CN1615151A - 用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充 - Google Patents

Abstract

本发明涉及质粒介导补充的组合物和方法。该组合物和方法可用于延缓肿瘤生长；延缓恶病质，消瘦，贫血及其它通常与患癌症的动物相关的病症。总的说来，本发明具体可如下实施：将有效量的编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到动物组织中，并使该编码基因在该动物体内表达。例如，当这种核酸序列被递送到个体组织特异性细胞中时，能够获得特定的组成型表达。而且，GHRH或其功能性生物等同物基因的外部调节可通过诱导型启动子而实现，其中所述启动子由施用给该动物的分子开关分子调控。编码GHRH或其功能性生物等同物的组成型或诱导型核酸表达构建体的优选递送方法是通过体内电穿孔方法直接注入动物细胞内。另外，可通过将重组GHRH或其生物等同物直接递送到动物体内而达到延缓肿瘤生长，延缓恶病质或通常与肿瘤相关的消瘦的治疗目的。

Description

用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充

相关申请

[0001]本申请要求号为60/339,610的美国临时专利申请的优先权，其名称为“质粒介导的治疗贫血，消瘦(wasting)，免疫功能障碍以及延长慢性疾病个体生命的疗法”，申请日为2001年11月12日(12/11/2001)，在此将其全文并入作为参考。

发明背景

[0002]本发明涉及用于质粒介导补充的组合物及方法。本发明涉及组合物和方法，用于抑制不正常细胞的生长率，减少肿瘤发展，防止肾衰竭，减少癌转移，提高存活率，以及治疗其它通常与癌症动物相关的病症。本发明的一些实施例可如下完成：将有效量的编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送至个体组织，并使编码基因在该个体体内表达。例如，当这种核酸序列被递送到个体组织的特定细胞中时可以获得特定的组成型表达。另外，可通过诱导型启动子实现GHRH或者其功能性生物等同物基因的外部调控，所述启动子由施用给个体的分子开关分子调控。编码GHRH或其功能性生物等同物序列的组成型或诱导型核酸的优选递送方法是通过体内电穿孔手段直接递送到个体细胞。另外，通过将重组GHRH或其功能性生物等同物递送到个体体内实现抑制肿瘤生长，抑制恶病质或通常与肿瘤相关的消瘦的治疗。贫血，消瘦，肿瘤生长，免疫功能障碍，肾衰竭，癌症，预期寿命缩短，以及其它病症都可能与特定的癌症，肿瘤，疾病或疾病治疗作用相关。本发明涉及质粒介导的补充，用于

1)治疗贫血个体；

2)提高个体体内总红细胞量；

3)降低癌症个体内的肿瘤生长；

4)防止或逆转个体消瘦；

5)逆转个体不正常的体重降低；

6)治疗免疫功能障碍；

7)预防肾衰竭发病；

8)预防癌转移发生和/或发展；

9)逆转个体内的淋巴生成抑制；和/或

10)延长慢性病个体的预期寿命并提高其存活率。

[0003]本发明涉及组合物和方法，用于抑制癌症个体体内不正常细胞的生长率，减少肿瘤发展，防止肾衰竭，减少转移，提高存活率。总之，本发明的实施例可通过将有效量的编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送至个体组织，并使该编码基因在该个体体内表达而完成。例如，当这种核酸序列被递送到个体组织的特定细胞中时得到特定的组成型表达。并且，可通过利用诱导型启动子实现GHRH或者其功能性生物等同物基因的外部调控，所述启动子由施用给个体的分子开关分子调控。编码GHRH或其功能性生物等同物质序列的组成型或诱导型核酸的优选递送方法是通过体内电穿孔手段直接递送到个体细胞。另外，通过将重组GHRH或其功能性生物等同物递送到个体体内而抑制不正常细胞的生长以及肿瘤的生长。贫血，消瘦，肿瘤生长，免疫功能障碍，肾衰竭，癌症，预期寿命缩短，以及其它疾病都可能与特定的癌症，肿瘤，疾病或疾病治疗作用相关。GHRH也可以作为蛋白，通过静脉，皮下或鼻内给药或者利用缓释泵(slow release pump)直接进行递送。

[0004] 贫血：贫血指血流中红血球数目或体积或者血红蛋白总量有所降低，从而导致个体面色苍白，全身无力等症状的疾病。已知哺乳动物中红细胞的产生即为红细胞生成。红细胞生成主要由一种酸性糖蛋白——促红细胞生成素(“EPO”)调控。EPO能够促进生成新的红细胞来替代那些由于衰老过程而丧失的红细胞。另外，在缺氧条件下可以促进EPO的产量，在这种条件下，尽管组织中灌注了足量的血液，但组织的氧气供应量减少，低于正常的生理水平。能够导致缺氧的有：出血，辐射诱导红细胞损伤，各种贫血症，海拔过高，或长期昏迷。受到缺氧压力的组织会产生应答，EPO会促进骨髓中原始前体细胞转换成原成红细胞，随后原成红细胞成熟，合成血红蛋白，并作为血细胞被释放到循环中，从而提高红细胞的产量。

[0005]EPO通常以较低浓度存在于血浆中，其在血浆中足以维持正常血细胞损失(即，由于衰老而导致)与红细胞生成之间的平衡。贫血是由红细胞的产量降低或损失量增加而导致的红细胞量减少。EPO补充目前用于治疗各种疾病相关的贫血，如晚期肾衰竭(Cremagnani等，1993；Diez等，1996)和艾滋病(“AIDS”)(Sowade等，1998)，特别是接受叠氮胸苷(“AZT”)治疗的个体。EPO还可用于改善癌症化疗相关的贫血(Vansteenkiste等，2002)。

[0006]另一组贫血症被称为血红蛋白病，每组都由遗传性球蛋白产量异常引起。血红蛋白病包括许多疾病，可基本分为两种类型。第一种类型是由球蛋白链上的遗传性结构改变而引起，例如镰状细胞贫血症。这些病症可产生异常血红蛋白分子(Papassotiriou等，2000)。第二种血红蛋白病的主要部分是地中海贫血症，是由于一个或多个球蛋白链合成率的遗传性缺陷导致。这导致无效的红细胞生成，溶血作用，以及由于红细胞产量不足而引起的各种程度贫血。相应地，EPO可用于治疗贫血，例如以贫乏性或缺陷性红细胞生产和/或红细胞损伤增加为特征的血红蛋白病(Makis等，2001；Payen等，2001)。

[0007]另外的现有技术已经说明：用重组人生长激素(“GH”)治疗垂体功能性减退的贫血症个体，可以提高其EPO水平(Sohmiya和Kato，2000)，所述垂体功能性减退病症中，尽管用甲状腺和肾上腺皮质激素进行了适当的替换，但血红蛋白(“Hb”)浓度仅维持在11.0g/dl的低水平。在12个月内持续地皮下注射重组人GH，会导致血浆促红细胞生成素(”EPO”)水平增长接近一倍，且伴随Hb浓度提高。当中断施用人GH时，血浆EPO水平和Hb浓度都有所降低。在人GH给药之前和给药过程中，血浆GH和EPO水平之间相关性很高。在人GH给药之前和给药过程中，血浆GH水平和Hb浓度紧密相关。血浆IGF-I水平也与Hb浓度相关，但与血浆EPO水平不相关。

[0008]美国专利US5,846,528(“‘528专利”)和6,274,158(“‘158专利”)指出可通过主动提高促红细胞生成素(“EPO”)水平来治疗贫血症。另外，‘528专利还教导在贫血症的治疗中使用重组腺伴随病毒(“AAV”)病毒粒子将编码EPO的DNA分子递送到肌细胞和组织。‘528专利显示直接体内注射重组AAV病毒粒子到肌肉组织(例如通过肌肉注射)和体外转导肌细胞，随后将该肌细胞导入个体进行治疗。这样，持续高水平表达递送的EPO编码核酸序列，从而自转导的肌细胞体内分泌，进行系统递送。‘158专利教导了皮下、静脉或口服给药重组人EPO作为止血剂来治疗或预防任何器官或身体部位出血，所述出血由良性或恶性病变，外科创伤，无法治愈或难以治疗的损伤，或辐射损伤而引发。

[0009]简言之，贫血症可由特定疾病，环境因素，或疾病治疗的作用引起。正如所讨论的，EPO循环水平可被直接(如注射重组EPO)或间接提高(如注射重组GH)。尽管不期望被理论束缚，相关技术暗示可通过使用能够提高EPO循环水平的方法或组合物成功地治疗贫血症。但是，本领域技术人员公知生物体系是不可测复合体，本领域技术人员不能精确地预测什么方法或组合物能够引发特定生物反应。只有通过不断的实验才能找到治疗贫血症的组合物或方法。

[0010] 消廋：个体的消瘦可以定义为体重至少降低个体最小理想体重的5-10％，其特征在于脂肪组织及肌肉量显著减少，这使得患有进行性疾病(如癌症，AIDS等)的个体特别难以增加体重。消瘦或恶病质是一类经典的临床现象，其能够令人想起病床和“消耗型”病人的典型形象。在希腊语中，它仅仅意味着“恶劣的条件”。在癌症，AIDS，或肺结核，以及其它慢性疾病中会加快骨骼肌的损失(Barber等，1999；Weinroth等，1995)。体重降低是与癌症相关的消瘦的最明显表现(Nelson，2000)。其它临床表现包括厌食，肌肉渐减，和/或脂肪组织减少以及疲劳，这就导致身体机能状况极差(Davis和Dickerson，2000)。由于体重降低，肿瘤组织，和不良的机能状况会导致预后不良，所以消瘦可成为死亡的直接因素。与单纯的饥饿相比，用大量进食来治疗体重降低是不够的。所以体重降低还不能够完全归因于摄入量少，而是基础能量消耗提高的结果。

[0011]消瘦存在于一多半卧床的癌症个体中，代表了慢性病个体治疗中的一个严重问题。尽管不希望被理论束缚，但假定细胞因子的释放和/或活化以及几种肿瘤衍生物质的释放引发了消瘦综合症。相关技术教导已评价许多物质用于治疗消瘦的效果，但只有孕激素物质获得了一般效果(Barber等，1999；Nelson，2001)。相反，重组生长激素(“GH”)，胰岛素样生长因子I(“IGF-I”)和IGF结合蛋白3(“IGFBP-3”)疗法却在治疗癌恶病质中取得了疗效(Bartlett等，1994)。这样，相关技术说明可用能够提高GH，IGF-I或IGFBP-3循环水平的方法或组合物来治疗消瘦。但不幸的是，生物系统的复杂性使得不可能精确预测什么方法或组合物能够引起特定生物反应。所以，只有通过细致的实验，本领域技术人员才能够阐明治疗消瘦的有效物质或方法。

[0012] 癌症和肿瘤生长：在美国和全世界，癌症是导致发病和死亡的首先因素之一。在过去的20年中，癌症的年平均发病率有所提高，在1999年达到了475比100000。由于人口增长和衰老，预期从2000年到2050年，癌症个体的数量会加倍，从130万增长到260万。另外，预测患有癌症的老年人的数量和比例将会急剧增加：从2000年新诊断出患有恶性肿瘤的389,000个75岁及更年老人，到2050年的1,102,000人，癌症人口将增加30％到42％(Edwards等，2002)。由于并发因素如年纪大而厌食，胃肠系统的改变，leptin水平提高作用，特别是男性中，中枢神经系统神经递质的各种变化，老年癌症个体预后不良。约70岁之后体重会下降。这包括脂肪组织和肌肉量的减少。老年人的肌肉量减少称为sarcopenia。疾病导致细胞因子增加，该细胞因子能够产生厌食并导致蛋白消耗。许多导致老年人恶病质的起因是可以治疗的(Morley，2001；Yeh和Schuster，1999)。通过提高癌症个体体内细胞因子及其它病理学改变能够促进肿瘤生长，但校正恶病质，贫血，改进免疫功能和阳性氮平衡能够减少肿瘤生长及其并发症(Demetri，2001；Koo等，2001)。因此，针对多数这些并发症的疗法对于个体而言极为有益。

[0013] 肾衰竭：预测患有肾衰竭和晚期肾病的个体数量给保健提供系统(Hostetter和Listing，2002)带来了极重的负担。为减小这个负担，必须采取措施来改进肾病检测，还要针对那些风险最高的疾病采取预防手段(Crook等，2002)。重要的危险因素包括高血压，糖尿病，肥胖和癌症(Al Suwaidi等，2002；Nampoory等，2002)。血清肌酸酐，蛋白尿和微清蛋白尿(microalbuminuria)作为疾病的检测指标至关重要，但能够推迟或预防肾衰竭的疗法对于个体和医疗系统均具有显著意义(LeBrun等，2002；Sakhuja等，2000)。

[0014] 生长激素(“GH”)以及免疫功能：生长激素的主要功能是控制人类和其它脊椎动物身体的生长，并且已知调节垂体分泌GH的生理相关途径。GH生成途径由一系列相互依赖的基因构成，这些基因的产物是正常生长所必需的。GH途径基因包括：(1)配体，如GH和胰岛素样生长因子-I(“IGF-I”)；(2)转录因子如pit 1的预言者(prophet)，或者prop 1，和pit 1；(3)激动剂和拮抗剂，分别例如生长激素释放激素(“GHRH”)和促生长素抑制素(“SS”)和(4)受体，例如GHRH受体(“GHRH-R”)和GH受体。这些基因在不同的组织和器官中表达，包括下丘脑，垂体，肝脏和骨。有效且受调控的GH途径表达对于优化线性生长，以及体内碳水化合物、蛋白质和脂代谢的动态平衡是必要的。GH的合成以及从垂体前叶的分泌由GHRH刺激，并由促生长素抑制素抑制，这两种激素都是下丘脑激素。GH会提高主要在肝脏以及其它靶器官中的IGF-I的产生。IGF-1和GH反过来会反馈抑制下丘脑和垂体中GHRH和GH的释放。GH既可直接又可间接地引发外周组织的运作，间接的效果主要是通过IGF-I介导。

[0015]免疫功能由IGF-I调节，IGF-I对B细胞发育有两个主要作用：增强(potentiation)和成熟，及作为B细胞增殖辅助因子与白介素-7(“IL-7”)共同发挥作用。这些活性通过使用抗IGF-I抗体，IGF-I反义序列以及使用重组IGF-I进行活性替换而被鉴定。有证据表明巨噬细胞是IGF-I的丰富来源。用重组IGF-I对小鼠的治疗证实了这些观察结果：它可提高小鼠骨髓中前B细胞和成熟B细胞的数目(Jardieu等，1994)。对IGF-I仍保持敏感的成熟B细胞因为免疫球蛋白生产也会被IGF-I体外和体内刺激(Robbins等，1994)。

[0016]在过去的20年中重组蛋白的产生为多种疾病的治疗提供了有效工具。例如，矮个儿童中的GH缺陷，烧伤、败血症和AIDS个体中的合成代谢物质。但是，有报道显示在营养不良和感染中有GH抗性。对转基因动物和经历GH治疗的个体进行的长期研究显示：GH和IGF-I疗法与癌症发展之间不相关。GH替代疗法在临床广泛使用，作用良好，但是该疗法具有几个不利因素：GH必须数月内或通常数年内，每天一次到一周3次经皮下或肌肉给药；胰岛素抗性和受损的葡萄糖耐受性；儿科个体中骨骺生长加速以及闭合(closure)(Blethen和MacGillivray，1997；Blethen和Rundle，1996)。

[0017]相反，关于重组GHRH疗法的报道中则没有副作用。颅外分泌的GHRH，作为成熟肽或截短的分子(如郎格罕氏岛(pancreaticislet)细胞肿瘤及各种局部良性肿瘤中见到的)通常具有生物活性，甚至能够产生肢端肥大症(Esch等，1982；Thomer等，1984)。对GH缺陷儿童或成人施用重组GHRH增加IGF水平，提高GH分泌(这种提高呈GHRH剂量依赖性)，但仍引发对大剂量的重组GHRH产生的反应(Bercu等，1997)。这样，施用GHRH代表着一种更符合生理学的提高亚正常GH和IGF-I水平的替代疗法。

[0018]GH以独特的脉动模式释放，该模式对其生物活性相当重要(Argente等，1996)。GHRH可以促进GH的分泌，而抑生长素(somatostatin)则抑制GH的分泌，两种皆为下丘脑激素(Thorner等，1990)。GH脉动由GHRH的分泌引起，而GHRH的分泌与抑生长素分泌量的减少和消退相关。另外，脉动发生器的机制由GH-负反馈定时调控。GH分泌的内源性节律会随外源性GH给药强加的节律调整。有效且受调节的GH表达和胰岛素样生长因子I(“IGF-I)途径对于优化线性生长，碳水化合物、蛋白质和脂代谢的动态平衡，以及提供阳性氮平衡都非常必要(Murray和Shalet，2000)。许多关于人、绵羊或猪的研究都显示持续注射重组GHRH蛋白能够恢复正常的GH模式，而无需脱敏GHRH受体或耗尽GH供给，因为该系统能够进行反馈调节，而在GH治疗中该反馈调节被消除(Dubreuil等，1990a；Vance，1990；Vance等，1985)。尽管重组GHRH蛋白疗法引发并刺激正常循环GH分泌且没有副作用，但是由于GHRH在体内半衰期很短，必须进行频繁的静脉，皮下或鼻内(剂量需要提高300倍)给药(每天1到3次)。这样，作为一种慢性治疗，施用重组GHRH蛋白并不实用。

[0019]在人(Frohman等，1984)和家畜中，野生型GHRH在循环系统中具有相对较短的半衰期。在血浆中孵育60分钟后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而在类似的条件下孵育该激素的较短形式(1-40)OH，经过60分钟的孵育后，显示只有77％的多肽被降解(Frohman等，1989)。在治疗性核酸载体中引入编码特定蛋白酶抗性的GHRH类似物的cDNA，可以产生在血清中具有更长半衰期，效力更强的分子，并且引起质粒注射动物体内释放更多的GH(Draghia-Akli等，1999，在此，将其引入作为参考)。将对蛋白酶敏感的氨基酸取代的突变延长了GHRH分子的血清半衰期。并且，通过使用超级-活性类似物可以提高GHRH的生物活性，该类似物可以提高其与特异性受体的结合亲合性(Draghia-Akli等，1999)。

[0020]颅外分泌的GHRH，作为经过加工的蛋白种类，GHRH(1-40)羟基或GHRH(1-44)酰胺，甚至作为更短的截短分子，都具有生物活性(Thorner等，1984)。有报道称：血液中提供的低水平GHRH(100pg/ml)可以刺激GH的分泌(Corpas等，1993)。直接质粒DNA基因转移是目前许多新治疗方法的基础，其不需要病毒基因或脂颗粒(Aihara和Miyazaki，1998；Muramatsu等，1998)。骨骼肌是靶组织，因为肌纤维具有很长寿命，并且能够用环状DNA质粒转导，其中该质粒能够在免疫活性宿主中表达几个月或几年(Davis等，1993；Tripathy等，1996)。前期的报道说明，通过可注射的生肌表达载体，人GHRH cDNA可被运送到小鼠体内的肌肉中，在肌肉中该cDNA可短暂地在多于两个星期的时间内促进GH分泌(Draghia-Akli等，1997)。

[0021]已经报道施用新型GHRH类似物蛋白(美国专利5,847,066；5846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5486505；5,137,872；5,084,442；5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512；RE33,699)或者合成的或天然存在的GHRH的肽片段(美国专利4,833,166；4,228,158；4,228,156；4,226,857；4,224,316；4,223,021；4,223,020；4,223,019)以达到提高生长激素释放量目的。还报道了含有下述突变的GHRH类似物(美国专利5,846,936)：位置1 Tyr变为His；位置2 Ala变为Val或其它氨基酸；位置8 Asn变为Gln，Ser或Thr；位置15 Gly变为Ala或Leu；位置27 Met变为Nle或Leu；位置28 Ser变为Asn。GHRH类似物是美国专利申请09/624,268(“‘268专利申请”)的主题，该申请教导了含突变的GHRH类似物的应用，其中所述突变提高引发生长激素释放的能力。另外，该‘268专利申请涉及生长缺陷的治疗，生长性能的改善；促进动物体内生成高于正常生长水平的生长激素；以及通过施用生长激素释放激素类似物提高生长，在此将该申请并入作为参考。

[0022]美国专利5,061,690涉及通过提供给受孕雌性哺乳动物一定有效量的人GHRH或其类似物10-20天，来提高出生体重和乳汁产量。类似物的应用仅在哺乳期持续。但是，提出了复合给药，并未公开关于将生长激素释放激素(或因子)作为DNA分子来施用，例如用质粒介导的治疗技术。

