CN1322121C

CN1322121C - 透明质酸合酶基因及其应用

Info

Publication number: CN1322121C
Application number: CNB988127733A
Authority: CN
Inventors: 保罗·H·韦格尔; 卡沙玛·库马里; 保罗·迪安吉利斯
Original assignee: University of Oklahoma
Current assignee: Oklahoma State University; University of Oklahoma
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2007-06-20
Anticipated expiration: 2018-10-30
Also published as: EP1522579A2; AU762036B2; ES2235378T3; WO1999023227A3; KR20010031682A; US7109011B2; US7141409B2; US7153677B2; DE69828193D1; JP4731013B2; DK1025211T3; US20030082780A1; EP1025211A2; JP2001521741A; US7060466B2; US20050202540A1; US20070087416A1; US20060216794A1; DE69828193T2; EP1522579A3

Abstract

本发明涉及具有编码酶学活性的类马链球菌透明质酸合酶(seHAS)的编码区区段的核酸区段，以及该核酸区段在制备产生透明质酸合酶和其透明质酸产物的重组细胞中的应用。透明质酸(hyaluronate)也称为透明质酸(hyaluronic acid)或者透明质酸(hyaluronan)。

Description

透明质酸合酶基因及其应用

本发明的背景

本发明的领域

本发明涉及具有编码酶学活性的类马链球菌(Streptocooccusequisimilis)透明质酸合酶(seHAS)的编码区区段的核酸区段，以及该核酸区段在制备产生透明质酸合酶和其透明质酸产物的重组细胞中的应用。透明质酸(hyaluronate)也称为透明质酸(hyaluronic acid)或者透明质酸(hyaluronan)。

相关技术的简要描述

链球菌感染是一个世界范围的重要的健康和经济问题，尤其是在发展中国家。其中一个原因是由于链球属细菌能够不被人体的吞噬细胞，如巨噬细胞和多形核细胞(PMNs)所察觉而生长。这些细胞负责识别并吞噬外源微生物。该细菌逃避监控的一种有效方法是利用多糖荚膜，如透明质酸(HA)荚膜将自己包被起来。HA的结构在原核生物和真核生物中是一样的。由于HA通常是非免疫原性的，被包裹的细菌不会引起免疫应答，所以不会招致破环。而且，这种荚膜在体外对PMN发挥出抗吞噬作用并防止链球菌粘附到巨噬细胞上。正因为如此，链球菌属的A组和C组中，HA荚膜在天然和实验感染中都是主要的毒素因子。A组链球菌属导致多种人类疾病，包括咽炎、脓疱病、深部组织感染、风湿热、中毒性休克类综合症。C组链球菌属类马链球菌导致骨髓炎、咽炎、脑脓肿、和肺炎。

在结构上，HA是一种由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)组成的二糖重复单位分高分子量的线性多糖。HA分子中重复二糖的数量可以超过30000，M_r大于10⁷。HA是唯一在哺乳动物和细菌细胞特别是A组和C组链球菌属和A型出血败血性巴斯德氏菌(Pasturella multocida)中都可以合成的多糖。这些菌株以HA荚膜形式和分泌到培养基中的形式产生HA。这些细菌合成HA的机制具有广泛的医学意义，因为HA荚膜的产生是链球菌属用于逃避免疫系统监控的一种非常有效和聪明的方法。

哺乳动物和细菌细胞是通过定位在质膜上的透明质酸合酶合成HA。据信，在这些生物中HA的合成是多步骤的过程。起始涉及一个起始前体，UDP-GlcNAc或UDP-GlcA的结合。随后的延伸涉及交替地在生长的寡糖链上添加两种糖。生长的聚合物挤出细胞的质膜区并进入细胞外空间。虽然HA的生物合成系统是第一个被研究的膜杂多糖合成途径，但是HA的合成仍然未能被非常清楚地了解。这可能是因为发展至今的体外系统仍然不足以完成HA的从头生物合成。

HA聚合物生长的方向在本领域的技术人员中仍有不同的争议。单糖可以添加在生长的HA链的还原端或者非还原端。而且，其他问题集中在(i)新生链是否与一个蛋白、UDP或者脂类中间体共价相连，(ii)糖链是否需要一个引物起始，和(iii)成熟聚合物挤出链球菌的质膜的机制。了解HA合成的这些机制可以有利于发展出其他的策略，以通过干扰该过程来控制链球菌属和巴斯德氏菌属的感染。

HA在脊椎动物的各种组织中都存在，并已经广泛用于各种临床应用，特别适于用作关节内基质的填充物和用于眼外科。科学文献表明原有的认识已经发生了转变，原来认为HA只是主要存在于少数结缔组织中的被动结构成分以及存在于某些细菌菌株的荚膜中，现在认识到这种广泛存在的大分子与许多生物过程密切相关：从胚胎发生中细胞迁移和分化的调节到细胞外基质组织和代谢的调控，从而在转移、创伤愈合和炎症的复杂过程中发挥重要的作用。而且，已经清楚的是HA具有高度代谢活性并且细胞高度关注其合成和催化过程。例如，HA在组织中的半衰期范围从软骨中的1至3周到表皮中的不到1天。

现已清楚的是一种单一的蛋白利用两种糖底物来合成HA。HA合酶，简写为HAS，已经广泛地用于此类酶的表述。Markovitz等成功地从化脓链球菌中鉴定出HAS活性并发现了该酶在膜上的位置以及它对糖核苷酸前体和Mg²⁺的依赖。Prehm发现B6细胞产生的延长的HA，被加入在培养基中的透明质酸酶消化，从而推测在质膜上存在HAS。Philipson和Schwartz也发现在鼠的少突胶质细胞瘤细胞中HAS活性与质膜标记具有相同的分布。

随着粘多糖合成过程的进行，HAS组装高Mr的HA，HA同时挤出膜进入细胞外空间(或者在细菌中产生细胞衣)。这种生物合成模式在各种大分子中是唯一的，而核酸、蛋白、和脂类是在核、内质网/高尔基体、细胞质、或线粒体中合成。生长链向细胞外空间的挤出可有利于聚合物不受束缚地生长，从而完成HA格外硕大的分子，而在高尔基体或高尔基前体中的合成是受限制的，形成的聚合物的总量或长度都有限。在内腔中高浓度的HA还会产生高粘度的环境而对其他的细胞器可能会造成损害。

多项研究曾试图从能够产生HA荚膜的链球菌属的菌株中以及从真核细胞中溶解、鉴定、和纯化HAS。虽然链球菌和鼠的少突胶质细胞瘤中的酶被成功地用去污剂溶解并进行了研究，但是试图纯化活性的HAS以进行进一步研究的努力几十年来却没有成功。Prehm和Mausolf利用高碘酸盐氧化的UDP-GlcA或UDP-GlcNAc来亲和标记链球菌属成员中的一个约52kDa的蛋白以进行HAS的共同纯化。结果报告宣称C组链球菌的HAS得到了克隆，不幸的是这是错误的。该研究无法表明活性合酶的表达，实际上可能克隆的是一个肽转运蛋白。Triscott和van de Rijn利用洋地黄皂苷以活性形式溶解链球菌属成员中的HAS。Van de Rijn和Drake选择性放射标记了三个42、33、和27kDa的带有5-叠氮钠-UDP-GlcA的链球菌属成员蛋白，并推测其中的33kDa蛋白是HAS。然而后来表明，HAS实际上是42kDa的蛋白。

尽管有这些努力，对于HA合成的调控和机制的了解基本上还是停滞的，因为没有HAS mRNA或HAS蛋白的分子探针。主要的突破发生在1993年，DeAngelis等报道了对编码蛋白HasA的A组链球菌基因的克隆和鉴定。该基因被认为某种程度上是细菌HA合成所需的一个操纵子，尽管该蛋白，现在被记作spHAS(化脓链球菌HAS)，的功能当时并不清楚。SpHAS后来被证明负责HA的延伸，它是第一个被鉴定的粘多糖合酶，被克隆并后来被成功地表达。化脓链球菌HA合成操纵子编码两个其他蛋白。HasB是一个UDP-葡萄糖脱氢酶，用于转化UDP-葡萄糖，形成HA合成的底物之一的UDP-GlcA。HasC是一个UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，用于转化葡萄糖-1-磷酸和UTP形成UDP-葡萄糖。hasA和hasB基因的共转染到无荚膜的链球菌属菌株或者粪肠球菌可使它们具有合成HA并形成荚膜的能力。这提供了第一个强有力的证据表明HasA是一个HA合酶。

难以捕捉的HA合酶基因最终通过转座子诱变的方法被克隆，该方法中产生出无荚膜的A组菌株的突变体，其含有将HA合成操纵子打断的转座子。该转座子的已知序列可以使得相邻的链球菌DNA区域得到鉴定并随后从野生型细胞中被克隆。编码的spHAS与酵母壳多糖合酶家族具有5-10％的相同性，与非洲爪蟾属Xenopus laevis的，功能当时尚不知道的蛋白DG42(其在原肠形成期发育性表达)具有30％的相同性。DeAngelis和Weigel在大肠杆菌中表达了活性重组spHAS并使得该单一的纯化基因产物在体外与UDP-GlcA和UDP-GlcNAc一起温育，合成了高MrHA，因此表明对于HA合成所需的两种糖基转移酶活性都由同一个蛋白所催化，这是在1959年被首次提出的。这为后来的研究提供了基础，1996年真核HAS cDNA几乎同时在4个实验室中被鉴定，揭示HAS是一个多基因家族，编码不同的同工酶。两个基因(HAS1和HAS2)很快在哺乳动物(29-34)中发现，并且第三个基因HAS3后来也被发现。第二个链球菌seHAS或称类马链球菌透明质酸合酶也被找到，并在本文中予以公开并要求权利。

正如所指出的，我们还鉴定了来自C组类马链球菌的真HAS基因(seHAS)；seHAS蛋白与spHAS酶具有高度的相同性(大约70％)。然而，这种相同性令人感兴趣，因为seHAS基因并不与spHAS基因交叉杂交。

从表达重组seHAS的大肠杆菌制备的膜在提供两种底物的情况下可以合成HA。这一结果证实了早先Lansing等报道的已经克隆了C组HAS的宣称是错误的。不幸的是，几项研究中使用了这一未鉴定的52kDa的链球菌蛋白的抗体，用于探查所认为的真核HAS。

Itano和Kimata在突变的不能合成HA的鼠乳腺癌细胞系中利用表达克隆，克隆了第一个推测的哺乳动物的HAS cDNA(mmHAS1)。HA合成缺陷的亚克隆被分为独立的三类，在体细胞融合实验中与HA合成相互补，结果提示至少有三种蛋白是所需的。三类中的两类保持了一些HA活性，而另一类没表现出活性。将后者细胞系与从平行细胞制备的cDNA一起用于瞬时转染实验，鉴定出单一的恢复了HA合成活性的蛋白。序列分析揭示约65kDa的蛋白的初级结构具有预期的与spHAS相似的膜拓扑学结构。mmHAS1与spHAS具有30％的相同性，与DG42具有55％的相同性。该报道出版的同一个月，另外三个小组所提供的论文描述了编码起先被认为是相同的鼠和人的酶的cDNA。但是，在各种特定的条件下，这四个实验室分别发现出的是在两个种中不同的同工酶。

利用与Itano和Kimata相似的功能克隆方法，Shyjan等鉴定了人HAS1的同源物。利用肠系膜淋巴结cDNA文库转染鼠粘膜T淋巴细胞，然后在红细胞玫瑰花结试验中筛选其粘附能力。一个转染子的粘附力被CD44的抗血清，一种已知的表面HA结合蛋白，所抑制，并可通过透明质酸酶进行的预实验所直接消除。因此，该转染子的红细胞玫瑰花结需要HA的合成。对相应的cDNA的克隆和测序鉴定出hsHAS1。Itano和Kimata还报道了从胎儿文库中分离出人HAS1cDNA。但是，这两个小组报道的hsHAS1 cDNA在长度上有差异；它们分别编码578和543个氨基酸的蛋白。HAS的活性只在较长的结构中有所表现。

根据对于spHAS作为可靠的HA合酶的鉴定以及DG42，spHAS和NodC(根瘤菌中一种β-GlcNAc转移酶生瘤因子)之间相近的相同性，Spicer等利用简并性RT-PCR方法克隆了鼠胚胎的编码第二种不同的酶cDNA，记作mmHAS2。通过颗粒排除试验，将mmHAS2cDNA转染进入COS细胞，介导了HA细胞衣的从头生产，因而提供了强有力的证据证明HAS2蛋白可以合成HA。利用相似的方法，Watanabe和Yamaguchi筛选人胎儿脑cDNA文库鉴定了hsHAS2。Fulop等独立地利用类似的策略也在从具有合成HA活性的卵丘细胞分离的RNA中鉴定了mmHAS2，合成HA是排卵期前卵泡中卵丘扩展的一个重要的过程。在排卵周期开始后，在HA合成开始之前，以及随后HA刚刚开始(3小时)，或者已经出现时(4小时)立即从小鼠分离卵丘细胞-卵母细胞复合体。RT-PCR表明HAS2 mRNA在开始时没有而在3-4小时后以高水平表达，这提示HAS2的转录在该过程中调控HA的合成。两种hsHAS2都是552个氨基酸长并具有98％的相同性。mmHAS1为583个氨基酸并与578个氨基酸的hsHAS1具有95％的相同性。

最近Spicer等利用PCR方法鉴定了哺乳动物中的第三个HAS基因。该mmHAS3蛋白长度为554个氨基酸并且与mmHAS1，mmHAS2，DG42和spHAS分别具有71、56、和28％的相同性。Spicer等还将这三种人和鼠的基因分别定位在三条不同的染色体上(HAS在hsChr19/mmChr17；HAS2在hsChr8/mmChr15；HAS3在hsChr16/mmChr8)。这三种基因在三条不同的染色体上的定位以及HA在整个脊椎动物纲中都存在的事实提示：该基因是古老的且同工酶在脊椎动物进化的早期就已经复制出现。细菌和真核的HAS间的高度相同性(～30％)还提示它们两者具有相同的祖先基因。可能原始细菌在真核基因产物变得更大和更复杂之前就从早期的脊椎动物祖先获取了HAS基因。或者，细菌曾经获取了较大的脊椎动物HAS基因而删除了不是酶活性所必需的调控序列。

Dawid和其同事对X.1aevis DG42的发现在近来的发展中具有重要的地位，尽管该蛋白当时并不被认为是一个HA合酶。但是，DG42和spHAS具有30％的相同性，这对于设计寡核苷酸用于鉴定哺乳动物HAS2是极为重要的。具有讽刺意味地，DG42是一个真正的HA合酶的确切证据只是在哺乳动物同工酶被发现之后才被报道，DeAngelis和Achyuthan在酵母中(不能合成HA的生物)表达了重组蛋白并显示分离的膜在提供了两种底物时，它可以合成HA。Meyer和Kreil也表示DG42的cDNA转染的细胞的溶解液可以合成更高水平的HA。如今功能已经知道，因而DG42可以记作X1HAS。

所有的HAS蛋白都拥有相同的预期结构特征，包括一个较大的中心结构域和在蛋白的氨基端和羧基端都有的2-3个跨膜或膜相关的结构域簇。中心结构域占多达～88％的预期的细胞内HAS蛋白序列，它可能含有酶的催化区域。预期的中心结构域在spHAS中为264个氨基酸(占总蛋白的63％)，在真核HAS成员中为307-328个残基(占总蛋白的54-56％)。所有的HAS的膜结构域的确切数目和方向以及细胞外和细胞内环的拓扑结构都还没有在实验上确定。

spHAS是HAS家族中已经被纯化和部分鉴定的一个成员。利用spHAS/碱性磷酸酶融合蛋白的初步研究表明spHAS的N末端，C末端和大的中心结构域实际上都在细胞内。spHAS有6个半胱氨酸，而HAS1，HAS2，和HAS3分别有13，14和14个Cys残基。spHAS的6个Cys中的两个是保守的并且与HAS1和HAS2中的相同。只有一个保守的Cys残基在所有的HAS家族成员中存在于同一位点(spHAS的Cys225)。这可能是一个重要的Cys，它被巯基药物修饰可能会抑制酶的活性。HAS家族中任何成员的可能存在的二硫键以及对于下文所提及的多种HAS的功能来说非常重要的Cys残基还未被阐明。

