CN1330555A - 抗截短的vegf－d的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明基于针对具有截短的VEGF－D的氨基酸序列的多肽而制备的抗体的分离。这些抗体中的一种可干扰由VEGFR－2介导的VEGF－D活性并干扰VEGF－D与VEGFR－3的结合,但是不干扰由VEGFR－2介导的VEGF活性或不与VEGF－C结合。本发明提供了使用这些抗体的药物组合物和诊断组合物及方法。

Description

抗截短的VEGF-D的抗体及其应用
本发明涉及一种组合物，其包含一特异地与具有图1(SEQ IDNO：1)的氨基酸序列的多肽反应的抗体。所述抗体包括单克隆抗体(MAb)，其免疫反应片段或其重组体。本发明还涉及使用这些抗体的药物组合物和诊断组合物及方法。
发明背景
在发育的胚胎中，初级血管网络在一称为血管发生(vasculogenesis)的过程中经中胚层细胞的原位分化而建立。据信涉及胚胎新血管生成和成人新血管化的所有后续过程均通过在一称为血管生成(angiogenesis)的过程中从预先存在的血管中萌发或分裂新的毛细血管而控制(Pepper等，酶及蛋白质，49：138-162，1996；Breier等，Dev.Dyn.204：228-239，1995；Risau，自然386：671-674，1997)。血管生成不仅参与胚胎发育和正常组织生长、修复和再生，其也参与妇女或雌性动物的生殖周期，妊娠的建立和保持以及创伤和骨折的修复。除了在正常个体中发生的血管生成之外，血管生成事件也参与各种病理过程，尤其是肿瘤生长和转移，以及有血管增殖特别是微血管系统增殖的增加的其它状态，如糖尿病性视网膜病、银屑病和关节病。对血管生成的抑制可用于防止或减轻这些病理过程。
另一方面，在需建立或延伸血管化的情况下希望促进血管生成，例如在组织或器官移植后，或者在组织梗塞或动脉狭窄如在冠心病和闭塞性血栓血管炎中刺激建立侧支循环时。
血管生成过程高度复杂并涉及内皮细胞保持细胞周期，胞外基质的降解，周围组织的迁移和侵入，以及最终的管形成。复杂的血管生成过程的分子机制远未清楚。
由于血管生成在如此多的生理和病理过程中的重要作用，所以已深入研究了参与控制血管生成的因子。已证明许多生长因子参与血管生成的调节；这些生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子α(TGFα)和肝细胞生长因子(HGF)。综述例如参见Folkman等，生物化学杂志1992 26710931—10934。
已提示一特定家族的内皮细胞特异性生长因子血管内皮生长因子(VEGF)及其相应的受体主要负责刺激内皮细胞生长和分化，以及负责分化细胞的某些功能。这些因子是PDGF家族的成员，并看起来主要通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)起作用。
PDGF家族已鉴别了9种不同的蛋白质，即2种PDGF(A和B)，VEGF和与VEGF紧密相关的6个成员。这6个与VEGF紧密相关的成员是：VEGF—B，见路德维格癌症研究所和赫尔辛基大学的国际专利申请PCT/US96/02957(WO96/26736)和美国专利5,840,693和5,607,918所述；VEGF—C，见Joukov等，EMBO杂志，15290—298，1996和Lee等，美国科学院学报93：1988-1992，1996所述；VEGF—D，见国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)和Archen等，美国科学院学报95：548-553，1998所述；胎盘生长因子(PIGF)，见Maglione等，美国科学院学报88：9267—9271，1991；VEGF2，见人体基因组科学有限公司的国际专利申请PCT/US94/05291(WO95/24473)所述；VEGF3，见人体基因组科学有限公司的国际专利申请PCT/US95/07283(WO96/39421)所述。每个VEGF家族成员均示出与VEGF的30—45％氨基酸相同性。VEGF家族成员共享含有形成半胱氨酸结基序的6个半胱氨酸的VEGF同源性结构域。VEGF家族的功能特征包括对内皮细胞的不同程度的促有丝分裂活性，对血管通透性的诱导以及血管和淋巴血管生成性质。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种同二聚体糖蛋白，已从几种来源分离出。VEGF示出对内皮细胞的高度特异的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管发生过程的新血管形成和成体生命过程中的血管生成中有重要调节功能(Carmeliet等，自然380：435-439，1996；Ferrara等，自然380：439-442，1996；综述见Ferrara和Davis-Smyth，内分泌综述18：4-25，1997)。VEGF所起作用的显著性在一些研究中已经证实，这些研究示出单个VEGF等位基因的失活导致由于血管发育失败所致的胚胎死亡(Carmeliet等，自然380：435-439，1996；Ferrara等，自然380：439-442，1996)。另外，VEGF对单核细胞具有强趋化活性，可以在内皮细胞中诱导纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂，并可影响微血管通透性。由于后一活性，其有时也被称为血管通透因子(VPF)。VEGF的分离和性质已有综述，参见Ferrara等，细胞生物化学杂志，47：211—218，1991，Connolly，细胞生物化学杂志，47：219—223，1991。单一VEGF基因的可变mRNA剪接产生5种VEGF同种型。
VEGF—B具有与VEGF类似的血管生成性质和其它性质，但是在不同于VEGF分布和表达的组织中分布和表达。特别是，VEGF—B在心脏中非常强地表达，在肺中仅弱表达，而VEGF则正相反。这提示VEGF和VEGF—B尽管在许多组织中共表达，但是可能仍具有功能差异。
通过用酵母共交(co-hybrid)相互作用捕获筛选技术筛选可与I型细胞视黄酸结合蛋白(CRABP—I)相互作用的细胞蛋白而分离VEGF—B。其分离和鉴定详见PCT/US96/02597和Olofsson等，美国科学院学报93：2576—2581，1996。
VEGF—C是通过用转染表达VEGFR—3的PC—3前列腺腺癌细胞系(CRL1435)筛选其条件培养基产生内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶VEGFR—3(Flt4)的酪氨酸磷酸化的能力而从所述条件培养基中分离。用与VEGFR—3的亲和层析纯化VEGF—C，并从PC—3 cDNA克隆。其分离和鉴定详见Joukov等，EMBO杂志，199615290—298。
VEGF—D是通过用得自称为“Soarse Breast 3NbHBst”的人cDNA文库的表达序列标记作为杂交探针筛选购自Clontech的人乳腺cDNA文库而分离(Achen等，美国科学院院刊199895548—553)。其分离和鉴定详见国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)。
