CN1379681A - 治疗性的血管生成因子及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了刺激需要血管生成的人或动物中的血管生成的方法,还提供了含有血管生成因子和药物可接受载体的组合物。在一个实施方案中,所述方法包括给人或其它动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的血管生成因子,例如多效素或midkine蛋白。在一个实施方案中,载体包括可控释血管生成因子的控释基质,如聚合物。该聚合物是可生物降解的和/或可生物侵蚀的,优选是可生物相容的。可用于控释的聚合物包括例如聚(酯),聚(酸酐)和聚(氨基酸)。聚合物包括例如丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物和聚－丙交酯－共－乙交酯。在另一个实施方案中,血管生成因子可包含在含有脂质体,如异囊型脂质体的载体中被提供。如脂质体的载体可含有能将脂质体靶向体内预定位点的靶向配体。可以给血管系统,例如心血管系统或外周血管系统施用血管生成因子。在优选的实施方案中,血管生成因子是多效素蛋白或midkine蛋白。在另一个实施方案中,提供了刺激人或动物中的血管生成的方法,所述方法包括给人或动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的基因转移载体,所述基因转移载体能编码产生多效素或midkine蛋白。基因转移载体可以是例如裸露的DNA或病毒载体,并且可以例如与脂质体联合使用。

Description

治疗性的血管生成因子及其使用方法
技术领域
本发明一般涉及诸如多效素(pleiotrophin)的治疗性血管生成因子促进血管生成以治疗包括心血管病的多种适应症的用途。
背景技术
在胚胎和新生儿生长过程中，多肽生长因子对组织的适时发育起着重要的生理作用，因此，它们的表达被严格地调控。相反，在肿瘤细胞系以及实体肿瘤中，多肽生长因子基因的表达失去了控制，Cross和Dexter，细胞，64：271(1991)。
多效素(PTN)是属于肝素结合生长因子家族的分泌型生长因子，Lai等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，187：1113-1121(1992)。起初，多效素作为弱的促分裂原纯化自牛子宫和作为轴突突起促进剂纯化自新生大鼠的脑，Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，165：1096-1103(1989)；Rauvala，EMBO J.，8：2933-2941(1989)；和Li等，科学，250：1690-1694(1990)。已有人报道从人乳腺癌细胞系的条件培养液中纯化出18-kDa的肝素结合生长因子，Wellstein等，生物化学杂志，267：2582-2587(1992)。已克隆和测序了人，牛和大鼠PTN的cDNA，Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)；Li等(1990)，文献同上；Lai等(1992)，文献同上；Kadomatsu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，151：1312-1318(1988)；Tomomura等，生物化学杂志，265：10765-10770(1990)；Vrios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，175：617-624(1991)；和Li等，生物化学杂志，267：26011-26016(1992)。
PTN属于肝素结合蛋白质家族，该家族中包括midkine(MK)生长因子蛋白。midkine蛋白的氨基酸序列与PTN有约50％的同源性，Kadomatsu等，细胞生物学杂志，110：607-616(1990)；和Kretschmer等，生长因子，5：99-114(1991)。在神经外胚层的发育过程中，PTN和MK蛋白似乎起着一定的作用。成年时，所述基因的生理表达仅出现在神经系统很有限的区域内，Bohlen和Kovesdi，生长因子研究进展.，3：143-157(1991)。
PTN可作为肿瘤中的生长因子起作用。如PCT WO 96/02257(其内容列入本文作为参考)所述，PTN的反义核苷酸已发展成为可以抑制肿瘤形成。在高度血管化的黑素瘤中，PTN的表达提高，PTN支持SW13细胞在软琼脂中生长，Wellstein等，生物化学杂志，267：2582-2587(1992)。纯化自不同来源的PTN被描述成对内皮细胞和上皮细胞和成纤维细胞具有促有丝分裂活性，例见Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)；Kuo等，生物化学杂志，265：18749-18752(1990)；Rauvala，EMBO J.，8：2933-2941(1989)；Merenmies和Rauvala，生物化学杂志.，265：16721-16724(1990)；Li等.，科学，250：1690-1694(1990)；和Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，165：1096-1103(1989)。PTN显示出对牛脑毛细血管细胞具有促有丝分裂活性并在兔角膜试验中显示出血管生成活性(Courty等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，180：145-151(1991))。在体外，PTN也显示出可诱导内皮细胞的管形成，Laaroubi等，生长因子，10：89-98(1994)。
已在人乳腺癌样品和人乳腺癌细胞系中检测到PTN mRNA，Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)。也在致癌剂诱导的大鼠乳房肿瘤中检测到PTN，Koyama等，国家癌症学会杂志，48：1671-1680(1972)。还发现其它原发性人癌症和细胞系也能表达PTN，其中包括黑素瘤，头和颈的鳞状细胞癌，成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤。根据啮齿动物模型，PTN在非癌状态下受到很严格的调控，仅在脑和生殖道区域表达，Bloch等，Brain Res.Dev.Brain Res.，70：267-278(1992)；和Vanderwinden等，Anat.Embryol.，(Berl)186：387-406(1992)。
相对于成年状态而言，PTN在胚胎发育过程中有更加广泛的表达。在脑，肺间充质，肠，肾脏和生殖道，以及骨和软骨的祖细胞中可检测到PTN(Bloch等，Brain Res.Dev.Brain Res.，70：267-278(1992)；和Vanderwinden等，Anat.Embryol.，(Berl)186：387-406(1992))。这表明PTN在脑发育和器官形成的过程中起着重要的生理作用。
