CN1367845A - 平行的配体指数富集系统生成法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共生成得自两种或更多种反应物的产物与能够促进制备该产物的反应的核酸的方法。本发明另外公开了由所述方法制备的产物和促进性核酸。

Description

平行的配体指数富集系统生成法

发明领域

本发明涉及从两种或更多种反应物制备产物的方法，其中反应物之间的反应，优选是成键，是由具有促进性能的核酸调节的。本发明还包括由该方法制得的产物。更为具体地说，本发明涉及共生成促进性核酸和由所述促进性核酸的调节而装配的产物的方法。本发明另外涉及鉴定具有促进性能的核酸的方法并涉及所述核酸。

发明背景

已经开发出与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外评价的方法。将该方法，配体指数富集系统生成法(Systematic Evolution ofLigands by Exponetial Enrichment)称为SELEX，在以下文献中对其进行了描述：序列号为07/536428的美国专利申请，标题为“配体指数富集系统生成法”，现已放弃；序列号为07/714131的美国专利申请，1991年6月10日申请，标题为“核酸配体”，现为美国专利第5475096号；序列号为07/931473的美国专利申请，1992年8月17日申请，标题为“鉴定核酸配体的方法”，现为美国专利第5270163号(参阅WO 95/19813)；所有这些文献引入本文作参考。这些申请在本文中总称为SELEX专利申请，它们描述了全新的制备任何期望的靶分子的核酸配体的方法。

SELEX方法包括从候选寡核苷酸混合物中的选择，以及采用相同的一般选择流程的结合、分离和扩增的逐步重复，以实际上达到任何期望的结合亲合力和选择性的标准。SELEX方法从核酸混合物开始，所述核酸混合物优选包括随机序列片段，包括以下步骤：将该混合物在有利于结合的条件下与靶接触，将已特异性结合到靶分子上的核酸与未结合的核酸分离，解离核酸-靶复合物，扩增从核酸-靶复合物中解离的核酸以得到配体富集的核酸混合物，然后重复结合、分离、解离和扩增的步骤，进行所期望次数的循环以得到对靶分子具有高度特异性的高亲合力核酸配体。

本发明者已经认识到SELEX方法表明核酸作为化合物可以形成一系列形状、大小和构型，并具有比在生物系统中所表现的功能宽泛得多的结合和其它功能。

多年的定理是核酸主要起信息作用。通过应用SELEX，本发明者已明晰核酸具有与蛋白质类似的三维结构多样性。同样，本发明者已认识到SELEX或类似SELEX的方法可以用于鉴定能促进任何所选择的反应的核酸，那样任何既定的靶的核酸配体可以被鉴定。理论上，在大约10¹³到10¹⁸的核酸的候选混合物中，本发明者假定至少有一种核酸以适于促进多种物理的和化学的相互作用的形状存在。

目前的研究只鉴定了少量的核酸，它们只具有促进能力中的小部分。已知少数的RNA催化剂(Cech，1987.科学236：1532-1539和McCorkle和Altman(1987)J.Chem.Education 64：221-226)。目前仅表明这些天然存在的RNA酶(核酶)作用于寡核苷酸底物。另外，这些分子作用于小范围的可能化学事件，因此它们在很大程度上与磷酸二酯键的缩合/水解非常相关，除了在蛋白质生物合成中可能涉及RNA之外。尽管目前的研究致力于鉴定RNA或DNA催化剂，但很少已经鉴定成功。已观察到磷酸二酯裂解、氨酰酯的水解(Piccirilli等，1992，科学256：1420-1424)、寡核苷酸的3′OH与催化剂的5′三磷酸端的连接(Bartel和Szostak，1993.科学261：1411-1418)、酰胺断裂(Dai等，1995.科学267：237-40)、联苯异构酶活性(Prudent等，1994.科学264：1924-1927)和多核苷酸激酶活性(Lorsch和Szostak，1994.自然371：31-36)。Illangasekare等(科学(1995)267：643-47)描述了第一种催化碳氧成键的RNA分子。目前已知的核酸催化剂具有某些与其在成键/裂键反应中的效力相关的缺陷。这些缺陷是它们比蛋白酶作用慢，而且如上所述，它们作用于小范围的可能化学事件。

已将基本SELEX方法进行改进以实现多种特定的目的。例如，序列号为07/960093的美国专利申请，1992年10月14日申请，标题为“根据结构选择核酸的方法”，现已放弃(参阅美国专利第5707796号)，描述了SELEX与凝胶电泳结合，用以选择具有特定结构特征的核酸分子，如硬折DNA。序列号为08/123935的美国专利申请，1993年9月17日申请，标题为“核酸配体的光选择”，现已放弃(参阅美国专利第5765177号)，描述了基于SELEX的用于选择含有能与靶分子结合和/或光致交联和/或使靶分子光致失活的光反应性基团的核酸配体的方法。公开号为WO 95/08003的待审PCT申请，1994年12月19日申请，它是序列号为08/123935的美国专利申请的CIP，引入本文作参考，该文献公开了鉴定某种含有5-碘尿嘧啶残基的共价结合到HIV-1 Rev蛋白上的核酸序列。序列号为08/134028的美国专利申请，1993年10月7日申请，标题为“区分茶碱和咖啡因的高亲合性核酸配体”，现已放弃(参阅美国专利第5580737号)，描述了一种用于鉴定能区分密切相关的分子的高度特异性核酸配体的方法，将其称为逆SELEX。序列号为08/143564的美国专利申请，1993年10月25日申请，标题为“配体指数富集系统生成法：SELEX方案”，现已放弃(参阅美国专利第5567588号)，描述了基于SELEX的方法，该方法实现了对靶分子具有高和低亲合力的寡核苷酸的高效分离。序列号为08/400440的美国专利申请，1995年3月8日申请，标题为“配体指数富集系统生成法：化学SELEX”，现在为美国专利第5705337号，描述了用于将核酸配体共价连接到其靶上的方法。

SELEX方法包括对含有赋予配体改善的特征如体外稳定性或改善的转运特征的修饰的核苷酸的高亲合性核酸配体的鉴定。这种修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。在序列号为08/117991的美国专利申请中描述了SELEX鉴定的含有修饰的核苷酸的核酸配体，该专利于1993年9月8日申请，标题为“含有修饰的核苷酸的高亲合性核酸配体”，现已放弃(参阅美国专利第5660985号)，该文献描述了含有在嘧啶的5-和2′-位被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。上述序列号为08/134028的美国专利申请描述了含有一种或多种在2′-氨基(2′-NH₂)、2′-氟和/或2′-O-甲基(2′-OMe)被修饰的核苷酸的高度特异性核酸配体。序列号为08/264029的美国专利申请，1994年1月22日申请，标题为“通过分子内亲核置换制备已知的和新的2′修饰的核苷酸的新方法”，现在为美国专利第5756703号，描述了含有各种2′-修饰的嘧啶的寡核苷酸。

SELEX方法包括将选择的寡核苷酸与其它选择的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单元结合，分别如以下文献所述：序列号为08/284063的美国专利申请，1994年8月2日申请，标题为“配体指数富集系统生成法：嵌合SELEX”，现在为美国专利第5637459号；和序列号为08/234997的美国专利申请，1994年4月28日申请，标题为“配体指数富集系统生成法：混合SELEX”，现在为美国专利第5683867号。这些申请允许寡核苷酸的多种形状和其它性质、有效扩增和复制性质与其它分子的期望的性质的组合。所有上述描述对基本SELEX方法的改进的专利申请都引入本文作参考。

近来进行了一些采用组合化学作为发现新药的方法的尝试。设计了少数详细的生产具有多种不同结构的组合文库的方案。与已知的组合文库相关的结构包括前述的用于SELEX方法的核酸、肽(Brenner等，1992.PNAS 89：5381-5383；Needels等，1993.PNAS 90：10700-10704；Alper，1994.科学264：1399-1401；Longman，1994.In Vivo23-31，Fodor等，1991.科学251：767-773)，而更小的数量指有机小分子(Ohlmeyer等，1993.PNAS 90：10922-10926)。每一种已知的组合文库方法都存在着某些缺陷。

首先，某些用于制备肽或小分子组合文库的方案要求严格的记录保持系统(recordkeeping system)以记录发生在阵列/矩阵上任意点的化学事件。另外，没有扩增肽和有机小分子，因而在该文库中必须存在大量的每一种个体产物以能够对期望产物进行测试和鉴定。为了得到足够大的量的特定产物，组成阵列的反应必须高度有效。更为重要的是，为了进行这些方法，在阵列的同一部位不能存在产物及其副产物的混合物。多样性由多步骤的聚合组合产生，每一步骤由具有可预测结果的单一反应组成。但是，聚合组合的程度受产量和记录保持约束的限制。

小分子组合法的另一局限在于该方案通常排斥通过不对称反应产生的新立体异构中心的成键反应。通过消除不对称反应，这些方法不提供在单一步骤中能够产生的化学多样性。通常，不对称反应难以控制，因此如果在组合方案中包括形成新的手性中心的反应，则有可能产生外消旋产物混合物。当存在一个以上的手性中心时，非对映异构体产物混合物可能导致背景问题。例如，有可能引入期望的原子和基团用于组配，但是产物的手性是所期望性质的关键，而正确的对映异构体仅以占总数的少数的百分比存在。在这一实例中，很有可能未制得足够用以鉴定的量的正确对映异构体。另外，当不对称转化中含有多种反应物时，则不可能准确地预测各个单独反应的手性。因此，不可能通过传统的方法解决与外消旋混合物有关的难点。将不对称催化纳入常规的组合文库方法中所需的劳动和时间通常是不实际的。因此，通常排斥用不对称反应避免上述问题的发生。

但是，不对称反应包括所有成键反应类型的最有效的类型之一。在组合文库方法中缺少不对称反应明显地限制所能产生的产物的类型和该文库的范围。以下实施例表明了由不对称反应赋予的极广的多样性。一般来说，由反应物矩阵产生的可能产物的数目为M×2ⁿ，其中M＝反应物的数目，n＝手性中心的数目。考虑包括形成一个不对称键的成键反应的矩阵。可能产物的数目以该矩阵产物的两倍方式增长。注意对于每一个形成的键而言，存在产生两个手性中心的可能，因此对于单一转化而言，可能组合的数目为4或2²。考虑不对称反应的特定实例，狄尔斯-阿尔德反应，其中形成两个碳-碳键，且存在产生4个手性中心的可能。

对于狄尔斯-阿尔德反应，亲双烯体反应物两端如双烯反应物的两端一样偶联，这种相对立体化学将每个双烯/亲双烯体对的可能事件数目减少到2³。这意味着对于与10个双烯组合的单一亲双烯体而言，可以形成的可能产物分子的数目为1×10×2³＝80。从仅采用单一成键步骤的常规组合方法获得相同水平的多样性需要直接合成81种化合物。对于10×10反应物的阵列而言，标准组合方法得到100种化合物。将不对称狄尔斯-阿尔德反应阵列扩大到10×10个反应物则具有从初始的20种化合物得到800种新化合物的可能。目前的组合策略不能筛选所有可能的不对称转化产物，因为它一般不可能获得每一种期望产物。如上所述，消除不对称反应是常规组合文库方法的严重局限。

理想的组合文库方法与SELEX方法是互补的，其中收率不是关注点，因为存在扩增寡核苷酸产物和得到具有口服活性且生产相对便宜的有机小分子的能力。本发明将SELEX与新的方法组合，以产生大量的具有结构多样性的产物文库。本发明采用的方法克服了许多与其它组合文库方法有关的不足，并给出在未来药物发现中的革命性观念。

发明概述

本发明提供产物文库，所述产物文库同时包括相应的由一种或多种化学反应物生产该文库的每一成员所需的核酸促进剂。更为重要的是，可以从该产物文库鉴定具有期望特征的产物。本文将该方法称为平行SELEX，它是一种与SELEX类似的方法，用于产生这样的产物文库并接着鉴定具有所期望特征的产物。如在SELEX法中一样，提供了大量多样性核酸试验混合物，各个核酸偶联于化学反应物。本发明以以下的假设为前提：在足够大的核酸文库中，人们可以鉴定核酸试验混合物中能够调节连接于核酸上的化学反应物与游离化学反应物之间的化学反应的核酸。另外，在能够调节化学反应的核酸子集中，某些核酸对于产生每一种或相当部分的可能产物是高度特异性的。因此，产物文库含有给定的反应的至少一些可能产物。核酸提供对产物的促进特异性，从而产物提供对靶具有预期作用的特异性。

平行SELEX方法减轻了现有技术组合文库方法的许多缺陷。在其最为基本的形式中，平行SELEX方法包括通过使两种或更多种反应物接触形成产物文库，其中反应物之一偶联于能调节成键的核酸上；选择具有预期特征的产物；利用SELEX法鉴定产物以重复扩增。图1提供了平行SELEX方法的示意图。

本发明提供了从产物文库中鉴定期望产物的方法，其中为了其表现对靶预选功能的能力而选择所述期望产物，所述方法包括：制备包括各自具有随机序列区并各自与第一反应物相连的核酸的核酸反应物试验混合物；将所述核酸反应物试验混合物与游离反应物反应，形成包括与所述第一和游离反应物的反应形成的产物相连的核酸的产物文库；以及根据其表现所述预选功能的相对能力分离所述产物文库的成员，由此可以鉴定所述期望产物。

本发明提供包括作为至少一种偶联的反应物和游离反应物之间的反应的结果的产物混合物的产物文库，其中所述偶联的反应物连接于促进所述反应物之间的反应的核酸上。

平行SELEX方法不要求记录产物矩阵及其各自的化学事件，也不要求高效或快速的反应。这一优点是产物形成是由特定的核酸指导这一事实的结果。这一指导方法与其它组合文库方法中采纳的编码方法形成对照。可以容易地扩增特异性地促进期望产物形成的核酸，并在随后的生产循环中可靠地复制产物。这一方法允许最初发生大量的反应，其后一旦确定已形成表现出预期特征的产物则可以将其挑选出。通过这一方法，可以在欠缺具体结构信息的情况下选择产物。

平行SELEX方法可以包括采用不对称反应形成产物文库。与常规的组合文库方法不同，即使在反应起始处不可能预测其立体化学结果，仍可包括不对称反应。无需记录特异性化学以使SELEX方法有效。唯一的要求是核酸调节可能反应的总数中的至少一个有限子集。

在另一实施方案中，提供了促进性核酸。具有促进性质的核酸能调节化学反应如成键或裂键。可以以各种方式修饰核酸以包括提供有助于化学反应调节的附加电荷、极性、氢键、静电相互作用和流动性(fluxionality)的其它化学基团。其它化学基团可以包括，尤其是烷基、氨基酸侧链、各种辅因子和有机金属部分。本发明要求促进性核酸指导具有预期特征的产物的合成。

本发明涵盖含有本发明产物的药学组合物和该组合物的给予方法。本发明还涵盖含有本发明产物的诊断剂、农用组合物和生产组合物。

附图的简要说明

图1是平行SELEX方法的最基本形式的示意图。

图2A-D是SELEX方法的示意图，其中促进性核酸调节双烯和亲双烯体之间的一般狄尔斯-阿尔德反应。

图3A-E描绘了如何在平行SELEX方法中将连接序列用于扩大第二反应物分子的阵列。显示了与图2一致的16384种可能事件中的5种。

图4A-C是平行SELEX方法的示意图，其中促进性核酸调节酮和醛之间的一般成键醛醇缩合反应。

图5A-C描绘了图4中所述的混合的醛醇反应对产物的结构多样性的影响。A_1-10和B_1-10描绘了反应物。C_1-10、D_1-10、G_1-10和H_{1 -10}描绘了当A为亲核试剂而B为亲电试剂时形成的非对映体。E_1-10、F_1-10、I_1-10和J_1-10描绘了当B为亲核试剂而A为亲电试剂时形成的非对映体。仅显示非对映体，而各个结构具有相应的对映体。

图6A描绘了三种炔的环三聚反应得到取代的苯环。图6B描绘了图6A中所述的三种炔通过环三聚反应组配苯化合物的可能事件矩阵。图6C描绘了炔的环三聚反应的机理。仅显示了一种可能产物。

图7描绘了逆合成本发明典型产物的可能策略。

发明详述

平行SELEX方法提供产物文库，所述产物文库是通过将一集合体的偶联于核酸上的第一反应物与一集合体的游离化学反应物结合而形成的。偶联的核酸能调节生成产物文库的化学反应，并进而扩增该核酸，从而为该产物文库富集并从该产物文库鉴定具有预期的特征的产物。

可以将平行SELEX方法的最一般形式描绘成图1。通过将第一反应物(R)连接于每一试验混合物(含有10²-10¹⁸个随机序列的核酸)的核酸上来形成核酸-反应物试验混合物。用其它将与该第一反应物(R)结合的游离反应物(表示为三角形、五角形和六角形)处理该核酸-反应物试验混合物，形成不同产物。重要的是注意从核酸试验混合物(NA)中，分立的核酸序列将与促进不同形状的产物的形成有关，这些不同形状的产物如图1中序列-A、序列-B和序列-C所表示。这些产物可以在形状、活性或形状和活性两方面存在不同。通过与靶的结合或反应实现期望产物形状或活性的分离。蛋白质、小分子、脂质、多糖等都是靶(T)的实例。如图1所示，在与靶结合或反应之后，将连接于序列-B和序列-C的非反应性产物与序列-A分离并弃去。然后通过各种本领域技术人员已知的方法将核酸序列-A扩增。接着将序列A用于促进期望产物的组配，组配是通过促进在用起始反应物混合物处理时形成所选择的产物的特定反应而进行的。在典型的反应中，序列-A可以再连接到第一反应物上，但是并不是总是需要所述的再连接。这是一种理想化的情况，而在许多实例中，核酸促进剂可以从起始混合物中组配一种以上产物，但所有选择的产物将具有期望的与靶结合或化学反应的性质。I.定义

本文中某些用于描述本发明的术语定义如下：

“核酸”意指DNA、RNA、单链或双链DNA和RNA及任何化学修饰DNA和RNA。修饰包括但不限于提供其它化学基团的修饰，所述化学基团给各个核酸碱基或整个核酸引入附加电荷、极性、氢键、静电相互作用和流动性。这种修饰包括但不限于修饰的碱基如2′-位碱基修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、7-位嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺上的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化、异常碱基对结合如异碱基(isobase)、异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。修饰还可以包括强化核酸促进性质的修饰。修饰还可包括3′和5′修饰如端基封闭。在每轮扩增之后发生的修饰也与本发明相容。扩增后修饰可以在每轮扩增之后可逆或不可逆地加入。实际上本发明包括核酸的任何修饰。核酸的随机化部分的长度一般在8到800个核苷酸之间，优选在40到400个核苷酸之间。

“核酸试验混合物”为不同的随机化序列的核酸混合物，包括具有使其能调节化学健形成和/或断裂的形状的核酸。“核酸试验混合物”的来源可以是天然存在的核酸或其片段、化学合成核酸、酶促合成核酸或通过前述技术的组合制备的核酸。在优选的实施方案中，各个核酸具有环绕随机化区的固定序列以促进扩增过程。

“具有促进性质的核酸”或“促进性核酸”或“促进的核酸”或“核酸促进剂”指任何能调节或促进化学反应的核酸。化学反应可以是成键或裂键反应。本发明的优选的实施方案指成键反应。核酸不必表现出被认为具有促进性质的催化转换(turnover)。产物形成的反应速率可以通过核酸的存在增大，但是增大反应速率并不是促进性质的要求。促进性核酸折叠以使它的三维结构促进特定的化学反应。核酸可以单独或与其它直接偶联于该核酸的催化部分组合，或与其它可以在溶液中找到的催化部分组合来调节化学反应。其它的催化部分包括有机金属部分、金属离子等。核酸可以导致不同立体异构体的形成。核酸可以调节各种类型键的形成或断裂，包括但不限于缩合/水解反应、环加成反应(如狄尔斯-阿尔德反应、Ene反应和1，3偶极反应)、α，β-不饱和化合物的共轭加成、醛醇缩合、克莱森反应和肽、糖与脂质的糖基化。此外，当核酸修饰包括有机金属部分，可以发生其它可以形成对称或不对称产物的反应，它包括但不限于环丙烷化、环氧化、azridination、氢化、炔的环三聚反应、不饱和分子的[3+2]和[4+1]环加成和烯烃置换。