[0023]美国专利5,134,120(“‘120专利”)和5,292,721(“‘721专利”)教导了从妊娠期的最后两个星期内到3星期的哺乳期，人为地提高母猪体内的生长激素，导致新生小猪出生后禁食时具有显著增强的维持乳糖和游离脂肪酸血浆浓度的能力。另外，该120专利和721专利还表明在哺乳期内治疗母猪会导致初乳的乳脂增多并且乳汁产量也有所提高。这些效果对于提高新生小猪的存活力和增加断乳前体重十分重要。但是120专利和721专利都没有提供关于以DNA形式施用生长激素释放激素的教导。

[0024] 基因递送和体内表达：最近，已证明有可能以某种方式将特定基因递送到体细胞组织，以纠正先天性或后天性缺陷和失调(Herzog等，2001；Song等，2001；Vilquin等，2001)。基因基础的药物递送相较于施用重组蛋白具有很多优点。这些优点包括天然蛋白结构的保守性，改进的生物活性，避免了系统毒性，避免了感染和有毒杂质。另外，核酸载体疗法延长了治疗范围内对蛋白的暴露，因为新分泌的蛋白在血液循环中持续地存在。在某些情况下，简易质粒注射后获得的相对较低的表达水平已足够使分泌多肽的生物活性达到生理可接受水平(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等，1996)。

[0025]施用重组蛋白的首要限制是在施用后有限的蛋白利用率。使用可注射DNA质粒载体进行的核酸载体疗法克服了这个缺陷，因为向个体骨骼肌进行的单次注射可允许长时期的生理表达(WO99/05300和WO01/06988)。载体的注射以更近似于天然过程的方式，促进动物体内酶和激素的产生。并且，在体内基因转移的非病毒技术中，直接将质粒DNA注射到肌肉组织中更加简单，低廉且安全。

[0026]在质粒介导的表达系统中，非病毒核酸载体除了包含编码治疗性基因产物的核酸外，还可以包含合成的核酸递送系统。通过这种方式，可以避免使用大多数病毒载体的风险。由于使用“种特异”组份进行核酸递送，非病毒表达载体通常会产生较低的毒性，这样将通常与病毒载体相关的免疫原性风险降到最低。另外，目前还没有在体内将质粒序列整合到宿主细胞的报道，所以这种类型的核酸载体疗法应该既不会活化致癌基因也不会消除肿瘤抑制基因的活性。由于游离基因体系存在于染色体外，质粒具有确定的药代动力学和消除曲线，导致基因在靶组织中进行表达的时间有限。

[0027]为提高质粒DNA到细胞的运输，已通过物理方法做了多种努力，包括电穿孔，声穿孔(sonoporation)和压力。利用电穿孔进行给药涉及电脉冲领域的应用，其可在细胞膜上产生瞬时小孔而不会给细胞带来永久损害。因此可以导入外源分子(Smith和Nordstrom，2000)。通过调整电穿孔体系产生的电脉冲，核酸分子可以通过由该方法在细胞上产生的通道或小孔。美国专利5,704,908描述了用于在个体体腔的选定位置递送分子到达细胞的电穿孔仪。这些脉冲电压注射设备在US5,439,440和5,702,304以及WO96/12520，96/12006，95/19805和97/07826中也有描述。

[0028]最近，使用电穿孔来提高质粒的体内递送获得了令人瞩目的成就。电穿孔已成功地用于在注射质粒后转染肿瘤细胞(Lucas等，2002；Matsubara等，2001)或者在人体内递送抗肿瘤药物博莱霉素到皮肤或皮下肿瘤(Geh1等，1998；Heller等，1996)。电穿孔还被广泛应用于在小鼠(Lesbordes等，2002；Lucas等，2001；Vilquin等，2001)，大鼠(Terada等，2001；Yasui等，2001)和狗(Fewell等，2001)体内运输编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。我们使用生长激素释放激素(“GHRH”)进行的前期研究显示用电穿孔进行的质粒治疗颇具潜力并且提出了一种前景看好的方法来诱导大动物和人类体内产生蛋白及调控其分泌(Draghia-Akli等，1999；Draghia-Akli等，2002)。

[0029]如上所述，电穿孔提高骨骼肌摄取质粒的能力已被完全证实。另外，已观察到用聚-L-谷氨酸盐(“PLG”)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)配制的质粒能提高质粒转染率并由此表达目的转基因。阴离子聚合物PLG钠能够增强低质粒浓度下质粒的摄入，同时减少该方法可能带来的任何组织损伤。如前所述，电穿孔提高骨骼肌摄取质粒的能力已被完全证实。PLG是种稳定的化合物，可抵抗相对较高的温度(Dolnik等，1993)。以前PLG用于提高疫苗制剂稳定性(Matsuo等，1994)而不增加其免疫原性。其还用作后抗原吸入(post-antigeninhalation)或针对臭氧的抗-毒素(Fryer和Jacoby，1993)。另外，用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)制备的质粒能提高质粒转染并由此在小鼠，大鼠和狗骨骼肌中将目的转基因的表达提高10倍(Fewell等，2001；Mumper等，1998)。PLG已经用于提高抗癌药物的稳定性(Li等，2000)并且作为“胶”用以封闭伤口或者在伤口和组织修复过程中防止组织流血(Otani等，1996；Otani等，1998)。

[0030]尽管不希望被理论束缚，但是PLG会在电穿孔过程中增强质粒的转染，不仅是由于稳定了质粒DNA并促进通过细胞膜孔进行的细胞内转运，还由于一种活性机制。例如，细胞上带正电的表面蛋白可以通过蛋白-蛋白相互作用结合带负电的PLG，该PLG与质粒DNA相连。当使用电场时，蛋白的表面翻转方向然后主动将该DNA分子包容于其内，该方法能够显著地提高转染效率。而且，PLG可以预防体内质粒运输相关的肌肉损伤(Draghia-Akli等，2002a)并能够在注射前提高质粒体外稳定性

[0031]可直接注射的DNA质粒载体的应用在过去是被限制的。在简易地直接注射后，肌肉纤维对于DNA摄入效率低，导致相对较低的表达水平(Prentice等，1994；Wells等，1997)。另外，转基因表达的持续时期很短(Wolff等，1990)。以前最成功的临床应用限于疫苗领域(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等，1996)。

[0032]尽管本领域有针对用线性DNA电穿孔真核细胞的参考文献(McNally等，1988；Neumann等，1982)(Toneguzzo等，1988)(Aratani等，1992；Nairn等，1993；Xie和Tsong，1993；Yorifuji和Mikawa，1990)，这些实例说明了对细胞悬浮液，细胞培养物等的转染作用，但在体细胞组织中并不存在转染的细胞。

[0033]美国专利4,956,288涉及制备重组宿主细胞的方法，该宿主细胞含有大量外源DNA的拷贝，该方法是在外源DNA的存在下，电穿孔细胞群，培养细胞，然后破坏这些含有较低外源DNA拷贝数目的细胞。

[0034]美国专利5,874,534(“‘534专利”)和美国专利5,935,934(“‘934专利”)描述了突变的类固醇受体，其应用方法和一种核酸载体疗法的分子开关，将这两篇文献并入本文作为参考。用于在核酸载体疗法中调节表达的分子开关例如Gene Switch^以及在人，动物，转基因动物及植物中利用该分子的方法在‘534专利和‘934专利中描述。该分子开关描述为一种调节核酸载体疗法中异源核酸序列盒表达的方法，其由修饰的类固醇受体构成，该修饰的类固醇受体包含一个天然类固醇受体DNA结合结构域，该结合结构域与修饰的配体结合结构域相连。修饰的结合结构域通常只结合非天然配体，抗-激素或非自然配体。本领域技术人员公知：天然配体并不轻易地结合修饰的配体-结合结构域，所以对核酸盒所含基因的调节和/或表达几乎没有影响。

[0035]总之，对于像贫血，消瘦和免疫功能障碍这类疾病的治疗均不经济且在范围上有所限制。相关技术已显示可以使用重组蛋白技术以有限能力治疗那些不同的疾病，但是这些治疗具有一些显著的缺陷。还教导了对于频繁的注射和传统重组治疗的高消费而言，编码重组蛋白的核酸表达构建体不失为一种可行的解决方法。对于生产比野生型对应物的体内稳定性更好的蛋白而言，向编码的重组蛋白中导入突变位点无疑迈进了一步。不幸的是，在指定重组蛋白中每个氨基酸的改变必须独立地评价，因为相关的技术并没有教导本领域技术人员精确地预测如何在结构(如氨基酸序列)上进行改变将会导致重组蛋白的功能(如提高或降低的稳定性)发生改变。所以，编码表达蛋白的核酸表达构建体的有益效果只有通过直接的实验才能确定。本领域渴望一种扩展疗法，该疗法使用递送到个体体内并在体内稳定表达治疗性蛋白的核酸表达构建体对个体进行治疗。

发明概述

[0036]本发明涉及用于延缓异常细胞生长，减少肿瘤发展，预防肾衰竭，减少癌转移，以及提高癌症动物存活率的组合物和方法。本发明的方法包括用质粒介导的基因补充治疗个体。本方法包括将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织，如肌肉组织。本发明的具体实施例针对各种类型的肿瘤，例如腺瘤；恶瘤；白血病；淋巴瘤；肺肿瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；和实体肿瘤。在个体体内中GHRH或其功能性生物等同物的随后体内表达足够延缓肿瘤生长，防止肾衰竭，并提高癌症动物存活率。还可按下述增强本方法：在选定组织中安置多个电极，然后在插入电极的区域将核酸表达构建体递送到选定的组织中，对选定组织的选定区域内，对选定组织施加细胞转染脉冲，所述选定组织的选定区域是核酸表达构建体被递送的区域。在具体实施例中也使用了电穿孔，直接注射，基因枪，或金颗粒轰击来递送编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体到个体体内。本发明所述的个体包括哺乳动物，例如人，和家畜。

[0037]本发明的组合物包括有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体，其中GHRH或其功能性生物等同物向个体组织中的递送和随后的表达作用足以延缓肿瘤生长并延缓恶病质或通常与肿瘤生长相关的消瘦作用。还描述了本发明核酸表达构建体的具体元件。例如，该构建体含有组织特异性启动子；GHRH或其功能性生物等同物；和操作性连接的3’非翻译区(“3’UTR”)。本发明核酸表达构建体包括一个基本上不含病毒骨架的构建体。还提供了本发明所用的核酸表达构建体的具体实例。编码的GHRH功能性生物等同物包含与GHRH多肽相比具有类似的或改进的生物活性的多肽。本发明应用的由核酸表达构建体编码的GHRH或其功能性生物等同物包含具有下述通用序列的氨基酸结构：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQHQGA-OH

其中通式具有下述特征：X₁是D-或L-异构体酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)；  X₂是D-或L-异构体丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)；  X₃是D-或L-异构体丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)；  X₄是D-或L-异构体蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)；X₅是D-或L-异构体丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)，或以上组合。列出了可用于本发明的GHRH或其功能性生物等同物氨基酸序列的具体实例。在一个具体实施例中，编码的GHRH或其功能性生物等同物在接受核酸表达构建体的个体中促进生长激素(“GH”)分泌。在本发明的具体实施例中，提高组织吸收核酸表达构建体能力的转染-促进多肽包含一个带电荷的多肽，例如聚-L-谷氨酸盐。

[0038]本发明的一个实施方案涉及质粒介导的补充方法用于治疗贫血；提高个体体内总红细胞量；逆转消瘦；逆转异常体重降低；治疗免疫功能障碍；逆转淋巴生成的抑制；或者延长慢性病个体的寿命。这可利用有效量的含有组成型启动子和生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物编码序列的核酸表达构建体来完成。当该核酸序列被递送到个体的特定细胞(如体细胞，干细胞，或生殖细胞)中时，获得GHRH的组织特异性和组成型表达。组成型启动子和GHRH或其功能性生物等同物编码序列的优选递送方法是通过体内电穿孔方法直接递送到个体细胞。电穿孔可涉及外部应用的电极，或当使用针的情况下，当细胞是在个体组织中时，内部应用的电极帮助目的核苷酸序列进入个体细胞。

[0039]本发明的另一实施方案涉及通过利用调节GHRH或其功能性生物等同物表达的能力，进行质粒介导的方法来治疗贫血；消瘦；免疫功能障碍和慢性病个体的寿命。所述调节可如下获得：将第一核酸序列和第二核酸序列递送到个体细胞，然后再将分子开关递送到个体细胞；其中第一核酸序列含有诱导型启动子和生长激素释放激素或其类似物的编码区域(“诱导型-GHRH”)，第二核酸序列具有组成型启动子和无活性调节蛋白的编码区域。通过将分子开关分子(如米非司酮(mifepistone))递送到个体体内，无活性的调节蛋白转变为活性蛋白并在个体体内起始诱导型-GHRH的转录。通过修饰细胞在个体体内GHRH或其功能性生物等同物的外部调控、表达和确保释放，可治疗贫血症，消瘦，免疫功能障碍和提高慢性疾病个体的寿命。可通过体内电穿孔方法将能够对GHRH或其功能性生物等同物类似物进行外部调节的核酸序列直接递送到个体细胞。

[0040]本发明的另一实施方案涉及通过将特定重组GHRH生物等同蛋白导入个体体内的疗法来治疗贫血，消瘦，免疫功能障碍和提高慢性疾病个体的寿命。

附图说明

[0041]以下附图构成本说明书的一部分，从某些方面进一步说明本发明。可以结合这些附图和本说明书具体实施方案的详细描述以便更好地理解本发明。

[0042]图1显示GHRH或其生物等同物的氨基酸序列。

[0043]图2显示接受了不同浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内IGF-I水平上升的百分比。

[0044]图3显示在第0天接受了100mcg/kg而总量不超过1000mcgpSP-HV-GHRH质粒注射的癌症狗体内，在注射后9-27和28-56天IGF-I水平上升的百分比。

[0045]图4显示接受了不同浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体重增加的百分比。

[0046]图5显示用GHRH质粒疗法进行治疗的患有自发性恶性肿瘤的狗体内红细胞数量，以癌症狗作为对照。

[0047]图6显示用GHRH质粒疗法进行治疗的患有自发性恶性肿瘤的狗体内血红蛋白数值，以癌症狗作为对照。

[0048]图7显示用GHRH质粒疗法进行治疗的患有自发性恶性肿瘤的狗体内血球容积水平，以癌症狗作为对照。

[0049]图8显示用GHRH质粒疗法进行治疗的患有自发性恶性肿瘤的狗体内淋巴细胞的百分比，以癌症狗作为对照。

[0050]图9显示依赖米非司酮的GHRH/GeneSwitch系统的示意图。质粒p1633编码GeneSwitch调节蛋白，该蛋白是酵母GAL4 DNA结合结构域(“GAL4”)、截短的人黄体酮受体配体-结合结构域(“hPRLBD”)以及人NF-κB的p65亚基的活化结构域(“p65”)的嵌合蛋白。该蛋白以无活性的单体合成。与米非司酮的结合引发构象变化，该构象变化会导致活化作用和二聚化作用。被活化的同二聚体与诱导型启动子GAL4位点结合并刺激GHRH基因的转录。

[0051]图10显示在左肋腹接受了2X₁0⁶ Lewis肺腺癌细胞的免疫活性C57/B16小鼠体内肿瘤体积的发展。被治疗的动物在肿瘤细胞植入后第1天接受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒，而对照接受了对照β-半乳糖苷酶质粒。GHRH治疗的肿瘤动物中肿瘤发育和进展明显缓慢。

[00521图11显示在左肋腹接受了2X₁0⁶ Lewis肺腺癌细胞的免疫活性C57/B16小鼠存活率。被治疗的动物在肿瘤细胞植入后第1天接受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒，而对照接受了对照β-半乳糖苷酶质粒。GHRH治疗的肿瘤动物的存活率有所提高。

[0053]图12显示在左肋腹接受了2X₁0⁶ Lewis肺腺癌细胞的免疫活性C57/B16小鼠的肾脏大小。被治疗的动物在肿瘤细胞植入后第1天接受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒，而对照接受了对照β-半乳糖苷酶质粒。对照动物的肾脏明显更小，是肾衰竭的迹象。

[0054]图13显示对照动物与GHRH-治疗动物相比其中增加了转移发生相关标记，组织病理学报告显示对照动物中的转移远比接受治疗的动物中多。

[0055]图14显示在接受质粒介导的生长激素释放激素(组成型活性pGHRH或受调节的Gene Switch系统GHRH-IS+/-MFP)治疗的裸鼠中肿瘤生长并没有增加。NCI——人肺腺癌细胞系。在治疗后33天，以组成型活性GHRH治疗的动物与对照相比肿瘤更小(p＜0.02)。其它组与对照相比差异不显著。

[0056]图15显示在注射后56天，狗体内的蛋白代谢。

[0057]图16显示在注射后56天，狗体内的血液值。

[0058]图17显示在注射后56天，狗体内的骨代谢。

[0059]图19显示癌症狗体内的血液值。

[0060]图20显示老年健康狗体内的血液值。

优选实施方案详述

定义

[0061]术语“一个”或“一”在本说明书中可以指一个或多个。当用于权利要求中时，当与“包含”相连使用时，“一个”或“一”表示一个或不止一个。这里所用的“另一个”可以指至少第二个或更多。

[0062]这里所用术语“异常体重降低”指体重至少降低个体最小理想体重的5-10％，个体显现出脂肪组织及肌肉量显著降低的特征。

[0063]这里所用的术语“AIDS治疗”指治疗艾滋病(“AIDS”)，可用任何医学或物理方法，这些方法包括但不限于：抗逆转录病毒剂，核苷类似物，非核苷逆转录酶抑制物(NNRTI)，蛋白酶抑制剂，和/或其它用于提高免疫系统的药物。

[0064]这里所用的术语“类似物”指GHRH的任何突变型，或合成的或天然存在的GHRH多肽片段，例如HV-GHRH(SeqID#1)，TI-GHRH(SeqID#2)，TV-GHRH(SeqID#3)，15/27/28-GHRH(SeqID#4)，(1-44)NH₂(SeqID#5)，或(1-40)OH(SeqID#6)形式，或更短的但不少于(1-29)氨基酸的形式。

[0065]这里所用的术语“贫血症”指血流中红血球数目或体积或者血红蛋白的总量降低，从而导致个体面色苍白，全身无力等症状的疾病。

[0066]这里所用的术语“非病毒治疗”指一组药物，其可分为3种主要类型，包括：核苷类似物药物，蛋白酶抑制剂药物，和非核苷逆转录酶抑制剂药物(NNRTI)。

[0067]这里所用的术语“身体脂肪比例”指身体脂肪质量除以总体重。

[0068]这里所用的术语“癌症治疗”指治疗癌症，可用任何医学或物理方法，这些方法包括但不限于：外科手术，免疫疗法，化学疗法，辐射疗法，过热和/或光力学疗法。

[0069]这里所用的术语“恶病质”指骨骼肌的丧失加快。

[0070]这里所用的术语“盒”指一个或多个转基因表达载体。

[0071]这里所用的术语“细胞-转染脉冲”指力量的传送，该力量可引起载体——例如线性DNA片段——转染到细胞。在一些实施方案中，该力量是来自电力，如在电穿孔中，或者该力量来自血管压力。

[0072]这里所用的术语“慢性病个体”指患有慢性阻塞性肺病，慢性心衰竭，中风，痴呆，臀部骨折后复原，慢性肾衰竭，风湿性关节炎，和老年个体多发性紊乱，且在至少2年时间内，每个月要看医生和/或住院的个体。

[0073]这里所用的术语“编码序列”指DNA序列的任何部分，该DNA序列能够转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成具有特定肽特征的氨基酸序列。

[0074]这里所用的术语“编码序列”指DNA序列的任何部分，该DNA序列能够转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成具有特定肽特征的氨基酸序列。

[0075]这里所用的术语“递送”或“运输”指将材料导入组织，个体，细胞或任何受体的方法，该方法是在有或没有压力的情况下，利用化学或生物方法，注射，混合，电穿孔，声纳穿孔，或其组合。

[0076]这里所用的术语“DNA片段”或“核酸表达构建体”指实质上双链的DNA分子。尽管可用本领域公知的常规分子生物方法产生片段，但是在一些实施例中，该DNA片段或表达构建体是通过对亲代DNA分子进行限制性酶消化而得到。术语“表达载体”，“表达盒”或“表达质粒”在此可以互换使用。尽管亲代分子可以是任何常规分子生物DNA物质，但在一些实施方案中亲代DNA分子是质粒。

