吸附能力和选择性。而且，多孔纤维素凝胶具有以下优点(1)至(4)，就实施本发明所用的水不溶性载体而言是最优选的载体之一。
(1)由于机械强度和硬度较高，该凝胶不易因搅拌等作用而崩解成粉尘样的细小颗粒，充入柱内时，即使体液高速流过柱床，它也不会严重压缩或堵塞。而且，由于其多孔结构，即使高压灭菌时也不易形变。
(2)由于是用纤维素制成，该凝胶是亲水性的，具有大量结合配体的羟基，而非特异性吸附低。
(3)即使提高空隙率仍能保持较高的强度，因而其吸附能力可以如软凝胶一样大。
(4)与合成聚合物凝胶或其它凝胶相比，该凝胶的安全性更高。
上述水不溶性载体可以各个单独使用，也可以两种或两种以上适当混合使用。
考虑到它作为丙肝病毒吸附剂的用途和使用方式，本发明使用的水不溶性载体宜具有较大的表面积，就此而言，最好是具有大量孔隙即多孔性的载体。
所述多孔性水不溶性载体的平均孔径宜为10至1500nm。丙肝病毒的粒径为50至55nm，为了多孔性载体能够有效吸附这些病毒颗粒，载体的孔径分布宜大大偏向于大于病毒粒径的范围。如果孔径太大，将有损载体的强度并降低表面积。较好的平均孔径是50至1250nm。
另一方面，即使是基本上无孔的载体也能够吸附病毒。这种载体可利用的优点在于：体液(血液、血浆、血清等)中对机体有用的蛋白和其它组份几乎不吸附于基本无孔的载体。
“基本上无孔”在本说明书中包括孔很小(例如小于10nm)的有孔载体。
另外，有关所述水不溶性载体的孔隙结构，就单位体积吸附剂的吸附能力而言，孔隙最好不局限于表面而是在载体内通体分布，而且载体的空隙率不宜低于20％，比表面积不宜低于3m2/g。
对所述水不溶性载体的形状没有特别的限定，包括珠状、纤维状(包括中空纤维)和薄膜状，以及其它。从体液在体外循环中流体动力学的观点出发，宜采用的是珠状载体。就所述珠状载体的平均粒径而言，便于使用的是10至2500μm的微珠。但是，以采用25至800μm的微珠为佳。
带有将配体固定在水不溶性载体表面的官能团将有利于固定化。
这类官能团的代表性例子包括羟基、氨基、醛基、羧基、硫醇、硅烷醇、酰氨基、环氧基、琥珀酰氨基、酸酐、以及其它官能团。
上述水不溶性载体既可以是硬凝胶也可以是软凝胶。对用作体外循环治疗的吸附剂而言，重要的是在充入柱内时一定不能发生堵塞阻碍体液通过-即孔隙的堵塞。所以，为了确保足够的机械强度，水不溶性载体以硬凝胶为宜。
在本发明中，硬载体即这样的载体：当例如珠状的凝胶在下述条件下均匀充入玻璃圆柱(直径9mm，长150mm)时，水相液体能够通过充填柱，压降(ΔP)和0.3kg/cm2以上流速之间存在线性关系。
例如，在一玻璃圆柱(直径9mm，长150mm)的两端装配孔径15μm的滤器，柱中均匀地充填以琼脂糖凝胶(Bio-Rad，Biogel-A5m，粒径50至100目)，乙烯聚合物凝胶(Toyo Soda，Toyopearl HW-65，粒径50-1000μm)或纤维素凝胶(ChissoCorporation，Cellulofine GC-700m，粒径45-105μm)，利用蠕动泵将水引入柱中，制作流速和压降(ΔP)之间的关系图(图1)。
纵坐标为流速(cm/min)，横坐标为压降(kg/cm2)。图1中，○代表ToyopearlHW-65，△代表Cellulofine GC-700m，●代表Biogel-A5m。
结果，如果用Toyopearl HW-65和Cellulofine GC-700m，流速升高与压力增加几乎成正比，Biogel-A5m因为发生压缩所以提高压力不能加快流速。
在根据本发明将免疫球蛋白结合蛋白或肽固定到水不溶性载体上时，为了降低蛋白质或肽的位阻以改善吸附效率并抑制非特异性吸附，最好通过有关亲水性臂来固定。
较好的亲水性臂有例如聚氧化亚烃，它是聚亚烃链被例如羧基、氨基、醛或环氧基等取代基在其一个末端修饰而得的衍生物。
欲固定在所述水不溶性载体上的对免疫球蛋白和/或免疫复合物具有结合亲和性的化合物与作为臂的有机化合物可以用合适的技术来固定。这类技术包括用于将蛋白质和肽固定在载体上的常规技术，例如利用环氧反应、Nic碱反应的方法，利用碳化二亚胺试剂、活泼酯反应的缩合反应，和利用戊二醛试剂的载体交联反应。
考虑到本发明用于清除丙肝病毒的吸附剂主要用于体外循环疗法和清血法，使用的固定方法最好能确保在灭菌和在所述治疗过程中，蛋白质等不易从水不溶性载体中释放出来。例如，可用以下方法。