PTN已被描述为多效素，例见PCT WO 96/02257(其内容列入本文作为参考)。根据组织来源将其描述为不同的名称：得自牛脑的肝素亲和调节蛋白，HARP(Courty等，细胞生物化学杂志，15F：摘要.221-摘要.220(摘要)(1991)；和Biochem.Biophys.Res.Commun.，180：145-151(1991))，肝素结合神经营养因子，HBNF(Kovesdi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，172：850-854(1990)和Huber等，神经化学研究，15：435-439(1990))和p18(Kuo等，生物化学杂志，265：18749-18752(1990))；得自大鼠脑的肝素结合生长相关分子，HB-GAM(Rauvala，EMBO J.8：2933-2941(1989)；和Merenmies和Rauvala，生物化学杂志.，265：16721-16724(1990))；得自人胎盘和大鼠脑的肝素结合生长因子8，HBGF-8(Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，165：1096-1103(1989))，成骨细胞特异性因子，OSF-1(Tezuka等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，173：246-251(1990))和多效素PTN(Li等，科学，250：1690-1694(1990))。
据报道，PTN的蛋白质结构含有5个决定其三维结构的二硫键。二硫键的存在决定了蛋白质的某些特性，例如对低pH的耐受性和对还原条件的敏感性，Wellstein等，生物化学杂志，267：2582-2587(1992)；和Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)。
需要开发给需要血管生成疗法的患者施用治疗有效量的血管生成生长因子，如多效素的方法。尤其需要开发使用血管生成生长因子治疗局部缺血病症的治疗方法。也需要开发治疗血管病，例如心血管病的方法。还需要开发用于送递血管生成生长因子的送递系统，该系统可用于生长因子的受控送递和释放。
发明内容
本发明提供了刺激需要生成血管的人或动物的血管生成的方法。还提供了含有血管生成因子和药物可接受载体的组合物。在一个实施方案中，所述方法包括给需要血管生成疗法的人或动物施用治疗有效量的，任选包含在药物可接受载体中的血管生成因子，如多效素或midkine分子。血管生成因子可以是例如多效素或midkine蛋白。
一个实施方案中的载体包括控释基质，例如聚合物，它们可以控释血管生成因子。聚合物是能生物降解的或生物侵蚀的和生物相容的。可用于控释的聚合物包括例如聚(酯)，聚(酐类)和聚(氨基酸)。例举的聚(氨基酸)包括丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。在另一个实施方案中，血管生成因子可在含有脂质体(如异型囊状脂质体)的载体中被提供。可同时提供诸如脂质体的载体和能将脂质体靶向身体内预先选定之位点的靶向配体。
在一个实施方案中，给血管系统，例如心血管系统或外周血管系统施用血管生成因子。可施用治疗有效量的血管生成因子以治疗例如冠状动脉病，局部缺血性心脏病，糖尿病性外周血管病变或外周动脉粥样硬化病。在另一个实施方案中，在创伤处局部施用治疗有效量的血管生成因子以促进伤口愈合。可被治疗的创伤包括溃疡，褥疮，外科手术导致的创伤和外伤导致的创伤。
在另一个实施方案中，给含有神经的组织局部施用治疗有效量的血管生成因子以治疗神经病，例如中风，多梗死性痴呆和一般的脑局部缺血。还可以给含有骨或软骨的组织局部施用治疗有效量的血管生成因子以治疗诸如骨质疏松，关节炎和关节置换或修复的病症。还可在宿主的器官移植位点局部施用治疗有效量的血管生成因子以促进移植物移入宿主中。
在优选的实施方案中，血管生成因子是可分离自例如人细胞来源的多效素蛋白或midkine蛋白或其活性片断或类似物，它们可在真核宿主细胞中重组产生。
在一个实施方案中，提供了刺激需要血管生成疗法的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给所述人或动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的血管生成因子，所述载体含有丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物和/或聚-丙交酯-共-乙交酯。
可以使用的血管生成因子包括多效素，midkine，成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族成员，血小板衍生的生长因子(PDGF)家族成员和上皮细胞生长因子(EGF)家族成员以及它们的活性片断和类似物。
在另一个实施方案中，提供了刺激需要血管生成疗法的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给人或其它动物施用治疗有效量的，任选包含在药物可接受载体中的基因转移载体，所述载体能编码多效素或midkine蛋白的产生。基因转移载体可以是例如裸露的DNA或病毒载体，并且可以与脂质体联合使用。
附图简述
图1图示了用多效素处理之后的时间内内皮细胞增殖所增加的百分数。
图2图示了在用含有多效素的植入物治疗小鼠创伤之后的时间内聚生血管的横断面面积。
实施本发明的模式
本发明提供了含有血管生成因子的组合物，及其制备和使用方法。当血管组织损坏或患病时，可给组织施用血管生成因子以使组织重新血管化。在一个实施方案中，所提供的血管生成因子被包含在送递基质中以使该因子局部控释于损坏或患病位点。本发明的方法和组合物能促进血管生成，形成新的血管，因此可用于多种治疗性的应用中。血管生成因子优选刺激给药位点的内皮细胞，上皮细胞和成纤维细胞的生长。给多种血管化较差的组织治疗性施用所述血管生成因子可通过刺激新血管形成来增加血液供应。本发明还提供了送递核酸构建体的方法和组合物，所述构建体可指导血管生成因子的表达。
血管生成因子
本文所用术语“血管生成因子”指的是能刺激血管生成的分子。血管生成因子包括天然多肽生长因子或者其生物活性片断或其衍生物或其类似物。血管生成被定义为新血管的生成。体内血管生成一般包括刺激内皮细胞并使其生长。另外，刺激成纤维细胞和上皮细胞有助于形成含有正常血管组织，包括血管结缔组织外层的完整的细胞群体，Folkman，1992，EXS 61：4-13和Bicknell等，1996，Curr.Opin.Oncol.8(1)：60-65。
在一个实施方案中，血管生成因子是多效素分子。多效素分子包括多效素蛋白。多效素分子可以是例如天然的多效素蛋白及其生物活性片断，及其修饰和合成形式，包括衍生物、类似物和模拟物，如小分子模拟物。天然多效素蛋白包括多效素家族的蛋白，尤其是人多效素。
多效素蛋白可有利地刺激内皮细胞，上皮细胞和成纤维细胞的增殖，因此，多效素蛋白可有利地刺激新血管生成和纤维组织形成，这对于自然的创伤愈合和组织修复至关重要。新血管的生成对于局部缺血组织的补救尤为重要。在一个实施方案中，多效素蛋白可分离自天然来源或通过重组方法产生。在一个实施方案中，多效素是成熟的肽，它具有PCT WO 96/02257(其内容列入本文作为参考)所述的SEQ IDNO：1的碱基477至980所编码的序列。