“反应物”指与核酸的热稳定性和化学稳定性相容的成键或裂键反应涉及的任何化学实体，包括上述的修饰的化学实体。术语反应物可以指单一化学实体或一类化合物，包括具有几种一般化学结构的几种反应物或具有不同的一般化学结构的几种反应物。反应物的分子量范围一般为2至1000，优选约为26至500。特别优选的反应物包括有机小分子如链烯、炔、醇、醛、酮、酯、羧酸、芳香族碳环、杂环、双烯、硫醇、硫化物、二硫化物、环氧化物、醚、胺、亚胺、磷酸酯、酰胺、硫醚、磺酸酯、卤代化合物。本发明还包括无机反应物。但是，在本发明的某些实施方案中，可以包括更大的反应物，如聚合物或蛋白质。所用化学反应物的选择可以随机或基于多种标准，这些标准包括期望产物的性质、该产物将具备的活性，或根据产物将要作用的靶的性质的信息。

“偶联的反应物”或“第一反应物”或“第一化学反应物”指上述偶联于核酸上以形成核酸-反应物试验混合物的反应物。第一反应物与核酸的偶联可以是共价的或非共价的。第一化学反应物可以是单一化学实体或一类化学分子，包括具有几种一般化学结构的几种反应物或具有不同的一般化学结构的几种反应物。例如，第一反应物可以是一种链烯(如1-丙烯)，或10种不同的链烯，或10种不同的链烯和10种不同的炔。

“游离反应物”或“第二反应物”或“游离化学反应物”指不与核酸偶联的反应物。反应可以包括一种以上游离反应物，如在环三聚反应中。游离反应物彼此或与偶联的反应物可能相同或不同。例如游离反应物可以是一种链烯(如1-丙烯)，或10种不同的链烯，或10种不同的链烯和10种不同的炔。

“核酸-反应物试验混合物”指各核酸偶联于第一化学反应物上的核酸的混合物。偶联可以是共价或非价的、直接的或在核酸与反应物之间有接头的。将核酸反应物试验混合物与一集合体的游离化学反应物接触，使产物文库能够形成。

“产物”指由一种或多种反应物之间由核酸调节的成键或裂键反应得到的化合物。在优选的实施方案中，产物一般在偶联的反应物和游离反应物之间形成。两种反应以制备产物的反应物不必是不同化学结构的反应物。本发明的产物优选是具有药用活性并表现出治疗效能或用作诊断试剂或农用试剂的有机小分子。产物的通常的分子量范围约为40至2000，优选约为100至1000。但是，在某些较低程度优选的实施方案中，产物可以是更大的分子，如肽、蛋白质、聚合物等。在某些较低程度优选的实施方案中，反应为裂键反应，并可以仅与偶联的反应物发生或在两种或更多种的反应物之间发生。

“产物文库”指通过偶联于促进性核酸上的反应物和优选至少一种游离反应物之间的化学反应形成的产物的集合。由于本发明的性质，产物文库可以含有多种具有不同化学结构的各种产物。

“能在靶上进行预选功能的产物”或“具有预定特征的产物”或“期望产物”指以预期的方式作用于靶的产物。对靶的预期作用的例子包括但不限于与靶结合、催化改变靶、以修饰/改变靶或靶功能活性的方式与靶反应，如在自杀抑制剂中的共价连接于靶、促进靶和另一分子之间的反应。作为一个实例，在产物文库中具有预定特征的产物是以比大部分产物更大的亲合力与靶结合的产物。在任何给定的产物文库中可以存在一种以上对给定靶具有预定特征的产物。具有预定特征的产物可以在与靶的结合亲合力或其它作用于靶的能力方面彼此不同。

“靶”指通过平行SELEX方法鉴定的产物以预期方式作用其上的任何化合物。靶分子可以是但没有限制地是蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织等。

特别优选的靶包括但不限于血管紧张肽转换酶、肾素、环加氧酶、5-脂肪氧化酶、IL-1β转换酶、细胞因子受体、PDGF受体、II型肌苷酸脱氢酶、β-内酰胺酶和真菌细胞色素P-450。靶可以包括但不限于缓激肽、嗜中性弹性蛋白酶、HIV蛋白，包括tat、rev、gag、int、RT、壳包核酸等、VEGF、bFGF、TGFβ、KGF、PDGF、凝血酶、茶碱、咖啡因、P物质、IgE、sPLA₂、红细胞、成胶质细胞瘤、血纤维蛋白凝块、PBMCs、hCG、凝集素、选择蛋白、细胞因子、IPC4、补体蛋白等。

“分离”意指可以根据核酸促进涉及与其相关的反应物，并生成预期产物的反应的能力而从大量试验混合物中分离核酸试验混合物或核酸-反应物试验混合物的任何方法。可以通过本领域已知的各种方法完成分离。滤膜结合、亲合层析、液-液分配、过滤、凝胶移位、密度梯度离心、分子量过滤分配、大小排阻层析、大小排阻膜分离和等电点聚焦都是适宜的分离方法的实例。分离方法的选择取决于靶和产物的性质，并可以根据本领域技术人员已知的原则和性质进行。

此外，起始分离步骤为分离与产物相连的核酸(和因此的促进性核酸)和仅与第一反应物相连的核酸(非促进性核酸)是合乎需要的。分离步骤可以通过多种本领域普通技术人员已知的方法实现，如分级柱法(sizing column)、亲合层析法等。在这样的分离步骤之后，富集核酸试验混合物，得到促进性核酸。

“扩增”意指增大一种分子或一类分子的拷贝的数目的任何方法或方法步骤的组合。在优选的实施方案中，扩增在试验混合物的成分被分离之后发生，且扩增的是与期望产物相连的促进性核酸。例如，可以通过三步反应进行RNA分子的扩增：制备选择的RNA的cDNA拷贝，利用聚合酶链反应以增加各个cDNA的拷贝数目，转录cDNA拷贝以得到具有与选择的RNA相同序列的RNA分子。本领域已知的任何反应或反应的组合可以适用，包括直接DNA复制、直接RNA扩增等，如本领域技术人员将认识到的。扩增方法应该导致扩增的混合物的部分本质上代表扩增前混合物中不同序列的部分。已知对核酸的许多修饰是与酶促扩增相容的。如果需要，可以在各轮扩增之后进行与扩增不相容的修饰。

“随机化”这一术语用于描述在所给的长度上大体上具有任何可能序列的核酸片段。随机化序列是各种期望的长度，其范围为约八到大于一百个核苷酸。制备随机序列片段的化学或酶促反应可以由于可能存在的未知偏差或核苷酸首选而不产生数学随机化序列。术语“随机化”代替“随机的”而被使用，以反映这种来自非理想化的偏差的可能性。在已知的技术中，例如连续化学合成已知未发生大的偏差。对于20个或更少个核苷酸的片段而言，任何可能存在的小偏差具有可以忽略的后果。单一合成的序列越长，任何偏差的影响越大。

可以通过例如改变合成反应中前体三磷酸核苷(或脱氧核苷)的摩尔比而有意地往随机序列中引入偏差。有意的偏差被期望或根据初步的结果，例如影响二级结构，向已知具有促进活性的分子引入偏差，引入某种结构特征。

“SELEX”方法包括选择以期望的方式与靶相互作用，如结合到蛋白上的核酸配体与扩增那些选择的核酸的组合。选择/扩增步骤反复循环允许从含有大量核酸的集合体中选择一种或少量的与靶发生最强烈相互作用的核酸。继续选择/扩增过程的循环直至获得选择的目标。在本发明中，采用SELEX方法以扩增与期望产物有关的核酸。

“平行SELEX”为这样的方法：其中将核酸试验混合物中的核酸偶联于化学反应物，然后在有利于促进成键的条件下与其它一集合体的游离化学反应物接触以生产产物文库。筛选该产物文库以鉴定具有预期特征的产物。可以测试该产物以预定的方式(例如结合到靶上，以某种方式修饰靶等)作用于给定靶的能力。然后可以将不期望的产物与期望产物分离。期望产物仍偶联于指导其合成的促进性核酸上。可以将促进性核酸与集合体的剩余物分离并如SELEX方法中所述进行扩增。可以将促进性核酸单独或和与其相连的期望产物一起分离。富集扩增的核酸，以得到能组配期望产物的核酸。然后将扩增的核酸再偶联于第一反应物上，与游离反应物再接触，合并SELEX方法的选择/扩增步骤的重复循环以合成、选择和鉴定期望产物。选择的核酸最终产生足量的期望产物，从而能够确定结构。II.反应A.核酸

平行SELEX方法取决于核酸调节产物形成的能力。该方法要求最初制备核酸试验混合物。一般来说，制备核酸试验混合物的基本原理和方法如前述的SELEX专利申请中已概括的，这些文献引入本文作参考。简单地说，制备不同序列的核酸试验混合物。该试验混合物中的各核酸一般包括固定序列区(即该试验混合物的每一成员在相同位置含有相同的序列)和随机化序列区。固定序列区为以下目的之一选择：(a)有助于在SELEX专利中详述的扩增步骤，(b)模仿已知调节反应的序列，(c)提高在该试验混合物中具有给定结构排列的核酸的浓度，或(d)促进第一反应物的连接。随机化序列可以是全部随机化(即在任何位置找到碱基的概率为1/4)或仅部分随机化(如在任何位置找到碱基的概率可以是零至百分之百之间的任意水平)。在核酸试验混合物中找到的核酸将包括那些能够适当折叠以特异性调节各种化学反应的核酸。

可以以多种方式将核酸试验混合物修饰以增大核酸具有促进性质的可能性。本发明所涵盖的修饰是引入其它具有正确的电荷、极性、氢键、静电相互作用或流动性和全部能采纳进行该反应所需的形状的化学基团的任何修饰。在不拘泥于任何理论的情况下，据信进行该反应的机理可以包括但不限于稳定反应过渡态、促进特定化学反应和以与偶联的反应物极相似的方式与游离反应物结合。可以促进核酸活性部位的修饰包括亲水部分、疏水部分、各种氧化态的金属原子、刚性结构、在蛋白酶活性部位发现的官能团如咪唑、伯醇、羧酸酯(盐)、胍鎓基团、氨基、硫醇等。此外，可以引入有机金属或无机金属催化剂作为核酸的其它化学基团，如可以引入氧化还原反应物一样。

可以以多种方式将核酸试验混合物的各组分修饰。适宜的修饰包括但不限于在核酸的各个残基上的修饰、在随机残基上的修饰、在所有嘧啶或嘌呤或所有特定碱基(如G、C、A、T或U)上的修饰，或每个核酸分子一种修饰。还认识到某些分子(如金属催化剂等)可以在溶液中，不偶联到核酸上，并有助于调节与核酸的调节作用相应的反应。据信只要偶联到第一化学反应物上的核酸在某些方面与调节化学反应相关，则这样的方法和产物都在本发明的范围内。还认识到修饰并非是本发明核酸的促进活性的先决条件。

在某些情况下，预选与靶结合的核酸可能是所希望的，在这一实施方案中，在反应物偶联到核酸集合体之前，使随机核酸集合体经历对靶分子的数轮(1-10)的SELEX。

i.用其它化学基团修饰核苷酸

可以以任何数目的方式修饰核苷酸，包括核糖和/或磷酸和/或碱基位置的修饰。在以下文献中描述了某些修饰：美国专利申请号08/117991，标题为“含有修饰核苷酸的高亲合性核酸配体”，现已放弃(参阅美国专利第5660985号)；美国专利申请第08/076735号，标题为“钯催化的碳-碳偶联的方法和产物”，现在为美国专利第5428149号，该文献引入本文作参考。在一个实施方案中，修饰是其中另一个化学基团偶联到嘧啶的5-位、嘌呤的7-或8-位，或糖的2′位的修饰。对于能被引入到各个核苷酸上的其它化学基团的类型没有限制。在优选的实施方案中，所得的修饰的核苷酸是可扩增的，或者可以在扩增步骤之后被修饰。

作为一个实例，而不以任何方式限制本发明，可以预想仿生促进性核酸。核酸修饰的一种选择包括使某些碱基的化学和物理性质更象蛋白质的修饰。可以对嘧啶和嘌呤核苷酸碱基进行某些修饰以使该核酸表现出具有类似于蛋白质的氨基酸侧链的“侧链”。有几种合成方法将其它化学基团，在本例中为氨基酸衍生物偶联到嘧啶的5-位或嘌呤的7-或8-位。在美国专利申请第08/076735号，现在的美国专利第5428149号、第08/347600号(现在的美国专利第5580972号)和第08/458421号(现在美国专利第5719273号)以及其它公开的过程中描述了在5-位修饰嘧啶的方法。已知大量修饰核酸的公开的过程，包括但不限于以下：Limbach.PA等，1994.Nucleic Acids Res.22：2183-2196，以及该文献中所引的文献；Hayakawa H等，1985.Tetrahedron 41：1675-83；Crouch GJ等，1994.NucleosidesNucleotides 13：939-44；Scheit KH，1966.Chem.Ber.98：3884；Bergstrom和Ruth，1976.J.Am.Chem.Soc.98：1587-89；Bergstrom和Ogawa，1978.J.Am.Chem.Soc.100：8106-12；Ruth和Bergstrom，1978.J.Org.Chem.43：2870；Bergstrom DE，等，1981.J.Org.Chem.46：1432-41；Bergstrom DE，1982.NucleosidesNucleotides 1：1-34；Crisp和Flynn，1990.Tetrahedron Lett.31：1347-50；Hobbs FW Jr，1989.J Org.Chem.54：3420-22；Hirota K等，1993.Synthesis 213-5；Nagamachi T等，1974.J.Med.Chem.17：403-6；Barton DHR等，1979.Tetrahedron Lett.3：279-80；Hirota K等，1992.J.Org.Chem.57：5268；Mamas P等，1992.Tetrahedron Lett.33：2413-16；Sessler JL等，1993.J.Am.Chem.Soc.115：10418-19；Long RA等，1967.J.Org.Chem.32：2751-56；Prakash TP等，1993.Tetrahedron 49：4035；Janokowski AJ等，1989.Nucleosides andNucleotides 8：339；Kumar和Buncel，1984.J.Inorg.Biochem.22：11-20；Moffatt JG，1979.在Nucleoside Analogues中，RT Walker，E De Clercq，F Eckstein编，pp.71-163纽约：Plenum Press；Townsend LB，1988.Chemistry of Nucleosides and Nucleotides pp.59-67纽约：Plenum Press；Verheyden JpH等，1971.J.Org.Chem.36：250-54；Wagner D.等，1972.J.Org.Chem.37：1876-78；Sproat BS等，1991.在Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach中，F.Eckstein编，pp.49-86.纽约：剑桥大学出版社；Lesnik EA等，1993.Biochemistry 32：7832-38；Sproat BS等，1991.Nucleic AcidsRes.19：733-38；Matsuda A等，1991.J.Med.Chem.34：234-39；Schmit C，1994.Synlett 238-40；Imazawa和Eckstein，1979.J.Org.Chem.44：2039-4；Schmit C，1994.Synlett 241-42；McCombie和Metz，1987.Tetrahedron Lett.28：383-6；Imazawa M等，1975.Chem.Pharm.Bull.23：604-10；Divakar KJ等，1990.J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1969-74；Marriott JH等，1991 Carbohydrate Res.216：257-69；Divakar和Reese，1982.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.l 1625-28；Maniott JH等，1990.Tetrahedron Lett.31：7485-88。

上述的氨基酸修饰的核苷酸可以代替天然核苷酸并被引入核酸试验混合物的序列中。用其它化学基团代替上述的氨基酸修饰的核苷酸也为本发明所涵盖。时常地，可以做如下的工作假设：修饰的核苷酸是最理想的向核酸试验混合物加入的。例如，如果所要调节的反应为由I类醛缩酶结构指导的醛醇缩合，则所需的其它化学基团可以是含有伯氨基基团的氨基酸衍生物以与羰基底物形成亚胺，以及其它碱性基团，从而促进用作反应中亲核试剂的烯胺的形成。

其它的核苷酸修饰包括将官能团偶联到增强核酸促进性质的核苷酸上。这种官能团可以参与生成促进性核酸的活性部位。所生成的活性部位可以有能力结合多种底物并以高精度调整主要促进功能。这些官能团应具有充足的构象游离度以调整反应物和活性部位的反应动力学以帮助成键。官能团包括极性和非极性基团，通常可作为酸、碱、亲核试剂、亲电试剂和金属配体的基团。通过以这种方式修饰核苷酸，可以产生具有适宜性质的所有可能类型的促进性核酸，这些性质包括但不限于溶剂化、pKa、极化性、动力学等，它们使核酸促进实际上任何类型反应物之间的相互作用得以发生。核苷酸可以在糖和/或碱基和/或磷酸部位被一种或多种以下官能团取代，这些官能团包括但不限于：

其中星号表示官能团偶联到核酸上的位点，n可以为任何整数，优选n为0-20，并且其中这样的化学基团也可包括在脂肪或芳香位置的取代。优选官能团是碱基取代基。

ii.用有机金属基团修饰核酸

本发明涵盖的另一种对核酸试验混合物的修饰为往组成核酸试验混合物的序列中引入有机金属试剂。在复杂有机结构的合成中采用有机金属催化剂使有机合成发生革命化。有机金属催化剂为任何能调节反应的金属和有机配体层。能组成配位层的配体是本领域技术人员已知的，它们包括嘧啶配体、磷化氢配体、肟配体、卟啉、异氰酸酯、氰酸酯、羧酸酯、硫醇、一氧化碳、链烯、酯等。有用的金属包括镍、铑、钴、钯、锆、铝、铁、镁、钛、钌、钼和硼。例如，已知吡啶镍配合物催化尿素水解；乙酸铑催化剂促进环丙烷化；钴配合物催化环三聚反应和[3+2]环加成；钯催化氢化作用和[3+2]环加成；钌和钼配合物催化烯烃置换。将这些反应组合在一起可以制备3、4、5、6和7元环，所有这些环已知在许多药用化合物的结构中有用。可以通过π-烯丙基钯催化剂制备更大的环。手性中心的形成是许多生物活性化合物的合成的关键，而且在许多情况下错误的对映体可能具有有害的药理学作用。通过钯和锆配合物已实现形成单一对映体的不对称氢化作用。

在这一实施方案中，将有机金属配合物连接到寡核苷酸上有几种可供选择的方法。有机金属配合物可以直接偶联到核苷酸碱基上，如在嘧啶的5-位。应完整地将修饰的寡核苷酸扩增。

在某些情况下，核酸和有机金属配合物之间的连接应该是可断裂的，保持寡核苷酸完整无损。可断裂的连接的实例包括但不限于光化学不稳定的接头、二硫化物和碳酸酯。这些连接化学已为本领域技术人员所熟知并用于将有机金属配合物偶联到核酸的5′或3′端或者核酸中的嘧啶残基的5-位。

另一可供选择的方法为采用可以被合成以包含有机金属配合物的弹夹寡核苷酸。该弹夹寡核苷酸实施方案包括具有与其相连的有机金属配合物的固定的核酸序列，所述有机金属配合物可在各轮选择的起始处被连接到核酸上。该核酸试验混合物的各成员具有相同的与该弹夹的固定序列互补的固定区。该盒式寡核苷酸可以避免对其它结合方法的需求。

将有机金属催化剂包埋在寡核苷酸内也是可取的。对于这些实施方案中的某些而言，可以在各轮扩增之后进行修饰。在将有机金属配合物包埋在寡核苷酸内的情况下，一个以上的可断裂的键可能是合乎需要的，并需使各个可断裂的键具有独特的化学性质。将联吡啶配体用作以下的方案的实施例。

X＝S-S

Y＝O-Si[CH(CH₃)₂]₂

DTT＝二硫苏糖醇

由于标记为A和B的寡核苷酸组分可以从载体上化学选择性地断裂，因此可以分别测定它们的序列。此外，A和B可以包括易于通过化学方法合成的相对短的序列。对某些有机金属配合物而言，在合成或转录后将金属引入是可取的。在这些情况下，可以将与金属结合的螯合配体如上所讨论地偶联到寡核苷酸上，并通过配体交换反应偶联到在核酸合成或扩增之后引入的金属上。