VEGF—D基因在成人中广泛表达，但是当然不是普遍表达。VEGF—D在心脏、肺和骨骼肌中强表达，在脾、卵巢、小肠和结肠中中等程度表达，在肾、胰腺、胸腺、前列腺和睾丸中低表达。在来自脑、胎盘、肝或外周血白细胞的RNA中未检测到VEGF—DmRNA。
PIGF是从足孕胎盘cDNA文库中分离出来，其分离和鉴定详见Maglione等，美国科学院院刊1991889267—9271。目前其生物学功能尚未完全清楚。
VEGF2是从高度致瘤性的不依赖于雌激素的人乳腺癌细胞系中分离出来的，尽管这一分子据称与PDGF具有约22％同源性，与VEGF具有约30％同源性，但是分离编码VEGF2的基因的方法不清楚，也没有公开对其生物学活性的鉴定。
VEGF3从来自结肠组织的cDNA文库中分离出来。据称VEGF3与VEGF具有约36％相同性和66％相似性。分离编码VEGF3的基因的方法不清楚，也没有公开对其生物学活性的鉴定。
两个蛋白质之间的相似性通过比较一个蛋白质的氨基酸序列和保守氨基酸取代与另一个蛋白质的序列而确定，而相同性的确定不包括保守氨基酸取代。
PDGF/VEGF家族成员主要通过结合受体酪氨酸激酶起作用。已鉴别了5种内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶，即VEGFR—1(Flt-1)、VEGFR—2(KDR/Flk-1)、VEGFR—3(Flt4)、Tie和Tek/Tie-2。所有这些受体均具有内在酪氨酸激酶活性，这种活性是信号转导所需的。通过在小鼠胚胎中定向突变失活这些受体已证实了VEGFR—1、VEGFR—2、VEGFR—3、Tie和Tek/Tie-2在血管发生和血管生成中的重要和特异作用。
已知结合VEGF的受体酪氨酸激酶是VEGFR—1、VEGFR—2和VEGFR—3。VEGFR—1和VEGFR—2以高亲和性与VEGF结合，VEGFR—1也结合VEGF—B。已表明VEGF—C是VEGFR—3的配体并也活化VEGFR—2(Joukov等，EMBO杂志，199615290—298)。VEGF—D与VEGFR—2和VEGFR-3。已描述了Tek/Tie-2的配体(Regeneron药物公司的国际专利申请PCT/US95/12935(WO96/11269))；但是尚未鉴定Tie的配体。
最近，已纯化和克隆了新的130—135kDa VEGF同种型特异性受体(Soker等，细胞，1998，92735—745)。发现该VEGF受体经外显子7编码的序列与VEGF165同种型特异结合，其显示对肝素的弱亲和性(Soker等，细胞，1998，92735—745)。令人惊奇地，该受体显示与参与早期神经形态发生的一个受体，人neuropilin—1(NP—1)相同。P1GF—2也表明与NP—1相互作用(Migdal等，生物化学杂志，1998，27322272—22278)。
VEGFR—1、VEGFR—2和VEGFR—3在内皮细胞中不同地表达。VEGFR-1和VEGFR-2均在血管内皮中表达(Oelrichs等，癌基因，8：11-18，1992；Kaipainen等，实验医学杂志178：2077-2088，1993；Dumont等，Dev.Dyn.203：80-92，1995；Fong等，Dev.Dyn.207：1-10，1996)，VEGFR-3大多在成体组织的淋巴内皮中表达(Kaipainen等，美国科学院学报9：3566-3570，1995)。VEGFR-3还在肿瘤周围的血管内皮中表达。
VEGFR基因的破坏导致血管发育异常，使得胚胎在妊娠中期死亡。对携带完全失活的VEGFR-1基因的胚胎的分析提示这一受体是内皮功能化组织所需的(Fong等，自然376：66-70，1995)。但是，VEGFR-1的胞内酪氨酸激酶结构域的缺失产生具有正常血管的存活小鼠(Hiratsuka等，美国科学院学报95：9349-9354，1998)。这些差异的原因仍有待于解释，但是提示经酪氨酸激酶进行受体信号传导不是VEGFR-1正常功能所必须的。对具有失活的VEGFR-2等位基因的纯合小鼠的分析提示这一受体是内皮细胞增殖、造血细胞发生和血管发生所需的(Shalaby等，自然376：62-66，1995；Shalaby等，细胞89：981-990，1997)。VEGFR-3的失活导致由于大血管组织异常是致的心血管不全(Dumont等，科学，1998282946—949)。
尽管VEGFR-1主要在发育过程中在内皮细胞中表达，但是它也可在胚胎发生早期在造血前体细胞中发现(Fong等，自然376：66-70，1995)。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达这一受体(Barleon等，血液87：3336-3343，1995)。在胚胎中，VEGFR-1由大多数(即使不是全部)血管表达(Breier等，Dev.Dyn.204：228-239，1995；Fong等，Dev.Dyn.207：1-10，1996)。
受体VEGFR-3在早期胚胎发育过程中在内皮细胞上广泛表达，但是随着胚胎发生的进程，其表达限于静脉内皮，随后限于淋巴内皮((Kaipainen等，癌症研究1994546571—6577；美国科学院院刊1995923566—3570)。VEGFR-3在成体组织的淋巴内皮细胞上表达，这一受体对于胚胎发生过程中的血管发育是必需的。
定向失活小鼠中VEGFR-3基因的两个拷贝导致缺陷性血管形成，其特征在于具有缺陷的腔的异常组织的大血管，导致在性交后9.5天心包腔液体蓄积和心血管功能不全。基于这些发现，已提示VEGFR-3是初级血管网络成熟为更大的血管所需的。但是，在这些小鼠中不能进行VEGFR-3在淋巴血管发育中的作用的研究，因为胚胎在淋巴系统出现前死亡。尽管如此，仍推测VEGFR-3在淋巴血管发育和淋巴血管生成中起作用，因为其在胚胎发生和成体生命中在淋巴内皮细胞中特异表达。这一点由如下的发现支持，即VEGFR-3的一个配体VEGF-C在转基因小鼠的皮肤中的异位表达导致淋巴内皮细胞增殖和真皮中血管增大。另外，这提示VEGF-C可能在淋巴内皮中具有主要功能，在血管生成和通透性调节中有与VEGF共享的次级功能(Joukov等，EMBO J.15：290-298，1996)。
VEGF/VEGF-受体系统的某些抑制剂已表明经抗血管生成机制防止肿瘤生长，参见Kim等，自然362：841-844，1993和Saleh等，癌症研究56：393-401，1996。
发明概述
本发明一般地提供了包含一种特异地与具有图1(SEQ IDNO：1)的氨基酸序列的多肽反应的抗体的组合物，其中抗体是单克隆抗体(MAb)，其免疫反应片段或其重组体。在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含可干扰由哺乳动物VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与哺乳动物VEGFR-3的结合的抗体。一特别优选的抗体可干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-2的结合，但不干扰由VEGFR-2介导的VEGF活性和/或不与VEGF-C结合。本发明还涉及使用所述抗体的药物组合物和诊断组合物及方法。
根据第一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含特异地与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽反应的抗体。这种抗体的例子包括称为2F8，4A5，4E10，5F12，4H4和3C10的单克隆抗体(MAb)。
