CN1309418C - 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 - Google Patents

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Abstract

记载了一种具有式(I)结构的免疫刺激寡脱氧核酸分子(ODN)以及一种含有这种ODN的药物组合物，式(I)中任何NMP是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞苷-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷或N-异戊烯基-脱氧腺苷一磷酸或一硫代磷酸的2’脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，NUC是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞苷、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷或N-异戊烯基-脱氧腺苷的2’脱氧核苷，任何X是O或S，a和b是从0至100的整数，条件是a+b介于4和150之间，B和E是核酸分子的5’或3’端的常用基团。

Description

免疫刺激性寡脱氧核苷酸
本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核酸分子(ODN)以及含有这种ODN的药物组合物。
疫苗比任何其它医学干预手段能挽救更多的生命(和节省更多的资源)(Nossal，1998)。由于实行了世界范围的接种疫苗计划，所以许多致命疾病的发生率已被大大地降低。尽管这一计划对整个一组有代表性的疾病，例如肺结核、白喉、百日咳、麻疹和破伤风是有效的，但是还没有针对于众多的包括大多数病毒感染如AIDS在内的传染性疾病有效的疫苗。也没有针对包括疟疾或癌症在内的每年引起无数患者失去生命的其它传染性的或非传染性疾病的有效疫苗。另外，抗生素抗性细菌和微生物的快速涌现需要采用一种选择合理的利用疫苗的治疗方法。最后，传染性疾病，而不是心血管疾病或癌症或损伤仍然是引起世界范围内死亡和残疾的最大原因这一事实也说明对疫苗有着极大的需要(Bloom和Widdus，1998)。
从免疫学的观点出发，如今疫苗领域中存在的一个主要问题是传统疫苗(和/或含在这些制剂中的免疫调节化合物)被设计用来诱导高水平的抗体(Harrow和Lane，1988)。然而，抗体本身在预防包括由病毒、胞内细菌、某些寄生虫引起的多数病症和癌症在内的许多疾病方面是无效的。这类疾病的实例是，但不限于，上述的HIV病毒或疟疾中的疟原虫。在众多的实验系统中表明对于这些适应征来说包括T细胞在内的免疫系统的细胞臂，而不是体液臂是重要的。因此，为了克服传统疫苗的局限性需要新的改进技术。重点必需放在有效诱导包括抗原特异性T细胞在内的细胞免疫系统的技术上，所述T细胞能够识别在被病原体感染的细胞上表达的分子。理想的是，将疫苗设计成既诱导能区分病变的和/或被感染的细胞与正常细胞的T细胞，又同时诱导由可识别胞外区室中的病原体的B细胞分泌的抗体。
几种制备出来的疫苗由减毒的活生物体组成，其中存在恢复到有毒的野生型病毒株的风险。尤其是在无免疫应答的宿主中，这会成为一种威胁生命的方案。或者，由于这些亚单位疫苗本身通常没有效力，所以疫苗以一种源自病原体的抗原与诱导或加强针对这些抗原的免疫应答的化合物(这些化合物通常被称作佐剂)的组合形式进行给药。
尽管对于上述疫苗作为有效医学治疗手段不存在疑问，但是由于其复杂性，仍然存在着可能产生严重副作用的缺点，例如含在疫苗中的抗原与由被接种个体的细胞表达的分子发生交叉反应。另外，难以满足管理机构，例如世界卫生组织(WHO)、食品和药物管理局(FDA)及其它们的欧洲相应机构对疫苗组合物和免疫诱导机制的准确说明的现有要求。
抗原呈递细胞属于天然免疫系统，它已经进化为与微生物接触后早期第一道限制传染的宿主防御系统(Hoffmann等，1999)。天然免疫系统的细胞识别在它们的靶向物上表达的模式或相对非特异性结构而不识别被适应性免疫系统识别的更复杂的、特异性结构(Hoffmann等，1999)。天然免疫系统的细胞的实例是巨噬细胞和树突细胞以及粒细胞(例如嗜中性粒细胞)，自然杀伤细胞等。相反，适应性免疫系统的细胞识别T细胞的包括肽在内的特异性抗原结构以及B细胞的肽和三维结构。适应性免疫系统比天然免疫系统的特异性更强和更复杂并且经反复暴露于给定病原体/抗原而变得更好。在系统发生学方面，天然免疫系统更老并且已经在非常原始的生物体内被发现。然而，由于除了控制病原体外，天然免疫系统的细胞，即APC，还可致敏适应性免疫系统的细胞并因而引发导致入侵物清除的特异性免疫应答，所以在抗原暴露初期，天然免疫系统是至关重要的。总之，天然免疫系统的细胞以及具体地是APC在免疫应答的诱导期由于下列原因起着关键性的作用：a)依靠原始模式识别系统控制感染和b)致敏适应性免疫系统的细胞，从而引发导致入侵病原体或其它靶向物清除的特异性免疫应答和免疫记忆(Roitt等，1998)。这些机制对于清除或控制肿瘤细胞也相当重要。
如上所述，天然免疫系统的细胞识别在它们的相应靶向物上表达的模式。实例是革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、分枝杆菌的糖脂、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸质、酵母菌的甘露聚糖和病毒的双链RNA(Hoffmann等，1999)。另外，它们可以识别诸如肿瘤细胞上的被改变的蛋白糖基化作用的模式。
最新发现描述了作为被哺乳动物的天然免疫系统(但是也可能被适应性免疫系统)识别的另外一种模式的原生动物或低等真核生物的DNA(如果不是全部的脊椎动物也可能是大多数)(Krieg，1996；Lipford等，1998)。
可能是由于病原体与宿主DNA之间存在着结构和序列使用方面的差异，所以所述免疫系统识别包括细菌在内的低等生物。具体地说，源自于非脊椎动物或在某一个碱基中含有非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的合成短链ODN形式的短链DNA被作为靶向物(Krieg等，1995)。CpG基元以预期频率出现在细菌的DNA中，但是出现在脊椎动物DNA中的频率相当低(LipLord等，1998；Pisetsky，1999)。另外，非脊椎动物(即细菌)的CpG基元不被甲基化而脊椎动物的CpG序列被甲基化。细菌DNA与脊椎动物DNA之间的这些差异使得脊椎动物能将非脊椎动物的DNA识别为一个危险信号。
含有天然CpG的DNA，ODN以及被硫代磷酸基取代(硫代磷酸残基取代磷酸基)的含有CpG基元的ODN不仅是免疫细胞增殖和体液免疫应答的有效激活剂(Krieg等，1995)，而且还刺激强烈的细胞免疫应答(被记载在Lipford等的综述中，1998)。含有非甲基化的CpG基元的DNA/ODN能够直接激活单核细胞(树突细胞，巨噬细胞)和B细胞。同样地，自然杀伤(NK)细胞不能被直接激活，但却能对由它们的IFN-γ产生量明显增加的单核细胞产生的IL-12(白细胞介素12)发生应答(Chace等，1997)。结果，通过CpG DNA诱导单核细胞和NK细胞能够促进对Thl-型应答的诱导以及促进细胞毒T细胞的发育。
已知基于肌苷和胞嘧啶的核糖核酸，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)促进Thl-特异性免疫应答。已知刺激巨噬细胞产生细胞因子如IL-1α和IL-12(Manetti等，1995)，还已知作为一种有效的干扰素1型诱导物(Manetti等，1995)和一种有效的NK细胞刺激物(Cavanaugh等，1996)。
然而，这一效果被严格地限制在含有肌苷和胞苷残基的核糖核酸(WO98/16247)。
本发明人的研究结果表明含有非甲基化的CpG基元的ODN，尽管在刺激免疫系统方面是有效的，但是也具有本质的缺点，尤其是在特异性方面(高本底)和产生副作用方面，如高系统性TNF-α的产生。已知高系统性TNF-α的释放能够引起中毒性休克综合症，该综合症能够引起患病患者的死亡。
因此本发明的一个目的是提供合适的新型ODN，该ODN没有像基于CpG序列的ODN那么明显的副作用。另一个目的是降低含有已知ODN的药物组合物的副作用以及提供安全和有效的耐受性良好的药物组合物，该组合物具有适合于动物，尤其是包括人类在内的哺乳动物接种的自动免疫接种调节特性。
这个目的通过具有式(I)结构的免疫刺激寡脱氧核酸分子实现：