可以通过将官能团加到使有机金属配合物与核酸连接的催化剂上而实现将有机金属催化剂包埋到核酸内。通常，可以用将提高配体或任何结合的金属与核酸的亲合力的官能团修饰配体如乙酸乙酯、胺、羧酸酯(盐)、吡唑硼酸盐、卟啉、碳硼烷、硫醇、硫化物、膦类、亚磷酸盐、联萘酚、沙仑、噁唑啉和肟金属配位体修饰。可修饰金属配位体使其包括核酸结合基团，例如但不限于胺、酰胺、亚砜、磺酸酯(盐)、羟基、胍鎓、多元胺、putrescene或亚精胺。可以通过静电吸引实现将有机金属催化剂非共价偶联到核酸上，在这种情况下催化剂上的官能含有净正电荷。此外，可以通过引入插入核酸结构内但不是通过静电吸引而结合的基团来实现核酸与有机金属催化配合物的连接。另外，与核酸的大沟或小沟具有良好亲合力的基团是已知的，也可将其偶联到有机金属配合物的配体上。在以下的示意图中给出了可用作炔和链烯的环三聚反应的催化剂的有机金属辅因子的实例。

钴配合物A是一个可能的实例，通过为取代而活化羟基给出如B的核酸辅因子，钴配合物A为序列号为08/619228的美国专利申请的主题，该申请于1996年3月20日提交，现在为美国专利第5659069号，标题为“在水溶液中进行炔的环三聚反应的方法”，该文献引入本文作参考。用胍基丁胺取代B给出C，或用胍取代B给出D，这样得到具有能静电结合到核酸上的类型的基团的钴配合物。磷酸盐与正的胍基间的引力是为人熟知的，提供了大约3千卡/摩尔的结合能。另外的环戊二烯基或环辛二烯基配体插入核酸或与核酸的疏水接触将提高钴有机金属辅因子结合的亲合力和特异性。

从以上提供的实例可以看出，存在大量修饰核酸而使其能调节化学反应如成键或裂键的方法。本发明涵盖所有的核酸的修饰。B.反应物

在其最宽泛的意义上，术语反应物指任何与成键或裂键反应有关的与核酸的热稳定性和化学稳定性相容的化学实体。本发明不应受反应物类型的限制。以下类别的有机小分子为可能的反应物的非限制性实施例：链烯、炔、醇、醛、酮、酯、羧酸、芳香族碳环、杂环、双烯、硫醇、硫化物、二硫化物、环氧化物、醚和卤化物。反应物优选的分子量范围为2至1000，最优选的范围为26至500。如果期望产物是更大的分子，则反应物也更大，如肽、蛋白质和聚合物。反应物可含有一种以上所列的官能团并含有手性中心。一般来说，术语反应物代表一类由其化学反应性单元(如双烯、酯等)定义的化学反应物。作为一个实例，化学反应物可以为一类包括1-10ⁿ个该类的不同成员的反应物。任何为给定反应选择的反应物还可以包括几类反应物。

在确定用于平行SELEX方法的适宜的反应物的过程中的某阶段，必须鉴定靶和确定期望产物作用于该靶的作用模式。一旦进行了那种测定，即可以选择一类认为可能具有期望性质的产物。然后可选择适宜的可能产生期望类别的产物的反应物并将其引入到平行SELEX方法中。

可以随机地确定反应物的选择。但是，优选根据多种标准选择反应物，这些标准包括但不限于根据期望类别的产物选择反应物，其可以根据已知具有期望特征的化合物的类似性的最初结构假设、其它已知配体、计算机模拟、NMR和X-射线数据/结构、酶和化学足迹法试验来确定。一旦鉴定了一类产物，即选择反应物以使能够获得的变异性最小化。通常采用逆合成过程以选择可能的反应物。可以同时利用多种类别的反应物。

为了本发明的目的，将偶联到核酸上的反应物称为第一反应物或偶联的反应物。通常，第一反应物将与至少一种游离反应物在有利于促进成键的条件下接触，并且分析所得产物以确定它是否具有预期的特征。预想第一反应物可以与一种以上的其它反应物(即第二、第三、第四等反应物)发生化学反应以形成产物。还预想可以同时发生一种以上类型的反应。还预期多重反应可以同时或逐步发生，有可能利用多种核酸以促进不同部分的产物的形成。理想地选择反应物以便，取决于促进性核酸序列的特异性地产生产物的能力，生成产物文库。C.将反应物偶联到核酸上

平行SELEX方法要求第一反应物偶联到存在于核酸试验混合物中的具有促进性质的核酸上。第一反应物共价或非共价地偶联到核酸上。理论上这种偶联可以在核酸的任何位置。但是，为实际目的，偶联通常发生在核酸的5′或3′端。通常，偶联是通过连接反应进行的，但是任何已知的偶联反应都是可以接受的。偶联可以是直接的，如可用5′GMP连接，用末端转移酶进行3′双脱氧等。

核酸和反应物之间的偶联还包括接头基团。这种接头基团可以使核酸以更有利的构象折叠，以使其能更好地与反应物相互作用而调节反应。接头基团可以使第一反应物到达折叠核酸的整个表面和催化口袋。

接头基团可以是任何适宜的间隔部分。接头基团应足够长，优选由聚合物单元组成，以产生能使各种反应物进入折叠核酸的整个表面和和结合口袋的弹性臂。这种接头的最优大小取决于核酸的大小。一般来说，接头基团的大小应该在10至1000埃之间，优选在50至300埃之间。核酸-反应物试验混合物中的接头基团是可以变化的，以选择对期望反应的最佳长度。接头基团在反应条件下还应容易被溶剂化。适宜的接头基团的例子为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯和多肽。

接头基团和核酸之间的连接优选是可断裂的，并保持核酸完整无损。适宜的可断裂的接头包括但不限于光化学不稳定的接头、二硫化物、顺式二醇和碳酸酯(盐)。该连接还可用酶如脱氧核糖核酸酶和蛋白酶断裂。

此外，该连接可以采用序列号为08/234997的美国专利申请中所述的夹板混合SELEX(Splint Blended SELEX)方法，该专利申请于1994年4月28日提交，标题为“配体指数富集系统生成法：混合SELEX”，该文献引入本文作参考。D.产物形成

当第一反应物和至少一种第二反应物相互作用并形成产物时，或当第一反应物以某种在与其相连的核酸的促进下的方式断裂时，发生化学反应。任何数目的化学反应都与平行SELEX方法相容。仅有的要求是反应由偶联到第一反应物上的核酸来调节。优选这种核酸的调节对反应物和期望产物是特异性的，然而，情况并不总是这样的。化学反应包括成键和裂键反应。本发明涵盖各种成键反应，以实施例的方式说明成键反应，这些实施例包括缩合/水解反应、环加成反应如狄尔斯-阿尔德和Ene反应、α，β-不饱和化合物的共轭加成、醛醇缩合和有机小分子、肽、糖和脂质的糖基化。此外，当将试验混合物中核酸被修饰以将有机金属催化剂包含于核酸时，可发生其它反应，这些反应包括但不限于炔和烯的环丙烷化、氢化反应、环三聚反应、不饱和分子的[3+2]和[4+1]环加成和烯烃置换，所有这些反应都可以形成不对称分子。本发明涵盖这些反应的单独与以任何组合形式的一起使用。本发明另外涵盖连续反应，其中可以用两种或更多的反应物制备第一产物，然后那种产物可以成为“反应物”，与其它游离反应物形成第二产物等。

本发明还包括裂键反应。裂键反应具有几种实施方案，包括但不限于第一反应物断裂形成与靶相互作用的产物，断裂第一反应物以使其能够更好地与第二反应物反应从而形成新的产物等。

本发明还包括这种实施方案，其中将通过本发明方法形成的产物连接到其它分子上，这些分子包括但不限于标记物、抗体、其它有机小分子等。

反应可在多种本领域普通技术人员已知的条件下发生，反应条件符合核酸的稳定性的要求。反应可以在任何缓冲或非缓冲的含水溶剂如水、Tris、HEPES等，或在含有适宜的烷基铵或类似的抗衡离子的有机溶剂系统如含三乙铵盐的醇/水、DMSO、二氧六环/水、乙腈/水、DMF/水中进行。或者，对于某些应用来说，水-有机二相溶剂系统可能是适宜的。一般的温度范围为-10℃至100℃，优选为10℃至50℃。随机化的核酸-反应物试验混合物的浓度范围一般为1皮摩尔/升至10毫摩尔/升，优选为1至100微摩尔/升，而第二反应物的浓度范围一般为1微摩尔/升至10摩尔/升，优选为10微摩尔/升至10毫摩尔/升。E.分离具有预期特征的产物

一旦发生化学反应，必须从产物文库中筛选出具有预期特征的产物。如上所述，预期特征可以包括结合到靶上、催化改变靶、以改变/修饰靶或靶的功能活性的方式与靶发生化学反应，以及如同在自杀抑制剂中一样共价连接到靶上。

靶可以是任何感兴趣的化合物。靶可以没有限制地是蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织等。特别优选的靶包括不限于血管紧张肽转换酶、肾素、环加氧酶、5-脂肪氧化酶、IL-1β转换酶、细胞因子受体、PDGF受体、II型肌苷酸脱氢酶、β-内酰胺酶和真菌细胞色素P-450。靶可以包括但不限于缓激肽、嗜中性弹性蛋白酶、HIV蛋白，包括tat、rev、gag、int、RT、壳包核酸等、VEGF、bFGF、TGFβ、KGF、PDGF、凝血酶、茶碱、咖啡因、P物质、IgE、sPLA₂、红细胞、成胶质细胞瘤、血纤维蛋白凝块、PBMCs、hCG、凝集素、选凝素、细胞因子、IPC4、补体蛋白等。

筛选产物的条件不限于在以上D部分所述的产物形成的条件。筛选条件对本领域普通技术人员是已知的。

可以通过本领域普通技术人员已知的方法将具有预期特征的产物与产物文库的剩余部分分离，所述产物仍连接在促进其形成的核酸上。关键是从整个产物文库中分离出期望产物，但所连接的核酸不化学降解，从而使核酸是可扩增的。然后可以扩增核酸，扩增时核酸或者仍连接在期望产物上，或者将核酸于期望产物分离之后进行扩增。

在最优选的实施方案中，期望产物作用于靶，但在连接到期望产物上的核酸与靶之间不发生任何相互作用。核酸促进连接其上的反应物和游离反应物之间的反应，得到期望产物，而且核酸还是可扩增的，从而使期望产物可以随后得以复制并最终从巨大的产物文库中被鉴定。但是，在这一优选的实施方案中并没有预期核酸与靶直接相互作用。

核酸可以在与靶接触之前被修饰以确保其不与靶相互作用。这种修饰可以采取多种方式，包括制备核酸双链以使其较低程度地能与靶相互作用。另一种修饰包括pH可逆的乙二醛变性。在某些较低程度优选的实施方案中，核酸可独立或与期望的其合成受到促进的产物协同作用于靶。在这一实施方案中，最终的产物可以是该产物与相连的核酸的组合。

在一个实施方案中，产物结合于靶，并可以采用多种方法将结合的核酸产物-靶复合物与未结合的产物分离。这些方法包括硝酸纤维素滤膜结合、柱层析、过滤、亲合层析、离心和其它熟知的方法。简单地说，对该产物文库施用分离方法，如其上结合靶的柱。所有未形成产物或与不期望的产物相连的核酸将通过该柱。可以采用逆SELEX除去其它不期望的产物(例如与靶交叉反应的产物)。期望产物结合到柱上，并可通过改变柱条件(例如盐等)将其洗脱，或者可以将与期望产物相连的核酸从产物断裂并直接洗脱。

此外，可以将与靶反应的产物和不与靶反应的产物分离。在一个实施例中，可以在非常严格的条件下将共价连接到靶上的产物(如自杀抑制剂)洗脱。然后可用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶或其它适宜的试剂处理所得产物-靶复合物以断裂连接而释放出与期望产物相连的核酸。释放出的核酸能够被扩增。

在另一实施例中，期望产物的预期特征为产物转移化学基团(如酰基转移)至靶并由此使靶失活的能力。可以拥有所有的产物都具有硫酯化学基团的产物文库。在与靶接触时，期望产物将化学基团转移到靶上，并伴随着将期望产物从硫酯变为硫醇。因此，鉴定现在为硫醇(而不是硫酯)的产物的分离方法将能够选择期望产物并扩增与其相连的核酸。

存在本领域普通技术人员已知的其它与本发明相容的分离和筛选的方法。在一个实施方案中，可以通过许多常规的方法将产物分成部分，然后分析各部分的活性。这些分部分方法可以包括大小、pH、疏水性等。

如上所述，SELEX方法可以包括可被引入用于成功地分离期望产物的其它方案，包括但不限于光SELEX、逆SELEX等。

根据期望功能选择有机小分子是平行SELEX方法所固有的；这可以推广至选择具有期望功能和特异性的有机小分子。在选择过程期间可以要求特异性，首先提取与能与非期望的“靶”相互作用的产物相连接的RNA(负选择或逆选择)，然后用期望的靶正选择。作为一个实例，已知真菌细胞色素P-450抑制剂与哺乳动物P-450发生某种程度上的交叉反应(导致严重的副作用)。真菌细胞色素的高度特异性的抑制剂可以选自平行SELEX方法产生的产物文库，其步骤为首先除去能与哺乳动物细胞色素相互作用的那些产物，然后保留能与真菌细胞色素相互作用的剩余产物。

在一个实施方案中，在分离步骤之前，以更低程度可能与靶相互作用的方式处理核酸。作为一个实例，可以在分离前使核酸形成双链或采用pH可逆的乙二醛变性处理核酸。在另一实施方案中，在将反应物偶联到核酸上之前，可以通过逆SELEX分离核酸试验混合物以除去直接作用于靶的核酸。F.扩增

如在基本SELEX方法中所述的采用本领域普通技术人员已知的方法进行指导具有期望特征的产物的合成的核酸的扩增。如果需要或要求，可以在扩增之前除去任何修饰或其它添加的特征(如连接基团)。聚合酶链反应(PCR)为一种示范性的扩增核酸的方法。关于PCR方法的描述在以下文献中找到，例如Saiki等，1985，科学230：1350-1354；Saiki等，1986.自然324：163-166；Scharf等，1986.科学233：1076-1078；Innis等，1988.Proc Natl Acad.Sci 85：9436-9440；以及美国专利第4683195号(Mullis等)和美国专利第4683202号(Mullis等)。PCR的基本形式包括期望单链DNA的复制的反复循环，或RNA的cDNA复制，采用与ssDNA的3′和5′端互补的特定寡核苷酸引物，用DNA聚合酶延伸引物，以及DNA变性。从一种引物的延伸产生的产物用作从其它引物延伸的模板。本发明涵盖其它已知的扩增方法。

链置换扩增(SDA)为可供选择的分离方法的一个实例(Walker等，1992.Proc.Natl. Acad. Sci.89：392-396；Walker等，1992.核酸研究20：1691-1696)。SDA为一种从ssDNA扩增ssDNA的技术，该技术与PCR有某些类似处。与PCR相似，SDA利用一套两个引物扩增位于引物之间的DNA并要求DNA聚合酶的活性以实现它。SDA还利用指数扩增方案，其中新合成的DNA用作进一步DNA合成的模板。与PCR不同的是，SDA在恒定的温度(～40摄氏度)下进行，并取决于某类聚合酶在其合成新链时将先前合成的DNA链从模板上置换下来的能力。这取代了PCR中的热变性步骤。SDA要求附加酶，限制性内切核酸酶的作用以在dsDNA模板上产生切口。在该切口的3′侧的DNA用作新的DNA合成的引物，而该切口的5′侧的DNA被DNA聚合酶置换进入溶液，它可用一种SDA引物退火并用作更多的DNA合成的模板。如果DNA配体是所期望的，则SDA对平行SELEX方法而言具有许多优点。SDA方法采用DNA聚合酶Klenow exo(-)用于合成DNA，一种已知容易地添加修饰的dNTP的较好表征的聚合酶。由于被较好地表征，修饰dNTP作出合理的决定应该更容易。应该设计一种简单的方案，其中引物延伸取代连接物，以将DNA配体连接到受限的反应基团上。SDA具有与PCR类似的扩增性质(对于＜200nt长度的DNA来说)，但可以利用较低程度专业化的装置在更短的时间内完成。

然后使扩增核酸经受任何所需的扩增后修饰，再次偶联到第一反应物上，并如上述继续该方法。多次重复该方法以满足富集具有适宜的促进活性的核酸的需要和/或直至获得具有最大期望特征的期望产物。完全有可能一轮平行SELEX方法即是获得具有期望特征的产物的全部所需。可以通过本领域普通技术人员理解的多种方法确定终点，包括结合曲线、由IC₅₀值确定的抑制作用、失活率、毒性分布图、生物利用度、药物动力学等。G.分析期望产物

在扩增核酸促进剂和产生足量期望产物之后，可以通过本领域普通技术人员已知的常规的光谱方法解析一种或一系列期望产物的结构。为了做这项工作，最初的反应条件必须被适当地重复。第一反应物应该被再偶联到核酸促进剂上，所得的核酸-反应物与一集合体的第二反应物混合，所得的期望产物形成并被分离。使这种方法最为有效的假设是核酸将特异性地促进单个反应或至少相对少数目的反应，包括期望的反应。常规的表征方法包括但不限于NMR光谱法、质谱法、HPLC偶联的光谱法、红外光谱法、紫外/可见光谱法、圆形二色性、旋光测定法、X-射线结晶法。一旦鉴定了期望产物的结构，则可以通过标准化学合成方法或本文所列的采用促进性核酸进行生产的方法来大量生产产物。III.一般实施例

本文包括以下的一般实施例，用于附加说明平行SELEX方法。图1列出了平行SELEX的最基本的方案。以下的实施例更为详尽地说明了本发明涵盖的反应的少量样本。提供这些实施例的目的仅在于说明本发明而并不试图以任何方式对本发明进行限定。A.狄尔斯-阿尔德反应

以下的讨论描述了如何利用图2A-2D所描绘的狄尔斯-阿尔德反应共生成RNA促进剂和结合到一般靶上的环己烷小分子产物。该平行SELEX实施例的另一形式可以使用DNA，并且在某些情况下DNA较RNA优选。

起始RNA(图2A的A)含有3′和5′固定区使其有连接到PEG接头上的转录和结合位点，该PEG接头而后连接到第一反应物亲双烯体上。起始RNA(A)将具有由约4^N个不同序列组成的随机化区，其中N为该RNA序列中核苷酸的数目；其确切的数目将取决于随机区的长度和制备它的RNA的合成规模。PEG接头可含有足够数目的聚合单元以使其有能使第一反应物亲双烯体接近折叠RNA的整个表面和结合口袋的弹性臂(图2A的C和D)。为了清楚起见，将偶联到第一反应物上的起始RNA(A)描绘为线性结构。实际的RNA结构将由不同的由C和D表示的拆叠基元组成。

在该实施例中，步骤1将包括一集合体的标记为B_1-10的10种第二反应物双烯底物，其中基团R¹、R²和R³不是氢。并不存在该集合体不能扩大到包括基团R¹、R²和R³中的一种或全部为氢的第二反应物双烯的原因。这仅将导致形成更少数目的立体中心。结构C和D代表了接近第一反应物亲双烯体的两种可能事件。各区域异构体(regioisomer)将具有四种可以形成的可能立体异构体，而且如果产生所有异构体，则11种化合物会转化成80种(图2B)。图的结构元素α和β代表RNA中理论上的凸起，该RNA可与第二反应物双烯或第一反应物亲双烯体相互作用以确定第二反应物双烯的取向和在过渡态接近第二反应物双烯。例如，对于E_1-10来说，如果R³比R²小，因为该RNA特征β和亲双烯体基团R²之间的位阻影响，则双烯优选的取向将有利E/E^*和F/F^*的形成，而不是G/G^*和H/H^*。对于途径C，将形成对映体E/E^*和F/F^*。吸引相互作用如在亲双烯体羧酸酯氧和标记为α的RNA区间的H-结合将促进内型产物的形成。R¹和标记为β的RNA表面之间的引力还有利于内型攻击。相反，该RNA结构特征α和β与羧酸酯(盐)和亲双烯体的R¹之间具有排斥的相互作用，导致形成内型产物。注意E/E^*和F/F^*对之间的关系为非对映异构体，因而尽管具有相同的取代基R¹、R²和R³，它们也将具有不同的物理性质。对于途径D，将形成对映体G/G^*和H/H^*，且G/G^*和H/H^*对之间的关系为非对映体。但是，因为寡核苷酸具有固有的手性，因而RNA促进位点将与对映体对的过渡态具有不同能量的非对映体相互作用，从而即使在能量差异很小时(ΔΔG3-4千卡/摩尔)仍允许有高度的对映选择性。

