CN1706002B - 用于检测和鉴定分子结构的扫描探针显微图像基于模型的融合 - Google Patents
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Abstract
在本发明某些实施方案中,可以使用不同的成像技术诸如不同形式的扫描探针显微技术捕获一个或多个对象的一系列图像。利用已知的分子结构的一种或多种模型,可以由所述的一系列图像估算出参量,以提供基于模型的分析。所述的估算出的参量可以与来自已知的分子结构的物理模型的进一步输入相融合。融合参量可以用来表征对象。这样的表征可以包括检测和/或鉴定特定的分子结构,例如具有已知序列和/或结构的蛋白、肽和/或核酸。在本发明的某些实施方案中,结构表征可以用来鉴定对象分子的先前未知的性质。
Description
相关申请
本申请是2002年10月17日提交的、在审中的序列号为10,273,312的美国专利申请的部分继续申请。
发明领域
本申请总体上涉及成像,更特别地,涉及图像基于模型的融合(model-based fusion)。某些公开的方法是涉及测定结构,包括生物分子诸如蛋白、肽、脂类、多糖和/或核酸的结构。
背景技术
在各种形式的成像技术诸如扫描探针显微技术(scanning probemicroscopy,SPM)中,可以应用不同的传感形式(sensing modalities)对特定的对象进行成像。在传统方法中,各个图像可以被单独阐释(interpreted),其仅仅对图像的各种常规特征作定性的交叉参照(cross-referencing)。在SPM中,图像通常用目测(visual observation)来阐释。当必须阐释大量的数据时,如鉴定各种样品中一种或者多种特定的分子结构时,图像的阐释可能是耗费时间且效率低下的。通过不同的扫描探针形式诸如原子力显微技术(atomic force microscopy,AFM)、扫描穿隧显微技术(scanning tunneling microscopy,STM)和/或磁力显微技术(magnetic force microscopy,MFM)摄取的图像中的结构特征的交叉参照是非常缓慢的,而且容易产生操作失误或错误阐释。
在确定已知的对象是否存在于样品中时,通常并不会将用于对样品进行成像的不同传感形式组合起来以提供样品的同一区域的融合图像(fused image)。在样品的多个图像被组合时,通常是通过在逐点(point-by-point)或逐象素(pixel-by-pixel)的基础上将不同组的数据组合起来实现的。然而,图像的组合不能充分利用在不同图像中相互独立的信息。而且,在逐点或逐象素的基础上组合图像需要各个图像精确的对准(alignment),以在同一栅格(grid)创造出多特征(multi-feature)图像。在不存在用于对准的已知的校正地标(calibrationlandmarks)时,这样的对准对于纳米级结构的SPM图像是非常困难的。因此需要利用生物分子的已知结构特征来辅助SPM图像的鉴定和分析的图像融合方法。
附图简述
下面的附图形成本说明书的一部分,用来进一步阐述公开的方法和仪器。通过参考其中一幅或多幅附图并结合本文中的详细描述,可以更好的理解这些方法和仪器。
图1显示了图像参量基于模型的融合的示范性方法。
图2显示了流程图,其示出了对一组图像进行基于参量的分析(parameter-based analysis)的示范性方法。
图3显示了将SPM图像与分子结构的物理模型组合起来形成该结构基于参量的表征的示范性方法。
图4显示了示范性的利用SPM的对象鉴定体系。
图5显示了示范性的通过原子力显微技术获得的消化λDNA图像。
图6显示了用微流态分子梳(microfluidic molecular combing,MMC)对准DNA分子的实例。
图7显示了用微流态分子梳(microfluidic molecular combing,MMC)对准DNA分子的另一个实例。
图8显示了示范性的由13个独立寡核苷酸链杂交在一起的寡核苷酸SPM探针。
图9显示了图8的SPM探针的各个寡核苷酸组分。注意,如图8中所示,有9个片段(按次序标记为PT1到PT9)用于组成SPM探针的上链;有4个片段(标记为#1到#4)组成SPM探针的下链。杂交的SPM探针显示出可由扫描探针显微技术检测到的分支点(branchpoints)。
图10列出了PT1到PT9的全序列,包括分支点。
图1 1显示了通过原子力显微技术成像的图8和图9的SPM探针(箭头,图的右上角)。为了比较,2.8kb的线性质粒DNA也被显示出来。
示范性实施方案详述
定义
如本文中所用的, “一”、 “一个”(“a”和“an”)可以指一个或者一个以上的某事物。
如本文中所用的,“对象(subject)”可以是能够通过SPM技术成像的任何物体,包括但不局限于生物分子。技术人员将会理解,生物分子可以指发现于生物系统的任何分子,包括但不局限于蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、脂蛋白、脂类、多糖、糖脂、脂多糖、寡核苷酸、多聚核苷酸、核酸和核蛋白。 “对象”不局限于单分子,也可以包括两个或多个分子的复合物。
“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA),可以是单链的、双链的或三链的,以及其任何化学修饰。“核酸”可以是任何长度的,从2个碱基大小的到全长染色体。事实上,核酸的任何共价或非共价修饰都在请求保护的主题的考虑范围之内。“核酸”包括,但不局限于寡核苷酸和多聚核苷酸。
“蛋白质”指任何长度的由氨基酸组装而得的聚合分子。“蛋白质”可以包括自然发生的、修饰的、衍生的、标记的和/或非自然发生的氨基酸和/或氨基酸类似物。“蛋白质”包括,但不局限于肽、多肽、糖蛋白和脂蛋白。
本文中描述的方法和仪器可用于SPM图像基于模型的融合。SPM图象基于模型的融合可以用来检测、鉴定和/或表征一种或多种生物分子。参量可以源自已知的对象的多份图像,这些图像是利用不同的SPM成像形式获得的。所述参量可以与所述对象的模型融合,从而形成所述对象基于参量的表征。
在下面的详细描述中,为了解释的目的,描述了许多具体的细节。然而,应该理解,请求保护的方法和仪器没有这些具体细节也可以实施。在其他方面,众所周知的电路、结构、技术和装置没有详细描述。
下面描述的各种方法可以用硬件组件来实施,或者可以根据可由机器执行的指令来实施,所述指令可以被用来获得由所述指令编程的通用的或专用的处理器或逻辑电路以实施这些方法。可选择地,这些方法可以通过硬件和软件的组合来实施。
生物分子
下面的讨论关于已知生物结构的非限制性实施例,诸如核酸和蛋白质。本领域技术人员将认识到,其他类型的已知生物结构,包括但不局限于脂类、糖类、肽、寡核苷酸、糖蛋白、糖脂、脂蛋白也可以用公开的方法和仪器分析。
核酸
待分析的核酸可以用本领域已知的任何技术制备。将被分析的核酸可以包括纯化或部分纯化的DNA或RNA样品。事实上,任何自然发生的核酸都可以被分析,包括但不局限于染色体、质粒、叶绿体和线粒体DNA和信使RNA、核糖体RNA、转运RNA和不均一核RNA。纯化核酸的方法是已知的(如Guide to Molecular Cloning Techniques,eds.Berger and Kimmel,Academic Press,New Your,NY,1987;MoleculaCloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,eds Sambrook,Fritsch andManiatis,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor Press,NY,1989)。核酸纯化试剂盒也可以商购(如Qiagen,Valencia,CA;Ambion,Austin,TX;Clontech,Palo Alto,CA)。这些方法和试剂盒只是示范性的,本领域技术人员知道的任何变化都可以被应用。
将被分析的其他类型的核酸可以用引物延伸或聚合酶链式反应(PCRTM)制备(如美国专利4,683,195;4,683,202和4,800,159)。可选择地,核酸可以被插入到各种载体中,诸如BAC、YAC、质粒、病毒、柯斯质粒(cosmids)、噬菌体等,并复制和/或纯化这些插入片段(参见如Berger and Kimmel,1987;Sambrook etal.,1989)。核酸插入片段可以从载体DNA分离得到,例如通过用合适的限制性内切酶切割,再进行琼脂糖凝胶电泳来分离。分离核酸插入片段的方法是本领域已知的。公开的方法不限制待分析的核酸的来源,任何类型的核酸包括原核生物、细菌、病毒、真核生物、哺乳动物和/或人的核酸都可以在请求保护的主题范围内被分析。