除了所推定的在质膜上独特的合成方式，HAS酶家族在HA整体聚合所需的许多功能方面都具有不寻常之处。在HAS中存在至少6种独立的活性：对两种不同的糖核苷酸前体(UDP-GlcNAc和UDP-GlcA)的每一种的结合位点，两种不同的糖基转移酶的活性，一个或多个将生长的HA聚合物与酶锚定的结合位点(可能涉及到B-X₇-B基序)，以及将生长的聚合物每次向前移动一个糖的棘齿类的转移反应。后一活性可能与聚合物穿膜的步进过程相配合。所有这些功能以及其他可能还不了解的功能都由一个大小为419个(spHAS)到588个(xHAS)氨基酸范围内的相对较小的蛋白所提供。

虽然各种已有的证据都支持spHAS蛋白是细菌或体外HA生物合成所需蛋白的结论，但是，较大的真核HAS家族成员可能是多成分的复合物。由于真核HAS比spHAS大～40％，它们多出的结构域可能与更为精巧的功能如细胞内的转运和定位、酶学活性的调控、和与其他细胞组分的介导反应相关。

对编码不同合酶的多种脊椎动物HAS基因的意外发现明显说明，HA是一个重要的细胞行为的调节因子而不仅是组织中的一个结构成分。因此，在不到6个月内，对HA的合成和生物学研究的领域从一个已知的克隆HAS(spHAS)发展到对一个多基因家族的识别，其预示着对HA的合成和生物学的快速大量的令人激动的研究进展。

例如，本文下面公开了两种HAS基因的序列：来自出血败血性巴斯德氏菌和paramecium bursaria chlorella病毒(PBCV-1)。这两个系统中透明质酸合酶的存在，以及对这两种不同系统的透明质酸合酶的纯化和应用提示：我们能够从多种不同的原核和病毒来源中纯化和分离编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸序列。

C组类马链球菌菌株D181能够合成并分泌透明质酸(HA)。研究人员曾经利用该菌株和A组化脓链球菌菌株，诸如S43和A111，来研究HA的生物合成并鉴定HA的合成活性对二价阳离子的需要、前体(UDP-GlcNAc和UDP-GlcA)的利用和优化的pH。

传统上，HA商业上从鸡冠或链球菌培养物的细胞外培养基中制备。曾有一种改进的利用产生HA的链球菌制备HA的方法。美国专利4,517,295描述了这种方法，将产生HA的链球菌在富含CO₂的生长培养基中厌氧条件发酵。在此条件下HA产生并可从培养基中抽提出来。一般认为从鸡冠中分离HA的方法是辛苦和困难的，因为是从低纯度的HA状态开始。从鸡冠中分离HA的优点在于产生的HA是较高分子量的。但是，通过细菌发酵进行HA的制备较为容易，因为制备是从较高纯度的HA状态开始。然而通常以这种方法产生的HA的分子量小于来自鸡冠的。因此，能够使得细菌发酵产生高分子量HA的技术将是对现有方法的一大改进。

高分子量HA具有广泛的应用—从化妆品到眼外科的各种领域。根据它在高粘度和高度生物相容性上的潜力，HA在眼外科中具有特别的应用，可用以作为玻璃体的替代物。HA还可以通过关节内注射被用于治疗赛马的创伤性关节炎，还可用作剃须泡沫的润滑剂，并根据其生理化学特性中的高粘度和可以长时间保湿的能力，将其用于各种化妆品。实际上，1997年8月食品药物局批准了通过直接在受治的关节处注射高分子量HA来对严重的关节炎进行治疗。通常，所使用的HA的分子量越高越好。这是因为HA溶液的粘度随着溶液中各种HA聚合物分子的平均分子量的增大而增大。不幸地是，非常高分子量的HA，如达到10⁷，很难通过现有的分离方法获得。

为了解决这些以及其他问题，有必要找到新的方法和构建体，从而在HA的生产上具有一种或多种改进特性，诸如更高的纯度或者简便的制备。尤其是有必要发展出新的方法，以生产大量的、比现有的商业产品分子量相对高并相对纯的HA。另外还需要开发生产具有修饰的大小分布的HA(HA_Δsize)以及具有修饰的结构的HA(HA_Δmod)的方法学。

本发明解决了现有技术中的一种或几种缺陷。本文公开了利用重组DNA技术得到的纯化的具有编码酶学活性seHAS编码区的核酸区段，以及用于生产酶学活性的HA合酶的方法，和利用该核酸区段制备能产生HAS和它的透明质酸产物的重组细胞的方法。

因此，本发明的一个目的在于提供一种具有编码酶学活性HAS的编码区的纯化的核酸区段。

本发明另一个目的在于提供一种包含具有编码酶学活性HAS的编码区的纯化的核酸区段的重组载体。

本发明再一个目的在于提供一种用包含具有编码酶学活性HAS的编码区的纯化的核酸区段的重组载体转化的重组宿主细胞。

本发明的又一个目的在于提供一种检测表达HAS的细菌细胞的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种用于由透明质酸合酶基因诸如seHAS产生高和/或低分子量透明质酸的方法，以及产生具有修饰的大小分布和/或修饰的结构的HA的方法。

本发明的这些和其他目的通过说明书、权利要求书和附图的描述而更加明了。

本发明概述

本发明涉及应用重组DNA技术解决透明质酸(HA)制备中的一个或几个问题。这些问题通过分离或利用具有编码酶学活性类马链球菌透明质酸合酶(seHAS)基因的编码区的核酸区段而得到解决。seHAS基因是负责HA链生物合成的基因，它从适当的微生物来源的DNA克隆得到并被操作进入有用的重组构建体中用于制备HA和用于制备大量的HAS酶本身。

本发明包含一个新基因，seHAS。通过提供逃避吞噬作用和免疫监控的手段，这个基因的表达与链球菌A组和C组菌株的毒性相关。术语“透明质酸合酶(hyaluronate synthase)”、“透明质酸合酶(hyaluronic acid synthase)”、“透明质酸合酶(hyaluronan synthase)”、“HA合酶”可互换地用于描述能够聚合粘多糖多糖链的酶，该粘多糖多糖链交替地由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成，通过β1，3键和β1，4键相连。术语“seHAS”描述了来自类马链球菌的HAS酶。

本发明涉及对透明质酸合酶基因、cDNA和基因产物(HAS)的分离与鉴定，其可以用于葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的聚合反应而形成粘多糖透明质酸。本发明确定了seHAS的基因座并公开了编码类马链球菌的酶学活性的seHAS基因的核酸序列。该HAS基因还可提供新的探针，用以检定细菌样本是否具有产生透明质酸的能力。

通过应用本文的技术和知识，本领域的熟练技术人员将能够获得编码seHAS基因的核酸区段。本领域的熟练技术人员应能认识到的是，根据本发明，这些优点能够在控制seHAS基因的表达和控制所产生的seHAS基因产物，seHAS酶，的特性上提供有效的应用。

因此，本发明涉及分离具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段，不论该片段是原核还是真核来源的。这是因为该酶，实际上就是该基因在原核与真核中都存在。真核生物也已经知道能够产生HA，因而也具有HA合酶基因，可以与本发明相结合应用。

本发明的HA合酶的编码核酸区段是指不含有总染色体或基因组DNA的分离的核酸，因而可以容易地通过重组DNA技术进行操作。因此本文所用的短语“纯化的核酸区段”是指，不含有无关的染色体或基因组DNA的DNA区段，并保持在可以用于重组技术操作的状态下，诸如单独的分离的DNA区段或含有该片段的载体(例如，质粒、噬菌体或病毒)的形式。

本发明的一个优选的实施方案是具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的seHAS或者是含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的纯化的核酸区段。

本发明的另一个实施方案包含具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段，且该纯化的核酸区段能够与SEQ ID NO：1的核苷酸杂交。

本发明还包括天然的或重组的载体，包括质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。该重组载体也可含有具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。

尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的seHAS或者该纯化的核酸区段含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。如果重组载体是一个质粒，它还进一步包括表达载体。该表达载体还可包括与酶学活性HAS编码区有效相连的启动子。

在另一个实施方案中，本发明包括一种重组宿主细胞，如转化有重组载体的原核细胞。该重组载体含有具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ IDNO：2的seHAS或者该纯化的核酸区段含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

本发明还包括重组宿主细胞，如转染有重组载体的真核细胞，该重组载体含有具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的seHAS或者该纯化的核酸区段含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。该概念是产生编码酶学活性的HAS的特异修饰的seHAS基因，它能够产生具有修饰的结构或修饰的大小分布的透明质酸聚合物。

本发明进一步包括通过电穿孔导入重组载体的重组宿主细胞。该重组载体可包括具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的seHAS或者该纯化的核酸区段含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。该酶学活性的HAS还能够产生具有修饰的结构或修饰的大小分布的透明质酸聚合物。

在另一个实施方案中，本发明包括转导有重组载体的重组宿主细胞，该重组载体包括具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段。尤其是，该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的seHAS或者该纯化的核酸区段含有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。该酶学活性的HAS还能够产生具有修饰的结构或修饰的大小分布的透明质酸聚合物。

本发明还包括纯化的组合物，其中该纯化的组合物含有一个具有编码酶学活性的HAS的编码区以及进而具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施方案中，本发明包括一种检测DNA样品的方法，包括的步骤有：(1)获取DNA样品；(2)将该DNA样品与SEQ IDNO：1的纯化的核酸区段相接触；(3)将该DNA样品与该纯化的核酸区段杂交从而形成杂交复合物；以及(4)检测该复合物。

本发明还包括一种检测表达编码seHAS的mRNA的细菌细胞的方法，包括的步骤有：(1)获取细菌细胞样品；(2)将该细菌细胞样品中的至少一种核酸与SEQ ID NO：1的纯化的核酸区段相接触；(3)将该至少一种核酸与该纯化的核酸区段杂交，从而形成杂交复合物；以及(4)检测该复合物，杂交复合物的存在则表明细菌菌株表达编码seHAS的mRNA。

本发明还包括检测细胞中seHAS或者spHAS的存在的方法。尤其是，该方法包括利用SEQ ID NO：3-8所述的寡核苷酸作为探针。这些寡核苷酸可使研究人员搜索和检测细胞中seHAS或spHAS的存在。

本发明进而还包括生产透明质酸的方法，包括的步骤有：(1)将具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸引入一个宿主生物中，其中该宿主生物含有编码能够产生UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的酶的核酸区段；(2)在培养基中培养此宿主生物以分泌透明质酸；并(3)回收分泌的透明质酸。

此方法还包括从培养基中抽提分泌的透明质酸的步骤，以及纯化抽提的透明质酸的步骤。而且，该宿主生物可以分泌结构上修饰的透明质酸或者大小上修饰的透明质酸。

本发明还包括一种药物组合物，其包括一种预选的药物和有效量的由重组HAS产生的透明质酸。该药物组合物中的透明质酸的分子量被修饰从而产生的经修饰的分子量的药物组合物能够提高免疫应答。经修饰的分子量也可以产生一种药物组合物，其能够靶向具有对该经修饰的分子量的药物组合物有亲和力的患者体内特异的组织或细胞类型。

本发明还包括纯化的和分离的编码酶学活性seHAS的核酸序列，该核酸序列是(a)SEQ ID NO：1的核酸序列；(b)与SEQ ID NO：1的核酸序列互补的核酸序列；(c)能够与SEQ ID NO：1的核酸杂交的核酸序列；和(d)能够与SEQ ID NO：1的互补核酸序列杂交的核酸序列。

本发明进而还包括基本上由编码酶学活性HAS的核酸区段组成的纯化的和分离的核酸区段。

本发明还包括基本上由编码seHAS的核酸区段组成的分离的核酸区段，其具有充分复制于SEQ ID NO：1的核酸区段的核酸区段从而拥有编码酶学活性的HAS的生物学特性。该核酸区段也可以是cDNA序列。

本发明还包括具有编码酶学活性的HAS的编码区的纯化的核酸区段，其中纯化的核酸区段能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列杂交。

附图的简要描述

图1描述的是seHAS和spHAS基因之间不发生交叉杂交。

图2图示了seHAS与细菌和真核HAS蛋白的相关性。

图3图示了已知的一些透明质酸合酶之间的进化关系。

图4描述了经各种工程链球菌HAS酶所产生的HA的大小分布。

图5图示了大肠杆菌中重组seHAS和spHAS的过表达。

图6描述了链球菌HA合酶的纯化。

图7描述了在酵母膜中表达的重组链球菌HAS合成的HA的凝胶过滤分析。

图8是利用特异抗体进行的重组seHAS的Western印迹分析。

图9是重组seHAS和spHAS产生的HA大小分布的动力学分析。

图10图示了seHAS和预计的膜相关区域的亲水性图。

图11是seHAS在膜中拓扑学组织的模型。

图12表示重组seHAS合成了真HA。

图13描述了利用特异的寡核苷酸和PCR对编码seHAS、编码spHAS、或编码seHAS和spHAS的核酸序列的识别。

图14描述了特异PCR杂交所用的寡核苷酸。

本发明的详细描述

在详细解释本发明的任何一个实施方案之前，应当了解的是，本发明的应用并不局限于下文和图表详细描述的细节和内容上的安排。本发明可以有其他的实施方案或者以其他的方式进行操作。而且，应当了解的是，本文所用的措辞和术语目的在于描述而不应被视作限制。

本发明中所用的术语“核酸区段”和“DNA区段”可以相互替换，是指被分离的、不含某种生物总基因组DNA的DNA分子。因而本文所用的“纯化的”DNA或核酸区段是指含有透明质酸合酶(“HAS”)编码序列的DNA区段，它被分离或者说纯化而不含有无关的基因组DNA，例如，类马链球菌或者例如哺乳动物宿主的总的基因组DNA。包括在术语“DNA区段”之中的有DNA区段和该区段中的较小的片段，以及重组载体，包括，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。

类似地，含有分离的或纯化的seHAS基因的DNA区段是指，与其他天然存在的基因或蛋白编码序列基本上分离的包含有HAS编码序列的DNA区段。在这一点上，使用的术语“基因”出于简单化的考虑是指功能性蛋白、多肽或肽的编码单位。正如本领域熟练技术人员所能理解的，此功能性术语包括基因组序列，cDNA序列或两者的结合。“与其他编码序列基本上分离的”是指所感兴趣的基因，如seHAS，形成该DNA区段的编码区的主要部分，而且该DNA区段不含有大部分的天然存在的编码DNA，诸如大的染色体片段或其他功能性基因或DNA编码区。当然，这是指最初分离的DNA区段，并不排除后来加入的或人为有意在该区段中放入的基因和编码区。

根据使用的原核来源所涉及的某些优越性，我们可以很容易地认识到从原核生物诸如化脓链球菌，类马链球菌或出血败血性巴斯德氏菌中分离HAS基因的最为有利之处。一个有利之处就是，通常地，真核生物的酶可能需要重要的转录后修饰，这只能在真核宿主内完成。这将会限制所获得的真核HA合酶的应用。而且，本领域的普通技术人员可以很容易地认识到选择使用原核酶的基因在时间和遗传操作上其他的优越性。其他的优越性包括(a)原核基因分离的简便性，因为基因组相对的小，因此降低了对其相应的基因组文库筛选的数量；(b)操作的简便性，因为原核基因编码区的总体大小由于不存在内含子而明显小得多。而且，如果seHAS基因产物(如，酶)需要翻译后修饰，它可以在该基因所来自的较小的原核细胞环境(宿主)中完成。

优选地，本发明的DNA序列进一步包括遗传控制区域，以使得该序列在选择的重组宿主中表达。当然，所用的控制区域的特性通常应当根据预想的特定应用(如克隆宿主)而变化。

在特定的实施方案中，本发明涉及掺入编码seHAS基因的DNA序列的分离的DNA区段和重组载体，该基因的氨基酸序列包含SEQID NO：2的氨基酸序列。而且，在另一个实施方案中，本发明涉及掺入编码一个基因的DNA序列的分离的DNA区段和重组载体，该基因的氨基酸序列包括HAS基因或DNA尤其是指类马链球菌的HAS基因或cDNA的氨基酸序列。例如，当DNA区段或载体编码全长的HA蛋白，或者用于表达HAS蛋白时，优选的序列是基本上如SEQ IDNO：2所列的序列。