根据第二个方面，本发明提供了一种组合物，其包含干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性的抗体。在一优选的实施方案中，这一抗体也干扰VEGF-D与VEGFR-3的结合，但不干扰由VEGFR-2介导的VEGF活性和/或不与VEGF-C结合。这种抗体的例子是具有IgG1同种型的抗体MAb4A5。
在第三个方面，本发明提供了一种组合物，其包含干扰VEGF-D与VEGFR-3的结合的抗体。
抗体可通过用现有技术的标准方法针对具有图1(SEQ IDNO：1)的氨基酸序列的多肽或该多肽的片段而产生。另外，这一多肽可与附加表位如FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)连接以便于亲和纯化。对于某些应用，例如当在临床情况下抗体用于抑制VEGF-D的作用时，可能希望的是用人源化或嵌合单克隆抗体或其免疫反应性片段。产生这些的方法如下所述，并且上现有技术中熟知的，包括重组DNA方法。
本发明的这些方面还包括MAb，其免疫反应性片段或其重组体，它们均可合适地被标记。
本发明的抗体可用检测标记来标记并用于诊断目的。抗体可与合适的超磁、顺磁、电子致密的、生态的(ecogenic)或放射性试剂共价或非共价偶联以成像。为用于诊断分析可使用放射性或非放射性标记。放射性标记的例子包括放射性原子或基团，如125I或32P。非放射性标记包括酶标记，如辣根过氧化物酶，或荧光标记，如荧光素—5—异硫氰酸酯(FITC)。标记可以是直接或间接的，共价或非共价的。
本发明的第四个方面涉及制备与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽特异反应的单克隆抗体的方法。另外，这一多肽可与附加表位如FLAG八肽(Sigma—Aldrich)连接。所述方法包括如下步骤：用一种免疫原免疫免疫活性哺乳动物，该免疫原包括具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽或该多肽的片段，以及任选地，一种相连的附加表位；将该免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤；筛选杂交瘤细胞产生的单克隆抗体以检测其与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽的特异结合活性；在一种培养基中培养产生与具有图1(SEQ IDNO：1)的氨基酸序列的多肽有特异结合活性的MAb的杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及从培养物上清中回收所述单克隆抗体。
另外，本发明提供了一种制备干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-3的结合的单克隆抗体的方法。这一方法包括如下步骤：用一种免疫原免疫免疫活性哺乳动物，该免疫原包括具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽或该多肽的片段，以及任选地，一种相连的附加表位；将该免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤；筛选杂交瘤细胞产生的单克隆抗体以检测其VEGF-D干扰活性和/或VEGF-D结合干扰活性；在一种培养基中培养产生具有VEGF-D干扰活性和/或VEGF-D结合干扰活性的MAb的杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及从培养物上清中回收所述单克隆抗体。在两种方法中优选的免疫活性哺乳动物是小鼠或大鼠。
本发明的第五方面是一种杂交瘤细胞，其产生特异地与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽反应的单克隆抗体或干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-3结合的单克隆抗体。
本发明的第六方面提供了一种制备杂交瘤的方法，该杂交瘤产生特异地与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽反应的单克隆抗体或干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-3结合的单克隆抗体，所述方法包括如下步骤：用一种免疫原免疫免疫活性哺乳动物，该免疫原包括具有图1(SEQ IDNO：1)的氨基酸序列的多肽或该多肽的片段，以及任选地，一种相连的附加表位；获得该免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞；将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；筛选杂交瘤细胞产生的单克隆抗体以检测其与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽的特异结合活性和/或其VEGF-D干扰活性和/或VEGF-D结合干扰活性；培养产生具有与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽的特异结合活性和/或VEGF-D干扰活性和/或VEGF-D结合干扰活性的所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
术语“培养”是指通过使杂交瘤细胞增殖而克隆杂交瘤细胞并诱导杂交瘤分泌上述抗体。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物或细胞培养物中干扰由VEGF-D诱导的至少一种生物学活性的方法，包括给予所述哺乳动物或向所述细胞培养物中加入有效干扰生物学活性量的单克隆抗体。
“由VEGF-D诱导的生物学活性”可通过本领域已知的方法容易地测定。具体地，VEGF-D具有刺激内皮细胞增殖或分化的能力，包括但不限于血管内皮细胞和/或淋巴内皮细胞的增殖或分化。所涉及的其它生物学活性包括血管生成，淋巴血管生成以及血管和淋巴管的通透性的诱导。
术语“抗体”是指包括能干扰由哺乳动物VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与哺乳动物VEGFR-3的结合的抗体的组合物。特别优选的抗体可以干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-3的结合但不干扰由VEGFR-2介导的VEGF活性和/或不与VEGF-C结合。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的抗体，其药物学可接受的非毒性盐，以及药物学可接受的固体或液体载体或佐剂。这种载体或佐剂的例子包括但不限于盐水，缓冲盐水，Ringer溶液，矿物油，滑石，玉米淀粉，明胶，乳糖，蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露醇，磷酸二钙，氯化钠，藻酸，右旋糖，水，甘油，乙醇，增稠剂，稳定剂，悬浮剂，及其组合。这种组合物可以是溶液、悬浮液、片剂、胶囊、乳液、膏剂、酏剂、糖浆、薄片(wafer)、油膏或其它常规形式。配方应适合给药模式。包含PDGF-C的组合物应含有0.1％-90％(重量)的活性化合物，大多数通常为约10％-30％。
