CN1463360A - 生物传感器 - Google Patents

Abstract

提供一种使过滤掉血球的血浆迅速地达到电极系统，精度高，响应性能优异，以全血作为测定的对象的胆固醇传感器。在利用毛细管现象将过滤除去血球的血浆吸引到前述试样液体供应通路内的生物传感器中，设置从下方保持过滤器的初级侧部分的第一压紧部，从上下保持过滤器的次级侧部分的第二压紧部，从上方保持过滤器中央部的第三压紧部，以及在第二压紧部和第一压紧部之间包围过滤器的间隙部。

Description

生物传感器

技术领域

本发明涉及能够对试样中的特定成分进行迅速、高灵敏度且简便的定量分析的生物传感器，特别是涉及胆固醇传感器。

背景技术

下面作为现有技术的生物传感器的例子，对葡萄糖传感器进行说明。

作为具有代表性的这种传感器，具有利用在绝缘性基板上进行丝网印刷的方法，形成至少包括测定电极和对电极的电极系统，能够在该电极系统上，形成包含亲水性高分子、氧化还原酵素以及电子媒质的酵素反应层的葡萄糖传感器。对于氧化还原酵素，可以采用葡萄糖氧化酶，对于电子媒体可以采用铁氰化钾，二茂铁电介质，醌电介质等金属络合物及有机化合物等。根据需要，可以在酵素反应层上加入缓冲剂。

当在酵素反应层上滴下含有基质的试样液体时，酵素反应层溶解，酵素和基质反应，伴随着该反应，电子媒体还原。酵素反应结束后，从电化学氧化所述已被还原的电子媒体的氧化电流值可以求出试样液体中的基质浓度。

在这种类型的葡萄糖传感器中，用电极将氧化酵素反应的结果生成的电子媒质的还原体氧化，从该氧化电流值求出葡萄糖的浓度。

这种生物传感器，通过使用以测定对象物质作为基质的酵素，在原理上可以对各种物质进行测定。例如，对于氧化还原酵素，采用胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶的话，在各医疗机构中，可以测定作为诊断指示的血清中的胆固醇值。

由于胆固醇酯酶的酵素反应的进行非常缓慢，通过添加适当的界面活性剂，可以提高胆固醇酯酶的活性，缩短整个反应所需的时间。

但是，由于反应系统中含有界面活性剂，界面活性剂会对血球产生恶劣影响，所以，不可能象葡萄糖传感器那样对全血进行测定。

因此，为了迅速地将过滤了血球的血浆供应到传感器内，提出了在试样液体供应通路的开口部附近设置过滤器(血球过滤部)的方案。但是，当不适合于向传感器中装入过滤器时，收集到过滤器内的血球被破坏，血红蛋白溶解析出。当缩小到血红蛋白的程度时，很难将血球成分过滤，血红蛋白流入试样供应通路，成为测定误差的原因。

可以认为，这是由于吸收试样液体之前的过滤器的厚度与吸收试样液体之后的膨胀的过滤器的厚度之差，与从上下保持过滤器的压紧部的间隔不匹配造成的。当从上下保持过滤器的压紧部的间隔相对于膨胀的过滤器的厚度过窄时，会妨碍过滤器的膨胀。同时，膨胀受到妨碍的过滤器的孔径不能充分扩展，破坏浸透的血球。

与此相对地，因试样液体的不同，血细胞比容值(红血球容积比)各异，由此造成的过滤器的膨胀的程度也不同，所以当预先假定膨胀的过滤器的厚度、将前述压紧部的上下间隔设定得较宽时，在保存期间内，过滤器会发生偏移。

进而，为了减少试样液体的量，使过滤器的厚度比以前薄时，则如现有的方法(特愿2000-399056号)所述的那样，只从过滤器的初级侧部分的端部吸引试样液体，则在一定时间内能够吸收的试样液体的量减少。因此，从过滤器的次级侧部分出来的血浆的流出速度变得缓慢，在传感器内，特别是试样液体供应通路内血浆饱和的速度变慢，所以，测定时间加长。