步骤2描述了环己烯期望产物的选择(图2C)。如果靶为蛋白质而选择的期望产物用于结合靶，则在初始循环期间步骤2可以在过量的靶蛋白中进行，然后随环己烯期望产物富集的增加降低蛋白质浓度。靶蛋白的实例包括酶、激素、细胞受体、细胞粘附分子等。在竞争性测试中将找到亲合力最高的期望产物。这可以在对整个基团的选择的最初导致如E/E^*和F/F^*。对于这一实施例，假设选择某种对映体组，假定为E，因为它更紧密地结合到靶蛋白上，且为了举例起见，仅有10种可能结构中的5种具有类似的亲合力。E1-5描述了五种与该蛋白质结合的“胜利者”。(注意不存在相信不能获得来源于各非对映体的期望产物的先验原因)。

将选择的期望产物和与其连接的、共生成的RNA促进剂与不期望的产物分离，并通过标准SELEX过程的步骤3到5扩增RNA(图2C和2D)。在步骤5之后，已富集了用于促进特异性地形成化合物的E基团的活性的RNA。如图2C的E所示，在步骤5之后所得的RNA结构在被折叠时为形成环己烯产物的活性催化剂。在这一点可以有远多于5个的RNA序列。为了进行随后的SELEX循环，要求有步骤6，其中连有第一反应物亲双烯体的最初的PEG接头结合到新富集的RNA集合体上。重复步骤1-6可以进一步富集在步骤5之后所得的RNA的促进活性。此外，可以使环己烯期望产物的结合亲合力达到最大。假设RNA集合体现为非随机的，通过克隆和测序不同的RNA，可以测定各个RNA分子的促进活性。用相同的第一和第二反应物亲双烯体和双烯处理这些RNA分子将必要地导致共生成的环己烯期望产物的形成。在产生足量的RNA促进剂以后，通过常规的光谱方法来解析一种或一系列的环己烯期望产物的结构。

以上给出的实施例是为用一集合体的10个第二反应物双烯处理单一第一反应物亲双烯体的。可以通过简单地将许多不同的第一反应物亲双烯体连接到配体序列上而增大包含在共生成方法中的第一反应物亲双烯体的数目。在共生成、克隆并测序各RNA促进剂之后，然后用第一和第二反应物双烯和亲双烯体处理各RNA促进剂以通过促进RNA而形成的各期望产物达到充足的数量以进行光谱学结构鉴定。由于在上述的平行SELEX实施例中，第一反应物亲双烯体连接到RNA上，因而设想该促进RNA对于连接于第一反应物亲双烯体的反应是特异性的，而对连接在其它RNA上的反应物的反应则相反。结果是采用一集合体的第一和第二反应物双烯和亲双烯体处理单一促进RNA将导致对第二反应物双烯的非常特定的反应，因为这是选择的结果，但是它对第一反应物亲双烯体的选择性很差，因为它在选择期间是连接着的。

另一方面，如果第一和第二反应物都是变化的，则可以获得对二者的特异性。改进的实施方案为采用配体序列编码连接到特定的如图3所示的核酸上的第一反应物亲双烯体，并因而允许矩阵扩大。采种这种途径，在克隆和测序各促进RNA时，结合位点的序列将表示通过PEG连接其上的第一反应物亲双烯体。以这种方式，只有与特定的促进RNA对应的第一反应物亲双烯体将被用于进化的期望产物的最终制备。应该注意到不存在不能采用与图2中提出的试验互补的试验的原因，其中单一的第一反应物双烯连接到RNA结合序列上，而向步骤1中引入一集合体的第二反应物亲双烯体。还可能采用多种第一反应物和一种第二反应物。

狄尔斯-阿尔德只是许多有效的不对称成键反应中的一种。B.醛醇缩合反应

在合成和生物合成化学中的另一种反应类型为醛醇缩合。将狄尔斯-阿尔德反应中所讨论的基本概念用于醛醇缩合反应，其中一种或多种醛为一种反应物，而一种或多种酮为另一种反应物。在以下的实施例和图4A-4C中描述了如何调整平行SELEX方法成为醛醇缩合的一种合乎逻辑的变体。RNA(或DNA)包括3′和5′固定区以转录。连接到RNA上的是PEG接头(长20-50个乙烯单元)，它又具有连接其上的第一反应物醛。第一反应物醛由于其具有较第二反应物酮更高的反应性因而被用作醛醇反应的亲电试剂。标记为A的RNA序列集合体将折叠成不同的结构基元。在图4A的步骤1中，用A处理具有不同化学基团R¹和R²的标记为B_1-10的第二反应物酮。在这一实施例中，RNA含有能加到酮的羰基上并形成如C_1-10、D_1-10、E_1-10和F_1-10所示的烯胺的胺。RNA的形状将决定形成E-烯胺或Z-烯胺。然后将烯胺用作与所连的醛的醛醇反应中的亲核试剂。RNA环绕烯胺的空间和电子环境，将决定观察到的给定RNA序列的对映选择性程度。

为了达到本实施例的目的，醇醛缩合反应产物G_1-10、H_1-10、G^* _{1 -10}和H^* _1-10是由所述第一反应物醛从同侧进攻而得到的。如果存在不同的烯胺和不同的第一反应物醛的相对取向，从对侧进攻也有可能形成相同的产物，这是有可能发生的。重要的是，对于形成的两个新的手性中心，所有四十种产物都由G_1-10、H_1-10、G^* _1-10和H^* _1-10表示。醇醛缩合产物G_1-10/G^* _1-10是对映体，H_1-10/H^* _1-10也是对映体。

在水中G_1-10、H_1-10、G^* _1-10和H^* _1-10的亚胺连接将会是可逆的，并水解得到相应的β-酮醇产物。选择最高亲合力的β-酮醇期望产物将通过连接到生物素或柱载体上的蛋白质靶分离所得到的产物文库而实现。在平衡之后，选择的RNA采用标准的SELEX技术扩增，如图4C中的步骤3-5所示。经步骤5后所得到的RNA，在折叠时，是形成以G1-9表示的醇醛缩合β-酮醇产物的活性催化剂。

一旦达到促进最大化，或者连接到靶上的亲合力变得稳定，则与期望产物相连的促进RNA被克隆和测序。然后就可个别地制备促进RNA，它们相应的β-酮醇期望产物的合成就可以足够分离的规模进行，之后，采用光谱法进行结构表征。

与狄尔斯-阿尔德实施例一样，平行SELEX方法中的第一反应物醛的阵列可以通过以下方法被扩大：使不同的第一反应物醛连接到PEG接头上，并编码第一反应物醛连接其上的核酸上的连接序列。

从以上讨论的狄尔斯-阿尔德反应实施例可知，对于生成两个立体中心来说得到的系数为4。但是，醇醛缩合具有形成较此更多可能性的潜力。考虑混合醇醛缩合反应，其中采用两种酮作为第一和第二反应物，它们的羰基碳具有类似的亲电性，且α-碳具有相似的亲核性(图5)。通常，在有机合成中，这种反应是被避免的，这是因为它会形成非常复杂的产物混合物。在平行SELEX策略中，这种多样性的增加是具有额外优点的。结构C、D、E、F、G、H、I和J都是不同的非对映体。这些产物中的每一种都具有相应的对映体，这意味着，对于图4的混合醇醛缩合反应来说，从最初的20种结构(A_{1 -10}和B_1-10)将形成1600种具有不同结构的产物。C.[2+2+2]环三聚反应

促进RNA和期望产物的平行选择和共生成不限于具有能产生手性中心的结构的产物的形成。许多重要的药用化合物中含有带有附加手性取代基的非手性芳香基团。一种最为有效的用来建构包括芳环体系(苯、萘、吡啶等)产物的方法是二茂钴(CpCo)调节的第一、第二和第三反应物炔的环三聚反应。需要指出的是，[2+2+2]环三聚反应不限于炔反应物，可以通过组合炔和链烯反应物而组装得到非芳族六元环产物。

此处所讨论的实施例包括本发明的实施方案，其中将有机金属催化剂引入RNA(或DNA)中，以及它在平行SELEX方法中的用途。上述步骤1-6，如图2和图4中所示，对于所有的平行SELEX方法来说是常用的，所以在此仅讨论环三聚反应对形成的产物结构的可能数目的影响。对于形成包括有苯环的产物的三种炔反应物的环三聚反应来说，可能性的最大数目是采用三种不同的炔反应物而得到的，这些炔具有不同的连接到各反应物的各端上的取代基(如图6所示)。

对于如图6所示的炔反应物的环三聚反应，存在有4MN²种可能的区域异构体产物，其中，M＝连接到RNA上的不对称炔第一反应物的数目，而N＝与RNA-第一反应物混合物相接触的游离的不对称炔的第二和第三反应物数目。图6给出了仅3种炔反应物的可能性的矩阵，其中第一反应物连接到RNA上，而第二和第三反应物是游离的。如果平行SELEX方法扩大到含有10种连接到RNA分子上的炔第一反应物和10种第二和第三反应物，那么，就可得到4000种苯类产物。

CpCo催化的炔反应物的环三聚反应机理如在图6的底面所示。通过如上所述将CpCo(或其它能够环化炔的金属配合物)连接到寡核苷酸上，就有可能形成环三聚促进RNA。在有机金属中心周围折叠的RNA结构将提供口袋，它将赋予如图6C中所示的B→C或C→D的成键步骤选择性。采用平行SELEX方法的分离应给期望苯类产物合成提供特异性。在克隆和制备足够数量的促进RNA时，共生成的芳香族产物可以通过用在选择中使用的炔反应物的混合物处理RNA来制备。所得到的芳族产物然后可采用常规方法进行结构表征。D.逆合成策略

一般而言，设想所有平行SELEX方案都具有如上所述且如图2和图4所示的共有的步骤1-6。不同的化学事件仅改变所形成产物的类型和数目。在考虑到何种化学事件最好包括在平行SELEX方法之中时，对感兴趣的结构产物类别进行逆合成分析可能是有价值的。考虑图7和所示的产物可能的断开。A断开涉及狄尔斯-阿尔德转化，而B断开涉及醇醛缩合。这些成键反应都在上面讨论过。对于这种产物可进行许多种其它的断开。一般而言，包括环形成产物转化的逆合成策略是理想的，因为形成最大数目的键或立体中心。当考虑何种类型的反应对于平行SELEX是最为有效的，可能需要考虑其它因素。例如，在反应条件下试剂的有效性和寡核苷酸的反应性和稳定性。可以形成的可能立体或区域异构体产物的数目是非常重要的。尽管狄尔斯-阿尔德和醇醛缩合反应，由于形成新的立体中心，具有形成多种产物的潜力，但是，逆合成路线C能够提供多种区域异构体产物。可以预期，本发明可包括几种化学反应，包括一种或多种促进性核酸和两种或更多种不同的反应物，同时或依次地制得本发明的产物。E.逆SELEX策略

根据期望功能选择小分子是平行SELEX方法所固有的。这可扩展至具有期望功能和特异性的小分子的选择。在用先提取连接到能够与非期望的“靶”反应的产物上的RNA(逆SELEX，负选择，或逆选择)，接着用期望的靶进行正选择的选择过程中要求有特异性。这种技术的应用包括但不限于选择仅与多种同工酶中的一种同工型反应的小分子，选择能结合到一类受体上的小分子，选择能区分密切相关的受体的小分子，选择不会抑制哺乳动物的重要的酶/受体的真核病原体的重要的酶/受体的小分子抑制剂等。

可应用于这一技术的靶的实例包括但不限于：环加氧酶、肌苷酸脱氢酶和真菌细胞色素P-450。环加氧酶是抗炎药的靶，其催化花生四烯酸的过氧化，它最终导致形成经典的前列腺素(PGD₂、PGE₂和PGF_2α)、前列环素(PGI₂)和血栓烷A₂(TXA₂)。目前可得的抑制剂包括非甾体抗炎药(NSAIDS)。胃溃疡由前列腺素抑制所引起，是这些药物较常见的副作用。靶酶存在两种同工型：Cox1和Cox2。Cox1同工酶基本在大多细胞类型中表达，而Cox2可迅速地为单核细胞中的LPS和纤维原细胞中的IL-1所诱导(炎症组织表达Cox2)。通过采用平行SELEX方法/逆SELEX方法，有可能选择不与Cox1交叉反应的Cox2小分子抑制剂。Cox2的选择抑制将会引起抗炎活性而不会引起胃肠腐蚀，这是人们所期望的。

II型肌苷酸脱氢酶(II型IMP脱氢酶)是免疫抑制剂的重要靶。需要IMP脱氢酶的鸟嘌呤核苷酸的从头合成似乎是人T和B淋巴细胞对抗原和诱变刺激的增殖反应所需的。I型IMP脱氢酶在静息细胞中表达，包括淋巴细胞，而II型IMP脱氢酶当T和B淋巴细胞应答增殖信号时，会迅速地被诱导。平行SELEX方法/逆SELEX方法用于选择对I型酶具有低的或没有交叉反应性的II型酶的小分子抑制剂(免疫抑制剂导物(lead))。

真菌细胞色素P-450是重要的抗真菌剂的靶，它在此处用作平行SELEX方法/逆SELEX试验是如何进行的实例。P-450的功能是羊毛甾醇的C14脱甲基化，这是麦角甾醇(真菌细胞膜组分)合成中的步骤。目前的唑类抗真菌剂(咪唑和三唑)靶向于这种细胞色素。

可能的用来确定真菌细胞P-450的特异性抑制剂的方法在此略述如下。首先，通过使连接有第一反应物的RNA与游离反应物反应制得产物文库。接着，采用多种可能分离方案(在其它地方描述)中的一种，最优选采用与固定在固体载体上的哺乳动物细胞色素P-450接触，使产物文库与哺乳动物细胞色素P-450接触。这样将具有对哺乳动物细胞色素亲合性的产物与产物文库的剩余物分离。通过众多前述分离方法中的一种回收不为哺乳动物细胞色素所保留的产物并与真菌细胞色素P-450接触，其中对真菌细胞色素具有特异性的产物与产物文库的剩余物分离。回收对真菌细胞色素亲合性增加的产物并扩增与其相连的核酸。重复选择和扩增方法，直到核酸集合体富集了足量的促进性核酸以鉴定与其相连的产物。

一种已知的P-450抑制性药效团的平行SELEX逆合成分析如以下示意图所示，它作为一个非限制性实施例用来说明如何选择反应物。对于氟康唑：

可以设想大量的的逆合成策略。两种明显的但非限制性策略如以上示意图的A和B所示。从任何2，4-二取代芳香族羰基化合物开始，与R′进行缩合反应，就可得到相应的苄醇。可用于策略A的反应类型的实例包括但不限于：醇醛缩合反应和克莱森缩合反应，其中R′为醛、酮和酯、羧酸、腈或酰胺。而且，策略A可以伴有包括咪唑、三唑、吡唑、吡啶、喹啉、吲哚、恶唑、嘧啶和嘌呤在内的杂环的烷基化反应。或者，策略B在环三聚反应中可以有多达三种不同的炔反应，其中，X和或X′可以选自所有官能团，但羧酸和Br和I除外。R和/或R′可以相同或不同，它们选自除羧酸和Br或I之外的所有官能团。F.选择蛋白平行SELEX方法

已表明选择蛋白与其天然的细胞表面靶，例如唾液酸路易斯X(sialyl lewis X)结合是有关炎症的事件级联中的关键步骤。抑制这一过程的分子，除了预防其它的选择蛋白调节的事件外，还可能用作抗炎药。下面将略述引出小分子选择蛋白配体的两种平行SELEX策略。

两种平行SELEX试验的一般流程图如下所示。两者都涉及化合物文库组合的衍生糖。在一种情形中，糖具有亲核官能团，它可与α，β-不饱和羰基化合物以迈克尔加成方式反应。另一策略涉及双烯官能化的糖，它或者与同类的α，β-不饱和羰基化合物进行狄尔斯-阿尔德环加成反应，或者与完全不同的亲双烯体文库进行该反应。所示的实施例采用D-甘露糖苷作为衍生糖，因为它与天然配体的L-岩藻糖具有相似性，但是原则上它可以涉及任何被适当地官能化的分子。类似地，迈克尔受体/亲双烯体文库是无条件的，但是，以下还是给出了一种方便的策略，用来产生α，β-不饱和羰基化合物多样集合体。根据已知的唾液路易斯X模拟型的结合要求，文库中的某些官能团的偏差可能是经济的。例如，已表明保留唾液酸负电荷对于结合是非常重要的。因此，迈克尔受体/亲双烯体文库应该含有大量在分子某处具有负电荷的成员。最后，分离可以多种方式进行，但是，确保所产生的小分子结合到唾液路易斯X结合位点的方法是优选的。这些方法包括但不限于用游离唾液路易斯X或已知的竞争剂洗脱，或者用螯合剂如EDTA从蛋白质中除去所需的钙离子。

G.采用平行SELEX方法合成吡啶化合物

许多天然存在的酶辅因子和药物是衍生化的吡啶，其中的一部分如下所示。例如，硝基吡啶是著名的抗癌药。采用一种腈-环三聚平行SELEX方法有可能得到官能化的吡啶药效团。例如，可以制备通过模仿关键反应中间体而抑制吡哆醛(维生素B6)依赖性的酶的吡啶衍生物。可以进行类似的试验以靶向于烟酸和烟碱受体。以下给出可采用这种方法合成的代表性化合物。

    

         

吡多醛                 吡多醛-5’-磷酸               吡多胺                   吡多醇(维生素B_n)       

             

尼可酸                 烟碱                         新烟碱(烟酸)IV.给药和用途

本发明的期望产物的用途包括各种治疗、预防、诊断和化妆品方面的用途。其中化学产物可能是所期望的任何用途都包括在本发明的范围之内。具体类别的症状包括但不限于：炎症、心血管疾病、肿瘤、代谢紊乱、寄生虫病和传染病。更具体地说，本发明的产物在治疗或预防癌症、咽峡炎、关节炎、哮喘、过敏、鼻炎、休克、炎症性肠疾病、低血压以及疼痛和炎症的系统治疗、局部外伤如伤口、烧伤和皮疹。

本发明的产物的优选的用途包括但不限于高血压和慢性炎症的治疗，包括血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂，和作为免疫抑制剂、抗菌剂和抗真菌剂的用途。

特别优选的靶包括但不限于血管紧张肽转化酶、肾素、环加氧酶、5-脂肪氧化酶、IL-1β转化酶、细胞因子受体、PDGF受体、II型肌苷酸脱氢酶、β-内酰胺酶和真菌细胞色素P-450。靶可以包括但不限于缓激肽、嗜中性弹性蛋白酶、HIV蛋白，包括tat、rev、gag、int、RT、壳包核酸等、VEGF、bFGF、TGFβ、KGF、PDGF、凝血酶、茶碱、咖啡因、P物质、IgE，sPLA₂、红细胞、成胶质细胞瘤、纤维蛋白凝块、PBMC、hCG、凝集素、选择蛋白、细胞因子、补体蛋白等。

抗炎药物可用来治疗急性和慢性炎症，它们可包括环加氧酶抑制剂、5-脂肪氧化酶、IL-1β转化酶(ICE)和细胞因子受体(例如，IL-1和TNF受体和其它促炎细胞因子的受体)。