给药剂量和途径取决于待治疗的患者和病情，并依靠参与的医生或兽医的判断力。合适的途径包括口服、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉注射、肠道外、局部应用、移植等。例如，有效量的抗体以约0.1-1000μg/kg体重的剂量给予需要其的生物体。
本发明的临床应用包括诊断应用以及在治疗癌症、糖尿病性视网膜病、银屑病和关节病中抑制血管生成和/或淋巴血管生成。因此，本发明还涉及在需要治疗的哺乳动物中干扰血管生成、淋巴血管生成和/或新血管化的方法，所述方法包括将有效量的抗体给予哺乳动物。所述抗体通过防止至少VEGFR-2的活化而干扰VEGF-D的作用。
另外，本发明的这一方面提供了在选自癌症、糖尿病性视网膜病、银屑病和关节病的哺乳动物疾病中干扰选自血管生成、淋巴血管生成和新血管化的至少一种生物学活性的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效干扰血管生成、淋巴血管生成或新血管化的量的抗体。如上所述，所述抗体至少部分通过干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性和/或干扰VEGF-D与VEGFR-3的结合而干扰VEGF-D的作用。
抗体可用于治疗例如涉及由于血管通透性增加而产生的液体在例如肺中的蓄积的充血性心功能不全，其是通过对血管通透性产生一偏移作用而对抗液体蓄积。因此，本发明提供了治疗哺乳动物由于血管通透性增加导致的心和/或肺中液体蓄积的方法，这一方法包括给予所述需要治疗的哺乳动物有效降低血管通透性的量的抗体。
本发明还提供了检测生物学样品中的VEGF-D的方法，包括将样品与一抗体接触，并检测涉及该抗体的结合。在一优选的实施方案中，结合和/或结合的程度通过检测标记而检测，合适的标记见上述。
根据另一方面，本发明提供了典型地为试剂盒形式的诊断/预后装置。例如，在本发明的一个实施方案中，提供了一种诊断/预后试剂盒，其包含抗图1(SEQ ID NO：1)的多肽的抗体以及检测该抗体与VEGF-D之间的结合的手段。在本发明的诊断/预后装置的一个优选实施方案中，提供了抗与抗图1(SEQ ID NO：1)的多肽的抗体(一抗)相同同种型和动物来源的抗体的第二种抗体(二抗)。该二抗与一检测标记偶联，随后未标记的一抗或VEGF-D与底物结合，从而可在一抗和VEGF-D结合以及随后标记的二抗与一抗的结合之后，通过测定与底物结合的标记量确定VEGF-D/一抗的相互作用。在本发明的一特别优选的实施方案中，诊断/预后装置可以提供为常规酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒的形式。
根据另一方面，本发明提供了鉴别干扰VEGFR-3和VEGF-D之间的相互作用的化合物的方法，该方法包括将具有VEGFR-3胞外域的多肽施加于一底物，将底物与VEGF-D在存在待鉴别的化合物的情况下保温，以及检测VEGFR-3与VEGF-D之间的相互作用。
根据另一方面，本发明提供了成像组织中的淋巴管系统的方法，包括将组织与一抗体接触，以及检测抗体结合的发生。
附图简述
图1示出用于产生抗体的多肽(无FLAG八肽)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2示出单克隆抗体对Ba/F3-NYK-EpoR细胞对VEGF-DΔNΔC的应答的影响。
图3A和3B示出单克隆抗体对VEGF-DΔNΔC的相对结合亲和性。
图4示出单克隆抗体对Ba/F3-NYK-EpoR细胞对鼠VEGF164-的应答的影响。
图5示出抗VEGF-D MAb对VEGF-DΔNΔC与VEGFR-3的胞外域的结合的影响。
优选实施方案的详细描述
图1示出用于产生抗体的无FLAG八肽的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。实施例I：抗体的产生
在小鼠中产生抗具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽的单克隆抗体。用作产生本发明的抗体的免疫原的多肽在其N-末端是FLAG标记的(见下述)。这一氨基酸序列是VEGF-D的中心区并在序列上与VEGF家族的所有其它成员类似。因此，据信VEGF-D的生物活性部分可能位于该保守区。用包含全长人VEGF-D cDNA的质粒作为模板，用Pfu DNA聚合酶经聚合酶链反应(PCR)扩增编码从残基93-201即除去N-末端和C-末端区的人VEGF-D的截短部分的DNA片段。其序列经核苷酸测序而证实的扩增的DNA片段随后插入表达载体pEFBOSSFLAG(澳大利亚墨尔本的沃尔特和伊丽莎豪医学研究所(WEHI)的Clare McFarlane博士惠赠)中，得到的质粒命名为pEFBOSVEGF-DΔNΔC。质粒pEFBOSSFLAG含有编码用于白介素—3(IL-3)的蛋白质分泌的信号序列和FLAG八肽的DNA。FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)可由商购抗体如M2单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO)识别。VEGF-D PCR片段插入载体的位置是使得IL-3信号序列位于FLAG八肽的相邻上游，而FLAG八肽位于截短的VEGF-D序列的相邻上游。所有三个序列均在同一读框，从而由pEFBOSVEGF-DΔNΔC转染进哺乳动物细胞产生的mRNA的翻译将产生在其N-末端具有IL-3信号序列，后接FLAG八肽和截短的VEGF-D序列的蛋白质。信号序列的裂解以及随后蛋白质从细胞的分泌将产生相邻N-末端由FLAG八肽标记的VEGF-D多肽。这一蛋白质称为VEGF-DΔNΔC，VEGF-DΔNΔC通过抗FLAG亲和层析从用质粒pEFBOSVEGF-DΔNΔC瞬时转染的COS细胞的培养基中纯化。(见国际专利申请PCT/US97/14696的实施例9)。
纯化的VEGF-DΔNΔC用于免疫雌性Balb/C小鼠，4天(静脉内)、71天(腹膜内)和85天(腹膜内)后从免疫小鼠中收获脾细胞，随后将这些脾细胞与小鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653(NS-1)细胞融合。对于前两次免疫，注射在磷酸缓冲盐水(PBS)与TiterMax佐剂(#R-1研究佐剂；CytRx公司，Norcross，GA)的1∶1混合物中的约10μgVEGF-DΔNΔC，而第三次免疫用在PBS中的35tg VEGF-DΔNΔC。
