CN1742201A - 使用荧光聚合物和猝灭剂－系链－配体生物缀合物的生物传感方法 - Google Patents

使用荧光聚合物和猝灭剂－系链－配体生物缀合物的生物传感方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了由一种生物素酰化的荧光聚合物和一种生物素结合蛋白形成的复合物以及由荧光聚合物复合物包被的固体支持体。该复合物可用作传感器以检测生物学识别活动(例如核酸杂交反应或酶诱导的多肽切割)。本发明还描述了生产该复合物的方法及使用该复合物检测样品中靶分析物的存在和/或量的方法。所述靶分析物可以是酶(例如β－分泌酶)或核酸(例如单链或双链核酸)。

Description

使用荧光聚合物和猝灭剂-系链-配体生物缀合物的生物传感方法
本申请要求申请日为2002年11月14日的美国专利申请系列号60/426,034的优先权，该申请全文在此通过引用并入本申请。
本申请与申请日为2001年5月8日的美国专利申请系列号09/850,074和申请日为2003年7月18日的美国专利申请系列号10/621,311相关。这些申请全文在此通过引用并入本申请。
根据Defense Advanced Research Projects Agency(DARPA)授予的MDA972-00-C-006号合同，美国政府拥有本申请已付费的许可并在有限情况下具有要求专利权人许可他人在合理条件下实施发明的权利。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及分子传感器及涉及检测分子间相互作用的方法。特别地，本发明涉及荧光聚合物复合物和在生物传感应用中使用该复合物的方法。
技术背景
酶联免疫吸附测定(即ELISA)是鉴别广泛的蛋白质、抗体、细胞、病毒等的存在和生物学活性而最普遍使用和公认的技术。ELISA是一种多步骤“夹心分析方法”，其中首先将分析物生物分子与表面附着的一种抗体结合。然后将第二种抗体与该生物分子结合。在一些情况中，第二种抗体附着于随后“产生”扩增反应的一种催化酶。在其它情况中，该第二种抗体是生物素酰化的抗体以结合第三种蛋白质(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素)。这一蛋白质附着于一种酶，以产生放大的比色变化的化学级联，或者附着于一个荧光团以进行荧光标记。
尽管ELISA具有广泛应用，但仍有许多缺点。例如，由于这一多步骤的方法需要精确控制试剂和显色时间，因此其耗费时间并趋于“假阳性”。另外，它还要求小心的洗涤以除去非特异性吸附的试剂。
荧光能量共振转移(即FRET)技术已被用于基于聚合酶链反应(PCT)的基因测序和免疫分析。FRET使用分析物生物分子的同源结合以激活在未结合状态(off-state)下呈猝灭状态的染料的荧光。在FRET技术的一个典型例子中，一种荧光染料与一种抗体(F-Ab)连接，并且这个二联体被结合到一种与猝灭剂连接的抗原(Ag-Q)上。结合的复合物(F-Ab:Ag-Q)通过能量转移猝灭(即无荧光)。在存在与Q(Ag)不相连的相同分析物抗原的情况下，Ag-Q二联体被定量置换，如通过[Ag-Q]/[Ag]相对浓度确定的平衡结合概率确定。这将FRET技术限制为一种定量分析，其中抗原是已被充分表征的，并且在每种新情况中必须设计将抗原与Q连接起来的化学。
其它FRET底物和分析在US 6,291,201以及如下文章中被公开：Anne，et al.，″High Throughput Fluorogenic Assay for Determination ofBotulinum Type B Neurotoxin Protease Activity″，AnalyticalBiochemistry，291，253-261(2001)；culmines.etal.，A Peptide BasedFluorescence Resonance Energy Transfer Assay for BacillusAnthracisLethal Factor Protease″，Proc.Natl.Acad.Scie.99，6603-6606(2002)；及Mock，et al.，″Progress in Rapid Screening of BacillusAnthracis LethalActivity Factor″，Proc.Natl.Acad.Sci.99，6527-6529(2002)。
应用分子内猝灭的荧光底物的其它分析在如下文章中被公开：
Zhong.et al.，Development of an Internally Quenched FluorescentSubstrate for Escherichia Coli Leader Peptidase″，AnalyticalBiochemistry 255，66-73(1998)；Rosse.et al.，″Rapid Identification ofSubstrates for Novel Proteases Using a Combinatorial Peptide Library″，J.Comb.Chem.，2，461-466(2000)；及Thomson et al.，″A BODIPYFluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpains andOther Proteases″，Analytical Biochemistry，279，170-178(2000)。也已经公开了其中荧光偏振中的改变已经测定并用于分析物量的量化分析。见例如Levine，et al.，″Measurement of Specific Protease ActivityUtilizing Fluorescence Polarization″，Analytical Biochemistry 247，83-88(1997)。也见例如Schade.et al.，″BODIPY-a-Casein，a pH-IndependentProtein Substrate for Protease Assays Using Fluorescence Polarization″，Analytical Biochemistry 243，1-7(1996)。
然而，仍需要快速和精确地检测和量化具有高灵敏性的生物相关分子的技术。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了一种制备用于检测生物学识别活动的传感器的方法。所述方法包括将一种生物素酰化的荧光聚合物与一种生物素结合蛋白在水溶液中组合以形成一种复合物，其中所述复合物包含游离的生物素结合位点。生物素酰化的荧光蛋白(例如藻红蛋白或藻胆体)可以与生物素酰化的荧光聚合物及生物素结合蛋白组合。该复合物可以置于固体支持体(例如微球体，纳米颗粒或珠)的表面上。该固体支持体可以是硅基或乳胶微球体。该固体支持体的表面可包含铵官能团。该生物素结合蛋白可以选自由以下所组成的组：抗生物素蛋白，链霉抗生物素和中性链亲和素(neutravidin)。