Figure C0181079700121
任何X是O或S，
其中
任何NMP是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞苷-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷或N-异戊烯基-脱氧腺苷一磷酸或一硫代磷酸的2’脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
NUC是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞苷、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷或N-异戊烯基-脱氧腺苷的2’脱氧核苷，
a和b是从0至100的整数，条件是a+b介于4和150之间，
B和E是核酸分子的5’或3’端的常用基团。
令人惊奇的是，证明了含有脱氧肌苷残基的ODN(I-ODNs)具有一种与含有CpG基元的ODN相当的免疫调节作用或者甚至在许多情况下比含有CpG基元的ODN的免疫调节作用强。而且，针对一种给定的抗原或抗原片段，本发明的ODN比CpG ODN产生特异性更强的免疫应答。另外，本发明的ODN降低了对不利副反应的诱导，尤其是对系统性TNF-α或IL-6的诱导。
然而，已经记载了含有肌苷的RNA分子如聚-IC或WO98/16247中提到的分子具有一定的免疫刺激作用，令人惊奇的是证明了含有脱氧肌苷残基的脱氧核酸分子可能是良好的免疫刺激ODN。
另外，本发明的I-ODN与基于特定CpG基元的ODN相反-不依赖于特定的基元或如对CpG寡核苷酸所述的回文序列(参见例如EP 0 468520 A2，WO96/02555，WO98/18810，WO98/37919，WO98/40100，WO98/52581，WO99/51259和WO99/56755，全部被引入本文作参考)。因此，本发明的一组I-ODN可以优选地含有一种CI基元(因此这些引用参考文献中记载的ODN是本发明ODN优选的实施方案，其中一个或多个鸟苷残基被脱氧肌苷残基所取代)。由于含有一个不存在于CI或IC中的肌苷的I-ODN也具有免疫刺激特性，所以对于其主要的免疫刺激特性来说它不是必需的。
因此本发明的I-ODN是一种含有一个优选地以单链形式提供的脱氧肌苷残基的DNA分子。
本发明的I-ODN可以通过重组方法来分离或化学合成。在后一种情况下，本发明的I-ODN还可以含有被修饰的寡核苷酸，如膦酸甲酯或其它基于磷的被修饰的寡核苷酸如磷酸三酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯，所述被修饰的寡核苷酸可以利用标准的化学转化方法来进行合成。也可以使用其它不基于磷的被修饰的寡核苷酸(Stirchak等，3月17日(1989)，6129-6141)，然而，一磷酸化合物或一硫代磷酸化合物是本发明优选使用的2’脱氧核苷一磷酸。
本发明I-ODN的NMP优选地选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷、脱氧尿苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸(通常，所述磷酸或硫代磷酸基团在脱氧核糖的5’端)。然而对于基于CpG基元的ODN来说必须是该基元未被甲基化，令人惊奇地是本发明的ODN就不是这种情况，例如其中2-甲基-脱氧肌苷或5-甲基-脱氧胞苷残基对本发明ODN的免疫刺激特性不具有通常的负面影响。或者，取代2-脱氧形式的NMP，其它的基团，尤其是惰性基团如-F、-NH2、-CH3、尤其是CH3也可以存在于核糖基团的2-位上。当然，对于本发明的I-ODN来说，-OH和SH基团不能存在于核糖的2’-位上，尤其是不能存在于肌苷NMP的核糖残基的2’-位上。
本发明ODN的长度在现有技术中所用的标准的ODN的长度范围内。因此，总长度在4以下和150以上的分子表现出逐步降低的免疫刺激潜力。优选的ODN含有10至60，特别是15至40个碱基(核苷)，意味着在这些优选的实施方案中，式I中的a+b在10至60的范围内，优选地在15至40的范围内。
然而，现有技术中记载的具有免疫刺激性的含有肌苷和胞苷的核糖核酸分子是大分子并且是分子量远远大于200000的还不太明确的多核酸(一种可从Sigma化学品公司购买的聚肌苷-聚胞苷酸具有220000至460000的分子量(至少500-1000个C+I残基))。本发明的分子是长度短得多且产品的长度和组成相当明确的、能够高度重现的DNA分子。
进一步优选地是式I所示的I-ODN的含有脱氧肌苷的NMP是一种具有1至4个硫原子的一硫代磷酸并且由于这种ODN对核酸酶的抗性较高，所以其它的NMP，尤其是其它所有的NMP也以核苷一硫代磷酸的形式存在(本发明中明确了“一硫代磷酸”中的“一”是指磷酸基，即每个NMP中含有一个磷酸基团(一个磷原子))。优选地，在本发明的NMP中，X1和X2中的至少一个是S以及X3和X4中的至少一个是O。优选地，X3和X4是O。(X3可以(由于合成NMP)源自例如磷酸基基团或源自NMP-核糖的3’-基团)。
优选地本发明的ODN含有以下序列：
hhh wdi dhh h
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn，
nhh wdi din hhh hdi ndi nh，
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn或
nhh wdi did hhh hdi ddi dh，
其中
任何n是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
任何h是一种选自脱氧腺苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或一硫代磷酸，
任何w是一种选自脱氧腺苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，和
任何d是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸。
如上所述，一种特定的基元(诸如CpG或一个回文序列)对于本发明的I-ODN不是必需的。然而，含有一个CI基元的ODN是优选的以致于在一个优选的实施方案中，式I所示的ODN含有至少一个与一个2’-脱氧肌苷一磷酸或一硫代磷酸3’-相邻的2’-脱氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸从而形成这种5’-CI 3’-基元。
本发明优选的ODN含有一个或多个以下序列：
gacitt，
iacitt，
gaictt，
iaictt，
其中
a是脱氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
g是脱氧鸟苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
c是脱氧胞苷-一磷酸或-一硫代磷酸，和
t是脱氧胸苷-一磷酸或-一硫代磷酸。
本发明的I-ODN特别适合于在药学领域中应用，例如作为一种药物被施用于动物或人。它们尤其适合作为一种免疫刺激剂，特别是在疫苗组合物中使用或与疫苗组合物共同使用。
因此，本发明还涉及一种含有本发明ODN的药物组合物。
由于本发明的一种优选药物组合物是一种疫苗，所以该组合物除含有本发明的ODN外，还应当含有一种抗原。尤其是由于ODN具有免疫刺激活性，所以通过所述抗原与本发明的ODN的结合，大大增强了该抗原激发被接种个体的保护/免疫应答的潜力。
一种疫苗可以含有各种不同的抗原。抗原的实例是完全灭活的生物体如灭活的病毒或细菌、真菌、原生动物或者甚至是癌细胞。抗原还可以由这些生物体/组织、蛋白质，或以它们最简单的形式，肽的亚片段组成。抗原也可以以糖基化蛋白或肽的形式被免疫系统所识别并且还可以是或含有多糖或脂类。由于例如细胞毒T细胞(CTL)识别通常与主要组织相容性复合体(MHC)结合的8-11个氨基酸长度的短肽形式的抗原(Rammensee等，免疫遗传学(Immunogenetics)41，(1995)，178-228)，所以可以使用短肽。B细胞识别比大约15个氨基酸更长的肽(Harrow等，冷泉港(Cold Spring Harbor)：冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，(1988))。通过与T细胞表位进行比较，B细胞抗原的三维结构对于被抗体识别也可能起着重要的作用。为了获得持续的、抗原-特异性免疫应答，佐剂能够帮助激发包括免疫系统必需所有细胞的免疫级联。佐剂主要作用于所谓的抗原呈递细胞(APC)，但它们的作用方式不受限制。这些细胞通常首先遇到所述的抗原，接着将被加工的或未被修饰的抗原呈递给免疫效应子。还可能涉及中间体细胞类型。在产生的免疫应答过程中，只有具有合适特异性的效应细胞被激活。所述佐剂还可以局部地保留抗原以及共同注射的其它因子。另外，所述佐剂可以对其它免疫细胞起到一种化学吸引剂的作用或对免疫系统局部地或全部地起到一种刺激剂作用。