与此相对，当为了增加在一定时间内能够吸收的试样液体的量而扩大吸引面积，从过滤器的上部滴下试样液体时，试样液体流过过滤器表面的速度比试样液体浸透过滤器的速度快。因此，流过过滤器表面的试样液体从连接试样供应通路和过滤器的试样液体供应通路的开口部流入试样液体供应通路内，成为引起测定误差的原因。

本发明的目的是，提供一种消除上述不适当之处，使过滤了血球的血浆迅速地达到电极系统的改进的生物传感器。

本发明的目的是提供以高精度、响应性优异、以全血作为测定对象的胆固醇传感器。

发明内容

本发明的生物传感器为一种具备有绝缘性基板，具有设于前述基板上的作用电极和对电极的电极系统，至少含有氧化还原酵素和电子媒质的试剂，含有前述电极系统和前述试剂、在终端部侧具有空气孔的试样液体供应通路，试样液体供应部，以及设于前述试样液体供应通路和试样液体供应部之间的过滤血球的过滤器，利用毛细管现象将用前述过滤器将血球滤除的血浆吸引到前述试样液体供应通路内的生物传感器中，其特征为，所述生物传感器具有从下方保持前述过滤器的初级侧部分的第一压紧部，从上下保持前述过滤器次级侧部分的第二压紧部，从上方保持前述过滤器的中央部分的第三压紧部，在前述第二压紧部和第三压紧部之间包围前述过滤器的空隙部。

前述过滤器的初级侧部分从生物传感器的上面露出到外部是有效的。此外，前述过滤器的次级侧部分与前述作用电极不接触是有效的。

附图说明

图1是根据本发明的一种实施形式的生物传感器的分解透视图。

图2是根据本发明的一种实施形式的生物传感器的透视图。

图3是图2所示的生物传感器的简略纵剖面图。

图4是根据本发明的另外一种实施形式的生物传感器的电极系统附近的放大剖面图。

图5是表示根据本发明的实施例的胆固醇传感器的响应特性的图示。

具体实施方式

如上所述，本发明的生物传感器具备包括电极系统和试剂、设于在终端侧有空气孔的试样液体供应通路和试样液体供应部之间的过滤血球的过滤器，利用毛细管现象将用前述过滤器将血球滤除的血浆吸引到前述试样液体供应通路内，其特征为，所述生物传感器具备从下方保持前述过滤器的初级侧部分的第一压紧部，从上下保持前述过滤器次级侧部分的第二压紧部，从上方保持前述过滤器的中央部分的第三压紧部，以及压紧在前述第二压紧部和第三压紧部之间包围前述过滤器的空隙部。利用这种结构，即使从上下保持过滤器的压紧部的间隔不适合于膨胀的过滤器的厚度，也可以防止由于妨碍过滤器的膨胀引起的血球的破坏。此外，通过将试样液体直接滴下到过滤器上，血球在过滤器表面上流动，可以抑制流入试样液体供应通路内产生的测定误差。

在本说明书中，所谓过滤器的“初级侧部分”是指接近供应试样的试样供应部的部分，所谓过滤器的“次级侧部分”是指靠近设置电极系统的试样供应通路的部分。此外，过滤器的基板侧为“下”，与过滤器的基板相反侧为“上”。

即，在前述过滤器的初级侧部分，由于第一压紧部只接触下侧，所以，前述过滤器在吸引试样液体时可以向上侧膨胀。此外，在前述过滤器的中央部分，由于第三压紧部只接触上侧，所以，前述过滤器在吸引试样液体时可以向下侧膨胀。进而，在前述第二压紧部和第三压紧部之间，在以包围前述过滤器的方式存在的空隙部，吸引了试样液体的过滤器也可以膨胀。并且，当没有包围过滤器的空隙部时，不通过过滤器而沿着过滤器压紧部传递的血球有流入电极系统的可能性。这样，保持过滤器的构件，通过尽可能地减少妨碍因膨胀引起过滤器的尺寸变化的部分，可以使过滤器的孔径自由地变化，并且能够不破坏血球进行过滤。

此外，由于在本发明的生物传感器的前述过滤器的初级侧部分，第一压紧部只与下侧接触，所以，可以在上部设置开口部，使初级侧露出到生物传感器的外部，借此，可以将试样液体直接滴到过滤器上。