(1)载体的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺反应，取代出一个琥珀酰亚氨基氧基羰基，使它与蛋白质或肽的氨基反应(活泼酯法)。
(2)在例如二环己基碳化二亚胺之类缩合剂存在下，载体的氨基或羧基与蛋白质或肽的羧基或氨基发生缩合反应。(缩合法)
(3)利用双官能团或多官能团化合物-例如戊二醛交联发生蛋白质或肽的交联(载体交联法)。
为了抑制蛋白质从载体上释放和洗脱，最好是通过共价键来固定。
带有能够吸附丙肝病毒的化合物的载体与例如血液、血浆或血清之类体液接触，由此从体液中清除丙肝病毒的吸附方法有多种实施形式。具体地说，有以下几种。
(1)抽取患者体液，收集在储血袋之类容器中，将吸附剂与体液混合以清除丙肝病毒，滤去吸附剂，将基本上无丙肝病毒的体液输回给患者。
(2)提供一个具有入口和出口的容器，并配以体液可透过而吸附剂不可透过的滤器，用吸附剂充填容器，令体液流经充填的吸附剂。
虽然两种方法均可选用，但是方法(2)更便捷。而且，所述的容器或柱被装配人体外循环管路中时，能够有效而且直接从患者体液中清除丙肝病毒。本发明用于清除丙肝病毒的吸附剂适用于后一种方法。
以下将结合附图详细说明包含本发明清除丙肝病毒的吸附剂的丙肝病毒吸附设备。
参照图2，设备7具有液体入口或出口1，液体出口或入口2，本发明的丙肝病毒吸附剂3，用于防止吸附剂渗漏的装置4和5，体液及其中成份能够顺利通过所述装置而吸附剂则不能，以及柱体6。
对于设备的几何形状和材料没有特殊限定。但是，最好使用容量约20至400ml，直径约2-10cm的圆柱形设备。
本发明的最佳实施方式
以下实施例更详细地说明了本发明，但是并不是对其范围的限定。在本说明书中，用以下缩写代表各种氨基酸残基：
Ala：L-丙氨酸残基，Asp：L-天冬氨酸残基，Asn：L-天冬酰胺残基，Cys：L-半胱氨酸残基，Gln：L-谷氨酰胺残基，Glu：L-谷氨酸残基，Gly：L-甘氨酸残基，Ile：L-异亮氨酸残基，Leu：L-亮氨酸残基，Lys：L-赖氨酸残基，Phe：L-苯丙氨酸残基，Thr：L-苏氨酸残基，Trp：L-色氨酸残基，Tyr：L-酪氨酸残基，Val：L-缬氨酸残基。
本说明书中，按照常规方式来描述肽的氨基酸序列，假设其氨基端(后文称N末端)在左，羧基端(后文称C末端)在右。
实施例1
将IgG结合蛋白(蛋白A)固定到多孔性载体(GCL 2000m)上
环氧活化纤维素凝胶
用水将90ml纤维素多孔性硬凝胶(Chisso Corporation，球蛋白截留分子量3×106)定容成180ml，然后加入60ml 2M氢氧化钠，调节凝胶温度至40℃。在凝胶中加入21ml表氯醇，环氧化反应在40℃进行1小时。反应结束后，用水彻底洗涤凝胶，得到环氧活化的纤维素凝胶。
蛋白A的固定化
将4mg蛋白A(Sigma)溶于0.5ml 0.05M硼酸盐缓冲液(pH10.0)中，加入0.01N的NaOH/水，将pH调节至10，并将总体积调至1.0ml(蛋白A溶液)。将该蛋白溶液(总体积)加入1ml上述环氧活化纤维素凝胶中，混合物在37℃振摇16小时，用足量的PBS(10mM磷酸盐缓冲液，其中补充了150mM的氯化钠)洗涤后得到GCL 2000m-蛋白A。
定量测定固定化蛋白量
在固定化反应之前和之后采用HPLC测定反应混合物中蛋白A的浓度，并计算反应速度来得出固定化的量。实验发现每ml蛋白A-GCL 2000m上固定有2.1mg蛋白A。
实施例2
将IgG结合蛋白(蛋白G)固定到多孔性载体(GCL 2000m)上
用蛋白G(Pharmacia LKB)代替蛋白A，重复实施例1的过程，得到GCL2000m-蛋白G(3.2mg/ml)。
实施例3
将蛋白G的IgG结合结构域固定到多孔性载体(Sepharose 6B)上
肽的合成
使用4170型肽合成仪(Pharmacia LKB)，用固相法合成一段肽，它具有G蛋白C3结构域的57个氨基酸残基序列，并在N末端加有一个半胱氨酸。
利用0.1mmol带有C末端谷胺酰胺的树脂Fmoc-谷胺酰胺NovaSyn KA朝N末端方向不断重复去保护和缩合反应，使得肽链根据输入上述肽合成仪中的程序来延伸。
