CN1541110A - 单克隆免疫球蛋白制剂灭菌方法 - Google Patents

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Abstract

提出对单克隆免疫球蛋白制剂进行灭菌以减少其中的活性生物污染物，如病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原菌和寄生虫含量的方法。

Description

单克隆免疫球蛋白制剂灭菌方法
技术领域
本发明涉及对单克隆免疫球蛋白的制备进行灭菌以减少其中的活性生物污染物，如病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原菌、蛋白病毒和/或寄生虫含量的方法。
背景技术
抗体是由有机体暴露于机体认为是威胁的外部物质而相应于产生的。抗体，或如众所周知的免疫球蛋白(Ig)是免疫系统的细胞所含有的蛋白质，我们将该细胞称为B细胞或浆细胞。免疫球蛋白的结构复杂而具有明显特征。简单而言，各个免疫球蛋白由一蛋白质链化合物组成，我们将其称为重链与轻链。通过额外的二硫键使各个重链与一单轻链连接。并通过额外的二硫键依次使所产生的化合物与一同样重-轻链化合物连接。可通过改变重链的结构与数量由该细胞将此基本单元组合成若干个专门形式。不同的重链结构产生不同的分子，我们将其称为免疫球蛋白的“类别”。这些类别还可具有不同数量的上述基本单元。
该免疫球蛋白分子的这些各种物理形式的产生是顺序发生的。在这一过程中，一单个分子或抗原的分子特异性保持不变。这是因为上述变化均是在该免疫球蛋白分子中的未牵涉到确定该特定免疫球蛋白分子的特异性的那部分发生的。这在B细胞成熟过程中，这种“超变量区域”面临着异常高度的重组作用。在由该细胞产生该第一免疫球蛋白分子之前，这些重组作用停止。结果，由一相应少量的变量区域基因，该机体产生了大量具有不同特异性的潜在免疫球蛋白分子。
一旦一B细胞与一与其自身的免疫球蛋白分子键联的分子相遇，且在从免疫系统内的其它细胞接受信号的时候，该B细胞首先增殖为大量同样细胞，(我们将其称为克隆)，且然后区分成为一免疫球蛋白含有的浆细胞。这样，将可能被制造的极大量的潜在免疫球蛋白分子限制为识别该机体所必须响应的抗原。
所产生的免疫球蛋白特异性的广泛数组造成了对机体所正进行的保护，以使机体免受过去制造免疫球蛋白以做抵抗的那些有机体的感染。总体而言，结果为来自一单供体的原生质内所包含的该免疫球蛋白可具有上百万个有用的免疫球蛋白特异性。既然其包括由该机体内所有浆细胞所制造的免疫球蛋白分子，因此，我们将从原生质制备免疫球蛋白称为一多克隆免疫球蛋白制剂。
多克隆免疫球蛋白对于治疗使制造Ig的能力缺乏或受损的人类疾病尤其有用。既然所有的浆细胞克隆均受到影响，则需要该原生质中所发现的所有免疫球蛋白特异性的混合物以更正该不足。相对而言，当要求特异性的一极端程度时，或当探索一单个限定治疗学目标时，多克隆免疫球蛋白并非最佳解决方案。相反，由一单克隆所产生的具有所需特异性的该免疫球蛋白分子所组成的一免疫球蛋白制剂是最精确与最可预测的解决方案。我们将该种制备称为一单克隆免疫球蛋白。
与多克隆免疫球蛋白相比，单克隆免疫球蛋白具有许多不同之处。它们的单个特异性使其在作为检测试剂时非常精确。作为治疗方法，它们没有从多克隆免疫球蛋白所产生的混合或危险的副作用，如将具有有害特异性的免疫球蛋白的的导入引入病人。它们的物理特性也会有所不同。既然各个单克隆免疫球蛋白具有一独特与不变的结构，它的稳定潜力、退化、聚合、温度敏感性与其它特性也时独特与不变的。一旦选择生产一种合适的单克隆免疫球蛋白，其特性将不会改变，且因此能连续生产，并确保其性能与存储特性。能够按照制品要求制定产量的能力也使单克隆免疫球蛋白成为多克隆免疫球蛋白一高度合适的替代品。
单克隆免疫球蛋白制剂通常有三种方式。第一种方式涉及一细胞培养系统内，该第二种方式使用了一动物作为单克隆免疫球蛋白的一暂时生物反应器，且该第三种方式涉及将一所需单克隆单克隆免疫球蛋白的基因插入一动物，从而导致该单克隆免疫球蛋白在该动物的流质或组织内持续生产中，使得其能不断产生(转基因生产)。
这些方法各会导致病原体将制品污染。在该第一种方法中，产生该单克隆免疫球蛋白的细胞会庇护在培养系统中可能会产生而未检测出的病毒。细菌、酵母菌或霉菌对该培养系统的污染也会发生。
余下的两种方法均涉及对一动物的使用，或使该动物作为该单克隆免疫球蛋白制造细胞的宿主，或使其作为一生物反应器以制造该单克隆免疫球蛋白自身。显然，这些制品面临着被宿主动物所感染或庇护的病原体污染的危险。该种病原体包括：病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原菌和寄生虫，等等。
因此，在使用单克隆免疫球蛋白制品之前将制品中含有的所有生物活性污染物进行去活化处理至关重要，特别是当制品在输血、器官移植和其他形式的人体治疗中直接施行于人体时尤其如此，并且对于在含有各种类型的原生质的介质中制备的，并可能含有支原菌或其他病毒污染物的各种单克隆免疫球蛋白制品来说，去活化处理也尤其重要。
过去，人们采取的最多的方法是从制品中筛选或检测出某种特定的污染物，而不是将制品中的污染物去除或去活化。污染物检测呈阳性的制品不再被使用。例如，筛选步骤可包括从捐血者的血液中检测某种特定的病毒。然而，这些步骤并不总是可靠，因为其无法检测出数量很小的病毒。由于可导致虚假的阳性结果，检测的价值或可靠性打了折扣。虚假阳性结果在某些情况下可危及生命，比如可能导致感染获得性免疫缺损综合症(艾滋病)。此外，在某些情况下，需要几周，甚至几个月来判断制品中是否含有污染物。
在进行实验以确定破坏病毒活性的技术能力的过程中，很少利用具有意义的实际病毒。这是由于考虑到进行测试的工作者的安全，以及与设备污染与废料处理所相关的困难与费用。在此处，使用了同族与同级别的模型病毒。
一般而言，我们承认其活性最难破坏的病毒为那些具有外壳的病毒，该外壳由蛋白质等组成，且其活性最难破坏的病毒为尺寸最小的病毒。γ辐射与大多数其他形式的辐射以显示这为事实，因为这些病毒小尺寸是它们小基因的产物。辐射对一分子的大量直接影响与分子的尺寸成正比，意思为，目标分子越大，其影响越大。由此推断，γ辐射已经显示滤过性毒菌基因越小，将其活性破坏所要求的辐射越高。
与人类与动物衍生的生物学有关的病毒中，相关的最小病毒属于细小病毒一族与尺寸略大的有蛋白质外壳的肝炎病毒。在人类中，该细小病毒B19，与肝炎A为主要关注对象。在猪衍生产品与组织中，最小的相应病毒为猪细小病毒。既然这种病毒对人类无害，通常将其选择作为该人类B19细小病毒与肝炎A的模型病毒。我们将对这个模型细小病毒的火星的破坏示范视为能充分证明所使用的方法能够杀灭人类B19病毒与肝炎A，且扩展而言，其也将能够杀灭更大与不那么坚硬的病毒，如人体免疫缺损病毒(HIV)、细胞肥大病毒(CMV)、肝炎B与C等等。
较新的方法旨在去除或去活化制品中的污染物。这些方法包括热处理，过滤和向制品中添加化学去活化剂或敏化剂。热处理要求将制品加热到约60℃，并保持70小时，但这可能会对敏感制品造成破坏。热去活化可破坏制品中50％或以上的生物活动。过滤是指对制品进行过滤，用物理方法去除污染物。遗憾的是，这种方法会将分子重量较大的制品一并去除，并且，在某些情况下，由于制品的分子结构较大，较小的病毒无法通过过滤方法去除。化学敏化步骤是指在制品中添加有毒试剂，使其与病毒的DNA(DNA)/RNA(RNA)结合，并通过紫外线(UV)或辐射进行活化，产生活性中间体和/或自由基，其键联至DNA/RNA或突破病毒DNA/RNA主链中的化学键，或者将其交键或结合，使病毒无法复制。由于敏化剂有毒，甚至可诱变或致癌，不能直接施行于人体，因此该步骤要求将未结合的敏化剂从制品中洗出。
另一种对制品进行灭菌的方法是用γ射线进行照射。在进行大剂量照射时，γ辐射可有效地破坏病毒和细菌。(参看：基斯利，Keasly等，《照射之后生命是否存在？》“Is There Life After Irradiation？第二部分，《生物制药》(BioPharm)1993年7-8月，和莱特曼，Leitman，《血液细胞照射在防止输血后的移植体抗宿主疾病中的应用》“Use ofBlood Cell Irradiation in the Prevention of Post TransfusionGraft-vs-Host Disease”，《输血科学》(Transfusion Science)10：219-239(1989))。然而，本领域公开发表的论文同时揭示，γ辐射可破坏辐射敏感制品，如血液。特别是大剂量的辐射会对红细胞、血小板和粒细胞(granulocyte)造成伤害(莱特曼)。美国第4,620,908号专利案提出，蛋白质制品必须在照射之前进行冷冻，以维持蛋白质制品的生存力(viability)。该专利指出，“如果在环境温度下对蛋白质材料进行γ照射，材料将被完全破坏，即：材料的活性将变得极低，实质上不再有效。”这对于当然也是蛋白质的单克隆免疫球蛋白同样实用。然而，如果为了照射目的将生物制品进行冷冻，然后在施行于人体前将其融化，那么许多敏感生物制品，比如血液，将失去生存力和活性。
由于存在上述困难，我们仍需要寻找对单克隆免疫球蛋白进行灭菌的方法，其既能降低活性生物污染物的含量，又不会对单克隆免疫球蛋白造成反作用。
发明说明
因此，本发明的目标是提出既能降低活性生物污染物含量，又能避免对单克隆免疫球蛋白造成反作用的单克隆免疫球蛋白制剂的灭菌方法。本发明的其他目标、特征和优点将在下文的优选实施例部分进行详细阐述，通过本说明书的说明和对本发明的实践，本发明的目标、特征和优点将更加明显。本发明的这些目标和优点可经由说明书和权利要求书中所特别指明的组成形式和方法实现和获得。
依照这些和其他目标，本发明的第一实施例是一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，其包括：(i)将单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量减低到足以有效保护生物材料抵御电离辐射的水平；和(ii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使其得到灭菌。
本发明的第二实施例是一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，其包括：(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射；和(ii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使其得到灭菌。
本发明的第三实施例是一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，其包括：(i)将单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量减低到足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射；和(iii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使其得到灭菌。在本实施例中，步骤(i)和(ii)可互相颠倒。