其它有用的血管生成因子包括生长因子，例如midkine，血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族的成员，包括VEGF-2，VEGF-C和VEGF-D(Plate等，J.Neurooncol，35：365-372(1997)；Joukov等，细胞生理学杂志，173：211-215(1997))；成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员，包括FGF-1至FGF-18，尤其是FGF-1，FGF-2和FGF-5；肝细胞瘤衍生的生长因子(HDGF)；肝细胞生长因子/分散因子(HGF，Boroset等，柳叶刀，345：293-295(1995))；上皮细胞生长因子(EGF)家族的成员，包括转化生长因子α(TGF-α)，EGF和TGF-α-HIII(Brown，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.，7：914-922(1995)和国际专利申请WO 97/25349)；和血小板衍生的生长因子(PDGF)，包括AA，AB和BB同种型(Hart等，基因工程，17：181：208(1995))。
其它血管生成因子包括血管生成素(angiopoietin)，如Ang1和整联蛋白刺激因子，如Del-1。Ang1描述于Suri等，细胞，87：1171-80(1996)；Del-1描述于Hidai等，Genes Dev.，12：21-33(1998)(它们的内容都列入本文作为参考)。
在一个实施方案中，血管生成因子是midkine分子，midkine分子包括midkine蛋白。midkine分子可以是例如天然的midkine蛋白及其生物活性片断，及其修饰和合成形式，包括衍生物、类似物和模拟物。
本文术语“蛋白质”，“多肽”和“肽”可以互换使用，它们指的是任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可含有经修饰的氨基酸，并可由非氨基酸间断。它也可以被天然修饰或通过干涉进行修饰；例如形成二硫键，糖基化，十四烷基化，乙酰基化，烷基化，磷酸化或去磷酸化。该定义中还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。
成纤维细胞生长因子(FGF)的分子量一般为10至20kDa，但已从天然来源分离到分子量较高的形式，Wilkie等，Curr.Biol.，5：500-507(1995)。FGF家族的至少18个成员是已知的(FGF-1至FGF-18)，但并非所有FGF家族成员的人同系物都已被克隆。生物活性不需要糖基化，因此可在真核和原核表达系统中重组产生该家族的蛋白质。
优选所用生长因子的来源与需施用生长因子的患者相匹配(例如将人多效素施用于人受试者)。本领域技术人员应理解本文所用术语“来源”指的是蛋白质的组织来源(如果它分离自天然来源)或氨基酸序列来源(如果该蛋白质是重组产生的)。
已知大多数血管生成因子可在多种不同的“剪接变体”中产生。通过差异剪接基因上的一个或多个外显子可产生剪接变体。在被翻译的剪接mRNA中不可能并不保留基因中所有的外显子。mRNA剪接的差异特异于发育阶段，特定组织或病原状态，并可导致由相同的基因产生大量不同的蛋白质。对本发明有用的血管生成因子包括剪接变体。
适应症
使用本文所述的方法和组合物可治疗多种适应症。例如血管病，如外周血管病(PVD)，包括外科手术后或外伤性PVD和心血管病，如冠状动脉病(CAD)。其它可治疗的血管病包括糖尿病性外周微血管病和其它血管病变，和由动脉粥样硬化病引起的跛行。可治疗的局部缺血性心脏病包括不宜手术的心脏病，如伴有严重并发症的心脏病。并发症的例子包括肺病，如慢性阻塞性肺病，fragile cardiac condition和心律失常(arrythmias)。其它可治疗的“不宜手术的”情形包括对麻醉，变态反应不耐受的患者，或者接受联合药物治疗的患者。也可治疗稳定或不稳定的新发作心绞痛。可在干预性心血管手术的同时辅助以血管生成因子疗法，所述手术如冠状动脉旁路移植和经皮经腔冠状血管成形术(气囊血管成形术)。在手术失败或干预后再狭窄的情况下也可实施血管生成因子疗法。
本文所述的方法和组合物可用于多种创伤愈合应用和治疗烧伤。创伤愈合应用包括慢性皮肤溃疡，褥疮，烧伤和久治不愈的创伤。也可治疗由外伤引起的创伤，例如由事故或外科手术引起的创伤。
也可治疗愈合缓慢或久治不愈的创伤，包括不形成肉芽的创伤。例如，可治疗与糖尿病相关的创伤，如糖尿病性溃疡。也可治疗免疫抑制或无免疫能力的患者中出现的创伤，例如接受癌症化疗的患者，患有获得性免疫缺损综合征(AIDS)的患者，接受移植的患者，和任何患有由药疗法引发的创伤愈合缓慢的患者中出现的创伤。
其它应用包括使因切除手术或外伤继发血液供给断流的组织区域血管化，所述手术包括一般的手术，整形手术和移植手术，还包括治疗坏疽前的局部缺血组织或断肢再接。
本文所述的方法和组合物可用作首选疗法，当其它可以使用的疗法不起作用时也可以使用本文所述的方法和组合物。由于整体健康状况较差不能承受外科手术的风险，或由于所患疾病的扩散特性(其中有很多小而严重的损害遍布冠状血管的血液供应处，而不是在旁路或开口处有一个或多个主要的损害)而被医生判定为“不宜手术的”患者，或者以前尝试过用侵入疗法矫正其疾病但没有疗效的患者可有利地接受本文所述的治疗。
本文所述的方法和组合物具有多种神经病学和神经外科用途，例如用于治疗脑血管疾病，如慢性脑血管功能不全，多梗死性痴呆(MID)，中风和一般性的脑局部缺血。
其它应用包括组织修复和加强以及骨修复，包括治疗骨质疏松，软骨修复，治疗关节炎，和关节置换或修复，以及毛囊靶向和治疗脱发。一般，可设计本文所述的组合物，使其可用于一系列受损的内部和外部组织，包括皮肤，生殖系统，生殖泌尿系统，肺系统以促进重新血管化和内皮修复。在一个实施方案中，组合物可用于皮肤修复和美容手术。
载体
本文提供的诸如多效素分子的血管生成因子可包含在药物可接受的载体中。载体可以是生物相容的能控制血管生成因子在原位释放的送递基质。优选血管生成因子能以稳定的形式掺入并同时能基本上维持其活性的基质以及生物相容的基质。根据所选择的送递基质和欲治疗的适应症，可设计受控释放，使其按小时、天、周或更长的时间顺序进行。
将受控送递基质用于血管生成因子，尤其是多效素或midkine蛋白具有很多好处。受控释放能在一段时间内按控释动力学释放剂量。在某些情况下，血管生成因子的送递需要在几周内持续到达需要生成血管的位点。治疗时，在一段时间内(例如几天或几周或更长时间)的受控释放可以持续送递血管生成因子以得到最佳的血管生成状况。受控送递基质也是有利的，因为它可以保护血管生成因子免受体液和组织中的体内降解，例如蛋白酶降解。
可根据例如所选择的载体等因素将送递基质的受控释放设计为例如超过约12或24小时内进行。可选择释放时间，例如使其连续释放约12小时至24小时；约12小时至42小时；或约12至72小时。在另一个实施方案中，释放时间可持续例如约2至90天，例如约3至60天。在一个实施方案中，血管生成因子，如多效素分子在约7至21天或约3至10天的时间内被局部送递。在一个实施方案中，对多效素蛋白而言，在1，2，3或更多周内以受控的剂量施用蛋白质。可根据欲治疗的病症选择控释时间。例如，对于创伤愈合而言，较长的时间更加有效；而对于一些心血管应用而言，较短的送递时间可能更加有用。