这样，重复以下循环：用哌啶去除氨基酸的α-氨基保护基即9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，用四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基和二异丙基乙胺进行缩合反应，然后用DMF洗涤。
氨基酸以以下形式使用：Fmoc-L-Ala，Fmoc-L-Asn(Trt)，Fmoc-L-Asp(OtBu)，Fmoc-L-Cys(Trt)，Fmoc-L-Gln(Trt)，Fmoc-L-Glu(OtBu)，Fmoc-L-Gly，Fmoc-L-Ile，Fmoc-L-Leu，Fmoc-L-Lys(Boc)，Fmoc-L-Phe，Fmoc-L-Thr(tBu)，Fmoc-L-Trp，Fmoc-L-Tyr和Fmoc-L-Val，根据试管中的底物，氨基酸各自的用量为5摩尔当量(0.5mmol)。这里，Trt、OtBu、Boc和tBu分别代表三苯甲游基、四丁基酯、四丁基氧羰基和四丁基。
肽链的去保护和剪切
在完成了所有氨基酸的反应后，在3G-3有孔玻璃滤器上顺次用四戊基醇、乙酸和乙醚洗涤载体，然后真空干燥得到干的载体。在瓶内1g的所得载体中加入2Cml三氟乙酸(TFA)，260μl 1，2-乙二醇和780μl茴香醚，室温下拌混合物1.5小时。
然后，混合物滤过3G-3有孔玻璃滤器以去除载体，35℃减压浓缩滤液。在残留物中加入事先冷却的无水乙醚，直至搅拌下不再产生沉淀，然后离心，回收粗肽颗粒。分几次用无水乙醚洗涤粗肽，真空干燥得到目标粗肽。
肽的纯化
将上述粗肽溶于0.1％TFA中，滤过0.2μm的滤膜，对滤液进行高效液相层析。在该HPLC中，反向使用LC-10A模式系统(Shimadzu)和作为层析柱的μBondasphere C18(Nippon Millipore-Waters)。作为移动相，以0.1％TFA/H2O作为溶剂A，以0.1％TFA-80％(v/v)乙腈/H2O作为溶剂B，利用由溶剂A向溶剂B的线性梯度进行洗脱。
收集对应于层析峰的流份。重复几次流份洗脱，冷冻干燥汇集的流份，得到纯化肽。用气相蛋白质测序仪477(Applied Biosystem)和Hitachi Custom离子交换树脂对该肽进行的氨基酸分析证实：所得肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
肽的固定化
如下，将上述肽固定在多孔性Sepharose上制成吸附剂。作为Sepharose，可使用硫代丙基-Sepharose 6B(Pharmacia LKB)。在50g硫代丙基-Sepharose 6B中加入50ml蒸馏水，混合物在室温下静置15分钟让树脂膨胀。然后，去除蒸馏水代之以0.5M NaCl-0.1M Tris-HCl(pH7.5)偶联缓冲液。
另一方面，将4mg上述纯化肽溶于400μl 0.5M NaCl-0.1M Tris-HCl(pH7.5)偶联缓冲液。将上述膨胀硫代丙基-Sepharose 6B加入该溶液，混合物在4℃搅拌12小时，由此得到带有纯化肽的吸附剂。
抽滤得到这种带肽的吸附剂，利用绝对校准曲线法经HPLC测定滤液中的肽含量，由此得出肽的固定化比率。用150mM NaCl-10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤带肽的吸附剂，并抽滤回收Sepharose 6B-C3Ppt，其中每ml载体带有3.6mg肽。
实施例4
将IgG结合肽(MK3P47)固定到多孔性载体(Kac)上
MK3P47肽的生产
设计并合成编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2的MK3P47肽的DNA，使得它能够通过5’端的NdeI限制性酶切位点和3’端的HindIII限制性酶切位点与pUCNT载体(日本专利公开平成-4-212692)连接。该合成DNA的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：3中。
根据Takara Shuzo的DNA连接试剂盒第2版中的说明书，将具有上述序列的DNA与经限制性酶NdeI和HindIII(Takara Shuzo)剪切的pUCNT载体连接，构建pUCNTMK3P47载体(图3)。