目前确定核酸分子结构的方法主要是指核酸测序,这主要是利用Sanger双脱氧测序方法的某些变型或与芯片阵列上的已知寡核苷酸序列杂交的方法来测定。可以用计算机处理方法来分析核酸序列,鉴定结构特征,诸如茎-环(stem-loop)形成序列、回文序列、发夹结构和蛋白结合结构域。目前其他的核酸结构分析方法包括核磁共振(NMR)成像和X射线晶体学(参见如http://ndbserver.rutgers.edu/)。NMR仅适用于鉴定短的、相对简单的核酸结构,而X射线晶体学需要繁琐、耗时的单分子晶体形成过程,并需要大量的纯化核酸。
已知的核酸结构通常归入表1中总结的几类中的其中一类。这些结构有时被称作双链DNA的A、B和Z结构。表1.已知的核酸结构
A | B | Z | |
螺旋型式(Helicalsense) | 右手螺旋 | 右手螺旋 | 左手螺旋 |
直径 | ~26A | ~20A | ~18A |
碱基对/螺旋 | 11 | 10 | 12(6个二聚体) |
螺距(每圈上升) | 28A | 34A | 45A |
螺旋上升/碱基对 | 2.6A | 3.4A | 3.7A |
相对于螺旋轴的碱基倾斜 | 20° | 6° | 7° |
大沟 | 窄而深 | 宽而深 | 平坦 |
小沟 | 宽而浅 | 窄而深 | 窄而深 |
糖折叠(Sugarpucker) | C(3’)-内 | C(2’)-内 | C(2’)-内(嘧啶)C(3’)-内(嘌呤) |
糖苷键 | 反式 | 反式 | 嘧啶为反式嘌呤为顺式 |
本领域技术人员将认识到,表1中公开的核酸结构只是示范性的,核酸结构的其他变型是已知的 (参见如http://www.imb-jena.de/ImgLibDoc/nana/IMAGE NANA.html),且可以用于公开的方法。核酸结构的其他非限制性例子包括茎-环、发夹序列、单链区域、凸起(bulges)、内部环结构(internal loops)、接合(junction)、三链或伸展沟(extended grooves),其可以指示蛋白结合位点。已知的核酸结构的信息可以由例如各种数据库获得,所述数据库包括但不局限于GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/Overview.html);欧洲分子生物学实验室(http://www.ebi.ac.uk/embl.html);和日本DNA数据库。
已知的核酸结构的特性可以用作标记,来鉴定在一个或多个SPM图像中的核酸和/或核酸构象。在未纯化或部分纯化的样品中,已知的结构参量可以用于确定核酸在SPM域(SPM field)中的位置,例如以鉴定所述域中将用一种或多种SPM形式进行更详细分析的区域。在非限定性实施例中,此种区域可以被至少一种SPM形式,如AFM进行分析,并处理数据,产生扣除掉背景噪音的核酸3D扫描。然后可以利用至少一种另外的形式如STM或MFM来扫描同一区域。
使用不同的SPM形式获得的图像可以通过计算机程序来对准,其中所述计算机程序识别与分子标记物诸如化学修饰的核苷酸、标记核苷酸的短序列和/或结合的寡核苷酸探针有关的参量。用作探针的修饰核苷酸可以用纳米颗粒、重金属原子或复合物、放射性同位素或任何本领域已知的可被SPM成像识别的标记物进行标记。尽管认为此种标记可以附着于核酸或探针分子,但此种对准标记物也可能分散于整个SPM域中。
利用不同的SPM成像形式获得的图像可以使用基于物理模型的方法来融合,如下面详述。感兴趣的物理特性可以包括但不局限于核酸结构诸如A、B或Z型DNA、发夹环等。
蛋白
用公开的方法和仪器来分析、表征和/或鉴定的蛋白可以用本领域任何已知的方法制备。事实上,任何类型的蛋白都可以用公开的方法分析。用于分析的蛋白质可以是未纯化的、部分纯化的或纯化的,来自器官、组织、细胞匀浆、分离的细胞器、血液、唾液、尿、脑脊液或排泄样品、组织切片、细胞培养物等。
纯化各种形式的蛋白的方法是已知的(如Protein Purification,ed.Scopes,Springer-Verlag,New York,NY,1987;Methods in Molecular Biology:Protein Purification Protocols,Vol.59,ed.Doonan,HumanaPress,Totowa,NJ,1996)。公开于引用的参考文献中的方法只是示范性的,可以使用本领域已知的任何变型。当要纯化蛋白时,可以组合各种技术,包括但不局限于细胞分级分离(cell fractionation)、柱层析(如体积排阻层析、离子交换层析、反向层析、亲和层析等)、快速液相色谱(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)、凝胶电泳、盐沉淀、pH沉淀、有机溶剂或抗体沉淀、超滤和/或超离心。
可以分析自然发生的或非自然发生的蛋白质。例如,用于分析的蛋白可以如下地制备,将cDNA文库克隆到表达载体中,转化宿主细胞,表达克隆的蛋白和利用亲和层析纯化带标记的蛋白(如组氨酸、Flag标记的蛋白)。该公开方法不限制将被分析的蛋白的来源,任何类型的蛋白,包括原核生物的、细菌的、病毒的、真核生物的、哺乳动物的和/或人的都可以在请求保护的主题范围内分析。
已知的蛋白结构可以应用于蛋白的SPM图像基于模型的融合。已知的蛋白质结构包括但不局限于一级、二级、三级和四级蛋白结构。目前测定蛋白结构的方法包括x-射线晶体学、质谱术、用Edman降解法进行的蛋白质测序、分子建模、圆二色法、表面增强拉曼光谱术(SERS)、NMR和电子显微技术。考虑到所需的仪器和所需纯蛋白的数量,这些技术总体来说是耗时的,代价昂贵的。某些类型的蛋白,诸如膜整合蛋白用标准方法难以分析。对于这些技术中的大部分技术,待分析的样品在制备期间都要进行大量的操作,这可能在分子结构中引入矫作物(artifact)。
已知的蛋白结构信息来自各种数据库,诸如Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/);Motif in Protein Databases(http://alces.med.umn.edu/dbmotif.html);Incyte GenomicsBioKnowledge Library(http://www.incyte.com/sequence/proteome/index.shtml);NationalCenter for Biotechnology Information(http://www.ddbj.nig.ac.jp);proteincrystallization database(http://www.bmcd.nist.gov.8080/bmcd/bmcd.html);SWISS-PROT(http://www.expasy.ch);NIST Surface Structure Database(http://www.nist.gov/srd/nist42.htm);non-redundant protein sequencedatabase(http://www.bmbsgill.leeds.ac.uk/bmb5dp/owl.html);the proteinidentification resource database(http:/www-nbrgeorgetown.edu)和theCelera Discovery System(http://cds.com)。
二级结构预测方法
蛋白质的一级结构包括氨基酸的线性序列、以及任何额外的共价键如二硫键。蛋白质一级结构可以由Edman降解法测定,或更经常地,由编码该蛋白质的cDNA序列的测序和翻译来确定一级结构。商用蛋白质测序仪有各种来源,诸如Applied Biosystems(Foster City,CA)。
蛋白质二级结构包括有规则的重复结构基序,其主要由分子内氢键来稳定。典型的蛋白质二级结构包括α-螺旋、β-折叠和回折。用圆二色谱术(CD)测定纯化蛋白质中的二级结构的数量。然而,圆二色谱不能告诉给定的二级结构位于蛋白质序列的何方。蛋白质构象的精确结构信息可以由X-射线晶体学提供,或有限程度地,由其他技术如NMR提供。
蛋白质结构的计算机建模也已经被用来预测二级结构的元件的位置,其基于经验性规则,如由Chou和Fasman(Adv.Enzymol.47:45-148,1978)所提出的。每种氨基酸残基被赋予一个形成不同类型二级结构的概率值,移动窗口运算法则(moving window algorithm)寻找出可能的α-螺旋、β-折叠和回折区域。此种经验性分析在预测二级结构中具有某些价值。但是,这些方法不完全准确。下面的表2中示出了包含有蛋白质结构信息和/或预测蛋白质结构的计算机程序的各种示范性数据库。(也参见http://www.aber.ac.uk/~phiwww/prof;http://www.embl-heidelberg.de/cgi/predator_serv.pl;http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/ppDoPredDef.Html;)。表2.蛋白结构数据库