进而，存在于前述过滤器的中央部分的上侧的第三压紧部起着防止从前述开口部滴下的试样液体在过滤器的上侧表面上流动的围堰的作用。借此，可以防止试样液体不经过过滤工序侵入试样液体供应通路。

在本发明中，作为电子媒质，除铁氰化钾之外，还可以从具有与胆固醇氧化酶等氧化还原酵素的电子传输能的氧化还原化合物中选择。

氧化还原酵素是以测定对向物作为基质的酵素，在把葡萄糖作为测定对象的传感器中，使用葡萄糖氧化酶。为了测定用作诊断指标的血清中的胆固醇值，使用作为胆固醇氧化反应触媒的酵素的胆固醇氧化酶，或者作为使胆固醇脱轻酶与胆固醇酯变化成胆固醇的过程的触媒的酵素的胆固醇酯酶。由于胆固醇酯酶的酵素反应进行得非常缓慢，所以通过添加适当的界面活性剂，提高胆固醇酯酶的活性，可以缩短整个反应所需的时间。

这些作为反应层配置在传感器内电极系统上或者其附近。或者，也可以将构成电极的导电性与试剂混合，形成电极系统。把电极系统组合到基板上、在其基板与之间，具有形成向电极系统供应试样液体的试样液体供应通路的盖的传感器中，可以设置露出到前述试样液体供应通路的部分或试样液体供应通路的开口部等。在任何一个位置上，最好是，可以利用导入的试样液体很容易地将试剂溶解而到达电极系统。为了保护电极、抑制形成的试剂的剥离，优选地，形成与电极系统接触的亲水性高分子层。此外，在电极系统之外，优选地，作为形成试剂时的衬底，形成亲水性高分子层，或者，在最下层的试剂中含有亲水性高分子。

含有电子媒质的层为了提高容溶解性而优选地与界面活性剂分离。此外，为了保存时的稳定性，优选地，使胆固醇的氧化反应的触媒的胆固醇氧化酶及胆固醇酯酶分离。

在测定血糖值的生物传感器中，为了容易将试样液体导向试剂，可以被覆形成在电极系统上的层等，作为例子，形成含有脂质的层(例如特开平2-062952号公报)。在本发明的测定胆固醇的生物传感器中，优选地，可以利用冻结干燥法形成试剂的一部分(例如特愿2000-018834号公报说明书)，或者在盖构件的表面上。利用界面活性剂或等离子体照射等进行处理，赋予亲水性。当制成这种结构时，也可以不设脂质层。

作为亲水性高分子，例如，可以采用水溶性纤维素衍生物，特别是，除乙基纤维素，羟基纤维素，羧甲基纤维素之外，还可以采用聚乙烯咯吡烷酮，聚乙烯醇，明胶，琼脂糖，聚丙烯酸及其盐，淀粉及其衍生物，无水马来酸的聚合物及其盐，聚丙烯酰胺，异丁烯酸酯树脂，聚-2-羟乙基异丁烯酸酯树脂等。

作为界面活性剂，例如，可以列举出，n-辛基-β-D-硫代葡萄糖苷，聚乙烯酸单十二烷基醚，胆酸钠，十二烷基-β-麦芽苷，蔗糖-月桂酸酯，羟基胆酸钠，牛磺脱氧胆酸钠，N，N-二(3-D-葡萄糖酰胺丙基)脱氧胆酸酰胺，以及聚氧乙烯(10)辛基二苯醚等。

作为脂质，在使用时，最好是采用卵磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺等双亲媒性脂质。

作为氧化电流的测定方法，有只有测定电极和对电极的双电极方式，以及加入参照电极的三极方式，三极方式能够更正确地进行测定。

下面，利用具体的实施形式，更详细地对本发明进行说明。

图1是根据优选实施形式的生物传感器的分解透视图。

绝缘性基板1例如由聚对苯二甲酸乙二醇酯等绝缘性树脂构成。在图1中的基板1上的左侧部分上，利用溅射或蒸镀形成钯薄膜，并且，利用激光调整，形成包括作用电极2和对电极3的电极系统。电极的面积对应于后面描述的形成于衬垫6上的狭缝9的宽度决定。此外，在基板1上形成孔4。