然后，利用已知技术将pUCNTMK3P47载体DNA亚克隆到大肠杆菌HB101(Irivitrogen)中，并挑选出对作为指示物的青霉素有抗性的一个转化体。
抽提该转化体中的DNA并利用常规方法测序来证实它的DNA序列符合pUCNTMK3P47载体的原设计。
然后，该转化体在6L L-肉汤培养基(5g/l NaCl，10g/l细菌胰蛋白酶，5g/l酵母提取物)中37℃振荡培育20小时，然后离心回收(Hitachi RPR9-2转头，4℃，6000rpm×20min)细胞。
将获得的沉积物以300ml TE缓冲液(20ml Tris-HCl，1mM EDTA·pH7.5)重悬，超声波处理(BRANSON 250，冰浴中，6分钟，3次)，离心(Hitachi RPR16转头，4℃，1500rpm×20min)，回收上清液。
上述上清液在70℃加热10分钟，然后再离心(Hitachi RPR16转头，4℃，15000rpm×20min)，得到300ml上清液。如下所示从该上清液中分离目标MK3P47肽。采用高效液相层析(层析柱：Waters的μBONDASPHERE 5μC18 300A，19.0×150mm)，40ml乙腈以5ml/min的流速通过以活化层析柱，然后以相同的流速通过300ml样品。层析柱用200ml 0.1％TFA+64％乙腈洗涤，然后用200ml0.1％TFA+40％乙腈洗脱目标MK3P47肽。
在蒸发器上将该流份浓缩至100ml，冷冻干燥成1.2g高纯度肽样品。
环氧活化纤维素凝胶
取本申请人制备的球蛋白截留分子量大于5×106的原型纤维素多孔硬凝胶Kac 90ml，用水配制成180ml。然后，加入60ml 2M的氢氧化钠，将凝胶的温度升高到40℃。在该凝胶中加入表氯醇，反应在40℃搅拌进行1小时。反应完全后，用水彻底洗涤凝胶，得到环氧活化的纤维素凝胶。
MK3P47肽的固定和固定化蛋白量的测定
用50mg MK3P47代替4mg蛋白A，用环氧活化的Kac代替环氧活化的GCL-2000m，重复实施例1的过程，得到Kac-MK3P47(30mg/ml)。
实施例5
将IgG结合肽(MP47C)固定到多孔性载体(Sephacryl S1000)上
制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的肽MP47C。
设计并合成一段具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的DNA(编码MP47C)，使得它能够如实施例4所述与pUCNT载体连接。
利用实施例4中的过程，将上述DNA与pUCNT载体连接，制备得到pUCNTMP47C载体。
然后，利用实施例4中的方法，构建大肠杆菌转化体，并从其6升培养物中获得1.3g高纯度的目标肽样品，将其用于各种研究。
环氧活化Sephacryl凝胶
用水将90ml纤维素多孔性硬凝胶Sephacryl S1000(孔径400nm)(PharmaciaKLB)配制成180ml。然后加入60ml 2M氢氧化钠，将凝胶温度升至40℃。在该凝胶中加入21ml表氯醇，在40℃搅拌反应1小时。反应完全后，用水彻底洗涤凝胶，得到环氧活化的Sephacryl凝胶。
MP47C的固定和固定化蛋白量的测定
用10mg MP47C代替4mg蛋白A，用环氧活化的Sephacryl凝胶代替环氧活化的GCL-2000m，重复实施例1的过程，得到S1000-MP47C(7mg/ml)。
实施例6
将IgG结合肽(MP47C)固定到基本上无孔的载体(Bac)上
环氧活化纤维素凝胶
用水将90ml球蛋白截留分子量小于3×104的原型纤维素硬凝胶无孔载体(Bac)配制成180ml。然后，加入60ml 2M氢氧化钠，将凝胶升温至40℃，在该凝胶中加入21ml表氯醇，40℃搅拌反应1小时。反应完全后，用水彻底洗涤凝胶，得到环氧活化的纤维素凝胶。
MP47C的固定和固定化蛋白量的测定
用30mg MP47C代替4mg蛋白A，用环氧活化的Bac代替环氧活化的GCL-2000m，重复实施例1中的固定化过程，得到Bac-MP47C(20mg/ml)。
实施例7