上述方法可进一步包括向溶液中加入一种生物素酰化的生物缀合物，该生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸序列，一种肽核酸序列或一种多肽序列，其中所述生物素酰化的生物缀合物与复合物中游离的生物素结合位点结合。根据一个实施方案，生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸或肽核酸序列，且生物学识别活动是生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列与靶分析物的核酸杂交。根据该实施方案的方法还可包括向溶液中加入第二种生物缀合物，其包含一种猝灭剂和一种多核苷酸或肽核酸序列，其中所述猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭(amplified super-quenching)，其中第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列能与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交。第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列可以与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列互补。
根据另一个实施方案，生物素酰化的生物缀合物包含一种多肽序列及能一种导致荧光聚合物放大的超猝灭的猝灭剂，生物学识别活动是酶诱导的多肽序列的切割。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于检测生物学识别活动的传感器，其包含一种生物素酰化的荧光聚合物与生物素结合蛋白的复合物，其中所述复合物包含游离的生物素结合位点。该复合物可置于固体支持体的表面上(例如微球体，纳米颗粒或珠)。该固体支持体可以是一种硅基或乳胶微球体。包含一种多核苷酸序列，一种肽核酸序列或一种多肽序列的生物素酰化的生物缀合物可以与该复合物结合。例如，该生物素酰化的生物缀合物可包含一种多核苷酸或肽核酸序列，生物学识别活动可以是生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列与靶分析物的核酸杂交。或者，该生物素酰化的生物缀合物可包含一种多肽序列和一种猝灭剂，其中所述猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，其中生物学识别活动是酶诱导的多肽序列的切割。该生物素结合蛋白可以是抗生物素蛋白，链霉抗生物素或中性链亲和素。固体支持体的表面可包含铵官能团。该传感器还可以包括一种生物素酰化的荧光蛋白(例如藻红蛋白或藻胆体)，其与生物素酰化的荧光聚合物和生物素结合蛋白形成一种复合物。
本发明还提供了一种传感器，其包含置于固体支持体上的生物素酰化的荧光聚合物、生物素结合蛋白和生物素酰化的生物缀合物的一种复合物，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸或肽核酸序列，其中生物素酰化的生物缀合物进一步包含一种能导致荧光聚合物放大的超猝灭的猝灭剂。根据这一实施方案，所述多核苷酸序列位于生物素酰化的生物缀合物上猝灭剂和生物素之间。本发明还提供了使用如上述传感器来检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，包括将样品与传感器进行组合(例如在溶液中)。根据这一实施方案，靶分析物包含能与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交的多核苷酸序列，并且靶分析物与生物素酰化的生物缀合物的杂交导致猝灭剂与固体支持体表面分离增强并伴随着荧光增加。
根据本发明的另一个实施方案，包含如上述被置于固体支持体上的荧光聚合物的所述传感器可进一步包含一种生物素酰化的生物缀合物，所述生物缀合物包含与系链(tether)上第一个和第二个位置缀合的一种配体和一种生物素组分，其中所述配体包含能导致荧光聚合物放大的超猝灭的一种猝灭剂组分，其中所述配体能参与生物学识别活动。根据这一实施方案，在第一个和第二个位置之间的系链部分具有一定长度和柔性，由此生物学识别活动的发生导致猝灭剂与固体支持体表面分离并伴随着荧光增加。该配体可包含一个多肽序列。第一个和第二个位置之间的系链部分可包含由如下化学式表示的一个重复单位：
Figure A20038010874800151
其中n是一个正整数。本发明还提供了一种使用上述传感器来检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法。所述靶分析物可以是孢子，细胞，细菌或病毒。本发明还提供了一种用于检测生物学识别活动的传感系统，其包含上述传感器及第二种固体支持体，该支持体包含置于其表面上的众多靶组分，其中配体可以与靶组分相互作用使得猝灭剂与荧光剂分离，从而增加荧光聚合物的荧光。第二种固体支持体可以是一种微球体(例如硅基或乳胶微球体)，纳米颗粒或珠。本发明还提供了一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括将所述传感系统与样品组合，其中靶分析物可以识别配体并与之相互作用，其中靶分析物与配体的相互作用导致荧光降低。所述配体可包含一种多肽，并且生物学识别活动可以是配体的多肽与包含一种多肽的靶分析物之间的相互作用。