数据库 | 网址 |
FASTA | http://www2.ebi.ac.uk/fasta3 |
BLAST | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/http://www2.ebi.ac.uk/blast2/ |
Clustal W | http://www2.ebi.ac.uk/clustalw |
AMAS | http://banon.ebi.ac.uk/servers/amas_server.html |
PDB | http://www.rcsb.org |
PROCHECK | http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html |
COMPOSER | http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk |
MODELLER | http://guitar.rockefeller.edu/modeller.html |
SWISS-MODEL | http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html |
SCOP | http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk./scop |
CATH | http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath |
FSSP | http://www2ebi.ac.uk/dali/fssp.html |
MMDB | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/MMDB/mmdb/html |
THREADER | http://insulin.brunel.ac.uk/threader/threader.html |
topITS | http://www.embl-heidelberg.de/preditprotein/ppDoPredDef.html |
CASP | http://predictioncenter.llnl.gov/casp2/Casp2.htmlhttp://predictioncenter.llnl.gov/casp3 |
下面的表3提供了蛋白质二级结构的参量(Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties,Ch.5,W.H.Freeman,New York,NY,1984)。其他的二级结构参量在本领域是已知的,如右手α-螺旋的氢键长度为Ramachandran和Sasisekharan(Adv.Protein Chem.23:283-437,1968)公开了各种类型的蛋白质二级结构的参量范围。表3.蛋白质二级结构参量
可以利用SPM技术鉴定未知蛋白样品中的蛋白质二级结构。这些特征可以用做标记,来校正若干由SPM技术产生的图象的处理数据,和/或来鉴定样品目标。感兴趣的物理特性可以包括但不局限于蛋白质二级结构,诸如α-螺旋、β-褶状折叠、转角等。这些结构可以由AFM、STM或任何其他类型的扫描探针显微技术鉴定。
蛋白质三级结构包括蛋白质的完整三维结构。目前测定三级结构的方法主要有X-射线晶体学,从NMR和类似技术只能得到有限的结构信息。三级结构直接涉及到蛋白质折叠领域,其是确定蛋白质结构功能关系的研究热点。这样的研究可以用于如设计新颖、更有效的药物化合物、酶活性的抑制剂和/或激活剂。
四级结构涉及两个或多个蛋白质组装形成复合物。这样的复合物的形成在调节酶活性和/或信号转导过程中也是重要的。公开的方法和仪器对测定生物分子诸如核酸和/或蛋白的一级、二级、三级和四级结构都是有用的。各种形式的SPM成像可以用于测定这些结构信息。探针可以用于鉴定特定类型的核酸或蛋白结构,诸如在核酸上的蛋白结合位点、在蛋白质上的催化或其他活性位点、抗体结合结构域等。针对核酸和/或蛋白质结构的各种探针是本领域已知的,任何这样的已知探针都可以使用。探针可以是未标记的,或者可以标记有一个或多个可被SPM成像检测的标记物。在下面公开的非限制性实施例中,未标记的寡核苷酸探针通过AFM光谱术来成像。然而,技术人员将认识到,针对核酸或蛋白结构的探针可以用各种SPM标记物进行标记,在下文中将详细描述。这样的探针可以包括本领域已知的任何类型的结构探针,诸如抗体、抗体片段、适体(aptamer)、寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物。
用分子梳(molecular combing)进行对准
要被分析的SPM标记、探针和/或生物分子在分析之前可以附着到表面并进行对准。对准可以使分析更正确和/或更快速。以无序形式置于表面的分子或SPM标记可能相互交迭或部分地被遮蔽,这使其检测和/或鉴定复杂化。
将分子诸如核酸、蛋白质和/或探针附着到表面并对准的方法或仪器是本领域已知的(参见如Bensimon etal.,Phys.Rev.Lett.74:4754-57,1995;Michalet et al.,Science 277:1518-23,1997;美国专利5,840,862;6,054,327;6,225,055;6,248,537;6,265,153;6,303,296和6,344,319)。例如,可以将分子附着到表面,并利用空气-水弯月面或其他类型的界面中固有的物理力使其对准。该技术通常称之为分子梳(molecular combing)。溶解于水介质中的分子可以在其一个或两个端部附着于表面,诸如硅化玻璃片、生物素化表面、包金表面(gold-coatedsurface)或任何其他本领域已知的表面上。所述表面可以缓慢地从水介质中抽出。极性或带电的目标分子,诸如核酸和大部分蛋白质,将优先分配到亲水(水)介质中。因此,将表面从水介质中移出时,会使得结合的目标分子伸展开,伸展方向与弯月面移动方向平行。展伸的分子的测量长度与其实际大小之间具有直接关系,1μm的延伸长度相当于约2000个碱基的核酸序列(Herrick etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:222-227,2000)。
一旦表面全部离开水介质后,附着的分子以平行的方式对准,这可以更容易和更精确地进行分析。该技术不受将要对准的目标分子的大小的限制,它对长至整个染色体的核酸也能起作用(如Michalet etal.,1997;Herrick et al.,2000)。弯月面以合适的速率移动时,产生的剪切力是相对低的,这样使得数百kb或更长的DNA片段被对准(Michaletet al.,1997)。
分子与表面之间强烈而又非特异性的吸附会抑制分子梳作用(Bensimon et al.,1995)。因此,可以对进行表面处理,以便目标分子的一端或多端可以结合到表面。将核酸、蛋白和其他类型的分子结合到表面的方法是本领域已知的,总结如下。在非限制性实施例中,目标分子可以在一端或两端用生物素残基共价修饰。当暴露于抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的表面时,只有生物素化的端部可以结合到表面。通过使用本质上斥水的表面如硅化表面,可以减少与表面的非特异性吸附。
公开的方法和装置不受可以使用的表面类型的限制。非限制性例子包括玻璃、功能化玻璃、陶瓷、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、锗、硅、石英、砷化镓、金、银、尼龙、硝化纤维或任何其他本领域已知的能够将目标分子附着到表面的材料。附着可以是共价的,或者是非共价的相互作用。