抗VEGF-DΔNΔC的单克隆抗体(MAb)通过用酶免疫分析在纯化的VEGF-DΔNΔC上筛选杂交瘤产生的MAb而选择。简单地说，用VEGF-DΔNΔC包被96孔微滴板并加入杂交瘤上清，在4℃保温2小时，随后在含0.02％Tween20的PBS中洗6次。然后与辣根过氧化物酶缀合的抗鼠Ig(Bio-Rad，Hercules，CA)在4℃保温1小时。洗涤后，用2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS)底物系统(Zymed，旧金山，CA)显色，通过在多孔板阅读器(FlowLaboratories MCC/340，McLean，VA)中阅读405nm吸收值而定量分析。选择6个抗体进行进一步分析并经限制稀释亚克隆2次。这些抗体称为2F8，3C10，4A5，4E10，4H4和5F12。用IsostripTMisotyping试剂盒(宝灵格曼海姆，Indianapolis，IN)确定这些抗体的同种型。抗体2F8，4A5，4E10和5F12是IgG1类，而4H4和3C10上IgM类。所有6个抗体均含κ轻链。实施例II：抗体的纯化
在含有5％v/vIgG耗竭的血清(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，5mML-谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素和10μg/ml重组IL-6的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)中培养杂交瘤细胞。用蛋白质G-Sepharose根据Darby等，免疫学方法杂志159：125-129，1993的技术经亲和层析纯化抗体2F8，4A5，4E10和5F12，产量通过在280nm测量吸收值评价。实施例III抗体对VEGF-DΔNΔC的结合亲和性
根据Nice和Catimel，生物分析21：339-352，1999的技术用表面等离子体共振经生物传感器研究分析四种抗VEGF-DΔNΔC MAb2F8，4A5，4E10和5F12与人VEGF-DΔNΔC的相互作用，从而确定这四种MAb对人VEGF-DΔNΔC的相对结合亲和性。用Nice和Catimel，生物分析21：339-352，1999所述的标准胺偶联化学将VEGFR-2-FLAG，VEGFR-3-Ig和抗VEGF-D单克隆抗体偶联至传感器芯片的羧甲基化葡聚糖层上。(固定化的VD14739RU，VD25268RU，VD35781RU和VD45634RU分别相应于4.7，5.2，5.7和5.6ng/mm2(Stenberg等，J.Colloid Interface43：513-526，1990))。用BIAcore3000光学生物传感器(BIAcore，Uppsala，瑞典)分析配体结合。用BIAcore3.1控制软件(Catimel等，J.Chromatogr.A.776：15-30，1997)实现固定化水平的自动定向。固定化后，通过用1M盐酸乙醇胺pH8.5处理封闭残余的活化酯基。之后用10mM二乙胺洗涤以除去非共价结合的物质以及在两次分析之间再生传感器表面。用于这一分析的样品在电泳缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，150nV NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween20)中稀释。通过将人VEGF-DΔNΔC以10μl/min的流速流过表面(41-689nM)而获得结合曲线。为了确定抗体对人VEGF-DΔNΔC的相对结合亲和性，如Catimel等，J.Chromatogr.A.776：15-30，1997所述用BIAevaluation3.0(BIAcore，Uppsala，瑞典)分析数据。通过分析初始解离相获得kd，kd随后用于曲线的结合区即呈1∶1 Langmuirian模型的区域的全局分析，这样获得结合常数。抗体对人VEGF-DΔNΔC的相对结合亲和性的分析见下表。由于抗体被固定化，配体的化合价设定为1。所有抗体均呈类似的亲和性(KD为30-60nM)，ks在7.4-10.7×104M-1s-1之间，kd在2.1-5.2×10-3s-1之间。
    抗体   ks(l/Ms)   kd(l/s)     KD(M)
    5F12     8.6e4     5.2e-3     6.05e-8
    4A5     7.4e4     2.16e-3     2.98e-8
    4E10     7.8e4     4.45e-3     5.71e-8
    2F8     1.07e5     3.9e-3     3.64e-8
实施例IV：干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性的抗体
用国际专利申请PCT/US95/14696的实施例7所述的生物分析法，测试纯化的单克隆抗体(MAb)2F8，4A5，4E10和5F12的干扰由小鼠VEGFR-2(也称为Flk1和NyK)介导的VEGF-DΔNΔC活性的能力。该生物分析法也见于国际专利申请PCT/US95/16755。这一分析法涉及使用Ba/F3 pre-B细胞，该细胞用编码由VEGFR-3的胞外域和促红细胞生成素受体(EpoR)的细胞质结构域组成的嵌合受体的质粒构建体转染(Ba/F3-NYK-EpoR细胞)。这些细胞常规在白介素-3(IL-3)中传代并在缺乏IL-3时会死亡。但是，如果从嵌合受体的细胞质结构域诱导信号传导，则这些细胞在缺乏IL-3时仍存活和增殖。这种信号传导是通过与嵌合受体的VEGFR-2的胞外域结合的配体诱导的，因此VEGF-DΔNΔC或VEGF与VEGFR-2胞外域的结合导致细胞在缺乏IL-3时仍存活和增殖。加入干扰这种配体与胞外域的结合或干扰细胞质结构域的活化的抗体将导致细胞在缺乏IL-3时死亡。不含嵌合受体的亲代Ba/F3细胞不被VEGF-DΔNΔC或VEGF诱导而不在缺乏IL-3时增殖，说明Ba/F3-NYK-EpoR细胞对这些配体的应答完全依赖于嵌合受体。
纯化的VEGF-DΔNΔC的样品与各种量的抗体在PBS中于4℃保温1小时，之后用IL-3缺陷的细胞培养物培养基1∶10稀释混合物。得到的培养基含有约500ng/ml VEGF-DΔNΔC，以及一系列浓度范围的抗体，最多为100μg/ml。随后将Ba/F3-NYK-EpoR细胞在该培养基中于37℃保温48小时。随后加入1μCi3H—胸苷并进一步保温4小时，之后收获定量DNA合成。用细胞收获仪(Tomtec，Orange.Conn)和β计数测定掺入的3H—胸苷。抗体2F8，4A5，4E10和5F12对Ba/F3-NYK-EpoR细胞对VEGF-DΔNΔC的增殖应答的作用示于图2，该图中的数据点代表两次实验的平均值，误差杆表示在每一个点的两次实验的范围。
抗体4Δ5以剂量依赖方式阻断Ba/F3-NYK-EpoR细胞对VEGF-DΔNΔC的应答(图2)。在细胞培养物培养基中包括40μg/ml抗体4A5就足以完全阻断细胞的应答。相反，其它三个抗体浓度接近80μg/ml时仍无可检测到的对应答的作用。这些结果证明抗体4A5干扰由VEGFR-2介导的VEGF-D活性。产生抗体4A5的小鼠杂交瘤细胞4A5A已于1999年4月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，地址为Manassas，VA20110-2209，USA。该保藏物是根据用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定保藏的。实施例V：测试抗体干扰VEGF-D与固定化VEGFR-2和VEGFR-3的结合的能力