根据本发明的第三方面，提供了一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括将样品与一种包含一种核苷酸序列、一种肽核酸序列或多肽序列的生物素酰化的生物缀合物及一种包含上述荧光聚合物复合物的传感器组合。当生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸或肽核酸序列时，所述方法可进一步包括将所述样品与第二种生物缀合物组合，该第二种生物缀合物包含一种猝灭剂及一种多核苷酸或肽核酸序列，其中猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，且其中第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列能与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交。根据这一实施方案，靶分析物包含一种多核苷酸序列，其能与生物素酰化的生物缀合物或第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交。例如，第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列可以与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列互补。根据本发明的另一个实施方案，将传感器与生物素酰化的生物缀合物组合，由此生物素酰化的生物缀合物与传感器复合，随后将样品与传感器/生物素酰化的生物缀合物复合物一起保温，接着向保温的样品中加入第二种生物缀合物。根据本发明的另一个实施方案，靶分析物的核苷酸序列可包含一个双链核酸。根据这个实施方案，所述方法进一步包括：在存在第二种生物缀合物的情况下将保温的样品加热至足以使样品中双链的核酸解链的温度；冷却样品以使得双链体形成。样品中存在的靶分析物与第二种生物缀合物之间的双链体形成导致荧光增加。或者，生物素酰化的生物缀合物可包含一种多肽序列和一种猝灭剂，并且该靶分析物可以是一种能切割该多肽序列的一种酶(例如β-分泌酶)。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于检测靶生物学物种的传感器，其包含：在其表面上包含受体的众多配体的细菌芽孢或病毒；置于细菌芽孢或病毒表面上的荧光聚合物或荧光聚合物复合物；及众多的生物缀合物，其包含一种与配体的受体缀合的猝灭剂，其中所述受体和配体相互作用，并且受体与配体的相互作用导致荧光聚合物的荧光放大的超猝灭。本发明还提供了一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括：将样品与上述传感器一起保温，其中靶分析物识别受体并与之相互作用，并且靶分析物与受体的相互作用导致荧光增加。该靶分析物可以是在其表面上包含受体的众多配体的细菌芽孢或病毒。
附图简述
通过参考以下附图可以更好地理解本发明。
图1图示了根据本发明的一个分析，其中含有QTL的DNA被用于检测具有与含有QTL的DNA互补的碱基序列的靶分析物；
图2A-2C图示了根据本发明的一个分析，其中具有一个柔性系链的QTL生物缀合物被用于检测多价的分析物；
图3图示了本发明的多价抗原珠(MAB)的合成；
图4图示了本发明的荧光聚合物标记的失活靶的合成与应用；
图5表示根据本发明的一个实施方案的传感器制作的反应方案，其中将中性链亲和素与聚合物重复单位的混合物复合，然后所得的聚合物-蛋白质复合物通过静电作用沉积在铵功能化的微球体的表面上；
图6表示一种用于DNA检测的分析，其中猝灭剂标记的靶与传感微球体的表面上的互补捕获链的靶相互竞争；
图7图示的是通过各种寡核苷酸及寡核苷酸混合物猝灭PPE荧光；
图8图示的是具有基于PNA的捕获链的微球体传感器的错配分析。
发明详述
US 09/850,074公开了生物缀合物，其包含与猝灭剂(Q)经系链(T)连接的靶生物分子的配体(L)，所述猝灭剂与荧光聚合物(P)相结合并使其猝灭，所述文献在此通过引用将其全文并入本发明中。这些生物缀合物(称为QTL生物缀合物)利用荧光聚电解质的超猝灭，通过例如电子转移或能量转移猝灭。荧光聚合物(P)可以与QTL生物缀合物形成一种结合的复合物，通常具有与所述荧光聚合物相反的电荷。QTL生物缀合物包括一种通过共价键系链与特异于特定的生物分子的配体(L)连接的猝灭剂(Q)。QTL生物缀合物的配体与生物分子的结合将QTL生物缀合物与荧光聚合物分离，或者以可易于检测的方式修饰其猝灭，由此通过荧光改变而感应所述生物分子。以这种方式，生物分子可在非常低的浓度检测到。
也已经论证了将荧光聚合物包被在支持体如乳胶或硅基珠或纳米颗粒上可导致超猝灭增加，并由于与大分子如蛋白质或核酸的非特异性相互作用而伴随着荧光变化的降低。结果，设计了这样的分析，即利用共同位于同一颗粒上的荧光聚合物和受体，由此QTL与荧光聚合物的相互作用通过QTL缀合物的L部分与特异性受体的结合而介导。这种类型的分析在2002年3月18日提交的美国专利申请US10/098,387中公开，该专利在此处通过引用将其全文并入本发明。这些分析典型地是竞争分析，其中分析物由表面结合受体识别的L序列组成或含有该序列。L与受体的结合因此在聚合物或聚合物集团(polymer ensemble)中产生很小的或不产生荧光改变。然而，通过与受体结合的QTL结合导致荧光猝灭。
1.用于在溶液中及以位于支持体上的形式进行传感的预形成聚合物-蛋白质复合物
如上所述，QTL-聚合物超猝灭分析已经通过将荧光聚合物如聚阴离子聚亚苯基亚乙炔基(1)：
Figure A20038010874800191
或生物素酰化的聚亚苯基亚乙炔基(2)：
Figure A20038010874800201
和一个受体共同定位于一个支持体如乳胶或硅基珠或纳米颗粒上而构建。典型地，所述受体可以是抗体、蛋白质、寡核苷酸或其它配体。受体和/或聚合物可以通过生物素-抗生物素蛋白结合而固定在支持体上。一种生物素结合蛋白(抗抗生物素蛋白，中性链亲和素或链霉抗生物素)可以在加入聚合物或受体之前与支持体共价连接。
本发明提供了另一种共同定位荧光聚合物和受体的方式，包括生物素酰化的荧光聚合物(例如聚合物2)与生物素结合蛋白在溶液中的最初复合。聚合物2含有一些可利用的生物素，然而仅可结合这些蛋白质的每一种所提供的4个生物素结合位点中的一个或至多两个位点。这部分是由于PPE聚合物的大节段的“刚性棒”性质所致。
然而，向水溶液中的生物素结合蛋白如中性链亲和素加入生物素酰化的荧光聚合物如上述聚合物2，导致了聚合物通过蛋白质而交联。就聚合物2而言，这种交联伴随着聚合物荧光的中等增加及如光散射而所显示出的集团大小显著增加。根据生物素结合蛋白与聚合物的比率，以及精确的加入顺序，所得生物素酰化的荧光聚合物和生物素结合蛋白的集团可含有中等数目的游离生物素结合位点，其可用于固定特异的生物素酰化的受体如抗体、蛋白质、寡核苷酸或肽。当生物素功能化的受体含有一个猝灭剂时(作为受体的一部分或作为受体-QTL复合物)，可以发生聚合物荧光的有效猝灭。
生物素结合蛋白/生物素酰化的荧光聚合物集团可以包被在固体支持体上。例如，将中性链亲和素：聚合物2集团(即1中性链亲和素：15聚合物重复单位)包被在用季铵基团功能化的乳胶微球体上。所得微球体是高度荧光性的。这种荧光性可以通过加入生物素-猝灭剂缀合物而特异性猝灭。相反，加入不含有生物素的猝灭剂导致很低的非特异性猝灭。用相同组成的溶液相中性链亲和素：聚合物2集团观测到猝灭略微增强。