[0077]这里所用的术语“供体个体”指动物界的任何物种，其中细胞已被取出并在其体外，在任意长时期内维持可存活状态。

[0078]这里所用的术语“供体-细胞”指任何被取出的细胞，并且其在供体个体体外，在任意长时期内维持可存活状态。

[0079]这里所用的术语“有效量”指施用给人，动物或组织培养物中的足够量的核酸表达构建体或编码蛋白，以生成足够水平的蛋白，RNA，或激素。本领域技术人员公知足够水平的蛋白或RNA依赖于所应用的特定核酸表达构建体。这些水平可根据给药和治疗或接种的类型而不同。

[0080]这里所用的术语“电穿孔”指应用电脉冲将核酸序列递送到细胞的方法。

[0081]这里所用的术语“电脉冲”和“电穿孔”指对组织或细胞施加电流来达到吸收核酸分子到细胞内的目的。本领域技术人员公知这些术语是与术语“脉冲的电场”“脉冲的电流设备”和“脉冲的电压设备”相联系的。本领域技术人员公知电脉冲的量和时间是依赖于组织，大小和受体个体的总健康状况，并且可进一步知道凭经验如何确定这些参数。

[0082]这里所用的术语“编码的GHRH”是生物活性的生长激素释放激素多肽。

[0083]这里所用的术语GHRH“功能性生物等同物”是一种多肽，该多肽氨基酸序列不同于野生型GHRH多肽，并且相较于GHRH多肽，同时具有类似的或改进的生物活性。功能性生物等同物可以天然存在或经人工修饰。本领域技术人员公知这里所用的类似的或改进的生物活性指促进和/或释放生长激素或其它垂体激素。本领域技术人员公知在一些实施方案中，编码的GHRH功能性生物等同物是被改造而含有不同的氨基酸序列并且相较于GHRH多肽同时还具有类似的或改进的生物活性的多肽。本领域公知的操作这种序列的方法包括定点突变。

[0084]这里所用的术语“生长激素释放激素”(”GHRH”)指一种激素，其能够促进或刺激释放生长激素，以及更小范围内其它垂体激素，如促乳激素。

[0085]这里所用的术语“生长激素”(“GH”)指与生长相关，并作为化学信使在靶细胞上行使功能的激素。

[0086]这里所用的术语“GeneSwitch”(Valentis Inc.的注册商标，(Burlingame，CA))指米非司酮-诱导型异源核酸序列编码调节蛋白，GHRH，功能性生物等同物或其组合的技术。这种技术在图1和图9中用示意图表示。本领域技术人员公知米非司酮的替代物抗黄体酮物质是可获得的，包括onapristone，ZK112993，ZK98734和5α-孕烷-3，2-二酮。

[0087]这里所用的术语“生长激素”(“GH”)指与生长相关，并作为化学信使在靶细胞上行使功能的激素。在一个具体实施方案中，该生长激素通过生长激素释放激素的作用而释放。

[0088]这里所用的术语“生长激素释放激素”(”GHRH”)指一种激素，其能够促进或刺激释放生长激素，以及更小范围内其它垂体激素，如促乳激素。

[0089]这里所用的术语“异源核酸序列”指含有不同调节和表达元素的DNA元件。

[0090]这里所用的术语“免疫功能障碍”指个体免疫系统异常的，削弱的，或不完全的功能，如通过免疫特异性标记(如IGF-I水平，或％淋巴细胞)间接或直接侧定的。

[0091]这里所用的术语“免疫疗法”指促进或提高机体免疫系统的治疗，来建造保护性抗体，该抗体可减少医疗病症和/或减少药疗法的需要。

[0092]这里所用的术语“瘦体重”(“LBM”)指动物体中非脂肪组织如肌肉所引起的质量。

[0093]这里所用的术语“慢性病个体的寿命延长”指与未接受治疗的个体相比，接受了治疗的个体的实际预期寿命有所增加。

[0094]这里所用的术语“淋巴生成”指淋巴细胞的产生。

[0095]这里所用的术语“肾衰竭”指肾脏局部缺血性或毒性损伤而导致的肾小球过滤率急性或慢性降低，包括肾小球毛细管通透性降低，肾小球过滤的后部泄漏(back-leak)，管状梗塞，和肾内血管收缩。

[0096]这里所用的术语“修饰的细胞”指来自个体的细胞，该个体的细胞被导入额外的核酸序列。

[0097]这里所用的术语“修饰的供体细胞”指任何含有运输的GHRH编码核酸序列的供体细胞。

[0098]这里所用的术语“分子开关”指被运输到个体中的能够调节基因转录的分子。

[0099]这里所用的术语“核酸表达构建体”指任何类型的含有编码可转录RNA的核酸的遗传性构建体。术语“表达载体”可在此与之互换使用。在具体实施例中，核酸表达构建体包含：启动子；目的核苷酸序列；3’非翻译区域；其中启动子，目的核苷酸序列和3’非翻译区域是操作性连接；并且目的核苷酸序列的体内表达由启动子调节。

[00100]这里所用的术语“操作性连接”指核酸序列中的元件或构建体，其连接是通过可操作的能力而不是物理位置。该元件或构建体能够、或者说其特征在于，完成目的操作。本领域技术人员公知核酸序列中各元件或构建体的操作性连接不一定必须是串联或邻近的顺序。

[0100]这里所用的术语“聚-L-谷氨酸盐”(“PLG”)指生物可降解的L-谷氨酸盐，其适于在电穿孔或无电穿孔情况下在DNA到细胞的转移中用作载体或辅剂。

[0101]这里所用的术语“注射后”指将含有编码GHRH或其功能性生物等同物的异源核酸序列的核酸序列盒导入个体细胞之后，且当修饰的细胞在活有机体内时允许该编码基因表达的时期。

[0102]这里所用的术语“质粒”通常指含有染色体外遗传物质——通常是环状二倍体DNA——的构建体，该DNA能够在染色体外独立复制。质粒或其片段可用作载体。质粒是存在于或可衍生自细菌和其它微生物(较少)的双链DNA分子。但是通常排除线粒体和叶绿体DNA，酵母杀手(yeast killer)或其它情况。

[0103]这里所用的术语“质粒介导的基因补充”指在体内利用核酸表达构建体使个体接受延长的治疗性蛋白疗程的方法。

[0104]这里所用的术语“脉冲电压设备”或“脉冲电压注射设备”指通过对细胞发射定位脉冲，能够导致核酸分子被吸收到有机体细胞的仪器。然后细胞膜变得不稳定，会形成通道或孔。这种类型的常规设备都被校准到可以选择或调整期望脉冲电压振幅以及脉冲电压的时间。脉冲电压设备最基本的意义是能够促进本发明组合物特别是线性DNA片段被递送到有机体细胞。

[0105]这里所用的术语“质粒骨架”指通常含有细菌起始复制位点和细菌抗生素选择基因的DNA序列，该选择基因对于只允许那些用适当质粒转化的细菌的特定生长非常必要。但是，还有一些质粒，称为迷你环，缺少抗生素抗性基因和复制起始位点(Darquet等，1997；Darquet等，1999；Soubrier等，1999)。体内扩增表达质粒DNA(即非病毒表达体系)的应用避免了病毒载体相关的风险。由于应用了“种-特异性”成分进行基因运输，将病毒载体相关的风险最小化，所以非病毒表达体系产物通常具有低毒性。本发明的一个特点是质粒骨架不含有病毒核苷酸序列。

[0106]这里所用的术语“启动子”指能够指导基因转录的DNA序列。启动子可以指导原核或真核基因的转录。启动子可以是“诱导型”，响应诱导物质而起始转录，或者，相反，启动子可以是“组成型”，由此诱导物质并不能调节转录速度。启动子可以组织特异性或组织优选性的方式被调节，这样只在特定组织类型中的操作性连接编码区域的转录中具有活性。

[0107]这里所用的术语“辐射疗法”指对癌症个体进行的辐射治疗，能够损伤癌症细胞中的DNA，其通常导致癌症细胞死亡。

[0108]这里所用的术语“复制元件”包括能够在特定宿主中引起质粒复制的核酸序列。分子生物领域技术人员公知这种复制元件可以包括但不限于：选择性标记基因启动子，核糖体结合位点，选择性基因序列，和复制起始位点。

[0109]这里所用的术语“残余线性质粒骨架”包括在制备线性核酸表达质粒过程的末期所残留的任何质粒骨架片段。

[0110]这里所用的术语“受体个体”指可以导入来自供体者的修饰供体细胞的动物界中任何动物品种。

[0111]这里所用的术语个体“红细胞量”(“RBC-量”)用下述3种测试之一来进行测定：1)血细胞比容：血浆中红细胞的百分比；2)红细胞(“RBC”)计数：血浆中红细胞的数目；和3)血红蛋白：个体红细胞中携氧蛋白的水平。

[0112]这里所用的术语“调节蛋白”指任何可用于调控基因表达的蛋白。

[0113]这里所用的术语“调节蛋白”指对诱导物产生反应从而提高转录率的蛋白。

[0114]这里所用的术语“个体”或“动物”指动物界的任何动物品种。在优选实施方案中，更具体指人和用作宠物(如猫，狗等)、劳力(如马等)、食物(奶牛，鸡，鱼，羊，猪等)的家畜；以及本领域公知的所有其它动物。

[0115]这里所用的术语“组织”指类似细胞以及环绕其周围的细胞间物质的集合。技术人员公知组织是行使特定功能的特征类似细胞集合。在本发明的范围内，该术语组织并不指细胞系，细胞悬浮液或细胞培养物。在一个具体实施方案中，组织在体内被电穿孔。在另一实施方案中，该组织并非植物组织。技术人员公知在体内有四种基本组织：1)上皮2)结缔组织：包括血液、骨和软骨；3)肌肉组织；以及4)神经组织。在一个具体实施方案中，该方法和组合物涉及通过电穿孔将线性DNA转移到肌肉组织。

[0116]这里所用的术语“治疗元件”包括可导致编码基因产物体内表达的核酸序列。分子生物领域技术人员公知治疗元件可以包括但不限于，启动子序列，转基因，多聚腺苷序列，或者3’或5’UTR。

[0117]这里所用的术语“转染”指将核酸导入真核细胞。在一些实施方案中，该细胞不是植物组织或酵母细胞。

[0118]这里所用的术语“载体”指任何能够将核酸递送到细胞或有机体的媒介。包括质粒载体，病毒载体，脂质体，或阳离子脂类。

[0119]这里所用的术语“病毒骨架”指核酸序列，该序列不含有启动子，基因，3’多聚腺苷信号，或未翻译序列，但含有一些元件，该元件包括但不限于点特异性染色体组整合Rep和反向末端重复序列(“ITR”)或tRNA引物逆转录的结合位点，或核苷酸序列成份，该成份被体内插入时，可诱导病毒免疫原性，允许整合，影响组织特异性启动子的特异性和活性，引起转录沉默或给个体带来安全性风险。

[0120]这里所用的术语“血管压力脉冲”指来自大体积液体的压力来促进细胞吸收载体。本领域技术人员公知血管压力脉冲的大小和时间依赖于组织，大小和受体个体的总健康状况，并且可进一步知道凭经验如何确定这些参数。

[0121]这里所用的术语“载体”指含有遗传材料的构建体，该遗传材料被设计成通过将核酸序列运输到靶细胞而指导靶细胞的转化。载体可以含有多个元遗传元件，这些元件在位置上和序列上与其他必要的元件相关，这样，诱导的核酸序列盒可被转录，且如果有必要，在转染细胞中可被翻译。术语“表达载体”指含有信息的DNA质粒，该信息指在异源细胞内产生重组蛋白所必需的所有信息。

[0122]这里所用的术语“消瘦”指体重降低，特点是脂肪组织及肌肉量显著降低，这就使得患有进行性疾病如癌症，AIDS等的个体增加体重十分困难。消瘦可与疾病本身或针对疾病的治疗作用相关，或与这二者都相关。

[0123]本发明一方面涉及用于延缓癌症个体中异常细胞生长，促进减少肿瘤进展的方法。本发明方法包括用质粒介导的基因补充来治疗个体。本发明包括将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织，如肌肉组织中。本发明的具体实施方案是针对各种类型的肿瘤(例如腺瘤；恶瘤；白血病；淋巴瘤；肺肿瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；和实体肿瘤)。在个体体内GHRH或其功能性生物等同物的随后表达足够延缓肿瘤生长，预防肾衰竭，延缓恶病质或通常与肿瘤生长相关的消瘦作用。还可以如下增强本方法：在选定组织中安置多个电极，然后在插入电极的区域将核酸表达构建体递送到选定的组织中，对选定组织的选定区域施加细胞转染脉冲(如电脉冲)，所述选定组织的选定区域是核酸表达构建体被递送到的区域。但是，细胞转染脉冲不一定必须为电脉冲，还可使用血管压力脉冲。在一些具体实施方案中使用电穿孔，直接注射，基因枪，或金颗粒轰击来递送编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体到个体体内。本发明所述的个体包括哺乳动物(例如人，猪，马，母牛，小鼠，大鼠，猴，绵羊，山羊，狗或猫)。

[0124]还描述了本发明核酸表达构建体的具体元件。例如，该构建体含有组织特异性启动子；GHRH或其功能性生物等同物；和操作性连接的3’非翻译区(“3’UTR”)。本发明核酸表达构建体包括一个基本上不含病毒骨架的构建体。在一些具体实施方案中，组织特异性启动子包括肌特异性启动子(如SPc-12(SeqID#7))，且核酸构建体的3’UTR包含人生长激素3’UTR(SeqID#8)，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV-40多聚腺苷酸化信号。本发明核酸表达构建体包括一个基本上不含病毒骨架的构建体。本发明所用的核酸表达构建体的具体实例包括具有SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，和SeqID#14的质粒。编码的GHRH功能性生物等同物包含相较于GHRH多肽而言，具有类似的或改进的生物活性的多肽。本发明应用的由核酸表达构建体编码的GHRH或其功能性生物等同物包含具有下述通用序列的氨基酸结构(SeqID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：X₁是D-或L-异构体酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)；X₂是D-或L-异构体丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)；  X₃是D-或L-异构体丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)；X₄是D-或L-异构体蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)；X₅是D-或L-异构体丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)，或以上组合。用于本发明的GHRH或其功能性生物等同物氨基酸序列的具体实例示于SeqID#2；SeqID#3；SeqID#4；和SeqID#10。在一个具体实施方案中，编码的GHRH或其功能性生物等同物在接受核酸表达构建体的个体中促进生长激素(“GH”)分泌。

[0125]尽管不希望被理论束缚，但是可以用转染-促进多肽来提高组织细胞吸收核酸表达构建体能力。在本发明的具体实施例中，转染-促进多肽包含一个带电荷的多肽，例如聚-L-谷氨酸盐。

[0126]本发明另一方面涉及组合物和方法，用于延缓癌症动物中异常细胞的生长，减少肿瘤发展，防止肾衰竭，降低癌转移，提高存活率。本发明的组合物包括有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体，其中在个体体内GHRH或其功能性生物等同物的递送和随后的表达足够延缓异常细胞的生长，促进减少肿瘤发展的作用，预防肾衰竭，提高癌症动物的存活率。本发明的具体实施方案针对特定类型的癌症和肿瘤(例如腺瘤；恶瘤；白血病；淋巴瘤；肺肿瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；和实体肿瘤)

[0127]GHRH或其功能性生物等同物的随后表达足够延缓异常细胞的生长，促进减少肿瘤发展的作用，预防肾衰竭，提高癌症动物的存活率。还可以如下增强本发明组合物(即核酸表达构建体)的吸收：在选定组织中安置多个电极，然后在插入电极的区域将核酸表达构建体递送到选定的组织中，对选定组织的选定区域施加细胞转染脉冲(如电脉冲)，所述选定组织的选定区域核酸表达构建体被递送到的区域。但是，细胞转染脉冲不一定必须为电脉冲，还可使用血管压力脉冲。在一些具体实施方案中使用电穿孔，直接注射，基因枪，或金颗粒轰击来递送编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体到个体体内。本发明所述的个体包括哺乳动物(例如人，猪，马，母牛，小鼠，大鼠，猴，绵羊，山羊，狗或猫)。

[0128]另外，本发明涉及用质粒介导的补充方法以治疗慢性疾病个体贫血，消瘦，肿瘤生长，免疫功能障碍，肾衰竭和/或延长寿命。贫血指血流中红血球数目、体积或二者都减少，或血红蛋白的总量降低，从而导致面色苍白，全身无力等症状的疾病。个体的消瘦可定义为体重降低，特点是脂肪组织及肌肉量显著降低，这就使得患有进行性疾病(如癌症，AIDS等)的个体增加体重十分困难。贫血，消瘦，肿瘤生长，免疫功能障碍，肾衰竭和预期寿命降低可与特定疾病或疾病的治疗效果相关。更具体地，本发明涉及将编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的异源核酸序列运动到个体细胞中(如体细胞，干细胞，或生殖细胞)，并当修饰的细胞在个体体内时，使编码的GHRH或其功能性生物等同物基因表达。GHRH或其功能性生物等同物的随后表达由组织特异性启动子(如肌肉)，和/或含有修饰配体结合结构域(如分子开关)的调节蛋白进行调控，所述调节蛋白只有当正确修饰的配体(如米非司酮)被外部施用给个体时，才具有活性。修饰细胞在个体体内颅外表达和确保释放GHRH或其功能性生物等同物可治疗慢性疾病个体的贫血症，消瘦，免疫功能障碍和延长寿命。将GHRH或其功能性生物等同物递送到个体细胞的优选方法是电穿孔。

[0129]重组GH替代疗法在临床广泛应用，具有良好效果，但是其用量通常超过生理范围。重组GH的这种高剂量与有害的副作用相关，例如，接受达30％该重组GHRH治疗的个体会显示出更高频率的胰岛素抗性(Blethen，1995；Verhelst等，1997)，或者在儿科个体中的骨骺的生长加速以及闭合现象(Blethen和Rundle，1996)。另外，循环的GH的分子异质性还与生长和动态平衡非常相关，其可导致GH的效力降低，这样该GH刺激催乳激素受体的能力就会降低(Satozawa等，2000；Tsunekawa等，1999；Wada等，1998)。这些不利的副作用是因为这种现象：用重组的外源GH蛋白进行的治疗会提高GH的基础水平并消除GH的天然阵发式脉冲。相反，重组GHRH治疗则未见有副作用的报道。在垂体门静脉循环中，正常GHRH水平约为150-800pg/ml，而在体循环中该激素的值约为100-500pg/ml。颅外肿瘤所引起的肢端肥大症个体体内具有将近10倍的水平(如50ng/ml免疫反应性GHRH)(Thorner等，1984)。使用重组GHRH治疗儿童和成人的长期研究(1-5年)表明不存在经典的GH副作用，例如禁食性葡萄糖浓度的改变，或在儿科个体中的骨骺的生长加速以及闭合现象或头状股骨骺移位松脱(Chevalier等，2000)(Duck等，1992；Vittone等，1997)。对人，绵羊或猪的大量研究显示，持续地注入重组GHRH蛋白可无需脱敏GHRH受体或耗尽GH供给而成恢复正常的GH模式(Dubreuil等，1990)。由于该系统能够引起一定程度的在GH治疗中被消除的反馈抑制，所以GHRH重组蛋白治疗可能比GH治疗更符合生理学。但是，由于GHRH在体内半衰期很短，必须进行频繁的静脉，皮下或鼻内(剂量需要提高300倍)给药(每天1到3次)(Evans等，1985；Thorner等，1986)。这样，作为一种慢性治疗，施用重组GHRH蛋白并不实用。但是基因转移技术可以克服GHRH应用的这个缺陷。而且，很宽范围内的剂量都可用于治疗。选择GHRH用于基因治疗应用基于以下有利事实：猪和其它物种的基因、cDNA以及天然和几种突变分子已被鉴定(Bohlen等，1983；Guillemin等，1982)，并且疗效的测定简单明确。