在实施例IV的生物分析中抗体4A5的抑制作用可能是抗体阻断VEGF-DΔNΔC与受体的结合或随后的受体交联的作用。实施例IV的生物分析不能辨别由这两种不同机制导致的抑制。为了直接研究四种抗VEGF-DΔNΔC单克隆抗体2F8，4A5，4E10和5F12对VEGF-DΔNΔC与各受体的结合的作用，用生物传感器分析VEGF-DΔNΔC与固定化受体胞外域的相互作用。如实施例III所述将小鼠VEGFR—2的胞外域(VEGFR—2—FLAG)以及由人VEGFR—3的胞外域和人IgG1的Fc部分组成的嵌合蛋白(VEGFR—3—Ig)固定在传感器芯片上(4677和5113固定化RU，分别相当于4.7和5.1ng/mm2)。通过流过与各种浓度(37.5-1200nM)的抗VEGF-DΔNΔC抗体在PBS中于4℃预保温1小时的纯化的人VEGF-DΔNΔC(61nM)的混合物确定抗体对受体相互作用的作用。将含有浓度为2μg/ml的人VEGF-DΔNΔC和如图3A和3B所示各种浓度的抗体的混合物的30微升等份以10μl/ml的流速注射在传感器芯片上。图3A和3B示出这一分析的结果。抗体4A5足以几乎完全阻断与两种受体的结合。抗体2F8和5F12也抑制与两种受体的相互作用，但是其抗体浓度比4A5高许多。需要约40倍摩尔过量的2F8和5F12才可能阻断与两种受体的结合。相反，4E10仅具有边缘作用。这些数据表明，抗体4A5，2F8和5F12可用于VEGF—D生物学功能分析以及用于临床意义上的对VEGF—D生物活性的抑制。用在解离相开始时在存在竞争剂时观察到的生物传感器信号(RUc)和在存在非特异性对照抗体(抗EGFR MAb 528(8))时以2μg/ml注射VEGF-DΔNΔC观察到的信号(RUt)经下式计算结合的抑制百分率：
％竞争＝RUt-RUc/RUt×100实施例VI：测试抗体干扰由VEGFR—2介导的VEGF活性的能力
作为对照，测试抗体干扰Ba/F3-NYK-EpoR细胞对纯化的鼠VEGF164的增殖应答的能力，这些测试的结果如图4所示。没有抗体对细胞对鼠VEGF164的应答有明显作用，这些结果表明抗体4A5干扰由VEGFR—2介导的VEGF-D活性，但不干扰由这一受体介导的VEGF活性。实施例VII：测试抗体与VEGF—C结合的能力
用如上所述相同的酶免疫分析测试六个VEGF—D单克隆抗体结合VEGF—CΔNΔC的能力。VEGF—CΔNΔC由VEGF—C的VEGF同源结构域(VHD)(残基103—215)组成并是VEGF—C的与VEGF-DΔNΔC最相同的区域。在其C—末端已加有6×组氨酸标记的VEGF-CΔNΔC是用表达载体plC9(Invitrogen，San Diego，CA)根据厂商指导在巴斯德毕赤氏酵母菌株GS115中表达，并用Ni-NTASuperflow树脂(QIAGEN，Valencia，CA)纯化。在由这一免疫分析测试的六个抗体中，仅4E10与VEGF-CΔNΔC结合。实施例VIII：干扰VEGF—D与VEGFR—3结合的抗体
用体外受体结合分析测试四种抗VEGF-DΔNΔC单克隆抗体2F8，4A5，4E10和5F12的干扰VEGF-DΔNΔC与VEGFR—3的胞外域的结合的能力。用Fugene 6(Boehringer Mannheim，德国)根据厂商指导将编码一嵌合蛋白的质粒构建体(K.Pajusola，生物技术研究所，赫尔辛基)转染进293-EBNA细胞，该嵌合蛋白由人VEGFR—3的胞外域和人IgG的Fc部分组成。通过与蛋白质A Sepharose珠(Amersham，UK)在4℃轻轻搅拌过夜并用100mM甘氨酸—HCl，pH2.8洗脱而从细胞上清中纯化嵌合蛋白。用小部分样品与过氧化物酶缀合的亲和纯化的山羊抗人IgG，Fc片段特异性抗体(JacksonImmunoresearch Labs.，West Grove，PA)经Western印迹分析证实洗脱液中嵌合蛋白的存在。剩余样品用50mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)进行1∶3稀释，并用Centricon10浓缩器(Amicon，Beverly，MA)浓缩约4倍，并在96孔微滴板(Linbro/Titertek，ICN Biomedicals，Aurora，OH)的孔中于37℃保温1小时。在除去含有嵌合蛋白的溶液后，用PBS和0.05％Tween20(PT20)成分洗板，并用在PBS中的1％牛血清白蛋白在室温封闭板30分钟。用PT20再次洗板，然后与含有VEGF-DΔNΔC(7.3μg/ml)和MAb的PBS在室温保温1小时。在加入到微滴板中之前，VEGF-DΔNΔC和MAb已在4℃一起保温1小时。在与VEGF-DΔNΔC和MAb溶液保温后，用PT20洗板并与含3.5μg/ml生物素化M2抗FLAG MAb(Sigma，St.Louis，MO)的PBS在4℃振荡保温2小时。M2 MAb可用于在受体结合分析中检测与VEGFR—3结合的VEGF-DΔNΔC，因为该多肽在N—末端用FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)标记。随后用PT20洗板，在4℃与链亲和素—过氧化物酶缀合物(Boehringer Mannheim，德国)振荡保温1小时，并再次用PT20洗涤。随后用ABTS底物系统(Zymed，San Francisco，CA)显色该分析并通过在多孔读板器(FlowLaboratories MCC/340，McLean，VA)中在414nm读取吸收值而定量。
该分析包括两个阴性对照。首先，用表达由人VEGFR—1的胞外域和人IgG的Fc部分组成的嵌合蛋白的质粒构建体(E.Korpelainen，Haartman研究所，赫尔辛基)转染293—EBNA细胞，如上所述进行293—EBNA细胞的转染、嵌合蛋白的纯化、Western印迹分析和结合分析(在不存在MAb时)。VEGFR—1/Ig蛋白作为分析的阴性对照是因为VEGF-DΔNΔC不与VEGFR—1结合。其次，用缺少编码VEGF受体的序列的表达载体转染293—EBNA细胞。来自这些细胞的条件培养基如含有VEGFR—3/Ig和VEGFR—1/Ig嵌合蛋白的条件培养基一样使用。
为了测试四种MAb是否干扰M2 MAb与VEGF-DΔNΔC的结合，通过在50mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中于37℃保温1小时将亲和纯化的VEGF-DΔNΔC包被在微滴板的表面。随后用PT20洗板，并在抗VEGF—D MAb存在或不存在下于4℃保温1小时，再次用PT20洗板并与生物素化M2 MAb保温，如上所述洗涤、显色和定量。这些对照分析使用恒量的VEGF-DΔNΔC以及用于受体结合分析中的相同浓度范围的四种抗VEGF—D MAb。另外，对照用恒定浓度的每种MAb(200μg/ml)和约100倍范围的VEGF-DΔNΔC浓度进行。在两个系列的对照中，无论分析中抗VEGF—D MAb或VEGF-DΔNΔC的浓度如何，在存在或不存在抗VEGF—D MAb下经生物素化M2 MAb对VEGF-DΔNΔC的检测均相同。这些对照分析表明所测试的四种单克隆抗体对M2 MAb与VEGF-DΔNΔC的结合均无任何作用。