因此一种优选的聚合物-生物素结合蛋白复合物提供了在溶液中或在支持体上的形式传感应用的基础。在这两个“平台”中，所述复合物表现出了某些优势。首先，受体与聚合物的密切接近被确定。其次，所述集团很少与试剂如蛋白质、小的有机分子和无机离子非特异性地相互作用。另外，对所述分析进行广泛调整也是可能的。例如，对如下一或多个参数可以改变：生物素结合蛋白与生物素酰化的聚合物的比率、聚合物上生物素密度、加入顺序、或者所使用的特异性生物素结合蛋白。以这种方式，所述分析可以适合特定应用。另外，复合物的总电荷可以通过改变聚合物上带电侧链基团或者通过改变生物素结合蛋白而调整。因此可以选择复合物以增强或消除与其它蛋白质的非特异性结合，与其它生物分子(例如DNA或PNA)的非特异性结合，或者与带电或中性的表面的非特异性结合。
2.基于荧光聚合物超猝灭的对单链和双链DNA的分析
用荧光聚合电解质进行感应可用于寡核苷酸-寡核苷酸识别。例如，最近已经报道了基于QTL的单链DNA的感应[Kushon，etal.，Langmuir，18，7245-7249(2002)]。在最简单的情况中，单链“靶”DNA序列可以与互补的“捕获”单链结合，由此调节(猝灭或增强)聚合物或聚合物集团的荧光。其中一个方法包括使用与“靶”序列互补的生物素酰化的DNA捕获链。已经公开了在存在未知量的靶分析物的情况下，使用已知量的猝灭剂标记的靶(DNA-QTL)的竞争分析。在这些分析中，生物素酰化的捕获链与含有荧光聚合电解质和生物素聚合蛋白如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或中性链亲和素的珠支持体结合。生物素酰化的捕获链与珠的结合(通过生物素-抗生物素蛋白结合)导致很少的聚合物荧光改变或无改变。另外，生物素酰化的捕获链-靶分析物双链体与珠的结合导致很少的荧光改变或无改变。然而，生物素酰化的捕获链-DNA-QTL双链体与具有先结合的生物素酰化的捕获链的珠或者DNA-QTL的结合导致聚合物荧光强猝灭。
DNA-QTL与靶分析物之间对预先与珠结合的生物素酰化的捕获链的直接竞争导致低检测灵敏度，这是因为DNA-QTL与捕获链的(动力学)结合(相比于未标记的分析物)更快。然而，分析物与珠结合的捕获链的逐步结合及随后加入DNA-QTL提供了一种灵敏而简便的定量分析方法。通过预先保温生物素酰化的捕获链、DNA-QTL及分析物单链DNA，及随后将该混合物暴露于荧光聚合物包被的珠，也获得了一种相似的灵敏度分析。对于后两种分析，荧光水平随着单链分析物DNA的浓度增加而增加。
上述分析应用单链DNA及包括使用含有与靶分析物相同碱基序列的DNA-QTL。另一种分析模式示于图1。这个分析模式包括使用具有与靶分析物互补的碱基序列的DNA-QTL。
如图1所示，能量转移或电子转移猝灭剂可以与所述链的一个末端共价结合以产生DNA-QTL。也如图1所示，具有与靶分析物相同序列的生物素酰化的链及在所述链的一个末端上的生物素可用作捕获链。生物素酰化的捕获链与荧光聚合物包被的珠的结合导致聚合物的荧光水平很少改变或无改变。然而，DNA-QTL与珠结合的捕获链之间的双链体形成导致聚合物荧光猝灭，这是因为聚合物与DNA-QTL上猝灭剂之间的紧密结合所致。
为完成单链分析物DNA的分析，分析物(未知水平)和DNA-QTL可以与含有生物素酰化的靶的珠悬浮液混和。靶分析物与DNA-QTL之间的双链体形成除去了“游离”DNA-QTL，从而抑制了在没有靶的情况中将会发生的聚合物的猝灭。以这种方式，可以提供一种简便而相似的单链分析物的定量分析。
上述分析材料也可以提供一种简便而相似的模式以读出以双链体存在的靶分析物。例如，含有分析物及具有与分析物互补的碱基序列的双链体DNA-QTL的样品可以加至含有共定位的荧光聚合物和生物素酰化的捕获试剂的固体支持体(例如珠的悬浮液)，随后将温度加热至足以使双链体“解链”的温度。这在将混合物恢复至环境温度之后，导致DNA-QTL与单链分析物配对及与样品中靶链的水平成比例的荧光猝灭的减弱。
与那些先前报道的及上述相似的分析可以使用肽核酸的生物素酰化的肽核酸捕获链(即生物素酰化的PNA)构建。生物素酰化的PNA在与靶分析物DNA或DNA-QTL的互补序列的配对中呈现相似的选择性，但提供了更强的双链体，并因此在单链靶分析物分析中可提供更高的灵敏性。生物素酰化的PNA作为捕获链的一个优势是DNA-PNA结合的更高强度提供了对通过链入侵而形成的双链靶在环境温度进行相似分析的基础。
另一种DNA检测方法包括使用生物素酰化的DNA-QTL。将缀合物中生物素和猝灭剂置于相反端。当暴露于携带生物素结合蛋白的聚合物包被的微球体时，生物素-DNA-QTL变为通过生物素而附于表面。另外，由于应用的猝灭剂的普遍(general)疏水性，猝灭剂标记的末端折叠回表面上，使得猝灭剂猝灭表面上的聚合物。然而，在存在靶链的情况中，生物素-DNA-QTL杂交成DNA双链体。已知DNA双链体与单链DNA相比相对刚性。因此，双链体的形成可导致猝灭剂与表面的距离增加，因为DNA易于与靶杂交而导致生物素-DNA-QTL不能折叠回到表面上。结果，猝灭水平可被降低。
3.基于使用长的柔性系链(例如亲水性聚合的系链)的传感模式
如上所述，基于荧光聚合物的猝灭/非猝灭聚合物或聚合物集团的生物传感中使用的QTL缀合物典型地由三种成分组成：猝灭剂(Q)、系链(T)及配体或受体(L)。超猝灭的程度，无论通过能量转移还是电子转移，均依赖于猝灭剂与荧光聚合物或聚合物集团的接近度。被感应的生物学识别活动的灵敏度典型地依赖于识别活动与猝灭剂和聚合物集团分离距离的变化之间的联系。
在最初的基于聚合物/QTL超猝灭相互作用的生物传感方法中，聚合物(于溶液中，或者与支持体如微球体或纳米颗粒结合)与QTL通过非特异性相互作用而结合(通常是Coulombic引力和疏水性相互作用的组合)。在荧光“turn-off”分析中，在生物学识别活动中释放的QTL与聚合物的结合导致荧光猝灭。或者，QTL与特异性受体的结合可引起预结合的聚合物和QTL分离，并导致荧光“turn-on”传感。这个分析平台根据靶分析物及合成的QTL而可用于直接分析及竞争分析中。
在另一种传感平台中，荧光聚合物和受体(即QTL生物缀合物的配体L的受体)共同位于固体支持体如微米大小的或亚微米大小的乳胶珠、硅基微球体、纳米颗粒或表面上。在这种情况中，QTL与受体的特异性结合导致荧光猝灭，而QTL的释放导致荧光的出现(turnon)。在上面讨论的两种传感方案中，当QTL与聚合物或聚合物集团结合时，QTL缀合物通常应用最小长度的系链以提供荧光聚合物与猝灭剂和QTL的配体部分的紧密接近。
另一种实施方案在QTL缀合物中掺入了长的柔性系链。如图2A-2C所示，将生物素“连接器”与携带猝灭剂的识别分子分开的“柔性”系链的构建产生一种QTL，其可以与含有生物素结合蛋白和荧光聚合物的珠“平台”结合。