用于在表面对准目标分子的其它方法是本领域已知的。 (如Bensimon etal.,1995;Michalet et al.,1997;美国专利5,840,862;6,054,327;6,225,055;6,248,537;6,265,153;6,303,296和6,344,319)。可以认为,任何已知的对准方法都可以在请求保护的主题范围内使用。在某些实施方案中,当溶解于水介质中的目标分子从移动的弯月面抽出时,对准便发生了。弯月面移动的机制并不重要,可以通过如将表面浸于缓冲液中并缓慢从溶液中抽出来完成。可选择地,表面可以浸入溶液,然后通过蒸发或通过除去液体缓慢降低弯月面水平。在另外一个可选择的方法中,可以将一滴溶液置于盖片和诸如玻璃片的表面之间。表面可以慢慢被拉开,与盖片分离。因为溶液粘附到盖片,这导致在盖片接触表面的边缘处形成空气-水界面。移动该界面的同时,对准在表面上的目标分子。对准分子的其它可选择的方法涉及用自由流动电泳(free-flow electrophoresis)替代分子梳,或者在进行分子梳期间同时使用自由流动电泳。可选择地,分子可以用微流态分子梳对准,在下面的实施例中将描述。
寡核苷酸探针的杂交和连接
目标核酸与SPM标记的寡核苷酸的杂交可以在仅允许完全互补的核酸之间进行杂交的严紧条件(stringent conditions)下进行。低严紧性杂交通常在0.15M到0.9M NaCl、在20℃到50℃的温度进行。高严紧性杂交通常在0.02M到0.15M NaCl、在温度50℃到70℃之间进行。应该理解合适的严紧性的温度和/或离子强度是部分地通过寡核苷酸探针的长度、目标核酸的碱基成分、甲酰胺、四甲基氯化铵或其他溶剂在杂交液中的存在与否来确定的。上述提到的范围是示范性的,针对特定杂交反应的合适的严紧性常常经验性地通过与阳性和/或阴性对照比较来确定。本领域普通技术人员能够容易地调节杂交条件,以仅允许在准确互补的核酸序列之间进行严紧性杂交。
一旦短的寡核苷酸探针与核酸杂交后,邻近的探针可以用已知的方法连接(如美国专利6,013,456)。短至6到8个碱基的寡核苷酸序列可以有效地与目标核酸杂交(美国专利6,013,456 )。不依赖引物的连接可以使用至少6到8个碱基的寡核苷酸来实现(Kaczorowski andSzybalski,Gene 179:189-193,1996;Kotler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4241-45,1993)。将与目标核酸杂交的寡核苷酸连接起来的方法是本领域已知的(美国专利6,013,456)。邻近的寡核苷酸探针的酶法连接可以利用DNA连接酶,诸如T4、T7或Taq连接酶或大肠杆菌DNA连接酶。酶法连接的方法是已知的(如Sambrook etal.,1989)。
分子的固定化
在SPM分析之前,待分析的目标分子可以进行固定化。尽管下述谈论涉及核酸的固定化,本领域技术人员将认识到固定各类型分子的方法是本领域已知的,可以用于请求保护的方法中。
核酸固定化可以通过各种本领域已知的方法来实现。例如,可以通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被基质,然后附着生物素化的核酸,来实现固定化(Holmstrom et al.,Anal.Biochem.209:278-283,1993)。也可以通过用聚-L-Lys(赖氨酸)包被硅、玻璃或其他基质,再使用双功能交联试剂共价连接氨基或巯基修饰的核酸,来进行固定化作用(Running rt al.,BioTechniques 8:276-277,1990;Newton et al.,nucleic acids Res.21:1155-62,1993)。也可以通过应用用于交联的氨基硅烷(aminosilane),将氨基残基引入到基质上。
可以通过将5′-磷酸化的核酸直接共价连接到化学修饰的基质上进行固定化(Rasmussen et al.,Anal Biochem.198:138-142,1991)。通过用水溶性碳二亚胺或其他交联试剂的缩合,可以在核酸和基质之间形成共价键。该方法有利于核酸主要的通过其5′-磷酸进行的5′端连接。示范性的修饰基质可以包括玻璃片或盖片,其已在酸浴中处理过,从而将SiOH基团暴露在玻璃上(美国专利5,840,862)。
通常通过首先硅烷化玻璃基质,然后用碳二亚胺或戊二醛活化,将DNA结合到基质上。可选择的方法可以使用试剂如3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)、乙烯基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTS),通过在分子的3′或5′端引入的氨基连接子来连接DNA。DNA可以使用紫外辐射直接结合到膜基质上。固定化技术的其他非限制性例子公开于美国专利5,610,287;5,776,674和6,225,068。用于核酸结合的商品化的基质可来自如Covalink、Costar、Estapor、Bangs和Dynal。技术人员将认识到公开的方法不局限于核酸固定化,也可以用于例如将蛋白质、脂类、糖或其他生物分子附着于基质。
用于固定化的基质的类型是不受限制的。固定化基质可以是磁珠、非磁性珠、平面基质或具有任何形状的固体基质,可由几乎任何材料构成。可以使用的基质的非限制性例子包括玻璃、硅石、硅酸盐、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、银或其他金属包被的基质、硝化纤维、尼龙、活化石英、活化玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚聚丙烯酰胺,其它的聚合物诸如聚(氯乙烯)或聚(甲基丙烯酸甲酯),以及光聚合物,其含有光反应活性物质,诸如氮宾、卡宾和羰自由基,它们能够与目标分子形成共价连接(见美国专利5,405,766和5,986,076)。
双功能交联试剂可以用于固定化和/或标记。可以根据它们的功能基团如氨基、胍基、吲哚或羰基特异性基团的特异性对双功能交联试剂进行分类。这些之中,由于商业可获得性、容易合成以及温和反应条件的原因,涉及游离氨基的试剂受到欢迎。交联分子的示范性方法在美国专利5,603,872和5,401,511中公开。交联试剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和碳二亚胺,诸如1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
标记
探针和/或对象的结构特征可以用一个或多个标记物进行标记,以方便结构特征的检测和/或鉴定,或帮助对准由不同SPM形式获得的图像。任何本领域已知的可被SPM检测到的标记都可以使用。下述实例不是限制性的,技术人员将认识到其他类型的已知标记可以用于实施请求保护的主题。
纳米微粒
标记可以包括单个的纳米微粒和/或纳米微粒聚集体。使用的纳米微粒可以包括银或金纳米微粒。考虑平均直径10到50nm、50到100nm或约100nm的纳米微粒。尽管任何形状的、或不规则形状的纳米微粒都可以使用,纳米微粒在形状上可以是近似球形的。制备纳米微粒的方法是已知的(例如美国专利6,054,495;6,127,120;6,149,868;Lee and Meisel,J.Phys.Chem.86:3391-3395,1982)。纳米微粒也可以商购(如Nanoprobes Inc.,Yaphank,NY;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)。
纳米微粒标记可以是纳米微粒的随机聚集体(胶体纳米微粒)。可选择的,纳米微粒可以交联,以产生纳米微粒的特定聚合体,诸如二聚体、三聚体、四聚体或其他聚合体。交联纳米微粒的方法是本领域已知的(参见如Feldheim,″Assembly of metal nanoparticle arrays usingmolecular bridges,″The Electrochemical Society Interface,Fall,2001,pp.22-25)。金纳米微粒与具有末端硫醇或巯基基团的连接化合物的反应是已知的(Feldheim,2001)。金或银纳米微粒可以用衍生硅烷诸如氨基硅烷、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)包被。硅烷末端的反应基团可以用于形成纳米微粒的交联聚集体,或将纳米微粒附着于探针或其他分子,诸如核酸或蛋白质。
金属条形码
标记可以包括亚微米金属条形码(如Nicewarner-Pena et al.,Science 294:137-141,2001)。Nicewarner-Pena等(2001)公开了制备多金属微棒(multimetal microrods)的方法,它是用不同类型的金属构成的亚微米条纹(submicrometer stripes)编码。该系统使得用两种金属可以产生多达4160种可区别的大量条形码,使用三种不同的金属可以产生8×105种可区别的条形码。此种标记可以附着到探针和/或对象分子上,并用SPM技术读取。将金属颗粒诸如金或银附着到寡核苷酸和其他类型的分子上的方法是本领域已知的(如美国专利5,472,881)。