将抗IgG抗体的Fab片段固定到多孔性载体(CNBr活化的Sepharose 6B)上
用少量1mM HCl/H2O让4g CNBr活化的Sepharose 6B(Pharmacia LKB)膨胀15分钟，依次用1mM HCl/H2O和偶联缓冲液(pH8.3，0.5M NaCl，0.1M NaHCO3)洗涤。
将木瓜蛋白酶消化得到的1mg抗人IgG抗体(Binding Site Co.)的Fab(PIECE，免疫纯Fab制备试剂盒)溶解在1ml偶联缓冲液中。在溶液中加入上述洗涤后的凝胶，4℃反应16小时。
用偶联缓冲液洗涤反应混合物后，加入封闭缓冲液(pH8.3，0.2M甘氨酸，0.5M NaCl，0.1M NaCHO3)，室温反应2小时。
反应产物用两种后处理缓冲液(pH4.0，0.5M NaCl，0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液，和pH8.0，0.5M NaCl 0.1M Tris-HCl缓冲液)交替各洗涤3次，得到Sepharose4B-抗IgG Fab。
实施例8
将抗IgG抗体固定到多孔性载体(tresyl Toyopearl)上
将1mg抗人IgG(Fc)抗体(Binding Site Co.)溶于1ml偶联缓冲液(0.5M NaCl，0.1M碳酸钠缓冲液)中，然后加入200mg无水AF-tresyl-Toyopearl 650。在4℃反应通宵。
用0.5M NaCl/水洗涤反应产物，然后加入封闭缓冲液(pH8.0，0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl缓冲液)，室温反应2小时。
反应混合物再用0.5M NaCl/水洗涤后得到Toyopearl-抗IgG。
实施例9
评价合成吸附剂的丙肝病毒吸附性能
吸附实验
各种吸附剂取100μl加入小瓶中，加入100μl含有丙肝病毒的患者血清，混合物在37℃振摇2小时。
吸附丙肝病毒能力的测定
上述悬浮液5000rpm离心1分钟，测定上清液中的丙肝病毒即HCVRNA(Nippon Roche，Amplicore HCV检测仪)含量。
作为对照实验，用100μl生理盐水代替吸附剂加入小瓶中，重复上述过程测定溶液中丙肝病毒含量。
利用以下方程计算丙肝病毒吸附率(％)：
吸附率(％)＝[(Vr-Vt)/Vr]×100
Vr：对照溶液中的病毒浓度
Vt：吸附试验上清液中的病毒浓度
结果见表1。
                                         表1
  实施例   吸附剂  吸附试验上清液中的HCVRNA(拷贝/ml)   对照溶液中的HCVRNA(拷贝/ml)   吸附率(％)
  12345678   GCL2000M-蛋白AGCL2000M-蛋白GSepharose6B-C3PptKac-MK3P47S1000-MP47CBac-MP47CSepharose4B-抗IgG FabToyopearl-抗IgG   2.70E+041.40E+048.10E+043.20E+041.00E+044.20E+044.80E+043.60E+04   7.90E+047.90E+041.12E+051.05E+051.05E+051.05E+051.05E+051.05E+05   6682287091605466
实施例10
合成吸附剂的评价
吸附测试
各种吸附剂取100μl加入小瓶中，加入100μl含有丙肝病毒的患者血清，混合物在37℃振摇2小时。
高密度HCV/低密度HCV之比的测定
各吸附实验中获得的HCV悬浮液和用生理盐水代替吸附剂重复相同方法得到的HCV悬浮液分别与抗LDL和抗IgG抗体混合，反应在4℃进行16小时。反应混合物5000rpm离心15分钟，回收沉淀，测定丙肝病毒即HCV RNA(NipponRoche，Amplicore HCV检测仪)的量。将用抗LDL抗体沉淀的HCV作为低密度HCV，用抗IgG抗体沉淀的HCV作为高密度HCV，计算HCV RNA之比(T/B＝低密度HCV/高密度HCV)。
结果见表2。
                                表2
  实施例   吸附剂   吸附实验的T/B HCV   对照实验的T/B HCV