本发明还提供了一种组合物，其包括至少一个单克隆免疫球蛋白与一至少一个稳定剂，该稳定剂是从由下列物质组成的群中选出的：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸；尿酸或其盐或酯；甲硫氨酸；组氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；二肽(dipetide)甘氨酸-甘氨酸；地奥司明；水飞蓟素；一抗坏血酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物；一抗坏血酸或其盐或酯、尿酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物；以及一尿酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物，该至少一种稳定剂的剂量能有效保持该单克隆免疫球蛋白在用辐射与此组合物灭菌后能继续使用。
附图说明
图1和2显示某些稳定剂对暴露于45kGy低剂量γ照射的冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的保护效果。
图3A-3C显示某些稳定剂对暴露于45kGy低剂量γ照射的冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的保护效果。
图4&5显示首次冻干(primary lyophilizing)和二次冻干(secondary lyophilizing)对单克隆免疫球蛋白敏感性的保护效果。
图6-11显示某些稳定剂对冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的活性的保护效果。
图12显示当以高比率(30kGy/小时)照射试样时，稳定剂对冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的活性的保护效果。
图13显示稳定剂对接受γ射线照射后的免疫球蛋白M(igM)的活性的效果。
图14与15显示稳定剂对于接受γ辐射照射后的固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的效果。
图16A、16B、17A与17B显示抗坏血酸盐在变化的浓度中对接受γ辐射照射后的固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的效果。
图18A-18H显示了稳定剂对接受γ辐射照射后由人类血清白蛋白或蔗糖所补充的冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的效果。
图19A-19F显示稳定剂对接受γ射线照射后的牛血清白蛋白所补充的冻干的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的效果。
图20A与20B在具有或不具有抗坏血酸盐的情况下，各种剂量的γ辐射对抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的效果。
图21A与21B显示低pH(4.5)值对于L-抗坏血酸对暴露于45kGyγ照射单克隆免疫球蛋白的效果的效果。
图22显示由对受猪细小病毒(PPV)污染的单克隆免疫球蛋白进行γ辐射照射而将滤过性毒菌活性破坏的程度。
图23A与23B显示当使液体或冻干形式单克隆免疫球蛋白受e-电波辐射的照射时，抗坏血酸钠盐的存在与否对于对于所达到的活性保持力程度的效果。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语均与所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明中提及的所有的专利案和出版物均以引用方式明确并入本文中。
除非上下文另有明确说明，本说明书中所使用的单数形式“一个、”“一个、”与“该”包括单数参照意。
本说明书中所使用的术语“免疫球蛋白”与术语“抗体”同义，且包括所有类别的免疫球蛋白，其包括，而不限制于以下几种：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE以及免疫球蛋白的所有亚类，如由包括人类的动物细胞中所找到或产生的IgG亚类IgG1、IgG2、IgG2、与IgG4。术语“免疫球蛋白”包括膜免疫球蛋白与分泌免疫球蛋白。膜免疫球蛋白是B细胞的横跨膜蛋白质，且作用为B细胞的抗体受体。除了缺乏在膜免疫球蛋白的C-终点的该氨基酸的横跨膜区域，分泌免疫球蛋白结构上与其膜配对物相同。分泌免疫球蛋白存在于细胞外的流质与分泌物中。
术语“免疫球蛋白”还包括免疫球蛋白片段，其包括，而不限制于以下几种片段：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fc、Facb、pFc’、与Fd，以及该技术中所知的免疫球蛋白衍生物与代谢物。免疫球蛋白的代谢物是一活性有机体所进行的免疫球蛋白代谢所产生的。该技术范围内已知有多种方法制备免疫球蛋白的各种衍生物，其通常涉及打破该免疫球蛋白中的肽或二硫键。也可眼生该免疫球蛋白，以包括变型或人造或非自然氨基酸。免疫球蛋白的衍生物还包括与一半族成对，该半族可如一毒素(例如，白喉毒素、篦麻毒素)、一标签分子(例如二氢荧光素、得克萨斯红)、一治疗或诊断用放射性原子或分子(例如125I)、一酶(例如抗生物素蛋白、山葵过氧化物酶、碱性磷酸酯酶)等等。免疫球蛋白可包括后平移变型，例如，磷酸化、glyocsylation、十四酰化、含异戊间二烯基化、ADP-核糖基化、甲基化、乙酰化、羟基化、羧化、与氧化变型，或可阳离子化或阴离子化以改变该免疫球蛋白的整个电荷。
本说明书中所使用的术语“单克隆免疫球蛋白”指一单克隆所产生的同类免疫球蛋白，其与多克隆免疫球蛋白相比照。单克隆免疫球蛋白通常由使用聚乙烯乙二醇(PEG)将具有免疫性的老鼠或耗子的脾细胞与一非分泌器骨髓瘤熔合而制备的杂种细胞制造而成。将该熔合混合物平摊在HAT媒介上，其包括次黄嘌呤、氨喋呤与胸苷。则氨喋呤会将代谢途径堵塞，但如果存在次黄嘌呤与胸苷，能将该堵塞旁路。该骨髓瘤细胞缺乏这种旁路，且因而在HAT媒介中死亡。在培养一或两星期后，脾细胞自然死亡，但熔合的细胞生存下来，因为它们具有骨髓瘤的不死性与脾细胞的代谢旁路。一些熔合的细胞分泌抗体，且以一特定化验方法检测该上清液。随后克隆生所需抗体的井。还可通过熟悉基因工程技术者所熟悉的各种技术生产单克隆免疫球蛋白，其导致了一单个套为单个免疫球蛋白代码的内在基因的诱导或结构性表达，或其牵涉将一套基因的一套或一部分加入一细胞或有机体，从而导致一单个套为单个免疫球蛋白代码的内在基因的诱导或结构性表达。
可使用上述技术结合微晶细胞培养在生物细胞培养(例如一腹水培养)中或通过转基因技术生产单克隆免疫球蛋白。转基因技术包括将一个或多个基因插入一受体有机体中。随后该受体有机体连续或根据引导生产这些基因的蛋白质制品，并将其合并或分泌进入一组织(包括蛋)或流质(包括血液、汗液、奶液、或尿液)。随后收获所导致的组织或流质，并由其净化出所需的单克隆免疫球蛋白。
本说明书中所使用的术语“单克隆免疫球蛋白的制备”包括而不限制于以下几种：(1)单独由单克隆免疫球蛋白(如一单个特异性或结合具有不同特异性和/或不同类的单克隆免疫球蛋白)所组成的组合物，且其会包含杂质(包括通过转基因方法由单克隆球蛋白所生产的一组织或流质自然产生的部分)；(2)组合物，其包括单克隆免疫球蛋白、药物可接受稀释液、载体、助理液、脂质体与其他治疗性试剂，等等，如此技术所了解；(3)部分净化的进程中单克隆免疫球蛋白中间体制备；以及(4)包含单克隆免疫球蛋白或其上固定由或排列有单克隆免疫球蛋白的物质。以下将说明优选的“单克隆免疫球蛋白的制备”。
在治疗学应用中，单克隆免疫球蛋白一般与缓冲或盐溶液结合。该单克隆免疫球蛋白还可与另一治疗学试剂结合。例如，评估防止血小板聚合的抗血小板单克隆免疫球蛋白可用于长期治疗，以防止血栓症的形成。在此应用中，该抗血小板单克隆免疫球蛋白与阿司匹林同时使用。该单克隆免疫球蛋白与其他治疗学试剂可同时包装，以通过(例如)静脉注射而使用。这也可以直接包含在一单个容器中的形式进行。包装的一更先进形式的实例为：在脂质体中使用单克隆免疫球蛋白。一般而言，通过键联至所需细胞或组织的结构上或内从而将该免疫球蛋白嵌入该作为目标试剂的脂质体的至少外层中。随后脂质体中所含药物这个特定场所释放，提供了更浓的药物治疗法，其比一般系统性治疗法具有更大的治疗指数。
对于治疗用途而言，一般以在氮或真空下密封的液体、冻结、或(冻结-干燥)冻干形式提供该单克隆免疫球蛋白。随后，通常将该单克隆免疫球蛋白与灭菌水重组(若需要，或按需要解冻)，并经过一适当途径，施行，如通过直接或在放置于一静脉(IV)包内后进行肌肉注射或静脉注射。根据本发明，可使单克隆免疫球蛋白的制备在任何阶段接受照射，包括但不限制于一原材料、一净化的或部分净化的进行中中间体，大量或单独或多重剂量密封，在密封前或密封后，在稀释以进行施行，或在该IV包或其它运输工具其自身内。该照射可在任何便利温度下进行，该温度需不对制备过程产生有害效果，且会在制备的冻结或共晶点以上或以下。有多种单克隆免疫球蛋白的制备方法可用于治疗用途，如表1所列：
    表1：治疗用单克隆免疫球蛋白制品
名称 mAb名称 目标 迹象 公司 状态 物理状态*
Herceptin Trastuzumab 抗-HER2   转移性乳癌   基因技术(Genentech) 许可 FD
Rituxan Rituximab 抗-CD2   B细胞非何杰金病   基因技术(Genentech) L
Xolair Omalizumab 抗-IgE 哮喘   基因技术(Genentech)   临床实验 FD
 抗-VEGF 抗-VEGF   复发性转   基因技术   临床实
 移乳癌   (Genentech)   验
Xanelim 抗-CD11a 抗-CD11a  严重牛皮癣   基因技术(Genentech)   临床实验 FD
LDP-02 抗-a4b7 抗-a4b7 IBD   基因技术(Genentech)   临床实验 FD
  抗-HER22C4  实体瘤   基因技术(Genentech)   临床实验   FD
Remicade Infliximab cA2  克罗恩氏病 Centacor   临床实验 FD
  Gleevec  CML   Novartis   C
  Campath  Alemtuzu  CLL   Berlex/千年
上表来源：《酶联免疫吸附测定实际指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加马出版社(Pergamon Press)