四种VEGF—D单克隆抗体对VEGF-DΔNΔC与VEGFR—3的结合的作用如图4所示。MAb浓度代表在每种MAb在微滴板孔中的具有VEGF-DΔNΔC的溶液中的浓度。每一曲线代表两次分析的结果，误差杆代表在每一抗体浓度的两次实验中测得的吸收值范围。MAb4E10甚至在浓度为200μg/ml时对这一相互作用仍无作用。相反，MAb4A5在浓度为25μg/ml时就足以几乎完全阻断配体和VEGFR—3的胞外域之间的相互作用。MAb2F8和5F12在浓度高于90μg/ml时仅有微弱抑制作用，其效果远不及4A5的效果那样惊人。从表达VEGFR—1/Ig嵌合蛋白的细胞产生的缺少抗VEGF—DMAb的阴性对照或无VEGF受体衍生物的阴性对照均给出相同于包括200μg/ml浓度的MAb4A5的VEGFR—3/Ig分析的吸收值，即VEGF-DΔNΔC与VEGFR—3的相互作用被完全阻断时的吸收值。这表明VEGF-DΔNΔC与分析中的微滴板的结合依赖于VEGFR—3的胞外域。
上述描述和实施例仅为举例例证本发明而设，而不是限制本发明。由于本领域技术人员能意识到掺入本发明的精神和物质的所公开的实施方案的修改，因此本发明应被广义地理解为包括落入所附权利要求书及其等价物范围内的所有变化。
        序列表<110>马克·G·阿肯
 史蒂文·A·施塔克尔<120>抗截短的VEGF—D的抗体及其应用<130>序列表<140><141><150>60/113，254<151>1998-12-21<150>60/134，556<151>1999-05-17<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>109<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Phe Tyr Asp Ile Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg1               5                  10                  15Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu
         20                  25                  30Gly Lys Ser Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe
     35                  40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr
 50                  55                  60Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu65                   70                  75                  80Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly
             85                  90                  95Cys Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser
         100                105

Claims (45)

1、一种组合物，包含与具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽特异性反应的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，或其F(ab′)2，F(ab′)，F(ab)片段或嵌合抗体。
2、权利要求1的组合物，其中所述抗体用一检测标记物标记。
3、权利要求2的组合物，其中所述检测标记物是一种放射性同位素。
4、权利要求1的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。
5、权利要求1的组合物，其中所述抗体选自MAb2F8，MAb4A5，MAb4E10，MAb5F12，MAb4H4，MAb3C10或其F(ab′)2，F(ab′)，F(ab)片段。
6、权利要求1的组合物，其中所述抗体是MAb4A5，其F(ab′)2，F(ab′)或F(ab)片段。
7、一种组合物，包含干扰由VEGF受体—2介导的VEGF—D活性的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，或其F(ab′)2，F(ab′)，F(ab)片段或嵌合抗体。
8、权利要求7的组合物，其中所述抗体不干扰由由VEGF受体—2介导的VEGF活性。
9、权利要求7的组合物，其中所述的抗体不与VEGF—C结合。
10、权利要求7的组合物，其中所述的抗体干扰VEGF—D与VEGF受体—3的结合。
11、权利要求7的组合物，其中所述的抗体是人源化抗体。
12、权利要求7的组合物，其中所述抗体是MAb4A5，或其F(ab′)2，F(ab′)或F(ab)片段。
13、制备权利要求1的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
a)用—种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)将免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
c)筛选步骤b)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其与具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽的特异结合活性；
d)在一种培养基中培养产生与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽有特异结合活性的MAb的杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及
e)从培养物上清中回收所述单克隆抗体。
14、权利要求13的方法，其中所述免疫活性哺乳动物是小鼠。
15、权利要求13的方法，其中所述免疫活性哺乳动物是大鼠。
16、一种产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
17、一种制备产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤的方法，包括如下步骤：
a)用一种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)获得免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞；
c)将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
d)筛选步骤c)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其与具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽的特异结合活性；
e)培养步骤d)的产生与具有图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽有特异结合活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