根据本发明的优选实施方案，T细胞表位被用作抗原。或者，T细胞表位与B细胞表位的结合也可能是优选的。
被用于本发明组合物中的抗原不是关键的。根据本发明，当然也可以使用不同抗原的混合物，优选地，来源于一种病毒或一种细菌病原体或来源于真菌或寄生虫的蛋白质或肽被用作这种抗原(包括衍生化的抗原或糖基化的或脂化的抗原或多糖或脂类)。另一个优选的抗原来源是肿瘤抗原。优选的病原体选自人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、流感病毒、轮状病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎衣原体、砂眼衣原体、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、霍乱弧菌、疟原虫属某种(P1.恶性疟原虫，P1.间日疟原虫等)、曲霉属某种或白色念珠菌。抗原也可以是由癌细胞表达的分子(肿瘤抗原)。衍生过程可以包括从病原体/癌细胞中纯化一种特异性蛋白质，激活病原体以及这种蛋白质的蛋白质水解或化学衍生化或稳定化。肿瘤抗原(癌症疫苗)或自身免疫抗原也可以以同样的方式被用于本发明的药物组合物中。利用这种组合物可以进行肿瘤疫苗接种或自身免疫疾病的治疗。
对于肽抗原来说，肽模拟物(mimitope)/激动剂/超激动剂/拮抗剂或某些位点发生了变化而不影响免疫学特性的肽或非肽模拟物/激动剂/超激动剂/拮抗剂(被记载在Sparbier和Walden的综述中，1999)的用途被包含在本发明中。肽抗原还可以包括在肽抗原的羧基端或氨基端的延伸以便促进与聚阳离子化合物或免疫刺激化合物之间的相互作用。为了治疗自身免疫疾病可以使用肽拮抗剂。
抗原还可以被衍生化从而包括使抗原呈递能力以及抗原靶向抗原呈递细胞能力增强的分子。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物适合于提供对与自身免疫疾病有关的蛋白质或蛋白质片段和肽的耐受性。用于该实施方案中的抗原足以耐受免疫系统或下调针对与自身免疫过程有关的表位产生的免疫应答。
优选地，本发明的所述药物组合物，尤其是疫苗形式的组合物，还含有一种聚阳离子聚合物，优选地是一种聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸、聚赖氨酸或一种抗微生物肽。
被用于本发明的聚阳离子化合物可以是任何具有WO 97/30721中记载的特有效果的聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子化合物、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应当具有一条至少4个氨基酸残基长度的链(参见：Goldman等描述的他福新(1983))。特别优选的是含有肽键的物质，如聚赖氨酸、聚精氨酸和在8个以上，尤其是20个以上氨基酸残基的范围内含有20％以上，特别是50％以上的碱性氨基酸的多肽或其混合物。其它优选的聚阳离子化合物及其药物组合物被记载在WO 97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO 99/38528中。优选地，这些多肽含有20至500个氨基酸残基，尤其是30至200个残基。
这些聚阳离子化合物可以通过化学或重组技术来制备或来源于自然界。
阳离子(多)肽还可以是聚阳离子抗微生物肽，该肽具有Ganz和Lehrer，1999；Hancock，1999中记载的特性。这些(多)肽可以来源于原核生物或动物或植物，或者可以通过化学或重组技术进行制备(Andreu和Rivas，1998；Ganz和Lehrer，1999；Simmaco等，1998)。肽还可以属于防御素类(Ganz，1999；Ganz和Lehrer，1999)。这种肽的序列可以，例如在国际互联网网址为 http：//www.bbcm.univ. trieste.it/-tossi/pagl.html下的抗微生物序列数据库中找到。
这种宿主防御肽或防御物也是本发明聚阳离子聚合物的一种优选形式。通常，一种作为终产物对适应性免疫系统能起活化作用(或下调作用)的化合物，优选地由APC介导(包括树突细胞)，被用作聚阳离子聚合物。
作为本发明的特别优选的聚阳离子物质是由cathelicidin产生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，被引入本文作参考)，尤其是来源于哺乳动物，优选地来源于人、牛或小鼠的cathelicidin的抗微生物肽、或神经活性化合物如(人)生长激素。
来源于自然界的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(产生的阳离子肽、触足肽、脱乙酰壳多糖或壳多糖的其它衍生物)或来源于由生物化学或重组方法制备的那些肽或蛋白质的肽。其它优选的聚阳离子化合物是cathelin或与cathelin相关的或由cathelin衍生的物质。例如，鼠cathelin是一种具有氨基酸序列为NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相关的或衍生的cathelin物质含有至少具有15-20个氨基酸残基的cathelin序列的全部或部分序列。衍生化可以包括采用20个常规氨基酸以外的氨基酸取代或修饰天然氨基酸。而且，可以将其它的阳离子残基引进这类cathelin分子中。这些cathelin分子优选地是与抗原和本发明的致免疫的ODN结合。然而，令人惊奇地是这些cathelin分子被证明还可以作为抗原的一种有效佐剂而不需要加入其它的佐剂。因此有可能将这类cathelin分子作为疫苗配制品中的有效佐剂，同时加入或不加入其它的免疫刺激物质。
本发明使用的另一种优选的聚阳离子物质是一种至少含有2个由3至7个疏水氨基酸的连接区间隔的KLK-基元的合成肽(A 1789/2000，被引入本文作参考)。
非常惊奇地是本发明的药物组合物的免疫刺激效果远远高出每一单种组分的效果加合后期望得到的效果或者甚至高于OND或聚阳离子的效果与抗原的效果加合后期望得到的效果。
式I中的B和E是核酸分子的5’和/或3’端的常用基团。这种基团的实例对于本技术领域的技术人员来说容易得到(参见例如″寡核苷酸和类似物-实用方法(Oligonucleotides and Analogues-APractical Approach)″(1991)，Eckstein编辑，牛津大学出版社)。本发明的I-ODN的B和/或E优选独立地选自于-H、-CH3、-COCH3、-OH、-CHO、磷酸基、硫代磷酸基、硫酸基或硫代硫酸基或磷酸烷基，尤其是具有一个长度为C1-C6的烷基和/或具有一个末端氨基的磷酸烷基(所述氨基可以例如被用于进一步标记本发明的I-ODN，例如-PO4-(CH2)n-NH2或-PO4-(CH2)n-NH-标记物)。特别优选的B是核苷酸，尤其是上述的2’脱氧核苷酸(即没有磷酸或硫代磷酸基团)。或者这些基团还可以含有连接其它分子，尤其是载体分子或标记物的接头。对于其中ODN与固体表面或颗粒或标记物等连接的这种形式的ODN也可以作为B和/或E基团的一部分。
当然，任何离子化(盐)形式或互变异构形式的式I分子被包括在式I中。
本发明的药物组合物还可以含有其它的活性成分(药物活性物质)，尤其是能在疫苗结合物中使用的物质。这种其它活性成分的优选实施方案是细胞因子、抗炎物质、抗微生物物质或其混合物。
当然，本发明的药物组合物还可以含有辅助物质，尤其是一种药用载体，缓冲物质、稳定剂或其混合物。
这些成分在该药物组合物中的相对用量主要取决于个体抗原的需要以及取决于应该被施用该组合物的动物/人。因此，本发明的药物组合物优选地含有一种或多种本发明的ODN，优选地含有1pg至10g，优选地含有1ng至1g，更优选地含有100ng至10mg，特别优选地含有10mg至1mg。所述抗原以及所述聚阳离子聚合物可以采用相似的剂量进行施用，每次接种1至10,000mg的抗原和0.1至1,000mg的聚阳离子是优选的。