组合到前述基板1上的衬垫6上形成容纳过滤器5的辅助狭缝7，构成试样液体供应通路9’的狭缝9，以及从辅助狭缝7通过狭缝9的开口部8。

此外，在盖10上，形成孔11和空气孔12，在辅助板13上形成向过滤器5供应试样液体用的孔14，进而，形成孔15和成为第三压紧部的间隔部18。

在辅助上盖16上形成构成向过滤器5滴下试样液体用的试样液体供应部的孔17，铺助下盖20用平板构成。

在把图1所示的各构件形成一个整体时，图1中辅助狭缝7的右侧部分，形成于盖10上的孔11的右侧部分，形成于辅助板13上的孔14，以及形成于辅助上盖16上的孔17连通。

过滤器(血球过滤部)5由玻璃纤维过滤纸构成，在与基板1相同的平面上的投影图上，如图1所示，具有底边为3mm，高度为5mm的等腰三角形的形状。同时，在次级侧的前端上形成半径为0.4mm的半圆部(图未示出)。过滤器5的厚度约为300～400μm。

在组装这种传感器时，首先，以用图1中点划线所示的位置关系，分别将各自的右侧，即，在和基板1同一平面中的投影图上，使孔11及与形成于辅助狭缝7上的等腰三角形的底边侧相当的部分相一致的方式进行组合，获得组合体基板B。这时，在盖10面对狭缝9的部分上，即，在试样供应通路9’的上侧部分上形成后面所述的反应层。

进而，将由基板1和辅助下盖20构成的组合体基板A和盖10及时垫6构成的组合体B以图中的点划线表示的位置关系组合，以在向与基板1同一个平面上的投影图上，具有等腰三角形形状的过滤器5均初级侧的右端(底边侧)与前述孔11和辅助狭缝7的右端部分一致均方式设置过滤器5。换言之，过滤器5配置在基板1上，并且，成为嵌入衬垫6的辅助狭缝7和盖10的孔11中的状态。

此外，过滤器5的次级侧部分的前端进入由狭缝9形成的试样供应通路9’内，夹持基板1和盖10，该部分构成第二压紧部。此外，后面进行详细的描述。

最后，在盖10上，以图1中虚线表示的位置关系，以使孔14和孔17的右端与盖10的孔及衬垫6的辅助狭缝17的右端一致的方式，将辅助板13及辅助上盖16配置在盖10上。

按上述方式获得的本发明的生物传感器的简略透视图示于图2。此外，其剖面图示于图3。图3是本发明的生物传感器的简略纵剖面图，相当于图2的X-X线的剖面图。在图2所示的本发明的生物传感器中，如图3所示，形成过滤器5和其它部分非接触的孔15及4。

即，如图3所示，形成从下方保持过滤5的初级侧部分的第一压紧部a，从上下保持过滤器的次级侧部分的第二压紧部b及b’，从上方保持过滤器5的中央部分的第三压紧部c，以及在第二压紧部b和b’与第三压紧部c之间包的围过滤器5的孔(空隙部)15。这样，在过滤器5的下侧，相当于第三压紧部的下侧的部分上存在空洞，其形成与孔15相连的孔(空隙部)4。

这里，图4是表示本发明的生物传感器的另外一种形式的简略纵剖面图。在图2中省略了反应层及电极系统，但图4中表示出了反应层和电极系统。在基板1的电极系统(2及3)上形成亲水性高分子层21和反应层22a。此外，在相当于试样液体供应通路的顶板的盖10的下面侧上形成反应层22b。图4所示的其它构件和图3所示的相同。

如图1～4所示的本发明的生物传感器，为易于理解的对其结构进行说明，用六种构件进行制造，但辅助上盖16和辅助板13也可以用一个构件构成，此外，也可以将它们和盖10用同一个构件构成。进而，也可以用一个构件构成辅助下盖20和基板1。