碳纳米管
用于所公开的方法的其他示范性标记涉及单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWNTs)。纳米管可以制成可用SPM方法区别的各种形状和大小(参见,如Freitag et al.,Phys.Rev.B 62:R2307-R2310,2000;Clausset al.,Europhys.Lett.47:601-607,1999;Clausset al.,Phys.Rev.B.58:R4266-4269,1998;Odom et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.960:203-215,2002)。Odom等(2002)公开了一种STM技术,其能够检测10nm或更小尺寸的SWNTs的穿隧谱(tunneling spectra)中的分离的峰。
通过管长度可以调节碳纳米管的电子特性。用作标记的纳米管的长度可以约10到100、220、300nm,直径约1.2到1.4nm。用作标记的纳米管长度或直径不受限制,实质上可以考虑为任何长度或直径的纳米管。纳米管可以用已知的方法制备,或从商业渠道获得,如CarboLex(Lexington,KY)、NanoLab(Watertown,MA)、Materials andElectrochemical Research(Tucson,AZ)或Carbon Nano Technologies Inc.(Houston,TX)。
不同长度和/或直径的纳米管也可以用本领域已知的许多技术制备,包括但是不局限于碳弧放电法(carbon-arc discharge)、通过碳氢化合物催化热解的化学气相沉积、等离子体辅助化学气相沉积(plasma assisted chemical vapor deposition)、含催化金属的石墨的激光烧蚀(laser ablation)或凝集相电解(condensed-phase electrolysis)(参见如美国专利6,258,401;6,283,812和6,297,592)。纳米管可以用质谱进行大小分选(参见Parker et al.,J.Am.Chem.Soc.113:7499-7503,1991)。可选择的,可以使用AFM(原子力显微镜)或STM(扫描穿隧显微镜)对纳米管进行分选。其他的大小分选方法是本领域已知的,可以考虑诸如气相色谱、时间飞行质谱、超滤或等同技术。一旦被选出,碳纳米管便可以进行衍生处理,并共价附着到探针、核酸和/或蛋白上。上述讨论的例子不是限制性的,可以使用制备碳纳米管的任何方法(如美国专利6,258,401;6,283,812和6,297,592)。
碳纳米管可以用反应基团进行衍生处理,以帮助附着到探针或对象分子上。在一个非限制性实例中,纳米管可以进行衍生,以包含羧酸基团(美国专利6,187,823)。可以用标准化学方法将羧酸盐衍生的纳米管附着到探针分子上,例如通过碳二亚胺的介导与探针上的伯胺或仲胺形成氨基连接。衍生和交联的方法不是限制性的,可以使用本领域任何反应基团或交联方法。
富勒烯(Fullerenes)
富勒烯可以用于标记探针、核酸和/或蛋白。生产富勒烯的方法是已知的(如美国专利6,358,375)。利用类似于上面为碳纳米管描述的方法,富勒烯可以进行衍生并附着到其他分子上。富勒烯标记的探针或结构可以用SPM技术鉴定。
技术人员将认识到用于本公开方法的标记物不局限于本文中所公开的那些,而是包括可以附着到探针或对象分子上并可以被检测到的任何其他类型的已知标记物。可以使用的标记物的其他非限制性例子包括量子点(如Schoenfeld,et al.,Proc.7th Int.Conf.on ModulatedSemiconductor Structures,Madrid,pp.605-608,1995;Zhao,et al.,lst Int.Conf.on Low Dimensional Structures and Devices,Singapore,pp.467-471,1995)。量子点和其他类型的标记物可以通过已知的方法合成,和/或从商业来源获得(如Quantum Dot Corp.,Hayward,CA)。
量子点微珠(Quantum Dot Microbeads)
SPM标记也可以包括量子点标记的微珠,如在Han等(NatureBiotech.19:631-635,2001)中公开的。通过以精确控制的量将不同大小的量子点(罩有zin-sulfide的硒化镉)包埋到聚合微珠里,可以制得多色光学编码珠(multicolor optical coded microbeads)。尽管这份2001年的出版物是涉及使用微珠用于荧光标记和检测,但技术人员将认识到此种珠也可以用于其他检测形式,诸如SPM成像。可选择地,多孔硅光晶体(porous silicon photonic crystals)已被描述过,其是通过趋电性阳极蚀刻来编码的(Cunin et al.,Nature Materials 1:39-41,2002)。这样的微米大小的纳米结构微粒也可以用于SPM标记。
扫描探针显微技术(SPM)
扫描探针显微镜是一类可以用于在微米和/或纳米尺度上测量对象的物理特性的仪器。不同形式的SPM技术是已知的,任何形式都可以用于生物检测、表征和/或鉴定。一般地,SPM仪器使用非常小的点式探针在非常接近表面的距离来测量对象的性质。探针可以安装在悬臂上,悬臂的长度可以为几百微米,厚在约0.5和5.0微米之间。通常,探针针尖以xy型式对表面进行光栅扫描,从而描绘表面性质的局部差异。用于生物分子成像和/或探针分子检测的SPM方法是本领域已知的(如Wang et al.,Amer.Chem.Soc.Lett.,12:1697-98.1996;Kim etal.,Appl.Surface Sci.130,230,340-132:602-609,1998;Kobayashi et al.,Appl.Surface Sci.157:228-32,2000;Hirahara et al.,Phys.Rev.Lett.85:5384-87,2000;Klein et al.,Applied Phys.Lett.78:2396-98,2001;Huanget al.,Science 291:630-33,2001;Ando et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA12468-72,2001)。
扫描穿隧显微技术
扫描穿隧显微技术(STM)是被开发出来的第一个SPM技术。STM依靠在探针针尖和样品表面之间存在的量子力学电子隧道贯穿(quantum mechanical electron tunneling)。将针尖削尖成极细的点,可以小到单个原子。针尖在表面做光栅扫描,使针尖和表面距离维持在几埃,而不实际接触表面。在探针和样品之间运用微小的电压差(在毫伏到几伏的级别内),并测定针尖和样品之间的隧穿电流(tunnelingcurrent)。随着针尖在表面移动,样品的电性质和拓扑性质的差异引起隧穿电流在数量上的变化。通过用针尖扫描表面,并测定隧穿电流,可以对单独的原子进行成像。
可以利用压电元件来控制针尖的相对高度,所述压电元件具有连接至计算机的反馈控制系统(feedback control)。计算机可以实时监控电流强度,并上下移动针尖以维持相对恒定的电流。可以通过计算机来处理针尖的高度和/或电流强度,从而形成扫描表面的图像。
因为STM能测量样品的电子特性以及样品的拓扑特性,所以它能够鉴定不同类型的导电材料,如金属纳米微粒或条形码。STM也能够测量对象中的局部电子密度。利用已知的STM技术,电子密度测量可以被用来鉴定和/或表征生物分子的结构。
原子力显微技术
SPM的另一形式是原子力显微技术(AFM)。用AFM分析生物分子的方法是本领域已知的(例如,Uchihashi et al.,″Application ofNoncontact-Mode Atomic Force Microscopy to Molecular Imaging,″http://www foresight org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。在AFM中,可能有不同的操作模式,包括接触模式(contact mode)、非接触模式(non-contact mode)和轻敲模式(Tapping ModeTM)。