*：FD-冻结-干燥(冻干)，L-液体，I-固定于一表面，C-包含干燥材料的胶囊(口服给药)
单克隆免疫球蛋白的制备还可找到作为研究工具的应用方法，其中大量用于诊断目的，尤其在血液工作中。涉及单克隆免疫球蛋白的一般的研究工具与诊断测试包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、磁珠基础测定与分离套件、以及荧光激活细胞分析和/或分类，等等。在由实验室技术人员使用时，为了维护与安全，需要将该种诊断工具灭菌。用于诊断目的的单克隆免疫球蛋白的制备通常包括一固体支撑，如一量杆或塑料盘，其上或其内通过共价化学反应、干燥或其它已知方法固定有该单克隆免疫球蛋白。根据本发明，一完全商业包装或套件、包括其上安装有该单克隆免疫球蛋白的该固体支撑、说明书、试剂容器(例如一用于产生一标准曲线的参照样本)，等等，可根据本发明将该商业包装或套件灭菌。表2提出了许多商业诊断单克隆免疫球蛋白制品。
    表2：诊断用单克隆免疫球蛋白制品
  名称 mAb名称 目标 迹象 公司 状态 物理状态*
 CMV IgG  ELISA   ∑     FD
 CMV IgM  ELISA   ∑     FD
 HSV类型1与2(IgG) Omalizumab  ELISA   ∑     FD/L
 风疹IgG(间接)  ELISA   ∑ FD/L
 风疹IgG(俘获)  ELISA   ∑ FD
 莱姆病(间接)  ELISA   ∑ FD
 腮腺炎(间接)  ELISA   ∑ FD
 妊娠测试套件 J&J I
 FACS分析(诊断成像)   HD，犁刀     FD/L
上表来源：《酶联免疫吸附测定实际指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加马出版社(Pergamon Press)
*：FD-冻结-干燥(冻干)，L-液体，I-固定于一表面，C-包含干燥材料的胶囊(口服给药)
本说明书中所使用的术语“灭菌”指根据本发明使在所处理单克隆免疫球蛋白制剂中所发现的至少一种活性生物污染物含量降低。
本说明书中所使用的术语“生物污染物”指当与单克隆免疫球蛋白制剂直接或间接接触时可对单克隆免疫球蛋白制剂或其受体产生有害作用的污染物。这些生物污染物包括所属技术领域的技术人员已知的各种病毒、细菌和寄生虫，通常存在于或感染全血(whole blood)或血液成分等单克隆免疫球蛋白制剂。生物污染物包括，但不仅限于以下几种：病毒，比如人类免疫缺陷病毒和其他逆转录病毒(retrovirus)、疱疹病毒、细小病毒(parvovirus)、费罗病毒(filovirus)、环形病毒(circovirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒、披膜病毒(Togavirus)、埃布斯滕巴尔病毒(EbsteinBarrvirus)和细小病毒(parvovirus)；细菌，比如埃希氏杆菌、芽孢杆菌、弯曲菌、链球菌和葡萄球菌；寄生虫，比如锥体虫(Trypanosoma)和疟原虫，包括疟原虫种；酵母菌、霉菌、支原菌；以及蛋白病毒。本说明书中所使用的术语“活性生物污染物”指有能力导致有害作用的生物污染物。
本说明书中所使用的术语“生物相容溶液”(biologicallycompatible solution)指通过悬浮或溶解等方式含有单克隆免疫球蛋白，并保持其活性，即：保持其基本生物和生化特征的溶液。这些生物相容溶液最好含有有效剂量的至少一种抗凝剂。
本说明书中所使用的术语“生物相容缓冲溶液”指pH值和渗透属性(如：渗透压、渗透浓度和/或胶体渗透压)适合于保持单克隆免疫球蛋白完全性的生物相容溶液。适当的生物相容缓冲溶液的pH值通常在4到8.5之间，并且等渗，或适度低渗或高渗。所属技术的技术人员了解并可方便地得到生物相容缓冲溶液。
本说明书中所使用的术语“稳定剂”指一种化合物或材料，能够在当单克隆免疫球蛋白制剂接受照射的剂量不足，妨碍了该单克隆免疫球蛋白制剂的安全和有效使用时减少对生物材料的破坏。稳定剂包括，但不仅限于以下几种：抗氧化剂，如抗坏血酸和生育醇；以及自由基净化剂，如乙醇。稳定剂的优选实例包括，但不仅限于以下几种：脂肪酸，包括6，8二巯基辛酸(硫辛酸)及其衍生物和类似物(α、β、二氢化、双降和四环硫辛酸)、硫辛酸，6，8二巯基辛酸、dihydrolopoate(DL-6，8-二硫辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二硫甲酯和四环二硫辛酸、呋喃脂肪酸；油酸、亚油酸和棕榈酸及其酸盐和衍生物；类黄酮、苯基丙醇和黄酮醇，如槲皮黄酮、芸香苷及其衍生物，芹菜素、氨基黄酮、儿茶酚、桔皮苷以及柚苷；胡萝卜素，包括β胡萝卜素；C0-Q10；叶黄素；多羟基醇，如丙三醇、甘露醇；糖类，如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖、海藻糖；氨基酸类，如组氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、钠carpryl N-乙酰氨酸癸酰基钠和甲硫氨酸；叠氮化物，如叠氮化钠；酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶；尿酸及其衍生物，如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；别嘌呤醇；硫醇类，如谷胱甘肽和巯基丙氨酸；微量元素，如硒；维生素，如维生素A、维生素C(包括其衍生物和盐类，如抗坏血酸钠和棕榈酰抗坏血酸维生素C)和维生素E(及其衍生物和盐类，如醋酸生育酚和α三烯生育酚)；色原烷醇-α-C6；6羟基2，5，7，8-四甲基Chroma-2羧基酸(Trolox)及其衍生物；外源蛋白质，如凝胶和白蛋白；三-3-甲基-2-苯基-2-吡唑啉-5-1(MCI-186)；西替沃酮；puercelin；柯因；二甲基亚砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧基补骨脂素(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；还原物质，如丁羟甲醚(BHA)和丁羟甲苯(BHT)；胆固醇；丙丁酚；吲哚衍生物；水杨乙汞；氨基类固醇衍化物(Lazaroid)和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；原花青素；硫酸铵；聚乙烯醇超氧化物歧化酶(PEG-SOD)；N-第三丁基-α-苯基硝酸灵(PBN)；和4-异烟肼-2，2，6，6-四甲基胡椒酸-1-烃氧基(Tempol)；抗坏血酸盐、尿酸盐与Trolox C的混合物(Asc/urate/Trolox C)；蛋白质，肽与二肽；甘氨酸均二肽甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)；减少的谷胱甘肽；地奥司明；普普若加林(pupurogalin)；五倍子酸及其衍生物，包括但不限制于：丙基五倍子酸；，硫化甲醛钠与水飞蓟素。
本说明书中所使用的术语“溶剂残留量”指单克隆免疫球蛋白制剂中的自由液体(freely-available liquid)含量。自由液体是指存在于单克隆免疫球蛋白制剂中，但是不与单克隆免疫球蛋白制剂中的某种或更多种非液体成分结合或复合的水或有机溶剂(如：乙醇、异丙醇、聚乙二醇，等等)液体。自由液体包括细胞内水分。本说明书所引用的溶剂残留量是指采用经美国食品及药物管理局(FDA)批准的，经过修正的卡尔-费歇尔法(Karl Fischer method)测定的含量(梅尔(Meyer)和博伊德(Boyd)，《化学分析》(Analytical Chem.)，31，215-219，1959；梅(May)等人，《化学标准化》(Biol.Standardization)，10，249-259，1982；FDA生物制品鉴定和研究中心，备审案件号89D-0140，83-93；1990)。根据缩使用的溶剂，可通过本技术领域内已知的方法确定其它溶剂的残留水平。也可将残留溶剂与溶质的比例视为反映了该溶剂内的该溶质的浓度。当这样表达时，溶质浓度越高，残留溶剂量越低。
本说明书中所使用的术语“敏化剂”指一种能够选择性地针对病毒、细菌、蛋白病毒和/或寄生虫污染物的物质，使其对辐射去活化更加敏感，因而与不添加敏化剂的情况相比，可以采用较低的辐射率和/或较短的照射时间。适当的敏化剂包括，但不仅限于以下几种：补骨脂素及其衍生物和类似物(包括3碳乙氧基补骨脂素(3-carboethoxypsoralens)；白芷素、凯林(khelins)和含有卤代物和半水溶物(watersolubilization moiety)的香豆素，如四价铵离子或磷离子；核酸结合化合物；溴化血卟啉；鄰-二苯；羟基茜草素；卟啉(porphorin)；二聚血卟啉酯衍生物的卤代物或金属代物、二聚血卟啉衍生物、苯卟啉衍生物、氢化二苯卟啉(hydrodibenzoporphyrin)二顺丁烯二酰亚胺、氢化二苯卟啉、二氰化二磺(dicyano disulfone)、四乙酸二苯卟啉，和四乙酸二苯卟啉三丙酸氨基化合物；可用卤素或金属原子改良的阿霉素和道诺霉素；纺锤菌素；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，如金丝桃素、亚甲基蓝、四溴荧光素、荧光素(及其衍生物)，黄素、部花青540；感光化合物，如佛手柑内酯；和SE肽。
本说明书中所使用的术语“辐射”指具有足够能量将被照射单克隆免疫球蛋白的至少一些组分灭菌的辐射。辐射类型包括，但不仅限于以下几种：(i)粒子辐射(亚原子粒子流，如中子、电子、和/或质子流)；(ii)电磁辐射(从不同的电磁场中产生，如无线电波、可见光(单色与多色)和不可见光、紫外线、X射线和γ射线以及其混合物)。我们经常将该种辐射称为电离(能够在被照射材料上产生离子)辐射，如γ射线，以及非电离辐射，如可见光。该种辐射的来源可以变换，但一般而言，只要在一适当时间与一适当比率来产生灭菌效果，具体来源的材料区别很小。在实际应用中，γ辐射通常是由钴与铯的同位素产生，而X射线由发射X辐射的机器产生，且在被称为“电子束”辐射的方法中，通常使用一电子来将材料灭菌，其涉及通过一机器进行生产。
B.特别优选实施例
本发明的第一优选实施例为一种用于灭菌对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂的方法，其步骤包括：(i)将单克隆免疫球蛋白中的溶剂残留量减低到足以有效保护该单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射的水平；以及(ii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使单克隆免疫球蛋白制剂得到灭菌。