18、检测生物学样品中的VEGF—D的方法，包括将所述样品与权利要求1的抗体接触，并检测所述抗体的结合的发生。
19、用于VEGF—D的诊断或预后试剂盒，包括权利要求1的抗体和用于检测所述抗体的结合的手段。
20、一种药物组合物，包含权利要求1的抗体和药物可接受的载体或佐剂。
21、制备权利要求7的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
a)用一种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)将免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
c)筛选步骤b)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其VEGF—D干扰活性；
d)培养产生步骤c)的具有VEGF—D干扰活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及
e)从培养物上清中回收所述单克隆抗体。
22、权利要求21的方法，其中所述免疫活性哺乳动物是小鼠。
23、权利要求21的方法，其中所述免疫活性哺乳动物是大鼠。
24、产生权利要求7的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
25、制备产生权利要求7的单克隆抗体的杂交瘤的方法，包括如下步骤：
a)用一种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)获得免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞；
c)将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
d)筛选步骤c)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其VEGF—D干扰活性；
e)培养步骤d)的产生干扰VEGF—D的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
26、一种干扰VEGF—D的选自血管通透性、内皮细胞增殖、血管生成、淋巴血管生成和内皮细胞分化的至少一种生物学活性的方法，所述方法包括给予有效干扰生物学活性的量的权利要求7的抗体。
27、一种在哺乳动物中干扰选自血管生成、淋巴血管生成和新血管化的至少一种生物学活性的方法，包括给予所述哺乳动物有效干扰血管生成、淋巴血管生成或新血管化的量的权利要求7的抗体。
28、在选自癌症、糖尿病性视网膜病、银屑病和关节病的哺乳动物疾病中干扰选自血管生成、淋巴血管生成和新血管化的至少一种生物学活性的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效干扰血管生成、淋巴血管生成或新血管化的量的权利要求7的抗体。
29、检测生物学样品中的VEGF—D的方法，包括将所述样品与权利要求7的抗体接触，并检测所述抗体的结合的发生。
30、在哺乳动物中调节血管通透性的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效调节血管通透性的量的权利要求7的抗体。
31、用于VEGF—D的诊断或预后试剂盒，包括权利要求7的抗体和用于检测所述抗体的结合的手段。
32、用于治疗哺乳动物中由于血管通透性增加导致的液体在心脏和/或肺中蓄积的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效降低血管通透性的量的权利要求7的抗体。
33、一种药物组合物，包含权利要求7的抗体以及药物可接受的载体或佐剂。
34、一种组合物，包含干扰VEGF—D与VEGF受体—3的结合的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，或其F(ab′)2，F(ab′)，F(ab)片段或嵌合抗体。
35、权利要求34的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。
36、权利要求34的组合物，其中所述抗体是MAb4A5，或其F(ab′)2，F(ab′)或F(ab)片段。
37、一种干扰由VEGF—D诱导的生物学活性的药物组合物，包含权利要求34的抗体以及药物可接受的载体或佐剂。
38、一种成像组织中的淋巴脉管系统的方法，包括将组织与权利要求34的抗体接触，并检测所述抗体的结合的发生。
39、制备权利要求34的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
a)用一种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)将免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
c)筛选步骤b)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其VEGF—D结合的干扰活性；
d)在一种培养基中培养产生步骤c)的具有VEGF—D结合干扰活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及
e)从培养物上清中回收所述单克隆抗体。
40、产生权利要求34的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
41、制备产生权利要求34的单克隆抗体的杂交瘤的方法，包括如下步骤：
a)用一种免疫原免疫接种免疫活性哺乳动物，该免疫原包含具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽或其片段；
b)获得免疫接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞；
c)将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；
d)筛选步骤c)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，测试其VEGF—D结合干扰活性；
e)培养步骤d)的产生干扰VEGF—D结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
42、鉴别干扰VEGFR—3和VEGF—D之间的相互作用的化合物的方法，包括如下步骤：
a)将具有VEGFR—3的胞外域的多肽施加于—基质上，
b)在待鉴别的化合物的存在下，将步骤a)的基质与VEGF—D保温，以及
c)检测VEGFR—3与VEGF—D之间的相互作用。
43、一种组合物，包含与VEGF—D和VEGF—C交叉反应的抗体。
44、权利要求43的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。
45、权利要求43的组合物，其中所述抗体是MAb4E10，或其F(ab′)2，F(ab′)或F(ab)片段。
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