为了用传感器测定血液中的胆固醇，从用辅助上盖16的孔17构成的试样液体供应部将作为试样液体的血液供应给保持过滤器5的部分(试样供应部)。供应给这里的血液从过滤器5的初级侧部分的上表面向其内部浸透。在过滤器5内，由于血球的浸透速度比作为液体成分的血浆的浸透速度慢，所以，血浆从过滤器5的次级侧部分的端部渗出。同时，渗出的血浆一面溶解载置于覆盖电极系统的位置及/或盖10的背面上的反应层，一面充满电极系统附近、进而充满一直延伸到空气孔12的部分的用狭缝9构成的整个试样供应通路9’。当用液体充满整个试样液体供应通路9’时，过滤器5内的液体也停止流动，在这个时刻，血球未到达过滤器5的次级侧部分的端部，残留在过滤器5内。从而，有必要对过滤器5进行设计，使其在血浆和血球的流通阻力具有即使仅通过充满整个试样液体供应通路9’的量的血浆，血球也达不到过滤器5的次级侧部分的程度的差值。作为本发明的过滤器，孔径为1～7μm左右的深层过滤器比较合适。此外，在本发明的实施例的情况下，过滤器的厚度可以是300～400μm。

经过这种血球过滤过程，被血浆溶解的反应层和血浆中的测定成分(在胆固醇传感器的情况下为胆固醇)发生化学反应，经过一定时间后，测定由电极反应产生的电流值，可以进行血浆中的成分的定量测定。

图4表示在试样液体供应通路9’的电极系统附近的反应层的配置的例子。在基板1的电极系统上，形成羧甲基纤维素的钠盐(下面简单地表示为“CMC”)等亲水性高分子层21，以及例如包括电子媒质等的反应试剂的反应层22a。此外，在组合成盖10和衬垫6的盖构件的背面上，在露出在试样液体供应通路9’的面上形成包括氧化还原酵素的反应层22b。

如图1～4所示，构成狭缝9的试样液体供应通路9’的、垂直于液体流动方向的方向上的截面面积小于过滤器5的初级侧部分的截面面积，但在距过滤器5的次级侧部分1mm的部分压缩设置在试样液体供应通路9’的开口部8附近。这里，过滤器5的被压缩的部分，在本发明的实施例中的传感器尺寸的吸引力的情况下，优选地距离次级侧部分的端部约1mm左右。此外，对于压缩过滤器5的次级部分的程度，可以将次级侧部分压缩到初级侧部分的约1/4～1/3。在这种压缩条件下，难以用数值表示传感器的吸引力，但当厚度为100μm的情况下，过滤器厚度为370μm的测定结果(流入速度)良好。此外，在过滤器厚度在310μm以下的情况下，流入速度缓慢。

这样，通过使试样液体供应通路9’的截面面积小于过滤器5的初级侧部分的截面面积，可以利用毛细管现象使利用过滤器5过滤了血球的血浆迅速地被吸引到试样液体供应通路9’内。

一般地，在反应层上具有容易溶解的部分和难以溶解的部分。容易溶解的部分为试样液体供应通路9’的边缘，即沿着衬垫6的狭缝9的壁面的部分，以及在液体的流动方向的中央部分难以溶解。由于通过过滤器5的试样液体优先地沿衬垫6流动，所以无论中央部分是否完全溶解，试样液体会堵塞空气孔。通过使过滤器5的次级侧部分的中央部分比左右两端向试样液体供应通路9’内突出，优先地流过试样液体供应通路9’内的中央部分，借此，使气泡不残留在试样液体供应通路9’的中央部分内，可以使血浆迅速地流入传感器内。

测定时，当将作为试样液体的血液从用辅助上盖16的孔17构成的试样液体供应部向过滤器5供应时，血液从过滤器5的初级侧部分的上表面向其内渗透。这时，由于有成为隔板的第三压紧部c，所以，即使试样液体滴到过滤器5的表面上，试样液体也优先地流过过滤器5的表面，不会直接流入试样液体供应通路9内。此外，在和基板1同一个平面上的投影图中，由于第三压紧部c和第一压紧部a的位置不一致，所以不会妨碍过滤器5的膨胀，不会有破坏血球的危险。