本发明的第二实施例是一种用于灭菌对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂的方法，其包括：(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射；和(ii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使单克隆免疫球蛋白制剂得到灭菌。
本发明的第三实施例是一种用于灭菌对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂的方法，其包括：(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射；和(iii)按有效比率用射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使其得到灭菌。在本实施例中，步骤(i)和(ii)可互相颠倒。
依照本发明的方法，在用辐射对单克隆免疫球蛋白制剂进行照射之前，应降低单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量。溶剂残留量应降低到足以保护单克隆免疫球蛋白制剂抵御辐射的水平。溶剂残留量的适当水平取决于接受照射的特定单克隆免疫球蛋白制剂的性质和特点，也可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。优选情况为，当溶剂是水时，溶剂残留量应低于约2.0％，低于1.0％更好，低于0.5％更好，最好是低于0.2％。
根据本发明的方法，可通过熟悉此技术领域者所熟悉的一种方法可将该待灭菌单克隆球蛋白固定于一固体表面。
根据本发明的方法，可将照射比率优化以产生制品回复与完成操作所需时间的最有利组合。通过此处所说明的方法的适当应用，可达到低比率(小于等于3kGy/小时)与高比率(大于等于3kGy/小时)。
尽管不希望与任何操作性理论结合，但是人们公认降低溶剂残留量可降低单克隆免疫球蛋白制剂的自由度，因而保护其抵御电离性辐射的影响。通过将单克隆免疫球蛋白制剂的温度降低到其低共熔点或凝固点以下来降低单克隆免疫球蛋白制剂的自由度可获得相似结果。这些结果允许采用更高的照射率。因此，此处所说明饿方法可在任何不会导致损害该单克隆免疫球蛋白的温度下进行。
可采用所属技术领域的技术人员已知的任何方法和技术来降低单克隆免疫球蛋白制剂中的溶剂残留量，从而将溶剂从单克隆免疫球蛋白制剂中去除。该方法可包括，但不限制于：蒸发、浓缩、离心浓缩、玻璃化与喷溅干燥。降低单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量的一种特别优选方法是冻干法。根据本发明的特别优选实施例，可将生物材料在照射之前储存在真空或惰性空气中(惰性气体优选，如氦或氩，高分子重量惰性气体更佳，最好是氩)进行冻干。
本发明中所采用的辐射可以是任何能够将需处理的单克隆免疫球蛋白制剂中的一种或更多种生物污染物有效去活化的辐射。该辐射可为微粒子辐射，包括e电波辐射。优选的辐射为电磁辐射，包括可见光、UV光与电磁辐射的各种波长的混合物，且特别优选的辐射形式是γ辐射。
根据本发明的方法，用辐射照射单克隆免疫球蛋白制剂的比率应足以将单克隆免疫球蛋白制剂的一种或更多种生物污染物有效去活化。适当的照射比率取决于辐射的特定形式以及被照射的特定单克隆免疫球蛋白制剂和被去活化的特定生物污染物的性质和特点。适当的照射比率也可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。在灭菌程序持续过程中，照射比率最好保持不变。当这无法实行时，可利用一可变或间断辐射。
根据本发明的一个特别优选实施例，照射的比率不应超过约3.0KGy/小时，在约0.1kGy/小时和3.0kGy/小时之间优选，在约0.25kGy/小时和2.0kGy/小时之间更佳，在约0.5kGy/小时和1.5kGy/小时之间更佳，在约0.5kGy和1.0kGy/小时之间最佳。
根据本发明的另一特别优选实施例，照射比率至少为约3.0kGy/小时，至少为约6kGy/小时优选，至少为约16kGy/小时更佳，至少为约30kgy/小时更加，至少为约45kgy/小时或以上最佳。
用辐射照射单克隆免疫球蛋白制剂一段时间，使单克隆免疫球蛋白制剂中的一种或更多种生物污染物有效地去活化。与照射比率相结合，适当的照射时间导致应用于该单克隆免疫球蛋白的照射的适当剂量。适当的电离时间取决于辐射的特定形式和比率，以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性质和特征。适当的电离时间还可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。
在用辐射照射单克隆免疫球蛋白制剂之前，可选择向单克隆免疫球蛋白制剂中添加至少一种有效剂量的敏化剂，以增强该照射的抗微生物效果，同时使用此处所说明的方法将照射对单克隆免疫球蛋白的有害效果最小化。适当的敏化剂为所属技术领域的技术人员已知的敏化剂。
依照本发明的方法，对单克隆免疫球蛋白制剂进行照射可在任何对需处理的单克隆免疫球蛋白制剂无害的温度下进行。根据本发明的一个优选实施例，在环境温度下照射单克隆免疫球蛋白制剂。根据本发明的一个替代优选实施例，在对比温度下，最好在单克隆免疫球蛋白制剂的凝固点或低共熔点或更低的温度下照射单克隆免疫球蛋白制剂。
为了避免该单克隆免疫球蛋白的退化，单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于7，优选为小于6，更佳为小于5，更佳为小于4，且最佳为小于3。
应当理解，可将此处所说明的若干方法组合使用以进一步将辐射对单克隆免疫球蛋白的有害效果最小化，同时维持该辐射过程的抗微生物属性的充分效力。
C.实施例
以下实施例用来说明，而并非限制本发明。所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种修正和改进。除非另有说明，所有辐射均使用一60Co来源实现。
例13
在本实验中，我们通过将冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白暴露于45kGy的低剂量γ辐射来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、蛋氨酸和硫辛酸。
方法
在2ml玻璃小试管中，将总容积为0.5ml，含有50μg抗胰岛素单克隆免疫球蛋白5mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或50mM稳定剂的试样冻干。在真空状态中将试样塞紧。用γ射线照射试样(总剂量45kGy，比率1.83kGy/小时，温度4℃)，然后用水重组。
用标准ELISA协议测定独立副样的抗体结合活性：96孔微滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。在DEA缓冲液中使用1mg/ml的∑104碱性磷酸酶基质。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
通过估算接受照射的试样的滴定曲线相对于未接受照射试样的位移(即：观察到同样结合量所需的免疫球蛋白浓缩)来测定相对保护作用，未接受照射试样处于未接受照射试样的最大吸收率标志的约50％处。
结果
不含稳定剂的冻干试样在经受45kGy的γ照射后保持50％的免疫球蛋白活动性。这一结果与先前45kGyγ照射几乎破坏了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的结果形成了对照。因此，显而易见，通过冻干减少残留水分可非常有效地保护该单克隆免疫球蛋白。
添加抗坏血酸钠使试样在接受照射之后能够完全恢复其活性。经过与未接受照射的试样相比可以发现，蛋氨酸和硫辛酸也能充分恢复活性(76-83％)。实验结果如图1和2所示。使用普普罗加林(pupurogalin)可得到相似结果(65％的恢复活性)(数据未显示)。
例2
在本实验中，我们通过将冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白暴露于45kGy的低剂量γ辐射来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽以及尿酸/trolox混合物和抗坏血酸/尿酸/trolox混合物。
方法
在3ml玻璃小试管中，将总容积为1.0ml，含有100μg抗胰岛素单克隆免疫球蛋白、10mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或稳定剂的试样冻干。在真空状态中将试样塞紧。用γ射线照射试样(总剂量45kGy，比率1.83kGy/小时，温度4℃)，然后用1.0ml水重组。
用标准ELISA协议测定独立副样的球蛋白结合活性：96孔Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
采用平行线分析软件包(PLA 1.2，Stegmann Systemberatung)测定相对保护作用。
结果
不含稳定剂的冻干试样在经受45kGy的γ照射后保持70％的球蛋白活动性。这一结果不同于先前45kGyγ照射几乎破坏了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的结果。因此，显而易见，通过冻干减少残留水分可非常有效地保护蛋白质。
添加抗坏血酸钠使试样在接受照射之后使活性增加恢复20％，即：照射之后，活动性恢复90％。其他稳定剂恢复活性77-84％。实验结果如图3A-3C所示。
例3
在本实验中，我们测定首次冻干(制品中仍留有相对“高水分”)和首次与二次冻干的结合(使制品只含“低水分”)对单克隆免疫球蛋白敏感度的效果。
方法
在3ml玻璃小试管中，将总容积为1.0ml，含有100μg抗胰岛素单克隆球蛋白(mAb)、10mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或100mM稳定剂的试样冻干(使用首次冻干或首次与二次冻干的结合)。在真空状态中将试样塞紧。用γ射线照射试样(总剂量45kGy，比率2.03到2.13kGy/小时之间，温度4℃)，然后用1.0ml水重组。
用标准ELISA协议测定独立副样的免疫球蛋白结合活性：Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
结果
不添加稳定剂时，已经经过二次“低水分”干燥期的抗胰岛素免疫球蛋白在照射之后的恢复度更好，即：在不添加稳定剂的情况下，较低的总水分含量可改善恢复度。
然而，在添加稳定剂时，球蛋白在经过45kGy照射后具有非常好的恢复度，无论是仅经过首次“高水分”干燥期的试样还是经过了二次“低水分”干燥期的试样。
本实验的结果如图4与图5所示。
例4
在本实验中，我们某些稳定剂对冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的活性的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、trolox/抗坏血酸/尿酸混合物、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。