由基质体内控释血管生成因子，如多效素蛋白的量可以是例如约1ng至1mg/天，例如约50ng至500μg/天，或者在一个实施方案中，为约100ng/天。根据治疗应用，可将含有血管生成因子和载体的送递系统配制成包括例如10ng至1mg血管生成因子，或者在另一个实施方案中，包括约1μg至500μg，或者约10μg至100μg血管生成因子。
送递基质可以是例如扩散控制的基质系统或可侵蚀的系统，它们描述于例如：Lee，“扩散控制的基质系统”，p155-198和Ron和Langer，“可侵蚀的系统”，p199-224，见“有关受控药物送递的论文”，A.Kydonieus编，Marcel Dekker公司，纽约1992(列入本文作为参考)。基质可以是例如可生物降解的材料，它能在原位和体内通过水解或酶解(如蛋白酶)自发降解。任选使用血管生成因子和聚合物载体的缀合物。
送递基质可以是例如天然或合成的聚合物或共聚物，例如水凝胶形式的聚合物或共聚物。具有可裂解之连键的聚合物包括例如聚酯，聚原酸酯，聚酸酐，多糖，聚(磷酸酯)，聚酰胺，聚氨基甲酸酯，聚(亚氨碳酸酯)和聚(磷腈)。
聚酯包括聚(α-羟基酸)，如聚(乳酸)和聚(乙醇酸)及其共聚物，以及聚(己内酯)聚合物和共聚物。在优选的实施方案中，控释基质是聚-丙交酯-共-乙交酯。使用聚(丙交酯)和聚(乙交酯)共聚物进行控释描述于Lewis，“由丙交酯/乙交酯共聚物控释生物活性剂”，见于“用作药物送递系统的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，编，Marcel Dekker，纽约，1990，p1-41(列入本文作为参考)。可以多种不同的聚合物和共聚物比例得到或形成聚-丙交酯-共-乙交酯，例如100％D，L-丙交酯；85∶15 D，L-丙交酯∶乙交酯；50∶50 D，L-丙交酯∶乙交酯；和100％乙交酯，例见Lambert和Peck，控释杂志，33：189-195(1995)；和Shively等，控释杂志，33：237-243(1995)(列入本文作为参考)。可通过诸如熔体挤出，注射成型法，溶剂浇铸或溶剂蒸发的方法加工聚合物。
将聚酸酐用作控释基质并通过热-熔化和溶剂清除技术形成微球体描述于Chasin等，“用作药物送递系统的聚酸酐”，见于“用作药物送递系统的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，编，MarcelDekker，纽约，1990，p42-70(列入本文作为参考)。
可使用多种本领域可以制备得到的聚磷腈，例见Allcock，H.R.，“用作新的生物医学和生物活性材料的聚磷腈”，见于“用作药物送递系统的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，编，Marcel Dekker，纽约，1990，p163-193(列入本文作为参考)。
可使用聚酰胺，例如聚(氨基酸)。在一个实施方案中，聚合物可以是聚(氨基酸)嵌段共聚物。例如，可使用血纤蛋白-弹性蛋白和血纤蛋白-胶原聚合物以及其它蛋白质聚合物，包括壳多糖，藻酸盐和明胶。在一个实施方案中，可使用丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。基因和蛋白质工程技术已经发展到可以设计具有受控的化学和物理特性的丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。可将这些蛋白质聚合物设计成具有丝样晶体氨基酸序列嵌段和弹性蛋白样柔性氨基酸序列嵌段。这些材料的特性是由可得自天然蛋白质，如丝心蛋白和弹性蛋白的短的重复寡肽序列引起的。重组的丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物描述于，例如Protein Polymer Technologies的美国专利5,496,712，5,514,581和5,641,648；Cappello，J等，生物技术进展，6：198-202(1990)；Cappello，J.，Trends Biotechnol.，8：309-11(1990)；和Cappello等，生物聚合物，34：1049-1058(1994)(皆列入本文作为参考)。
聚(磷酸酯)可用作受控送递基质。具有不同侧链的聚(磷酸酯)及其制备和加工方法描述于Kadiyala等，“聚(磷酸酯)：合成，物理化学鉴定和生物反应”，见于“合成的可生物降解的聚合物的生物医学应用”，J.Hollinger编，CRC出版社，Boca Raton，1995，p33-57(列入本文作为参考)。
可使用聚氨基甲酸酯材料，包括例如聚氨基甲酸酯酰胺分段的嵌段共聚物，其描述于例如Biomedical Polymers International的美国专利5,100,992中(列入本文作为参考)。还可使用Poloxamer聚合物，其为聚氧化烯嵌段共聚物，如氧化乙烯氧化丙烯嵌段共聚物，例如Pluronic凝胶。
在另一个实施方案中，受控送递基质是脂质体。可使用两亲性分子，如含脂质的分子形成脂质体，例见Lasic，“基因送递所用的脂质体”，CRC出版社，纽约，1994，p67-112(列入本文作为参考)。脂质包括例如卵磷脂，鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇。可使用天然或合成的脂质，例如，用于形成脂质体的合成脂质分子包括脂类链，例如二肉豆蔻酰基，二棕榈酰基，二硬脂酰基，二油酰基和棕榈酰基-油酰基链。还包括胆甾醇。脂质体及其形成方法也描述于Nassander，“脂质体”，见于“用作药物送递系统的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，编，Marcel Dekker，纽约，1990，p261-338(列入本文作为参考)。在一个优选的实施方案中，可使用包括具有确定大小和分布的独立室的异型囊状脂质体，例见DepoTech公司的美国专利5,422,120和5,576,017(列入本文作为参考)。
可使用含胶原，白蛋白和血纤蛋白原的材料，例见Bogdansky，“用作药物送递系统的天然聚合物”，见于“用作药物送递系统的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，编，Marcel Dekker，纽约，1990，p231-259(列入本文作为参考)。可使用的胶原组合物的例子包括胶原-聚合物缀合物，例见Collagen公司的美国专利5,523,348，5,510,418，5,475,052和5,446,091(列入本文作为参考)。可以使用包括游离巯基的可交联的改性胶原，例见Flamel Technologies的美国专利5,412,076(列入本文作为参考)。包括胶原的蛋白质基质也描述于Matrix Pharmaceuticals的美国专利4,619,913(列入本文作为参考)。
也可使用基于hyaluran的药物送递系统，包括例如hyaluronan或与亲水性聚合物共聚化的hyaluronan或hylan，例见Biomatrix公司的美国专利5,128,326(列入本文作为参考)。