具有HA合酶活性的核酸区段可以通过本文所述的方法分离。术语“基本上如SEQ ID NO：2所列的序列”是指该序列基本上与SEQ IDNO：2的部分相符，而只有相对很少的氨基酸不与SEQ ID NO：2的氨基酸相同，或者不是SEQ ID NO：2的氨基酸的生物学功能等同物。术语“生物学功能等同物”是本领域中所熟知的，在本文中的进一步定义是指，具有基本上如SEQ ID NO：2所列的序列的基因，并且与原核生物产生HA或透明质酸包被的能力相关。

例如，seHAS和spHAS编码序列大约70％相同并富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)碱基。SeHAS碱基组成为A-26.71％，C-19.13％，G20.81％，T-33.33％(A/T＝60％)。而spHAS则为A-31.34％，C-16.42％，G16.34％，T-35.8％(A/T＝67％)。本领域的普通技术人员会惊异于seHAS编码序列并不与spHAS基因杂交，反之亦然，尽管它们具有70％的相同性。这种意外的不能够交叉杂交的情况可能是由于整个阅读框上不匹配碱基的短小的中断。seHAS与spHAS不能交叉杂交的情况如图1所示。seHAS与spHAS编码序列两者间最长的相同核苷酸跨度只有20个核苷酸。此外，富含A-T的序列比富含G-C的序列形成较低的稳定性杂交复合物。另外的可能的解释是两个序列上都有多个A和T的延伸，因而可能形成偏离的和不稳定状态的杂交。这使得seHAS和spHAS基因序列相互不在框内，因而降低了形成杂交的可能性。

由于这一独特的、两个基因编码的蛋白具有70％的相同性而不能交叉杂交的现象，因而有必要从其功能上考虑所要求的核酸区段；例如，一个编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段。本领域的普通的技术人员应当理解的是，编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段可以含有对SEQ ID NO：1和2所述序列的保守的和半保守取代，并依然处于本发明的范围之内。

尤其是，研究人员能够对核酸区段进行结构改变(例如，保守型或者半保守型氨基酸的取代)而依然保持它的酶学或者功能活性，这样的实例在本领域有很多。例如可参见：(1)Risler等，“结构相关蛋白的氨基酸取代，一种模式识别方法”，分子生物学杂志，204：1019-1029(1988)[“…根据所观察到的氨基酸侧链的可取代性，只分成四组(i)Ile和Val；(ii)Leu和Met；(iii)Lys，Arg，和Gln，以及(iv)Tyr和Phe。”]；(2)Niefind等，“来自主链折叠变色龙的蛋白模型与序列比对的氨基酸相似性系数”，分子生物学杂志，219：481-497(1991)[相似性参数可用于设计氨基酸取代]；和(3)Overigton等，“环境特异的氨基酸取代表：三级模板和蛋白折叠的预测”，蛋白质科学，1：216-226(1992)[“根据局部环境功能对所观察的取代类型进行的分析表明存在不同的类型…”可以进行相容性改变]。

这些以及其他很多的参考文献表明，对于一个核酸序列，本领域的普通技术人员可以进行取代和改变而不改变它的功能。而且，与原类型相比，取代的核酸区片段可以具有高度相同性并保持它的酶学活性，但不能与之杂交。

本发明公开了编码酶学活性的透明质酸合酶—seHAS和spHAS的核酸区段。虽然seHAS和spHAS具有70％的相同性并且都编码酶学活性的透明质酸合酶，但是它们并不交叉杂交。因此，本领域的普通技术人员能够理解的是，可以对SEQ ID NO：1所列的seHAS核酸区段进行取代而并不偏离出本发明的范围与权利要求之外。表I中列出了标准化的和可接受的功能相当的氨基酸取代。

表I

氨基酸组别	保守型和半保守型取代
氨基酸组别	保守型和半保守型取代	非极性R组	丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸
极性但不带电荷R组	甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺	非极性R组	丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸
极性但不带电荷R组	甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺	带负电荷R组	天冬氨酸，谷氨酸
带正电荷R组	赖氨酸，精氨酸，组氨酸	带负电荷R组	天冬氨酸，谷氨酸

本发明的另一个优选的实施方案是纯化的、编码基于SEQ IDNO：2的蛋白的核酸区段，进而还包括重组载体。本文所用的术语“重组载体”是指一个经过修饰含有编码HAS蛋白或其片段的核酸区段的载体。该重组载体可进而定义为含有与所说的HAS编码核酸区段有效相连的启动子的表达载体。

本发明的进一步的优选的实施方案是一种宿主细胞，它用含HAS基因的重组载体重组。优选的重组宿主细胞可以是一个原核细胞。在另一个实施方案中，此重组宿主细胞是一个真核细胞。本文所用的“工程”或者“重组”细胞是指在一个细胞中被引入了重组基因，诸如编码HAS的基因。因此工程细胞不同于天然存在的细胞，后者不含有重组引入的基因。工程细胞因而具有人为引入的一个或多个基因。重组引入的基因可以是cDNA基因的形式、基因组基因的拷贝形式、还可以包括定位于天然情况下与此特定的引入基因不相关的启动子附近的基因。

当需要利用链球菌属以外的宿主来产生重组的HA合酶时，可以有利地利用原核系统，诸如大肠杆菌、枯草杆菌、乳球菌，或者甚至利用真核系统，诸如酵母或者中国仓鼠卵巢细胞，非洲绿猴肾细胞，VERO细胞等等。当然，在操作时，通常将HA合酶基因置于在所选择的宿主中具有功能的序列的控制之下。合适的DNA控制序列，及其构建与使用，是本领域通常所知的，在下文中还将详细讨论。

在优选的实施方案中，HA合酶编码的DNA区段进而还包括为本领域所知的功能性复制起点或“复制子”的DNA序列，它可使特定的宿主进行连续序列的复制。该起点可使得制备位于染色体之外并复制的嵌合型区段或质粒，而HA合酶DNA序列与之相连。在更为优选的方案中，所用的起点是能够在适于生物工程应用的细菌中进行复制的起点。然而，出于克隆的DNA区段的多功能性考虑，可以设计出其他的或甚至另外添加的起点，用于被其他的可相容应用的宿主系统所识别(例如在穿梭载体中)。

本领域普通技术人员熟知对其他的复制起点诸如SV40，多瘤或牛乳突状瘤病毒的起点的分离和应用，它们可以用于许多高等生物中的克隆或表达。在某些实施方案中，本发明因而可以是一种重组转化载体，该载体上含有HA合酶编码基因序列以及适当的复制起点并被选择的控制区域所调控。

因此，本领域的熟练技术人员应当理解的是，可以根据本发明的揭示，利用其他的方法来获得HAS基因或cDNA。例如，可以获得聚合酶链反应或RT-PCR产生的DNA区段，它可以含有来自多种来源的基因或cDNA的全长互补体，包括链球菌属的其他菌株或来自真核来源的，如cDNA文库。实际上任何分子克隆的方法都可以用于产生本发明的DNA片段。因此，唯一的对某种分离DNA的方法的一般限制就是分离的核酸应当编码一个在生物学上功能相当的HA合酶。

一旦将DNA分离出后，将其与一个选择的载体相连接。实际上任何克隆载体都可以用以实现本发明优越性。典型的可用载体包括用于原核生物的质粒和噬菌体以及用于真核生物的病毒载体。实例包括pKK223-3，pSA3，重组λ噬菌体，SV40，多瘤病毒，腺病毒，牛乳突状瘤病毒和反转录病毒。然而，据信当利用在诸如乳球菌或者枯草杆菌属菌株和大肠杆菌中都能复制的载体时，才能最终实现某些特定的优越性。

这些载体，例如Dao和Ferrttti的pSA3载体或者Trieu-Cuot等的pAT19载体，能够在易于操作的宿主如大肠杆菌中进行克隆菌落的筛选，然后转移回食品级的乳球菌或者枯草杆菌属菌株中生产HA。有许多刚开始和已有深入研究的微生物用于食品和生物工程产品的生产。其优越性在于可以通过基因剂量(即，通过扩增提供额外拷贝的HA合酶基因)和/或加入其他基因以增加HA前体的数量来增强乳球菌或者枯草杆菌属菌株生产HA的能力。细菌固有的合成HA的能力也可以通过形成额外的拷贝数或者扩增携带HA合酶基因的质粒来增强。这种扩增可以获得多达10倍的质粒拷贝数，从而得到10倍的HA合酶基因的拷贝数。

另一种可以进一步增加HA合酶基因拷贝数的方法是，在质粒中插入多拷贝的基因。其他的技术包括将HAS基因整合到染色体DNA上。这种额外扩增尤为可行，因为细菌HA合酶基因比较小。在某些情况下，使用连接染色体DNA的载体转染出于克隆筛选的目的而选择的宿主，如大肠杆菌，利用该载体从而能够在所选择的宿主中表达插入的DNA。

当使用真核来源如真皮或滑液的纤维原细胞或者鸡冠细胞时，可以以制备cDNA文库作为开始。首先从上述细胞中分离出mRNA，然后利用具有反转录活性的酶制备双链cDNA并将其连接到所选的载体上。制备双链cDNA有许多种可行的方法并且是本领域所熟知的，所有这些技术据信都可以应用。一种优选的技术涉及反转录。一旦获得了大量的双链cDNA，在所选的宿主中将cDNA文库通过可接受的技术制备，如与适当的载体相连接并在适当的宿主中扩增。由于通过本文所述技术可获得大量的克隆，而且大量的克隆比较易于筛选，所以可使用噬菌体表达载体，如λgt11，λgt12，和/或λZAP来克隆和表达筛选cDNA克隆。

在某些其他实施方案中，本发明涉及含有基本上如SEQ ID NO：1所列的核酸序列分离的DNA区段和重组载体。所用的术语“基本上如SEQ ID NO：1所列的核酸序列”与上文所述的意思相同，是指该序列基本上与SEQ ID NO：1的一部分相符，而只有相对很少的密码子不与SEQ ID NO：1的密码子相同，或者不与SEQ ID NO：1的密码子在功能上相当。术语“功能上相当的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，如表I中所列，也可以是指编码生物学相当的氨基酸的密码子。

应当理解的是氨基酸和核酸序列可以包括添加的残基，如添加在N-或C-末端的氨基酸或5’-或3’-核酸序列，而仍然基本上与本文所公开的序列相同，只要该序列符合上述的标准，包括对所研究的蛋白表达和酶学活性来说，保持了生物学蛋白活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，它可以包括，例如，在编码区的5’和3’外侧部分的各种非编码区序列，或者可以是各种内部序列，这在基因中是存在的。尤其是，真核生物中的HAS基因的氨基酸序列比在原核生物中的要大40％。

考虑到遗传密码的简并性以及保守型和半保守型取代，如果序列所具有的约40％和80％之间；或者更为优选地在约80％至90％之间；或者更为优选地在约90％至99％之间的核苷酸与SEQ ID NO：1的核苷酸相同，那么它就是“基本上如SEQ ID NO：1所列的核酸序列”。基本上与SEQ ID NO：1所列序列相同的核酸序列也可以在功能上来定义，它能够与含有SEQ ID NO：1的互补链的核酸区段在标准条件下或不很严格的杂交条件下杂交。适当的标准杂交条件是本领域熟练技术人员所熟知的，并在本文中有清楚的描述。

本文所用的术语“标准杂交条件”是指在该条件下基本互补的核酸区段将形成标准的Watson-Crick碱基对。已知有许多因素决定结合或杂交的特异性，如pH，温度，盐浓度，存在的试剂诸如甲酰胺和二甲亚砜，杂交区段的长度，等等。当用较短的核酸区段进行杂交时，例如约14至100个核苷酸之间的片段，杂交的盐和温度的优选条件为1.2-1.8×HPB，40-50℃。

当然，本发明还包括与SEQ ID NO：1所列序列互补，或基本互补的DNA区段。“互补的”核酸序列是指能够按照标准的Watson-Crick互补原则形成互补碱基对的序列。本文所用的“互补序列”是指基本上互补的序列，可通过上述的相同核苷酸比较来确定，也可以通过能够与SEQ ID NO：1的核酸区段杂交来确定。

本发明的核酸区段，不考虑编码序列本身的长度，可以与其他的DNA序列联合使用，如启动子，多聚腺苷信号，添加的限制酶位点，多克隆位点，附加表位，多聚组氨酸区域，其他的编码区，等等，因而其总体长度可以是非常可观的。因此可以认为几乎任何长度的核酸区段都可以使用，而其总长度应限制在易于制备和用于重组DNA操作的范围内。

当然，应当理解的是本发明并不限制于SEQ ID NO：1和2的特定的核酸和氨基酸序列。重组载体和分离的DNA区段因而不同的情况下可以包括HAS编码区本身、在基本的编码区中带有所需要的改变和修饰的编码区，或者它也可以编码较大的多肽而其中含有HAS编码区，或可以编码具有不同的氨基酸序列而在生物学上功能相当的蛋白或肽。

例如，我们在两个系统中发现、鉴定并纯化了透明质酸合酶：(a)格兰氏阴性菌出血败血性巴斯德氏菌(SEQ ID NO：19)；和(2)绿藻病毒PBCV-1(SEQ ID NO：7和8)。透明质酸合酶在这两个系统中的存在以及我们能够从这两个系统中纯化并利用它的透明质酸合酶表明，我们能够纯化并分离编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸序列。

Carter A型的出血败血性巴斯德氏菌(SEQ ID NO：19)的荚膜中长期以来一直被怀疑含有透明质酸HA。对出血败血性巴斯德氏菌的HA合酶的鉴定发现了在它与seHAS和spHAS蛋白之间的有趣的酶学差异。

出血败血性巴斯德氏菌(细胞产生一个易于观察到的细胞外HA荚膜，而且由于那两个链球菌HAS是膜蛋白，因而对禽类霍乱病原体的膜制备物进行了检测。在早期的试验中，超声破碎获得的粗的膜组分只含有很低水平的UDP-GlcNAc依赖的UDP-[¹⁴C]Glc掺入HA中[～0.2 pmol的GlcA转移(μg蛋白)^-1h^-1]，试验条件与测试链球菌HAS活性的条件相似。带有重组hasA质粒的大肠杆菌中的酶起先也不容易分离。与这些结果相反的是以相类似的方法从链球菌属中很容易获得可检测数量的酶。

另一种制备方法是在蛋白酶抑制剂存在下，利用冰冷的溶菌酶处理，并结合使用超声处理，可以从两种格兰氏阴性菌中基本回收HAS活性。用这种新方法从野生型出血败血性巴斯德氏菌的粗膜中常规可获得的HAS的比活性为5-10pmol的GlcA转移(μg蛋白)^-1h^-1。在不存在UDP-GlcNAc的情况下，实际上没有来自UDP-[¹⁴C]GlcA的放射性掺入高分子量物质(＜1％以两种糖前体所作的相同实验)。从无荚膜的突变体TnA制备的膜，在提供了两种糖前体情况下，不具有可检测到的HAS活性(数据未给出)。利用Sephacryl S-200柱子进行的凝胶过滤分析表明主要的¹⁴C标记的体外合成的产物的分子量为＞8×10⁴Da，因为该物质在外水体积中被洗脱，这样的分子量相当于由至少400个单体组成的HA分子。该产物对链霉菌透明质酸酶消化敏感而对蛋白酶处理具有抗性。

可改变HAS试验的参数以通过出血败血性巴斯德氏菌膜使掺入多糖中的UDP-糖的量最大。链球菌spHAS需要Mg²⁺，因而在起始的出血败血性巴斯德氏菌试验中含有此金属离子。出血败血性巴斯德氏菌的HAS(pmHAS)在pH6.5至8.6的Tris型缓冲盐中相对具有活性，最佳为pH7。HAS活性在中性pH下与温育时间至少在1小时内呈线性关系，。pmHAS在高离子强度下活性较低，因为在含有50mM Tris，pH7，和20mM MgCl₂的反应中加入100mM NaCl，糖的掺入降低了50％。

pmHAS的离子特异性在pH7进行了测试。在存在EDTA而无金属离子的条件下，没有放射性前体掺入到多糖中(＜0.5％的最大信号)。在最低浓度下所有测试的离子(Mg，Mn，Co，Cu，和Ni)中，Mn²⁺获得了最高的掺入率。Mg²⁺在高10倍的浓度下获得了Mn²⁺效果的50％。Co²⁺或Ni²⁺在10mM只提供了很低水平的活性(分别相当于1mMMn²⁺试验的20％或9％)，而提供有10mM Cu²⁺时膜没有活性。实际上将10mM Cu²⁺和20mM Mg²⁺与膜制备物混合，其结果是几乎没有标记物掺入多糖(＜0.8％的单独使用Mg的值)。