在接触模式中,通过保持针尖和样品间的距离恒定,并测量悬臂的偏转——通常是通过将激光从悬臂反射到位置敏感检测器上——来测定探针针尖和样品表面之间的原子力。悬臂偏转导致反射的激光束的位置变化。如在STM中一样,探针针尖高度可以用带有反馈控制的压电元件进行计算机控制,通过提高或降低探针针尖来维持相对恒定的偏转度。因为探针针尖可以在分子力范围内(即,在范德华力作用的范围内)接触样品,所以接触式AFM容易使非刚性样品变形。在非接触式中,针尖维持在样品表面上方约50到150埃的距离。针尖和样品表面之间的范德华力相互作用反映在针尖振动的相位、振幅或频率上。
在TappingModeTM中,利用压电元件以悬臂的共振频率或接近共振频率来振动悬臂。在空气中,AFM针尖以约50,000到500,000循环/秒的频率周期性地接触(轻敲)样品表面,如果在液体中则频率低些。当针尖开始接触样品表面时,振动的振幅降低。振幅的变化被用来确定样品的拓扑性质。因为AFM分析不依靠导电性,其可以用来分析非导电性材料的形态学性质。
AFM显微技术已经被用于检测各种生物分子的结构(如美国专利5,497,656;Moller et al.,Biophys.J.,77:1150-8,1999;Thundat et al.,Scanning Microsc.6:911-8,1992;Hansma et al,Nucleic Acid Res.,21:505-12,1993;Murray et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3811-4,1993)。通过将特定的抗体附着到悬臂上,已经显示了同时的目标抗原成像和抗原-抗体相互作用鉴定。
磁力显微技术
磁力显微技术(MFM)是使用磁性探针针尖(magnetic probe tip)来测量样品磁场的SPM技术。当样品被光栅扫描时,样品产生的磁场引起悬臂偏转,其通过上面描述的激光系统来监控。来自控制器的反馈不断调节样品的Z(垂直)位置,以在扫描时将悬臂偏转保持在恒定值。
为了增加灵敏性,大多数MFM仪器利用压电元件使悬臂在接近其共振频率处振动该悬臂。磁力梯度改变悬臂的共振频率。监控振动振幅或相的变化,由此产生磁力图像。在本发明某些实施方案中,可以使用MFM对磁标记探针和/或结构进行成像。
技术人员将认识到,请求保护的发明和仪器不局限于公开的SPM技术,而是可以利用任何已知的SPM成像形式。其他可能应用的SPM模式包括高频MFM(high frequency MFM)、磁阻敏感绘图(magnetoresistive sensitivity mapping,MSM)、电力显微术(electricforce microscopy,EFM)、扫描电容显微术(scanning capacitancemicroscopy,SCM)、扫描扩展电阻显微术(scanning spreading resistancemicroscopy,SSRM)、侧向力显微术(lateral force microscopy,LFM)、穿隧AFM和传导AFM(conductive AFM)。另外一个变型是化学力显微术(chemical force microscopy,CFM),其中探针针尖用化学物质进行功能化处理,扫描样品以检测化学物质和样品之间的粘附力(如Frisbie et al.,Science 265:2071-2074,1994)。另一个可能应用的SPM模式是力调制成像(force modulation imaging) (Maivald et al.,Nanotechnology 2:103,1991)。Uchihashi等(http://www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)公开了在非接触模式的AFM中使用频率调制(frequency modulation)进行生物分子成像的方法。
用于生物分子分析、检测和/或鉴定的SPM仪器可商购(如Veeco Instruments,Inc.,Plainview,N Y;Digital Instruments,Oakland,CA)。可选择地,可以使用客户定制的SPM仪器。
图像分析和参量融合
在此公开了分析使用不同成像形式获得的SPM图像的方法。目前对不同图像进行交叉参考的方法主要涉及目测法,其仅仅是对统计特征作出定性的交叉参考。在大多数情况下,只使用一种传感形式,用不同的传感形式获得的图像很少被组合起来用以分析样品的同一区域。公开的方法提供了对由不同传感形式获得的SPM图像进行定量交叉参考。
目前,通常通过在逐象素的基础上组合一系列数据(图像)来产生多特征图像,从而完成多图像融合。该技术需要将各个图像精确地对准,以在同一栅格上产生多特征图像。如果没有已知的校正标的物,该技术是极其困难的。目前的方法也不利用生物分子结构的知识来辅助SPM图像分析。
公开的方法通过图像处理过程的定量建模(quantitativemodeling),来提供纳米尺度结构的三维分析。研究之中的对象的分子模型,诸如上述讨论的A、B或Z型DNA结构或α-螺旋、β-折叠或转角的蛋白质结构,可以用于发展成SPM图像的参量化模型。此种参量化模型可以按照如下方法获得,例如,构建已知的生物分子结构的计算机建模的理论化图像(computer-modeled theoretical image),如通过不同的SPM形式成像;通过下面讨论的图像数据分析来产生参量范围。可选择地,具有已知结构的纯化生物分子可以用不同的SPM形式成像,再直接确定不同类型的已知结构的参量范围。已知结构的参量特征然后可以用于分析未知样品中是否存在已知的生物结构,或用于鉴定在样品中的已知生物分子结构。可选择地,基于与已知结构的模型的相似性,未知的对象分子可以被表征。结构模型可以用几何图元谱系(hierarchies ofgeometric primitive)来表示,或者用定义对象的表面性质水平集的概率微分方程(probabilistic differential equations)来表示。这些技术在图像分析领域是已知的。
采用不同的SPM形式获得对象的多个图像,从这些多个图像可以定量估算一种或多种参量。感兴趣的基于模型的参量可以使用已知的基于模型的图像分析工具,从SPM图像中提取出来。其中,基于模型的图像分析工具包括但不局限于PDE(偏微分方程(partial differentialequation))技术、水平集技术(level-set techniques)和活性表面技术(active surface techniques) (如美国专利6,078,681;6,195,445;6,259,802;6,345,235)。这些技术可以嵌入概率(Bayesian)估算框架,来表示模型的不确定性和仪器噪音。
由不同的成像形式获得的估算参量可以用对象的模型组合(融合)起来,以形成对象的基于参量的表征。可以将由各个图像获得的参量集和它们各自的误差界限(error bounds)组合成关于待鉴定的对象的类型和定向的最终参量估算值。通过利用一种或者多种统计分类器(statistical classifiers),对象的表征可以用于对象分类。用于表征对象的统计分类器可以包括但不局限于向量量化(vector quantization)和支持向量机(support vector machines)(如美国专利6,327,581和6,360,020)。向量量化是减少大量信息以消除过量或多余的数据同时不失去数据的必要内容的一种方法,它涉及信息的有目的应用。应用到数字化图像的向量量化方法是已知的(美国专利6,360,020)。支持向量机是基于内核的学习方法(kernel-based learning method)的一个例子。依据由特征向量(feature vectors)和预先设定的分类(predetermined classifications)表示的一组训练实例,这类学习机已经被用于训练对象分类器程序(美国专利6,157,921和6,327,581)。这样的训练实例集可以包括例如上面列举的一个或多个数据库中获得的已知的生物分子结构。
实施例
实施例1.SPM图像基于模型的融合
图1示出了用于图像参量120、140基于模型的融合145的示范性方法100。将待分析的对象的一系列特性105、125命名为特性1105到特性N125。在请求保护的主题的范围内,特性105、125实质上可以是对象的任何特征。例如,特性105、125可以代表对象的电子密度分布。可选择地,特性105、125可以代表对象的某部分的弯曲度。对象的可以用SPM成像检测到的任何特征都可以是特性105、125。