如图2A-2C所示，用荧光聚合物包被的并具有可利用的抗生物素蛋白或链霉抗生物素受体位点的固体支持体(显示为珠)，可以与具有长的柔性生物素酰化的系链的猝灭剂复合。结果荧光被猝灭(图2B)。然而，结合识别分子的分析物的存在可以从荧光支持体中除去猝灭剂，导致荧光增加(图2C)。
柔性系链可以许多构象存在。在一个优选的实施方案中，柔性系链由聚乙二醇(即PEG)线性链组成，如图2A所示。在一个实施例中，生物素与受体通过一个具有～75个重复单位的PEG系链分开。如果这个链是充分伸展的构象，则生物素连接器与受体之间的距离是～278埃。
在水介质中，PEG链应略微折叠或者处于折叠或卷曲状态，使得猝灭剂标记的受体可以与珠结合的荧光聚合物相对密切接近。这可以引起来自(在珠的表面上)相对远离QTL的生物素结合的生物素结合蛋白位点的聚合物区域的荧光猝灭。链末端的猝灭剂-受体与表面上的荧光聚合物之间的相互作用程度可以通过改变表面及猝灭剂-受体上的电荷，通过改变猝灭剂-受体的疏水性，或者通过向悬浮液中加入试剂进行调节。
优选的是柔性链足够长，从而当其从表面充分伸展出时，猝灭剂标记的受体与聚合物相距太远以至于不能显著使其猝灭。由于珠表面上受体-猝灭剂与荧光聚合物之间的结合弱，因此加入大的分析物可导致受体-猝灭剂被除去及PEG伸展至聚合物的猝灭半径外的距离。对于大的多价分析物，传感可以通过从同一或多个珠上除去多个受体-猝灭剂而放大。因此这个分析模式特别适于相对大的分析物如孢子、细胞、细菌或病毒。
4.作为QTL生物传感的基础的多价抗原珠
根据本发明的另一个实施方案，可以使用同样的珠和具有上述长的柔性系链的缀合物进行分析，其进一步包含在存在靶蛋白分析物的情况中不同地相互作用的两种成分。在这种情况中，所述分析特别适于不激发在上述3中所说的应答但可结合受体-猝灭剂集团而不导致其从荧光聚合物中除去的小的蛋白质分析物。在这种情况中，成分之一是含有上述3中所述生物素结合蛋白和生物素-柔性系链-受体-猝灭剂“QTL成分”的荧光聚合物包被的珠。第二种成分可以是荧光聚合物珠或微球体，其表面被识别受体的靶抗原的多个拷贝“装饰”(即“多价抗原珠”或MVAB)。MVAB如图3所示。
如图3所示，生物素酰化的抗原可以与用生物素结合蛋白功能化的聚合物珠复合以形成本发明的多价抗原珠。
将多价抗原珠加入含有生物素-柔性系链-受体-猝灭剂的珠的悬浮液中，通过从珠的表面除去猝灭剂-受体而导致从聚合物中开始发出荧光。随后加入靶分析物通过竞争受体及置换MVAB而引起荧光猝灭。这个分析可以直接竞争方式进行，其中向含有荧光聚合物的珠悬浮液中同时加入已知量的MVAB和未知量的靶蛋白质分析物。荧光猝灭的水平提供了分析物浓度的直接量度。这个分析也可以作为置换竞争分析而进行，这是通过用靶分析物随后用MVAB相继处理荧光聚合物-受体包被的珠进行，或者反之。
5.通过荧光聚合物或聚合物-集团标记的靶的QTL传感
大的和强壮的生物学物种如细菌芽孢和病毒在其由抗原性和化学反应性位点组成的表面上具有重复模式，它们提供了另一种聚合物超猝灭分析。如图4所示，这个类型的一个失活的靶可以被活化以共价连接于或以其它方式附着于荧光聚合物或荧光聚合物集团的表面。
如图4所示，荧光聚合物可以共价连接于一个失活的靶(例如细菌芽孢)以形成功能化的失活的靶。一个荧光芽孢如图4所示。附着水平可以被控制，由此受体与靶的结合位点保持易接近。
如图4所示，功能化的失活的靶(即荧光芽孢)是高度荧光的。加入受体-猝灭剂QTL生物缀合物(例如该受体可以是抗体、抗体片段或其它结合试剂如肽或其它小分子结合剂)，引起与荧光靶的结合，同时猝灭其荧光。如图4所示，每个被标记的靶均可以接受若干受体-猝灭剂缀合物的分子。也如图4所示，加入未标记的靶导致受体结合位点的“稀释”及受体-猝灭剂缀合物从荧光标记的靶中除去。结果，可以观测到荧光增加。
上述分析的灵敏性可以通过调节所述靶上荧光聚合物的包被水平，调整缀合物的结构及其对被标记的和未被标记的靶的亲和性而调整。如一些先前的QTL聚合物超猝灭分析所表明，实际的竞争可以以若干不同的模式进行，从预先保温标记的靶与猝灭剂-结合剂QTL到直接混和QTL、靶和被标记的靶。
用于在溶液中及以在支持体上的形式进行传感的预形成聚合物-蛋白质复合物
实施例1：在溶液中传感的聚合物-蛋白质复合物的制备
一种QTL溶液传感器(传感器SS)按如下制备：将56.5nmol的Avidin(生物素结合蛋白，BBP)和848nmol的生物素酰化的PPE聚合物(1)混合，总体积为11.3mL，并在CRT保温24小时。聚合物与BBP通过生物素-抗生物素蛋白相互作用彼此组合以形成稳定的整体。由此所制备的溶液传感器在每次实验开始时用缓冲液适当稀释。聚合物(1)的结构如下所示：
Figure A20038010874800281
聚合物1的结构
实施例2：在固体-溶液界面传感的预形成蛋白质-聚合物复合物的调试
在这个实施例中，通过两个步骤程序将聚合物-蛋白质集团包被在季铵官能化的直径为0.55微米的聚苯乙烯微球体(MS)上(来自Interfacial Dynamics Corporation)。在第一个步骤中，将于溶液中的预定量的聚合物(1)加入中性链亲和素(另一种BBP)溶液中，以便聚合物重复单位(PRU)与BBP的最终比率为5∶1。将这个溶液在环境温度条件下保温30分钟。在第二个步骤中，将聚合物/蛋白质混合物加入聚苯乙烯微球体中并在pH＝7保温2小时，然后渗滤并置换入磷酸盐缓冲盐水中。应用示差荧光分光镜以量化聚合物和蛋白质包被密度。
对于PPE-B估计的聚合物包被密度为4.75×106 PRU/MS，估计的蛋白质包被密度为9.5×105中性链亲和素/MS。基于聚合物/蛋白质混合物在微球体表面上的包被，确定球体具有～1.3×105个生物素结合位点/球体，这从应用荧光素标记的生物素衍生物的结合实验中确定。
图5表示的是上述传感器制作的反应方案，其中将中性链亲和素与荧光聚合物的混合物复合，并将所得复合物包被于固体支持体上。如上所述，聚合物重复单位与中性链亲和素的比率可以是5∶1。如图5所示，该复合物可以通过静电作用而置于铵官能化的微球体的表面上。
实施例3：使用如实施例1中制备的QTL溶液传感器(传感器SS)对于酶活性的检测(sensing)
向384孔平板中存在于分析缓冲液中的5μL的400nM BSEC-1(结构如下所示)溶液中加入溶解于5μL分析缓冲液中的30ng β-分泌酶。BSEC-1具有如下所示的肽结构：
(QSY7)-T-E-E-I-S-E-V-N-L-D-A-E-F-(K-生物素)-OH SEQ IDNO：1
其中“QSY7”和“生物素”如下式所示：
Figure A20038010874800291