前述电极系统优选地为贵金属电极。由于前述试样液体供应通路的宽度优选地为1.5mm以下，用丝网印刷的电极，决定电极面积的精度差。与此相对，贵金属电极能够进行0.1mm宽度的激光调整，高精度地决定电极面积。

下面，说明本发明的实施例，但本发明并不局限于此。

实施例

制作在反应层22a上含有电子媒质，在反应层22b上含有胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶及界面活性剂、具有图1～4的结构的胆固醇传感器。

首先，在基板1的电极系统上，滴下5μl的CMC的0.5wt％的水溶液，在50℃的温风干燥机中干燥10分钟，形成CMC层21。

接着，在CMC层21上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于铁氰化钾70mM)，通过在50℃的温风干燥机中干燥10分钟，形成包含铁氰化钾的反应层18a。

将溶解有由诺卡菌引起的胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6)和由假单胞菌引起的胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)的水溶液中，添加作为界面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基二苯醚(TritonX-100)。将该混合液0.64μl滴到将盖10和衬垫6成一整体地形成的狭缝9的部分(试样供应通路9’)上，在用-196℃的液氮进行预冷冻之后，通过用干燥机使之干燥2小时，形成含有570U/ml胆固醇氧化酶，1425U/ml胆固醇酯酶以及2wt％的界面活性剂的反应层22b。

狭缝9的宽度为0.8mm，狭缝9的长度(从试样液体供应通路9’的开口部到空气孔的长度)为4.5mm。此外，衬垫6的厚度(基板1与盖10之间的距离)为100μm。

作为过滤器5，采用由厚度约为370μm的玻璃纤维滤纸构成，底边为3mm，高度为5mm的等腰三角形。将次级侧部分的前端(与试样液体供应通路9’的开口部8接触的部分)的角加工成圆形，设置在基板1与辅助下盖20构成的组合基板A和盖10与衬垫6构成的组合基板B之间。

然后，通过粘结在组合基板A和组合基板B之间设置过滤器5而成的构件和辅助板13与辅助上盖16成一整体而成的构件，制作具有图1、2和4中所示的结构的胆固醇传感器。

将作为试样液体的全血10μl导入到该传感器的试样液体供应部，3分钟后以对电极作为基准，在测定电极上向阳极方向上外加+0.2V的脉冲电压，5秒钟之后，测定在作用电极和对电极之间流过的电流值。其结果示于图5。图5是表示胆固醇的浓度和响应电流的关系的曲线图。

如从图5中可以看出的，根据本发明的传感器，在胆固醇浓度和响应电流值之间获得良好的直线性关系。在图5中，×是红血球容积比为0％的血浆的结果，○是红血球体积比为35％的全血的结果，□是红血球容积比为60％的全血的结果。

工业上的利用可能性

根据本发明，通过利用过滤器将作为妨碍物质的血球不溶血地除去，即使减薄过滤器的厚度也可以把除去血球后的血浆迅速地供应给电极系统。从而，可以提供响应性优异的化学生物传感器。

Claims (3)

1、一种生物传感器，具备绝缘性基板，具有设于前述基板上的作用电极和对电极的电极系统，至少含有氧化还原酵素和电子媒质的试剂，含有前述电极系统和前述试剂、在终端部侧具有空气孔的试样液体供应通路，试样液体供应部，以及设于前述试样液体供应通路和试样液体供应部之间的过滤血球的过滤器，利用毛细管现象将用前述过滤器将血球滤除的血浆吸引到前述试样液体供应通路内，其特征为，

所述生物传感器具有从下方保持前述过滤器的初级侧部分的第一压紧部，从上下保持前述过滤器次级侧部分的第二压紧部，从上方保持前述过滤器的中央部分的第三压紧部，以及在前述第二压紧部和第三压紧部之间包围前述过滤器的空隙部。

2、如权利要求1所述的生物传感器，其特征为，前述过滤器的初级侧部分露出到生物传感器的上面。

3、如权利要求1或2所述的生物传感器，其特征为，前述过滤器的次级侧部分与前述作用电极是非接触的。

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