  12345678   GCL2000M-蛋白AGCL2000M-蛋白GSepharose6B-C3PptKac-MK3P47S1000-MP47CBac-MP47CSepharose4B-抗IgG FabToyopearl-抗IgG   3/12/13/21/11/11/51/31/3   1/11/11/11/101/101/101/101/10
                           产业应用性
以上实施例清楚地显示，本发明提供了一种新的吸附剂，它能够选择性吸附和清除体液中的丙肝病毒，并/或能够降低高密度HCV与低密度HCV之比。而且，利用上述吸附剂充填的体液处理设备，可以选择性地清除例如血液、血浆和血清等体液中的丙肝病毒。
                              序列表
SEQ ID NO：1
长度：58
类型：氨基酸
拓扑结构：线性
种类：肽
Cys Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
 1               5                   10                  15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe
            20                  25                  30
Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp
        35                  40                  45
Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
    50                  55
SEQ ID NO：2
长度：60
类型：氨基酸
拓扑结构：直链
种类：肽
Met Lys Lys Lys Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu
 1               5                   10                 15
Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys
             20                 25                   30
Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr
         35                 40                  45
Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
    50                  55                  60
SEQ ID NO：3
长度：190
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
CATATGAAAA AGAAGACCAC CTATAAACTG GTTATCAACG GTAAAACCCT GAAAGGTGAA
GTATACTTTT TCTTCTGGTG GATATTTGAC CAATAGTTGC CATTTTGGGA CTTTCCACTT     60
ACCACCACCA AGGCTGTTGA CGCTGAAACC GCTGAAAAAG CATTTAAACA GTATGCTAAC
TGGTGGTGGT TCCGACAACT GCGACTTTGG CGACTTTTTC GTAAATTTGT CATACGATTG    120
GACAACGGTG TCGACGGTGT TTGGACCTAT GACCCCGCTA CCAAAACCTT TACCGTTACC
CTGTTGCCAC AGCTGCCACA AACCTGGATA CTGGGGCGAT GGTTTTGGAA ATGGCAATGG    180
GAATAAGCTT
CTTATTCGAA 190
SEQ ID NO：4
长度：58