一式三份制备混合物并在CRT保温30分钟。对照孔仅含有肽而没有酶。保温后，将上述溶液传感器的100倍稀释液以20μL加入每个孔中。将平板在微平板读数器内部摇动，并通过使用截断值为475nm的滤膜在440nm激发聚合物并在530nm测定发射强度而对孔加以探测。对照孔的平均RFU值为5,400±200，含有酶的样品孔的平均RFU值为8,350±200。荧光差异是酶活性的量度标准。
尽管上文公开了BSEC-1，但其它多肽也可用于β-分泌酶活性分析中。例如，根据本发明的另一个实施方案，BSEC-3可用于β-分泌酶活性分析中。BSEC-3具有如下所示的多肽结构：(AZO)-T-E-E-I-S-E-V-N-L-D-A-E-F-(K-生物素)-OH  SEQ ID NO：2
在上述肽结构中，“QSY7”和“生物素”如上述阐明，“AZO”具有下式表示的结构：
Figure A20038010874800301
实施例4：使用可与聚合物-蛋白质复合物复合的生物素-R-藻红蛋白，利用BBP上的额外的生物素结合位点进行分析
实施例3的分析通过掺加一种如实施例1所述的QTL溶液传感器及少量的生物素-R-藻红蛋白(BRPE)而改良。所得溶液传感器(传感器YY)是在每次实验的开始通过保温“传感器SS”的母液(masterstock)的200倍稀释液和BRPE而制成，两者比率为后者在40μL混合物中为250fmol。向于分析缓冲液中的5μl，300nM的BSEC-3溶液中加入于5μL分析缓冲液中的30ngβ-分泌酶。BSEC-3具有上述多肽结构。将对照和样品混合物在CRT保温30分钟后，向每个孔中加入40μL掺加的溶液传感器(传感器YY)。将平板在平板读数器内部摇动，并通过使用截断值为475nm(cut-off)的滤膜在440nm处激发聚合物并在530nm处测定发射密度而对孔的荧光强度加以探查。对照孔的平均RFU值为5,200±200，含有酶的样品孔的平均RFU值为14,500±200。观测到的差异是酶活性的量度标准。
实施例5：基于荧光聚合物超猝灭对单链和双链DNA进行分析
以下数据论证了QTL分析对DNA检测的特异性。所用方法包括猝灭剂标记的靶与传感微球体表面上的互补捕获链的靶的竞争。
图7图示的是通过各种寡核苷酸及寡核苷酸混合物对PPE荧光的猝灭。从图7可以看出，由于DNA-QTL与微球体表面的非特异性相互作用而观测到很低的猝灭。相反，DNA-QTL缀合物与捕获链的特异性相互作用导致猝灭显著高于上述非特异性猝灭。所用的捕获链(即ALF-捕获链，结构在下面展示)是生物素酰化的DNA捕获链，其携带有与编码炭疽热致死因子(ALF)的序列的一个区域互补的一个序列。
使用17-mer和20-mer DNA-QTL，结果示于图7。图7所示的所有实验均是在25℃，在96孔平板中进行(200mL Vt/孔)。在每种情况中，均加入20pmole的寡核苷酸或寡核苷酸混合物。
图7中所述多肽如下：
ALF-捕获链：
5′-生物素-TAA ATA CCA TTA AAA ATG CA-3′SEQ ID NO：3
ALF-靶：
5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO：4
DNA-QTL(20-mer)：
5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO：5
DNA-QTL(17-mer)：
5′-ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO：6
其中“生物素”和“QSY7”如上述被定义。非互补的DNA寡核苷酸在图7中以NC表示。
从图7中可以看出，ALF-捕获链和DNA-QTL的存在导致猝灭显著增加。这种猝灭的增加是DNA-QTL与ALF-捕获链的杂交的结果。另外，生物素酰化的ALF-捕获链与荧光聚合物和生物素结合蛋白在微球体表面上形成一种复合物。DNA-QTL与ALF-捕获链杂交，从而使得猝灭剂与荧光聚合物紧密接近，这导致放大的超猝灭。
实施例6：在支持体上的聚合物-蛋白质复合物在检测单核苷酸DNA错配中的应用
以下实施例论证了一种传感器(例如实施例2所述的传感器)可用于检测甚至单核苷酸的DNA错配。这个实施例中使用的方案包括猝灭剂标记的靶与传感微球体表面上互补捕获链的靶的竞争。
图8图示的是用具有基于PNA的捕获链(表示为PNA-Cap)的微球体传感器的错配分析，所述捕获链具有如下结构。实验在40℃，孔总体积200μl的条件下进行。
上述实验中使用的及图8所示多肽如下阐明：
ALF靶：
5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO：7
G-T错配：
5′-TGC ATT TTT GAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO：8
T-T错配：
5′-TGC ATT TTT TAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO：9
C-T错配：
5′-TGC ATT TTT CAT GGTATT TA-3′SEQ ID NO：10
双错配：
5′-TGC ATA TTT AATGGA ATT TA-3′SEQ lD NO：11
DNA-QTL：
5′-ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO：12
PNA-捕获链：
生物素-TAA ATA CCA TTAAAA-Lys-NH2SEQ ID NO：13上式中，“生物素”和“QSY7”如上述定义。
从图8可以看出，对于除了AA双错配靶之外的所有靶都观测到随着靶的量的增加而相对荧光增加。然而，随着靶的量的增加而观测到的增加的荧光量对于完全互补的靶而言更高。
固体支持体可以从适用于生物分析的任何材料制备。固体支持体也可以是任何大小、形状和形式的。制备固体支持体的材料及固体支持体的大小、形状和形式可以基于所进行的分析的要求而变化。固体支持体例如包括但不限于微球体、纳米颗粒和珠。例如，硅基或乳胶微球体可用作固体支持体。
固体支持体的表面可包含官能团。固体支持体可从包含官能团的材料中制备，或者可以采用本领域公认的技术对不含有这种基团的固体支持体的表面官能化以含有这种基团。如上所述，固体支持体的表面可包含铵官能团(例如固体支持体的表面可以被官能化以包含铵官能团)。固体支持体表面也可以包含其它官能团或被官能化以使其包含其它官能团，这些官能团包括但不限于带电反应性基团、中性反应性基团、及羧基反应性基团。
在复合物中使用的荧光聚合物可以是一种缀合聚合物，该缀合聚合物是中性的、带正电荷或负电荷的，或者是兼性离子型的。荧光聚合物也可以是一种包含具有悬垂的荧光染料的未缀合主链的侧链聚合物，，呈现J-型聚集行为。荧光聚合物的结构例如下式所示：
Figure A20038010874800341