可以采用一周、两周或一个月的间隔将有效量的本发明组合物施用于一名患者，例如一名接种疫苗的受试者。采用该组合物进行治疗的患者还可以重复接种或只接种一次。本发明的一种优选的用途是自动免疫接种，尤其是针对对特定抗原没有抵抗力的人或动物进行的自动免疫接种。
本发明的组合物的施用途径不是很关键，例如皮下、肌内、皮内或透皮注射与口服同样适用。
本发明的组合物也可以单独施用，例如与所述抗原/聚阳离子组合物分开，通过单独注射所述的免疫刺激物质来施用。因此本发明还涉及一种包括以一种含有所述抗原和所述聚阳离子聚合物的组合物作为一种组分和以一种含有所述免疫刺激或趋化性物质的组合物作为第二种组分的试剂盒。
所述组分可以在同一位点或时间进行施用，然而，也可以在不同的位点或不同的时间或不同的时间段进行施用。还可以分别改变所述组合物或组分的全身或局部用药。
下列实施例以及附图详细地描述了本发明，当然本发明并不局限于此。
图1表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR 60)和含有脱氧肌苷I的寡脱氧核苷酸(I-ODN)或CpG 1668后，针对由卵清蛋白产生的肽OVA257-264的免疫应答。将所示的混合物注射进小鼠的后爪垫内。四天后，采用OVA257-264对外流的淋巴结细胞进行体外刺激。24小时后，利用ELISPOT分析方法测定产生IFN-g的细胞数目。分析结果以斑点数目/1×106淋巴结细胞来表示。
图2表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR 60)和含有I的寡脱氧核苷酸(I-ODN)或CpG 1668后，对系统TNF-a产生的诱导作用。将所示的混合物注射进小鼠的后爪垫内。注射后1小时，从尾静脉中抽血并制备血清。利用ELISA方法测定血清中的TNF-a的浓度。
图3表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR 60)和含有脱氧肌苷I的寡脱氧核苷酸(I-ODN)、CpG 1668或GpC后，针对由卵清蛋白产生的肽OVA257-264的免疫应答。将所示的混合物注射进小鼠的后爪垫内。四天后，采用OVA257-264、一种不相关的肽mTRP2181-188(小鼠酪氨酸酶相关蛋白-2，VYDFFVWL)或pR 60对外流的淋巴结细胞进行体外刺激。24小时后，利用ELISPOT分析方法测定产生IFN-g的细胞数目。分析结果以具有三份样品产生的标准差的斑点数目/1×106淋巴结细胞来表示。
图4表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR 60)和含有I的寡脱氧核苷酸(I-ODN)、GpC或CpG 1668后，对系统TNF-a产生的诱导作用。将所示的混合物注射进小鼠的后爪垫内。注射后1小时，从尾静脉中抽血并制备血清。利用特异于细胞因子的ELISA方法测定血清中的TNF-a和IL-6的浓度。
图5表示注射了TRP-2、聚-L-精氨酸、CpG 1668或含有随机20-聚体序列的脱氧肌苷后，针对由卵清蛋白产生的肽OVA257-264的免疫应答。将所示的混合物注射进小鼠的后爪垫内。四天后，采用TRP-2、一种不相关的肽OVA257-264或pR 60对外流的淋巴结细胞进行体外刺激。24小时后，利用ELISPOT分析方法测定产生IFN-g的细胞数目。分析结果以具有三份样品产生的标准差的斑点数目/1×106淋巴结细胞来表示。
图6表示与由黑素瘤产生的肽一起联合注射I-ODN和聚-L-精氨酸(pR 60)。
图7表示与由黑素瘤产生的肽一起联合注射I-ODN和聚-L-精氨酸(pR 60)后降低了对系统TNF-a和IL-6的诱导作用。
图8表示与由黑素瘤产生的肽一起联合注射10-聚体I-ODN和pR60。
图9表示联合施用了卵清蛋白(OVA)和寡-dIC26-聚体和PR后增强了OVA-特异性IgG抗体的产生。将所示的混合物皮下注射进小鼠的后爪垫内。在注射后的第24和115天，收集血清并通过ELISA方法筛选OVA-特异性IgG2a(A)和IgG1(B)抗体。所述结果以抗体滴度来表示。
实施例
在所有实施例中都使用了被硫代磷酸基取代的ODN(用硫代磷酸残基取代了磷酸基，在下文中被称作″被硫代磷酸基取代的寡脱氧核苷酸″)，这是由于这种ODN对核酸酶表现出较高的抗性(Ballas等，1996；Krieg等，1995；Parronehi等，1999)。
实施例1
联合注射不同的I-ODN和聚-L-精氨酸(pR 60)协同增强了针对由卵清蛋白产生的肽的免疫应答。
小鼠                   C57BI/6(Harlan/Olac)
肽                     利用常规的固相F-moc化学合成方
                       法合成OVA257-264-肽(SIINFEKL)，一
                       种MHC I类(H-2Kb)-限定的鸡卵清
                       蛋白的表位(Rotzschke等，
                       1991)，利用HPLC进行纯化以及通
                       过质谱分析纯度。
                       剂量：300mg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)    平均聚合度为60个精氨酸残基的聚
                       -L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                       剂量：100mg/小鼠
CpG-ODN 1668           通过NAPS GmbH，Gottingen合成被
                       硫代磷酸基取代的含有CpG基元的
                       ODN：tcc atg acg ttc ctg atg ct。
                       剂量5nmol/小鼠
I-ODN 1                   通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                          硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷的
                          ODN：tcc ati aci ttc ctg atg ct。
                          剂量：5nmol/小鼠
I-ODN 2                   通过NAPS GmbH，Gttingen合成含
                          有脱氧肌苷的ODN：tcc atg acittc
                          ctg atg ct。
                          剂量：5nmol/小鼠
I-ODN 3                   通过NAPS GmbH，Gottingen合成被
                          硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷的
                          ODN：tcc ati aci ttc cti ati ct。
                          剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.OVA257-264
2.OVA257-264+pR 60
3.OVA257-264+CpG 1668
4.OVA257-264+I-ODN 1
5.OVA257-264+I ODN 2
6.OVA257-264+I-ODN 3
7.OVA257-264+CpG 1668+pR 60
8.OVA257-264+I-ODN 1+pR 60
9.OVA257-264+I-ODN 2+pR 60
10.OVA257-264+I-ODN 3+pR 60