方法
冻干，并在真空状态下塞紧添加了1％人类血清白蛋白(以及5％蔗糖，可选)的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白，然后照射试样(总剂量45kGy，比率1.83到1.88kGy/小时之间)采用上述的标准ELISA协议测定球蛋白结合活性。
结果
以45kGy的剂量照射添加了1％HSA的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白导致其活动性平均损失约33％。添加下列稳定剂可明显改善恢复度：20mM抗坏血酸钠(恢复度100％)；200μMtrolox/1.5mM尿酸/20mM抗坏血酸(恢复度87％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢复度82％)。以45kGy的剂量照射添加了1％蔗糖的含有1％HSA的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白导致其活动性平均损失约30％。添加下列稳定剂可明显改善恢复度：20mM抗坏血酸钠(恢复度88％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗坏血酸(恢复度84％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢复度72％)。
这些实验的结果如图6-11所示。
例5
在本实验中，我们测定当试样经受高比率(30kGy/小时)照射时，稳定剂(抗坏血酸)对冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的活性的保护效果。
方法
冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白，并以的30kGy/小时的比率对其进行照射(总剂量45kGy)。采用上述的标准ELISA协议测定免疫球蛋白结合活性。
结果
以45kGy的剂量照射冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白导致其活动性平均损失约32％。添加20mM抗坏血酸钠可将活性恢复到未照射试样的85％。本实验的结果如图15所示。
例6
在本实验中，我们以低比率照射添加或不添加稳定剂的特别用于鼠IgG3的IgM单克隆免疫球蛋白。
方法
照射液体抗鼠IgG3单克隆IgM(在含10mM叠氮化钠的PBS缓冲液中；抗体浓度为666μg/μl)，比率1.8kGy/小时，总剂量为10kGy或45kGy。试样不含稳定剂，或者含有包括20mM柠檬酸、300μM尿酸和200mM抗坏血酸的稳定剂混合物。
使用鼠IgG3作为覆盖抗原，以及与磷酸酶共轭的抗白鼠IgM检验抗体，根据标准ELISA协议分析免疫球蛋白活性。
结果
在接受总剂量为10kGy或45kGy的γ照射后，不含稳定剂的液体试样丧失了所有功能性免疫球蛋白活性。但是，如果添加稳定剂混合物，接受10kGyγ照射后，活性可完全恢复，接受45kGyγ照射后，活性恢复88％。本实验的结果图13所示。
例7
在本实验中，使用固定的抗人类胰岛素单克隆免疫球蛋白，使其暴露至45kGy的低剂量γ照射后，将测定特定稳定剂的保护效果。受检测稳定剂为：抗坏血酸钠、降低的谷胱甘肽、硫化甲醛钠、与聚丙二醇。
方法
于4℃在覆盖缓冲中将两培养板用100μl/井的新制备的2μg/毫升抗胰岛素免疫球蛋白覆盖过夜。用PBS将该培养板简单冲洗三次。制备PBS中的各稳定剂的一两重连续稀释液。向各井加入100μl选定的稳定剂。将该板紧紧用一盖垫覆盖。于将4℃一块板以1.92kGy/小时总共照射45kGy。该控制板接受了0kGy且将其在4℃储存。
用一标准ELISA协议确定免疫球蛋白结合活性。将该板井清空并用一整个容积的PBS清洗4次。将整个容积的阻塞缓冲(约380μl)加入所有井中，并在37℃培育两个小时。将所有井用一整个容积的TBST(TBSpH 7.4并具有0.05％TWEEN 20)清洗4次。将一百μl的在结合缓冲中的59ng/毫升生物素标签的胰岛素加入各个井。用一板封条将该板覆盖，并在37℃培育1.5小时并不断摇晃(实验室浓度测定摇晃器设置为3)。将井用TBST清洗4次。将一百μl的在结合缓冲中的0.5μg/毫升磷酸酶标签链霉胍加入各个井。用一板封条将该板覆盖，并在37℃培育一小时并不断摇晃。随后将井用TBST清洗4次。将一百μ1的在DEA缓冲中的0.1克/毫升∑104磷酸酶基板加入各个井。随后在37℃将该板培育一小时并不断摇晃。每5分钟间隔于405nm-628nm确定吸收率。
结果
如图14与15所示，抗坏血酸钠显示了一依赖剂量的效果。包括31-250mM之间的抗坏血酸钠表现出73-81％的保留活性的增加。
包含谷胱甘肽的样本体现出25％的单克隆免疫球蛋白活性保持力的增加，其取决于谷胱甘肽的浓度约为31mM。
用硫化甲醛钠处理的样本体现出在稳定剂浓度为31mM的情况下，比控制样本多出约50％的维持活性。
所有三种形式的聚丙二醇(意即，聚丙二醇P400(Fluka31250)；聚丙二醇P1200(Fluka81370)；以及聚丙二醇P2000(Fluka81380)体现出一保护效果。用聚丙二醇处理的样本体现出比控制样本多出约50-60％的活性保持力的增加。
例8
在本实验中，确定保护固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白抵御45kGy的γ照射的抗坏血酸钠的最佳浓度。同时还确定了1.5mM尿酸的存在是否对暴露至γ照射的固定单克隆免疫球蛋白的稳定性是否有任何效果。
方法
于4℃在覆盖缓冲中将两培养板用100μl/井的新制备的2μg/毫升抗胰岛素免疫球蛋白覆盖过夜。丢弃覆盖溶液，并用PBS将该培养板简单冲洗二次。将二十五μl的4X抗坏血酸盐溶液加入适当的井中。将七十五μl的水加入该无尿酸盐的井中(a-d行)。将二十五μl的水加入包含尿酸盐的井中(e-h行)将十五μl的3mM尿酸盐加入该包含尿酸盐的井中(e-h行)。将该板紧紧用一96-井盖垫覆盖。于4℃将一块板以1.9kGy/小时总共照射45kGy。在4℃将另一控制板储存作为一行动控制。
用一标准ELISA协议确定免疫球蛋白结合活性。将该板井清空并用一整个容积的PBS清洗两次。通过将整个容积的阻塞缓冲(约380μl)加入所有井中，并在37℃培育两个小时，使得不存在具体的结合点被阻塞。将所有井用TBST清洗三次。将一百μl的在结合缓冲中的10ng/毫升生物素标签的胰岛素(在结合缓冲内按照1∶100,000稀释)加入各个井。用一板封条将该板覆盖，并在37℃培育一小时并不断摇晃(实验室浓度测定摇晃器设置为三)。将井用TBST清洗，每套两次，共四套，通常每套间隔五分钟。将一百μl的在结合缓冲中的25ng/毫升磷酸酶标签链霉胍(在结合缓冲内按照1∶20,000稀释)加入各个井。用一板封条将该板覆盖，并在37℃培育一小时并不断摇晃。随后将井用TBST清洗，每套两次，共四套，通常每套间隔五分钟。将一百μl的在DEA缓冲中的1ng/毫升∑104磷酸酶基板加入各个井。随后在37℃将该板培育一小时并不断摇晃。每5分钟间隔于405nm-628nm确定吸收率。
结果
我们确定，在一水性环境中(存在尿酸的情况下)，为固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白提供最大保护所需要的抗坏血酸钠的最佳浓度为150mM。在约150mM的抗坏血酸盐浓度的情况下，所达到的抗胰岛素结合活性的恢复约为50％。加入1.5mM的尿酸导致了抗坏血酸剂量曲线的略微左移(-5mM)，并显示出以一较低浓度达到最大的活性回复。图16A显示了完整的数据套，且图16B是确定这些值所使用的数据的关键区域的扩展。
例9
在本实验中，确定保护固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白抵御45kGy的γ照射的抗坏血酸钠的最佳浓度。实验还确定了2.25mM尿酸的存在是否会影响抗坏血酸盐的稳定效果稳定性。
方法
于4℃在覆盖缓冲中将两培养板用100μl/井的新制备的2.5μg/毫升抗胰岛素免疫球蛋白覆盖过夜。丢弃覆盖溶液，并用PBS将该培养板简单冲洗二次。将二十五μl的4X抗坏血酸盐溶液加入适当的井中。将七十五μl的水加入该无尿酸盐的井中(a-d行)。将七十五μl的尿酸盐堆加入包含尿酸盐的井中(e-h行)(f.c＝2.25mM)。将该板紧紧用一96-井盖垫覆盖。于4℃将一块板以1.9kGy/小时总共照射45kGy。在4℃将另一控制板储存作为一行动控制。
按照例8所述确定单克隆免疫球蛋白的结合活性。
结果
如图17A与17中所显示，我们确定，在一水性环境中(存在尿酸的情况下)，为固定抗胰岛素单克隆免疫球蛋白提供最大保护所需要的抗坏血酸钠的最佳浓度为70mM。这与例8形成对比，例8显示了抗坏血酸钠的最佳浓度为150mM。在此例中达到了约100％的抗胰岛素结合活性的回复，二在例8中知达到了约50％。在约150mM的抗坏血酸盐浓度的情况下，所达到的抗胰岛素结合活性的恢复约为50％。加入尿酸(2.5mM)再次导致了抗坏血酸剂量曲线的略微左移(-5mM)，并显示出以一较低抗坏血酸盐浓度(-25mM)达到最大的活性回复。我们发现，对于无尿酸的受照射样本，其存在一双相属性。在0-20抗坏血酸盐之间，回复率大大提高，在20-50mM的抗坏血酸盐之间平稳，随后再次升高直至观察到约为70mM的抗坏血酸盐的最大恢复率。
例10
在本实验中，我们将评估各种稳定剂对于受照射的由1％人类血清白蛋白(HSA)与5％蔗糖不中的冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的保护效果。受测稳定剂为：抗(坏雪酸mM)；trolox(200mM)、尿酸(1.5mM)、与抗坏雪酸(20mM)的混合物；n-乙酰基-1-半胱氨酸(20mM)；降低的谷胱甘肽(20mM)；与二肽，Gly-Gly(20mM)。
方法
将样本冻干约64小时，在真空下停止，并由铝制折压封条密封。在4℃以1.83-1.88kGy/小时的剂量率总共照射样本45.1-46.2kGy。
用一标准ELISA协议确定单克隆免疫球蛋白结合活性。于4℃将Maxisorp板用人类重组细胞胰岛素以2.5μg/毫升覆盖过夜。在37℃用200μl的堵塞缓冲(PBS，pH7.4，2％BSA)将该板堵塞两小时并用清洗缓冲(TBS，pH7，0.05％TWEEN20)清洗六此。将样本重新悬浮在500μl的高纯度水(100ng/μl)中，在一300μlU型底部的板中稀释至5μg/毫升，用堵塞缓冲将该板覆盖过夜活两小时。执行三重连续稀释，最终浓度为0.0022μg/毫升。在37℃将板培育一个小时，并不断搅动，然后用一清洗缓冲清洗6次。在结合缓冲中将磷酸酶标签山羊抗鼠IgG(H+L)稀释至50ng/毫升，并将100μl加入各个井。并在37℃将板培育一个小时，在37℃培育一小时，并不断搅动。然后用一清洗缓冲清洗6次。将一百μl的∑104基板(1克/毫升在DEA缓冲中)加入各个井，并在室温下进行反应。减去620nM吸收率后，一MultiskanMCC/340上的板读数为405nM。