可以吸收荧光聚合物激发的辐射能以猝灭荧光的任何组分均可以用作猝灭剂。猝灭剂例如包括但不限于如下种类：中性、正电荷或负电荷或兼性离子、非荧光或荧光的、有机、无机、有机金属、生物或聚合的、或者能量转移或电子转移的种类。根据本发明的一个实施方案，猝灭剂是一种非荧光性的小分子染料如上述的QSY-7或Azo染料。根据本发明的一个实施方案，猝灭剂可以扩大荧光聚合物的猝灭(即超猝灭)。根据本发明的另一个实施方案，猝灭剂可以作为荧光再次发射，荧光是从荧光剂吸收的辐射能。
荧光聚合物复合物可进一步包含一种生物素酰化的荧光蛋白。该生物素酰化的荧光蛋白可结合到生物素结合蛋白的游离生物素结合位点。荧光蛋白例如包括但不限于藻红蛋白和藻胆体。例如，生物素酰化的荧光蛋白可以是生物素酰化的R-藻红蛋白(BRPE)。在存在荧光蛋白的情况下，荧光聚合物的激发的生色团可以将其能量转移至复合物中的荧光蛋白分子。然后荧光蛋白分子可更有效地再次发射这一能量。例如，包含BPRE的荧光聚合物复合物的应用可产生一种明显的红移的荧光信号。然后当包含猝灭剂的生物缀合物与复合物结合时，来自复合物的荧光发射然后可以被猝灭(例如，当包含猝灭剂的生物素酰化的生物缀合物与复合物结合时或当包含多核苷酸或肽核酸序列及猝灭剂的第二种生物缀合物与和复合物结合的捕获链杂交时)。
前面的说明书教导了本发明的原理，以提供实施例的方式加以说明，通过阅读本发明的公开内容本领域技术人员将会意识到在不偏离本发明真正范围的前提下，可以对本发明在形式和细节上加以各种改变。

Claims (57)

1.一种制备检测生物学识别活动的传感器的方法，所述方法包括：将一种生物素酰化的荧光聚合物与一种生物素结合蛋白在水溶液中组合以形成一种复合物，其中所述复合物包含游离的生物素结合位点。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：将一种生物素酰化的荧光蛋白与所述生物素酰化的荧光聚合物及生物素结合蛋白组合。
3.权利要求2的方法，其中所述荧光蛋白是藻红蛋白或藻胆体。
4.权利要求1的方法，其进一步包括将该复合物置于固体支持体的表面上。
5.权利要求1的方法，其中所述荧光聚合物包含一个由如下通式表示的重复单位：
Figure A2003801087480002C1
其中n是一个正整数；其中取代基“R”由下式表示：
和/或由下式表示：
6.权利要求4的方法，其中所述固体支持体包含微球体，纳米颗粒或珠。
7.权利要求4的方法，其中固体支持体的表面包含一个选自由以下所组成的组的官能团：铵官能团，羧基官能团，带电反应性基团，及中性反应性基团。
8.权利要求1的方法，其中生物素结合蛋白选自由以下所组成的组：抗生物素蛋白，链霉抗生物素和中性链亲和素。
9.权利要求1的方法，所述方法进一步包括：
向溶液中加入一种包含一种核苷酸序列、一种肽核酸序列或一种多肽序列的生物素酰化的生物缀合物，
其中所述生物素酰化的生物缀合物与该复合物结合。
10.权利要求9的方法，其中所述生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸或肽核酸序列，且其中生物学识别活动是生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸序列或肽核酸与靶分析物的核酸杂交。
11.权利要求9的方法，其中所述生物素酰化的生物缀合物包含一种多肽序列和一种猝灭剂，其中猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，且其中生物学识别活动是酶诱导的多肽序列的切割。
12.权利要求10的方法，其进一步包括：向溶液中加入包含一种猝灭剂和一种多核苷酸或肽核酸序列的第二种生物缀合物，其中所述猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，且其中第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列能与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交。
13.权利要求12的方法，其中第二种生物缀合物的多核苷酸序列或肽核酸序列与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列互补。
14.权利要求11的方法，其中所述猝灭剂具有如下式所示的结构：
或具有如下式所示的结构：
Figure A2003801087480004C2
15.权利要求12的方法，其中所述猝灭剂具有如下式所示的结构：
Figure A2003801087480005C1
或具有如下式所示的结构：
Figure A2003801087480005C2
16.一种检测生物学识别活动的传感器，其包含：一种生物素酰化的荧光聚合物和一种生物素结合蛋白的复合物，其中所述复合物包含游离的生物素结合位点。
17.权利要求16的传感器，其进一步包含：一种固体支持体，其中所述复合物置于该固体支持体的表面上。
18.权利要求16的传感器，其进一步包含：一种包含一种多核苷酸序列、一种肽核酸序列或多肽序列的生物素酰化的生物缀合物；其中所述生物素酰化的生物缀合物与该复合物结合。
19.权利要求18的传感器，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸序列，且其中生物学识别活动是生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列与靶分析物的核酸杂交。
20.权利要求18的传感器，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种多肽序列和一种猝灭剂，其中所述猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，且其中的生物学识别活动是酶诱导的多肽序列的切割。
21.权利要求20的传感器，其中所述猝灭剂具有如下式所示的结构：
Figure A2003801087480006C1
或具有如下式所示的结构：
22.权利要求16的传感器，其中所述生物素结合蛋白选自由以下所组成的组：抗生物素蛋白、链霉抗生物素和中性链亲和素。
23.权利要求17的传感器，其中所述固体支持体包含微球体、纳米颗粒或珠。
24.权利要求17的传感器，其中所述固体支持体的表面包含一个选自由以下所组成的组的官能团：铵官能团、羧基官能团、带电反应性基团及中性反应性基团。