在0天将总体积为100ml的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50ml)。注射后4天将所述动物处死并且收获腘淋巴结。淋巴结通过一个70mm细胞渗滤器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化学品公司)的DMEM培养基(GIBCO BRL)冲洗两次。用DMEM/5％FCS将细胞调整到3×106细胞/ml。根据所记载的内容(Miyahira等，1995)对三份样品进行IFN-g ELISPOT分析。该方法是一种被普遍用来对抗原-特异性T细胞进行定量的方法。用背景对照培养基、OVA257-264-肽或伴刀豆凝集素A(Con A)对淋巴细胞进行体外刺激。对代表单个产生IFN-g的T细胞的斑点进行计数。被Con A刺激后所检测到的斑点数高的(没有显示数据)表明所使用的淋巴细胞的状态良好。图1给出了针对每个小鼠实验组的斑点数目/1×106细胞。
注射后1小时，从尾静脉中取血，然后制备血清以便利用ELISA方法测定对系统TNF-a的诱导作用(图2)。
实施例2
用脱氧肌苷取代鸟苷使非致免疫的GpC-序列转化成高度致免疫的序列，尤其是当与聚-L-精氨酸(pR60)联合施用时。
小鼠                    C57BI/6(Harlan/Olac)
肽                      利用常规的固相F-moc化学合成方
                        法合成OVA257-264-肽(SIINFEKL)，一
                        种MHCI类(H-2Kb)-限定的鸡卵清
                        蛋白的表位(Rotzschke等，
                        1991)，利用HPLC进行纯化以及通
                        过质谱分析纯度。
                        剂量：300μg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)     平均聚合度为60个精氨酸残基的
                        聚-L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                        剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668                 通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                             硫代磷酸基取代的含有CpG基元
                             的ODN：tcc atg acg ttc ctg atg
                             ct。
                             剂量5nmol/小鼠
GpC-ODN                      通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                             硫代磷酸基取代的含有一种非致免
                             疫的GpC基元的ODN：tcc atgagc
                             ttc ctg atg ct。
                             剂量：5nmol/小鼠
I-ODN 9                      通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                             硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷的
                             ODN：tcc atg aic ttc ctg atg ct。
                             剂量：5nmol/小鼠
I-ODN 10                     通过NAPS GmbH，Gttingen合成
                             被硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷
                             的ODN：tcc ati aic ttc cti ati
                             ct。
                             剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
OVA257-264
VA257-264+pR 60
OVA257-264+CpG 1668
OVA257-264+GpC
OVA257-264+I ODN 9
OVA257-264+I-ODN 10
OVA257-264+CpG 1668+pR 60
OVA257-264+GpC+pR 60
OVA257-264+I-ODN 9+pR 60
OVA257-264+I-ODN 10+pR 60
在0天将总体积为100μl的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50μl)。注射后4天将所述动物处死并且收获腘淋巴结。淋巴结通过一个70μm细胞渗滤器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化学品公司)的DMEM培养基(GIBCO BRL)冲洗两次。用DMEM/5％FCS将细胞调整到3×106细胞/ml。根据所记载的内容(Miyahira等，1995)对三份样品进行IFN-g ELISPOT分析。该方法是一种被普遍用来对抗原-特异性T细胞进行定量的方法。用培养基(对照)、OVA257-264-肽、一种不相关的肽mTRP-2181-188(鼠酪氨酸酶相关蛋白-2，VYDFFVWL)、pR60和伴刀豆凝集素A(Con A)对淋巴细胞进行体外刺激。对代表单个产生IFN-g的T细胞的斑点进行计数并从所有样品中减去对照斑点的数目。被Con A刺激后所检测到的斑点数高的(没有显示数据)表明所使用的淋巴细胞的状态良好。图3给出了针对每个小鼠实验组的斑点数目/1×106细胞，给出了被体外刺激的三份样品的标准差。注射后1小时，从尾静脉中取血，然后制备血清以便利用特异于细胞因子的ELISA方法测定对系统TNF-a和IL-6的诱导作用(图4)。
实施例3
联合注射含有脱氧肌苷的随机20-聚体序列与一种由黑素瘤产生的肽能够诱导针对所述肽产生的强烈免疫应答，该应答通过共同施用聚-L-精氨酸(pR60)还可以被进一步增强。
小鼠                     C57BI/6(Harlan/Olac)
肽                              利用常规的固相F-moc化学合合方
                                法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一种
                                MHC I类(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸
                                酶相关蛋白-2的表位(Bllom等，
                                1997)，利用HPLC进行纯化以及通
                                过质谱分析纯度。
                                剂量：300μg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)             平均聚合度为60个精氨酸残基的聚
                                -L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                                剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668                    通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                                硫代磷酸基取代的含有CpG基元的