如图18A-18H中所显示，用1％HSA补充的冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白，用γ将其照射至45kGy，导致了其活性平均降低1.5倍(亲抗原性平均降低33％)。
在存在稳定剂的情况下将样本照射至45kGy会产生变化的结果：
20mM抗坏血酸盐＝~100％回复
200uM trolox，1.5mM尿酸盐，20mM抗坏血酸盐＝~87％回复
20mM降低的谷胱甘肽＝~76％回复
20mM Gly-Gly＝~100％回复
在将样本照射至45kGy时，将5％的蔗糖加入包含1％HSA的冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白会导致样本活性平均回复70％(活性平均降低约1.5倍或亲抗原性平均降低30％)。
在存在前述稳定剂的情况下，当样本被辐射至45kGy时，若加入了5％的蔗糖，则活性会降低：
20mM抗坏血酸盐＝-88％回复
200uM trolox，1.5mM尿酸盐，20mM抗坏血酸盐＝-84％回复
20mM降低的谷胱甘肽＝-69％回复
20mM Gly-Gly＝-79％回复
将20mM抗坏血酸盐，20mM Gly-Gly或加入20mM的抗坏血酸盐与Gly-Gly加入具有不同特异性的另一单克隆IgG制备中(抗-Igλ光链)，会达到相似的结果。
例11
在本实验中，评估了抗坏血酸盐(Asc，20mM)，抗坏血酸盐(20mM)/尿酸盐(1.5mM)/trolox(200uM)鸡尾酒(AUT)、n-乙酰基-半胱氨酸(中性形式：NAC-n，酸性形式：NAC-a，都为20mM)，Gly-Gly(20mM)，降低的谷胱甘肽(GSH，20mM)，地奥司明(39.3uM)与水飞蓟素(246uM)对冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白的保护效果。
方法
在3ml玻璃小试管中，将总容积为1.0ml，含有100μg抗胰岛素单克隆免疫球蛋白，附带有10克BSA(1％)以及/无相关稳定剂的样本冻干。在真空状态中γ射线照射样本(总剂量45kGy，剂量比率1.83kGy/小时之间，温度4℃)，然后用1ml水重组。对不包含免疫球蛋白的四重样本进行卡尔·费希尔湿度分析。
通过一标准ELISA协议确定独立性独立样本的免疫球蛋白结合活性：将Maxisorp板用2.5μg/毫升的胰岛素抗原覆盖过夜。在5μg/毫升时开始对该抗胰岛素单克隆免疫球蛋白使用三重连续稀释。在50克/毫升使用山羊抗鼠磷酸酶共轭。采用平行线分析软件包(PLA1.2，Stegmann Systemberatung)计算与其相应未受照射样本相比受照射样本的相对力量值。由宾夕法尼亚州Westchester的M-scan公司实施质谱分析法。
如图19A-19F所显示，在存在1％牛血清白蛋白的情况下对冻干抗胰岛素单克隆免疫球蛋白进行照射会导致其固定抗原免疫球蛋白的亲抗原性损失约30％(相对于未受照射的样本)。单独添加抗坏血酸盐将回复改进20％，使得在照射后约回复90％的亲抗原性。添加抗坏血酸盐/尿酸盐/trolox鸡尾酒/二肽甘氨酸Gly-Gly、中性n-乙酰基-半胱氨酸、降低的谷胱甘肽、或水飞蓟素会导致亲抗原性回复77-84％。
将200mM抗坏血酸盐，200mM Gly-Gly或加入200mM的抗坏血酸盐与Gly-Gly加入具有不同特异性的另两个其他单克隆IgG制备中(抗-Igλ光链与抗IgG1)，会达到相似的结果。
例12
在本实验中，评估了在存在或不存在抗坏血酸盐的情况下以液体形式受照射的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白抗坏血酸盐的稳定性。
方法
将抗胰岛素单克隆免疫球蛋白稀释至1克/毫升，并在4℃时在存在或不存在200mM抗坏血酸盐的情况下用γ射线照射至一总剂量为0，15，或45kGY的程度。
大体按照前一实例中所述通过一标准ELISA协议确定独立性独立样本的免疫球蛋白结合活性。
结果
如图20A与20B所显示，与室内稀释控制与0kGy加抗坏血酸盐控制相比，加入200mM抗坏血酸盐导致用15Kgvy的射线照射的样本的免疫球蛋白结合活性回复100％，且导致用45Kgvy的射线照射的样本的免疫球蛋白结合活性回复71.7％与80.4％。按照由聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定，在不存在稳定剂的情况下对抗胰岛素免疫球蛋白的照射导致了蛋白质的退化，如在聚丙烯酰胺凝胶上的高分子重量带所显示。此外，显然，材料大大损失了。加入200mM的抗坏血酸盐对于在15kGy与45kGy受辐射的免疫球蛋白具有一保护性效果，如一完整IgG1带与一重及轻链带所显示。
当均分该15kGy加200mM抗坏血酸盐的副本时，该抗原结合活性与该稀释控制的结合活性并无显著不同。与其相比，与室内稀释控制与桨料控制相比，将包含抗坏血酸的样本照射至45kGy会导致亲抗原性相应平均降低2-与2.5-成。该SDS-PAGE分析表明在不存在抗坏血酸的情况下，照射该抗胰岛素单克隆免疫球蛋白会导致材料大量损失，并产生一高分子重量退化。加入200mM抗坏血酸盐能防止退化形成，并导致在照射至15Gy与45kGy后，该免疫球蛋白相应回复约80％与约50％。
例13
执行本实验以确定是否低pH值(4.5)会减少L-抗坏血酸对被用γ射线照射至45kGy的单克隆免疫球蛋白的稳定效果。
方法
于pH6.8与4.5时在存在与不存在200mM L-抗坏血酸的情况下将液体形式的抗胰岛素单克隆Ig(抗人类胰岛素单克隆免疫球蛋白，净化的克隆#7F8；升华设计国际#E86102M，7125000组)以一1.774kGy/小时(60Co)的比率照射至一总剂量为45kGy。在照射后，在一ELISA测试重使用胰岛素覆盖板作为目标测试分析样本的抗原-特定结合能力。经由标准SDS-PAGE电泳在降低与未降低条件下对Ig进行结构分析。
结果
如图21A与21B所显示，该ELISA功能测试清晰的显示出在存在抗坏血酸盐的情况下，单克隆免疫球蛋白的回复并不取决于pH值。pH值6.8与4.5的图表实际上是双重的。加入抗坏血酸时并在照射之后，在两个pH值中均可看到活性略微损失，然而此降低的程度与当不存在抗坏血酸盐的情况下进行照射而导致的活性完全损失相比是很小的。
SDS-PAGE电泳凝胶显示出在pH3.8与pH4.5的情况下，若不存在抗坏血酸，则在45kGy时该免疫球蛋白会完全被破坏。加入200mM的抗坏血酸在照射后维持了同样透明的结构。若pH值为4.5则可消除退化现象。
这些结果表明，在存在200mM抗坏血酸的情况下，可至少将单克隆Ig照射至45kGy，同时在pH值6.7与4.5保持结构与活性。
例14
在本实验重，评估了在将一用猪细小病毒(PPV)感染的抗胰岛素单克隆免疫球蛋白用60Coγ射线以约1.8kGy/小时的比率在4℃时进行照射时滤过性毒菌灭活水平与单克隆免疫球蛋白活性保持力。
方法
我们利用PPV作为人类细小病毒B19的一模型病毒，该病毒被人们视为在人类来源的生物物质中所关注的最困难的非包络病毒，它是细小病毒族其他成员的极其相似物，我们也将该其他细小病毒族成员视为动物来源的生物物质中最困难的病毒。
将一高滴定率穿入一用于抵抗胰岛素的单克隆免疫球蛋白的制备中。将一杀虫剂，(抗坏血酸钠盐)加入一些样本中，最终浓度为200mM。
在4℃时于1.8kGy/小时的大约比率将待照射样本暴露至60Co辐射。
在照射一些样本后，取出穿入样本的整除部分并将其用于滴定剩余感染病毒粒子的数量。简单而言，以一被成为细胞病理效应测试(CPE)的滤过性毒菌检测生物鉴定法来测试该样本。一细胞系，其能被PPV病毒感染，并被其细胞溶解(猪肾细胞，也被成为PK-13细胞)，将该细胞系加入96-井测试板以形成一约70％汇合的单层。以一限制连续稀释(5重稀释)将样本的四重整除部分加入该井。然后将板培育7-8添，并检查以确定活细胞是否还存留在该井中。按卡伯(Karber)的说明使用一限制-稀释方法分析所产生的数据，以确定该滤过性毒菌的滴定率，该结果在附图中了有所显示，为每毫升Log10TCID50滴定率。
结果
如以下的表4与图22所显示，对γ射线的应用以一依赖剂量的方式有效阻止了该病毒的活动。将200mM的抗坏血酸钠盐加入该单克隆免疫球蛋白导致了在较低剂量的滤过性毒菌灭活显著降低，但在较高剂量时，此效果要小很多。将45kGy的γ射线应用于包含抗坏血酸盐的样本导致4组以上的滤过性毒菌灭活。
    γ射线剂量     抗坏血酸盐   TCID50滴定率/0.1毫升   滤过性毒菌滴定率的
    Log10降低
    0kGy     -     7.075
    ″     +     7.95
    10kGy     -     5.4125     1.66
    ″     +     3.575     4.375
    30kGy     -     3.4     3.675
    ″     +     2.35     5.6
    45kGy     -     2.525     4.55
    ″     +     2.35     5.6
例15
执行本实验中以评估在存在或不存在抗坏血酸钠盐的情况下将液体与冻干形式的单克隆免疫球蛋白用e电波辐射照射时所达到的活性保持力水平
方法
测试液体的抗胰岛素IgG1，并在冻干后也惊醒测试。准备具有或不具有200与20mM抗坏血酸钠盐的样本，样本相应为液体与冻干状态。
在77-88°F时，以一大约为45kGy/小时的比率将待照射样本(具有或不具有抗坏血酸盐)暴露至e电波辐射。该e-电波能量为7MeV，且所给总剂量为约45kGy。控制样本由未受照射的样本与一参照控制样本组成，该未受照射的样本具有或不具有抗坏血酸盐传送至或来自该照射点，该参照控制样本并不被传送至该照射点。在传输过程中，将样本保持在4℃。下表5显示了样本：
表5：样本
样本名称 物理状态  抗坏血酸盐 传送至照射器  E电波剂量(kGy)
    新鲜Ig     液体     0
    L-I/0     液体     √     0
    L-I/45     ″     √     45
    L-I/A/0     ″     √     √     0
    L-I/A/45     ″     √     √     45
    新鲜Ig     冻干     0
    fd-I/0     冻干     √     0
    fd-I/45     ″     √     45
    fd-I/A/0     ″     √     √     0
    fd-I/A/45     ″     √     √     45