起先对pmHAS的鉴定是在Mg2+存在的条件下进行。酶对糖核苷酸前体的结合亲和力通过测量表观K_M值来测定。[¹⁴C]GlcA或[³H]GlcNAc在多糖中的掺入在不同浓度的UDP-GlcNAc或UDP-GlcA下进行监测。在含有Mg²⁺的缓冲液中，利用滴定数据的Hanes-Woolf作图([S]/v对[S])确定出UDP-GlcA的表观K_M值为～20μM，UDP-GlcNAc的表观K_M值为～75μM。两种糖的V_max值相同，因为Hanes-Woolf作图中相应于1/V_max的斜率是相同的。与用Mg²⁺作的试验相比较，UDP-GlcNAc的K_M值增加了25-50％，达～105μM，而在Mn²⁺存在下V_max增加了2-3倍。

来自出血败血性巴斯德氏菌，类马链球菌或化脓链球菌的HA合酶都利用UDP-糖，但对于pH和依赖的金属离子拥有不同的动力学参数和K_M值。该酶在pH7最具活性；但是pmHAS据报道在略酸的pH时更具活性并且在pH7.4时失活。在体外试验条件下，pmHAS利用Mn²⁺比利用Mg²⁺更为有效，但在细菌细胞内的生理学金属辅因子未被鉴定。相比之下，以前利用链球菌的酶的研究中，Mg²⁺比Mn²⁺更好，但是Mn²⁺在比最佳Mg²⁺的浓度低10倍时具有最高效果。pmHAS表现出的与UDP-糖的结合力比spHAS要强。在粗膜中测量的pmHAS各种底物的K_M值大约比链球菌膜中的HAS获得的数值低2-3倍：分别为UDP-GlcA的50或39μM，UDP-GlcNAc的500或150μM。

经动力学分析，pmHAS的V_max在Mn²⁺存在下比Mg²⁺存在时高2-3倍，但UDP-GlcNAc的K_M值在用前一种离子进行的试验中增长缓慢。显现出的较低的亲和力表明聚合反应率的提高不是由于Mn²⁺离子/糖核苷酸复合物与酶活性位点更强的结合。因此，Mn²⁺可能增强了某些其他反应步骤，改变了酶的另一位点/结构，或者修饰了磷脂膜的环境。pmHAS的基因序列和蛋白序列在SEQ ID NO：19中给出。

绿藻病毒PBCV-1编码一种功能性糖基转移酶，可以合成多糖、透明质酸(透明质酸，HA)。这一发现与通常的观察相反，通常病毒要么：(a)利用宿主细胞的糖基转移酶产生新的碳水化合物结构，要么(b)在病毒颗粒成熟的过程中积累宿主细胞的糖缀合物。而且，HA以前通常被认为只限于动物及其少数的致病菌病原体中。虽然许多植物的碳水化合物已经被鉴定，但是不论是HA还是相关的类似物以前都未曾在植物细胞中或原生生物中被检测到。

脊椎动物的HAS酶(DG42，HAS1，HAS2，HAS3)和链球菌HasA酶(spHAS和spHAS)具有几个序列相似的区域。测序病毒PBCV-1[草履虫Paramecium bursaria绿藻病毒]的双链DNA基因组时，一个ORF[开放阅读框]，A98R(登录号442580)编码一个567个残基的蛋白，其中28-33％的氨基酸与各种已发现的HAS相同。该蛋白被记作cvHAS(绿藻病毒HA合酶)。编码PBCV-1的基因序列和它的蛋白序列如SEQ ID NO：7和8所示。

PBCV-1是藻DNA病毒科的原形，该科是大的(175-190nm直径)多面体，形成噬斑的病毒科，在某些单细胞真核藻类如绿藻中复制，。PBCV-1在外层糖蛋白衣壳中含有至少50个不同的蛋白和脂类成分。PBCV-1的基因组是线性的非变序的330kb双链DNA分子，具有共价闭合的发卡结构末端。

根据其推导的氨基酸序列，A98R基因产物应当是一个完整的膜蛋白。为了验证此假说，在大肠杆菌中生产重组A98R并对膜组分进行HAS活性的试验。UDP-GlcA和UDP-GlcNAc被来自在质粒pCVHAS上含有A98R基因的细胞的膜组分掺入到多糖中(平均比活性为2.5pmoles GlcA转移/μg蛋白/分钟)，而不被来自对照细胞的样品掺入(＜0.001 pmoles GlcA转移/μg蛋白/分钟)。在转化了pCVHAS的细胞的可溶性组分中未检测到活性。UDP-GlcA和UDP-GlcNAc对于聚合反应是同时需要的。活性在pH7.2的Hepes缓冲液，含有10mM MnCl₂的条件下最佳，而当缺少此金属离子时则检测不到活性。在同一浓度下Mg²⁺和Co²⁺为Mn²⁺效力的～20％。PmHAS具有相似的金属依赖性，而其他的HAS则更依赖于Mg²⁺。

重组的A98R酶合成平均分子量为3-6×10⁶Da的多糖，比重组的spHAS或DG42 x1HAS体外合成的HA小(分别为～10⁷Da和～5-8×10⁶Da；13，15)。多糖被链霉菌Streptomyces hyaluroniticus HA裂解酶完全降解，该酶可以解聚HA，但不降解结构相关的粘多糖，如肝素和软骨素。

将PBCV-1感染的绿藻细胞进行A98R基因表达测验。在感染后的～15分钟出现一个～1,700个核苷酸的A98R的转录物，并在感染后60分钟消失，这表明A98R是一个早期基因。然后，对来自未感染和被PBCV-1感染的绿藻细胞的膜组分在感染后50和90分钟进行HAS的活性试验。感染的细胞具有活性，而未感染的细胞没有。如同细菌衍生的重组的A98R酶，从UDP-[¹⁴C]GlcA到多糖的放射性掺入同时依赖于Mn²⁺和UDP-GlcNAc。该放射性产物也可以被HA裂解酶降解。被破坏的PBCV-1病毒颗粒没有HAS活性。

利用高度特异的¹²⁵I-标记的HA结合蛋白对PBCV-1感染的绿藻细胞的HA多糖进行分析。感染后50和90分钟的细胞抽提物中含有大量的HA，但未感染的绿藻或被破坏了PBCV-1病毒颗粒的细胞抽提物中却没有。标记的HA结合蛋白也在感染后50和90分钟与被完全感染的细胞相互作用，而不与健康的细胞作用。因此，相当大部分的新合成的HA多糖固定在被感染的绿藻的外层细胞表面。细胞外HA并不对病毒与绿藻宿主间的相互作用起显著的作用，因为噬斑的大小和噬斑的数量都不随在PBCV-1噬斑试验的顶层琼脂中加入睾丸透明质酸酶(465单位/ml)或者游离的HA多糖(100μg/ml)而变化。

PBCV-1基因组还具有其他的基因编码UDP-Glc脱氢酶(UDP-GlcDH)和谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转氨酶(GFAT)。UDP-Glc DH将UDP-Glc转化为UDP-GlcA，后者是HA生物合成所需的前体。GFAT将果糖-6-磷酸转化成葡糖胺-6-磷酸，它是UDP-GlcNAc代谢途径中的中间体。这两个PBCV-1的基因，同A98R HAS一样，都在感染的早期表达并编码酶学活性的蛋白。HA生物合成中多种酶的存在表明HA的产生一定在绿藻病毒的生命周期中具有重要的功能。

链球菌属，脊椎动物和PBCV-1的HA合酶具有许多以相同的相对顺序排列的2-4个残基的基序。这些保守的基序可能反映了如图2所示的对于HA生物合成至关重要的一些结构域。C组seHAS，A组spHAS，鼠HAS1，HAS2，HAS3和蛙HAS的蛋白序列的对比如图2所示。图2中的对比是利用DNAsis多重对比程序完成的。seHAS中与其他已知的家族成员(包括人HAS1和2，未显示)相同的残基用阴影和星号标出。用点标出的氨基酸在较大的β-糖基转移酶家族的所有成员中保守。钻石符号表示高度保守的对酶活性至关重要的半胱氨酸残基。在预计的膜结构域MD1到MD7的大约中点处用箭头标出。X1表示Xeopus laevis，而MM表示Mus musculis。

HAS与其他催化UDP-糖前体合成β-连接的多糖的酶之间具有相似性的区域也随着更多的糖基转移酶被测序而被发现。实例包括细菌的纤维素合酶，真菌和细菌的壳多糖合酶，和各种HAS。这些相似的结构性基序的意义将随着糖基转移酶的三维结构的积累而变得越来越清楚。

图3描述了已知的透明质酸合酶之间的进化关系。图3的系统发育树是利用DNA多重对比程序按照Higgins-Sharp算法得出的。计算出的匹配百分比标记在系统发育图的各个分支上。

本发明的DNA区段包括生物学上功能相当的HAS蛋白和肽。这种序列可以由于密码子冗余而功能相当而产生，已知这是在核酸序列和其编码的蛋白序列中可以天然发生的。另外，功能相当的蛋白和肽可以通过重组DNA技术产生，其中根据对替换的氨基酸特性的考虑，在蛋白结构中产生改变。人为所需的变化可以通过应用定点诱变技术来诱导，例如，为了改进HAS蛋白或酶活性或抗原性，或者测试HAS突变体以在分子水平上检测HA合酶的活性。

另外，HAS编码序列的特定的改变可以导致产生具有修饰的大小分布或结构的HA。本领域的普通技术人员应当理解的是，HAS编码序列可以以某种方式进行操作从而产生变化的透明质酸合酶，它因而能够产生具有不同的聚合物大小和/或功能的透明质酸。例如，可以改变HAS编码序列，从而透明质酸合酶具有改变了的糖底物特异性，使得该透明质酸合酶产生出新的透明质酸类聚合物，它掺入不同的结构，如先前不被掺入的糖或糖的衍生物。这种新掺入的糖导致具有不同的功能特性的修饰的透明质酸，具有更小或更大的聚合物大小/分子量的透明质酸，或包括两者的透明质酸。正如本领域的普通技术人员所能理解的，给出了HAS编码序列，就可以对此HAS编码序列进行改变和/或取代，从而就可以完成所需的对特性和/或大小的修饰。表II列出了重组seHAS糖核苷酸的特异性和对镁离子的需要。

表II重组seHAS糖核苷酸的特异性和对镁离子的需要

提供的第二种糖核苷酸(μM)	HA合成^*
	HA合成^*		UDP-[¹⁴C]GlcAdpm(％)	UDP-[¹⁴C]GlcNAcdpm(％)
	无UDP-GlcNAc (300)UDP-GlcA (120)UDP-Glc (160)UDP-GalNAc (280)UDP-GalA (150)UDP-GlcNAc+EDTAUDP-GlcA+EDTA	90 (2.1％)4134(100％)----81 (1.9％)74 (1.7％)58 (1.4％)31 (0.7％)----	UDP-[¹⁴C]GlcAdpm(％)	UDP-[¹⁴C]GlcNAcdpm(％)	8 (1.2％)----635(100％)10 (1.5％)19 (2.9％)19 (2.9％)----22 (3.4％)

^*将膜(324ng蛋白质)与120μM UDP-[¹⁴C]GlcA(2.8×10⁴dpm)或者300μM UDP-[³H]GlcNAc(2×10⁴dpm)在37℃温育1小时。放射性标记的糖核苷酸在所示的第二种未标记的糖核苷酸存在下使用。HA合酶活性按照本发明中所描述的方法确定。

本文所用的术语“修饰的结构”是指透明质酸聚合物含有正常情况下在天然存在的HA多糖中未被发现的糖或衍生物。术语“修饰的大小分布”是指合成的透明质酸分子的大小分布在用天然酶的合成中未曾发现；经过操作的大小可以比正常的大小小得多或大得多。

各种不同大小的透明质酸产物可应用于药物输送领域，而且改变了结构的酶的产生可以与不同大小的透明质酸联合。如果能够大量产生大约含有20个单糖的透明质酸聚合物，那么在血管生成和创伤愈合中的应用有很大的潜力。小分子透明质酸寡糖的另一种特别应用是在医用重组人蛋白的稳定性方面。这类蛋白的主要问题是它们在血液中被清除以及较短的半衰期。现在对此问题的一种解决方法是结合一种小分子护罩以防止蛋白被快速地从循环系统中清除。非常小的分子量的透明质酸很适于此角色并且没有免疫原性并具有生物相容性。附着于药物或蛋白的较大分子量的透明质酸可以用于网状内皮组织细胞系统的定位，该系统具有透明质酸的内吞受体。

根据本发明，本领域的普通技术人员应当理解的是，有几种方式可对透明质酸合酶产生的透明质酸聚合物的大小分布进行控制以产生不同的大小。首先，产物大小的动力学控制可以通过降低温度、降低酶作用时间和降低一种或两种糖核苷酸底物的浓度来改变。降低任何一种或所有这些参数将得到较少数量的和较小的透明质酸产物。这种方法的不利之处在于产物的产量也会被降低而且很难在天与天之间或批与批之间获得重复性。

第二，改变酶固有的合成较大透明质酸的能力。可以通过重组DNA技术对蛋白进行操作，包括取代、缺失和添加特定的氨基酸(或者甚至通过代谢过程引入非氨基酸基团)，这种改变产生固有的慢反应酶，从而在动力学方法上可以获得更具重复性的对透明质酸大小的控制。最终的透明质酸的大小分布由该酶的某些基于序列上特定的氨基酸的特性确定。在链球菌的酶与其它真核的透明质酸合酶之间有20％的残基是绝对保守的，在这其中有一系列的特定位点上的氨基酸控制或极大影响着该酶所产生的透明质酸聚合物的大小。在这些残基上任何一处的特异改变都可以产生修饰的HAS，它产生的HA产物具有修饰的大小分布。对seHAS，spHAS，pmHAS，或cvHAS进行的改变，降低了该酶产生的透明质酸的固有的大小，这将可以提供强有力的方法用以产生比天然的酶所产生的更小的或者更大的透明质酸产物。

最后，较大分子量的透明质酸可以用特异的透明质酸酶降解产生较低分子量的透明质酸。但是此方法非常难以获得重复性，而且必须细致地重新纯化以去除透明质酸酶和不需要的消化产物。

如图4所示，可操作透明质酸合酶以产生不同大小的透明质酸聚合物，尤其是比正常的野生型酶更小的。该图显示了一系列spHAS酶的HA大小的分布(分子量标为百万道尔顿)，每一种通过定点诱变在天然的酶上获得单个氨基酸的变化。每个都有不同的半胱氨酸残基被丙氨酸所取代。五个空心符号标记的曲线代表下列spHAS蛋白：野生型，C124A，C261A，C366A，和C402A。实心圆代表的是表达较差的C225蛋白，它只有部分活性。

实心三角是C280A spHAS蛋白，发现它所合成的HA聚合物比正常的酶或给出的其他变异体要小。实验中的这种减小表明可以通过改变透明质酸合酶而使合成的HA产物大小在所需范围内。编码透明质酸合酶的seHAS，pmHAS，和cvHAS基因也可以通过定点诱变的操作来产生一个酶，使其合成的HA产物大小在所需范围内。

结构上修饰的透明质酸在概念上与通过在所需的HAS或者spHAS上改变特定的氨基酸来改变透明质酸产物的大小分布没有什么不同。UDP-GlcNAc的衍生物，其中N-乙酰基团缺失了UDP-GlcN或者被另一种化学有用的基团所替代，它可以用于特定的用途。强底物特异性要求必须依赖于20％的保守型氨基酸中特定的一些氨基酸。对这些残基的特定的改变产生的功能性酶，它比天然的酶对一种或几种底物的作用具有较低的特异性。这种变化了的酶将可以利用其他的天然的或特定的糖核苷酸将所需的糖衍生物掺入，从而获得不同的化学性质，它可用于：(i)使特定的药物、蛋白、或者毒素与结构上修饰的透明质酸共价结合，用于一般的或导向药物的输送、放射疗法等等。(ii)使透明质酸本身或者与其他支持物共价交联，形成凝胶或者其他具有较强的物理特性的三维生物材料，和(iii)使透明质酸与一个表面共价相连，产生一种具有生物相容性的薄膜或单层。