可使用本领域可制备得到的水凝胶，所述材料包括例如聚(异丁烯酸羟基乙基酯)(聚(HEMA))，不溶于水的聚丙烯酸酯和琼脂糖，聚氨基酸，如藻酸盐和聚(L-赖氨酸)，含有聚(氧化乙烯)(PEO)的聚合物和聚乙二醇(PEG)二丙烯酸酯。其它水凝胶的例子包括具有可变长度的聚氧乙烯侧链的甲氧基聚(乙二醇)单异丁烯酸酯的交联聚合物链，例见Nagaoka等，“用作生物材料的聚合物”(Shalaby，S.W等编)，Plenum出版社，1983，p.381(列入本文作为参考)。
可使用的水凝胶包括亲水性和疏水性的嵌段聚合物成分(例见Okano等，生物医学材料研究杂志，15，393，1981)，或移植共聚物结构(例见Onishi等，Contemporary Topics in Polymer Science，(W.J.Bailey & T.Tsuruta编)，Plenum Publ.公司，纽约，1984，p.149)和掺合物(例见Shah，聚合物，28，1212，1987；和美国专利4,369,229)(皆列入本文作为参考)。
可使用含有聚醚dl-聚丙交酯嵌段共聚物之丙烯酸封端的水溶性链的水凝胶，水凝胶可含有聚乙二醇，聚(α-羟酸)，如聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)或聚(L-乳酸)及其共聚物或聚(己内酯)或其共聚物。在一个实施方案中，水凝胶可含有聚(乳酸)和聚(乙醇酸)的共聚物，本文将其称为聚-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物。可使用聚合的和交联的大分子单体形式的水凝胶，其中大分子单体含有亲水性寡聚体，该寡聚体具有可生物降解的单体或寡聚体延伸，其自由端被能够聚合和交联的封端单体或寡聚体封端。亲水核心自身可被降解，从而使核心和延伸部分功能相结合。在长波长的紫外光，可见光照射或热能的影响下使用自由基引发剂可聚合大分子单体。生物降解发生在延伸寡聚体内的连键处，并导致产生无毒的，易于从体内清除的片断。水凝胶的例子描述于美国专利5,410,016，5,626,863和5,468,505(列入本文作为参考)。
可以使用基于共价交联网络的水凝胶，其含有多肽或聚酯成分作为酶解或水解不稳定成分，例见Jarrett等，Trans.Soc.Biomater.，Vol.XVIII，182，1995；Pathak等，大分子，26，581，1993；Park等，用于药物送递的可生物降解的水凝胶，Technomic Publishing公司，Lancaster，Pa.，1993；Park，生物材料，9，435，1988；和W.Shalaby等，1992(列入本文作为参考)。也可使用透明质酸凝胶和聚羟基乙基异丁烯酸酯凝胶。
另外，送递基质可包括能将血管生成因子靶向送递至身体内预定位点的靶向配体。靶向配体是能与体内位点特异性结合的特异性结合组成成分。例如，靶向配体可以是抗体或其片断，受体配体，或选择性针对或特异于所需靶位点的粘附分子。靶位点的例子包括血管细胞间粘附分子(ICAM)和内皮细胞表面受体，如αvβ3。包括靶向配体的送递基质的实施方案包括与抗体缀合的脂质体，其中抗体与脂质体之间通过亲和素-生物素接头相连接，例见Sipkins，放射学，197：276(1995)(摘要)；和Sipkins等，放射学，197：129(1995)(摘要)。
制剂和给药方法
可通过本领域已知的多种途径施用任选包含于载体中的血管生成因子或其制剂，所述途径包括表面，口服，非肠道(包括静脉内，腹膜内，肌内和皮下注射以及鼻内或吸入给药)和植入给药。送递可以是全身性的，区域性的或局部的。另外，送递可以是鞘内的，例如CNS送递。例如，治疗创伤时施用血管生成因子的方式可以是在创伤表面施用血管生成因子，通过肠道或非肠道途径全身性给药或者局部或区域性注射或植入给药。可按本领域已知的方法将血管生成因子配制成适当的形式以适用于不同的给药途径，例见“Remington：药物科学与实践”，Mack Publishing公司，Pennsylvania，1995(列入本文作为参考)。
任选掺入控释基质中的血管生成因子可被配制成多种制剂形式，包括溶液，乳剂，悬浮液，粉末，片剂和凝胶。制剂中可包括本领域可得到的赋形剂，如稀释剂，溶剂，缓冲液，增溶剂，悬浮剂，粘度控制剂，结合剂，润滑剂，表面活性剂，防腐剂和稳定剂。制剂可包括填充剂，螯合剂和抗氧化剂。当使用非肠道制剂时，制剂还可以，或者可以包括糖，氨基酸或电解质。
赋形剂包括多元醇，例如分子量小于约70,000kD的多元醇，如海藻糖，甘露糖醇和聚乙二醇。例见美国专利5,589,167(列入本文作为参考)。表面活性剂包括例如非离子型表面活性剂，如吐温表面活性剂，多乙氧基醚类，如多乙氧基醚20或80等和poloxamer，如poloxamer184或188，Pluronic(r)多元醇和其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物等。缓冲液包括Tris，柠檬酸盐，琥珀酸盐，醋酸盐或组氨酸缓冲液。防腐剂包括酚，苄基醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，氯苄烷铵(benzalconium chloride)和苯索氯铵。其它添加剂包括羧甲基纤维素，葡聚糖和明胶。稳定剂包括肝素，戊聚糖聚硫酸酯和其它磺酸酯粘多糖(heparinoid)和二价阳离子，如镁和锌。
可将任选与受控送递基质联合的血管生成因子加工成多种形式，包括例如微球体，微胶囊，微粒，薄膜和涂层。可使用本领域已知的用于将药物加工成聚合物载体的方法，例如喷雾干燥，沉淀和结晶。其它方法包括成型技术，例如溶剂浇铸，压缩成型，热-熔解微囊化和溶剂清除微囊化，例见Laurencin等，“聚(酸酐)”，见于“合成的可生物降解的聚合物的生物医学应用”，J.Hollinger编，CRC出版社，Boca Raton，1995，p59-102(列入本文作为参考)。
在一个实施方案中，将血管生成因子包含在控释载体中进行局部送递以使送递的位置和时间受到控制较为有利。局部送递可以到达例如选定的组织位点，如创伤或其它需要治疗的区域，或者血流不足(局部缺血)的组织区域，如局部缺血的心脏组织或其它肌肉，如外周。
对于如闭塞性血管病的适应症而言，也可在缺血区域附近现存的血管系统附近局部施用任选与载体，如控释基质联合的血管生成因子以促进治疗区域附近的血管生成。
核酸治疗
也可通过施用编码血管生成因子的核酸来施用血管生成因子，因此，可治疗性地施用编码血管生成因子的核酸聚合物。编码血管生成因子的核酸聚合物(DNA或RNA)可掺入核酸构建体(基因转移载体)，该载体中还包括适当的信号(例如增强子，启动子，内含子加工信号，终止信号，poly(A)添加位点等)以在患者细胞中产生血管生成因子。编码血管生成因子的核酸构建体可以全身性，区域性，局部或表面送递，优选表面、局部或区域性送递以诱导患者身体的细胞产生血管生成因子。或者，可将编码血管生成因子的核酸构建体送递至偏远的位点，它将产生血管生成因子并将所述因子分散至患者全身。