[0130]在体内基因转移的非病毒技术中，将质粒DNA直接注射到肌肉组织十分简单、低廉且安全。在简易直接注射后，DNA到肌纤维的低吸收率导致相对较低的表达水平(Prentice等，1994；Wells等，1997)。另外，转基因表达的持续时间很短(Wolff等，1990)。以前最成功的临床应用是在疫苗领域(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等，1996)。最近，利用电穿孔技术获得了提高质粒体内递送以及随后得到生理水平的分泌蛋白的显著进步。最近，使用电穿孔来提高质粒体内递送已取得巨大进步。已经成功地应用电穿孔在注射质粒后转染肿瘤细胞(Lucas等，2002；Matsubara等，2001)或在人体内递送抗肿瘤药物博莱霉素到皮肤和皮下肿瘤(Gehl等，1998；Heller等，1996)。电穿孔还被广泛用于小鼠(Lesbordes等，2002；Lucas等，2001；Vilquin等，2001)，大鼠(Terada等，2001；Yasui等，2001)，和狗(Fewell等，2001)来递送编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。我们使用生长激素释放激素(“GHRH”)进行的前期研究显示用电穿孔进行质粒治疗颇具潜力并且代表诱导蛋白在大动物和人类体内产生并受调节分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等，1999；Draghia-Akli等，2002)。电穿孔还广泛用于啮齿动物和其它小动物(Bettan等，2000；Yin和Tang，2001)。已知电极的构造能够影响电场分布以及随后的结果(Gehl等，1999；Miklavcic等，1998)。预实验显示，对于大动物模型，针式电极比外部卡尺电极更能持续产生重复性好的结果。

[0131]如上所述，电穿孔提高骨骼肌摄取质粒的能力已被完全证实。另外，已观察到用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)配制的质粒在小鼠，大鼠，和狗骨骼肌中提高基因转染及转基因表达提高10倍(Fewell等，2001；Mumper等，1998)。尽管不希望被理论束缚，但是PLG会在电穿孔过程中增强质粒的转染，不仅通过稳定质粒DNA，促进其通过细胞膜上的孔进行细胞内转运，还通过一种活性机制。例如，细胞上带正电的表面蛋白可以通过蛋白-蛋白相互作用结合带负电的PLG，该PLG与质粒DNA相连。当使用电场时，蛋白的表面翻转方向然后主动地将该DNA分子包容于其内，该方法能够显著地提高转染效率。

[0132]这里所述的用质粒介导的补充方法来治疗贫血，消瘦，肿瘤生长，免疫功能障碍，肾衰竭和延长慢性病个体的寿命，与直接注射重组GH或GHRH的限制相比，具有几个优点。血清蛋白酶抗性的新型GHRH功能性生物等同物的表达可由表达质粒来指导，该质粒由合成的肌特异性启动子调节。通过肌肉注射以及体内电穿孔将编码序列递送到个体细胞内之后，这种GHRH或其功能性生物等同物的表达会引发个体体内高水平的GH和IGF-I。尽管体内电穿孔是将异源核酸编码体系递送到个体细胞内的优选方法，但还存在本领域技术人员公知的其它方法(如电穿孔，lipofectamine，磷酸钙，体外转化，直接注射，DEAE葡聚糖，超声处理输入(sonication loading)，受体介导的转染，微弹轰击(microprojectile bombardment)等)。例如，可通过如下步骤直接向个体细胞导入编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸序列：首先从个体或供体者体内取出该细胞，在培养基中维持该细胞，然后通过各种方法(如电穿孔，lipofectamine，磷酸钙，体外转化，直接注射，DEAE葡聚糖，声处理输入(sonication loading)将该核酸编码体系导入，最后将该修饰的细胞再导入原始个体或其它宿主个体(体外方法)。GHRH序列可克隆到腺或腺病毒载体相关载体中，并通过简单的肌肉注射或者静脉或动脉注射来递送。携带GHRH序列的质粒可与阳离子脂类或脂质体复合，然后肌肉内，静脉内或皮下递送。

[0133]这里所用的给药是指将DNA载体或携带体导入体内的路径。给药可以直接递送到靶组织或在系统给药后定向递送到靶组织。特别地，本发明可通过对身体施用载体来进行疾病的治疗，在组织内以用于质粒介导补充的特定水平建立任何特定核酸序列的受控表达。施用载体的优选方法和递送方法的应用如上所述。

[0134]在简单地将DNA颗粒作为溶液，悬浮液或胶体注射到肌肉中后，肌细胞具有独特的从细胞外空间吸收DNA的能力。通过这种方法进行的DNA表达可以维持几个月。应用体内电穿孔进一步提高DNA到肌肉细胞内的吸收。

[0135]制剂的DNA载体的递送涉及将DNA并入大分子复合物，该复合物会经历靶细胞的内吞作用。这种复合物可包括脂类，蛋白，碳水化合物，合成的有机化合物，或无机化合物。这些用载体形成的化合物的特征(大小，电荷，表面特征，组成)决定了该载体在体内的生物利用率。制剂的其它元素作为能够与细胞表面或内部特异性受体反应的配体来发挥作用。合成的其它元素的功能在于促进进入细胞，从内涵体释放以及进入核。

[0136]递送还可以通过应用DNA转运子(transporter)。DNA转运子指可以结合DNA载体并能够被表皮细胞吸收的分子。DNA转运子包含能够非共价地结合到DNA上并有效递送该DNA通过细胞膜的分子复合物。优选该转运子还可以递送DNA通过核膜。例如参见下述申请，将这些申情(包括附图)并入本文作为参考：(1)Woo等，美国专利6,150,168，标题：“DNA转运系统及应用方法；”(2)Woo等，PCT/US93/02725，标题：“核酸转运系统及应用方法”，申请日1993年3月19日；(3)Woo等，美国专利6,177,554“核酸转运系统及应用方法；”(4)Szoka等，美国专利5,955,365，标题“自我组装的多核苷酸递送系统；”和(5)Szoka等，PCT/US93/03406，标题“自我组装的多核苷酸递送系统”，申请日1993年4月5日。

[0137]另一种递送方法涉及DNA转运系统。该DNA转运系统由各微粒构成，这些微粒含有几种独立地且非共价连接到DNA上的元件。每种元件由配体构成，该配体能够识别特定受体或其它功能基团，例如与阳离子基团复合的蛋白，所述阳离子基团能够与DNA结合。可使用的阳离子实例为精胺，精胺衍生物，组蛋白，阳离子肽和/或聚赖氨酸。一个元件既能与DNA载体结合又能与靶细胞上的细胞表面受体结合。这些元件的实例是与脱唾液酸糖蛋白受体，叶酸受体，甘露糖-6-磷酸受体，或肉毒碱受体反应的有机化合物。另一元件既能与DNA载体结合又能与核膜上的受体结合。核配体能够识别并递送转运系统通过核膜。这种配体是例如来自SV40的大T抗原或组蛋白的核靶向序列。第三个元件既能结合DNA载体又能结合诱导游离体溶解的元件。实例包括无活性的病毒颗粒，例如腺病毒，流感病毒血球凝集素相关多肽，或上面引用的Skoka专利中描述的GALA多肽。

[0138]给药还可以涉及脂类。该脂类可形成脂质体，其为中空的球形囊，由单层、双层或多层形式排列的脂质和内部的水性空间构成，该水性空间用于捕获水溶性化合物，例如DNA，所述化合物直径范围0.05到几微米。脂质可无需形成脂质体而应用。具体实例包括应用含有DOPE的阳离子脂质和复合物，该DOPE与DNA和靶细胞膜反应来促进DNA进入细胞。

[0139]基因递送还可以通过移植遗传改造的细胞来完成。例如，可使用称为成肌细胞的未成熟肌细胞将基因递送到肌肉纤维中。被遗传改造以表达重组人生长激素的成肌细胞可以向动物血液中分泌生长激素。被插入基因的分泌可维持3个月以上。

[0140]成肌细胞最终分化并合并到现有的肌肉组织。由于该细胞被并入到已存在的组织，其不仅被耐受而且还被提供营养。成肌细胞可通过从需要补充GHRH的个体中分离肌肉组织而简易获取，遗传改造的细胞还可以被简易地放回原处而不对个体产生任何损伤。类似的，角化细胞可用于向组织中递送基因。大量的角化细胞可通过培养少量活组织而获得。该培养物可被制备成层叠的细胞层，当其被移植到人体，会产生表皮，该表皮在许多年内会继续改善组织型性质。培养该角化细胞时，用适当的载体转染角化细胞，将该角化细胞遗传改造。尽管角化细胞通过分隔表皮和真皮的基膜而从循环中分离，但人角化细胞分泌产生蛋白到循环中。

[0141]递送还可涉及病毒载体的应用。例如，可构建腺病毒载体：用本发明所述载体元件，包括启动子，5’UTR，3’UTR和核酸盒，替换腺病毒基因组的E1区域，并将该重组基因组导入293细胞，该细胞会将该基因包装为有传染性的病毒颗粒。然后来自该细胞的病毒就可用于离体或体内感染组织从而将载体导入组织，致使核酸盒中的基因表达。

[0142]尽管不希望被理论束缚，但相信为提供在人体内应用这些异源核酸序列的可接受的安全系数，调节基因表达体系应该具有低水平的GHRH基本表达，并且仍保持高度的可诱导性。这样，可通过合并分子开关的技术来调节靶基因的表达，该技术如图9的示意图所示并在实施例1进一步讨论。相较于半衰期只有6-12分钟的天然GHRH，HV-GHRH或其功能性生物等同物分子显示出高度血浆稳定性，其半衰期为6小时。这样，通过将强有力的电穿孔DNA递送法和稳定的可调节GHRH或其功能性生物等同物的编码核酸序列相结合，可进行治疗来逆转慢性消瘦，使个体体重增加，并延长个体的预期寿命。

I.载体

[0143]这里所用的术语“载体”指导入细胞的核酸分子载体，该核酸分子中可插入核酸序列，其中，在一些实施方案中，该载体可复制。核酸序列可以是动物自身的，或者可以是“外源的”，这是指该核酸序列对载体被导入的细胞而言是外来的，或该序列与该细胞中的序列同源，但该序列通常未发现存在于宿主细胞核酸中。尽管在一个优选实施方案中，载体基本不含有病毒序列，但载体包括质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)，线性DNA片段，以及人工染色体(如YAC)。本领域技术人员能够通过常规重组技术构建载体(例如参见Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，均并入作为参考)。

[0144]这里所用术语“表达载体”指含有编码可被转录RNA的核酸的任何类型遗传性构建体。有时，RNA分子被翻译成蛋白，多肽或肽。而在另外一些情况下，这些序列并不被翻译，而是例如产生反义分子或核糖酶。表达载体可含有各种“调控序列”，其指操作性连接的编码序列在特定宿主细胞中转录或可能的翻译所必需的核酸序列。除控制转录和翻译的调控序列外，载体和表达载体还可包含下述的起其它作用的核酸序列。

II.质粒载体

[0145]在一些实施方案中，来自质粒载体的线性DNA期望用于转染真核细胞，特别是哺乳动物细胞。含有复制子和来源于宿主细胞相似物种的调控序列的质粒载体通常与这些宿主联合使用。该载体通常带有复制位点，和能够在被转染细胞中产生表型选择的标记序列。在一个非限制性实施例中，通常用pBR322衍生物转化大肠杆菌，该pBR322是来源于大肠杆菌物种的质粒。pBR322含有氨卞青霉素和四环素抗性基因，这样就提供了鉴定转化细胞的简易方法。该pBR质粒，或其他微生物的质粒或噬菌体必须含有，或经过修饰后含有，例如能够被微生物应用的启动子，来表达其自身的蛋白。本领域技术人员公知本领域的任何质粒都可以被修饰而应用于本发明方法。例如，在一个具体实施方案中，用于治疗应用的GHRH载体来自pBlueScript KS+，并且具有卡那霉素抗性基因。

[0146]另外，含有复制子和来源于宿主微生物相似物种的调控序列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主结合使用。例如，λ噬菌体GEM^TM-11可用于制备重组噬菌体载体，该载体可用于转化宿主细胞，例如E.coli LE392。

[0147]更多的有用质粒载体包括pIN载体(Inouye等，1985)；和pGEX载体，产生谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)可溶性融合蛋白用于随后分裂片段的纯化和分离。其它适当的融合蛋白是带有β-半乳糖苷酶、泛素等的那些。

[0148]含有表达载体的细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，可在任何适当的培养基例如，LB中生长。如本领域技术人员公知的，可通过将宿主细胞对特定启动子特异的试剂接触，例如向培养基中加入IPTG，或将培养转换到更高温度而诱导某些载体中重组蛋白进行表达。继续培养细菌一段时间后，通常在2到24小时之间，离心收集细胞，然后清洗去除残留的培养基。

III.启动子和增强子

[0149]启动子是控制基因产物转录起始和转录速度的一段核酸序列。其含有遗传元件，调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其它转录因子)能够与该遗传元件结合，而起始核酸序列的特异性转录。短语“操作性定位”，“操作性连接”，“受控”，和“受转录调控”指启动子相对于一段核酸序列而言，位于正确的功能性位点和/或定位，能够调控该序列的转录起始和/或表达。

[0150]启动子通常含有定位RNA合成起始位点功能的序列。最著名的例子是TATA序列盒，但是在一些缺乏TATA盒的启动子中，例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子，以及SV40晚期基因的启动子，自身覆盖起始位点的不连续的元件能够帮助固定起始位点。额外的启动子元件调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于距起始位点30-110bp的上游区域，尽管许多启动子已显示在起始位点的下游含有功能性元件。为使编码序列处于启动子的“调控下”，这些序列转录阅读框的转录起始位点5’末端应该定位于所选启动子“下游”(即，在所选启动子的3’端方向)。“上游”启动子促进DNA的转录并促进编码的RNA进行表达。

[0151]启动子元件之间的距离常常是可变的，这样，当元件被相对翻转或移动时，仍可保留启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的距离可增加到50bp而启动子的活性未降低。似乎单独的元件可以联合地，也可以独立地活化转录，这要视不同的启动子而定。启动子可以与“增强子”联合使用，也可以不与其联合使用，增强子是指与核酸序列的转录活化相关的顺式作用调控序列。

[0152]启动子可以天然地与核酸序列相连，如通过分离位于编码区域上游的5’非编码序列和/或外显子而可获得。这种启动子可称为“内源的”。类似地，增强子可以天然地与核酸序列相连，位于该序列的上游或下游。或者，有利的做法是定位编码核酸序列使其处于重组的、合成的或异源启动子的调控之下，其中重组的、合成的或异源启动子是指在该启动子的天然环境中，正常情况下不与核酸序列相连的启动子。重组的，合成的或异源增强子也指在其天然环境中正常情况下不与核酸序列相连的增强子。这种启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，以及分离自任何其它病毒，原核或真核细胞的启动子或增强子，以及“天然”不存在的启动子或增强子，即，含有不同转录调控区域的不同元件，和/或改变表达的突变型。例如，最通常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子体系。除合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR^TM，与这里公开的化合物(参见美国专利4,683,202和5,928,906，将这两篇申请并入本文作为参考)结合，来产生序列。而且，可以预期，还可以应用那些指导序列在如线粒体，叶绿体等非核细胞器内转录和/或表达的调控序列。

[0153]显而易见地，使用能有效地指导DNA序列在被选择用于表达的细胞器，细胞类型，组织，器官或有机体中表达的启动子和/或增强子非常重要。分子生物领域技术人员公知启动子，增强子和细胞类型结合用于蛋白表达(例如，参见Sambrook等，1989，并入作为参考)。所用的启动子可以是组成型的，组织特异性的，诱导型的，和/或用于适当条件下指导导入的DNA序列高水平表达的，这对大规模生产重组蛋白和/或多肽非常有利。该启动子可以是异源或同源。

[0154]另外，任何启动子/增强子的组合(例如，按照真核启动子数据库(the Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB，http：//www.epd.isb-sib.ch/)也可用于驱动表达。T3，T7或SP6细胞质表达体系的应用是另一可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶，真核细胞能够支持从特定细菌的启动子进行细胞质转录，作为运送复合物的一部分或者作为额外的遗传表达构建体。

[0155]表1和2列出了可应用于本发明来调节RNA表达的元件/启动子非限制性实例。表2列出了诱导型元件的非限制性实例，该诱导型元件是能够被特定刺激物活化的核酸序列。

表1启动子和/或增强子
		启动于/增强子	相关参考文献
免疫球蛋白重链
		免疫球蛋白轻链
T-细胞受体
		HLA DQ a和/或DQ β
β-干扰素
		白介素-2
白介素-2受体
		II型MHC 5
II型MHC HLA-Dra
		β-肌动蛋白	(Kawamoto等，1988；Kawamoto等，1989)
Muscle Creatine Kinase(MCK)	(Horlick和Benfield，1989；Jaynes等，1988)
		前白蛋白(转甲状腺素)
弹性蛋白酶I
		金属硫因(MTII)	(Inouye等，1994；Narum等，2001；Skroch等，1993)
胶原酶
		白蛋白	(Pinkert等，1987；Tronche等，1989)
α-胎蛋白
		γ-球蛋白
β-球蛋白	(Tronche等，1990；Trudel和Costantini，1987)
		c-fos
c-HA-ras
		胰岛素	(German等，1995；Ohlsson等，1991)
神经细胞粘着分子(NCAM)
		α1-抗胰蛋白酶
H2B(TH2B)组蛋白
		小鼠和/或I型胶原
葡萄糖调节的蛋白(GRP94和GRP78)
		大鼠生长激素	(Larsen等，1986)
人血清淀粉样蛋白A(SAA)
		肌钙蛋白I(TN I)	(Lin等，1991；Yutzey和Konieczny，1992)
血小板衍生生长因子(PDGF)	(Pech等，1989)
		杜兴肌营养不良	(Klamut等，1990；Klamut等，1996)
SV40
		多瘤病毒
逆转录病毒
		乳头瘤病毒
B型肝炎病毒
		人体免疫缺陷病毒
细胞巨化病毒(CMV)	(Boshart等，1985；Dorsch-Hasler等，1985)
		长臂猿白血病病毒
合成肌特异性启动子(c5-12，c1-28)	(Draghia-Akli等，1999；Draghia-Akli等，2002；Li等，1999)

表2元件/诱导物
		元件	诱导物
MT II	佛波纯酯(TFA)重金属
		MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)	糖皮质激素
β-干扰素	聚(rI)x/聚(rc)
		腺病毒5 E2	EIA
胶原酶	佛波醇酯(TPA)
		溶基质素	佛波醇酯(TPA)
SV40	佛波醇酯(TPA)
		鼠MX基因	干扰素，纽卡斯尔疾病病毒(Newcastle DiseaseVirus)
GRP78基因	A23187
		α-2-巨球蛋白	IL-6
波形蛋白	血清
		MHC I型基因H-2κb	干扰素
HSP70	EIA，SV40大T抗原
		多育曲菌素	佛波醇酯-TPA
α肿瘤坏死因子	PMA
		促甲状腺激素α基因	甲状腺激素

[0156]组织特异性启动子或元件的鉴定，以及检定其活性的试验是本领域技术人员公知的。这些序列非限制性地包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)，生长激素抑制素受体2基因(Kraus等，1998)，鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)，人CD4(zhao-Emonet等，1998)，鼠α2(XI)胶原(Liu等，2000；Tsumaki等，1998)，D1A多巴胺受体基因(Lee等，1997)，胰岛素样生长因子II(Dai等，2001；Wu等，1997)，和人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。

[0157]在一个优选的实施例中，采用合成的肌启动子，例如SPc5-12(Li等，1999)，其含有邻近的来自骨骼α-肌动蛋白的血清反应元件(“SRE”)，多元MEF-2位点，MEF-1位点和TEF-1结合位点，并极大地提高了天然生肌启动子的转录潜能。这种合成启动子的唯一性是一个巨大的改进，例如相较于已发表的关于生肌启动子及其应用(如美国专利5,374,544)或核酸序列的成肌表达体系(如美国专利5,298,422)的专利。在一个优选的实施方案中，本发明使用的启动子的生物活性并不会因为内源细胞工具或因子而失去或减少。可根据本发明的该实施方案应用其它元件，包括反式作用因子结合位点和增强子。在另一实施方案中应用了天然生肌启动子，本领域技术人员公知如何从数据库中获取这种启动子序列，所述数据库包括NationalCenter for Biotechnology Information(”NCBI”)GenBank database或者the NCBI PubMed站点。本领域技术人员公知可利用这些数据库来获取与本发明相关的序列或相关文献。

IV.起始信号和内部核糖体结合位点

[0158]为有效翻译编码序列还需要一个特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近的序列。可能需要提供外源翻译调控信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员能够显而易见地确定并提供必要的信号。公知起始密码子必须是与目的编码序列的阅读框“符合读框”来确保整个插入序列的翻译。外源翻译调控信号和起始密码子可以是天然或合成的。表达的效率可通过容纳合适的转录增强子元件而提高。