可以操作细菌来生产透明质酸。例如，我们制备了含有spHAS基因以及一种糖核苷酸前体的基因的枯草杆菌菌株。我们选择这种细菌是因为它经常被用于生物技术工业来生产人类使用的产品。应使用第一代原形细菌，因为第一代细菌比现有的利用野生型天然菌株产生更多量的透明质酸。我们在其中放入了多拷贝的基因。

例如，构建了三种枯草杆菌菌株，含有编码透明质酸合酶以及UDP-葡萄糖脱氢酶中的一种或者同时两种的化脓链球菌的基因，其结果如表II-B所示。根据敏感的商业化的放射性测量试验来检测并定量HA，确定出带有两个基因的菌株(3号菌株)产生并向培养基中分泌HA。父本菌株和只带有脱氢酶基因的菌株(1号菌株)不产生HA。2号菌株只含有spHAS基因，产生HA，但只有3号菌株产量的10％。琼脂糖凝胶电泳表明3号菌株分泌到培养基中的HA具有很高的分子量。

表II-B

菌株号	细胞	培养基(^*)	菌株所带基因	细胞密度(A₆₀₀)
菌株号	细胞	培养基(^*)	菌株所带基因	细胞密度(A₆₀₀)	(μgHA/ml培养物)
1	0	0	HasB	4.8	(μgHA/ml培养物)
1	0	0	HasB	4.8	2	4	35	SpHAS	3.9
3	＝＞10	＞250	SpHAS+hasB	3.2	2	4	35	SpHAS	3.9

(^*)大多数HA是在培养基中，但是有一些是细胞结合的；利用Pharmacia的HA Test 50试剂盒来确定HA。

这些实验利用通常与这些基因相连的链球菌启动子操纵蛋白的表达。我们构建了带有在B.subtilis启动子调控下的spHAS或seHAS阅读框的菌株，期望能够获得更好的效果。所用的载体为格兰氏阳性/大肠杆菌穿梭载体，它在B.subtilis中具有中等的拷贝数，并带有红霉素抗性基因(能够在枯草芽孢杆菌中具有8μg/ml的抗性或在大肠杆菌中具有75μg/ml的抗性)。所用的B.subtilis的宿主菌株是来自BGSC的1A1，它需要色氨酸，其它为野生型特征，并能够形成孢子。在添加有色氨酸、葡萄糖、微量元素和红霉素(8μg/ml)的Spizizens最低培养基中培养细胞并生产HA。在32℃剧烈摇荡培养直到培养基被耗尽(～36小时)。

这表明这些经过生物工程操作的细胞，原来通常不生产透明质酸，当它们被用spHAS基因转化后变得能够生产了。SeHAS也能够被引入到非透明质酸生产细菌中，产生出经过生物工程操作的能够生产透明质酸的细菌菌株。

本发明的一个优选的实施方案是包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的纯化的组合物。本文所用的术语“纯化的”是指一种HAS蛋白组合物中HAS蛋白或适当修饰的HAS蛋白(例如，含有[HIS]₆结尾)被纯化至相对其天然获取状态的任何纯度。例如，在该情况下，相对于它在原核细胞抽提物中的纯度。HAS蛋白可以从链球菌属，巴斯德氏菌属，绿藻病毒，病人样本，重组细胞，被感染的组织，在细胞外基质中含有高水平的透明质酸的分离的组织亚群等等本领域熟练技术人员所知的来源中分离。例如，重组的seHAS和spHAS蛋白构成了大肠杆菌10％的膜蛋白。经纯化的HAS蛋白组合物因而也指具有基于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的、从其天然环境分离的多肽(图5)。

对于seHAS的表达，从基因组DNA和cDNA都可以制备出表达系统，用于HAS蛋白的重组制备。对于在原核或真核系统中表达的DNA区段的操作，可以通过本领域熟练技术人员通常所知道的重组表达的技术来进行。

HAS可以在真核系统中成功地表达，但是，本发明人认为细菌表达系统可用来制备任何目的所需的HAS。据信，细菌表达从易于使用、生产消耗、和从中所获得的物质的量几方面来看，从根本上来说优于真核系统的表达。

链球菌透明质酸合酶(seHAS和spHAS)的纯化如表III和图6所示。纯化步骤各阶段的组份通过12.5％的凝胶上的SDS-PAGE来分析，凝胶用考马斯亮蓝染色。泳道：分子量标准；1，含有重组seHAS-H6的大肠杆菌的膜；2，去污剂溶解膜之后的不溶组分；3，去污剂溶解的组分；4，Ni-NTA树脂的穿过组分；5-9，5次对柱子的连续洗涤(每次2个柱体积)；10，洗脱的纯的HA合酶，它是一条单带。

表III

步骤	总蛋白(μg)	比活性(mmol/μg/hr)	总活性(nmol UDP-GlcA)	产量(％)	纯度(倍)
步骤	总蛋白(μg)	比活性(mmol/μg/hr)	总活性(nmol UDP-GlcA)	产量(％)	纯度(倍)	膜	3690	1.0	3649	100	1.0
抽提物	2128	2.2	4725	129	2.2	膜	3690	1.0	3649	100	1.0
抽提物	2128	2.2	4725	129	2.2	亲和柱	39	13	500	14	13.1

值得推荐的是，利用转化有编码HAS的DNA区段的宿主细胞便于获取HAS蛋白。另外还值得推荐的是，cDNA，基因组序列和两者相结合，很适于真核表达，因为宿主细胞将当然地加工基因组转录物以产生功能性的mRNA用来翻译出蛋白。

本发明的另一个实施方案是制备一种蛋白的方法，其中包括培养含有重组载体的宿主细胞，该载体编码一个包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者带有保守型或半保守型氨基酸变化的功能相似的氨基酸序列的蛋白。将该宿主细胞在允许核酸表达和蛋白产生并随后回收所产生的蛋白的条件下培养。HAS和最终的HA的生产，包括允许核酸表达和蛋白生产并随后回收所产生的蛋白的条件，对于本领域的熟练技术人员来说，根据本发明所公开的seHAS基因、和seHAS基因的产物HAS、以及本文所述的方法，将会知道。

优选的表达透明质酸的宿主是原核生物，如类马链球菌，和其他适当的链球菌属的成员。但是，已经知道的是，HA可以由表达重组HA合酶的异源宿主合成，如芽孢杆菌属，肠球菌属或者甚至埃希氏杆菌属的成员。最为优选的表达本发明的HA合酶的宿主是转化有本发明的HAS基因的细菌，如乳球菌的菌种，枯草杆菌或大肠杆菌。

类似地，据信，几乎任何真核表达系统都可以用于HAS的表达，例如基于杆状病毒的、基于谷氨酰胺合酶的、基于二氢叶酸还原酶的系统、基于SV40的、基于腺病毒的、基于细胞巨化病毒的、基于酵母的，等等，都可以使用。为了以这种方法表达，应当将编码序列置于启动子的附近并受其调控。本领域所理解的是，要将一个编码序列置于这样的启动子之下，该蛋白转录阅读框的转录起始位点的5’端的位置应位于所选启动子“下游”的大约1至50个核苷酸处。另外，啤酒糖酵母表达载体系统，如pYES2，在GAL启动子控制下也可产生HAS，如图7所示。图7显示出利用pYES2质粒在重组酵母中产生了spHAS酶。当提供UDP-GlcA和UDP-GlcNAc时，该酶产生出高分子量的HA。

在考虑真核表达时，通常还应在包括HAS基因或DNA的转录单位中加入一个适当的多聚腺苷化位点(例如，5’-AATAAA-3’)，如果它不包含在起初的克隆片段中的话。通常，polyA的加入位点位于该蛋白终止位点“下游”约30-2000个核苷酸处，在转录终止前的位置。

应当理解的是，实际上任何通常所用的宿主都可以照此用于HAS的表达。表达本发明的HAS cDNA的优选的细胞系的实例包括通常用于真核表达的细胞系，如239，AtT-20，HepG2，VERO，HeLa，CHO，WI38，BHK，COS-7，RIN和MDCK细胞系。通常应包括的步骤有提供带有编码HAS酶的重组DNA区段并能表达该酶的重组宿主；于培养基中在能使克隆的HAS基因或cDNA转录并适于透明质酸生产的条件下培养该重组宿主；以及从重组宿主中分离和纯化HAS酶或分泌的透明质酸。

通常，适于表达克隆的HAS基因或cDNA的条件取决于所使用的启动子、载体、和宿主系统。例如，在使用lac启动子时，应需要通过会刺激lac转录的物质，如异丙基硫代半乳糖苷，的诱导来诱导转录。例如，本发明的克隆的seHAS基因以含有HIS₆的蛋白在大肠杆菌中表达，如图5所示。当使用其他的启动子时，需要不同的物质来诱导或上调转录。

图5描述了在大肠杆菌中重组seHAS和spHAS的过表达。将膜蛋白(每道5mg)通过10％的凝胶的SDS-PAGE在还原条件下组分分离。将胶用考马斯亮蓝R-250染色、照相、扫描并通过分子动态密度测量仪(PDSI P60型)定量。HA合酶的位置如箭头所指。泳道A为天然的spHAS(A组)；泳道C为为天然的seHAS；泳道E为重组seHAS；泳道P为重组spHAS；泳道V为单独的载体。所用的标准为Bio-rad低分子量标准并标出了kDa值。

除了获得该合酶的表达，优选地还应当需要提供一个有利于HA合成的环境，包括适当的编码糖核苷酸前体生物合成所需酶的基因，或者利用含有提供前体的酶所需的底物的培养基，如N-乙酰葡糖胺或葡糖胺(GlcNAc或GlcNH₂)和葡萄糖。

进一步希望的是将基因掺入透明质酸酶缺损的宿主，从而酶合成的产物不会在培养基中被降解。而且，应当选择HA生产优化的宿主。例如，适当的宿主应当是可以产生大量的糖核苷酸前体以供应HAS酶并使之产生大量的HA。这种宿主可以在自然界中寻找或者通过各种技术包括诱变或重组DNA技术来制造。糖核苷酸合成酶的基因，尤其是生产UDP-GlcA所需的UDP-Glc脱氢酶，也可以与HAS基因或cDNA一起加入到载体中。本发明优选的实施方案为含有这些辅助性的重组基因或cDNA的宿主并在其中扩增这些基因产物从而增加HA的生产。

培养宿主细胞所用的方法并不认为是至关重要的。详细资料可参考美国专利4,517,295；4,801,539；4784,990；或4,780,414；各文献在此提及可供参考。在使用原核宿主时，如类马链球菌，应需要在无氧条件下在CO₂富集的肉汤培养基中进行细菌发酵。这样可以比在有氧条件下获得更多的HA产物。另一个需要考虑的是厌氧培养的链球菌细胞不会产生热原性外毒素。适当的培养条件可以根据本发明为其他原核宿主进行调整，正如本领域熟练技术人员所知道的。

构建了合适的宿主，并在适于HA生产的条件下培养之后，需要分离所生产的HA。通常，HA应由重组生物分泌或以其它方式释放到周围的培养基中，因而易于从培养基中通过所熟知的方法分离HA。例如，HA可以通过过滤从细胞h碎片中被分离出，并可以结合用醇如乙醇沉淀从培养基中分离。其他的沉淀试剂包括有机溶剂如丙酮或有机季铵盐如十六基吡啶氯化物(CPC)。

优选的分离HA的技术在美国专利4,517,295中有所描述，在此提及可供参考，在发酵末期在细菌悬浮液中加入有机羧酸，三氯乙酸。三氯乙酸导致细菌凝块并死亡，利于将细胞和相关的碎片与所需产物HA分离开。将澄清的上清浓缩并透析以去除低分子量杂质包括该有机酸。随后通过含有0.22μm孔径大小的滤膜的过滤盒进行过滤。继续透滤直到溶液的电导降至大约0.5兆欧。

加入过量乙醇试剂或其他有机溶剂沉淀浓缩的HA，用乙醇洗HA沉淀并真空冻干除去乙醇。HA可用pH8的硼酸盐缓冲液重悬，再用CPC或其他有机铵盐例如一种混合三甲基铵溴化物溶液CETAB在4℃沉淀。沉淀的HA经上文专利中详细叙述的粗滤，1MNaCl重悬，完全过滤和浓缩等步可回收。根据所需的最终用途，最终形成的HA过滤除菌后可制成一种合适的盐，干粉或无菌溶液。

A.可应用的典型的基因工程方法

以无难通透的胞膜屏障的细胞为受体细胞，可以通过为本领域技术人员熟知的磷酸钙共沉淀法进行转染。然而，其它方法也可用于介导DNA进入细胞，例如核注射，阳离子脂类，电穿孔，原生质体融合或Biolistic(tm)。生物颗粒转运系统是DuPont(1989)开发的。选用DuPont系统的优点是转化效率高。如果是原核细胞或其它有坚固的细胞壁结构的细胞，优选的转染方法是用氯化钙进行钙离子处理以产生感受态或电穿孔法。

应用标准的连接技术构建含有目的编码和调控序列的适当载体。分离的质粒或DNA区段经切割，目的性修饰后，以既定的方式再连接以构建所需的质粒。在合适的缓冲体系中用一种或多种限制性内切酶进行切割。一般来说，在20ul缓冲体系中，1ug质粒或DNA片段约用1单位的酶。对于特定的限制性内切酶适当的缓冲液和底物量制造商有详细说明。37℃温育一小时有效。

温育完毕酚氯仿抽提去除蛋白，水中的核酸组份通过乙醇沉淀回收。如需要平端，用十个单位的聚合酶I(Klenow)于15℃处理15分钟，再酚氯仿抽提，乙醇沉淀。末端经适当修饰可提供正确配对的等摩尔量目的组份的连接反应中，每0.5克DNA加10个单位的T4DNA连接酶。当经切割的载体是连接组份时，用细菌的碱性磷酸酶预处理以防止载体自连可能是有用的。

要分析鉴定构建质粒的功能序列时，第一步是通过30-32℃的转化反应将质粒DNA克隆到特定的SURE大肠杆菌感受态细胞(Stratagene)中进行扩增。第二步用重组质粒转化大肠杆菌K5株Bi8337-41，这样可以产生UDP-GlcA前体并可用适当的抗生素抗性筛选成功的转化子。从转化子文库提取的质粒然后用于筛选可表达HA的细菌克隆。挑取这些克隆，扩增后纯化质粒进行限制性酶切图谱分析。再用本领域一般技术人员共知的一些序列分析技术进一步分析含有功能性HAS基因的质粒的特征。

B.来源和宿主细胞培养及载体

总的来讲，在本发明中原核细胞用于有用的载体构建和DNA序列的初始克隆中。据信革兰氏阳性细菌尤其是来自C组链球菌株的细菌是适当的宿主细胞来源。如葡萄球菌和链球菌一样有单层细胞膜和厚的细胞壁的细菌是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌如大肠杆菌有两层不连续的细胞膜，而非由一层膜包裹细胞。革兰氏阴性细菌有较薄的细胞壁。革兰氏阳性细菌的单层膜与革兰氏阴性菌的内层质膜。优选的宿主细胞是突变为透明质酸酶缺陷或抑制的链球菌株(EP144019，EP266578，EP244757)。特别有用的链球菌株包括类马链球菌和兽疫链球菌。

原核细胞亦可用于表达。为获得更能适于高分子量HA合成的HA合酶，可优选链球菌种，如类马链球菌或兽疫链球菌。上述菌株及大肠杆菌W3110(F-，lambda-，原养型的，ATCC No.273325)，芽孢杆菌如枯草杆菌，或其它肠杆菌科如粘质沙雷氏菌，都可用于产生一种含“超级”HAS的宿主。

一般来讲，含有复制起点和与宿主细胞相容的调控序列的质粒载体可与这些宿主一起使用。载体一般带有复制起点和能给转化细胞提供表型筛选标记的序列。例如典型的pBR322转化大肠杆菌，该质粒来自大肠杆菌菌种。pBR322含有氨苄和四环素抗性基因便于鉴别转化的细胞。pBR质粒或pUC质粒，或其它微生物的质粒或噬菌体必须含有或经修饰后含有可用于表达该微生物自身蛋白的启动子。