                                ODN：tcc atg acg ttc ctg atg ct。
                                剂量5nmol/小鼠
wdi                             通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                                硫代磷酸基取代的ODN：nhh hhh wdi
                                nhh hhh hhh wn。
                                剂量：5nmol/小鼠
wdidin                          通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                                硫代磷酸基取代的ODN：nhh hhh
                                wdi nhh hhh hhh wn。
                                剂量：5nmol/小鼠
wdid                            通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                                硫代磷酸基取代的ODN：nhh hhh
                                wdi dhh hhh hhh wn。
                                剂量：5nmol/小鼠
wdidid                          通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                                硫代磷酸基取代的ODN：nhh wdi did
                                hhh hdi ddi dh。
                                剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-2
2.TRP-2+pR 60
3.TRP-2+CpG 1668
4.TRP-2+wdi
5.TRP-2+wdidin
6.TRP-2+wdid
7.TRP-2+wdidid
8.TRP-2+CpG 1668+pR 60
9.TRP-2+wdi+pR 60
10.TRP-2+wdidin+pR 60
11.TRP-2+wdid+pR 60
12.TRP-2+wdidid+pR 60
在0天将总体积为100μl的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50μl)。注射后4天将所述动物处死并且收获腘淋巴结。淋巴结通过一个70μm细胞渗滤器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化学品公司)的DMEM培养基(GIBCO BRL)冲洗两次。用DMEM/5％FCS将细胞调整到3×106细胞/ml。根据所记载的内容(Miyahira等，1995)对三份样品进行IFN-g ELISPOT分析。该方法是一种被普遍用来对抗原-特异性T细胞进行定量的方法。用培养基(对照)、TRP-2-肽、一种不相关的OVA257-264-肽、pR60和伴刀豆凝集素A(Con A)对淋巴细胞进行体外刺激。对代表单个产生IFN-g的T细胞的斑点进行计数并从所有样品中减去对照斑点的数目。被Con A刺激后所检测到的斑点数高的(没有显示数据)表明所使用的淋巴细胞的状态良好。图5给出了针对每个小鼠实验组的斑点数目/1×106细胞，给出了被体外刺激的三份样品的标准差。
实施例4
联合注射I-ODN与聚-L-精氨酸(pR60)能够协同加强针对由黑素瘤产生的肽的免疫应答。
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+pR 60
3.TRP-2181-188+CpG 1668
4.TRP-2181-188+I-ODN 2
5.TRP-2181-188+CpG 1668+pR 60
6.TRP-2181-188+I-ODN 2+pR 60
在0天将总体积为100μl的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50μl)。注射后4天将所述动物杀死并且收获腘淋巴结。淋巴结通过一个70μm细胞渗滤器并用含有50％胎牛血清(FCS，SIGMA化学品公司)的DMEM培养基(GIBCO BRL)冲洗两次。用DMEM/5％FCS将细胞调整到3×106细胞/ml。根据所记载的内容(Miyahira等，1995)对三份样品进行IFN-γELISPOT分析。该方法是一种被普遍用来对抗原-特异性T细胞进行定量的方法。用背景对照培养基、TRP-2181-188-肽、一种不相关的OVA257-264-肽和伴刀豆凝集素A(ConA)对淋巴细胞进行体外刺激。对代表单个产生IFN-γ的T细胞的斑点进行计数并从所有样品中减去对照斑点的数目。被Con A刺激后所检测到的斑点数高的(没有显示数据)表明所使用的淋巴细胞的状态良好。图6给出了针对每个小鼠实验组的斑点数目/1×1O6细胞，给出了被体外刺激的三份样品的标准差。
注射后1小时，从尾静脉中取血，然后制备血清以便利用特异性的ELISA方法测定对系统TNF-a和IL-6的诱导作用(图7)。
实施例5
联合注射随机10-聚体I-ODN与聚-L-精氨酸(pR60)能够协同加强针对由黑素瘤产生的肽的免疫应答。
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-218-188
2.TRP-2181-188+pR 60
3.TRP-2181-188+CpG 1668
4.TRP-2181-188+ODN 17
5.TRP-2181-188+CpG 1668+pR 60
6.TRP-2181-188+ODN 17+pR 60
在0天将总体积为100μl的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50μl)。注射后4天将所述动物杀死并且收获腘淋巴结。淋巴结通过一个70μm细胞渗滤器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化学品公司)的DMEM培养基(GIBCO BRL)冲洗两次。用DMEM/5％FCS将细胞调整到3×106细胞/ml。根据所记载的内容(Miyahira等，1995)对三份样品进行IFN-γELISPOT分析。该方法是一种被普遍用来对抗原-特异性T细胞进行定量的方法。用背景对照培养基、TRP-2181-188-肽、一种不相关的OVA257-264-肽和伴刀豆凝集素A(ConA)对淋巴细胞进行体外刺激。对代表单个产生IFN-γ的T细胞的斑点进行计数并从所有样品中减去对照斑点的数目。被Con A刺激后所检测到的斑点数高的(没有显示数据)表明所使用的淋巴细胞的状态良好。图8给出了针对每个小鼠实验组的斑点数目/1×106细胞，给出了被体外刺激的三份样品的标准差。
小鼠                    C57BI/6(Harlan/Olac)
肽                      利用常规的固相F-moc化学合成方
                        法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一种
                        MHCI类(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸
                        酶相关蛋白-2的表位(Bllom等，
                        1997)，利用HPLC进行纯化以及通
                        过质谱分析纯度。