使用合适的SPM传感形式(SPM sensing modality)来获得针对每个特性105、125的数据110、130。可以料到,可以使用同一SPM形式检测到多个特性105、125。可选择地,不同的特性105、125可以被不同的SPM形式检测到。使用已知对象的物理结构的一个或多个模型150,对数据进行基于模型的分析,可以使分析115、135更精确。如上面描述的,基于模型的分析115、135可以采用多种形式。例如,当应用学习机诸如支持向量机时,一种或多种已知的生物分子结构的模型150可以用作训练数据集(training data sets)。该机器将因此“学会”依据与已知的生物分子结构的相似性来识别各种类型的生物分子。作为学习过程(learning process)的一部分,在已知的生物分子结构的一种或多种特性105、125中观察到的可变程度(degree ofvariability)可以并入到模型150中。
数据分析115、135导致产生一系列的参量120、140。在图1中示范的方法100显示了,参量120、140由各个特性105、125产生。然而,有可能多个参量120、140由单个特性105、125产生,也有可能单个参量120、140由每一个特性105、125产生,或者多个特性105、125可以用于产生单个参量120、140。参量120、140可以代表或者不代表对象的某些真实特征。例如,由核酸对象产生的参量120、140可以是B-DNA的双链分子中碱基对的重复距离()。可选择地,参量120、140可以是不直接代表对象的任何物理特征的数值和/或数学函数。
基于模型150,参量120、140可以组合或融合140,形成已知对象基于参量的表征。适于参量融合145的程序是本领域已知的,并在上面已经描述。可以使用公开的方法100,利用样品基于参量的表征来分析一个或多个图像构成的图象集,从而确定已知的对象是否存在。例如,对象可以是附着到目标核酸或蛋白上的特定探针分子。
可以使用由粗到细的分析方法(coarse-to-fine analysis process)(图2)。例如,可以使用由粗到细的策略(coarse-to-fine strategy)进行SPM成像处理,其中图像域(image field)的大部分是以低分辨率快速扫描,同时实时检测数据。在低分辨率扫描检测到对象可能存在的地方,SPM仪器可以转换为高分辨率扫描。所获得的图像将由低分辨率和高分辨率的混合数据组成。这将大大地减少扫描整个SPM域来检测对象是否存在的时间。
另一个涉及数据分析的由粗到细的方法的非限定性实例如图2所示。在该实施例中,一个或多个对象的高分辨率图像可以用由粗到细的策略来分析。如图2中所示,以粗数据集(coarse data set)205起始,针对一个或多个图象210进行参量145的融合后验分布(fusedposterior distribution)分析,以检测已知对象可能存在的位置215。然后以逐渐增加的精确度(degrees ofrefinement)分析关于所述的可能位置的数据集,直到能以充分的确定度(degree ofcertainty)鉴定该对象。操作人员可以选择确定度,或可以预先设定确定度。一旦发现已知对象的可能位置215,就可以在各个选择的位置继续分析。对第一个可能位置进行分析220,从所述粗数据集提炼数据225,来产生更精确的数据集。分析所述的精练的数据集,确定是否存在已知的对象230。
精练的数据集230的分析可指示已知对象的存在。然后确定对象鉴定的确定度235。可以具有充分的确定度235地确定已知对象被鉴定位于第一位置,在这种情况下,在那个位置指示出已知对象的阳性鉴定255。做出其它可能的位置是否需要分析的决定260。如果需要,则在下一个可能的位置进行分析265,重复该过程,以粗数据集的精练作为起始225。如果没有其它潜在的位置需要分析,结束分析270。
对精练数据集的分析230可能表明已知对象不存在,或其可能表明已知对象存在,但不十分确定。在这种情况下,做出是否否定该位置的决定240。如果不否定该位置,那么进一步提炼该数据集245,使用更精练的数据集重复进行分析250。如果否定该位置,那么做出是否对其它可能的位置进行分析的决定260。当所有可能的位置或以最高的精练度被分析或被否定时,结束分析270。
在一个非限制性实施例中,可以首先分析看上去最有可能存在已知对象的潜在位置。余下的位置可以按照存在已知对象的可能性的次序进行分析。
图2是分析过程的简化图,为了示范的目的。可以在该过程中进行其他处理,它们可以按照与图2显示的不同的次序执行。图2仅仅示出了确定特定的已知对象是否存在的分析。在其他可选择的分析中,一组图像可以被分析,确定是否同时存在多种不同的已知对象。
图3示出了分子结构基于参量的表征的形成340,其利用了由不同形式的扫描探针显微技术形成的图像310、315、320。该图只是示范性的,额外的或不同的SPM形式也可以使用。如图3显示,可以使用不同的传感形式(sensing modalities)的SPM来获得分子结构的多个图像310、315、320。关于参量325的数据可以来自各个图像。此外,一个或多个已知对象的分子结构的物理模型330可以提供基于模型的知识335。可以组合或融合数据325和基于模型的知识335,可以形成分子结构基于参量的表征340。形成的表征340然后可以用于确定在样品中是否存在特定的分子结构,诸如特定的蛋白、肽或核酸序列。
图4示出了在请求保护的主题范围内的分子结构鉴定体系的非限制性实施例。为清晰的目的,图4没有包含所有可以包含在此类系统中的组分。显示在图4中的组分可以包括多个亚组分,或可以用其他组分或组分的组合实现所示组分的功能。如图4中所示,系统400可以包含扫描探针显微镜405、控制器415和存储器420。扫描探针显微镜405可以具有以两种或者更多种传感形式410进行操作的能力。在图4中,传感形式以原子力显微技术(AFM)、扫描隧道显微技术(STM)和磁场显微技术(MFM)为例。然而,用于公开的方法和装置中的形式不局限于这些例子。控制器415可以控制系统操作,可以包括处理器、反馈系统和其他元件。
存储器420可以包括已知的分子结构的一个或多个基于参量的表征425,如图4显示,为表征1到表征N425。在鉴定特定分子结构是否存在于样品的操作中,控制器415可以指导扫描探针显微镜405的操作,利用合适的传感形式410来获得样品的图像。获得的图像可以被分析,并与存储在存储器420中的已知分子结构基于参量的表征425相比较,来检测样品中是否存在已知的分子结构。
实施例2.基质制备和分子附着
各种基质可以用于生物分子成像。成像是缓慢的(分钟数量级),分子移动是快速的(比秒小的数量级)。因此,为了限制分子移动,样品可以吸附到基质上,变为晶格(crystal lattice)的一部分。利用云母对DNA进行AFM成像,便是这一概念的一个示例。DNA通过磷酸盐骨架(phosphate backbone),利用二价金属如Ni2+或Mg2+结合云母。DNA和云母都是带负电荷的,必须使用抗衡离子诸如Mg2+或Ni2+将DNA吸附到云母上(Biophys.J. 70:1933,1996;PNAS 94:496,1997;Biochemistry 36:461,1997)。二价阳离子充当抗衡离子,作用在带负电荷的DNA骨架上,也给予了额外的电荷,这样便可结合云母。AP-云母(功能化的氨丙基云母)已被用来结合DNA,用于AFM(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:496,1997)。
退火金云母基质(Annealing Gold-on-Mica Substrate)
利用Sutter Instruments P-2000毛细管生成器(capillary puller),拉出外径为100mm、内径为0.75mm的石英毛细管,制得石英毛细管喷枪(quartz capillary torch)。在毛细管内径为约200μm的地方,刻划并折断玻璃。将表面磨平,并用3M特级磨光膜(lapping film)磨光。在加热块上,在130℃加热石英片5分钟。用氢气喷枪,用石英尖部的1.5英寸火焰烧蚀所述片。用镊子将新鲜的金基质(涂面朝上)置于片中央。用预先火焰处理的1cm×1cm×1mm石英块压制基质,石英块仅接触云母表面,并加热5分钟。石英毛细管喷枪与片的平面保持30°,这样火焰焰尖刚好接触金表面。火焰以每秒2英寸的速度在金表面反复移动(45分钟)。在氩气中将基质保存于其最初的容器中,直到使用。
DNA沉积于基质上
将DNA沉积在云母上,并用AFM扫描。可以使用一群在1-10Kb范围内的、不同大小的质粒DNA分子(长度差异1,000个碱基),获得AFM图像(未显示)。
实施例3.STM成像
金纳米微粒