靶酶存在两种同工型：Cox1和Cox2。Cox1同工酶基本在大多数细胞类型中表达，而Cox2迅速地被单核细胞中的LPS和成纤维细胞中的IL-1诱导(炎症组织表达Cox2)。Cox2的选择性抑制可导致抗炎活性而不引起对胃肠的腐蚀。

5-脂肪氧化酶也参与花生四烯酸代谢，它是白三烯激素的合成所必需的。这种酶的抑制剂的开发由于其受几种辅因子(Ca⁺⁺、ATP、磷脂等)的调节而受到限制；因此，难以以纯的形式对其进行研究。现行的药物指导筛选方案要求使用整个细胞。可以将采用分离出来的酶的平行SELEX方法用于选择不可逆的抑制剂，同时需要伴随分析酶的活性。

免疫抑制药物可包括II型肌苷酸脱氢酶(II型IMP脱氢酶)抑制剂。鸟嘌呤核苷酸的从头合成似乎是人T和B淋巴细胞对抗原和诱变刺激的增殖反应所要求的(Allison，A.C.1993.Annals New YorkAcad.Of Sciences)。I型IMP脱氢酶在静息细胞包括淋巴细胞中表达，而II型IMP酶在T和B淋巴细胞应答增殖信号时会被迅速诱导。平行SELEX方法可用于设计对于II型酶具有高度特异性(对I型酶具有低的或没有交叉反应活性)的药物。

抗真菌产物包括真菌细胞色素P-450抑制剂。P-450的功能是羊毛甾醇的C14脱甲基化，这是麦角甾醇(真菌细胞膜组分)合成中的步骤。目前的唑类抗真菌剂(咪唑和三唑)靶向于这种细胞色素。平行SELEX方法可提供对真菌细胞色素P-450具有提高的选择性的药物(对哺乳动物细胞色素P-450具有更低的交叉反应性)。

作为类固醇激素兴奋剂和拮抗剂的产物也包括在本发明之中。据信这些产物对于治疗乳腺癌、前列腺癌和宫颈癌是有用的。这些产物作为避孕药和治疗关节炎的药物也是有用的。

本发明的期望产物，一旦经由平行SELEX方法鉴定，就可采用常规化学合成路线或者采用促进性核酸调节反应物间的反应而进行生产制备。本发明的产物可以含有不对称原子。不对称原子可以选自如碳、磷、硅、硫。因此，本发明包括各立体异构体及其混合物。各异构体可采用本领域已知的方法制备或分离。

期望产物可采用本领域普通技术人员已知的任何方法给予。给予方式包括但不限于肠内(口服)给予、肠胃外(静脉内、皮下和肌内)给予、局部给予、粘膜(鼻、呼吸道等)给予。

根据本发明的治疗方法包括根据治疗需要对个体体内或局部给予有效量的期望产物。本发明的方法中期望产物和含有期望产物的药物组合物的剂量为有效但无毒性的量，一般其范围为0.01至500毫克/千克的期望产物，优选为0.1至50毫克/千克。本领域技术人员采用常规的临床试验就能够确定用于治疗某特定疾病的最佳剂量。期望的剂量通常每天分1至6次或更多次给予个体，可以用静脉内、口服、直肠、肠胃外、局部或吸入给予。可采用本领域普通技术人员已知的标准技术测定本发明的期望产物的功效。

可采用本领域技术人员公知的多种方法制备以药物制剂方式给予的产物。在本发明范围之内的适宜的药学可接受的盐类包括以下盐：由无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸和硫酸衍生而来的盐；以及由有机酸如酒石酸、富马酸、乳酸、草酸、乙基磺酸、对甲苯磺酸等衍生而来的盐，分别形成盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、甲烷磺酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等盐。

可以将本发明的期望产物配方成肠胃外给予的含水注射液，它可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶解剂、化学防护剂等。临时配用的注射液可由无菌的丸剂、颗粒剂或片剂制得，它们可以含有稀释剂、分散剂和表面活性剂、粘合剂和润滑剂，这些物质对于本领域普通技术人员来说是公知的。

在口服给药的情况，期望产物的细粉或颗粒可以和稀释剂和分散剂以及表面活性剂来配方，并且可以制成在水或糖浆中的、以干燥状态在胶囊或小药囊中或在非水悬浮液中，悬浮液中可含有悬浮剂。期望产物也可以片剂形式与任选的粘合剂和润滑剂一起给予，或者以处在水或糖浆或油中的悬浮液或者以油包水乳剂或者以自可生物降解或可生物腐蚀的聚合物制备的缓释形式给予，且可以包括矫味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂和乳化剂。可以将口服给予的颗粒剂或片剂包衣，或者可以使用其它药学领域的技术人员公知的药学可接受的试剂和配方。

也可以采用固体或液体载体。固体载体包括淀粉、乳糖、二水合硫酸钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。软膏剂和乳剂是采用多种公知的亲水和疏水基质(base)制备的。局部药贴(topical reservoir)采用公知的聚合物材料如各种选择用以提供期望的释放性能的基于丙烯酸的聚合物而适当地制备。栓剂由标准基质如PEG和可可油制备。脂质体也可用作本发明产物的载体。

另外，本发明的期望产物可用作农用试剂。具体地说，期望产物可用作除草剂、杀虫剂、生长调节剂等。本发明的产物用于农用目的的用途和给予对于本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的产物也可用于化学生产方法中。

实施例

以下实施例是本发明的制备方法和产物的优选的实施方式的说明，它们不是对本发明的限制。实施例1含有修饰的核苷的核酸试验混合物的合成和表征

用T7 RNA聚合酶产生含有天然或修饰的核苷的核酸试验混合物，以从dsDNA模板转录修饰的RNA，所述dsDNA模板由例如40nt 5′-固定区和接着的40或100个核苷的随机区以及24个核苷的3′-固定区组成。具有随机区的模板用于(1)测试合成RNA随机集合体的相对效率，(2)生成用于反转录(RT)试验的随机RNA模板，以及(3)生成特征在于其碱基组成的RNA。常规转录的实施例在以下实施例3中给出。转录条件包括GMP以生成5′-单磷酸RNA，它与在常规SELEX试验中的RNA生成期间所用的条件类似。在单一修饰的RNA文库合成之后，在碱性条件下消化RNA，用细菌碱性磷酸酶将所得的核苷脱磷酸化。然后采用C18反相-HPLC分析得到的混合物的核苷组成。

各种修饰的尿苷和胞苷的合成在以下文献中描述：美国专利第5428149号，标题为“钯催化的碳-碳偶联的方法和产物”；序列号为08/264029的美国专利申请，1994年6月22日申请，标题为“通过分子内亲核置换进行的已知的和新的2′-修饰的核苷的新的制备方法”，现为美国专利第5756703号；序列号为08/347600的申请美国专利，1994年12月1日申请，标题为“钯催化的嘌呤核苷的修饰方法”，现为美国专利第5580972号；以及序列号为08/458421的美国专利申请，1995年6月2日申请，标题为“使用亲核试剂和一氧化碳的钯催化的核苷修饰方法”，现为美国专利第5719273号，所有这些文献引入本文作参考。三磷酸酯的合成，是通过按照改进的文献方案(Ludwig和Eckstein，J.Org.Chem(1989)54，631-635)通过将5′-羟基核苷转化为它们的三磷酸酯，接着进行酸性Dowex脱保护而实现的，或者是采用文献方案(J.Org.Chem.(1990)55，1834)通过转化核苷5′-单磷酸而实现的。采用离子交换层析和/或反相HPLC，以0.05摩尔/升的碳酸氢三乙基铵缓冲液作为水相纯化三磷酸酯，采用其¹H和³¹P NMR谱和质谱对其进行表征。根据其各自的最大吸收波长处的紫外吸收定量三磷酸酯溶液，测定游离核苷或核苷5-单磷酸。

以下给出了已被制得并被转化成其三磷酸酯的修饰的嘧啶的一些实例，包括5-苯甲酰尿苷(benzU)、5-吡啶基甲基尿苷(pymeU)、5-乙二胺尿苷氨基甲酰(N-TFA-enU)、5-咪唑尿苷氨基甲酰(imidU)、5-吡啶基甲基胞苷单磷酸氨基甲酰(pymeCMP)，和5-咪唑胞苷单磷酸氨基甲酰(imid CMP)。

实施例2反应物-接头化合物的合成

在平行SELEX方法的一个实施方案中，化学反应物是经由接头基团而连接到核酸上的。这个实施例说明如何通过将化学反应物偶联到PEG分子上而制备几种反应物-接头化合物。已通过几种采用已被转化成单氨基PEG-2000(“氨基PEG”)的PEG 2000的技术将几种化学反应物连接到2000 MW PEG上。下面是与双烯(环状和开链)、脂族酮、芳香族酮、β-酮酰胺、炔类(末端和内部)以及生物素部分连接的PEG化合物的实例。这些PEG化合物随后通过标准方法被转化为相应的磷酰胺。然后将偶联到保护的PEG接头上的反应物连接到DNA 10-mer的5′端(以促进与随机核酸试验混合物的连接)。这一清单并不试图包含易接近于PEG化合物连接的化学基团。接着将反应物-PEG-DNA部分偶联到核酸试验混合物上，例如实施例1或SELEX专利申请中所述的核酸试验混合物。这种偶联反应在实施例3中描述。PEG-开链双烯的合成

如以下的示意图所示，接着用以下过程制备PEG-开链双烯，尤其是2，3-己二烯基PEG2000氨基甲酸酯。

2，4-己二烯基-对硝基苯基碳酸酯如下制备。在氩气氛中，将1.0毫升(8.8毫摩尔)2.4-己二烯-1-醇和2.0毫升(11.5毫摩尔)无水二异丙基乙基胺溶于100毫升氯仿，用冰浴冷却到5℃。30分钟内，搅拌下往该混合物中逐滴加入1.97克(9.76纳摩尔)溶于10毫升氯仿的氯甲酸对硝基苯酯。对反应混合物再搅拌5小时，同时使其慢慢地达到室温。然后用50毫升盐水洗涤混合物。用氯仿(2×50毫升)对水层进行反萃取，收集有机部分，并用硫酸镁干燥，在减压下除去溶剂。通过从乙醇中进行重结晶从剩余黄色固体中对产物进行纯化，得到1.94克(83％)呈白色针状的碳酸酯。TLC：R_f＝0.39(己烷)。根据其¹H和¹³C NMR谱，对该化合物进行表征。

2，4-己二烯基-PEG-2000氨基甲酸酯如下制备。室温下向在30毫升氯仿中的500毫克(0.25毫摩尔)PEG-2000和42毫克(0.275毫摩尔)DBU的搅拌着的溶液中加入72毫克(0.275毫摩尔)2，4-己二烯基对硝基苯基碳酸酯。反应在室温搅拌下进行过夜。然后用碳酸氢钠(6×50毫升)和盐水(1×50毫升)洗涤溶液。然后用硫酸镁干燥氯仿相，并在减压下除去溶剂，得到微黄色蜡状固体。产物用闪蒸硅胶柱层析(7％的甲醇/二氯甲烷)进一步纯化，得到184毫克无色固体。期望产物由¹H NMR确证。PEG-环状双烯的合成

如以下的示意图所示，接着用以下过程制备PEG-环状双烯，尤其是PEG-N-乙酰基环己二烯。

PEG-环己二烯铁三羰基配合物如下制备。向在3毫升无水DMF中的250毫克(0.8毫摩尔)环己二烯鎓铁(O)(cyclohexadienyliumiron(O))三羰基四氯硼酸盐的搅拌着的溶液中，在0℃下加入1.6克(0.8毫摩尔)的在4毫升无水DMF中的氨基PEG溶液。让溶液慢慢暖至室温，并在真空下浓缩。使剩余物悬浮在10毫升THF中，并加入200毫升乙醚以沉淀产物。真空过滤收集所得的淡黄色固体，得到1.46克(81％粗收率)的产物，它由¹H NMR谱证实。

PEG-环己二烯如下制备。向在4毫升甲醇中的500毫克(0.22毫摩尔)PEG-环己二烯铁配合物的搅拌着的溶液中，加入42毫克(0.22毫摩尔)对甲苯磺酸。冷却溶液至-15℃，并加入1毫升二氯甲烷以溶解反应物。然后，以固体形式加入硝酸高铈铵(263毫克，0.48毫摩尔)，在-15℃下搅拌溶液40分钟。接着，使溶液暖至室温，并在真空下浓缩。将剩余物溶解在150毫升2∶1的盐水∶乙酸乙酯中，用100毫升浓碳酸氢钠水溶液使之呈碱性，并用4×50毫升20％的二氯甲烷/乙酸乙酯萃取，在真空下浓缩有机萃取物，得到369毫克(79％粗收率)产物，它由¹H NMR谱证实。

PEG-二乙酰基环己二烯如下制备。向在5毫升无水吡啶中的369毫克(0.17毫摩尔)的上述PEG-环己二烯的搅拌着的溶液中，加入35.3微升(0.37毫摩尔)的乙酸酐。在室温下搅拌溶液过夜，另外加入16微升乙酸酐。1小时后，在真空下浓缩溶液。将剩余物溶解在120毫升2∶1的盐水∶乙酸乙酯中，并用4×50毫升乙酸乙酯萃取，然后，用2×50毫升20％的二氯甲烷/乙酸乙酯萃取，合并萃取物，在真空下浓缩，得到260毫克(61％粗收率)产物，它由¹H NMR谱证实。

PEG-N-乙酰基环己二烯如下制备。向在3毫升甲醇中的260毫克(0.12毫摩尔)二乙酰化的PEG-环己二烯的搅拌着的溶液中，加入在1毫升在水中的163毫克(1.2毫摩尔)碳酸钾。在室温下搅拌溶液过夜，并在真空下浓缩。将剩余物溶解在60毫升2∶1的盐水∶乙酸乙酯中，并用2×40毫升20％的二氯甲烷/乙酸乙酯萃取。合并萃取物，在真空下浓缩，剩余物溶解在2毫升THF中，通过一个玻璃棉塞过滤，加入100毫升乙醚。通过真空过滤收集得到的白色固体，并在高真空下干燥，得到119毫克(46％收率)的产物，它由¹HNMR和质谱证实。PEG-酮的合成PEG-苯乙酮的合成

PEG-苯乙酮

PEG-苯乙酮如下制备。在氩气氛下，将2.0克(1.0毫摩尔)PEG-2000溶解在干燥的THF中，并用287毫克(1.1毫摩尔)对-(N-羟基丁二酰亚胺)羧基苯乙酮处理。在室温下搅拌混合物2小时，之后，通过加入醚沉淀PEG，并通过过滤分离之。剩余的白色固体采用闪蒸硅胶柱层析(7％的甲醇/二氯甲烷)纯化，得到450毫克呈蜡状固体的期望产物。产物由¹H NMR证实。PEG-乙酰乙酰胺的合成

PEG-乙酰乙酰胺

PEG-乙酰乙酰胺如下制备。向在2毫升无水DMF中的300毫克(0.18毫摩尔)氨基PEG的搅拌着的溶液中，加入36毫克(0.15毫摩尔)的N-羟基丁二酰亚胺乙酰乙酸酯。在室温下搅拌溶液2天，并在真空下浓缩。剩余物悬浮在5毫升THF中，并加入100毫升乙醚以沉淀产物。通过真空过滤收集白色固体，得到262毫克(70％收率)产物，它由¹H NMR证实。PEG-4-乙酰丁酰胺的合成

PEG-4-乙酰丁酰胺  

PEG-4-乙酰丁酰胺如下制备。向在25毫升无水二氯甲烷中的0.5毫升(4.2毫摩尔)4-乙酰丁酸的搅拌着的溶液中，加入1.6克(6.3毫摩尔)二丁二酰亚胺碳酸酯和644微升(4.6毫摩尔)三乙胺。在室温下搅拌溶液过夜，并在真空下浓缩。剩余物通过在硅胶上用30％的乙酸乙酯/己烷的闪蒸柱层析纯化，得到668毫克(70％收率)NHS酯，它由¹H NMR证实。

向在3.0毫升无水DMF中的55毫克(0.24毫摩尔)4-乙酰丁酸NHS酯的搅拌着的溶液中，加入400毫克(0.2毫摩尔)氨基PEG。在室温下将溶液搅拌过夜，并在真空下浓缩。剩余物溶解在10毫升THF中，并加入100毫升乙醚以沉淀产物。通过真空过滤收集得到白色固体并在高真空下干燥，得到334毫克(66％收率)的产物，它由¹H NMR证实。PEG-炔的合成PEG-2-丁炔酰胺(butvnamide)的合成

PEG-2-丁炔酰胺  

PEG-2-丁炔酰胺如下制备。向在20毫升无水二氯甲烷中的250毫克(3.0毫摩尔)2-丁炔酸的搅拌着的溶液中，加入619毫克(3.0毫摩尔)的1，3-二环己基碳二亚胺和345毫克(3.0毫摩尔)N-羟基丁二酰亚胺。溶液搅拌1.5小时，过滤除去固体，并在真空下浓缩。剩余物通过在硅胶上用40％的乙酸乙酯/己烷的闪蒸柱层析纯化，得到448毫克(83％收率)的NHS酯，它由¹H NMR证实。

向在2毫升无水DMF中的300毫克(0.15毫摩尔)氨基PEG的搅拌着的溶液中，加入33毫克(0.18毫摩尔)2-丁炔酸NHS酯。将溶液在室温下搅拌过夜，并在真空下浓缩。剩余物悬浮在15毫升THF中，并加入200毫升乙醚以沉淀产物。通过真空过滤收集得到白色固体并在高真空下干燥，得到280毫克(75％收率)的产物，它由¹H NMR证实。PEG-4-戊炔酰胺的合成

PEG-4-戊炔酰胺  

PEG-4-戊炔酰胺如下制备。向在20毫升无水二氯甲烷中的250毫克(2.5毫摩尔)4-戊炔酸的搅拌着的溶液中，加入515毫克(2.5毫摩尔)1，3-二环己基碳二亚胺和288毫克(2.5毫摩尔)N-羟基丁二酰亚胺。溶液在室温下搅拌过夜，过滤除去固体，并在真空下浓缩。剩余物通过在硅胶上用与40％的乙酸乙酯/己烷的闪蒸柱层析纯化，得到367毫克(75％收率)的NHS酯，它由¹H NMR证实。

向在2毫升无水DMF中的300毫克(0.15毫摩尔)氨基PEG的搅拌着的溶液中，加入35毫克(0.18毫摩尔)4-戊炔酸NHS酯。溶液在室温下搅拌过夜，并在真空下浓缩。剩余物悬浮在15毫升THF中，并加入200毫升乙醚以沉淀产物。通过真空过滤收集形成的白色固体并在高真空下干燥，得到214毫克(57％收率)的产物，它由1HNMR证实。PEG-生物素酰胺的合成

PEG-生物素酰胺  

PEG-生物素酰胺如下制备。向在2毫升无水DMF中的400毫克(0.2毫摩尔)氨基PEG的搅拌着的溶液中，加入82毫克(0.24毫摩尔)生物素NHS酯。溶液在室温下搅拌4天，并在真空下浓缩。剩余物悬浮在6毫升THF中，并加入150毫升乙醚以沉淀产物。通过真空过滤收集形成的白色固体并在高真空下干燥，得到411毫克(92％收率)的产物，它由¹H NMR证实。

实施例3制备核酸-反应物试验混合物

核酸试验混合物采用如实施例1和SELEX专利申请中所述制备。反应物直接或通过接头部分偶联到核酸试验混合物上，接头部分，例如实施例2中所述的接头部分。核酸-反应物试验混合物如下制备。核酸试验混合物通常含有100或更多个核苷酸的连续随机序列，所述随机序列的侧翼连有允许引物杂交的确定的5′和3′端。由Taq聚合酶合成的双链DNA(dsDNA)分子在其5′端具有T7 RNA聚合酶促进剂以促进转录。