                        剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)     平均聚合度为60个精氨酸残基的聚
                        -L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                        剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668            通过NAPS GmbH，Gttingen合成
                        被硫代磷酸基取代的含有CpG基元
                        的ODN：tcc atg acg ttc ctg atg
                        ct。
                        剂量5nmol/小鼠
ODN 17                  通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                        硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷的
                        ODN：hhh wdi dhh h。
                        (h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)
                        剂量：10nmol/小鼠
小鼠                       57BI/6(Harlan/Olac)
肽                         利用常规的固相F-moc化学合成方
                           法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一种
                           MHCI类(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸
                           酶相关蛋白-2的表位(Bllom等，
                           1997)，利用HPLC进行纯化以及通
                           过质谱分析纯度。
                           剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)        平均聚合度为60个精氨酸残基的聚
                           -L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                           剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668               通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                           硫代磷酸基取代的含有CpG基元的
                           ODN：tcc atg acg ttc ctg atg ct。
                           剂量5nmol/小鼠
I-ODN 2                    通过NAPS GmbH，Gttingen合成被
                           硫代磷酸基取代的含有脱氧肌苷的
                           ODN：tcc atg aci ttc ctg atg ct。
                           剂量：5nmol/小鼠
实施例6
联合施用寡-脱氧IC26-聚体和聚-L-精氨酸(pR)能够增强特异于卵清蛋白(OVA)的体液免疫应答。
小鼠                       C57BI/6(Harlan/Olac)
卵清蛋白(OVA)             鸡蛋的卵清蛋白，等级V，SIGMA化
                          学品公司，A-5503，批号54H7070
                          剂量：50μg/小鼠
聚-L-精氨酸60(pR60)       平均聚合度为60个精氨酸残基的聚
                          -L-精氨酸；SIGMA化学品公司
                          P-4663，批号68H5903
                          剂量：100μg/小鼠
寡-脱氧I C，26-聚体       通过批准的亚磷酰胺化学方法以
(寡-dIC26聚体)            4μmol的规模合成寡-dIC26聚体并且
                          通过HPLC纯化(NAPS Gottingen，
                          德国)。
                          剂量5nmol/小鼠
实验组(每组4只小鼠)
1.OVA+寡-dIC26-聚体+pR
2.OVA+寡-dIC26-聚体
3.OVA+pR
4.OVA
在0天将总体积为100μl的含有上述化合物的溶液注射进每个后爪垫中(每个爪垫注射50μl)。注射后第24天，收集血清并利用ELISA方法筛选存在的OVA-特异性抗体。这些结果表明当与采用OVA与寡-dIC和pR中的单独一种物质注射相比较时，OVA与寡-dIC和pR进行联合注射能够增强OVA-特异性IgG抗体的产生(图13A，B)。有趣地是，当单独一次注射OVA与寡-dIC/pR时，IgG2a和IgG1两者的滴度都增大了，表明同时涉及到了Th1和Th2细胞。然而，115天后，在被注射了OVA和寡-dIC/pR的小鼠的血清中仍然能够检测到增高的IgG2a水平。
这些数据表明联合注射OVA与寡-dIC和pR能够增强OVA-特异性体液免疫应答。该应答的特征是在早期，由Th1和Th2两者诱导的同型抗体产生，但在晚期，主要是由Th1诱导的抗体产生。
参考文献
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Claims (36)

1.一种具有式(I)结构的寡脱氧核酸分子
任何X是O或S，
其中
任何NMP是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
NUC是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷或脱氧胸苷-的2′脱氧核苷，
a和b是从0至100的整数，条件是a+b介于4和150之间，
B和E是核酸分子的5′或3′端的常用基团，
在制备免疫刺激性药物组合物中的用途。
2.权利要求1所述的用途，其特征在于a+b在10至60之间。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于a+b在15至40之间。
4.权利要求1所述的用途，其特征在于X1和X2中的至少一个是S并且X3和X4中的至少一个是O。
5.权利要求1所述的用途，其特征在于任何NMP是核苷一硫代磷酸。
6.权利要求1所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
hhh wdi dhh h
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn，
nhh wdi din hhh hdi ndi nh，
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn或
nhh wdi did hhh hdi ddi dh，
其中
任何n是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
任何h是一种选自脱氧腺苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或一硫代磷酸，