在照射之后，用蒸馏水重组该冻干样本。然后按实例10中所说明的抗人类胰岛素ELISA测试检测所有的样本。由于该浓度的Ig产生了最大OD的约50％，手动测量抗原结合活性的恢复情况。
入下表6中可见，当处于液体状态时，应用e电波辐射能完全灭活该Ig。在存在抗坏血酸盐的情况下，活性明显回复，但回复程度有限。
在照射以前，将Ig冻干，这对于活性回复比单独将抗坏血酸盐加入液体要具有更大效果。当将无抗坏血酸盐的Ig照射时，约有50％的抗原结合活性回复。在冻干之前加入20mM抗坏血酸盐导致活性完全回复。该ELISA的结果如图23A与23B所显示。
表6大约抗原结合活性
样本名称 物理状态  电子束计量(kGy) ≈50％的最大OD405-620 ≈％的活性回复
  新鲜Ig     液体     0     0.065
  L-I/0     液体     0     0.12     100
  L-I/45     ″     45     ∞     0
  L-I/A/0     ″     0     0.18     100
  L-I/A/45     ″     45     1.8     10
  新鲜Ig   冻干     0     0.17
  fd-I/0   冻干     0     0.21     100
  fd-I/45     ″     45     0.45     50
  fd-I/A/0     ″     0     0.22     100
  fd-I/A/45     ″     45     0.21     100
以上对本发明进行了充分说明，应当理解在不脱离本发明的范围及其任何实施例的情况下，所属技术领域的技术人员当可在更广或等同的条件、模式和其他参数范围内实施本发明。本说明书中所提及的所有专利或文献均以引用方式完整并入本文中。所引用的任何文献是未在其归档日期前的发表，且不应当将其视为承认本发明不比先前发明的该文献日期居前。

Claims (100)

1.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)将单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量减低到足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射的水平；以及
(ii)按有效比率用适当射线对所述单克隆免疫球蛋白制剂照射一段使所述单克隆免疫球蛋白制剂得到有效灭菌的时间。
2.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)向单克隆免疫球蛋白制剂中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射；和
(ii)按有效比率用适当射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段使所述单克隆免疫球蛋白制剂得到有效灭菌的时间。
3.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)向单克隆免疫球蛋白制剂中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射；和
(ii)按低比率用适当射线对单克隆免疫球蛋白制剂照射一段使所述生物材料得到有效灭菌的时间。
4.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射的水平；和
(ii)按低比率用适当射线对所述单克隆免疫球蛋白制剂照射一段使所述单克隆免疫球蛋白制剂得到有效灭菌的时间。
5.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)将单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量减低到足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述电离辐射的水平；
(ii)向所述单克隆免疫球蛋白制剂中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射；和
(iii)按有效比率用适当射线对所述单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使所述单克隆免疫球蛋白制剂得到灭菌，其中步骤(i)和(ii)可按颠倒顺序实施。
6.一种用于将对辐射敏感的单克隆免疫球蛋白制剂灭菌的方法，该方法包括：
(i)将单克隆免疫球蛋白制剂的溶剂残留量减低到足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述电离辐射的水平；
(ii)向所述单克隆免疫球蛋白制剂中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述单克隆免疫球蛋白制剂抵御所述辐射；以及
(iii)按低比率用适当射线对所述单克隆免疫球蛋白制剂照射一段有效时间，使所述单克隆免疫球蛋白制剂得到灭菌，其中步骤(i)和(ii)可按颠倒顺序实施。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为水。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述溶剂为水。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶剂为水。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶剂为水。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述残留水量通过添加一种有机溶剂来减少。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述残留水量通过添加一种有机溶剂来减少。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述残留水量通过添加一种有机溶剂来减少。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述残留水量通过添加一种有机溶剂来减少。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为有机溶剂。
16.根据权利要求4所述的方法，其中所述溶剂为有机溶剂。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶剂为有机溶剂。
18.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶剂为有机溶剂。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
20.根据权利要求4所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
21.根据权利要求5所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
22.根据权利要求6所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
23.根据权利要求7所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
24.根据权利要求8所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
25.根据权利要求9所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
26.根据权利要求10所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
27.根据权利要求11所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
28.根据权利要求12所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
29.根据权利要求13所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
30.根据权利要求14所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
31.根据权利要求15所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
32.根据权利要求16所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
33.根据权利要求17所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
34.根据权利要求18所述的方法，其中在减少该残留溶剂量后将该单克隆免疫球蛋白制剂悬浮于一有机溶剂中。
35.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂选自：IgG与其片段、衍生物、及代谢物；IgM与其片段、衍生物、及代谢物；IgA与其片段、衍生物、及代谢物；IgD与其片段、衍生物、及代谢物；IgE与其片段、衍生物、及代谢物；以及其混合物。
36.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白是IgG或其片段或其衍生物或其代谢物。
37.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白是IgM或其片段或其衍生物或其代谢物。
38.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白是IgA或其片段或其衍生物或其代谢物。
39.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白是IgD或其片段或其衍生物或其代谢物。
40.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白是IgE或其片段或其衍生物或其代谢物。
41.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白包括选自以下的免疫球蛋白：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fc、Facb、pFc’、与Fd；或其衍生物与代谢物。
42.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该有效比率不得大于约3.0kGy/小时。