通常用于重组DNA构建的启动子包括lacZ启动子，tac启动子，T7噬菌体启动子，色氨酸启动子系统。这些是最常用的启动子，其它微生物的启动子也已被发现和应用，有关其核酸序列的详细资料已出版，熟练的技术人员能够将它们与质粒载体进行有功能的连接。本发明也可应用整合载体。

除原核细胞外，也可选用真核微生物如酵母培养物。尽管一些其它菌株通常也可获得，但酿酒酵母，或普通面包酵母是真核微生物中最常使用的。如质粒YRp7常用在酿酒酵母中表达。这种质粒已含有trp1基因，该基因为无色氨酸不能生长的突变酵母菌株如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了筛选标记。有trp1缺失特性的酵母宿主细胞基因组为检测无色氨酸生长转化提供了有效的环境。酵母载体中合适的启动序列包括半乳糖利用基因的启动子，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸歧化酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。

构建合适的表达质粒时，与这些基因相关的终止序列也连于表达载体上待表达序列的3’端，以提供mRNA多腺苷酸化位点和终止位点。具有由生长条件调控转录的优点的另一些启动子是醇脱氢酶2，细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶，和上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，及负责麦芽糖和葡萄糖代谢的酶。任何含有酵母相容启动子，复制起点和终止序列的质粒载体都适用。

除微生物外，培养的源自多细胞生物的细胞也可以用作宿主。原则上，无论是来自脊椎动物或无脊椎动物的培养细胞都可用。然而脊椎动物细胞引起了更大的兴趣，而且近年来脊椎动物细胞的繁殖培养形成了固定的程序。有用的宿主细胞系包括VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，和WI38，BHK，COS及MDCK细胞系。

用于哺乳动物细胞的表达载体的调控功能通常来自病毒。例如，通常使用的启动子来自多形瘤，腺病毒2，牛乳突状瘤病毒，和最常使用的猿猴空泡病毒(SV40)。SV40病毒的早期启动子和晚期启动子尤其常用，因为它们易于从病毒中获得，且该片段中还含有SV40病毒的复制起点。也可用含有从病毒复制起点内的HindIII位点到BglI位点约250bp的序列的稍大或稍小的SV40片段。

此外，可行且通常更愿意使用的是与目的基因序列正常相关并与宿主细胞系统相容的启动子或调控序列。含外源基因起点的载体构建，例如可能是SV40或其它病毒(如，多形瘤，腺病毒，BPV)来源或宿主细胞染色体复制机制都可提供一个复制起点。如果载体整合到宿主细胞染色体，后者的机制通常是足够的。

C.从有大量荚膜包裹的C组类马链球菌株中分离可信的HA合酶基因

编码的长417个氨基酸名为seHAS的蛋白(计算的分子量为47，778，等电点9.1)，是HAS家族中至今所鉴定的最小成员(图2)。seHAS在SDS-PAGE中迁移率异常快(Mrp-42kDa)(图5，8)。

图8代表重组seHAS与特异抗体反应的Western Blot分析结果。含有重组seHAS(E；泳道2，7，9)或spHAS(P；泳道3，6，8和10)的C组(C；泳道1)或A组(A；泳道4)链球菌胞膜和大肠杆菌胞膜(9mg/道)通过还原性SDS-PAGE离散，电转于硝酸纤维素膜上。按应用程序用纯化的IgG组分探测并显色硝酸纤维素膜条带，所述IgG组分针对spHAS的下列区域产生：中心结构域肽E¹⁴⁷-T¹⁶¹(1-4道)；C端肽(5-6道)；完整蛋白(7，8道)；重组中心结构域(9，10道)。非免疫IgG或仅用载体转化的细胞的膜如5道中所示无显色。

seHAS和spHAS蛋白(曾在U.S.申请08/899,940中被鉴定)有72％的编码序列相同。推导的seHAS蛋白序列通过与一种合成肽抗体反应得到确证(图8)。在大肠杆菌中表达的重组seHAS作为一种主要的膜蛋白得到回收(图5)，其在体外在UDP-GlcNAc和UDP-GlcA存在的条件下合成的HA分子量很大(图9)。

图9显示的是seHAS和spHAS产生的HA的大小分布动力学分析。根据应用程序将含有等量seHAS或spHAS蛋白的大肠杆菌胞膜与1.35mM UDP-[¹⁴C]GlcA(1.3×10³dpm/nmol)和3.0mM UDP-GlcNAc于37℃温育。这些底物的浓度是相应Km阈值的15倍以上。将分别于0.5，1.0和60分钟取的样品进行SDS处理后，在SephacrylS400 HR柱上进行层析。将在该柱的分级分离范围(组分12-24)内的HA曲线图校正到每一组分中HA总量的百分数。图顶箭头上方的值是HA的分子量(以一百万为单位)，该值是用Dawn多角激光散射仪(Wyatt技术公司)独立试验测得的。0.5分钟(○，●)，1.0分钟(□，■)和60分钟(_，▲)取样的seHAS(●，■，▲)和spHAS(○，□，_)合成的HA大小分布如图所示。分析说明seHAS和spHAS在它们合成的HA链的大小分布上基本相同(图9)。SeHAS生成HA的能力是spHAS的两倍。

C.1细菌菌株和载体

粘液样C组菌株D181(类马链球菌)来自洛克菲勒大学收藏。大肠杆菌宿主菌株Sure和XL1-Blue MRF′来自Stratagene，菌株Top10F′来自Invitrogen。除非特别说明，链球菌培养于THY，大肠杆菌菌株培养于LB培养基中。pKK223表达载体来自Pharmacia，PCR2.1克隆载体来自Invitrogen，预消化的λZap Express TM BamHI/CIAP载体来自Stratagene。

C.2重组DNA和克隆

用Sau3A1部分消化通过Caparon和Scott法(为本领一般技术人员所熟知)分离的高分子量类马链球菌基因组DNA，形成平均大小为2-12kb的片段。乙醇沉淀消化的DNA，洗后连接于BamHI/CIAPλZap表达质粒。用购自Promega的Packagene^TM抽提物将连接的DNA包裹到噬菌体中。用XL1-Blue MRF′大肠杆菌作宿主检测包装噬菌体文库的滴度。

C.3简并PCR扩增

简并寡核苷酸序列根据spHAS(化脓链球菌)，DGr2(Xenopus laevisHAS；19)和nodC(草木犀根瘤菌成节瘤因子；20)的保守序列设计，用于以D181基因组DNA为模板的PCR扩增。扩增条件是94℃1分钟，44℃1分钟，72℃1.5分钟进行34个循环，最后于72℃延伸10分钟。寡核苷酸HADRF1，5’-GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCTATH GAY TTR GG-3’(sEQ ID NO：20；有义链)与序列D²⁵⁹RCLTNYAIDL(SEQ ID NO：9；spHAS)相应。寡核苷酸HACTR1，5’-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3’(SEQ ID NO：21；反义链)与区域C⁴⁰⁴TIKNTEWGTR(SEQ ID NO：10；spHAS)相应。某些位置碱基的简并性由IUPAC采用的命名法用表IV中简并性碱基的密码子代表。

表IVIUPAC密码子-简并性碱基国际理论应用化学联合会建立了一套标准的简并性碱基的单字母命名法。如下：B＝C+G+TD＝A+G+TH＝A+C+TK＝T+GM＝A+CN＝A+C+G+TR＝A+GS＝G+CW＝A+TV＝A+C+GX＝次要碱 (别处说明)Y＝C+T

这两种寡核苷酸产生一条459bp的PCR产物，用琼脂糖凝胶分离并用BIO-101 Geneclean试剂盒纯化该产物。根据厂商说明以TOP10 F′为宿主细胞，将该片段克隆到PCR2.1载体上。用QIAfilter PlasmidMidi试剂盒从大肠杆菌(Top 10 F′)中纯化双链质粒DNA。另外还合成了两条简并性有义引物：HAVAF1，5′-GTN GCT GCT GTW RTXCCW WSX TWT AAY GAR GA-3′(SEQ ID NO：22，与spHAS的V^66-AAVIPSYNE(SEQ ID NO：11)区域相关)和HAVDF1，5′-GTX RWT GAYGGN WSX WSN RAX GAX GC-3′(SEQ ID NO：23，根据spHAS的V¹⁰⁰DDGSSNTD(SEQ ID NO：12))。两个独特的反义引物是根据459bp的PCR产物合成的。它们是：D181.2，5′-GAA GGA CTT GTT CCA GCGGT-3′(SEQ ID NO：13)和D181.4，5′-TGA ATG TTC CGA CAC AGGGC-3′(SEQ ID NO：14)。用任一简并有义引物和D181.2或D181.4扩增D181基因组DNA都可得到预期大小的PCR产物。用与上文相同的策略克隆并测序四个PCR产物。比较来自六个不同克隆的PCR产物中的每一个序列以找出其保守序列。这样我们获得了一条与spHAS高度同源，长1042bp，有连续ORF的序列。

C.4文库筛选

用两个分子探针筛选文库；所述探针为克隆的459bp PCR产物和寡核苷酸D181.5(5′-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3′(SEQID NO：15)；来自1042bp序列)。根据厂商说明用Prime-It 11随机引物标记试剂盒标记459bp的PCR产物。用[γ³²P]ATP，Kinace-It Kinasing试剂盒标记寡核苷酸。通过NucTrap Push柱(Stratagene)分离标记的产物和未标记的产物。寡探针与Southern印记上的D181基因组消化物特异性杂交。筛选λ噬菌体文库时，XLBLUE MRF′作为吸附有噬菌体的硝酸纤维素膜上的宿主(3000个噬菌斑/板)，在60℃预杂交后，根据说明在QuikHyb杂交溶液中与5′-末端标记的寡核苷酸D181.5在80℃杂交。

室温下用2xSSC缓冲液和0.1％(w/v)SDS洗膜15分钟，60℃用0.1xSSC缓冲液和0.1％SDS(w/v)洗30分钟，烘干后于-70℃用Bio-Max Ms胶卷曝光过夜。阳性噬菌斑重新铺板再筛选两次。将纯阳性噬菌斑保存于含氯仿的SM缓冲液中。用载体引物PCR这些噬菌斑可发现3种不同的插入大小。

用重组载体引物和来自1042bp序列不同区域的引物PCR发现三种不同的噬菌体中只有一种有完整的HAS基因。这种噬菌体的插入片段有6.5kb。当试图通过从挑选的噬菌体文库克隆中自动切除的方法将插入片段亚克隆到质粒的形式中时失败了。因此又用PCR策略从纯阳性噬菌体DNA中扩增得到5′和3′ORF末端。寡核苷酸引物D181.3(5′-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3′(SEQ ID NO：16))和T3(载体引物)扩增出一条3kb的产物，而寡核苷酸D181.5和T7(载体引物)扩出一条2.5kb的产物。测序上述两个产物得到该ORF的5′和3′末端序列。分析所有PCR产物序列，我们重新构建了1254bp seHAS基因的ORF。

C.5 seHAS的表达克隆

设计的引物在seHAS的起始和终止密码子区域，有义寡核苷酸(5′-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3′(SEQ IDNO：17))包含一个EcoRI限制性位点，反义寡核苷酸(5′-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3′(SEQ ID NO：18))包含一个Pst1位点。从D181基因组DNA和纯杂交阳性噬菌体用这些引物扩增出一条1.2kb的PCR产物。此1.2kb的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，Pst1和EcoR1消化后，直接克隆到Pst1和EcoR1消化的pKK223载体。用连好的载体转化生长于30℃的大肠杆菌SURE细胞。由于其它宿主细胞或较高的温度会导致克隆的插入片段丢失，所以这一步尤其重要。分离菌落并纯化其DNA。六个菌落中(名为a，b，c，d，e，f)五个有正确大小的插入，一个没有。

C.6 HA合酶的活性

用从上述五个克隆制备的膜分析HA合酶的活性。以3000g收集新鲜的对数生长期的细胞，PBS 4℃洗后用为本领域一般技术人员熟知的改良原生质法分离胞膜。从化脓链球菌和类马链球菌中制备的胞膜是用一种不同的改良原生质法获得的。将膜于含20mM MgCl₂，1mM DTE，120uM UDP-GlcA和300uM UDP-GlcNAc的50mM磷酸钠和磷酸钾，pH7.0中，37℃温育。用UDP-[¹⁴C]GlcA(318mCi/mmol；ICN)和/或UDP-[³H]GlcNAc(29.2Ci/mmol NEN)检测糖的掺入。加入终浓度为2％的SDS终止反应。用下行纸层析法分离前体分子形成的HA产物，并通过测定开始掺入的放射活性来检测。

C.7凝胶过滤分析

用Sephacryl S500 HR(Pharmacia生物技术公司)柱(0.9×40cm)层析分析由含重组seHAS或spHAS的膜在体外生成的放射标记的HA.。样品(0.4ml于200mM NaCl，5mM Tris-HCl，pH8.0，加5％SDS中)用pH8.0的200mM NaCl，5mMTris-HCl溶解，取0.5ml组分测定¹⁴C和/或³H的放射活性。用链霉菌Streptomyces hyalurolyticus的HA特异性透明质酸裂解酶(EC4.2.2.1)于37℃处理另份同样的样品3小时以评价HA多糖的真实性。然后凝胶过滤消化物。

C.8 SDS-PAGE和Western印迹

根据Laemmli法进行SDS-PAGE。用Bio-Rad mini Transblot装置在加有20％甲醇的标准印迹缓冲液中电转到硝酸纤维素膜上。在TBS缓冲液中用2％BSA封闭膜。用蛋白A/G碱性磷酸酶缀合物(Pierce)和p-氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸p-甲苯胺盐显色。

C.9 DNA测序和分析

用荧光标记的载体引物测序质粒的两条链。测序反应在荧光标记引物(有7-deazaG)用的试剂盒中进行。在Pharmacia ALF表达DNA测序仪中电泳样品，用ALF管理软件v3.02分析数据。根据内部引物用ABI Prism 377(软件版本2.1.1)测序插入片段的内部区域。不确定的区域用Sequenase^TM 7-deaza-DNA聚合酶，7-deaza GTP mastermix(USB)和[α-³⁵S]dATP(Amersham生命科学)手工测序。获得的序列用DNASIS v2.1(Hitachi软件工程公司，有限公司)编辑分析。核苷酸和氨基酸序列与Genbank和其它数据库进行了比较。

C.10鉴定seHAS

根据spHAS，DG42(现已知是一种发育调节的HAS，命名为x1HAS)和Nodc(一种根瘤菌β-GlcNAc转移酶)的几个高度同源区合成的引物用PCR的方法完成seHAS的鉴定。x1HAS和NodC蛋白分别与spHAS有约50％和约10％的相同性。由此策略产生的459bp PCR产物与spHAS有66.4％相同，这说明A组(spHAS)HA合酶基因的一种C组同系物已被检测出来。再用相同的PCR策略重新构建该基因完整的编码区。最后一套PCR引物用于从基因组DNA中扩增完整的ORF。将此1.2kb的PCR片段连到表达载体pKK223上并转化到大肠杆菌SURE细胞后，从5个被检测的菌落中分离出的胞膜中都显示有HA合成活性。

重构建的基因的ORF编码一种预计为417个氨基酸的新蛋白，它不存在于数据库中且比spHAS少两个氨基酸。这两种细菌蛋白有72％的相同性，核酸序列有70％的相同性。预测seHAS蛋白分子量是47,778，等电点是pH9.1。最近鉴定的三个哺乳动物HASs(muHAS1，muHAS2，muHAS3，图2)与该细菌蛋白相似。两组的总体相同性为约28-31％，而且seHAS的许多氨基酸与真核HASs(如K/R或D/E取代)高度保守。A98R是PBCY-1HAS，与哺乳动物的HASs有28-33％的相同性，预测其在脂膜中有相似的拓扑结构。在哺乳类中相同的家族成员几乎完全相同(如muHAS1和huHAS1有95％相同；muHAS和huHAS2有98％相同)。然而如图3所示即使是在同物种中不同的HAS家族成员也有较大的离异度(如muHAS1和muHAS2有53％相同；muHAS1和muHAS3有57％相同；muHAS2和muHAS3有71％相同)。