25.权利要求17的传感器，其中所述复合物进一步包含：一种生物素酰化的生物缀合物，其包含与系链的第一个和第二个位置缀合的一个配体和一个生物素组分；其中所述配体包含一个猝灭剂组分；其中所述猝灭剂组分能导致荧光聚合物放大的超猝灭；其中所述配体能参与一种生物学识别活动；及其中第一个和第二个位置之间的系链部分有一定长度和柔性，由此生物学识别活动的发生导致猝灭剂从固体支持体表面上分离并伴随着荧光增加。
26.权利要求25的传感器，其中所述配体包含一个多肽序列。
27.权利要求25的传感器，其中第一个和第二个位置之间的系链的部分包含由如下化学式表示的一个重复单位：
Figure A2003801087480007C1
其中n是一个正整数。
28.权利要求27的传感器，其中n在70-80之间。
29.权利要求27的传感器，其中n是75。
30.权利要求25的传感器，其中系链的长度在完全伸展的构象中为至少250。
31.权利要求16的传感器，其进一步包含：一种生物素酰化的荧光蛋白；其中该生物素酰化的荧光蛋白与所述生物素酰化的荧光聚合物和生物素结合蛋白形成复合物。
32.权利要求31的传感器，其中所述荧光蛋白是藻红蛋白或藻胆体。
33.一种检测样品中靶分析物存在和/或数量的方法，包括将样品与一种生物素酰化的生物缀合物及一种权利要求16所述的传感器组合，所述生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸序列，一种肽核酸序列或多肽序列。
34.权利要求33的方法，其中所述生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸序列或肽核酸序列，所述方法进一步包括：将样品与包含一种猝灭剂和一种多核苷酸或肽核酸序列的第二种生物缀合物进行组合，其中所述猝灭剂能导致荧光聚合物放大的超猝灭，其中第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列能与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交；且其中所述靶分析物包含能与生物素酰化的生物缀合物或第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交的多核苷酸序列。
35.权利要求34的方法，其中第二种生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列与生物素酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列互补。
36.权利要求33的方法，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种多肽序列，并进一步包含一种猝灭剂，其中生物素酰化的生物缀合物与所述复合物的结合猝灭荧光聚合物的荧光，其中靶分析物是一种能切割多肽序列的酶。
37.一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，包括将样品与权利要求25的传感器组合。
38.权利要求37的方法，其中所述配体包含一个多肽序列。
39.权利要求37的方法，其中靶分析物选自由以下所组成的组：孢子，细胞，细菌或病毒。
40.一种用于检测生物学识别活动的传感系统，其包含权利要求25所述的传感器，及包含众多靶组分置于其表面上的第二种固体支持体，其中生物素酰化的生物缀合物的配体与靶组分相互作用，由此猝灭剂与荧光剂分离，从而增加荧光聚合物的荧光。
41.权利要求40的传感系统，其中所述配体包含一个多肽序列。
42.权利要求40的传感系统，其中第二种固体支持体是微球体，纳米颗粒或珠。
43.一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，包括将权利要求40所述的传感系统与样品组合，其中靶分析物可识别配体并与之相互作用，其中靶分析物与配体的相互作用导致荧光降低。
44.权利要求43的方法，其中所述配体包含一种多肽，及其中生物学识别活动包括配体的多肽与包含一种多肽的靶分析物的相互作用。
45.权利要求34的方法，其包括将样品与生物素酰化的生物缀合物及第二种生物缀合物一起保温，并向保温的样品中加入所述传感器。
46.权利要求34的方法，其中将所述传感器与生物素酰化的生物缀合物组合，由此生物素酰化的生物缀合物与传感器复合，随后将样品与传感器/生物素酰化的生物缀合物复合物一起保温，接着将第二种生物缀合物加入保温的样品中。
47.权利要求46的方法，其中靶分析物的核苷酸序列包含一个双链核酸，所述方法进一步包括在存在第二种生物缀合物的情况下加热保温的样品至足以使样品中双链核酸解链的温度，并将样品冷却以使得双链体形成，其中样品中存在的靶分析物与第二种生物缀合物之间的双链体形成导致荧光增加。
48.权利要求46的方法，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种肽核酸序列。
49.一种用于检测靶生物学物种的传感器，其包含：在其表面上包含受体的众多配体的细菌芽孢或病毒；置于细菌芽孢或病毒表面上的荧光聚合物或荧光聚合物复合物；包含与配体的受体缀合的猝灭剂的众多生物缀合物，其中所述受体和配体相互作用及其中受体和配体的相互作用导致荧光聚合物的荧光放大的超猝灭。
50.一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：将样品与权利要求49所述的传感器一起保温；其中样品中的靶分析物识别受体并与之相互作用，且其中样品中靶分析物与受体的相互作用导致荧光增加。
51.权利要求50的方法，其中靶分析物包含一种细菌芽孢或病毒，该细菌芽孢或病毒在其一个表面上包含受体的众多配体。
52.权利要求17的传感器，其中生物素酰化的生物缀合物包含一种多核苷酸或肽核酸序列，其中生物素酰化的生物缀合物进一步包含一种能导致荧光聚合物放大的超猝灭的猝灭剂，其中所述多核苷酸序列位于生物素酰化的生物缀合物上的猝灭剂和生物素之间。
53.一种检测样品中靶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：将样品与权利要求52所述的传感器组合，其中靶分析物包含能与输送酰化的生物缀合物的多核苷酸或肽核酸序列杂交的多核苷酸序列，及所述杂交导致猝灭剂与固体支持体表面分离并伴随着荧光增加。
54.权利要求6的方法，其中固体支持体包含硅基或乳胶微球体。
55.权利要求23的传感器，其中固体支持体包含硅基或乳胶微球体。
56.权利要求40的传感系统，其中第二种固体支持体的表面包含一个选自由以下所组成的组的官能团：铵官能团、羧基官能团、带电反应性基团及中性的反应性基团。
57.权利要求42的传感系统，其中第二种固体支持体包含硅基或乳胶微球体。
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