用金纳米微粒和λDNA获得AFM图像。使用的基质是聚L-赖氨酸包被的玻璃盖片和氨基处理的云母(AP-mica)。用3-氨丙基三乙氧基硅烷对新鲜切割的云母进行气相处理,获得AP-云母。50nm、10nm、5nm和2nm的金纳米微粒购自Ted-pella Inc.(Redding,CA)。对于聚L-赖氨酸盖片基质,将10μl的金胶体溶液在盖片上干燥。对于AP-云母,将100μl的金胶体溶液置于基质上15分钟。然后用Kimwipe吸去过量的溶液。使用Digital InstrumentsNano以轻敲模式AFM对AP-云母基质进行AFM成像,显示了光滑、无斑点的表面。AP-云母是用于固定金纳米微粒的良好表面。50nm的金纳米微粒容易用AFM成像(未显示)。5和1 0nm的金纳米微粒也可以清晰地用AFM观察到(未显示)。尽管图像分辨率不如较大的纳米微粒,但2nm的金纳米微粒也可以各个地被辨别(未显示)。
有可能在1 0、5和2nm的金纳米微粒混合物中,区别不同大小的纳米微粒(未显示)。根据使用轻敲模式AFM时测量的高度,可以区分2和5nm纳米微粒。这些结果显示,基于不同大小的纳米微粒的SPM标记可以用SPM成像技术区别开来。
在其他的非限制性实施例中,将20μl的聚赖氨酸溶液(0.01%,购自Sigma Chemicals,St.Louis,MO)置于云母基质上约5分钟,然后用纳米纯水(18Mn)清洗,并在过滤过的N2气中干燥。将金纳米微粒(来自Polysciences或Ted-Pella Inc.)超声处理30秒。将25μl未稀释的纳米微粒样品置于聚L-赖氨酸包被的云母上约10分钟,然后用纳米纯水(nanopure water)清洗,在过滤过的N2气中干燥。用DigitalInstruments Nano在轻敲模式AFM下,获得图像(未显示)。[0103]λDNA的Hind III消化产物也用AFM成像。在HEPES缓冲液(40mM HEPES、5mM NiCl、pH 6.8)中制备1μg/ml的消化λDNA溶液。将30μl DNA溶液样品沉积到处理过的云母基质上10分钟,用纳米纯水清洗,并在N2下干燥。消化的λDNA的AFM图像显示于图5中。通过AFM成像,双链DNA分子清晰可见。
富勒烯
实施例4.核酸对准
用微流态分子梳对λDNA进行对准。在覆盖基质的PDMS层上制备微流态通道(microfluidic channel)。依据Anderson等(″Fabricationof topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMSby rapid prototyping,″Anal.Chem.72:3158-3164,2000),通过模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备微流态通道。基质可以包括,例如按上述方法制备的AP-云母或金包被的基质。样品可以被引入到微流态通道一端的腔室里,而通道另一端的储存室内则为真空。通道内加入一个或者多个柱子,使得分子可以通过分子梳进行对准。除去PDMS层,用纳米纯水漂洗基质,用N2干燥。使用多个腔室和/或微流态隧道、不同形状的微流态组分、通道内不同的微流态流(microfluidic stream)和不同结构,可以形成各种对准。
图6和图7示出了λDNA分子的实施例,用MMC方法对准。完全展开并对准的λDNA约17μm长。对准的分子与微流态流动方向平行,如期望的那样。该结果证明了在表面对准分子的可行性。将分子对准有助于用SPM成像技术对它们进行成像和鉴定。
实施例5.基于寡核苷酸的SPM探针的AFM成像
在非限制性的实施例中,SPM探针可以被制备成一套杂交在一起的短寡核苷酸序列,如图8所示。图中的每条线代表单个合成的寡核苷酸,在上链上有9个,下链上有4个。杂交产生了可由SPM技术成像的分支点(branch points)。可选择地,所述分支点可以作为金属纳米微粒或其他标记物的附着点,如上所述。图9提供了示范性的寡核苷酸探针序列,显示了相互杂交的上链和下链序列。为了清楚起见,图9未显示分支序列(branch sequences)。图10示出了形成编码探针的上链的9条独立寡核苷酸的全序列。指出了相互杂交以形成分支点的部分。例如,标记“A”的PT1(SEQ ID NO:1)3′端与标记“A’”的PT2(SEQ ID NO:2)5′端杂交。类似地,B结合B’,C结合C’,等等。
用上面所述的AFM技术对示范性的编码探针进行成像。图11中的箭头指出了编码探针的AFM图像。为了比较,将线形2.8 kb的质粒双链DNA分子显示在编码探针的旁边。
本领域技术人员将认识到,请求保护的方法和装置不局限于本文中公开的实施例,而是可以在请求保护的主题范围内进行修饰和改变。说明书和附图因此可以看作示范性的而不是限制性的。
Claims (24)
1.一种检测和鉴定分子结构的方法,包括:
a)在分析之前,将生物分子附着到表面上并且通过分子梳在所述表面上以平行的方式对准所述生物分子;
b)用至少两种不同形式的扫描探针显微技术(SPM)对所述生物分子进行成像;
c)使用基于模型的分析,利用已知生物分子的一个或多个物理结构模型来分析所述图像;
d)由所述图像获得一个或多个参量的值的估量和与一个或多个参量的值的所述估量相关的误差;
e)融合由不同的图像获得的估量参量和所述误差,以获得最终参量估量;和
f)鉴定所述生物分子的结构,
其中所述分子梳包括将所述生物分子附着到所述表面并且利用抽出所述生物分子通过移动的弯月面将所述附着的生物分子对准。
2.权利要求1的方法,其中所述融合基于所述生物分子的物理结构的模型。
3.权利要求1的方法,进一步包括鉴定所述生物分子。
4.权利要求3的方法,进一步包括将所述一个或多个融合参量与由已知生物分子确定的参量相比较,从而鉴定是否存在已知生物分子。
5.权利要求1的方法,其中SPM成像包括选自下列形式的至少两种形式:原子力显微术(AFM)、扫描穿隧显微术(STM)、侧向力显微术(LFM)、化学力显微术(CFM)、力调制成像、磁力显微术(MFM)、高频MFM、磁阻敏感绘图(MSM)、电力显微术(EFM)、扫描电容显微术(SCM)、扫描扩展电阻显微术(SSRM)、穿隧AFM和传导AFM。
6.权利要求1的方法,其中所述参量通过水平集技术、PDE(偏微分方程)技术和/或活性表面技术来估量。
7.权利要求6的方法,进一步包括将所述技术嵌入到概率(贝叶斯)估算框架,来表示模型的不确定性和仪器噪音。
8.权利要求1的方法,进一步包括将向量量化、支持向量机和/或统计分类器运用于所述融合的参量,从而对所述生物分子进行分类。
9.权利要求8的方法,进一步包括利用已知的生物分子结构来产生训练数据集。
10.权利要求1的方法,进一步包括利用已知的生物分子结构来获得每类生物分子的参量范围。
11.权利要求10的方法,其中所述已知生物分子的参量范围被用于估量所述参量。
12.分子结构鉴定系统,包括:
a)包括分子结构的表面,所述分子结构在分析以前通过分子梳以平行的方式对准;
b)用于拍摄图像的具有多种成像形式的扫描探针显微镜;
c)控制扫描探针显微镜的操作的控制器;和
d)包括一个或多个已知分子结构的表征的存储器;
其中所述控制器包含处理器,其被设定用于由所述图像获得一个或多个参量的值的估量和与一个或多个参量的值的所述估量相关的误差和融合由不同的图像获得的估量参量和所述误差,以获得最终参量估量,其中所述分子结构是生物分子,并且所述分子梳包括将所述生物分子附着到所述表面并且利用抽出所述生物分子通过移动的弯月面将所述附着的生物分子对准。
13.权利要求12的系统,其中所述的已知结构的表征代表来自多个已知的生物分子结构的融合参量的集合。
14.权利要求13的系统,其中所述的已知结构的表征被用于分析一组SPM图像。
15.权利要求14的系统,其中所述的SPM图像被分析,以鉴定样品中是否存在一种或多种已知结构。
16.权利要求15的系统,其中所述SPM图像按下面方法分析:(i)分析粗数据集,以检测已知结构可能出现的位置;和(ii)再一次或多次重新分析可能的出现位置,每一次分析利用比在前分析中所利用的数据集更精练的数据集。
17.权利要求15的系统,其中所述多个图像形式选自:原子力显微术(AFM)、扫描穿隧显微术(STM)、侧向力显微术(LFM)、化学力显微术(CFM)、力调制成像、磁力显微术(MFM)、高频MFM、磁阻敏感绘图(MSM)、电力显微术(EFM)、扫描电容显微术(SCM)、扫描扩展电阻显微术(SSRM)、穿隧AFM和传导AFM。
18.权利要求1所述的方法,其中分子梳包括微流态分子梳。
19.权利要求1所述的方法,其中分析包括同时分析多个不同的已知生物分子的存在。
20.权利要求1所述的方法,其中分析包括纳米级结构的三维分析。
21.权利要求1所述的方法,其中分析包括确定所述生物分子的一级结构。
22.权利要求1所述的方法,其中分析包括确定所述生物分子的二级结构。
23.权利要求1所述的方法,其中分析包括确定所述生物分子的三级结构。
24.权利要求1所述的方法,其中分析包括确定所述生物分子的四级结构。
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