图10显示了seHAS亲水性图和预测的膜拓扑结构。C组链球菌HAS的亲水性图是根据Kyte和Doolittle法(J.Mol.Biol.157，105，1982)用DNAsis制作的。预测该蛋白是整合膜蛋白。

图11显示了膜中seHAS拓扑结构构成的模型。预测的蛋白拓扑结构符合电荷在内原则，将大的中心结构域包在内部。这个结构域可能含有酶的大部分底物结合位点和催化功能区。seHAS的在所有的HAS家族成员中是保守的Cys²²⁶和其它三个半胱氨酸出现在中心结构域。Cys²⁸¹很关键，它的改变会极大的改变该酶合成的HA产物的大小分布。

预测的seHAS总的膜拓扑结构与spHAS及迄今所报道的真核HASs相似。该蛋白在氨基末端有两个推测的跨膜区，在羧基端有2-3个膜相关或跨膜结构域。两个链球菌酶的亲水图基本相同，同时也说明在预测seHAS K³¹³-R⁴⁰⁶(spHAS的K³¹³-K⁴⁰⁵)约90个残基的极度亲水性区域的拓扑结构方面的困难性。

seHAS在大肠杆菌细胞中得到有效表达。通过SDS-PAGE凝胶染色估算大约总膜蛋白的10％是seHAS(图5)。在仅有载体的对照泳道中无明显的42KD seHAS条带。膜蛋白这种不同寻常的高水平表达在用相同的载体于SURE细胞中表达spHAS时也体现出来。在大肠杆菌SURE细胞中，约8％的膜蛋白是spHAS。相反的，C组膜中的seHAS的表达量不到总膜蛋白的1％。A组膜中的spHAS几乎检测不到。由于大肠杆菌SURE细胞缺少合成HA所需的底物UDP-GlcA，在该细胞中重组seHAS不合成HA。当提供有底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA时，含有重组seHAS蛋白的膜可以合成HA(图12)。

图12说明重组seHAS合成HA的真实性。取含重组seHAS或空载体的大肠杆菌的细胞膜(69ug)与终体积200ul的700uM UDP-[³H]GlcNAc(2.78×.10³dpm/nmol；□，■)和300uM UDP-[¹⁴C]GlcA(3.83×10³dpm/nmol；○，●)在37℃温育一小时。加入终浓度25mM的EDTA终止酶反应。在37℃用链霉菌透明质酸酶处理一半的反应混合物3小时。在透明质酸酶处理的(○，□)和未处理的(●，■)的样品中加入SDS(2％，w/v)并于90℃加热一分钟。样品用500ul柱缓冲液(5mM Tris，0.2mM NaCl，pH8.0)溶解，离心澄清，将200ul注入Sephacryl S-500 HR柱中。收集过柱组份(1ml)，测放射活性。BD是峰洗脱溶液位置，即蓝色右旋糖的位置(约2×10⁶DA；Pharmacia)。V_○代表柱空隙体积，Vi代表填料微孔体积。掺入柱中分级分离的HA总量的[¹⁴C]GlcA∶[³H]GlcNAc的比率是1.4，此值与两底物比活性的比率相同。因此，结合到真实HA产物中的糖的摩尔比正如预测值是1∶1。空载体转化的细胞的膜不能合成HA。

加入120uM UDP-GlcA和300uM UDP-GlcNAc，HA的合成在至少一小时内与膜蛋白(≤0.微克)呈线性关系。同样的，用非转化细胞或空质粒转化的细胞制备的膜不能检测到HAS活性。如果Mg⁺²被EDTA螯和(＜对照的5％)或缺失任一种底物(对照的约2％)，HA不能合成。重组seHAS也显示出预期的糖核苷酸底物特异性，在任何一种底物存在条件下不能聚合UDP-GalA，UDP-Glc或UDP-GalNAc的任何一个(表II)。

根据凝胶过滤分析，分离的膜中的seHAS合成的HA平均分子量是5-10×10⁶Da。根据与糖的等摩尔结合和其对特异的链霉菌透明质酸酶的降解敏感性，判断重组seHAS的产物确是HA(图12)。尽管总HA合成的条件并不优化(既约90％的一种底物结合到产物上)，但此酶产生的HA链长有较宽的分布。峰组分与含有约36,000个单糖的7.5×10⁶Da的HA分子量相关。由柱分辨的HA大小分布范围是2-20×10⁶Da。

推导的seHAS蛋白序列被能与C组蛋白交叉反应的spHAS蛋白抗体确证(图8)。整个spHAS蛋白或spHAS的中心结构域的多克隆抗体也可与seHAS蛋白反应。spHAS C端的抗肽抗体不能与seHAS蛋白的稍有变异的区域交叉反应。然而，抗spHAS序列E¹⁴⁷-T¹⁶¹的抗肽抗体可识别seHAS中相同的预测序列。抗肽抗体同样可与链球菌膜中的天然seHAS和spHAS反应，并确证了来自同物种的天然和重组酶大小相同。与spHAS蛋白相同，seHAS在SDS-PAGE迁移的异常快。尽管计算出的分子量是47，778Da，SDS-PAGE推出的Mr一直为约42kDa。

由于预测的两种细菌的酶的中心结构域区域的序列相同及总体结构相同，抗E¹⁴⁷-T¹⁶¹区域的肽的特异性抗体可用于校正从两种不同酶基因转化的细胞制备的膜中的HAS蛋白表达。用这种方法可以比较含有基本相同量的重组spHAS或seHAS的膜各自的HA起始合成速率及HA产物的大小分布。

如spHAS所示，seHAS合成HA链是逐步的。直到HA形成最终产物释放来，酶似乎一直与延伸的HA链相联系。因此，在HA链合成的第一轮过程中，通过检测初始形成的HA链的大小分布，可以比较seHAS和spHAS的HA延伸速率。根据不同时间HA大小的凝胶过滤分析，我们估算seHAS的平均延伸速率约是37℃ 9000个单糖/分钟(图9)。5分钟内，此酶能聚合一条5-10×10⁶Da的HA链。在60分钟的温育过程中，每个酶分子都具有依次起始，完成，释放5-8个如此大的HA分子的潜能。在反映第一个HA链的延伸的早期(例如，≤1分钟)，seHAS生成的HA的大小分布与spHAS相比偏向较大的HA。60分钟时两个HA大小的分布无明显差异。

克隆的seHAS代表了正确的C组HA合酶。因此以前报道的或揭示的“C组”蛋白并非真正的C组HAS。seHAS蛋白与现在已知的九种来自细菌，脊椎动物和病毒的HA合酶同源，这些组成了快速增加的HA合酶家族。这种同源性在图2中特别说明。在哺乳动物中三个命名为HAS1，HAS2，HAS3的基因已被鉴定，在人和鼠中被绘图于三个不同的染色体上。在两栖类中迄今唯一被鉴定的HAS蛋白是发育调控的DG42，它于1988年被克隆，并在最近通过酵母膜中重组蛋白的分析显示出编码HA合酶的活性。可能其它X.laevusHAS基因会很快鉴定出来。

一种变异进化模型表明一种远古的细菌HAS前体可能在脊椎底物发育时期被强占或如果远古的细菌被包在原始的HAS中，逐渐形成了细菌产生HA荚膜的致病机理。细菌和真核的HAS酶有同一的进化方向形成同样结构的结果似乎是不可能的，但却发生了。

哺乳动物三种HAS同工酶还未通过各自的HA产物大小进行酶的定性。至少十种已鉴定的HAS蛋白预测是有相似拓扑结构的膜蛋白。HA在质膜中合成，然后HA或进入培养基或与细胞保持联系形成细菌荚膜或是真核细胞细胞衣。细胞质中的糖核苷酸底物用于合成HA伸出到膜外空间的链。

HA蛋白极端疏水的羧基部分的蛋白拓扑结构在说明这些酶如何延伸HA链的同时使链伸出膜外时似乎很关键。例如，极大的酶活力可能需要特别的和复杂的蛋白与脂双层的相互作用。碱性磷酸酶融合蛋白的初步分析结果说明氨基和羧基末端及大的中心结构域均在胞内，如图10和11。seHAS蛋白也有一个包含两个底物结合位点和两个HA合成所需的糖基转移酶活力的大中心结构域(总蛋白的约63％)。尽管现行软件程序不能可信的预测C末端疏水区的膜相关结构域的本质或数量。推测的拓扑结构符合现在的证据，并可应用于真核生物的酶，由于该酶C端多两个推测的跨膜结构域，故约大40％。

spHAS的四个Cys残基与seHAS同样保守。仅Cys225在所有HAS家族成员的两种酶中都是保守的。由于巯基反应试剂如p-mercurobenzoate或NEM可极大程度地抑制酶活，因此这个保守的Cys对酶活很必要或重要。然而，定点突变研究的初步结果表明spHAS的C225S突变仍有5-10％的野生型活力。

用特异的寡核苷酸测得的仅编码seHAS，spHAS或编码seHAS和spHAS的核酸序列如图13所示。三对有义-反义寡核苷酸是根据IDSEQ NO.1的序列和spHAS编码序列设计的。seHAS的核酸区段(se1-se2和sesp1-sesp2)如图14所示。这三对寡核苷酸在典型PCR反应中与C组链球菌(seHAS)基因组(2，4，6泳道)或A组(spHAS)基因组(3，5，7泳道)DNA杂交。用Taq DNA聚合酶(来自Promega)进行25个循环的PCR：94℃ 1分钟使DNA变性，48℃(较小的普通sesp引物42℃进行)杂交1分钟，72℃DNA合成一分钟。再通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR反应混合物。

se1-se2引物对是特别为C组HAS(seHAS)设计的。sp1-sp2引物对是特别为A组HAS(spHAS)设计的。sesp1-sesp2引物对是为杂交A组和C组核酸序列设计的。三对引物如预期的表现出交叉杂交的活力，有利于产生特异的或单一的PCR产物。

特异性PCR或杂交的寡核苷酸如图14所示。合成的SEQ IDNOS：3，4，5，6寡核苷酸出现在SEQ ID NO.1的相关区域。#1表示有义方向的引物，而#2表示反义方向的引物。四个寡核苷酸中任一个都可与seHAS序列特异杂交，适当的有义/反义引物对都适用于聚和酶链反应，如图13所示。

酵母膜中表达的重组HAS所合成的透明质酸的凝胶过滤分析如图7所示。将编码与spHAS(将原来的Val密码子换为Met)相关的，长419个氨基酸残基的开放阅读框架的DNA区段亚克隆到酵母表达载体pYES2(来自Invitrogen)形成pYES/HA。用玻璃珠搅动法制备含此结构的细胞的膜。来自pYES/HA结构的样品含有充分的HA合酶活性，用特异抗体通过Western分析检测“42kDa″HAS蛋白；空质粒转化的细胞的膜既无活性也无免疫反应的条带(无图例)。膜(315ug蛋白)先与无载体UDP-[¹⁴C]GlcA(1uCi¹⁴C)和溶于pH7 50mM Tfis的900uM未标记的UDP-GlcNAc，20mM MgCl^- ₂，1mMDTT及0.05MNaCl(450ul的反应体积)30℃温育1.5分钟。脉冲标记后加入终浓度900uM的未标记的UDP-GlcA。“追踪”后分别于脉冲1.5分钟(黑圈)，15分钟(黑正方形)，45分钟(黑三角形)时取样。加入终浓度2％的SDS并于95℃ 1分钟终止反应。离心(10,000xg)澄清样品后再注入一半的样品于0.2M NaCl，pH8的5mMTris平衡的Sephacryl S-500HR凝胶过滤柱(Pharmacia；1x50)。

以0.5ml/分的速度洗脱柱子，加入BioSafeII cocktail(4.5ml，Research Products Intl.)用液闪计数法定量每组分(1ml)的放射性。洗脱体积中的柱空隙体积和总填料微孔体积各为14ml和35.5ml。蓝色右旋糖的峰洗脱体积在25-27ml之间。真核酵母细胞表达的重组HAS在体外产生高分子量的透明质酸。

因此很显然，依照本发明提供的含有酶学活性的HAS的编码区的核酸区段，由seHAS基因产生透明质酸的方法及seHAS基因编码的HAS所产生的透明质酸的用途，会充分满足多种目标，实现上文所述的优点。尽管本发明结合了实施方案来描述，但是显然对本领域的熟练技术人员而言，选择，修饰和改变是显而可行的。因而，在下文权利要求的本质与广泛的范围之内涵盖了所有这些选择、修饰和改变。

ATGAGAACATTAAAAAACCTCATAACTGTTGTGGCCTTTAGTATTTTTTGGGTACTGTTGATTTACGTCAAT 72

GTTTATCTCTTTGGTGCTAAAGGAAGCTTGTCAATTTATGGCTTTTTGCTGATAGCTTACCTATTAGTCAAA 114

ATGTCCTTATCCTTTTTTTACAAGCCATTTAAGGGAAGGGCTGGGCAATATAAGGTTGCAGCCATTATTCCC 216

TCTTATAACGAAGATGcTGAGTCATTGCTAGAGACCTTAAAAAGTGTTCAGCAGCAAACCTATCCCCTAGCA 288

GAAATTTATGTTGTTGACGATGGAAGTGCTGATGAGACAGGTATTAAGCGCATTGAAGACTATGTGCGTGAC 360

ACTGGTGACCTATCAAGCAATGTCATTGTTCATCGGTCAGAGAAAAATCAAGGAAAGCGTCATGCACAGGCC 432

TGGGCCTTTGAAAGATCAGACGCTGATGTCTTTTTGACCGTTGACTCAGATACTTATATCTACCCTGATGCT 504

TTAGAGGAGTTGTTAAAAACCTTTAATGACCCAACTGTTTTTGCTGCGACGGGTCACCTTAATGTCAGAAAT 576

AGACAAACCAATCTCTTAACACGCTTGACAGATATTCGCTATGATAATGCTTTTGGCGTTGAACGAGCTGCC 648

CAATCCGTTACAGGTAATATCCTTGTTTGCTCAGGTCCGCTTAGCGTTTACAGACGCGAGGTGGTTGTTCCT 720

AACATAGATAGATACATCAACCAGACCTTCCTGGGTATTCCTGTAAGTATTGGTGATGACAGGTGCTTGACC 792

AACTATGCAACTGATTTAGGAAAGACTGTTTATCAATCCACTGCTAAATGTATTACAGATGTTCCTGACAAG 864

ATGTCTACTTACTTGAAGCAGCAAAACCGCTGGAACAAGTCCTTCTTTAGAGAGTCCATTATTTCTGTTAAG 936

AAAATCATGAACAATCCTTTTGTAGCCCTATGGACCATACTTGAGGTGTCTATGTTTATGATGCTTGTTTAT 1008

TCTGTGGTGGATTTCTTTGTAGGCAATGTCAGAGAATTTGATTGGCTCAGGGTTTTAGCCTTTCTGGTGATT 1080

ATCTTCATTGTTGCCCTGTGTCGGAACATTCATTACATGCTTAAGCACCCGCTGTCCTTCTTGTTATCTCCG 1152

TTTTATGGGGTGCTGCATTTGTTTGTCCTACAGCCCTTGAAATTATATTCTCTTTTTACTATTAGAAATGCT 1224

GACTGGGGAACACGTAAAAAATTATTATAA 1254

序列号1

M R T L K N L I T V V A F S I F W V L L I Y V N 24

V Y L F G A K G S L S I Y G F L L I A Y L L V F 48

P F K G R A G Q Y K V A A I I P 72

S Y N E D A E S L L E T L K S V Q Q Q T Y P L A 96

E I Y V V D D G S A D E T G I K R I E D Y V R D 120

T G D L S S N V I V H R S E K N Q G K R H A Q A 144

W A F E R S D A D V F L T V D S D T Y I Y P D A 168

L E E L L K T F N D P T V F A A T G H L N V R N 192

R Q T N L L T R L T D I R Y D N A F G V E R A A 216

Q S V T G N I L V C S G P L S V Y R R E V V V P 240

N I D R Y I N Q T F L G I P V S I G D D R C L T 264

N Y A T D L G C I T D V P D K 288

M S T Y L K Q Q N R W N K S F F R E S I I S V K 312

K I M N N P F V A L W T I L E V S M F M M L V Y 336

S V V D F F V G N V R E F D W L R V L A F L V I 360

I F I V A L C E E I H Y E L K H P L S F L L S P 384

F Y G V L H L F V L Q P L

N E 408

D W G T R K K L L * 417

序列号2

序列号3

5’-GCTGATGAG ACAG G TAT TAAGC

引物：se1 (有义，核苷酸 G³¹⁶-C³³⁷)