[0159]在本发明的一些实施方案中，内部核糖体进入位点(“IRES”)元件被用于产生多基因，或多顺反子信使。IRES能够绕过5’甲基化帽子依赖的翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。来自细小核糖核酸病毒科(脊髓灰质炎和脑心肌炎)二个成员的IRES元件已被描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，还有来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可与异源开放阅读框相连。多元开放阅读框可被一起转录，由一个IRES彼此分隔，产生多顺反子信息。通过IRES元件，每个开放阅读框可以接近核糖体进行有效翻译。可使用单独的启动子/增强子转录单一的信息有效表达多基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819，在此将其并入本文作为参考)。

V.多克隆位点[MCS]

[0160]载体可包括MCS，MCS是含有多个限制性酶切位点的核酸序列，其中的限制性酶可与常规重组技术结合用于消化载体(例如，参见(Carbonelli等，1999；Cocea，1997；Levenson等，1998)，并入本文作为参考)。“限制性酶切”指用仅在核酸分子特定位置起作用的酶对核酸分子催化切割。许多限制性酶都可商业获得。本领域技术人员公知这种酶的应用。通常，使用在MCS内部切割的限制性酶使载体呈线状或片段以使外源序列能够连接到载体上。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，其中这两个核酸片段可以是互相连续的也可以不连续。

VI.剪接位点

[0161]多数被转录的真核RNA分子都会经历RNA剪接而从第一转录产物中去除内含子。含有真核基因组序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点来确保蛋白表达所需要的正确的转录加工(参见，例如(Chandler等，1997)，将其并入本文作为参考。)。

VII.终止信号

[0162]本发明的载体或构建体通常包括至少一个终止信号。一个“终止信号”或“终止子”包含一个DNA序列，该DNA序列与RNA聚合酶催化的RNA转录的特定终止子相关。这样，在一些实施方案中，考虑终止RNA转录产物生成的终止信号。为获取目的信息水平，终止子可能有必要存在于体内。

[0163]在真核体系中，终止子序列还可包含能够使新转录产物在特定位点分裂的特定DNA序列，以使得多聚腺苷位点暴露出来。这给一种专门的内源聚合酶传递一种信号，使该酶给转录产物的3’末端加上一个约200个A残基(“多聚A”)的延长序列。用该多聚A尾巴修饰的RNA分子似乎更稳定，且能更有效地翻译。这样，在另一些涉及真核生物的实施例中，优选终止子含有使RNA分裂的信号，更优选终止子信号能促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点元件能够提高信使水平并能最小化从该盒到其它序列的通读。

[0164]期望用于本发明的终止子包括这里描述的任何已知终止子或本领域技术人员公知的终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列如牛生长激素终止子，或病毒终止子序列如SV40终止子。在一些实施方案中，例如由于序列截短，该终止信号可能缺少可转录或可翻译的序列。

VIII.多聚腺苷化信号

[0165]在表达体系特别是真核表达体系中，典型地可以包括一个多聚腺苷化信号来实现适当的转录产物多聚腺苷化。并不认为多聚腺苷化信号的种类对于本发明的成功实施至关重要，可以使用任何这类序列。优选的实施例包括SV40多聚腺苷化信号，骨骼α肌动蛋白3’UTR或人或牛生长激素多聚腺苷化信号，比较方便且已知能够在各种靶细胞中很好的发挥作用。多聚腺苷化可以提高转录产物的稳定性或促进细胞质内的运输。

IX.复制起始位点

[0166]为使载体在宿主细胞内增殖，可以包含一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，其为起始复制的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，也可以使用自主复制序列(“ARS”)。

X.可选择的或可筛选的标记

[0167]在本发明一些实施例中，含有本发明核酸构建体的细胞可以通过将一个标记包含在病毒载体中而进行体外或体内鉴定。这种标记能够赋予细胞可鉴别的改变从而能简易地鉴别出含有表达载体的细胞。通常，可选择标记能够给出可选择的特性物质。阳性选择标记是该标记存在时，可以将其选出的标记，而阴性选择标记是该标记存在时，不能将其选出的标记。阳性选择标记的一个例子是药物抗性标记。

[0168]通常，包含药物选择标记可以帮助克隆和鉴定转化的细胞，例如，能够赋予新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，DHFR，GPT，zeocin和组氨醇抗性的基因都可以用作选择标记。除能在可执行条件下提供转化细胞可区分表型的标记外，还预期其它的标记类型，包括可筛选标记如GFP，其依据是比色分析。或者，可以使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(“tk”)或氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)。本领域技术人员公知如何使用免疫标记，也可以与FACS分析结合。所用的标记并不关键，只要其能够与编码核酸产物的核酸同时表达。其它的可选择标记和可筛选标记是本领域技术人员公知的。

XI.电穿孔

[0169]在本发明的一些实施例中，核酸是通过电穿孔被导入细胞器，细胞，组织或有机体内。电穿孔涉及使细胞悬浮液和DNA接受高电压的放电。在该方法的一些改变中，可应用某些细胞壁降解酶，例如果胶降解酶，使靶受体细胞比未处理的细胞更加容易受到电穿孔转化的作用(美国专利5,384,253，并入本文作为参考)。或者，可通过机械损伤和本领域公知的其它方法而使受体细胞更易受到电穿孔转化的作用。

[0170]使用电穿孔进行的真核细胞转染已获巨大成功。已经用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前-B淋巴细胞(Potter等，1984)，还以该方法用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等，1986)。

[0171]下面的电穿孔现象被认为在所有情况下都相同，但是引起所见效果的精确机制还未阐明。尽管不希望被理论束缚，电穿孔作用的明显表现为：细胞接受电脉冲后，细胞膜瞬间地变为大分子通透性的。存在通过细胞壁的通道，该通道在正常情况下，通过施加双向离子移动，维持约90mV的跨膜电位。

[0172]尽管不希望被理论束缚，电穿孔利用相同的结构，通过迫使高离子流通过这些结构而开启或扩大通道。现有技术中，金属电极被设置成与组织接触，并对其施加预定的电压，所述电压与电极之间的距离成比例。用于电穿孔的方案依据最后得到的电场强度而定，根据公式E＝V/d，其中(“E”)是电场，(“V”)是施加的电压，(“d”)是电极之间的距离。

[0173]现有技术中，设置用于递送药物或大分子到个体细胞的电穿孔工具时，电场强度是一个很重要的值。相应地，通过施加预定电压的脉冲，可以计算多种方案的任何电场强度，所述电压是与电极之间距离成比例。但应注意：可以使用绝缘电极(即，离子流并非必须要产生电场)在组织中产生电场。尽管不希望被理论束缚，但电流是成功电穿孔的必要条件，而不是电场本身。

[0174]在电穿孔中，产生的热量是内部电极阻抗、电流的平方和脉冲时间的乘积。热量是在组织电穿孔过程中产生的，并且可以作为内部电极电流、电压和脉冲时间的乘积而推导出。目前所述用于电穿孔的方案依据最后得到的电场强度E而定义，E值依赖于不确定电流的短电压脉冲。相应地，电阻或组织中产生的热量是无法测定的，这就导致用不同的脉冲电压电穿孔方案得到不同的成功。限制对跨越电极细胞的生热能力可以提高任何指定电穿孔电压脉冲方案的效率。例如，现有技术教导了6针电极矩阵的应用，该6针电极矩阵使用了跨越反向电极对的预定电压脉冲。这种状况在电穿孔过程中，在能够形成一致且交叉的重叠点的区域，导致集中的模式。在电穿孔过程中，过度地加热细胞和组织会杀死细胞，并降低该方案的效率。但是，没有相向对的对称设置的针式电极可以在电穿孔过程中在不能形成一致的电穿孔重叠点的区域，产生分散的模式。

[0175]控制电极之间的电流可以测定细胞的相对供热。这样，任何指定方案随后效率的决定因素是电流，而不是跨越电极的电压。预定的电压不产生预定的电流，并且现有技术并没有提供一种方法来精确地测定电流，这就限制了该技术的应用。这样，将两个电极间在组织中维持的电流控制在一定限度内就可以改变脉冲条件，减少细胞供热，降低细胞死亡率，并相较于预定的电压脉冲，能更有效地将大分子合并到细胞内。

[0176]本发明的一个实施方案通过精确地控制冲击细胞膜上通道的离子流，提供了一种有效地控制递送到内部电极空间细胞的电流量的方法，从而克服了上述问题。施加给组织的精确电流量可以作为电流水平、脉冲强度和被传递的脉冲数目的积而计算。这样，本发明的具体实施方案可通过多元途径，将导致电穿孔的电流传递给一定体积的组织，而不会在任何位点导致过量浓度的累积电流，从而避免了由于过度加热组织而引起的细胞死亡。

[0177]尽管不希望被理论束缚，待生成的电压脉冲的特性由组织的特性、所选组织的大小以及电极之间的距离决定。期望电压脉冲是尽可能均质且具有适当振幅。过量的电场强度会导致细胞裂解，而过低的电场强度会导致电穿孔效率降低。一些电穿孔设备利用电极之间的距离来计算电穿孔地电场强度和预定的电压脉冲。这种对已知电极之间距离的依赖是设计电极的限制因素。因为可设计的电流脉冲控制器决定着两个电极之间一定体积组织的阻抗，所以电极之间的距离对于确定合适的电流脉冲而言，不是至关重要的因素。另外，本领域技术人员在不背离本发明精神和范围情况下，可设想任何数目的适当的对称和非对称的针式电极矩阵。在矩阵中以及目的组织中，每个独立电极的深度可随可比较的结果而变化。另外，大分子的多注射位点可被加入到针式电极矩阵中。

XII.限制性酶

[0178]在本发明的一些实施例中，线性DNA片段通过用限制性酶消化亲代DNA分子而得到。以下提供了限制性酶的实例。

           名称               识别位点

AatII       GACGTC

Acc65 I    GGTACC

Acc I      GTMKAC

Aci I      CCGC

Acl I      AACGTT

Afe I      AGCGCT

Afl II     CTTAAG

Afl III    ACRYGT

Age I      ACCGGT

Ahd I      GACNNNNNGTC

Alu I      AGCT

Alw I      GGATC

AlwN I     CAGNNNCTG

Apa I      GGGCCC

ApaL I     GTGCAC

Apo I      RAATTY

Asc I      GGCGCGCC

Ase I      ATTAAT

Ava I

Ava II

Avr II

Bae I

BamH I

Ban I

Ban II

Bbs I

Bbv I

BbvC I

Bcg I

BciV I

Bcl I

Bfa I

Bgl I

Bgl II

Blp I

Bmr I

Bpm I

BsaA I

BsaB I

BsaH I

Bsa I

BsaJ I

BsaW I

BseR I

Bsg I

BsiE I

BsiHKA I

BsiW I

Bsl I

BsmA I

BsmB I

BsmF I

Bsm I

BsoB I

Bsp1286 I

BspD I

BspE I

BspH I

BspM I

EsrB I

BsrD I

BsrF I

BsrG I

Bsr I

BssH II

BssK I

Bst4C I

BssS I

BstAP I

BstB I

BstE II

BstF5 I

BstN I

BstU I

BstX I

BstY I

BstZ17 I

Bsu36 I

Btg I

Btr I

Cac8 I

Cla I

Dde I

Dpn I

Dpn II

Dra I

Dra III

Drd I

Eae I

Eag I

Ear I

Eci I

EcoN I

EcoO109 I

EcoR I

EcoR V

Fau I

Fnu4H I

Fok I

Fse I

Fsp I

Hae II

Hae III

Hga I

Hha I

Hinc II

Hind III

Hinf I

HinP1 I

Hpa I

Hpa II

Hph I

Kas I

Kpn I

Mbo I

Mbo II

Mfe I

Mlu I

Mly I

Mnl I

Msc I

Mse I

Msl I

MspA1 I

Msp I

Mwo I

Nae I

Nar I

Nci I

Nco I

Nde I

NgoMI V

Nhe I

Nla III

Nla IV

Not I

Nru I

Nsi I

Nsp I

Pac I

PaeR7 I

Pci I

PflF I

PflM I

Ple I

Pme I

Pml I

PpuM I

PshA I

Psi I

PspG I

PspOM I

Pst I

Pvu I

Pvu II

Rsa I

Rsr II

Sac I

Sac II

Sal I

Sap I

Sau3A I

Sau96 I

Sbf I

Sca I

ScrF I

SexA I

SfaN I

Sfc I

Sfi I

Sfo I

SgrA I

Sma I

Sml I

SnaB I

Spe I

Sph I

Ssp I

Stu I

Sty I

Swa I

Taq I

Tfi I

Tli I

Tse I

Tsp45 I

Tsp509 I

TspR I

Tth111 I

Xba I

Xcm I

Xho I

Xma I

Xmn I

[0179]这里所用的术语DNA的“限制性酶切”指只在DNA特定位点起作用的酶催化的DNA分裂。这种酶称为限制性内切酶，每种酶特异性的位点称为限制性位点。这里所用的各种限制性酶都是商业可获得，并且其反应条件，辅助因子，和其它要求按酶供应商的描述使用。通常限制性酶是利用简称命名，简称是由大写字母和命名该特定酶的数字构成，其中大写字母后接代表每种限制性酶最初获取自的微生物的其它字母。通常，在约20μl缓冲液中使用约1μg质粒或DNA片段与约1-2单位酶。特定限制性酶的适当缓冲液和基质数量由制造商指定。通常是在37C孵育1小时，但可以根据供应商的说明而有所改变。孵育后，用苯酚和氯仿抽提去除蛋白或多肽，然后用乙醇沉淀从液体部分收集消化的核酸。用限制性酶消化后，可用细菌碱性磷酸酶水解5’末端的磷酸化，来防止DNA片段的两个限制性酶切分裂的末端“成环”或形成闭合环而阻碍另外的DNA片段在限制性酶切位点插入。除非另有说明，质粒消化后，不进行5’末端脱磷酸化。脱磷酸作用所用的方法和试剂是本领域公知的常规方法和试剂。

实施例

[0180]以下实施例是为说明本发明优选实施例。本领域技术人员应能理解以下这些实施例中公开的技术表示本发明者发明的技术在本发明的实践中作用良好，所以可以认为构成了实践中的优选模式。但是在本发明前提下，本领域技术人员应该理解：在不背离本发明的精神和范围情况下，在公开的具体实施例中可以有许多改变，仍可获得同样或类似的结果。

实施例1

DNA载体的构建和动物个体中的方法

[0181]为治疗贫血；提高总红细胞量；逆转消瘦；逆转异常体重降低；治疗免疫功能障碍；逆转淋巴细胞生成的抑制作用；或者延长慢性病个体的预期寿命，首先应设计几种GHRH表达构建体。大体上，这些质粒载体包含与猪野生型GHRH或类似物相连的肌特异性合成启动子SPc5-12(Li等，1999)。GHRH类似物序列是按方法部分中所述，通过定点突变获得的。将编码GHRH或类似物的核酸序列克隆到pSPc5-12质粒的BamHI/HindIII位点，来产生pSP-GHRH。质粒中包含的其它元件包括如方法部分中所述的生长激素3’非翻译区域和来自pSEAP-2 Basic Vector的SV40 3’UTR。图1显示了构建体所应用的独特核酸分子。

[0182]DNA构建体：含有肌特异性合成启动子SPc5-12(SeqID#7)的质粒载体已在前面描述(Li等，1999)。野生型和通过对GHRH cDNA(SeqID#9)进行定点突变(改变的位点II体外突变体系(Altered SiteII in vitro Mutangenesis System)，Promega，Madison，WI)而产生的突变猪GHRH cDNA，被克隆到pSPc5-12的BamHI/HindIII位点，分别产生pSP-wt GHRH(SeqID#15)，或pSP-HV-GHRH(SeqID#11)。生长激素的3’非翻译区域(“3’UTR”)被克隆到GHRH cDNA的下游。所获的质粒含有突变的GHRH编码序列，所获的氨基酸序列并非天然地存在于哺乳动物中。尽管不希望被理论束缚，对于治疗贫血；提高个体总红细胞量；逆转消瘦；逆转异常体重降低；抑制肿瘤生长；预防肾衰竭；治疗免疫功能障碍；逆转淋巴细胞生成的抑制作用；或者延长慢性病个体的预期寿命的效果通过突变激素的循环水平最终测定。编码不同突变GHRH或其功能性生物等同物的氨基酸序列的不同质粒如下所示：

质粒                 编码的氨基酸序列

wt-GHRH    YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMBRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#10)

HV-GHRH    HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#1)

TI-GHRH    YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#2)

TV-GHRH    YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#3)

15/27/28-GHRH     YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#4)

[0183]通常，编码的GHRH或其功能性生物等同物如下式所示：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH(SeqID#6)

其中：X₁是选自酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；X₂是D-或L-异构体氨基酸，该氨基酸选自：丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)；  X₃是D-或L-异构体氨基酸，该氨基酸选自：丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)；X₄是D-或L-异构体氨基酸，该氨基酸选自：蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)；X₅是D-或L-异构体氨基酸，该氨基酸选自丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)。

[0184]使用的另一质粒包括pSP-SEAP构建体(SeqID#16)，其含有SacI/HindIII SPc5-12片段，SEAP基因和来自pSEAP-2 BasicVector的SV40 3’UTR(Clontech Laboratories，Inc.；Palo Alto，CA)。

[0185]上面描述的质粒 并不含有多位点接头，IGF-I基因，骨骼α肌动蛋白启动子或骨骼α肌动蛋白3’UTR/NCR。而且，这些质粒如下面所述通过肌肉注射被导入，然后在体内电穿孔。

[0186]至于“功能性生物等同物”，本领域技术人员公知，“功能性生物等同物”蛋白和/或多核苷酸的定义中固有的概念是：在维持分子具有可接受水平的同等生物活性情况下，在分子的规定部分可进行的改变是有(或密码子)限的。这样功能性生物等同物在此就定义为在所选氨基酸位可被替换的那些蛋白(和多肽)。含有GHRH功能性生物等同物的多肽就是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列，但相较于GHRH，同时具有类似或改善的生物活性的多肽。例如，GHRH的一个生物活性是促进个体体内分泌生长激素(“GH”)。

[0187]大动物研究：健康狗：将4只狗的组作为对照(2雄2雌)，用pSP-HV-GHRH体系注射3组8只狗的组(4雄4雌)。在卡尺电穿孔之后，仅用载体(对照)，或用200mcg，或600mcg或1000mcgpSP-HV-GHRH注射狗。

[0188]癌症狗：15只患有自发性恶性肿瘤的狗用于GHRH研究。用100mcg/kg到总量不超过1000mcg的pSP-HV-GHRH注射狗。质粒注射后最初三天内，有四只狗死于不相关的前置疾病并发症，或者应所有者的要求被安乐死。我们的研究中包含的条件是在注射后至少14天的存活率(为活化质粒以及使GHRH从骨骼肌中表达)，可以进行第二次抽血。该项研究分析了11只狗。动物是使用化学疗法，或辐射疗法或组合疗法特定治疗的(参见图1 )。在治疗前和注射后9-27及28-56天对动物称重，抽血。每一时间点都用相同的独立实验室(AntechDiagnostics，Irvine，CA)来评估完全CBC和代谢情况。每一次访问都由所有者填写健康表格。19只患有自发性恶性肿瘤的未注射狗在诊所中以相同的时间窗口(window)接受治疗，将其用作同时期的对照。接受治疗的动物生活质量有所提高。所有者没有观察到该治疗带来的反作用。3个所有者观察到与注射前的状况相比，接受治疗的狗通常保持良好的状态。

[0189]电穿孔设备：在所有实验中都使用BTX T820发电机(BTX，Genetronics Inc.分公司，CA)递送方形波脉冲。使用100V/cm的电压条件，6次脉冲，60毫秒每次脉冲。使用两针电极(BTX，GenetronicsInc.分公司，CA)传递体内电脉冲。在所有的注射中，针都是完全插入到肌肉中。

[0190]肌肉注射质粒DNA到患病犬中：四组健康受试犬(“狗”)，体重为8-12kg，用于研究生物分解毒理学。3组8只狗的组(4雄4雌)分别用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。持续地监测动物以观察副作用。另外，使用两组患癌症(自发性恶性肿瘤)的狗。根据NIH指南，USDA和AnimalWelfare Act方针养狗，并经Baylor College of Medicine IACUC批准。

[0191]不含内毒素的pSPc5 12-HV-GHRH质粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，USA)制剂在pH7.4的PBS或水中稀释到5mg/ml。在常规治疗之前注射狗。对于化学疗法的狗，在药疗前/后不少于5天时注射。用4-8mg/kg Propafol(Abbott Laboratories)将狗麻醉。麻醉后，使用3/10cc的胰岛素注射器和29G1/2针(Becton-Dickinson，Franklin Lacks，NJ)将100g/kg到最多1mg的质粒直接注射到狗半肌腱中。注射后2分钟，如所述，使用BTX T820电穿孔仪和两针电极(BTX，Genetronics Inc.分公司，CA)对注射的肌肉电穿孔，6次脉冲，100V/cm，60毫秒/脉冲。在所有的注射中，针都是完全插入到肌肉中。在动物与所有者重新在一起之前，使动物复原。