典型的转录反应含有200皮摩尔dsDNA、80微升5X T7 RNA聚合酶缓冲液(200毫摩尔/升的Tris-pH 8.0、60毫摩尔/升的氯化镁、5毫摩尔/升的亚精胺、25毫摩尔/升的DTT、20％的丙三醇和0.01％的triton X-100)、40微升10毫摩尔/升的的ATP、40微升10毫摩尔/升的GTP、40微升10毫摩尔/升的CTP、40微升10毫摩尔/升的UTP(或修饰的UTP)、4微升α[³²P]ATP(10μCi/μL，如果需要)、32微升250毫摩尔/升的GMP、5微升RNA酶抑制剂(Promega，40000单位/毫升)、16微升T7 RNA聚合酶(New England Biolabs，50000单位/毫升)，和dH₂O，使总体积为400微升。在37℃下保温过夜后，在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化RNA。如下所述，5′单磷酸对于将RNA连接到DNA的接头序列部分上是必需的。将核酸试验混合物连接到DNA-PEG-反应物上

连接反应含有500皮摩尔核酸试验混合物、1纳摩尔如实施例2所述的DNA-PEG-反应物，1.5纳摩尔桥联寡(5′-CTTGTCTCCCGCGTGCCTGG)(SEQ ID NO：3)、10微升10×T4DNA连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，660毫摩尔/升的Tris-HCl pH 7.5、50毫摩尔/升的氯化镁、10毫摩尔/升的二硫赤鲜糖醇、10毫摩尔/升的ATP)、8微升T4 DNA连接酶贮存缓冲液(BoehringerMannheim，20毫摩尔/升的Tris-HCl pH7.5，1毫摩尔/升的EDTA、5毫摩尔/升的DTT、60毫摩尔/升的氯化钾、50％的丙三醇)、2微升RNA酶抑制剂(Promega，40000单位/毫升)、8微升T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim，5单位/微升)，和dH₂O，使其总体积为100微升。除了RNA酶抑制剂和连接酶之外，混合连接反应的所有组分，并在72℃加热3分钟。然后缓慢冷却溶液至室温(约10分钟)，加入RNA酶抑制剂和连接酶。在37℃下保温过夜后，在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化连接产物。所得到的RNA-DNA-PEG-反应物即为核酸-反应物试验混合物。

实施例4未修饰的RNA在促进狄尔斯-阿尔德反应中的用途PEG接头的合成

合成聚乙二醇(PEG)，将其用作核酸(本例为40N8 RNA)(SEQID NO：2)与第一反应物(本例为马来酰亚胺)之间的间隔。接头的合成示意图如下所示。

甲苯磺酰化的PEG(Ts-PEG)(2)的合成-将1.0克聚乙二醇1(0.670毫摩尔，平均分子量为1500)溶于15毫升干燥的THF中，并在真空下除去溶剂。向已溶于15毫升干燥的THF中的剩余物中加入52毫克(0.335毫摩尔)DBU，接着加入64毫克(0.335毫摩尔)对甲苯磺酰氯。在室温下于氩气中将混合物搅拌10天，在此期间形成白色沉淀。10天后，过滤反应混合物，并在真空下除去溶剂。通过闪蒸硅胶层析(7％的甲醇/二氯甲烷)对单甲苯磺酰化的产物进行纯化，得到320毫克(58％)的浅黄色固体(R_f＝0.31)。产物根据其¹H NMR谱鉴别。

氨基-PEG(3)的合成-在2毫升干燥的THF中溶解400毫克(0.243毫摩尔)Ts-PEG(2)，接着溶解119毫克(2.43毫摩尔)叠氮化锂。在搅拌下于氩气氛中，在80℃加热反应混合物5小时。冷至室温后，通过二氧化硅垫片过滤混合物，并用10％的甲醇/二氯甲烷洗涤片垫，直到在洗脱液中检测不到产物为止。合并滤液，在减压下蒸发至干燥。将剩余物溶于4毫升甲醇，向其中加入30毫克5％的Pd/C，在一种氢气氛中搅拌溶液16小时。接着将混合物经硅藻土过滤。用甲醇洗涤硅藻土垫片，合并滤液，并在减压条件下蒸发除去溶剂，得到灰白色固体。通过闪蒸硅胶层析(12％的MeOH·NH₃/二氯甲烷)纯化，得到279毫克(77％)期望的氨基PEG产物3(R_f＝0.38，15％的MeOH·NH₃/二氯甲烷)，呈白色固体。

FMOC-PEG(4)的合成-将840毫克氨基PEG(3)溶于75毫升干燥的THF中，接着旋转蒸发除去溶剂，这样将氨基PEG(3)干燥。然后，在氩气氛下，将氨基PEG溶于50毫升干燥的THF中，用190毫克(0.563毫摩尔)9-芴基甲基丁二酰亚胺碳酸酯处理，然后在室温下于氩气氛中搅拌溶液2小时。旋转蒸发除去溶剂，通过闪蒸硅胶层析(8％的甲醇/二氯甲烷)对产物进行纯化，得到863毫克(92％)白色固体(R_f＝0.28，10％的甲醇/二氯甲烷)。

FMOC-PEG phosphoramidite(5)的合成-将173毫克(0.104毫摩尔)FMOC-PEG(4)溶解在25毫升干燥的THF中，接着旋转蒸发除去溶剂，这样将FMOC-PEG(4)干燥。在氩气氛下，接着将FMOC-PEG溶解在25毫升干燥的二氯甲烷中，用34.8毫升(0.208毫摩尔)的二异丙基乙基胺处理，接着用36.2毫升(0.156毫摩尔)2-氰基-N，N-二异丙基氯磷酰胺处理。混合物在室温下搅拌1小时。在减压下除去溶剂和过量的碱。通过闪蒸硅胶层析(8％的甲醇/二氯甲烷)纯化期望的phosphoramidite产物，得到190毫克(97％)的白色固体(R_f＝0.30，10％的甲醇/二氯甲烷)。

DNA-PEG的连接和第一反应物的添加

然后将上面合成的保护的PEG连接到DNA 10-mer的5′端(以促进与随机RNA的连接)，接着如以下流程图所示偶联第一反应物(本例为马来酰亚胺)。

采用实用的生物系统DNA合成仪合成DNA 10-mer(5′-CCAGGCACGC)(SEQ ID NO.1)，并将采用上述的标准phosphoramidite化学的一个过程中合成的FMOC-PEGphosphoramidite连接。将DNA-PEG连接从CPG(控制孔玻璃)固相载体上裂解下来，并采用标准的在浓氢氧化铵中过夜保温而完全脱保护，从而得到DNA-PEG游离胺物种6。然后可以采用多种反应将任何底物加到PEG链的末端。例如，通过氨基DNA-PEG与马来酰亚胺活化的酯7的反应将用于狄尔斯-阿尔德反应的马来酰亚胺亲双烯体挂上，得到酰胺8。

制备具有5′单磷酸的随机RNA集合体

随机序列40N8 RNA集合体(SEQ ID NO.2)，是采用标准SELEX策略和得自Operon(Alameda，CA)的合成的随机序列单链DNA(ssDNA)模板的技术制备的。随机区是通过在寡核苷酸合成期间使用四种核苷酸的混合物(调节混入的核苷酸的摩尔比为1∶1∶1∶1)而形成的。ssDNA含有40个核苷酸的连续随机序列，所述随机序列的侧翼连有允许引物杂交的限定的5′和3′端。双链DNA(dsDNA)分子是由Taq聚合酶合成的，在5′端具有T7 RNA聚合酶促进剂以促进转录。

每一转录反应含有100皮摩尔40 N8 dsDNA、80微升5X T7 RNA聚合酶缓冲液(200毫摩尔/升的Tris-pH 8.0、60毫摩尔/升的氯化镁、5毫摩尔/升的亚精胺、25毫摩尔/升的DTT、20％的丙三醇和0.01％的Triton X-100)、40微升10毫摩尔/升的GTP、40微升10毫摩尔/升的CTP、40微升10毫摩尔/升的ATP、40微升10毫摩尔/升的UTP、40微升500毫摩尔/升的GMP、8微升RNA酶抑制剂(Promega，40000单位/毫升，)、24微升T7 RNA聚合酶(New England Biolabs，50000单位/毫升)，和dH₂O，使最终体积为400微升。在37℃下保温过夜后，采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化5′单磷酸RNA。5′单磷酸对于如下所述的将RNA连接到接头序列的DNA部分上是必需的。

将随机RNA连接到DNA-PEG-马来酰亚胺上

如上所述得到随机序列RNA集合体。用于连接反应的DNA 10-mer(SEQ ID NO.1)和DNA桥联寡(5′-CTTGTCTCCCGCGTGCCTGG)(SEQ ID NO.3)得自Operon(Alameda，CA)，且使用前经凝胶纯化处理。100皮摩尔随机40N8RNA(SEQ ID NO.2)通过用细菌碱性磷酸酶(Gibco BRL)的去磷酸化和随后的用T4聚核苷酸激酶(New England Biolabs)和γ-[³²P]ATP的磷酸化而标记。

连接反应含有50皮摩尔随机40N8 RNA、大约60000 CPM随机5′-端标记的40N8 RNA、100皮摩尔DNA-PEG-马来酰亚胺、150皮摩尔桥联寡DNA、2.5微升10X T4 DNA连接酶缓冲液(50毫摩尔/升的Tris-pH 7.8、10毫摩尔/升的氯化镁、1毫摩尔/升的ATP、25毫克/毫升的牛血清白蛋白)、0.5微升RNA酶抑制剂(Promega，40000单位/毫升)、T4 DNA连接酶，使最终浓度为1.2外斯单位/毫升(New England Biolabs)，和dH₂O，使总体积为25微升。1.2外斯单位/毫升是通过采用在其任一目录中均有的转化系数(1NEB＝0.015外斯单位)将New England Biolabs单位定义转化为外斯单位而得到的。

混合除了RNA酶抑制剂和T4 DNA连接酶之外所有组分，在70℃保温3分钟，并缓慢冷却至低于37℃。然后加入RNA酶抑制剂和T4 DNA连接酶，混合物在37℃保温90分钟。保温后，加入RNA加样缓冲液，然后混合物在70℃加热3分钟，然后将其装载到预热的8％变性聚丙烯酰胺凝胶上。通过放射自显影得到连接收率。得到的RNA-DNA-PEG-马来酰亚胺即为核酸-反应物试验混合物。生物素化双烯连接物的制备

在氩气氛中于0℃下在10毫升干燥的吡啶中合并NHS-生物素(Pierce，99.3毫克，0.291毫摩尔)和2，4-己二烯1-醇(66.2毫克，2.3当量)，并在暗处搅拌过夜，同时暖至室温。TLC(50％的乙酸乙酯/己烷)监测反应混合物显示慢反应，因而然后在氩气氛中将溶液回流过夜。在真空下除去溶剂后，接着在闪蒸硅胶上依次用5％的甲醇/乙酸乙酯和甲醇/二氯甲烷连续层析纯化，得到纯产物9，它根据其¹H和¹H-¹H COSY NMR谱表征。

化学反应

上述制备的核酸-反应物试验混合物(RNA-DNA-PEG-马来酰亚胺)与第二反应物(生物素化的双烯)在下述条件下反应。一至二纳摩尔(约50000cpm)的核酸-反应物试验混合物溶解在50微升反应缓冲液(10毫摩尔/升的MES、200毫摩尔/升的氯化钠，pH6.5)中，或者，反应缓冲液可为(10毫摩尔/升的Tris、300毫摩尔/升的氯化钠，pH7.0)。将混合物在70℃加热5分钟。接着加入氯化镁至分别得到100微摩尔/升和10微摩尔/升的最终浓度，并使溶液缓慢达到室温(大约10分钟)。然后加入生物素化的双烯至最终浓度为1毫摩尔/升，混合物在室温下保温12小时。然后将溶液装载到固定化的链霉抗生物素蛋白柱上，用含有10微摩尔/升的氯化镁的反应缓冲液充分洗涤。通过蛋白酶K处理，接着用反应缓冲液洗涤，结合的RNA从柱基质中释放出来。或者RNA可以被反转录，但其同时仍结合在树脂上，或者可以采用二硫化物连接的生物素双烯底物，后一情况中，RNA采用50毫摩尔/升的DTT从柱上被洗脱下来。集合体富集之后，是按照标准蛋白酶K处理的洗脱cpm’s的数目。然后将洗脱的RNA反转录，PCR扩增得到cDNA，并如在典型SELEX试验中一样进行dsDNA转录。将DNA-PEG-马来酰亚胺连接物如上所述连接到RNA上，重复该方法直到得到的产物数量足以确定其结构。

实施例5未修饰的RNA和溶液中的金属促进狄尔斯-阿尔德反应的用途

严格地重复实施例4的过程，但是在反应溶液中含有金属离子铝(III)和钴(II)。

实施例6修饰的RNA(引入吡啶修饰的UTP)促进狄尔斯-阿尔德反应的用途

可采用各种前述的过程修饰本发明的核酸。给出修饰的核酸的一个实施例，其中的UTP分子已经被修饰以在5位引入吡啶型残基。将吡啶修饰的UTP引入前述的随机RNA中。通过PEG接头将修饰的RNA连接到反应物上，并用于促进狄尔斯-阿尔德反应。

接着进行以下过程，用来合成尿苷三磷酸(UTP)衍生物，它具有连接到碱基5-位上的吡啶型残基。

吡啶基甲酰胺修饰的UTP的制备

甲酰胺化

在氩气中于装有特氟隆旋阀的火焰干燥玻璃的高压储气瓶中在10毫升干燥的THF中制备5-碘尿苷-2′，3′-异亚丙(0.225克，0.545毫摩尔)、Pd(PPh₃)₄(0.1当量，56毫克)、三乙胺(10当量，0.76毫升)和4-(氨甲基)-吡啶(4当量，0.23毫升)的溶液。接着向高压储气瓶连续输入50psi的一氧化碳，并放空3次，然后加压至50psi一氧化碳并密封。剧烈搅拌烧瓶，同时加热至70℃。2小时后，钯的可以观察到的镀层开始形成。再对烧瓶搅拌18小时，冷却并放空，蒸发溶液得到微黄色的油。采用8-10％的甲醇/二氯甲烷梯度洗脱液在硅胶上层析，得到0.177克(78％)的白色固体10。通过¹H、¹³C NMR谱表征。分析样品可通过从甲醇中重结晶获得。

三磷酸酯的制备

三磷酸酯是采用以上制备的5′-羟基修饰的尿苷，按照Ludwig和Eckstein的方法(J.Org.Chem.1989，54，631-635)制备的。三磷酸酯的纯化是通过使在蒸馏水中的反应混合物与0.05-1.00摩尔/升的TBK(碳酸氢三乙铵)缓冲液通过阴离子交换柱(SephadexDEAE)而实现的。含有三磷酸酯的组分经冷冻干燥得到异亚丙基保护的三磷酸酯，它由³¹P NMR谱表征。异亚丙基保护基团的除去，是通过在70℃加热在5毫升蒸馏水中的三磷酸酯与100毫克Dowex50WX8树脂(H⁺型)15分钟，接着采用2摩尔/升的TBK缓冲液中和(至pH为8)而实现的。这一溶液的最终纯化是通过反相制备HPLC(C18柱)，采用于0.05摩尔/升的TBK缓冲液中的3-5％梯度的乙腈而进行的。这样制得的三磷酸酯(11)以三(三乙铵)盐形式根据其¹H和¹³P NMR谱表征，并采用UV吸光度(277纳米，ε＝14600M^-1cm^-1)定量。

反应如上述实施例4中所述继续进行。

实施例7修饰的RNA(混入组氨醇修饰的UTP)促进GRP的断裂的用途

可采用多种前述的过程修饰本发明的核酸。给出一个修饰的核酸的实施例，其中UTP分子已经被修饰以在5位引入组氨酸型残基。组氨酸修饰的UTP被引入前述随机RNA(SEQ ID NO.2)上。修饰的RNA经由PEG接头连接到反应物上，并用来促进胃泌素释放肽(GRP)的断裂。

组氨酸修饰的UTP的合成

按以下合成尿苷三磷酸(UTP)分子，它具有连接到碱基5-位上的组氨酸型残基。

图解：(a)醋酸钯，碘化亚铜，三苯基膦，乙烯基三丁基锡，一氧化碳，THF，70℃，5小时。(b)Hunig碱，DMF，室温，1小时。(c)2-氯-4H-1，2，3-苯基-二氧杂磷杂环己-4-酮，P₂O₇ ^4-(HNBu₃)₂ ²⁺，吡啶，二氧六环。(d)碘-吡啶/水(98∶2)。(e)氢氧化铵。(f)Dowex 50w x8，水，70℃，15分钟。

在成套偶联装置中，它装有压力平衡附加漏斗，在惰性气氛下于手套箱中，称量702.3毫克(2.0毫摩尔)的物质12、44.9毫克(0.20毫摩尔)醋酸钯、114.3毫克(0.60毫摩尔)碘化亚铜(I)、和157.4毫克三苯基膦。密封装置，从手套箱中移出，经由套管向装置的圆底部分加入30毫升无水THF。经由套管向附加漏斗部分加入0.643毫升(2.2毫摩尔)乙烯基三丁基锡在40毫升无水THF中的氩净化溶液。烧瓶连续放空并用一氧化碳进气三次，然后在70℃加热1小时，直到黄色溶液变成浅橙色。然后以每10秒1滴的速度加入乙烯基三丁基锡溶液。在加入5-10％的试剂后，溶液变为暗红色。溶液在70℃加热5小时，冷却并在真空下浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷中，并装载在二氧化硅垫片上，用200毫升己烷、200毫升二氯甲烷洗涤，产物用5％的甲醇/二氯甲烷洗脱。浓缩洗脱液，并采用5％的甲醇/二氯甲烷在硅胶上进行闪蒸层析，得到0.294克白色固体13。

组氨醇迈克尔加成加合物

TBDMS保护的组氨醇14-在氩气氛下，向在3.0毫升DMF中的205毫克(5.1毫摩尔)经己烷洗涤3x的氢化钠的搅拌着的溶液中，分批加入500毫克(2.3毫摩尔)N-甲基组氨醇二盐酸盐，结果适当的气体放出。搅拌溶液1.5小时，然后加入1.8毫升(23毫摩尔)无水吡啶和693.0毫克(4.6毫摩尔)TBDMSCl。搅拌溶液1.5小时，在真空下浓缩，用15％的CH₃OH·NH₃/二氯甲烷在二氧化硅上进行闪蒸层析，得到物质14。

迈克尔加合物15-向处于10毫升无水DMF中的167.9毫克(0.6毫摩尔)物质13的搅拌着的溶液中，加入0.105毫升(0.6毫摩尔)的二异丙基乙基胺，接着逐滴加入在1.8毫升无水DMF中的185毫克(0.72毫摩尔)物质14的溶液。搅拌溶液1小时，在真空下浓缩，用15％的CH₃OH·NH₃/乙酸乙酯在硅胶上进行闪蒸层析，得到90.0毫克白色固体15，它根据其¹H NMR谱表征。

三磷酸酯制备

向处于二氧六环/吡啶中的物质15的溶液中，逐滴加入处于THF中的2-氯-4H-1，2，3-苯基-二氧杂磷杂环己-4-酮(dioxaphosphorin-4-one)溶液，搅拌溶液20分钟，然后同时加入0.5摩尔/升的焦磷酸二(三丁基铵)的DMF溶液和三丁基胺。再另外的搅拌着的溶液20分钟，加入碘的吡啶/水溶液，搅拌溶液20分钟。用5％的亚硫酸氢钠破坏过量的碘，搅拌15分钟，浓缩溶液，并用浓氢氧化铵水解。在真空下除去氨，剩余溶液用二氯甲烷洗涤2次，用乙酸乙酯洗涤一次，并在真空下浓缩。将残余物溶解在水中，并与Dowex树脂于70℃下搅拌15分钟。过滤溶液，并用2摩尔/升的TBK缓冲液中和，直接装载在DEAE Sephadex上，并用梯度为0.05-1.0摩尔/升的碳酸氢三乙基铵缓冲液(TBK缓冲液)洗脱，得到产物，它含有微量的水杨酸盐物种和少量的TBDMS和仍保持原样的异亚丙基保护基团。再次用Dowex树脂处理物质，并在反相HPLCC18柱上，用在0.05摩尔/升的TBK缓冲液中梯度为0-5％的乙腈纯化15分钟，得到纯物质16，它由其¹H和¹³C和³¹P NMR谱表征。