序列号4

5’-A T C A A A T T C T C T G A C A T T G C

引物：se2(反义，相应于有义链核苷酸G¹⁰³¹-T¹⁰⁵⁰)

序列号5

5’-G A C T C A G A T A C T T A T A T C T A

引物：sesp1(有义，核苷酸 G⁴⁷⁵-A⁴⁹⁴)

序列号6

5’-T T T T T A C G T G T T C C C C A

引物：sesp2(反义，相应于有义链核苷酸 T¹²²⁸-A¹²⁴⁴)

A98R的蛋白质序列，PBCV-1 HA合酶

1 NGKNIIIMVS WYTIITSNLI AVGGASLILA PAITGYVLHW NIALSTIWGV SAYGIFVEGF

61 FLAQVLFSEL NRKRLRKWIS LRPKGWNDVR LAVIIAGYRE DPYMFQKCLE SVRDSDYGNV

121 ARLICVIDGD EDDDMRMAAV YKAIYNDNIK KPEFVLCESD DKEGERIDSD FSRDICVLQP

181 HRGKRECLYT GFQLAKMDPS VNAVVLIDSD TVLEKDAILE VVYPLACDPE IQAVAGECKI

241 WNTDTLLSLL VAWRYYSAFC VERSAQSFFR TVQCVGGPLG AYKDIIKEIK DPWISQRFLG

301 QKCTYGDDRR LTNEILMRGK KVVFTPFAVG WSDSPTNVFR YIVQQTRWSK SWCREIWYTL

361 FAAWKHGLSG IWLAFECLYQ ITYFFLVIYL FSRLAVEADP RAQTATVIVS TTVALIKCGY

421 FSFRAKDIRA FYFVLYTFVY FFCMIPARIT AMMTLWDIGW DTRGGNEKPS VGTRVALWAK

481 QYLIAYMWWA AVVGAGVYSI VHNWMFDWNS LSYRFALVGI CSYIVFIVIV LVVYFTGKIT

541 TWNFTKLQKE LIEDRVLYDA TTNAQSV

567

序列号7

PBCV-1病毒基因组中A98R基因的核苷酸序列

起始：ATG 50901终止：TGA 52607

50881 aagacttctt gaaagttaca ATGggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca

50941 tcataacttc aaatctaatc gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccggcaatta

51001 ctgggtatgt tctacattgg aatattgctc tctcgacaat ctggggagta tcagcttatg

51061 gtattttcgt ttttgggttt ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg aacaggaaac

51121 gtcttcgcaa gtggatttct ctcagaccta agggttggaa tgatgttcgt ttggctgtga

51181 tcattgctgg atatcgcgag gatccttata tgttccagaa gtgcctcgag tctgtacgtg

51241 actctgatta tggcaacgtt gcccgtctga tttgtgtgat tgacggtgat gaggacgatg

51301 atatgaggat ggctgccgtt tacaaggcga tctacaatga taatatcaag aagcccgagt

51361 ttgttctgtg tgagtcagac gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat ttctctcgcg

51421 acatttgtgt cctccagcct catcgtggaa aacgggagtg tctttatact gggtttcaac

51481 ttgcaaagat ggaccccagt gtcaatgctg tcgttctgat tgacagcgat accgttctcg

51541 agaaggatgc tattctggaa gttgtatacc cacttgcatg cgatcccgag atccaagccg

51601 ttgcaggtga gtgtaagatt tggaacacag acactctttt gagtcttctc gtcgcttggc

51661 ggtactattc tgcgttttgt gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg actgttcagt

51721 gcgttggggg gccactgggt gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt aaggacccct

51781 ggatttccca gcgctttctt ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc cggctaacca

51841 acgagatctt gatgcgtggt aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt ggttggtctg

51901 acagtccgac caatgtgttt cggtacatcg ttcagcagac ccgctggagt aagtcgtggt

51961 gccgcgaaat ttggtacacc ctcttcgccg cgtggaagca cggtttgtct ggaatttggc

52021 tggcctttga atgtttgtat caaattacat acttcttcct cgtgatttac ctcttttctc

52081 gcctagccgt tgaggccgac cctcgcgccc agacagccac ggtgattgtg agcaccacgg

52141 ttgcattgat taagtgtggg tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg gcgttttact

52201 ttgtgcttta tacatttgtt tactttttct gtatgattcc ggccaggatt actgcaatga

52261 tgacgctttg ggacattggc tgggatactc gcggtggaaa cgagaagcct tccgttggca

52321 cccgggtcgc tctgtgggca aagcaatatc tcattgcata tatgtggtgg gccgcggttg

52381 ttggcgctgg agtttacagc atcgtccata actggatgtt cgattggaat tctctttctt

52441 atcgttttgc tttggttggt atttgttctt acattgtttt tattgttatt gtgctggtgg

52501 tttatttcac cggcaaaatt acgacttgga atttcacgaa gcttcagaag gagctaatcg

52561 aggatcgcgt tctgtacgat gcaactacca atgctcagtc tgtgTGAttt ttcctgcaag

序列号8

出血败血性巴斯德氏菌的核苷酸和蛋白质序列

+1

1 M N T L S Q A I K A Y N S N D Y Q

-18 ATTTTTTAAGGACAGAAAATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGCATATAACAGCAATGACTATCAA

18 L A L K L F E K S A E I Y G R K I V E F Q I T

52 TTAGCACTCAAATTATTTGAAAAGTCGGCGGAAATCTATGGACGGAAAATTGTTGAATTTCAAATTACC

41 K C Q E K L S A H P S V N S A H L S V N K E E

121 AAATGCCAAGAAAAACTCTCAGCACATCCTTCTGTTAATTCAGCACATCTTTCTGTAAATAAAGAAGAA

64 K V N V C D S P L D I A T Q L L L S N V K K L

190 AAAGTCAATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAAAAAAATTA

87 V L S D S E K N T L K N K W K L L T E K K S E

259 GTACTTTCTGACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAATAAATGGAAATTGCTCACTGAGAAGAAATCTGAA

110 N A E V R A V A L V P K D F P K D L V L A P L

328 AATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGATTTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTA

133 P D H V N D F T W Y K K R K K R L G I K P E H

397 CCTGATCATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAGCGAAAGAAAAGACTTGGCATAAAACCTGAACAT

156 Q H V G L S I I V T T F N R P A I L S I T L A

466 CAACATGTTGGTCTTTCTATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCC

179 C L V N Q K T H Y P F E V I V T D D G S Q E D

535 TGTTTAGTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGGAAGAT

202 L S P I I R Q Y E N K L D I R Y V R Q K D N G

604 CTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAGACAAAAAGATAACGGT

225 F Q A S A A R N M G L R L A K Y D F I G L L D

673 TTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGATTACGCTTAGCAAAATATGACTTTATTGGCTTACTCGAC

248 C D M A P N P L W V H S Y V A E L L E D D D L

742 TGTGATATGGCGCCAAATCCATTATGGGTTCATTCTTATGTTGCAGAGCTATTAGAAGATGATGATTTA

271 T I I G P R K Y I D T Q H I D P K D F L N N A

811 ACAATCATTGGTCCAAGAAAATACATCGATACACAACATATTGACCCAAAAGACTTCTTAAATAACGCG

294 S L L E S L P E V K T N N S V A A K G E G T V

880 AGTTTGCTTGAATCATTACCAGAAGTGAAAACCAATAATAGTGTTGCCGCAAAAGGGGAAGGAACAGTT

317 S L D W R L E Q F E K T E N L R L S D S P F R

949 TCTCTGGATTGGCGCTTAGAACAATTCGAAAAAACAGAAAATCTCCGCTTATCCGATTCGCCTTTCCGT

340 F F A A G N V A F A K K W L N K S G F F D E E

1018 TTTTTTGCGGCGGGTAATGTTGCTTTCGCTAAAAAATGGCTAAATAAATCCGGTTTCTTTGATGAGGAA

序列号19

(1/3)

363 F N H W G G E D V F P G Y R L F R Y G S F F K

1087 TTTAATCACTGGGGTGGAGAAGATGTGGAATTTGGATATCGCTTATTCCGTTACGGTAGTTTCTTTAAA

386 T I D G I M A Y H Q E P P G K E N E T D R E A

1156 ACTATTGATGGCATTATGGCCTACCATCAAGAGCCACCAGGTAAAGAAAATGAAACCGATCGTGAAGCG

409 G K N I T L D I M R E K V P Y I Y R K L L P I

1225 GGAAAAAATATTACGCTCGATATTATGAGAGAAAAGGTCCCTTATATCTATAGAAAACTTTTACCAATA

432 E D S H I N R V P L V S I Y I P A Y N C A N Y

1294 GAAGATTCGCATATCAATAGAGTACCTTTAGTTTCAATTTATATCCCAGCTTATAACTGTGCAAACTAT

455 I Q R C V D S A L N Q T V V D L E V C I C N D

1363 ATTCAACGTTGCGTAGATAGTGCACTGAATCAGACTGTTGTTGATCTCGAGGTTTGTATTTGTAACGAT

478 G S T D N T L E V I N K L Y G N N P R V R I M

1432 GGTTCAACAGATAATACCTTAGAAGTGATCAATAAGCTTTATGGTAATAATCCTAGGGTACGCATCATG

501 S K P N G G I A S A S N A A V S F A K G Y Y I

1501 TCTAAACCAAATGGCGGAATAGCCTCAGCATCAAATGCAGCCGTTTCTTTTGCTAAAGGTTATTACATT

524 G Q L D S D D Y L E P D A V E L C L K E F L K

1570 GGGCAGTTAGATTCAGATGATTATCTTGAGCCTGATGCAGTTGAACTGTGTTTAAAAGAATTTTTAAAA

547 D K T L A C V Y T T N R N V N P D G S L I A N

1639 GATAAAACGCTAGCTTGTGTTTATACCACTAATAGAAACGTCAATCCGGATGGTAGCTTAATCGCTAAT

570 G Y N W P E F S R E K L T T A M I A H H F R M

1708 GGTTACAATTGGCCAGAATTTTCACGAGAAAAACTCACAACGGCTATGATTGCTCACCACTTTAGAATG

593 F T I R A W H L T D G F N E K I E N A V D Y D

1777 TTCACGATTAGAGCTTGGCATTTAACTGATGGATTCAATGAAAAAATTGAAAATGCCGTAGACTATGAC

616 M F L K L S E V G K F K H L N K I C Y N R V L

1846 ATGTTCCTCAAACTCAGTGAAGTTGGAAAATTTAAACATCTTAATAAAATCTGcTATAACCGTGTATTA

639 H G D N T S I K K L G I Q K K N H F V V V N Q

1915 CATGGTGATAACACATCAATTAAGAAACTTGGCATTCAAAAGAAAAACCATTTTGTTGTAGTCAATCAG

662 S L N R Q G I T Y Y N Y D E F D D L D E S R K

1984 TCATTAAATAGACAAGGCATAACTTATTATAATTATGACGAATTTGATGATTTAGATGAAAGTAGAAAG

685 Y I F N K T A E Y Q E E I D I L K D I K I I Q

2053 TATATTTTCAATAAAACCGCTGAATATCAAGAAGAGATTGATATCTTAAAAGATATTAAAATCATCCAG

708 N K D A K I A V S I F Y P N T L N G L V K K L

2122 AATAAAGATGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCCCAATACATTAAACGGCTTAGTGAAAAAACTA

731 N N I I E Y N K N I F V I V L H V D K N H L T

2191 AACAATATTATTGAATATAATAAAAATATATTCGTTATTGTTCTACATGTTGATAAGAATCATCTTACA

754 P D I K K E I L A F Y H K H Q V N I L L N N D

2260 CCAGATATCAAAAAAGAAATACTAGCCTTCTATCATAAACATCAAGTGAATATTTTACTAAATAATGAT

序列号19

(2/3)

777 I S Y Y T S N R L I K T E A H L S N I N K L S

2329 ATCTCATATTACACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGGCGCATTTAAGTAATATTAATAAATTAAGT

800 Q L N L N C E Y I I F D N H D S L F V K N D S

2398 CAGTTAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATGACAGCCTATTCGTTAAAAATGACAGC

823 Y A Y M K K Y D V G M N F S A L T H D W I E K

2467 TATGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAACACATGATTGGATCGAGAAA

846 I N A H P P F K K L I K T Y F N D N D L K S M

2536 ATCAATGCGCATCCACCATTTAAAAAGCTCATTAAAACTTATTTTAATGACAATGACTTAAAAAGTATG

869 N V K G A S Q G M F M T Y A L A H E L L T I I

2605 AATGTGAAAGGGGCATCACAAGGTATGTTTATGACGTATGCGCTAGCGCATGAGCTTCTGACGATTATT

892 K E V I T S C Q S I D S V P E Y N T E D I W F

2674 AAAGAAGTCATCACATCTTGCCAGTCAATTGATAGTGTGCCAGAATATAACACTGAGGATATTTGGTTC

915 Q F A L L I L E K K T G H V F N K T S T L T Y

2743 CAATTTGCACTTTTAATCTTAGAAAAGAAAACCGGCCATGTATTTAATAAAACATCGACCCTGACTTAT

938 M P W E R K L Q W T N E Q I E S A K R G E N I

2812 ATGCCTTGGGAACGAAAATTACAATGGACAAATGAACAAATTGAAAGTGCAAAAAGAGGAGAAAATATA

961 P V N K F I I N S I T L *

2881 CCTGTTAACAAGTTCATTATTAATAGTATAACTCTATAA

序列号19

(3/3)

Claims

1.一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的类马链球菌透明质酸合酶。

2.一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

3.一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该透明质酸合酶选自：

(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质；和

(b)通过在(a)的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸的替换、缺失或添加而衍生自(a)的蛋白质、并具有透明质酸合酶活性的蛋白质。

4.一种选自质粒、粘粒、噬菌体、或者病毒载体的重组载体，并且其中该重组载体进一步含有纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的类马链球菌透明质酸合酶。

5.一种选自质粒、粘粒、噬菌体、或者病毒载体的重组载体，并且其中该重组载体进一步含有纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

6.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是用一种重组载体转化的原核细胞，其中所说的重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ IDNO：2的类马链球菌的透明质酸合酶。

7.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是用一种重组载体转化的原核细胞，其中所说的重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞产生透明质酸。

9.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是用一种重组载体转染的真核细胞，其中所说的重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ IDNO：2的类马链球菌的透明质酸合酶。

10.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是用一种重组载体转染的真核细胞，其中所说的重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞产生透明质酸。

12.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞经电穿孔将一种重组载体引入该重组宿主细胞，其中该重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的类马链球菌的透明质酸合酶。

13.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞经电穿孔将一种重组载体引入该重组宿主细胞，其中该重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQID NO：1的核苷酸序列。

14.如权利要求13所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞产生透明质酸。

15.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一种重组载体转导，其中该重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的类马链球菌的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO：2的类马链球菌的透明质酸合酶。

16.一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一种重组载体转导，其中该重组载体含有一种纯化的编码酶学活性的类马链球菌的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段是SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

17.如权利要求16所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞产生透明质酸。

18.一种纯化的组合物，其中该纯化的组合物包括一种具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。

19.一种检测DNA物种的方法，包括下述步骤：

获得一个DNA样品；

将该DNA样品与纯化的SEQ ID NO：1的核酸区段相接触；

将该DNA样品与该纯化的核酸区段杂交从而形成杂交复合物；以及

检测该复合物。

20.一种能够与SEQ ID NO：1在标准杂交条件下杂交的引物或探针，其中所述引物或探针具有选自SEQ ID NO：3、4、5和6的序列。

21.一种纯化的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸区段，其中该纯化的核酸区段选自：

(a)具有SEQ ID NO：1的核酸序列的多核苷酸；和

(b)与(a)的多核苷酸在标准杂交条件下杂交且编码具有透明质酸合酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中所述标准杂交条件是1.2-1.8×HPB，温度为40-50℃。