编码血管生成因子的核酸构建体可作为“裸露的DNA”(即不具有任何衣壳化的膜或病毒衣壳/包膜)。已知肌细胞，尤其是骨骼肌细胞以及心肌细胞可摄取裸露的DNA并表达裸露的DNA所编码的基因。这种送递编码血管生成因子的核酸构建体的方法是一个治疗冠状动脉病的优选模式。可以局部送递含有编码血管生成因子的核酸构建体的裸露的DNA，例如通过注射至阻塞周围区域的心肌以替代阻塞的外科手术疗法或与后者联合。使用超螺旋小环的非病毒基因送递所用的DNA载体也可以使用，例见Darquet等，基因治疗，4：1341-1349(1997)(列入本文作为参考)。
也可在非细胞送递系统，如脂质体或阳离子脂质悬浮液中送递编码血管生成因子的核酸构建体。脂质体在基因转移疗法中的用途是众所周知的(例见Lee等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，14(2)：173-206(1997)；Lee和Huang，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.，14：173-206(1997)和Mahoto等，药物学研究，14：853-859(1997))(列入本文作为参考)。一般将编码血管生成因子的核酸构建体掺入脂质体或与脂质体复合，所述脂质体可进一步衍生化以包括靶向组成成分，如抗体、受体配体或者选择性针对或特异于所需靶位点的粘附分子。用于送递编码血管生成因子的核酸构建体的脂质体系统包括DNA/阳离子脂质体复合物，能包裹构建体，将聚阳离子一凝聚的DNA截留在脂质体中的中性或阴离子脂质体，或本领域已知的其它脂质体系统。
可以使用经由受体介导的胞吞作用促进靶细胞特异性基因转移的载体蛋白，例见Uherek等，生物化学杂志，273：8835-8841(1998)。糖基化的聚(氨基酸)也是可以将基因转移至细胞中的有用的非病毒载体，例见Kollen，Chest，111：95S-96S(1997)(列入本文作为参考)。基因转移也可通过biolistic方法实现，如Furth，分子生物技术，7：139-143(1997)(列入本文作为参考)所述的喷嘴注射。可以使用的非病毒的基因转移方法，例如基因枪，电穿孔，受体介导的转移和人工大分子复合物描述于Zhdanov等，Vopr Med Khim，43：3-12(1997)(列入本文作为参考)。DNA可与蛋白质，脂质，肽或其它具有组织靶向配体的聚合物载体复合，例见Sochanik等，Acta Biochim Pol43：293-300(1996)(列入本文作为参考)。使用随后被胞吞的凝集素配体进行的糖靶向的用途描述于Wadhwa等，药物靶向杂志，3：111-127(1995)和Phillips，生物制品，23：13-16(1995)(列入本文作为参考)。
其中掺入了编码血管生成因子的核酸构建体的病毒载体也可用于基因送递。病毒构建体在基因治疗中的用途是众所周知的(例见Robbins等，Trends Biotechnol.16(1)：35-40(1998)中的评论)。可用于基因转移的病毒包括逆转录病毒(尤其是小鼠白血病病毒，MLV，小鼠乳腺癌病毒，MMTV和人内源性逆转录病毒)，腺病毒，单纯疱疹病毒和腺相关病毒。用于本发明的基因转移的病毒载体可以具有复制能力，也可以不具有复制能力。对逆转录病毒载体而言，目前优选的是无复制能力的病毒载体。一般将编码血管生成因子的核酸构建体掺入载体中，通常，所述载体中包括足够的信息，可以被特定的包装细胞系包装成病毒颗粒。如果病毒载体具有复制能力，病毒载体也可包括足够的信息，以编码复制新的感染性病毒颗粒所需的因子和信号。将掺入了编码血管生成因子的核酸构建体的病毒颗粒注射至或灌注至或施用于所需位点。
产生血管生成因子
在一个实施方案中，可以使用本领域已知的多种方法中的任一种重组产生血管生成因子。对不糖基化的血管生成因子，和糖基化不是其活性所必需的血管生成因子(如FGF-1和FGF-2)而言，可从天然来源纯化产生血管生成因子，或者通过在原核或真核宿主细胞中重组表达以产生血管生成因子。对于糖基化是活性所必需的或需要的血管生成因子而言，从天然来源纯化或在真核宿主细胞中重组产生血管生成因子是合适的。优选通过重组表达产生并纯化用于本发明的血管生成因子。
从天然来源纯化血管生成因子的确切方法和方案取决于来源材料和特定的血管生成因子，所述方法是本领域众所周知的。血管生成因子的纯化方法是已知的，易于效仿。
为了重组生产血管生成因子，可将编码所述蛋白质的DNA分子掺入“表达构建体”，所述构建体中含有适当DNA序列以介导重组宿主细胞中的蛋白质表达。表达构建体的构建是本领域众所周知的，只是优选对其进行某种改变。
已对编码人、牛和大鼠多效素的cDNA进行测序，Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)；Li等(1990)，文献同上；Lai等(1992)，文献同上；Kadomatsu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.151：1312-1318(1988)；Tomomura等，生物化学杂志，265：10765-10770(1990)；Vrios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175：617-624(1991)；和Li等，生物化学杂志，267：26011-26016(1992)。然而，存在很多剪接变体，它们可产生不同的蛋白质同种型。在一种优选的分离自人源的同种型中，成熟的蛋白质有136个氨基酸(例如由SEQ ID NO：1的碱基573至980编码的蛋白质)，该蛋白质是通过从168个氨基酸长的前体蛋白质(例如由SEQ ID NO：1的碱基477至980编码的蛋白质)上蛋白酶裂解32个氨基酸的N-末端信号序列产生的。
人，小鼠，鸡和非洲爪蟾(Xenopus laevis)的midkine cDNA已被测序(Tsutsui等，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(2)：792-797(1991)；Fu等，基因，146(2)：311-312；和Urios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175：617-624(1991))。已检测到其它的midkine mRNA，虽然似乎只在mRNA的5’非翻译区域(5’-UTR)有所不同。优选的人源midkine蛋白是121个氨基酸长的成熟蛋白质，它是143个氨基酸长的前体蛋白质(例见Genbank登记号M69148所公开的蛋白质和核苷酸序列)的蛋白酶酶解加工产物。
VEGF家族多个不同成员的人cDNA已被克隆和测序，其中包括VEGF(Weindel等，Biochem.Biophys.Res.Commun.183(3)：1167-1174(1992))，VEGF2(Hu等，国际专利申请WO95/24473)，VEGF-C(Joukov等，EMBO J.15(2)：290-298(1996))和VEGF-D(Yamada等，基因组，42(3)：483-488(1997))和VEGF相关因子VRF186和VRF167(Grimmond等，基因组研究，6(2)：122-129(1996))。