反应如上述实施例4所述继续进行，但是，不是形成环乙烷产物，而是核酸将GRP蛋白水解。

实施例8结合到N-溴乙酰缓激肽上的5′-硫代磷酸酯修饰的RNA

本实施例描述平行SELEX过程，其中偶联的反应物是直接连接到随机核酸试验混合物上的5′-鸟嘌呤核苷单硫代磷酸酯(GMPS)。游离反应物是连接到缓激肽靶上的溴乙酰基团(BrBK)。本实施例描述了5′-鸟嘌呤核苷单硫代磷酸酯取代的RNA(GMPS-RNA)的选择和分析，它与N-溴乙酰化的缓激肽(BrBK)特异行地反应，并促进RNA和BrBK肽间硫醚键的形成。本领域先前的研究表明，得到处于游离溶液中和连接到载体基质上的缓激肽的配体都是困难的。如下所述，相对于起始集合体，鉴定了RNA的k_cat/K_m提高了6700倍，与N-溴乙酰-缓激肽的结合亲合力提高了100倍。这种RNA高度特异性地与其底物结合，它要求肽的氨基端和羧基端都是精氨酸残基以具有最佳的活性。

A.平行SELEX反应

平行SELEX反应，是采用作为偶联反应物连接到RNA试验混合物上的5′-鸟嘌呤核苷单硫代磷酸酯(GMPS)，和作为游离反应物和靶的溴乙酰化的缓激肽(BrBK)进行的。选择具有RNA的硫基(thioate group)被BrBK的溴化基团快速取代的能力的GMPS-RNA。接着将产物BK-S-RNA与剩余未反应的GMPS-RNA分离，并在继续进行另一选择循环之前进行再扩增。

1.GMPS-RNA

平行SELEX用初始随机约5×10¹³个长度为76个核苷酸的GMPS-RNA分子所有组成成分，这些分子具有30个随机化核苷酸(30 N1)的中心区(SEQ ID NO：4)，由Schneider等具体描述(FASEB，7，201(1993))，非随机区作为扩增的模板。核酸反应物试验混合物是通过将GMPS包含于初始和所有随后的转录反应中而形成的，这样，在引发通过T7 RNA聚合酶进行的转录中，优选使用多于等摩尔的GTP，这样约有80％全长产物由GMPS引发。转录GMPS-RNA，并采用Amicon Microcom-50旋转分离以除去过量的GMPS而纯化GMPS-RNA。GMPS-RNA采用ThiopropylSepharose 6B经纯化与非GMPS RNA分离，用二硫苏糖醇(DTT)从基质中洗脱下来，并用另一Microcon-50旋转分离从所述DTT中纯化出来。Thiopropyl Sepharose 6B(Pharmacia)在柱缓冲液(500毫摩尔/升的氯化钠，20毫摩尔/升的HEPES pH 7.0)中预洗涤，然后在使用前，以12000g旋转干燥。为了GMPS-RNA的纯化，Microcon-50柱纯化的RNA被移到终浓度为500毫摩尔/升的氯化钠、10毫摩尔/升的EDTA、20毫摩尔/升的HEPES，pH7.0的溶液中，并以每60微升孔隙体积25微升的量加入到基质中。混合物然后在70℃反应5分钟，以12000g进行旋转，用四倍柱体积的90％的甲酰胺、50毫摩尔/升的MES pH5.0于70℃进行旋转洗涤，用四倍柱体积的500毫摩尔/升的氯化钠在50毫摩尔/升的MES pH5.0中的溶液进行旋转洗涤，用四倍柱体积的100毫摩尔/升的DTT在50毫摩尔/升的MESpH5.0中的溶液进行旋转洗脱。这些条件是为了GMRS-RNA的保留和随后的洗脱而优化的。

2.溴乙酰化的缓激肽

溴乙酰化的缓激肽(BrBK)在本实施例中用作游离反应物和靶。溴乙酰基是游离反应物。BrBK是通过50微升5毫摩尔/升的缓激肽与三次连续的250微升部分的42毫摩尔/升的溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯在室温反应12分钟而合成的。过量的溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯是通过过滤5毫升氨基乙基乙酰胺(在室温反应5分钟)，接着在GS-10 Sepharose上分离而除去的。采用吸收系数为12000cm¹M^-1在220纳米测定BrBK的浓度。

3.选择反应

这些最有能力与BrBK反应的GMPS-RNA物种，经多轮SELEX作用而被重复选择。多轮选择是在反应缓冲液中，与1.1毫摩尔/升的BrBK和GMPS-RNA如以下表1所示的给定时间和温度的GMPS-RNA的浓度而进行的。

                          表1温度(℃)            37  30  30  24  24  20  0   0   0   0    0   0反应时间(s)         60  60  30  60  30  30  60  60  120 60   30  60[RNA](微摩尔/升)         40  40  40  40  40  40  20  20  20  20   20  20反应的RNA％         1.3 0.7 0.8 0.7 1.9 2.5 1.2 3.4 4.5 5.0  2.5 2.8(background ratio)  3.2 3.2 3.4 1.7 2.5 3.9 3.1 4.0 4.9 10.1 9.0 4.5

在选择期间，BrBK肽的浓度保持在1.1毫摩尔/升，该浓度低于BrBK第0轮集合体的K_m12倍。在进行选择时，反应时间是受限制的，降低反应温度以限定反应至5％或更低的GMPS-RNA。目的是为了保持二级反应条件，以选择结合和化学二者的性质改善。BrBK活性以12.5微摩尔/升的BrBK采用25摩尔/升的GMPS-RNA进行分析；当反应进行至结束时，有50％的RNA通过BrBK共价结合，这表明肽的溴乙酰化基本完成。

反应猝灭是采用最终浓度为235毫摩尔/升的硫代磷酸钠(1-8轮)或硫代硫酸钠(9-12轮)进行的，并在变性的7M脲8％聚丙烯酰胺APM凝胶上(1-6轮)或通过亲合层析(7-12轮)进行分离。反应的RNA％指自丙烯酰胺凝胶分离的以BK-S-RNA存在的或在亲合柱分离中游离洗脱的BK-S-RNA的总GMPS-RNA的百分比。在这两种情形中，从回收的RNA中扣除背景；背景是指从对照处理中回收的RNA的量，其中的反应是在加入BrBK之前被猝灭的。背景比是反应的RNA与作为背景存在的RNA之间的比值。通过调节反应时间，而尝试在整个SELEX的所有轮次中保持该比值在2至10之间。

分离是通过在Thiopropyl Sepharose 6B上减去GMPS-RNA，或者通过在APM聚丙烯酰胺凝胶上分离两个物种而实现。合成[(B-丙烯酰胺基)苯基]氯化汞(APM)并以25微摩尔/升的浓度在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中用于含有硫醇的RNA的保留，如G.L.Igloi，Biochemistry 27，3842(1988)中所报导的。通过在100毫摩尔/升的DTT存在下洗脱而从APM-聚丙烯酰胺中纯化出GMPS-RNA。与引用的文献一致，发现新纯化的APM-保留的GMPS-RNA当再次在APM凝胶上展开时，给出不保留的RNA游离条带，该条代由大约所施加的GMPS-RNA总量的3％组成。游离展开(free-running)的RNA是成问题的，因为它与BK-RNA非常接近地展开(无论用于凝胶中的丙烯酰胺百分含量是多少)，因而在分离期间增大背景。当这种游离展开的RNA从凝胶中纯化出，并在APM凝胶上再展开，大约有50％的这种RNA仍保持游离展开，其余的RNA与GMPS-RNA一样地展开。游离展开的RNA的量与在沉淀期间所花费的时间的量成比例，而不取决于pH影响、是否存在DTT、乙酸镁、甲酰胺、脲或加热。

反转录和聚合酶链反应是如Schneider等报导的(FASEB，7，201(1993))而进行的。GMPS-RNA集合体的k_obs值在第4轮至第6轮之间提高100倍，但对于更多轮仅提高2倍。测定k_obs值的反应是在0℃于反应缓冲液(50毫摩尔/升的HEPES，pH7.0，5毫摩尔/升的氯化镁，150毫摩尔/升的氯化钠)以2微摩尔/升的GMPS-RNA和130微摩尔/升的BrBK进行的，在0、1、3、10、30和90分钟时进行检测。GMPS-RNA在70℃变性3分钟，在其稀释到最终反应缓冲液条件，移入冰中，并加入BrBK之前，使之缓慢地冷却到室温。反应采用235毫摩尔/升的硫代硫酸钠在冰上猝灭，并在变性的7M脲8％聚丙烯酰胺APM凝胶上展开。K_obs值是以未反应的GMPS-RNA浓度相对于时间的曲线图的数据点的线性范围的负斜率测定的。第10轮和第12轮集合体被用来克隆和测序。

B.克隆

对56种克隆进行测序。用BrBK比较16种反应物与30 N1集合体的反应；相对于原始集合体，所有测试的反应物的k_obs值均提高了10至100倍。反应物12.1(SEQ ID NO：5)被选择作进一步的动力学分析，选择根据以下三个标准做出：(i)在用竞争性的缓激肽进行的反应抑制的初步研究中，它具有最低的对缓激肽的K_i(数据未列出)；(ii)它是第12轮群最频繁出现的分子；以及(iii)它具有所测试的反应物中第二最快的k_obs。

所选择的反应物12.1，其k_obs的增加对反应性和结合的提高都有贡献。在与BrBK的反应中，反应物12.1较30N1 GMPS-RNA的k_cat提高了67倍，而其K_m降低了100倍，从而使得k_cat/K_m总体上提高了6700倍(参见表1)。

C.特异性

与反应物12.1的最优结合所需要的BrBK结构元素，是通过用缓激肽类似物对反应的抑制而研究的。通过BK的抑制在30N1 GMPS-RNA与BrBK的反应中是不可测量的(数据未列出)，天然缓激肽(BK)对反应物12.1与BrBK间反应的K_i为140±60微摩尔/升。这一数值几乎等于未抑制的反应的K_m值。des Arg⁹-BK(一种缺少羧基端基精氨酸的BK类似物)具有的K_i为2.6±0.5毫摩尔/升。这样，羧基端精氨酸的缺少，使BK与反应物12.1之间的结合降低了约18倍。另外，des-Arg¹-BK(一种缺少氨基端精氨酸的BK类似物)对于反应物12.1与BrBK间的反应没有表现出任何可测的抑制作用，表明氨基端精氨酸是所观察到的反应物12.1和BrBK间的结合所必需的。精氨酸的识别必须在肽中进行，这是由于单独的游离L-精氨酸并不可测地抑制反应。因此，反应物12.1对BrBK的亲合力较之30N1 GMPS-RNA对BrBK的亲合力的提高，部分地对BrBK的氨基端精氨酸的识别有贡献，而更低程度的对羧基端精氨酸的识别有贡献。

反应物12.1的内在反应活性，是采用N-溴乙酰胺(BrAcNH₂)作为最小的溴乙酰结构而研究的。反应物12.1和30N1 RNA集合体与BrAcNH₂的反应中的K_m和k_cat大致相同。因此，反应物12.1与BrBK的反应速率提高明显不是由于硫基(thioate group)的亲核性提高，而是由于两种底物的定位中的立体和/或熵因素的结果。因此，化学反应被促进，正如进行平行SELEX方法所要求的。

实施例9未修饰的RNA和咪唑-UMP修饰的RNA促进克莱森缩合的用途

本实施例描述了平行SELEX过程，其中偶联的反应物为经由PEG接头连接到随机核酸试验混合物上的苯乙酮。核酸试验混合物含有100个核苷酸的随机序列，它们是未被修饰的或者含有咪唑-UTP。苯乙酮反应物-核酸试验混合物的制备在实施例1-3中描述。游离反应物为生物素-4-硝基酚分子。由RNA促进的反应，是苯乙酮与硝基酚部分之间的克莱森反应，如下示意图所示。

                 生物素对硝基酚酯

用于PCR和RNA的转录的单链DNA模板

采用标准方法，合成147个核苷酸100N8的单链DNA(ssDNA)寡核苷酸，它具有100个核苷酸的连续随机序列区和5′和3′固定区(SEQ ID NO：6)。除了3′-固定区中的位于随机区侧翼的8个核苷酸与5′-固定区中的位于随机区侧翼的8个核苷酸互补之外，100N8C(SEQ ID NO：7)ssDNA模板与100N8一样。100N8C的互补的8个核苷酸被提供以与可变区中的100N环在RNA中形成主干结构。100N8C因此而具有起始结构。

制备单拷贝双链PCR产物

在PCR反应中使用2纳摩尔100N8和100N8C的单拷贝ssDNA模板，用于2环扩增，生成2纳摩尔转录产物。单拷贝双链PCR产物在Qiagen柱上纯化用于转录。各1纳摩尔的100N8和100N8C模板，用于用未修饰的RNA转录，各1纳摩尔的模板用于用5-咪唑-UTP转录。RNA转录产物如下纯化、连接和凝胶纯化。

制备具有5′单磷酸的随机RNA集合体

RNA转录产物是通过在500微升反应混合物中的双链PCR产物的转录而制备的，所述反应混合物含有40毫摩尔/升的Tris-Cl、12毫摩尔/升的氯化镁，1毫摩尔/升的亚精胺、各1毫摩尔/升的ATP、CTP、UTP或5-咪唑-UTP、20毫摩尔/升的GMP、0.26微摩尔/升的α-³²P-ATP、5毫摩尔/升的DTT、4％的PEG、0.002％的TritonX-100，pH8.0。RNA的浓度在125纳摩尔/升至1微摩尔/升之间变化，较低的浓度给出较高的扩增。T7 RNA聚合酶加入至1.5μM，转录反应在37℃保温2小时。反应混合物萃取1x，每次采用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(50∶50)和氯仿。在萃取之后，RNA施加到CentrexUF-0.5 30000MW过滤器上。RNA用500微升水洗涤3x。RNA从各过滤器于200微升水中洗脱出来。对RNA定量。

将随机RNA连接到DNA-PEG-苯乙酮上

RNA以浓度为5微摩尔/升RNA在500微升等分试样中连接到苯乙酮-PEG-10-核苷酸DNA上。连接反应分为两个步骤。第一步，RNA与2倍过量的苯乙酮-PEG-10-核苷酸DNA和3倍过量的20-核苷酸桥联DNA于330微升混合物中在72℃保温3分钟，所述混合物含有66毫摩尔/升的Tris-Cl、5毫摩尔/升的氯化镁、1毫摩尔/升的DTE、1毫摩尔/升的ATP，pH7.5(1x BoehringerMannheim连接酶缓冲液)。第二步，当反应混合物达到室温后，向其中加入40微升的Boehringer Mannheim酶贮存缓冲液(20毫摩尔/升的Tris-Cl、60毫摩尔/升的氯化钾、1毫摩尔/升的EDTA、5毫摩尔/升的DTE、50％的丙三醇，pH 7.5)、53微升水、17微升RNA酶抑制剂(Promega，40单位/微升)、17微升10x连接酶缓冲液(如上所述)和40微升连接酶(Boehringer Mannheim，5单位/微升)，使其最终体积为500微升。将连接反应在37℃的恒温箱中放置2-3小时。RNA在两个1.5毫米6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上展开。连接的RNA从凝胶上切割下来，冷冻挤压过0.2μM过滤器，通过NAP-5脱盐柱，并在真空离心蒸发浓缩器.中干燥。干燥的连接的RNA重新悬浮在50微升水中，并定量。

化学反应

核酸-反应物试验混合物(苯乙酮-PEG-DNA-RNA)与第二反应物(生物素-4-硝基酚)的反应是在500μL等分试样中进行的，它含有50毫摩尔/升的Hepes、200毫摩尔/升的氯化钠、200毫摩尔/升的氯化钾、2毫摩尔/升的氯化镁、2毫摩尔/升的氯化钙、10微摩尔/升的氯化锌、20％的乙腈，pH 7.0。反应中连接的RNA的浓度为2.5微摩尔/升，生物素-4-硝基酚的浓度为0.5毫摩尔/升。核酸-反应物和第二反应物的浓度根据需要进行调节以提高严紧性。反应混合物在25℃保温17小时。在保温后，反应混合物先通过NAP-5柱，接着通过NAP-10柱，以除去游离的生物素-4-硝基酚化合物。这些样品在真空离心蒸发浓缩器中干燥，然后悬浮在100微升水中。测定这些样品的比活。已反应的产物如下所述分离、反转录、PCR扩增和转录。苯乙酮-PEG-DNA_10mer连接物如上所述连接到RNA上，重复选择/扩增，直到试验混合物集合体中的促进RNA足够富集以确定其连接的反应产物的结构。

凝胶移位分离

第1-3轮

加入链霉抗生物素蛋白(10纳摩尔)和10x缓冲液(给出含有10毫摩尔/升的Tris、150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.5的溶液)，各样品在37℃保温15分钟，然后在70℃保温3分钟。作为生物素化RNA的链霉抗生物素蛋白诱导的凝胶移位的阳性对照，生物素-PEG-DNA₁₀-RNA_100N(大约7皮摩尔)，其制备类似于以上苯乙酮-PEG-DNA₁₀-RNA_100N，与10纳摩尔链霉抗生物素蛋白如上所述保温的。链霉抗生物素蛋白移位的样品，在隔热的凝胶装置中于50瓦特下，在1.5毫米6％的变性凝胶上展开，直到二甲苯蓝指示染料剂距底部约有1英寸。

切除在移位区域的凝胶条带，该条带是由阳性对照测知的。RNA从凝胶中冷冻挤压，并通过NAP-5柱，在真空离心蒸发浓缩器.中干燥。RNA重新悬浮在50微升水中。回收的RNA的量通过测定回收的计数并使用施加在凝胶上的RNA的比活性而测定。反转录RNA，得到的DNA被PCR扩增。PCR产物接着进行转录，RNA转录产物如上所述连接到苯乙酮-PEG-DNA_10mer上。

用链霉抗生物素蛋白-涂覆的磁性珠(DYNAL)分离

第4-6轮

将在1.5毫升微量离心管中的50微升顺磁珠浆液(应结合多达100皮摩尔生物素化的寡核苷酸)放置在MPC装置中(磁性固定器)，并除去上清液。通过在每次洗涤之间将试管放置在MPC中，用含有10毫摩尔/升的Tris，pH 7.5，1毫摩尔/升的EDTA、2.0摩尔/升的氯化钠、0.5％的PEG 2000的结合和洗涤(B&W)缓冲液洗涤珠3x。B&W缓冲液用DEPC-处理的水制备。为了结合反应，将珠重新悬浮在100微升B&W缓冲液中。将RNA加入到100微升DEPC处理的水中，使总体积为200微升。RNA与珠保温30分钟，期间不定期地混合。试管放置在MPC固定器中，移除缓冲液体并保存为#1。珠用200微升B&W液洗涤2x，在洗涤之间放置在MPC固定器中。洗涤缓冲液保存为#2和#3。然后用200微升水洗涤珠，接着用100微升水洗涤。保存并合并水洗涤物为#4。将珠重新悬浮在50微升水中并保存为#5。在第6轮后，再另外用200微升水洗涤。将各洗涤缓冲液分别加入到4毫升闪烁液小瓶中。对磁性珠的等分试样也进行计数。这些数值用来测定结合％。本实验中的背景低于0.02％，背景是在没有第二反应物(生物素-4-硝基酚)的反应中将核酸-反应物试验混合物(苯乙酮-PEG-DNA-RNA)保温而测得的。将连接到珠上的RNA反转录。采用热变性条件和MPC固定器从珠中移出cDNA并进行PCR扩增。

逆SELEX方法

为了消除可能存在的不期望的产物，这些不期望的产物是由第二反应物(生物素-4-硝基酚)与核酸的普通官能团或因修饰RNA而引入的基团(咪唑)的反应而产生的，存在几种逆SELEX方法。