[0192]尽管体内电穿孔是将核酸构建体递送到个体细胞的优选方法，但是仍认为可用于本发明来转化细胞器，细胞，组织或有机体的适当核酸递送方法实际上包括任何能够将核酸(例如DNA)导入细胞器，细胞，组织或有机体的方法，如本文所述或是本领域技术人员公知的。这些方法包括，但不限于，直接递送DNA，例如通过离体转染(Nabel等，1989；Wilson等，1989)，通过注射(美国专利5,994,624，5,981,274，5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5656,610，5,589,466和5,580,859，将每篇并入本文作为参考)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985)(美国专利5,789,215，并入本文作为参考)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，并入本文作为参考)；(Potter等，1984；Tur-Kaspa等，1986)；通过磷酸钙沉淀(Chen和Okayama，1987；Graham和van der Eb，1973；Rippe等，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖然后再使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Hafez等，2001；Hamm等，2002；Madry等，2001；Raghavachari和Fahl，2002；Wiethoff等，2001)和受体介导的转染(Wu和Wu，1988a；Wu和Wu，1988b)；通过微弹轰击(PCT申请WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783 5,563,055，5,550,318，5,538,877和5,538,880，并且每篇都被并入本文作为参考)；通过与碳化硅纤维一起搅动((Johnson等，1992)；美国专利5,302,523和5,464,765，均并入作为参考)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转染(美国专利5,591,616和5,563,055，将每篇并入本文作为参考)；通过PEG介导的原生质体转染(Omirulleh等，1993)；(美国专利4,684,611和4,952,500，将每篇并入本文作为参考)；通过干燥/抑制介导的DNA吸收(Potrykus等，1985)，以及这些方法的任何组合。通过应用这些技术，细胞器，组织或有机体可被稳定地或瞬时地转染。

[0193]体重数据：使用相同的校准标度在质粒注射前和注射后第14，28和56天称重动物。

[0194]蛋白代谢，骨代谢和血液值：在质粒注射前和注射后第14，28和56天收集血液和尿样，并进行生化，代谢和激素分析。每一时间点都用相同的独立实验室(Antech Diagnostics，Irvine，CA)来评估完全CBC和代谢图谱。

[0195]质粒IGF-I：通过不同的人辐射免疫度量试验(radioimmunometric assay)(Diagnostics System Lab.，Webster，TX)测定IGF-I水平。试验的灵敏度为0.8ng/ml；试验内部和试验间的变差分别为3.4％和4.5％。

[0196]统计：用STATISTICA分析插件(StatSoft，Inc.Tulsa，OK)分析数据。图中显示的数据是平均值±s.e.m。使用ANOVA进行对比获得了具体的P值。设置P＜0.05即达到统计显著性水平。

实施例2

低电压电穿孔用于DNA吸收及在受试动物中表达

[0197]直接肌肉内注射质粒DNA然后再电穿孔是局部且受控递送质粒DNA到骨骼肌的方法。其优点是使用较低的质粒数量(低至0.1mg)，而不是被动运输形式典型使用的较高的质粒数量。尽管不希望被理论束缚，但电穿孔引起质粒吸收率提高的机制很可能是在有或没有蛋白主动运输情况下，通过新产生的膜孔发生。已经显示：肌细胞渗透性程度依赖于电场强度，脉冲长度，电极的形状和类型(Bureau等，2000；Gilbert等，1997)，以及细胞大小(Somiari等，2000)。经典的电极结构——板式或电线电极对被设置成相距4mm——已显示对啮齿动物有效，但在大动物如猪或人中，皮肤阻抗增大，皮下脂肪组织加厚，并且如果电场强度按比例增加则关系到组织损伤，使得这些类型的电极不可用。猪或狗的肌纤维很大所以比啮齿动物肌肉更加适用于电通透性研究。这里，我们表明：用肌内给药器单独注射各种剂量的GHRH或核酸序列类似物，然后再电穿孔，足以在大动物中产生治疗性质粒激素水平，对于治疗贫血，逆转消瘦，使个体体重增加，并延长慢性病个体的预期寿命等具有显著生物效果。

[0198]通过体内电穿孔将pSP-HV-GHRH体系注射到左胫前肌(theleft tibialis anterior muscle)中。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)，用pSP-HV-GHRH体系注射3组8只狗的组(4雄4雌)。仅用载体(对照)，或用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射狗，然后电穿孔。GHRH和GH的系统水平有所提高的指标是血清IGF-I浓度提高。所以，在注射后28天，收集仅用载体(对照)，或用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射的狗的血清，测定IGF-I水平。注射了600mcg pSP-HV-GHRHX的狗的IGF-I水平比对照(仅载体)治疗动物高出3倍(图2)。IGF-I水平的提高呈统计学差异显著(p＜0.046)。尽管用200mcg和1000mcg质粒注射的动物比对照IGF-I水平高，但其IGF-I水平低于用600mcg注射的动物。相应于更高GHRH水平的有所增长的IGF-I水平与其它应用重组的猪GH(“pGH”)在狗体内进行的研究相一致。例如，在pGH-治疗的狗中存在剂量相关的IGF-I水平增长(约2-10倍)，这与血清GH水平的提高相关。

[0199]尽管不希望被理论束缚，生长激素释放激素(GHHR)能刺激垂体前叶产生并释放生长激素(GH)，生长激素反过来可以刺激肝脏或其它靶器官产生IGF-I。这样，提高的GHRH和GH系统水平的指标是血清IGF-I浓度的提高。注射后28天，在用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射的健康狗体内血清IGF-I水平都高于注射前的值。注射了600mcg pSP-HV-GHRHX的狗的IGF-I水平具有最高的统计学显著增长(如高于90％，p＜0.046)，这说明600mcg可能是健康狗的最优浓度。

实施例3

提高癌症动物个体的存活

[0200]11只接受注射的癌症狗在注射后至少存活了56天，在所有的病例中收集全部数据。研究中登记的狗都处于其疾病相对严重的阶段(从治疗开始206天)。注射后的平均存活如图18所示。当准备本申请时，这11只狗中的8只仍存活着(注射后平均存活150.6天)。19只对照狗处于疾病的较不严重的阶段，在起始诊断后平均存活56天。相反，登记到本研究后，登记后平均存活162.5天。有5只对照动物在此期间死亡。接受治疗者的生活质量有所提高。所有者没有观察到该治疗带来的反作用。3个所有者观察到与注射前的状况相比，接受治疗的狗一般健康状态的很大提高。

实施例4

提高健康动物个体的体重

[0201]为说明提高的GHRH或其生物等同物水平能够改变大型健康动物体内的代谢，测定体重。如图4所示，与注射后56天的对照相比，接受治疗的狗体重有所增长。尽管用200mcg和1000mcg质粒注射的动物体重大于对照，但低于用600mcg注射的动物。这些结果有力地说明用pSP-HV-GHRH注射的狗体内的代谢有所改变，这种改变是剂量依赖性的。另外，与GHRH产量提高相关的额外体重增加也指示GH的水平有所提高。这个观察与其它应用重组的猪GH(“pGH”)在狗体内进行的研究相一致。在这些研究之一，对狗施用重组pGH 14周。与分别为0.4kg和0.8kg的对照和低剂量组相比，猪GH导致中高剂量组(分别为2.8kg和4.7kg)体重增加。

实施例5

GHRH或生物等同物疗法能够改进健康狗体内的蛋白利用

[0202]图15显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内与蛋白代谢相关的各个数值的变化。在56天内监测指示蛋白代谢的多个值，这些值包括：AST，ALT，T.胆红素(T.bilirubin)，Alk Phos，GGT，总蛋白，清蛋白，球蛋白，A/G比率，胆固醇，BUN和肌氨酸酐。用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗的组(4雄4雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。用200mcg和600mcg质粒注射的动物体内总蛋白水平有所提高。与对照相比，所有接受了注射的组尿素都稍有降低，这是蛋白利用有所改善的信号。

实施例6

GHRH或生物等同物疗法不能影响健康动物体内的葡萄糖代谢

[0203]图16显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内与血液组份相关的各个数值的变化。简写如下：WBC-白细胞；RBC-红细胞；HGB-血红蛋白；PCV-血细胞比容，或包装细胞的体积；MCV-平均细胞体积；MCH-平均细胞血红蛋白；MCHC-平均细胞血红蛋白浓度；n％-嗜中性白细胞的％；lym％-淋巴细胞的％；momo％-单核细胞的％；eos％-嗜曙红细胞的％；Bas％-嗜碱细胞的％；LDH-乳酸脱氢酶；Prothom-凝血酶原(prothrombine)；Qnt-定量；Plat-血小板；BUN-血液尿素氮/尿素。

[0204]在56天内监测血液组份的多个值，包括：WBC，RBC，HGB，PCV，MCB，MCH，MCHC，n％，lym％，mono％，eos％，Bas％，LDH，Prothom，Qnt.Plat。用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗的组(4雄4雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。在实验组和对照组之间没有显著差异。但是，随着质粒剂量的增加循环淋巴细胞有所减少，标志在淋巴器中的淋巴细胞的多价螯合作用。重要的是，葡萄糖水平在所有的实验组以及对照中都处于正常范围，这说明我们的治疗并不损害葡萄糖代谢。

实施例7

GHRH或生物等同物疗法能够影响骨重构(bone remodeling)

[0205]图17显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内与骨代谢相关的各个数值的变化。在注射后56天内监测磷、钙和钙/磷比率。用200mcg，600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗的组(4雄4雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。接受了质粒注射的狗Ca/PO4比率随治疗剂量成比例地提高，即代表着骨重构。

实施例8

GHRH或生物等同物疗法能够延长慢性病个体的预期寿命

[0206]图18显示注射了各种浓度pSP-HV-GHRH质粒的患有自发性恶性肿瘤的狗的诊断、特定治疗图表以及存活。表明了研究项目，组，治疗，剂量，狗的#，癌症类型，和注射后存活天数。向各组患有自发性恶性肿瘤的狗注射100mcg/Kg体重到总量不超过1000mcg的pSP-HV-GHRH。另外，用pSP-HV-GHRH治疗的狗生活质量有所改善。

实施例9

GHRH或生物等同物疗法能够正面影响癌症个体的免疫功能

[0207]图19显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的自发性癌症狗体内与血液组份相关的各个数值的变化。注射后监测血液组份的多个值，包括：WBC/HPF，RBC/HBF，HGB，％PCV，MCV，MCH，MCHC，n％，lym％，mono％，eos％，Bas％。对自发性癌症狗组注射100-1000mcg/Kg体重的pSP-HV-GHRH。发现注射后2周，相较于未接受注射的狗而言，所有接受了pSP-HV-GHRH质粒治疗的狗中RBC血红蛋白和血细胞比容水平都有所提高。另外，接受治疗的狗中，循环白细胞水平(通常与淋巴器官中白细胞(WBC)的增长相关)显著降低，而淋巴细胞百分比却有所提高。接受治疗的动物在注射后早期时间点循环淋巴细胞显著增加(15.11±2.81vs.12.5±2.41％，p＜0.046pst/pri)。在相应时间点也测定对照动物淋巴细胞值(p＝0.32)。

实施例10

GHRH或生物等同物疗法对老年健康狗显示出良好效果

[0208]图20显示用1000mcg pSP-HV-GHRH质粒注射的老年健康狗体内与血液组份相关的各个数值变化。在2周内监测血液组份的多个值，包括：WBC，RBC，HGB，lym％，总蛋白，白蛋白，球蛋白，胆固醇，BUN，肌酸酐，磷，钙，葡萄糖。对老年狗进行pSP-HV-GHRH质粒疗法，在注射后2周RBC血红蛋白和血细胞比容水平都高于注射前的值。另外，接受治疗的狗的尿素水平显著降低，总蛋白水平提高，葡萄糖水平正常。Ca/P比率的提高指示骨重构。

实施例11

贫血症的治疗

[0209]公知红细胞的数目基本上由促红细胞生成素(“EPO”)调节，但是受多种生长因子的影响。例如，垂体切除的大鼠显示出较低的成红细胞的、成脊髓的以及成淋巴细胞的血细胞数目，有大量的文献显示GH和IGF-I都对造血细胞系有作用(Kurtz等，1990；Kurtz等，1982；Claustres等，1987)。在真性红细胞增多症中，患者表现出成红细胞系远祖细胞对IGF-I的灵敏度提高，IGFBP-1水平增强，并由此过量产生红细胞(Mirza等，1997；Correa等，1994)。有证据证明是IGF-I而不是EPO在加速的生长或分解代谢过程中调节红细胞生成，并由此控制体重和氧运输能力成比例增长(Kurtz等，1990)。IGF-I是调节尿毒症个体体内红细胞生成的重要因子(Urena等，1992)。而且，已知重组人GH治疗垂体功能减退的贫血个体的疗效。用人GH治疗后，血浆EPO水平加倍，伴随Hb浓度增长到正常水平。当人GH给药被中断时，血浆FPO和Hb浓度都有所降低。

[0210]在接受注射的狗中，早在质粒注射后2星期，就获得了贫血的快速校正。9-27天红细胞(RBC)增长了8.9％，与注射前(“pri”)的值相比正常的值一直维持到注射后(“pti”)56天(6.27±0.33，对5.75±0.39，p＜0.027)，而对照组在相同时期内RBC水平降低了6％(6.00±0.2对5.5±0.2)(p＜0.006，与注射后对照相比)(图5)。红细胞水平(图6)提高了6.8％(14.68±0.78对13.74±0.97g/lpti/pri)，而对照组在相同时期内降低了5.7％(12.9±0.4对13.7±0.4g/l)，与注射后对照相比p＜0.01。红细胞比容水平(图7)显著提高了8.26％(42.22±2.16对39±2.62，p＜0.032pst/pri)。在相同时期，对照值降低了7.6％(36.9±1.4对39.9±1.6，与pst相比p＜0.012)。

[0211]在对癌症狗的临床前研究中，早在质粒注射后2星期，就获得了贫血的快速校正。在研究初期，个体处于分解代谢状态，其血红蛋白(Hb)，红细胞比容(“PVC”)和红细胞(“RBC”)值都显著低于正常的狗。质粒注射后，狗进入了快速逆转阶段，转变为生化合成代谢，模仿快速生长过程，如同前面所述的对幼龄大鼠在生长阶段进行的研究(“生长激素轴和免疫功能”)。Hb，PVC和RBC值增长了10-25％，数值差异统计上显著，并在治疗开始后两周转为正常。整个实验所有的值都在正常界限内。尽管不希望被理论束缚，我们的理论是GHRH-GH-IGF-I轴在分解代谢状态下的刺激作用很可能是通过刺激促红细胞生成素而促进了红细胞的生成。当个体逆转到正常的合成代谢状态，天然GH的作用是诱导轻微程度的贫血。但是，这些个体患有癌症，而该疾病的天然过程是朝向分解代谢的。通过这些对立的机制来维持个体的平衡，这样，Hb，PVC和RBC值就可校正到正常水平，但是不可能超越正常水平的上限，如同我们研究所展现的。

[0212]靶基因的表达还可通过结合分子开关技术进行调节，该技术如图9所示。用于配体-依赖性转基因表达诱导的商业可获得体系具有已注册的GeneSwitch商标名称。GeneSwitch技术是基于合成的但不能结合其天然激动剂(如黄体酮)的C末端截短的黄体酮受体。该截短的黄体酮受体只能被抗黄体酮物质活化，例如米非司酮(“MFP”)(Vegeto等，1992；Xu等，1996)。类似的体系用于GeneSwitch体系的嵌合调节蛋白，其由截短的人黄体酮受体的配体结合结构域和来自人NF-kB p65亚基的转录活化域(Abruzzese等，1999)构成，其中黄体酮受体的配体结合结构域已经融合了酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域(其结合特定的17bp识别序列)。GeneSwitch调节蛋白的基因被插入到生肌表达载体，命名为pGS1633，其在肌特异性骨骼α-肌动蛋白(“SK”)启动子的控制下组成型表达。GHRH质粒，命名为p6xGal4/TATA-GHRH，或pGHRH1633，含有诱导型启动子，该启动子由融合了最小TATA盒启动子的17-mer Gal4结合位点的6个拷贝构成。GHRH编码序列是超级猪突变GHRH cDNA的228-bp片段，称为HV-GHRH(Draghia-Akli等，1999)。相较于半衰期只有6-12分钟的天然GHRH，该HV-GHRH分子显示出高度血浆稳定性，其半衰期为6小时。该肌特异性GeneSwitch和诱导型GHRH质粒都具有含合成的内含子的5’非翻译区域以及来自人GH基因的3’非翻译区域/聚(A)位点。

实施例12

对正常动物个体施用外源GH的药理学和毒理学作用

[0213]由于猪GH(pGH)与犬GH结构一致，所以使用pGH对狗进行各种研究。在其中一项研究中，对狗施用pGH 14周。与分别为0.4kg和0.8kg的对照和低剂量组相比，猪GH导致中和高剂量组(分别为2.8kg和4.7kg)体重增加。在pGH治疗的狗中，皮肤厚度的增加在组织学上与皮肤胶原的增多密切相关。没有肥大或水肿的组织形态学迹象。在pGH-治疗的狗中存在剂量相关的IGF-I水平增长(约2-10倍)，这与血清GH水平的提高相关。另外，在整个研究中可观察到中剂量组的血清胰岛素水平提高。在高剂量组的狗中，胰岛素水平在注射后24小时持续上升。禁食狗的血清葡萄糖水平维持在对照范围内，没有血红蛋白水平基础上的慢性高血糖症。肾小球的改变，明显的多尿症且伴随尿比重降低，以及血清胰岛素水平升高都说明狗已患有早期胰岛素抗性糖尿病。pGH对狗体内的血清T3，T4和氢化可的松水平有很小或没有生物显著效果。pGH治疗的狗体内其它血清生化改变包括尿素氮和肌氨酸酐降低，和钾、胆固醇和甘油三酯提高。血清钙和磷水平以及碱性磷酸酶活性(骨同功酶)的显著提高与骨的组织学变化相关。在pGH治疗的狗中，存在剂量相关的血色正常性的，正常红细胞性的，非再生性的贫血。以上所述的变化都与高剂量GH的分解代谢作用相关，贫血除外(Prahalada等，1998)

实施例13

质粒介导的GHRH运输减缓肿瘤生长，预防肾衰竭以及提高癌症动物的存活力

[0214]用肿瘤细胞系注射免疫活性的C57/B16小鼠或无免疫应答的裸鼠(C57/B16移植Lewis肺大鼠腺癌细胞系，而裸鼠移植人肺小细胞腺癌细胞系)。肿瘤移植后1天，用组成型活性GHRH构建体或诱导型GHRH构建体治疗小鼠，或用β半乳糖苷酶表达构建体治疗(作为阴性对照)。在GHRH治疗的动物中肿瘤的产生更缓慢(图10和图14)，发展也较慢。由此，GHRH治疗的动物比对照存活更长(图11)，产生肾衰竭的可能更小(图12)。产生转移的可能也较小(图13)。

[0215]这里描述的本发明涉及几种不同的GHRH或其生物等同物核酸序列的应用。基于目前对蛋白-蛋白相互作用的理解，精确地推测含有一个点突变的GHRH序列在体内的参数(如半衰期，疗效，翻译后修饰等)即非显而易见也不可能，其中所述点突变是指多肽链中单一氨基酸有所改变。但是，在现有技术和本说明书的教导基础上，本领域技术人员可以知道在特定组织中如何进行质粒介导补充实验，鉴定变异和任何独特核酸序列的排列以准确评价对正常或慢性疾病个体的体内效果。所以，应用编码GHRH或其功能性生物等同物或相应重组蛋白的不同核酸序列作为质粒介导的方法来治疗贫血；提高总红细胞量；逆转消瘦；逆转异常体重降低；治疗免疫功能障碍；逆转淋巴细胞生成的抑制作用；和/或延长慢性病个体的平均寿命，是不能基于推测而预知的。