FGF家族已知的cDNA序列包括FGF-1(也被称为酸性FGF或aFGF)(Yu等，实验医学杂志，175(4)：1073-1080(1992))，FGF-2(也被称为碱性FGF或bFGF)(Satoshi等，日本专利申请JP 1993262798)，FGF-5(Haub等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，87：(20)：8022-8026(1990))，FGF-6(也被称为HST-2)(Iida等，癌基因7(2)：303-309(1992))，FGF-8(Payson等，癌基因，13(1)：47-53(1996))，FGF-9(Miyamoto等，分子细胞生物学，13(7)：4251-4259(1993))和FGF-10(Emoto等，生物化学杂志，272(37)23191-23194(1997))。
上皮细胞生长因子家族(EGF)的至少3个成员是已知的，EGF(Bell等，核酸研究，14(21)：8427-8446(1986))，转化生长因子α(TGF-α，Jakowlew等，Mol.Endocrinol，2(11)：1056-1063(1988))和TGF-αHIII(国际专利申请WO97/25349)的核酸序列可以得到。
编码PDGF的基因也是已知的，编码A和B链的mRNA已被克隆和测序，从而可以重组产生(Betsholtz等，自然320(6064)：695-699(1986)；和Collins等，自然316(6030)：748-750(1985))。
在原核宿主细胞中生产蛋白质的多种方法是已知的。一般而言，仅使用血管生成因子的成熟部分(即在正常的翻译后加工完成之后仍旧保留的血管生成因子部分)在原核细胞中表达。血管生成因子可“直接”表达(即产生的血管生成因子无任何融合或辅助序列)或表达为融合蛋白。在原核宿主细胞中直接表达血管生成因子一般会导致含有重组表达的蛋白质的“折射”体或“包涵”体的积累。可收集包涵体，然后再重新溶解。包涵体中产生的血管生成因子一般需要“重新折叠”(即重新溶解和还原，接着在允许蛋白质采取其天然、适当折叠的构象的条件下氧化)以再生生物活性蛋白质。重新折叠的方法是本领域众所周知的，有几种重新折叠的方法被认为一般适用于所有蛋白质(例见美国专利4,511,502，4,511,503和4,512,922)。根据本领域已知的任何方法，尤其是使用从天然来源纯化因子的成熟方法，可方便地纯化重新折叠的血管生成蛋白。
如果要在原核宿主细胞中将血管生成因子表达为融合蛋白，那么有很多该因子的融合配对物可以使用。含有外周质蛋白之前导序列的融合蛋白被分泌至革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌的外周质中。前导序列常常通过分泌至外周质间隙中而被裂解，导致产生不具有任何N-末端延伸序列的血管生成因子。当在外周质间隙中表达时，很多哺乳动物蛋白质因“伴侣”蛋白质的存在和外周质更加氧化的环境而折叠成天然，有活性的构象。也可使用维持所表达的融合蛋白的溶解性的氨基酸序列，或用作“标记物”的氨基酸序列(即可用于容易地鉴定或纯化融合蛋白的序列)，如寡-组氨酸，或身为细菌细胞生物素化底物的序列来制备融合蛋白。不能被天然地适当裂解的融合蛋白也可含有可用于除去融合配对物序列的蛋白酶识别位点。所述序列是本领域众所周知的。如上所述，作为融合蛋白产生的血管生成因子可能需要重新折叠。重新折叠之后，可根据本领域已知的任何方法，尤其是使用从天然来源纯化因子的成熟方法进一步纯化血管生成因子。
在真核细胞中重组生产蛋白质是众所周知的。血管生成因子可在任何真核宿主细胞中产生，所述细胞包括但不限于芽殖或裂殖酵母，昆虫细胞，如黑腹果蝇(D.melanogaster)细胞系，哺乳动物细胞系和植物。如果宿主细胞是能识别并适当裂解人信号序列的宿主细胞(例如哺乳动物细胞系)，则可将血管生成因子的完整编码区掺入表达构建体，或者仅使用编码成熟蛋白质的那部分序列。用于真核宿主细胞的表达构建体是本领域众所周知的。产生血管生成因子的优选系统包括烟草植物/烟草花叶病毒系统，杆状病毒/昆虫细胞系统和哺乳动物细胞系。当血管生成因子是多效素且在哺乳动物细胞系中表达时，优选表达构建体含有多效素的开放阅读框(ORF)，该阅读框与异源5’-和3’-序列相连，因为天然5’-和3’-序列可与编码人蛋白质，如hsp70的mRNA形成反义复合物。
除了重组生产外，也可合成生产血管生成因子。例如，可使用本领域已知的固相技术合成具有血管生成活性的天然生长因子肽，包括肽片断。另外，使用本领域已知的有机合成技术也可合成可用作生长因子模拟物的类似物，例见：March，“高级有机化学”，John Wiley &Sons，纽约，1985。类似物包括小分子肽模拟物以及与天然血管生成因子或其片断同源的合成的活性肽同系物。
本文提及的所有参考文献都列入本文作为参考。
下列非限制性的实施例有助于理解本发明。
实施例
实施例1：体外使用血管生成因子
按Fang等，生物化学杂志，267：25889-25897(1992)所述分离重组人多效素(PTN)。为了测定内皮细胞经PTN体外刺激之后增殖增加的百分比，使用标准的细胞培养方法将内皮细胞(HUVEC，人脐静脉内皮细胞，美国典型培养物保藏中心，#CRL-1730)以104个细胞/孔的密度接种于12孔组织培养板中的2ml含10％胎牛血清的F12K培养基中(Life Technologies(Rockville MD)，分别为#11765054和#16140071)。约6小时之后，细胞附着于培养板上，在每个待处理的孔中加入50ng溶于50μl PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)中的PTN(6个处理组，每组n＝6)。在每个对照孔(n＝6)中仅加入等体积的PBS以测定背景增殖水平。在每个24小时时间点，从孔中除去培养基，用2ml PBS洗涤细胞2次，再补充2ml培养基；只是对12小时组而言，在每个12小时时间点补充一次培养基。在每个24小时时间点再补充相同剂量的PTN直至所示的处理时间，然后仅补充培养基。一周结束时，使细胞解粘附，并通过标准的细胞培养技术计数。图1显示了减去平均背景(未处理的)增殖之后，每个处理组中的平均增加百分比。
实施例2：体内用血管生成因子治疗小鼠创伤
按实施例1所述分离PTN。为了测定体内局部PTN处理对小鼠皮下血管系统的影响，在每组5只(n＝10)的BALB/c小鼠(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)松弛的肋部皮肤下双侧注射基质植入体。为了制备植入体，将溶于PBS溶液(上述)的PTN蛋白混合于室温下为液体的MatrigelTM(Collaborative Research，MA)中，使浓度达到10μg/ml。按类似方法制备对照植入体，但缓冲液中不含PTN。由于温度升高至室温以上但低于37℃体温时基质溶液变为凝胶，使用16号针头以每个位点1ml的量将基质溶液注射至皮下囊内。在体温下，凝胶溶液变成部分固化的基质。在每个时间点，处死相应组的小鼠，使用标准的微型测径器测定植入体区域标志性血管的总体密集程度和直径。图2显示了经处理(+PTN)和未经处理(-PTN)的组在整个处理时间内聚生血管的平均大小。
实施例3：使用受控送递基质在体内生成血管