任何w是一种选自脱氧腺苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，和
任何d是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸。
7.权利要求1所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有至少一种与2′-脱氧肌苷一磷酸或一硫代磷酸3’-相邻的2′-脱氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸。
8.权利要求7所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有脱氧肌苷-脱氧胞苷26-聚体。
9.权利要求1所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
gacitt，
iacitt，
gaictt，
iaictt，
其中
a是脱氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
g是脱氧鸟苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
c是脱氧胞苷-一磷酸或-一硫代磷酸，和
t是脱氧胸苷-一磷酸或-一硫代磷酸。
10.权利要求9所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有序列tcc atg aci ttc ctg atg ct，其中a，g，i，c和t具有与权利要求9中所述相同的含义。
11.权利要求1所述的用途，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
wdi，
wdid，
wdidin或，
wdidid，
其中w，d，i和n的定义具有与权利要求7所述相同的含义。
12.权利要求1所述的用途，其特征在于B和E独立地选自-H、-CH3、-COH、-COCH3、-OH、-CHO、-PO4、-PSO3、-PS2O2、-PS3O、-PS4、-SO3、-PO4-(CH2)1-6-NH2或-PO4-(CH2)1-6-NH-标记物。
13.权利要求1所述的用途，其特征在于所述免疫刺激性药物组合物是一种疫苗。
14.一种药物组合物，其中含有具有式(I)结构的寡脱氧核酸分子
Figure C018107970005C1
任何X是O或S，
其中
任何NMP是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
NUC是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞苷-、脱氧尿苷或脱氧胸苷的2′脱氧核苷，
a和b是从0至100的整数，条件是a+b介于4和150之间，B和E是核酸分子的5′或3′端的常用基团。
15.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于a+b在10至60之间。
16.权利要求15所述的药物组合物，其特征在于a+b在15至40之间。
17.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于X1和X2中的至少一个是S并且X3和X4中的至少一个是O。
18.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于任何NMP是核苷一硫代磷酸。
19.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
hhh wdi dhh h
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn，
nhh wdi din hhh hdi ndi nh，
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn或
nhh wdi did hhh hdi ddi dh，
其中
任何n是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
任何h是一种选自脱氧腺苷-、脱氧胞苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或一硫代磷酸，
任何w是一种选自脱氧腺苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，和
任何d是一种选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-或脱氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2′-脱氧核苷一磷酸或一硫代磷酸。
20.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有至少一种与2′-脱氧肌苷一磷酸或一硫代磷酸3’-相邻的2′-脱氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸。
21.权利要求20所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有脱氧肌苷-脱氧胞苷26-聚体。
22.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
gacitt，
iacitt，
gaictt，
iaictt，
其中
a是脱氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
g是脱氧鸟苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
i是脱氧肌苷-一磷酸或-一硫代磷酸，
c是脱氧胞苷-一磷酸或-一硫代磷酸，和
t是脱氧胸苷-一磷酸或-一硫代磷酸。
23.权利要求22所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有序列tcc atg aci ttc ctg atg ct，其中a，g，i，c和t具有与权利要求22中所述相同的含义。
24.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述的寡脱氧核酸含有以下序列：
wdi，
wdid，
wdidin或，
wdidid，
其中w，d，i和n的定义具有与权利要求19所述相同的含义。
25.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于B和E独立地选自-H、-CH3、-COH、-COCH3、-OH、-CHO、-PO4、-PSO3、-PS2O2、-PS3O、-PS4、-SO3、-PO4-(CH2)1-6-NH2或-PO4-(CH2)1-6-NH-标记物。。
26.权利要求14所述的药物组合物，其中还含有抗原。
27.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于它还含有一种聚阳离子聚合物。
28.权利要求27所述的药物组合物，其特征在于它还含有聚阳离子肽，抗微生物肽，或生长激素。
29.权利要求27所述的药物组合物，其特征在于它含有聚精氨酸，聚赖氨酸，由cathelicidin产生的抗微生物肽，含有被3-7个疏水性氨基酸的接头分开的2个KLK基元的合成肽，或人生长激素。
30.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于它还含有其它的活性成分。
31.权利要求30所述的药物组合物，其特征在于含有细胞因子，抗炎物质，抗微生物物质或其混合物
32.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于它还含有辅助物质。
33.权利要求32所述的药物组合物，其特征在于它含有药用载体、缓冲物质、稳定剂或其混合物。
34.权利要求14所述的药物组合物，其特征在于含有1ng至1g权利要求14至25中任一所述的一种或多种寡脱氧核酸。
35.权利要求34所述的药物组合物，其特征在于含有100ng至10mg权利要求14至25中任一所述的一种或多种寡脱氧核酸。
36.权利要求35所述的药物组合物，其特征在于含有10mg至1mg权利要求14至25中任一所述的一种或多种寡脱氧核酸。
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