DNA-PEG接头的脱氧核糖核酸酶I消化是用来除去核酸-反应物试验混合物(苯乙酮-PEG-DNA-RNA)间的不包括第一反应物的产物的最有效的方法。所有的生物素化的产物都将连接到在磁性珠上的链霉抗生物素蛋白上。在为了除去任何未结合的核酸-反应物的多个洗涤步骤后，将磁性珠(具有结合的生物素化的RNA)重新悬浮在200微升脱氧核糖核酸酶I缓冲液中。加入脱氧核糖核酸酶I(4单位；不含核糖核酸酶)，DNA在37℃消化30分钟。将珠置于MPC中，释放出来的RNA在上清液中收集。对珠进行几次洗涤，以除去任何未结合的RNA。上清液和洗涤液仅含有由苯乙酮和生物素-4-硝基酚间的反应形成的产物连接到链霉抗生物素蛋白上的RNA。RNA溶液经苯酚/氯仿萃取以除去脱氧核糖核酸酶，并放置在真空离心蒸发浓缩器中干燥。将RNA重新悬浮在水中，并反转录。cDNA经PCR扩增，以制备用于下一轮转录的双链DNA产物。

或者，逆SELEX方法可包括减去步骤，其中RNA连接到另一种反应物-PEG-DNA_10mer上，即在克莱森缩合中为双烯。将这种RNA在与苯乙酮-PEG-DNA-RNA相同的条件下与第二反应物(生物素-4-硝基酚)反应。现在将连接到链霉抗生物素蛋白涂覆的磁性珠上的RNA通过NAP-10柱以除去盐，并在真空离心蒸发浓缩器中干燥，重新悬浮在水中，并反转录。PCR扩增cDNA，并转录以连接到苯乙酮-PEG-DNA_10mer上用于正选择。

如果未连接的RNA与第二反应物的保温引起相似数量的RNA结合到靶上，那么那些不期望的RNA可以通过使这一混合物通过磁性珠而除去。未结合的RNA接着通过NAP-10脱盐柱，并在真空离心蒸发浓缩器中干燥。RNA接着重新悬浮在水中，并直接用于与苯乙酮-PEG-DNA_10mer的连接反应中。苯乙酮-PEG-DNA-RNA接着如上所述与生物素-4-硝基酚保温。

实施例10RNA促进的克莱森反应

本实施例描述了平行SELEX过程，其中偶联的反应物为经由PEG接头连接到如前述实施例1-3中所述的随机核酸试验混合物上的苯乙酮。核酸试验混合物包括100个核苷酸的随机序列，含有苯甲酰-UTP或者咪唑-UTP。所述游离反应物为AMP-生物素分子。由RNA促进的反应是苯乙酮与AMP部分的克莱森反应，如下面的示意图所示。

苯乙酮-核酸试验混合物的合成

起始随机核酸试验混合物为2纳摩尔100N8，含有苯甲酰-UTP或咪唑-UTP，如实施例1所述。苯乙酮亲核试剂经由DNA-PEG接头连接到RNA分子上，如实施例2-3所述。AMP-生物素是通过等摩尔的AMP和生物素在过量在HCl/吡啶混合物中的DCC的存在下保温而合成的。AMP-生物素经反相HPLC纯化，并采用³¹P-NMR表征。

化学反应

SELEX反应缓冲液含有200毫摩尔/升的HEPES(pH7)、200毫摩尔/升的硫化钠、200毫摩尔/升的氯化钾、2毫摩尔/升的氯化镁、2毫摩尔/升的氯化钙、各10微摩尔/升的氯化钴、氯化铜、氯化亚铁、氯化锰、氯化镍、氯化锌，反应在25℃保温。在所述SELEX实验中，反应的严紧性在SELEX试验期间逐渐提高，这是通过由10微摩尔/升至1微摩尔/升降低RNA的浓度、由10毫摩尔/升至0.2-1毫摩尔/升降低AMP-生物素浓度，和由16小时至1小时减少保温时间而实现的。促进RNA分子的分离，是根据反应的分子上的生物素标记进行的。凝胶移位分离用于第1-7轮和第11轮；顺磁性链霉抗生物素蛋白Dynabeads M-280用于第8-10轮和第12-14轮的分离。在第12-14轮期间，富集集合体和起始集合体的SELEX反应并列进行。相应的背景通过在没有AMP-生物素的存在下，将各RNA集合体的一半保温而测定的。

为了确定这种生物素化是在端基亲核试剂还是在内部反应中心发生，第14轮或者采用正确的端基亲核试剂或者采用非反应性双烯连接在RNA分子上而进行。这一比较表明，具有作为端基亲核试剂的苯乙酮的RNA分子大多是在内部生物素化的。促进内部生物化的RNA分子，将采用如实施例9所述的逆SELEX方法从集合体中除去。SELEX集合体，通过具有提高的反应严紧性的继续的轮，进一步被富集以得到促进端基亲核试剂生物素化的RNA分子。

实施例11RNA促进的酰胺化反应

本实施例描述了平行SELEX过程，其中偶联的反应物为经由PEG接头连接到如实施例1-3所述制备的随机核酸试验混合物上的胺。核酸试验混合物包括100个核苷酸的随机序列，含有苯甲酰-UTP或咪唑-UTP。游离反应物为AMP-生物素分子。由RNA促进的反应是胺与AMP部分的反应，如下面的示意图所示。

胺-RNA文库的合成

起始随机核酸试验混合物为2纳摩尔100N8，含有苯甲酰-UTP或咪唑-UTP，如实施例1所述。胺亲核试剂经由DNA-PEG接头连接到RNA分子上，与在实施例1-3中所提供的描述相似。

AMP-生物素是通过等摩尔的AMP和生物素在过量在HCl/吡啶混合物中的DCC的存在下保温而合成的。AMP-生物素经反相HPLC纯化，并用³¹P-NMR表征。

反应

SELEX反应缓冲液含有200毫摩尔/升的HEPES(pH7)、200毫摩尔/升的氯化钠、2毫摩尔/升的氯化钾、2毫摩尔/升的氯化镁、2毫摩尔/升的氯化钙、各10微摩尔/升的氯化钴、氯化铜、氯化亚铁、氯化锰、氯化镍、氯化锌，反应在25℃保温。在SELEX试验期间，通过将RNA的浓度由10微摩尔/升降至1微摩尔/升，将AMP-生物素浓度由10毫摩尔/升降至0.2-1毫摩尔/升，和将保温时间由16小时降至1小时而使反应的严紧性逐渐提高。根据存在于已反应的分子上的生物素标记进行促进RNA分子的分离。凝胶移位分离用于第1-7轮和第11轮；顺磁性链霉抗生物素蛋白Dynabeads M-280用于第8-10轮和第12-14轮的分离。在第12-14轮中，富集集合体和起始集合体的SELEX反应并列进行。相应的背景通过在没有AMP-生物素的存在下，保温各RNA集合体的一半而测定的。

为了确定这种生物素化是在端基亲核试剂还是在内部反应中心发生，第14轮或者用正确的端基胺亲核试剂或者用非反应性双烯连接在RNA分子上而进行。这一比较表明，咪唑-UTP RNA分子的生物素化优先在端基胺上进行。促进内部生物素化的RNA分子，将采用如实施例9所述的逆SELEX方法从集合体中除去。SELEX集合体，通过具有提高反应严紧性的继续的轮，进一步富集促进端基亲核试剂生物素化的RNA分子。

实施例12未修饰的和5-咪唑-RMP修饰的RNA促进酰化反应的用途：从NHS-氨基甲酸酯-官能化的肽文库中选择人嗜中性弹性蛋白酶抑制剂

平行SELEX方法的其它应用，包括采用连接到伯胺上的未修饰或5-咪唑-UMP-修饰的RNA，从巨大的NHS-氨基甲酸酯-官能化的肽文库中选择丝氨酸蛋白酶人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)的抑制剂。该应用从事预合成的组合文库的去褶合。根据所得的RNA连接的肽与HNE反应的能力，选择能够促进连于其上的亲核性伯胺和NHS-氨基甲酸酯的亲电性羰基碳之间反应(酰化反应)的RNA。这一平行SELEX试验的更为详细的描述，该SELEX试验目前还在进行中，提供如下。

NHS-氨基甲酸酯-官能化的肽-膦酸二苯酯文库的合成

几种(α-氨基烷基)膦酸二苯酯的肽衍生物，已知为有效的HNE的不可逆(共价)抑制剂(J.Oleksyszyn和J.C.Powers.1991.(α-氨基烷基)膦酸二苯酯肽衍生物对丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制，Biochmistry 30：485-493)。采用已知的弱抑制剂Val^P(OPh)₂作为起始点，提供标准溶液相组合分裂合成法，合成了大约250000种不同四肽膦酸二苯酯文库。合成50种不同的Boc-保护的氨基酸的对称酸酐，用IR谱表征，并与氨基膦酸酯6进行反应，如下示意图所示。反应被组合得到约100种化合物混合物7，它具有与Boc-二肽混合物一致的¹H和³¹P共振。将混合物7转化为游离胺8，将其分为50等分，各自用50种酸酐处理，形成5K文库9。重复该方法一次，完成肽文库。得到的脱保护的肽被衍生化为NHS氨基甲酸酯。

RNA集合体

随机序列RNA集合体(100N；100个核苷酸连续随机序列；未修饰的或5-咪唑-U-修饰的)DNA-PEG-NH₂上，连接到如实施例1-3所述。

RNA-NH₂集合体与NHS-氨基甲酸酯-官能化的肽文库的反应

对于各RNA集合体，起始反应(以典型反应的实施例给出)由在200微升反应缓冲液(20％v/v甲醇、100毫摩尔/升的氯化钠、10毫摩尔/升的氯化钾、1毫摩尔/升的氯化镁、1毫摩尔/升的氯化钙、100微摩尔/升的氯化锰、10微摩尔/升的硫酸铜、10微摩尔/升的氯化锌、10微摩尔/升的氯化钴、10微摩尔/升的氯化镍、50毫摩尔/升的HEPES，pH 7.5)中的大约2纳摩尔RNA-NH₂和100纳摩尔NHS-氨基甲酸酯官能化的肽组成。在22℃保温16小时后，游离肽通过大小排阻层析从RNA溶液中除去。通过在30000分子量截断(MWCO)微离心旋转过滤器上保留，接着充分洗涤以除去任何剩余的游离肽将RNA进一步纯化。

为了防止根据其对HNE的亲合性对RNA序列选择，回收的RNA采用一种RnaseH负反转录酶(superscript；GibcoBRL)进行反转录，以制备双链RNAcDNA杂化物。

RNA-连接的HNE抑制剂的选择-有效选择RNA-连接的HNE抑制剂的方法已经完全得到表征。这些方法或者利用游离RNA和HNE连接的RNA在变性聚丙烯酰胺凝胶上的微分迁移率，或者利用RNA-连接的HNE抑制剂在珠偶联的HNE上的比保留。当琼脂糖珠(Sepharose 6B)偶联的HNE用来在第一选择循环中选择RNA-连接的HNE抑制剂时，下述的每一种方法都可在整个选择方法中使用，以确保仅富集与NHS氨基甲酸酯官能化的HNE抑制剂的酰化反应的RNA(即，通过在不同分离方法间，应该不会富集因具有连接的HNE抑制剂以外的原因而被保留的核苷酸)。

对于凝胶移位分离，回收的RNA与过量的HNE在HNE反应缓冲液(1M氯化钠，0.01％的Triton X-100，50毫摩尔/升的HEPES，pH 7.5)中组合，并于室温下保温30分钟。两倍体积的凝胶装填缓冲液(7M脲，50％v/v甲酰胺，0.05％的SDS，20毫摩尔/升的磷酸钾，1毫摩尔/升的EDTA，0.1％ w/v的二甲苯蓝和溴酚蓝)加入反应混合物中，接着在变性聚丙烯酰胺凝胶(5％的丙烯酰胺(19∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)、7M脲、50％v/v的甲酰胺、0.05％的SDS、20毫摩尔/升的磷酸钾、1毫摩尔/升的EDTA)上电泳，采用20毫摩尔/升的磷酸钾/1毫摩尔/升的EDTA作为展开缓冲液。在电泳之后，RNA-HNE连接物通过放射自显影鉴定，并采用标准方法回收。

已经开发了两种采用珠偶联的HNE来分离RNA-连接的HNE抑制剂的方法。在第一种方法中，HNE经由可断裂的接头连接到Sepharose 6B上的。更具体地说，硫代丙基-Sepharose 6B(Sigma；吡啶二硫醇连接臂)通过用DTT还原连接臂而转化为硫醇-Sepharose 6B。在除去DTT后，该硫醇官能化的珠与3-(2-吡啶二硫醇)丙酰肼(PDPH；Pierce)反应，得到酰肼官能化的珠，它具有含有二硫化物的连接臂，该连接臂易被还原剂断裂。偏高碘酸钠氧化的HNE接着通过酰肼基团偶联到珠上。采用这一过程偶联到Sepharose珠上的HNE保留了全部活性，并有效地保留了RNA连接的HNE抑制剂。得到的RNA-HNE连接物可通过用DTT(150毫摩尔/升的氯化钠，≥100毫摩尔/升的DTT，50毫摩尔/升的HEPES，pH7.5)断裂连接臂而从珠上被洗脱下来。HNE的特性洗脱防止与HNE之外的基质成分发生相互作用的核酸保留。

还将HNE偶联到链霉抗生物素蛋白涂覆的超顺磁性珠上(Dynabeads(Dynal))，仅当其被放置在磁场中才表现出磁性)。对于这种特殊应用十分重要，这些均匀尺寸的聚苯乙烯(具有均匀分散的三氧化二铁)珠，表现出非常低的与核酸非异特性结合。HNE的偶联，是通过首先采用生物素-LC-酰肼(Pierce)对偏高碘酸钠氧化的HNE进行生物素化，接着将生物素-HNE加入到链霉抗生物素蛋白涂覆的珠上。通过这一过程偶联的HNE对保留RNA连接的HNE抑制剂也完全有效。由于它们的非常低的非特异性结合性质，HNE连接的RNA可直接在珠的存在下被扩增。

用每一种所述的分离方法，通过提高结合反应的严紧性，可在SELEX方法中优先选出最佳的HNE抑制剂。它可以这样得以实现，例如，通过降低反应物的浓度，通过减少保温时间，或通过要求RNA连接的HNE抑制剂与可逆性HNE抑制剂与HNE竞争结合。重复选择/扩增方法，直到RNA集合体被富集了足够的促进RNA，以允许鉴定与它们特定连接的HNE抑制剂。

                     序列表<110>耐克斯达药物公司<120>平行Selex<130>NEX 22 C2/PCT<140><141><150>09/157,601<151>1998-09-21<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>1ccaggcacgc<210>2<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>2gggagacaag aataaacgct caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnttcgaca ggaggctcac aacaggc                                     87<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>3cttgtctccc gcgtgcctgg                                            20<210>4<211>77<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>4gggagcucag aauaaacgcu caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnuucgaca 60ugaggcccgg auccggc                                                77<210>5<211>78<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>5gggagcucag aauaaacgcu caaagcuguu ggcagcgcug gugaagggau aggcuucgac 60augaggcccg gauccggc                                               78<210>6<211>147<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>6gggagacaag aataaacgct caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120nnnttcgaca ggaggctcac aacaggc                                     147<210>7<211>147<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：核酸<400>7gggagacaag aataaacgct caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120nnnttgagcg tgaggctact aacaggc                                     147

Claims (27)

1.一种制备具有在靶上进行预选功能的能力的产物的方法，所述方法包括：

(a)制备核酸试验混合物，其中所述核酸试验混合物包括具有一个或多个选自以下基团的官能团的核酸：

其中星号表示官能团连接到核酸的部位，n可为任何整数，且其中所述官能团可以在脂族或芳香族位置被取代；

(b)将所述核酸试验混合物的各成员与第一反应物偶联以形成核酸-第一反应物试验混合物；

(c)将所述核酸-第一反应物试验混合物与由分子量范围为2至1000的有机小分子组成的游离反应物混合物接触而形成产物文库，其中所述产物文库是所述第一反应物和至少一种所述游离反应物之间的成键反应的结果，其中所述成键反应由偶联到所述第一反应物上的核酸促进；

(d)将步骤(c)的产物文库与靶接触，其中相对于产物文库而言具有对所述靶表现出预选功能的能力的产物可以与产物文库的剩余物分离；以及

(e)分离具有对所述靶表现出预选功能的所述能力的所述产物与产物文库的剩余物，由此所述产物被鉴定。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸试验混合物包括具有保守序列区和随机序列区的核酸。

3.权利要求1的方法，其中所述偶联到所述第一反应物上的所述核酸选自单链RNA、单链DNA和双链DNA。

4.权利要求1的方法，其中所述核酸试验混合物包括在2′-或5-位被修饰的嘧啶。

5.权利要求1的方法，其中所述官能团在所述核酸的核糖位置上。

6.权利要求1的方法，其中所述官能团在所述核酸的碱基位置上。

7.权利要求1的方法，其中所述官能团在所述核酸的磷酸位置上。

8.权利要求1的方法，另外包括偶联在所述第一反应物和所述核酸之间的连接基团。

9.权利要求8的方法，其中所述连接基团的大小范围为10至1000D。

10.权利要求9的方法，其中所述连接基团选自PEG、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯和多肽。

11.一种共制备促进成键的核酸和在靶上进行预选功能的产物的方法，所述方法包括：

(a)制备核酸试验混合物，其中所述核酸试验混合物包括具有一个或多个选自以下基团的官能团的核酸：

其中星号表示官能团连接到核酸的部位，n可为任何整数，且其中所述官能团可以在脂族或芳香族位置被取代；

(b)将第一反应物偶联到所述核酸试验混合物的各成员上以形成核酸-第一反应物试验混合物；

(c)将所述核酸-第一反应物试验混合物与由分子量范围为2至1000的有机小分子组成的游离反应物混合物接触而形成产物文库，其中所述产物文库是所述第一反应物和至少一种所述游离反应物之间的成键反应的结果，其中所述成键反应由偶联到所述第一反应物上的核酸促进，且其中各产物均偶联到核酸上；

(d)将所述产物文库与靶接触，其中相对于产物文库而言在所述靶上进行预选功能的产物可以与产物文库的剩余物分离；以及

(e)扩增与在所述靶上进行预选功能的产物相连的核酸，得到富含促进所述第一反应物和所述游离反应物之间的成键反应的核酸的核酸混合物，由此制备所述促进成键的核酸和所述产物。

12.权利要求11的方法，另外包括：

(f)将扩增的核酸与所述第一反应物偶联；以及

(g)重复步骤(c)至(f)，直至产生足量的在所述靶上进行所述预选功能的产物以确定结构。

13.权利要求11的方法，其中所述核酸试验混合物包括具有保守序列区和随机序列区的核酸。

14.权利要求11的方法，其中偶联到所述第一反应物上的所述核酸选自单链RNA、单链DNA和双链DNA。

15.权利要求11的方法，其中所述官能团在所述核酸的核糖位置上。

16.权利要求11的方法，其中所述官能团在所述核酸的碱基位置上。

17.权利要求11的方法，其中所述官能团在所述核酸的磷酸位置上。

18.权利要求11的方法，另外包括偶联在所述第一反应物和所述核酸之间的连接基团。

19.权利要求18的方法，其中所述连接基团的大小范围为10至1000D。

20.权利要求19的方法，其中所述连接基团选自PEG、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯和多肽。

21.一种生产产物文库的方法，所述方法包括将各自偶联到核酸试验混合物的成员上的第一反应物混合物与游离反应物混合物接触，其中所述核酸试验混合物包括具有一个或多个选自以下基团的官能团的核酸

其中星号表示化学基团连接到核酸上的部位，n可为任何整数，且其中所述化学基团可以在脂族或芳香族位置被取代，第一反应物和游离反应物各自由分子量范围为2至1000的有机小分子组成，其中所述产物文库是所述第一反应物和至少一种所述游离反应物之间的成键反应的结果，其中所述成键反应由偶联到所述第一反应物上的核酸促进。

22.权利要求21的方法，其中所述官能团在所述核酸的核糖位置上。

23.权利要求21的方法，其中所述官能团在所述核酸的碱基位置上。

24.权利要求21的方法，其中所述官能团在所述核酸的磷酸位置上。

25.权利要求21的方法，另外包括偶联在所述第一反应物和所述核酸之间的连接基团。

26.权利要求25的方法，其中所述连接基团的大小范围为10至1000D。

27.权利要求26的方法，其中所述连接基团选自PEG、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯和多肽。

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