按实施例1所述得到PTN。为了测定持续进行局部PTN处理对体内功能性血管系统的影响，使用了众所周知的Folkman CAM(鸡绒毛尿囊膜)试验。将受精5天的鸡蛋(local Leghorn white，Half Moon Bay，CA)蛋壳打开一部分之后，将VasotrophinTM系统(Angiogenix公司，Burlingame，CA)置于直径约为15mm的CAM的前缘。所用VasotrophinTM系统是500μl可生物侵蚀的沉淀物，所述沉淀物由配制成聚(丙交酯-共-乙交酯)基质(PLGA，Absorbable PolymerTechnologies，Birmingham，AL)的1μg/ml PTN组成，或者各含有500ng PTN。按类似的方法产生对照沉淀物，但不含PTN。在接下去的两周，用肉眼观察CAM，观察到血管生长模式的差异，通过解剖显微镜照相机显像。
含生长因子的Vasotrophin系统附近的血管的密集程度和管径都有显著的提高。血管朝着沉淀物的方向呈放射状向内生长或定向生长。在对照CAM中，血管按照与完全未处理(膜上未放置任何东西)的CAM相同的方式持续生长。相比较而言，对照血管要稀疏得多，直径也小得多；而且不是朝着沉淀物的方向生长。这表明局部持续暴露于PTN会直接和特异性地刺激血管密度和管径增加。
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Claims (50)

1.刺激需要生成血管的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给人或其它动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的多效素或midkine分子。
2.权利要求1的方法，其中多效素或midkine分子是多效素或midkine蛋白。
3.权利要求1的方法，其中载体包括可控释多效素或midkine分子的控释基质。
4.权利要求3的方法，其中载体包括能将多效素或midkine分子靶向到体内预定位点的配体。
5.权利要求1的方法，其中将分子施用于血管系统。
6.权利要求1的方法，其中将分子施用于心血管系统。
7.权利要求6的方法，其中施用治疗有效量的分子以治疗选自冠状动脉病和缺血性心脏病的病症。
8.权利要求1的方法，其中将分子施用于外周血管系统。
9.权利要求8的方法，其中施用治疗有效量的分子以治疗选自糖尿病性外周血管病变和外周动脉粥样硬化病的病症。
10.权利要求1的方法，其中在创伤部位局部施用治疗有效量的分子以促进创伤愈合。
11.权利要求10的方法，其中创伤选自溃疡，褥疮，外科手术导致的创伤和外伤导致的创伤。
12.权利要求1的方法，其中给含有神经的组织局部施用治疗有效量的分子以治疗神经病。
13.权利要求12的方法，其中施用治疗有效量的分子以治疗选自中风，多-梗死性痴呆和一般性脑局部缺血的病症。
14.权利要求1的方法，其中给含有骨或软骨的组织局部施用治疗有效量的分子。
15.权利要求14的方法，其中施用治疗有效量的分子以治疗选自骨质疏松、关节炎和关节置换或修复的病症。
16.权利要求1的方法，其中分子是多效素蛋白。
17.权利要求1的方法，其中分子是多效素分子，并且该多效素分子是分离自人细胞来源的多效素蛋白或其活性片断或其类似物。
18.权利要求16的方法，其中所述蛋白质是在真核宿主细胞中重组产生的。
19.权利要求1的方法，其中分子是midkine分子，并且该midkine分子是分离自人或动物细胞来源的midkine蛋白或其活性片断或其类似物。
20.权利要求3的方法，其中控释基质包括聚合物。
21.权利要求20的方法，其中聚合物包括可生物降解的或可生物侵蚀的聚合物。
22.权利要求20的方法，其中聚合物选自聚(酯)，聚(酸酐)和聚(氨基酸)。
23.权利要求20的方法，其中聚合物是丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
24.权利要求1的方法，其中载体包括脂质体。
25.权利要求24的方法，其中脂质体含有能将脂质体靶向到体内预定位点的靶向配体。
26.权利要求1的方法，其中在器官移植位点局部施用治疗有效量的分子以促进移植物移入宿主中。
27.刺激需要血管生成的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给人或动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的血管生成因子，所述载体含有丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
28.权利要求27的方法，其中血管生成因子选自多效素，midkine，成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族成员，血小板衍生的生长因子(PDGF)和上皮细胞生长因子(EGF)家族成员。
29.刺激需要血管生成的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给人或动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的血管生成因子，所述载体含有聚-丙交酯-共-乙交酯；其中血管生成因子选自多效素和midkine分子。
30.用于给人或动物治疗性送递多效素或midkine分子的药物可接受的组合物，所述组合物中含有多效素或midkine分子和药物可接受的载体。
31.权利要求30的组合物，其中多效素或midkine分子是多效素或midkine蛋白。
32.权利要求30的组合物，其中载体包括能控释该分子的聚合物。
33.权利要求32的组合物，其中聚合物选自聚(酯)，聚(酸酐)和聚(氨基酸)。
34.权利要求32的组合物，其中聚合物是可生物降解或可生物侵蚀的。
35.权利要求32的组合物，其中聚合物是丝弹性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
36.权利要求30的组合物，其中载体包括脂质体。
37.权利要求36的组合物，其中载体包括脂质体，该脂质体含有能将脂质体靶向至体内预定位点的靶向配体。
38.权利要求36的组合物，其中脂质体包括异囊型脂质体。
39.权利要求30的组合物，其中分子是多效素分子。
40.权利要求39的组合物，其中多效素分子是分离自人细胞来源的多效素蛋白或其活性片断或其类似物。
41.权利要求30的组合物，其中分子是midkine蛋白。
42.刺激需要血管生成的人或动物中的血管生成的方法，所述方法包括给人或动物施用治疗有效量的包含在药物可接受载体中的基因转移载体，所述基因转移载体能编码产生多效素或midkine蛋白。
43.权利要求42的方法，其中基因转移载体编码产生多效素蛋白。
44.权利要求42的方法，其中基因转移载体编码产生midkine蛋白。
45.权利要求43的方法，其中基因转移载体是裸露的DNA。
46.权利要求43的方法，其中所述方法包括联合使用基因转移载体和脂质体。
47.权利要求43的方法，其中基因转移载体是病毒载体。
48.权利要求44的方法，其中基因转移载体是裸露的DNA。
49.权利要求44的方法，其中所述方法包括联合使用基因转移载体和脂质体。
50.权利要求44的方法，其中基因转移载体是病毒载体。
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