[0216]尽管不希望被理论束缚，但相信提高GHRH可以提高GH水平，这个提高的GH水平足以治疗贫血；提高总红细胞量；逆转消瘦；逆转异常体重降低；或延长慢性病个体的预期寿命。激素(如GHRH和GH)通常含有复杂的反馈调节途径。在没有将GHRH或生物等同物应用于质粒介导的补充的直接实验或本发明所提供的教导情况下，本领域技术人员不能预测决定何种浓度的非天然编码序列会产生目的效果。编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸序列的理想调节由于多核苷酸运输所用的组织而进一步复杂化，如果没有用不同序列在特定组织中进行确实的实验，那么对本领域技术人员而言则不是显而易见的。这里所述的本发明含有说明书和必要的实验结果，这些实验研究了编码GHRH或其生物等同物的不同核酸序列的组织特异性和诱导型调节，这在现有技术基础上并非显而易见。本发明大大地向前发展了大动物包括人的非病毒治疗方法。为使基因治疗从啮齿动物转向大哺乳动物，并最终用于人类，令人震惊的是极低数量的质粒就可生效。这里显示在合适电穿孔条件下，递送低至0.2mg的质粒就可在个体中产生重要的生物效果：逆转消瘦；提高体重，延长患病狗的寿命。该质粒数量比理论值低100倍，并且不能从啮齿动物中使用的相关剂量(平均1mg/kg)预测。

[0217]对贫血症，消瘦或免疫功能障碍的治疗；总红细胞量的提高；异常体重降低的逆转；淋巴细胞生成抑制作用的逆转；和/或慢性病个体预期寿命的延长都是个体体内循环中存在的GHRH分子带来的效果，不论递送方式如何。例如，可以通过经典重组蛋白治疗或核酸转移来递送合适量的GHRH或其类似物，而获得相同的效果。因此，成功的质粒介导补充需要精确地将编码序列递送到个体细胞，使基因产物表达达到适于产生生物效果的水平。治疗的过程可延长到贯穿疾病症状的病程，并可持续下去。由于递送核酸序列到个体细胞的方法高度依赖于特定疾病和编码基因，所以本领域技术人员未经本说明书的教导，不能预测何种方法和条件适用。

[0218]本领域技术人员显而易见地意识到：本发明可进行改变，仍然能够实现发明目的，获得这里提及的结果和优点。这里所述的方法，过程，技术和试剂盒是优选实施方式的体现，仅为示范性的，而不是限制本发明的范围。本领域技术人员可在不背离本发明的精神或不超出本发明限定的范围情况下，对其进行一些改变和其它应用。

                   参考文献

下述参考文献提供了实验细节或其它补充细节，特此引用。

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序列表

<110>Advisys

<120>用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充

<130>108328.00073-AVSI-0007

<160>25

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是生长激素释放激素(GHRH)，其以His1和Va12替代了Tyr1和Ala2，以Ala15

     替代Gly15，以及用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。

<400>1

His Val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys val Leu Ala Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>2

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是修饰的生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列。通过将Gly15替换成Ala15

     增加了α-螺旋构象。这是TI-GHRH序列，所以它以Ile代替Ala2，用Ala15

     代替Gly15，并且用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。

<400>2

Tyr Ile Asp Ala Ile Phe Thr Ash Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>3

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是生长激素释放激素，其以Val2替代了Ala2，以Ala15替代Gly15，以及用

     Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。

<400>3

Tyr val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>4

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是猪生长激素释放激素(GHRH)，其以Ala15替代Gly15，以及用Leu27和Asn28

     替代了Met27和Ser28。

<400>4

Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>5

<211>44

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是(1-44)NH2的人工序列

<400>5

Thr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu

        35                  40

<210>6

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是GHRH(1-40)OH的人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>位置1的Xaa可以是Tyr或His。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>位置2的Xaa可以是Ala，Val或Ile。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>位置15的Xaa可以是Ala，Val或Ile。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(27)..(27)

<223>位置27的Xaa可以是Met或Leu。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(28)..(28)

<223>位置28的Xaa可以是Ser或Asp。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(34)..(34)

<223>ARG可以是SER

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(38)..(38)

<223>Gln也可以是Arg

<400>6

Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Xaa Xaa Arg Gln Gln Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>7

<211>323

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是真核启动子c5-12的核酸序列

<400>7

cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg     60

gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta    120

aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga    180

cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg    240

ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga    300

gctacccgga ggagcgggag gcg                                            323

<210>8

<211>190

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是人生长激素(hGH)聚腺苷尾的核酸序列

<400>8

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca     60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc    120

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca    180

acctgtaggg                                                           190

<210>9

<211>219

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是猪生长激素释放激素的cDNA

<400>9

atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc     60

ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggcacgtag atgccatctt caccaacagc    120

taccggaagg tgctggccca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat cctgaacagg    180

cagcagggag agaggaacca agagcaagga gcataatga                           219

<210>10

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>这是猪生长激素释放激素的氨基酸序列

<400>10

Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln

1               5                   10                  15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly

        20                  25                  30

Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala

        35                  40

<210>11

<211>3534

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是操作性连接HV-GHRH质粒的成分的核酸序列

<400>11

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60

accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120

gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180

tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240

aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300

cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg    360

cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420

ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480

ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540

ccctttgacc ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa     600

ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg     660

agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg     720

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag     780

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct     840

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa     900

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc     960

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt    1020

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg    1080

gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt    1140

ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga    1200

ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg    1260

cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca    1320

ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct    1380

tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc    1440

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt    1500

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc    1560

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg    1620

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct    1680

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca    1740

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga    1800

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc    1860

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg    1920

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat    1980

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt    2040

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc    2100

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg    2160

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg    2220

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg    2280

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg    2340

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca    2400

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga    2460

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa    2520

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca    2580

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa    2640

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat    2700

cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct    2760

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc    2820

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca    2880

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca    2940

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa    3000

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct    3060

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc    3120

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt    3180

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt    3240

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc    3300

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag    3360

agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca    3420

actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg    3480

gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac          3534

<210>12

<211>3534

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是操作性连接TI-GHRH质粒的成分的核酸序列

<400>12

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60

accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120

gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180

tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240

aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300

cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg     360

cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa     420

ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct     480

ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc     540

ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa     600

ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg     660

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<210>13

<211>3534

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是操作性连接TV-GHRH质粒的成分的核酸序列

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ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa     600

ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg     660

agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg     720

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag     780

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct     840

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa     900

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc     960

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt    1020

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg    1080

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ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt    1500

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cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca    1740

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cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt    3180

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt    3240

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc    3300

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag    3360

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<210>14

<211>3534

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是操作性连接15/27/28 GHRH质粒的成分的核酸序列

<400>14

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc      60

accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg     120

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ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct     480

ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc     540

ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa     600

ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg     660

agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg     720

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag     780

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct     840

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa     900

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc     960

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt    1020

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg    1080

gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt    1140

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gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca    2400

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga    2460

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gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca    2580

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cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct    2760

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gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca    2940

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa    3000

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct    3060

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc    3120

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt    3180

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt    3240

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc    3300

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag    3360

agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca    3420

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gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac          3534

<210>15

<211>3534

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是野生型GHRH的全部质粒序列

<400>15

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc      60

accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg     120

gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt     180

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aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg     300

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cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa     420

ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct     480

ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc     540

ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgc agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa     600

ggtgctgggc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcatgagca ggcagcaggg     660

agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg     720

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag     780

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct     840

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa     900

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc     960

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt    1020

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg    1080

gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt    1140

ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga    1200

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cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca    1320

ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct    1380

tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc    1440

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt    1500

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc    1560

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg    1620

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct    1680

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca    1740

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga    1800

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc    1860

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg    1920

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat    1980

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt    2040

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc    2100

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg    2160

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg    2220

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg    2280

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg    2340

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca    2400

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga    2460

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa    2520

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca    2580

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa    2640

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat    2700

cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct    2760

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc    2820

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca    2880

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca    2940

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa    3000

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct    3060

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc    3120

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt    3180

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt    3240

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc    3300

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag    3360

agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca    3420

actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg    3480

gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac          3534

<210>16

<211>4260

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是pSP-SEAP cDNA构建体的序列

<400>16

ggccgtccgc cttcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg      60

tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa     120

aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac     180

ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg     240

gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag     300

ctacccggag gagcgggagg cgccaagctc tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga     360

attcgatatc aagcttcgaa tcgcgaattc gcccaccatg ctgctgctgc tgctgctgct     420

gggcctgagg ctacagctct ccctgggcat catcccagtt gaggaggaga acccggactt     480

ctggaaccgc gaggcagccg aggccctggg tgccgccaag aagctgcagc ctgcacagac     540

agccgccaag aacctcatca tcttcctggg cgatgggatg ggggtgtcta cggtgacagc     600

tgccaggatc ctaaaagggc agaagaagga caaactgggg cctgagatac ccctggccat     660

ggaccgcttc ccatatgtgg ctctgtccaa gacatacaat gtagacaaac atgtgccaga     720

cagtggagcc acagccacgg cctacctgtg cggggtcaag ggcaacttcc agaccattgg     780

cttgagtgca gccgcccgct ttaaccagtg caacacgaca cgcggcaacg aggtcatctc     840

cgtgatgaat cgggccaaga aagcagggaa gtcagtggga gtggtaacca ccacacgagt     900

gcagcacgcc tcgccagccg gcacctacgc ccacacggtg aaccgcaact ggtactcgga     960

cgccgacgtg cctgcctcgg cccgccagga ggggtgccag gacatcgcta cgcagctcat    1020

ctccaacatg gacattgacg tgatcctagg tggaggccga aagtacatgt ttcgcatggg    1080

aaccccagac cctgagtacc cagatgacta cagccaaggt gggaccaggc tggacgggaa    1140

gaatctggtg caggaatggc tggcgaagcg ccagggtgcc cggtatgtgt ggaaccgcac    1200

tgagctcatg caggcttccc tggacccgtc tgtgacccat ctcatgggtc tctttgagcc    1260

tggagacatg aaatacgaga tccaccgaga ctccacactg gacccctccc tgatggagat    1320

gacagaggct gccctgcgcc tgctgagcag gaacccccgc ggcttcttcc tcttcgtgga    1380

gggtggtcgc atcgaccatg gtcatcatga aagcagggct taccgggcac tgactgagac    1440

gatcatgttc gacgacgcca ttgagagggc gggccagctc accagcgagg aggacacgct    1500

gagcctcgtc actgccgacc actcccacgt cttctccttc ggaggctacc ccctgcgagg    1560

gagctccatc ttcgggctgg cccctggcaa ggcccgggac aggaaggcct acacggtcct    1620

cctatacgga aacggtccag gctatgtgct caaggacggc gcccggccgg atgttaccga    1680

gagcgagagc gggagccccg agtatcggca gcagtcagca gtgcccctgg acgaagagac    1740

ccacgcaggc gaggacgtgg cggtgttcgc gcgcggcccg caggcgcacc tggttcacgg    1800

cgtgcaggag cagaccttca tagcgcacgt catggccttc gccgcctgcc tggagcccta    1860

caccgcctgc gacctggcgc cccccgccgg caccaccgac gccgcgcacc cgggttactc    1920

tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga    1980

caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt    2040

gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat    2100

tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac    2160

aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt    2220

cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt    2280

tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact    2340

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac    2400

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa    2460

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg    2520

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa    2580

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc    2640

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac    2700

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac    2760

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg    2820

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt    2880

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga    2940

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct    3000

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga    3060

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg    3120

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct    3180

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt    3240

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc    3300

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg    3360

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag    3420

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt    3480

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag    3540

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt    3600

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca    3660

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg    3720

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat    3780

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta    3840

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca    3900

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct    3960

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat    4020

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa    4080

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt    4140

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa    4200

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta    4260

<210>17

<211>2710

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对小鼠的密码

     子优化

<400>17

tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60

cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120

ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180

gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240

tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300

cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360

cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420

agctcaccta gctgccatgg tgctctgggt gctctttgtg atcctcatcc tcaccagcgg     480

cagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcaggatg cagaggcacg tggacgccat     540

cttcaccacc aactacagga agctgctgag ccagctgtac gccaggaagg tgatccagga     600

catcatgaac aagcagggcg agaggatcca ggagcagagg gccaggctga gctgataagc     660

ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc     720

actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag     780

gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg     840

aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc ttttgttccc tttagtgagg     900

gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc     960

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag    1020

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa    1080

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc    1140

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc    1200

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg    1260

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt    1320

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc    1380

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc    1440

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag    1500

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg    1560

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa    1620

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag    1680

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggctagc gcttagaaga actcatccag    1740

cagacggtag aatgcaatac gttgagagtc tggagctgca ataccataca gaaccaggaa    1800

acggtcagcc cattcaccac ccagttcctc tgcaatgtca cgggtagcca gtgcaatgtc    1860

ctggtaacgg tctgcaacac ccagacgacc acagtcaatg aaaccagaga aacgaccatt    1920

ctcaaccatg atgttcggca ggcatgcatc accatgagta actaccaggt cctcaccatc    1980

cggcatacga gctttcagac gtgcaaacag ttcagccggt gccagaccct gatgttcctc    2040

atccaggtca tcctggtcaa ccagacctgc ttccatacgg gtacgagcac gttcaatacg    2100

atgttttgcc tggtggtcaa acggacaggt agctgggtcc agggtgtgca gacgacgcat    2160

tgcatcagcc atgatagaaa ctttctctgc cggagccagg tgagaagaca gcaggtcctg    2220

acccggaact tcacccagca gcagccagtc acgaccagct tcagtaacta catccagaac    2280

tgcagcacac ggaacaccag tggttgccag ccaagacaga cgagctgctt catcctgcag    2340

ttcattcaga gcaccagaca ggtcagtttt aacaaacaga actggacgac cctgtgcaga    2400

cagacggaaa acagctgcat cagagcaacc aatggtctgc tgtgcccagt cataaccaaa    2460

cagacgttca acccaggctg ccggagaacc tgcatgcaga ccatcctgtt caatcatgcg    2520

aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg    2580

cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc    2640

agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga    2700

agggcgatcg                                                           2710

<210>18

<211>2713

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对大鼠的密码

     子优化

<400>18

tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct      60

cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt     120

ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg     180

gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg     240

tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct     300

cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag     360

cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac     420

agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttcttcgtg ctgctgaccc tgaccagcgg     480

aagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcagggtg cgccggcacg ccgacgccat     540

cttcaccagc agctacagga ggatcctggg ccagctgtac gctaggaagc tcctgcacga     600

gatcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag aggagcaggt tcaactgata     660

agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt     720

gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac     780

taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt     840

gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg     900

agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg     960

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat    1020

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta    1080

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa    1140

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc    1200

ccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttcccgaccct gccgcttacc ggatacctgt    1260

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca    1320

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg    1380

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat    1440

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta    1500

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct    1560

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac    1620

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa    1680

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc    1740

cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag    1800

gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat    1860

gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc    1920

attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc    1980

atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc    2040

ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat    2100

acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg    2160

cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc    2220

ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag    2280

aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg    2340

cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc    2400

agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc    2460

aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat    2520

gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct    2580

tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc    2640

cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg    2700

ggaagggcga tcg                                                       2713

<210>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对牛的密码子

     优化

tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct      60

cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt     120

ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg     180

gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg     240

tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct     300

cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag     360

cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac     420

agctcaccta gctgccatgg tgctgtgggt gttcttcctg gtgaccctga ccctgagcag     480

cggctcccac ggctccctgc cctcccagcc tctgcgcatc cctcgctacg ccgacgccat     540

cttcaccaac agctaccgca aggtgctcgg ccagctcagc gcccgcaagc tcctgcagga     600

catcatgaac cggcagcagg gcgagcgcaa ccaggagcag ggagcctgat aagcttatcg     660

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca     720

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc     780

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca     840

acctgtaggg ctcgaggggg ggcccggtac cagcttttgt tccctttagt gagggttaat     900

ttcgagcttg gtcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc     960

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    1020

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    1080

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    1140

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    1200

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    1260

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt    1320

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg    1380

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    1440

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    1500

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc    1560

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    1620

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    1680

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggc tagcgcttag aagaactcat ccagcagacg    1740

gtagaatgca atacgttgag agtctggagc tgcaatacca tacagaacca ggaaacggtc    1800

agcccattca ccacccagtt cctctgcaat gtcacgggta gccagtgcaa tgtcctggta    1860

acggtctgca acacccagac gaccacagtc aatgaaacca gagaaacgac cattctcaac    1920

catgatgttc ggcaggcatg catcaccatg agtaactacc aggtcctcac catccggcat    1980

acgagctttc agacgtgcaa acagttcagc cggtgccaga ccctgatgtt cctcatccag    2040

gtcatcctgg tcaaccagac ctgcttccat acgggtacga gcacgttcaa tacgatgttt    2100

tgcctggtgg tcaaacggac aggtagctgg gtccagggtg tgcagacgac gcattgcatc    2160

agccatgata gaaactttct ctgccggagc caggtgagaa gacagcaggt cctgacccgg    2220

aacttcaccc agcagcagcc agtcacgacc agcttcagta actacatcca gaactgcagc    2280

acacggaaca ccagtggttg ccagccaaga cagacgagct gcttcatcct gcagttcatt    2340

cagagcacca gacaggtcag ttttaacaaa cagaactgga cgaccctgtg cagacagacg    2400

gaaaacagct gcatcagagc aaccaatggt ctgctgtgcc cagtcataac caaacagacg    2460

ttcaacccag gctgccggag aacctgcatg cagaccatcc tgttcaatca tgcgaaacga    2520

tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa    2580

gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg    2640

caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agcaactgtt gggaagggcg    2700

atcg                                                                 2704

<213>人工序列

<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对羊的密码子

     优化

tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60

cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120

ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180

gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240

tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300

cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag     360

cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac     420

agctcaccta gctgccatgg tgctgtgggt gttcttcctg gtgaccctga ccctgagcag     480

cggaagccac ggcagcctgc ccagccagcc cctgaggatc cctaggtacg ccgacgccat     540

cttcaccaac agctacagga agatcctggg ccagctgagc gctaggaagc tcctgcagga     600

catcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag ggcgcctgat aagcttatcg     660

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca     720

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc     780

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca     840

acctgtaggg ctcgaggggg ggcccggtac cagcttttgt tccctttagt gagggttaat     900

ttcgagcttg gtcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc     960

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    1020

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    1080

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    1140

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    1200

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    1260

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt    1320

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg    1380

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    1440

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    1500

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc    1560

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    1620

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    1680

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggc tagcgcttag aagaactcat ccagcagacg    1740

gtagaatgca atacgttgag agtctggagc tgcaatacca tacagaacca ggaaacggtc    1800

agcccattca ccacccagtt cctctgcaat gtcacgggta gccagtgcaa tgtcctggta    1860

acggtctgca acacccagac gaccacagtc aatgaaacca gagaaacgac cattctcaac    1920

catgatgttc ggcaggcatg catcaccatg agtaactacc aggtcctcac catccggcat    1980

acgagctttc agacgtgcaa acagttcagc cggtgccaga ccctgatgtt cctcatccag    2040

gtcatcctgg tcaaccagac ctgcttccat acgggtacga gcacgttcaa tacgatgttt    2100

tgcctggtgg tcaaacggac aggtagctgg gtccagggtg tgcagacgac gcattgcatc    2160

agccatgata gaaactttct ctgccggagc caggtgagaa gacagcaggt cctgacccgg    2220

aacttcaccc agcagcagcc agtcacgacc agcttcagta actacatcca gaactgcagc    2280

acacggaaca ccagtggttg ccagccaaga cagacgagct gcttcatcct gcagttcatt    2340

cagagcacca gacaggtcag ttttaacaaa cagaactgga cgaccctgtg cagacagacg    2400

gaaaacagct gcatcagagc aaccaatggt ctgctgtgcc cagtcataac caaacagacg    2460

ttcaacccag gctgccggag aacctgcatg cagaccatcc tgttcaatca tgcgaaacga    2520

tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa    2580

gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg    2640

caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agcaactgtt gggaagggcg    2700

atcg                                                                 2704

<210>21

<211>2713

<212>DNA

<213>人工序列

<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对鸡的密码子

     优化

<400>21

tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60

cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120

ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180

gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240

tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300

cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360

cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420

agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttctttgtg ctgctgaccc tgacctccgg    480

aagccactgc agcctgccac ccagcccacc cttccgcgtc aggcgccacg ccgacggcat    540

cttcagcaag gcctaccgca agctcctggg ccagctgagc gcacgcaact acctgcacag    600

cctgatggcc aagcgcgtgg gcagcggact gggagacgag gccgagcccc tgagctgata    660

agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt    720

gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac    780

taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt    840

gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg    900

agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg     960

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat    1020

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta    1080

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa    1140

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc    1200

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt    1260

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca    1320

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg    1380

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat    1440

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta    1500

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct    1560

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac    1620

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa    1680

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc    1740

cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag    1800

gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat    1860

gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc    1920

attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc    1980

atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc    2040

ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat    2100

acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg    2160

cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc    2220

ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag    2280

aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg    2340

cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc    2400

agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc    2460

aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat    2520

gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct    2580

tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc    2640

cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg    2700

ggaagggcga tcg                                                   2713

<210>22

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是人生长激素5’非翻译区的核酸序列

<400>22

caaggcccaa ctccccgaac cactcagggt cctgtggaca gctcacctag ctgcc        55

<210>23

<211>782

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是质粒pUC-18复制起点的核酸序列

<400>23

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta     60

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag    120

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg    180

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg    240

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg    300

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga    360

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc    420

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt    480

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact    540

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg    600

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt    660

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt    720

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct    780

tt                                                                   782

<210>24

<211>5

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是NEO核糖体结合位点

<400>24

tcctc                                                                 5

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>这是原核PNEO启动子的核酸序列

<400>25

accttaccag agggcgcccc agctggcaa                                      29

6

3272758v1

Claims (386)