43.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该有效比率不得大于约2.0kGy/小时。
44.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该有效比率不得大于约1.0kGy/小时。
45.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该有效比率不得大于约0.3kGy/小时。
46.根据权利要求1、2或5的任何一项所述的方法，其中该有效比率大于约3.0kGy/小时。
47.根据权利要求1、2或5的任何一项所述的方法，其中该有效比率至少为约6.0kGy/小时。
48.根据权利要求1、2或5的任何一项所述的方法，其中该有效比率至少为约18.0kGy/小时。
49.根据权利要求1、2或5的任何一项所述的方法，其中该有效比率至少为约45kGy/小时。
50.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中在一低氧环境中维持该单克隆免疫球蛋白。
51.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中在一低氩环境中维持该单克隆免疫球蛋白。
52.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中在一真空环境中维持该单克隆免疫球蛋白。
53.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中通过选自以下方法的方法降低该残留溶剂量：冻干、干燥、浓缩、加入溶质、蒸发、化学萃取、喷溅干燥、以及玻璃化。
54.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中该残留溶剂量低于10％。
55.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中该残留溶剂量低于5％。
56.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中该残留溶剂量低于2％。
57.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中该残留溶剂量低于1％。
58.根据权利要求1、4、5或6的任何一项所述的方法，其中该残留溶剂量低于0.5％。
59.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中在进行照射该单克隆免疫球蛋白制剂的步骤之前，将至少一个敏感器添加至该单克隆免疫球蛋白制剂中。
60.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂包含至少一个蛋白病毒以作为生物污染物。
61.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂包含至少一个病毒作为生物污染物。
62.根据权利要求1或4所述的方法，其中在进行照射该单克隆免疫球蛋白制剂的步骤之前，至少将一个稳定剂添加至该单克隆免疫球蛋白制剂。
63.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂是抗氧化剂。
64.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂是自由基净化剂。
65.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂由于其反应氧气特性而降低损坏。
66.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个稳定剂选自：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸；尿酸或其盐或酯；甲硫氨酸；组氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；硫辛酸；硫化甲醛钠；五倍子酸或其衍生物；桔酸丙酯；以及该稳定剂中两种或多种的混合。
67.根据权利要求66所述的方法，其中该两个或多个该稳定剂的混合物选自：抗坏血酸或其盐或其酯与尿酸或其盐或其酯的混合物，抗坏血酸或其盐或其酯以及6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物；抗坏血酸或其盐或酯、尿酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物；以及尿酸或其盐或酯的混合物；硫辛酸；硫化甲醛钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物。
68.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂包含二肽甘氨酸-甘氨酸。
69.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂包含地奥司明。
70.根据权利要求2、3、5或6的任何一项所述的方法，其中至少一个该稳定剂包含水飞蓟素。
71.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射为粒子辐射或电磁辐射或其混合物。
72.根据权利要求71的一项所述的方法，其中该电磁辐射选自：无线电波、微电波、可见与不可见光，紫外线，X射线辐射，γ辐射与其组合。
73.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是γ辐射。
74.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是电子束。
75.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是可见光。
76.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是紫外线。
77.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是X射线辐射。
78.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是多色可见光。
79.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是一个或多个波长的可见光与紫外线的组合。
80.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是在环境温度下执行的。
81.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是在一低于该环境温度的温度下执行的。
82.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是在单克隆免疫球蛋白的凝固点以下的温度下执行的。
83.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该辐射是在单克隆免疫球蛋白的共晶点以下的温度下执行的。
84.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于7。
85.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于6。
86.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于5。
87.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于4。
88.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法，其中该单克隆免疫球蛋白制剂的pH值小于3。
89.一种组合物，其包括至少一个单克隆免疫球蛋白以及至少一个选自以下物质的稳定剂：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸；尿酸或其盐或酯；甲硫氨酸；组氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；二肽甘氨酸-甘氨酸；水飞蓟素；硫辛酸；硫化甲醛钠；五倍子酸盐或其衍生物；桔酸丙酯；抗坏血酸或其盐或酯与尿酸或其盐或酯的混合物；抗坏血酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物；抗坏血酸或其盐或酯以及尿酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物，尿酸或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲苯丙二氢吡喃-2-羧酸的混合物，该至少一个稳定剂的剂量能有效保持该单克隆免疫球蛋白使得在用辐射对该组合物进行灭菌后能够将其按目的使用。
90.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一残留溶剂量，其低至足以在用照射对该组合物进行消毒时保持该单克隆免疫球蛋白使得在用辐射对该组合物进行灭菌后能够将其按目的使用。
91.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一低于10％的残留溶剂量。
92.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一低于5％的残留溶剂量。
93.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一低于2％的残留溶剂量。
94.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一低于1％的残留溶剂量。
95.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一低于0.5％的残留溶剂量。
96.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一小于7的pH值。
97，根据权利要求89所述的该组合物，其具有一小于6的pH值。
96.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一小于5的pH值。
97.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一小于4的pH值。
98.根据权利要求89所述的该组合物，其具有一小于3的pH值。
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