类型：氨基酸
拓扑结构：线性
种类：肽
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
 1               5                   10                 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys
             20                  25                 30
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Pro
         35                 40                  45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
    50                  55
SEQ ID NO：5
长度：184
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
CATATGACCA CCTATAAACT GGTTATCAAC GGTAAAACCC TGAAAGGTGA AACCACCACC
GTATACTGGT GGATATTTGA CCAATAGTTG CCATTTTGGG ACTTTCCACT TTGGTGGTGG    60
AAGGCTGTTG ACGCTGAAAC CGCTGAAAAA GCATTTAAAC AGTATGCTAA CGACAACGGT
TTCCGACAAC TGCGACTTTG GCGACTTTTT CGTAAATTTG TCATACGATT GCTGTTGCCA   120
GTCGACGGTG TTTGGACCTA TGACCCCGCT ACCAAAACCT TTACCGTTAC CGAATGCTAA
CAGCTGCCAC AAACCTGGAT ACTGGGGCGA TGGTTTTGGA AATGGCAATG GCTTACGATT   180
GCTT
CGAA 184

Claims (11)

1.一种用于清除丙肝病毒的吸附剂，它包含固定在水不溶性载体上的能够吸附丙肝病毒的化合物，所述化合物选自：蛋白A，蛋白G，抗免疫球蛋白抗体，免疫球蛋白结合蛋白和/或抗免疫球蛋白抗体的片段，所述片段选自蛋白G中C1至C3结构域55个残基的肽和抗IgG抗体的Fab片段。
2.一种用于清除丙肝病毒的吸附剂，它包含固定在水不溶性载体上能够吸附于免疫球蛋白和/或免疫复合物结合的丙肝病毒的化合物，所述化合物选自免疫球蛋白结合蛋白和/或抗免疫球蛋白抗体的片段，所述片段选自蛋白G中C1至C3结构域55个残基的肽和抗IgG抗体的Fab片段。
3.根据权利要求1或2所述的清除丙肝病毒的吸附剂，其中的水不溶性载体是多孔性载体。
4.根据权利要求3所述的清除丙肝病毒的吸附剂，其中多孔性载体的平均孔径为10至1500nm。
5.根据权利要求1或2所述的清除丙肝病毒的吸附剂，其中的水不溶性载体是孔径小于10nm的载体。
6.根据权利要求1或2所述的清除丙肝病毒的吸附剂，其中的水不溶性载体是亲水性载体。
7.根据权利要求1或2所述的清除丙肝病毒的吸附剂，它被用来清除血液、血浆或血清中的丙肝病毒。
8.根据权利要求1或2所述的清除丙肝病毒的吸附剂，其中的丙肝病毒是免疫复合型病毒。
9.一种吸附丙肝病毒的设备，它包括一个具有供液体进出的入口和出口，以及用于装载权利要求1至8中任一项所述的清除丙肝病毒的吸附剂的容器，和用于防止所述清除丙肝病毒的吸附剂从容器中渗漏的装置。
10.吸附丙肝病毒的方法，它包括将权利要求1至8中任一项所述的清除丙肝病毒的吸附剂与含有丙肝病毒的液体接触的步骤。
11.根据权利要求10所述的吸附丙肝病毒的方法，其中含有丙肝病毒的液体是血液、血浆或血清。
CNB988036614A 1997-03-25 1998-03-25 用于消除丙肝病毒的吸附剂、吸附器和吸附方法 Expired - Fee Related CN1286535C (zh)

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