1.治疗个体贫血症的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

2.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

3.权利要求1的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

4.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

5.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

6.权利要求5的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

7.权利要求5的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

8.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体递送到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

9.权利要求8的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是在个体的组织特异性细胞中表达。

10.权利要求9的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

11.权利要求8的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

12.权利要求8的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

13.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

14.权利要求1的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

15.治疗个体贫血症的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

16.权利要求15的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

17.权利要求15的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

18.权利要求15的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

19.权利要求15的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

20.权利要求19的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

21.权利要求19的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

22.权利要求15的方法，其中将第二核酸表达构建体递送到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

23.权利要求22的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

24.权利要求23的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮(mifepristone)或其功能性等同物。

25.权利要求24的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

26.权利要求25的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

27.权利要求25的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

28.权利要求27的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

29.权利要求15的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

30.治疗个体贫血症的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到个体体内。

31.权利要求30的方法，其中重组的GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

32.权利要求30的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

33.权利要求30的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物是含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

34.权利要求30的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

35.提高个体总红细胞量的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

36.权利要求35的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

37.权利要求35的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

38.权利要求35的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

39.权利要求35的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

40.权利要求39的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

41.权利要求39的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

42.权利要求35的方法，其中递送核酸表达构建体到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

43.权利要求42的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在个体的组织特异性细胞中表达。

44.权利要求43的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

45.权利要求42的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

46.权利要求42的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

47.权利要求35的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

48.权利要求35的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

49.提高个体体内总红细胞量的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

50.权利要求49的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

51.权利要求49的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

52.权利要求49的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

53.权利要求49的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

54.权利要求53的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

55.权利要求53的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

56.权利要求49的方法，其中递送第二核酸表达构建体到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

57.权利要求56的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

58.权利要求57的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

59.权利要求58的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

60.权利要求49的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽还具有类似或改进的生物活性的多肽。

61.权利要求49的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

62.权利要求61的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

63.权利要求49的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

64.提高个体体内总红细胞量的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到个体体内。

65.权利要求64的方法，其中重组的GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

66.权利要求64的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

67.权利要求64的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

68.权利要求64的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

69.逆转个体消瘦的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

70.权利要求69的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

71.权利要求69的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

72.权利要求69的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

73.权利要求69的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

74.权利要求73的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

75.权利要求73的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

76.权利要求69的方法，其中递送核酸表达构建体到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

77.权利要求76的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在个体的组织特异性细胞中表达。

78.权利要求77的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

79.权利要求76的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

80.权利要求76的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

81.权利要求69的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

82.权利要求69的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

83.逆转个体消瘦的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

84.权利要求83的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

85.权利要求83的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

86.权利要求83的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

87.权利要求83的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

88.权利要求87的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

89.权利要求87的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

90.权利要求83的方法，其中递送第二核酸表达构建体到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

91.权利要求90的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

92.权利要求91的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

93.权利要求92的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

94.权利要求93的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

95.权利要求93的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID #6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

96.权利要求95的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

97.权利要求83的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

98.逆转个体消瘦的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到个体体内。

99.权利要求98的方法，其中重组GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

100.权利要求98的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

101.权利要求100的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

102.权利要求98的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

103.逆转个体异常体重降低的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

104.权利要求103的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

105.权利要求103的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

106.权利要求103的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

107.权利要求103的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

108.权利要求107的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

109.权利要求107的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

110.权利要求103的方法，其中递送核酸表达构建体到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

111.权利要求107的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在个体的组织特异性细胞中表达。

112.权利要求111的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

113.权利要求107的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

114.权利要求107的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

115.权利要求103的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

116.权利要求103的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

117.逆转个体异常体重降低的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

118.权利要求117的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

119.权利要求117的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

120.权利要求117的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

121.权利要求117的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

122.权利要求121的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

123.权利要求121的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

124.权利要求117的方法，其中递送第二核酸表达构建体到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

125.权利要求124的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

126.权利要求125的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

127.权利要求126的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

128.权利要求127的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

129.权利要求127的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

130.权利要求117的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

131.权利要求117的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

132.提高慢性病个体体重增加的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到慢性病个体体内。

133.权利要求132的方法，其中重组GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

134.权利要求132的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；或其组合。

135.权利要求132的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

136.权利要求132的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进慢性病个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

137.逆转个体淋巴细胞生成抑制的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

138.权利要求137的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

139.权利要求137的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

140.权利要求137的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

141.权利要求137的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

142.权利要求141的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

143.权利要求141的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

144.权利要求137的方法，其中递送核酸表达构建体到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

145.权利要求144的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在个体的组织特异性细胞中表达。

146.权利要求145的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

147.权利要求144的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

148.权利要求144的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

149.权利要求137的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

150.权利要求137的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

151.逆转个体淋巴细胞生成抑制的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

152.权利要求151的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

153.权利要求151的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

154.权利要求151的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

155.权利要求151的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

156.权利要求155的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

157.权利要求155的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

158.权利要求151的方法，其中递送第二核酸表达构建体到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

159.权利要求158的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

160.权利要求159的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

161.权利要求160的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

162.权利要求161的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

163.权利要求161的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

164.权利要求163的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

165.权利要求151的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

166.逆转个体淋巴细胞生成抑制的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到个体体内。

167.权利要求166的方法，其中重组GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽还具有类似或改进的生物活性的多肽。

168.权利要求166的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

169.权利要求166的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

170.权利要求166的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

171.治疗个体免疫功能障碍的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体细胞内。

172.权利要求171的方法，其中核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

173.权利要求171的方法，其中个体细胞是体细胞，或干细胞。

174.权利要求171的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

175.权利要求171的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

176.权利要求175的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

177.权利要求175的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

178.权利要求171的方法，其中递送核酸表达构建体到个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

179.权利要求178的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在个体的组织特异性细胞中表达。

180.权利要求179的方法，其中个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

181.权利要求178的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

182.权利要求178的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物是通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

183.权利要求171的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

184.权利要求171的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

185.治疗个体免疫功能障碍的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

186.权利要求185的方法，其中第一核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

187.权利要求185的方法，其中第二核酸表达构建体进入个体细胞的递送过程包括电穿孔。

188.权利要求185的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

189.权利要求185的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

190.权利要求189的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

191.权利要求189的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

192.权利要求185的方法，其中递送第二核酸表达构建体到个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

193.权利要求192的方法，其中编码的调节蛋白在个体细胞中表达，但无活性。

194.权利要求193的方法，其中递送分子开关到个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

195.权利要求194的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

196.权利要求195的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

197.权利要求195的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

198.权利要求197的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

199.权利要求185的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

200.治疗个体免疫功能障碍的方法，包括：将重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到个体体内。

201.权利要求200的方法，其中重组的GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

202.权利要求200的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

203.权利要求200的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

204.权利要求200的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

205.延长慢性病个体预期寿命的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到慢性病个体细胞内。

206.权利要求205的方法，其中核酸表达构建体到慢性病个体细胞的递送包括电穿孔。

207.权利要求205的方法，其中慢性病个体细胞是体细胞，或干细胞。

208.权利要求205的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

209.权利要求205的方法，其中核酸表达构建体进一步包含一种转染-促进多肽。

210.权利要求209的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

211.权利要求209的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

212.权利要求205的方法，其中递送核酸表达构建体到慢性病个体细胞起始编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

213.权利要求212的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物在慢性病个体的组织特异性细胞中表达。

214.权利要求213的方法，其中慢性病个体的组织特异性细胞包括肌细胞。

215.权利要求212的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

216.权利要求212的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征；

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

217.权利要求205的方法，其中核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

218.权利要求205的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进慢性病个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

219.延长慢性病缓者预期寿命的方法，包括：

(a)将有效量的第一核酸表达构建体和有效量的第二核酸表达构建体递送到个体细胞内；其中第一核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物；且其中第二核酸表达构建体具有调节蛋白的编码区域；以及

(b)将分子开关分子递送到个体体内，其中该分子开关分子控制调节蛋白的活化。

220.权利要求219的方法，其中第一核酸表达构建体到慢性病个体细胞的递送包括电穿孔。

221.权利要求219的方法，其中第二核酸表达构建体到慢性病个体细胞的递送包括电穿孔。

222.权利要求219的方法，其中第一核酸表达构建体编码含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的多肽序列。

223.权利要求219的方法，其中第一核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

224.权利要求223的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

225.权利要求223的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

226.权利要求219的方法，其中递送第二核酸表达构建体到慢性病个体细胞起始编码的调节蛋白表达。

227.权利要求226的方法，其中编码的调节蛋白是在慢性病个体细胞中表达，但无活性。

228.权利要求227的方法，其中递送分子开关到慢性病个体细胞活化调节蛋白，并且该分子开关包含米非司酮或其功能性等同物。

229.权利要求228的方法，其中活性调节蛋白起始第一核酸序列所编码的GHRH或其功能性生物等同物表达。

230.权利要求229的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽，而编码的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

231.权利要求229的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

232.权利要求231的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进慢性病个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

233.权利要求219的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进慢性病个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

234.延长慢性病个体寿命的方法，包括：将重组生长激素释放激素(“GHRH”)或其生物功能性等同物递送到慢性病个体体内。

235.权利要求234的方法，其中重组的GHRH是生物活性多肽，而重组的GHRH功能性生物等同物是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列同时相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

236.权利要求234的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物具有通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

237.权利要求234的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物是含有SeqID#1，SeqID#2，SeqID#3，或SeqID#4的通式。

238.权利要求234的方法，其中重组的GHRH或其功能性生物等同物促进慢性病个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

239.治疗有肿瘤的个体的方法，所述肿瘤选自：腺瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；或实体肿瘤；该方法包括：

将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织内。

其中随后的GHRH或其生物等同物表达足以延缓肿瘤的生长。

240.权利要求239的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲；其中，细胞转染脉冲施加给含有递送的核酸表达构建体的组织区域。

241.权利要求240的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲前，将多个电极安置在组织内；其中将核酸表达构建体递送到组织中插入了一对电极的区域。

242.权利要求240的方法，其中细胞转染脉冲电脉冲或血管压力脉冲。

243.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体进入个体组织的递送过程包括电穿孔。

244.权利要求239的方法，其中通过注射，基因枪，或金颗粒轰击递送。

245.权利要求239的方法，其中个体是家畜；食用动物；或力畜。

246.权利要求239的方法，其中个体是人。

247.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体基本上不含病毒骨架(viral backbone)。

248.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体的启动子包括组织特异性启动子。

249.权利要求248的方法，其中组织特异性启动子包括肌特异性启动子。

250.权利要求248的构建体，其中启动子包括SPc5-12。

251.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体3’非翻译区是人生长激素3’UTR，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV40多聚腺苷化信号。

252.权利要求239的方法，其中组织包括肌肉。

253.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

254.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包括SeqID#1。

255.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

256.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

257.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

258.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

259.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

260.权利要求239的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

261.权利要求259的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

262.权利要求259的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

263.权利要求239的方法，其中编码的GHRH功能性生物等同物是相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

264.权利要求239的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

265.权利要求239的方法，其中肿瘤包括良性或恶性肿瘤。

266.权利要求239的方法，其中预防了个体肾衰竭。

267.治疗有恶瘤的个体的方法，该方法包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织中；其中随后GHRH或功能性生物等同物的表达足以延缓恶瘤的生长。

268.权利要求267的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲；其中，细胞转染脉冲施加给含有递送的核酸表达构建体的组织区域。

269.权利要求268的方法，进一步包括：在对组织施加细胞转染脉冲之前将多个电极安置在组织内；其中将核酸表达构建体递送到组织中插入了多个电极的区域。

270.权利要求268的方法，其中细胞转染脉冲是电脉冲或血管压力脉冲。

271.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体进入个体组织的递送过程包括电穿孔。

272.权利要求267的方法，其中通过注射，基因枪，或金颗粒轰击递送。

273.权利要求267的方法，其中个体是家畜；食用动物；或力畜。

274.权利要求267的方法，其中个体是人。

275.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体基本上不含病毒骨架。

276.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体的启动子包括组织特异性启动子。

277.权利要求276的方法，其中组织特异性启动子包括肌特异性启动子。

278.权利要求276的构建体，其中启动子包括SPc5-12。

279.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体3’非翻译区是人生长激素3’UTR，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV40多聚腺苷化信号。

280.权利要求267的方法，其中组织包括肌肉。

281.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

282.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#1。

283.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

284.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

285.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

286.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

287.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

288.权利要求267的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

289.权利要求287的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

290.权利要求287的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

291.权利要求267的方法，其中编码的GHRH功能性生物等同物是相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

292.权利要求267的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

293.权利要求267的方法，其中肿瘤包括良性或恶性肿瘤。

294.治疗有白血病或淋巴瘤的个体的方法，该方法包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织中；其中随后GHRH或功能性生物等同物的表达足以延缓白血病或淋巴瘤的生长率。

295.权利要求294的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲；其中，细胞转染脉冲施加给含有递送的核酸表达构建体的组织区域。

296.权利要求295的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲前，将多个电极安置在组织内；其中核酸表达构建体递送到组织中插入了多个电极的区域。

297.权利要求295的方法，其中细胞转染脉冲是电脉冲或血管压力脉冲。

298.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体进入个体组织的递送过程包括电穿孔。

299.权利要求294的方法，其中通过注射，基因枪，或金颗粒轰击递送。

300.权利要求294的方法，其中个体是家畜；食用动物；或力畜。

301.权利要求294的方法，其中个体是人。

302.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体基本上不含病毒骨架。

303.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体的启动子包括组织特异性启动子。

304.权利要求303的方法，其中组织特异性启动子包括肌特异性启动子。

305.权利要求303的构建体，其中启动子包括SPc5-12。

306.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体3’非翻译区是人生长激素3’UTR，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV40多聚腺苷化信号。

307.权利要求294的方法，其中组织包括肌肉。

308.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

309.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#1。

310.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

311.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

312.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

313.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

314.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

315.权利要求294的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

316.权利要求315的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

317.权利要求315的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

318.权利要求294的方法，其中编码的GHRH功能性生物等同物是相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

319.权利要求294的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

320.预防个体产生转移性肿瘤的方法，包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织中；其中随后GHRH或功能性生物等同物的表达足以延缓转移性肿瘤的发生。

321.权利要求320的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲；其中，细胞转染脉冲施加给含有递送的核酸表达构建体的组织区域。

322.权利要求321的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲之前将多个电极安置在组织内；其中核酸表达构建体递送到组织中插入了多个电极的区域。

323.权利要求321的方法，其中细胞转染脉冲是电脉冲或血管压力脉冲。

324.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体进入个体组织的递送过程包括电穿孔。

325.权利要求320的方法，其中通过注射，基因枪，或金颗粒轰击递送。

326.权利要求320的方法，其中个体是家畜；食用动物；或畜力。

327.权利要求320的方法，其中个体是人。

328.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体基本上不含病毒骨架。

329.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体的启动子包括组织特异性启动子。

330.权利要求329的方法，其中组织特异性启动子包括肌特异性启动子。

331.权利要求329的构建体，其中启动子包括SPc5-12。

332.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体3’非翻译区是人生长激素3’UTR，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV40多聚腺苷化信号。

333.权利要求320的方法，其中组织包括肌肉。

334.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

335.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#1。

336.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

337.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

338.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

339.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

340.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

341.权利要求320的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

342.权利要求341的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

343.权利要求341的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

344.权利要求320的方法，其中编码的GHRH功能性生物等同物是相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

345.权利要求320的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

346.权利要求320的方法，其中肿瘤包括良性或恶性肿瘤。

347.治疗具有转移性肿瘤细胞生长的个体的方法，肿瘤细胞选自：腺瘤；恶瘤，白血病，淋巴瘤，肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；和实体肿瘤；该方法包括：

(a)将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体的肌肉组织中；

(b)对该组织施加电穿孔细胞转染脉冲；

其中：

核酸表达构建体包括：

肌特异性启动子；

编码的GHRH或其功能性生物等同物；和人生长激素3’非翻译区(“3’UTR”)；启动子，编码的GHRH或其功能性生物等同物，和3’非翻译区均操作性连接，GHRH或生物等同物的体内表达由启动子调控，并且该构建体基本上不含有病毒骨架；

随后GHRH或功能性生物等同物的表达促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌，并足以延缓细胞的转移性生长的生长。

348.权利要求347的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲前，将多个电极安置在组织内；其中核酸表达构建体递送到组织中插入了多个电极的区域。

349.权利要求347的方法，其中个体是家畜；食用动物；或力畜。

350.权利要求347的方法，其中个体是人。

351.权利要求347的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

352.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#1。

353.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

354.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

355.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

356.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

357.权利要求347的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

358.权利要求347的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种带电荷的转染-促进多肽，该带电荷的转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

359.治疗个体肾衰竭的方法，该方法包括：将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织中；其中随后GHRH或功能性生物等同物的表达足以延缓癌的生长。

360.权利要求359的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲；其中，细胞转染脉冲施加给含有递送的核酸表达构建体的组织区域。

361.权利要求360的方法，进一步包括：对组织施加细胞转染脉冲前，将多个电极安置在组织内；其中核酸表达构建体递送到组织中插入了多个电极的区域。

362.权利要求360的方法，其中细胞转染脉冲是电脉冲或血管压力脉冲。

363.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体到个体组织的递送包括电穿孔。

364.权利要求359的方法，其中通过注射，基因枪，或金颗粒轰击递送。

365.权利要求359的方法，其中个体是家畜；食用动物；或力畜。

366.权利要求359的方法，其中个体是人。

367.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体基本上不含病毒骨架。

368.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体的启动子包括组织特异性启动子。

369.权利要求368的方法，其中组织特异性启动子包括肌特异性启动子。

370.权利要求368的构建体，其中启动子包括SPc5-12。

371.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体3’非翻译区是人生长激素3’UTR，牛生长激素3’UTR，骨骼α肌动蛋白3’UTR，或SV40多聚腺苷化信号。

372.权利要求359的方法，其中组织包括肌肉。

373.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体是SeqID#11，SeqID#12，SeqID#13，SeqID#14，SeqID#17，SeqID#18，SeqID#19，SeqID#20，或SeqID#21。

374.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#1。

375.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#2。

376.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#3。

377.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#4。

378.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含SeqID#10。

379.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物包含氨基酸通式(SEQID#6)：

-X₁-X₂-DAIFTNSYRKVL-X₃-QLSARKLLQDI-X₄-X₅-RQQGERNQEQGA-OH

其中通式具有下述特征：

X₁是酪氨酸(“Y”)，或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₂是丙氨酸(“A”)，缬氨酸(“V”)，或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₃是丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₄是蛋氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体氨基酸；

X₅是丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体氨基酸；

或其组合。

380.权利要求359的方法，其中核酸表达构建体进一步含有一种转染-促进多肽。

381.权利要求380的方法，其中转染-促进多肽包含带电荷的多肽。

382.权利要求380的方法，其中转染-促进多肽包含聚-L-谷氨酸盐。

383.权利要求359的方法，其中编码的GHRH功能性生物等同物是相较于GHRH多肽具有类似或改进的生物活性的多肽。

384.权利要求359的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等同物促进个体体内生长激素(“GH”)的分泌。

385.权利要求359的方法，其中肾衰竭缘于患有癌症的个体，所述癌症选自：腺瘤；恶瘤，白血病，淋巴瘤，肥大细胞瘤；黑素瘤；肉瘤；和实体肿瘤。

386.权利要求385的方法，其中癌症包括良性或恶性肿瘤。

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