CN1780851A - 将分子递送到细胞的方法和载体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于递送分子到细胞的载体复合物和方法。根据本发明该载体复合物包括分子和芳香族阳离子肽。在一个具体实施方式中，用于递送分子到细胞的方法包括使载体复合物与细胞接触。在另一个具体实施方式中，该用于递送分子到细胞的方法包括将分子和芳香族阳离子肽与细胞接触。

Description

将分子递送到细胞的方法和载体复合物
本申请要求于2003年5月1日提交的序列号为60/467,516的美国临时申请的优先权。序列号为60/467,516的美国临时申请的说明书的全部内容以引用方式结合于本文。
本发明系在批准号为P01-DA-08924的来自国家药物滥用研究所的政府支持下完成的。美国政府对本发明拥有一定权利。
背景技术
生物细胞对于被允许穿过细胞膜的分子通常是高选择性的。因此，将例如小分子和生物分子这样的化合物递送(或运送)进入细胞，通常受限于该化合物的物理性质。该小分子和生物分子可以是，例如，具有药物活性的化合物。
这样的分子(包括大分子，如蛋白质和核酸)在体内被递送至细胞内的不足，已经成为大量潜在有效的化合物在治疗、预防和/或诊断中的应用的障碍。此外，因为在体内缺乏将化合物有效地递送到细胞内的能力，许多在体外看来很有前途的化合物已经作为潜在的药物而被放弃了。
许多报导都已提及通过共价地将化合物附着到“蛋白转导结构阈”(PTDs)而将化合物递送至细胞的问题。Schwarze等(TrendsPharmacol Sci.2000；21：45-8)和授权给Dowdy的美国专利第6,221,355号披露了几种能够以浓度依赖性的方式穿过细胞的脂质双层的PTDs。所披露的PTDs包括来源于HIV-1tat蛋白、来源于由触角足(简写为ANTP)基因编码的果蝇同型转录因子、以及来源于单纯疱疹病毒VP22转录因子的PTDs。HIV-1 tat PTD的长度为十一个氨基酸，ANTP PTD的长度为十六个氨基酸，而VP22 PTD的长度为34个氨基酸。
然而，最近出版的资料显示这些PTDs经由能量依赖性的胞吞作用而进入细胞。因此，“PTD-运载物”复合物包括在细胞内涵体的小泡内，而不存在于例如细胞的胞质。因此，该“PTD-运载物”复合物必需从内涵体的小泡释放，以便具有生物活性(Richard et al.，J Biol.Chem.2003；278：585-590；Drin et al.，J Biol.Chem.2003；278：31192-31201)。此外，最近的报导表明PTDs对细胞是有毒性的。
因此，需要有能够以不依赖能量的非胞吞方式穿过细胞的脂质膜的肽。此外，为了避免通常周知的对较大的肽的免疫反应，需要有较小的、耐肽酶的肽。最后，所述肽载体对于细胞没有毒性，这也是很重要的。
发明内容
通过本发明提供的一种用于将分子递送到细胞的方法，从而满足了这些要求。本方法包括将载体复合物与所述细胞接触，其中该载体复合物包括所述分子和芳香族阳离子肽，并且其中该芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
在另一个具体实施例中，本发明提供了一种载体复合物，该载体复合物包括分子和芳香族阳离子肽，其中芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
在另一个具体实施例中，本发明提供了一种用于将分子递送至细胞的方法。该方法包括将分子和芳香族阳离子肽与细胞接触，其中该芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
附图说明
图1.Caco-2细胞内肽的摄取。[3H][Dmt1]DALDA(A)和[14C]Gly-Sar(B)的摄取的时间过程。在37℃或者4℃下，Caco-2细胞与[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或者[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时。随后在溶解后的细胞中测定放射性。(C)将[3H][Dmt1]DALDA的积聚物进行酸洗的结果。Caco-2细胞与[3H][Dmt1]DALDA在37℃下孵育1小时。在细胞溶解前，对细胞进行酸洗，以便去除与细胞表面结合的放射性(物质)。(D)[Dmt1]DALDA的浓度对[Dmt1]DALDA摄取的影响。细胞在37℃下与一定浓度范围(1μM-3mM)的[Dmt1]DALDA孵育1小时。所有的数据用三个独立单层的平均数±S.E.表示。其中误差棒(errorbar)不明显，它们比标记组更小。
图2.pH和DEPC对Caco-2细胞内[3H][Dmt1]DALDA(A和C)和[14C]Gly-Sar(B和D)的摄取的影响。在37℃和不同pH条件下将Caco-2细胞与[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时(A和B)。在37℃下将细胞与[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)孵育1小时(C和D)之前，在25℃将细胞与0.2mM DEPC预先孵育10分钟。所有的数据用三个独立的单层的平均数±S.E.表示。
图3.(A)[3H][Dmt1]DALDA在不同的细胞系中的摄取。在37℃将细胞与[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)孵育1小时。在细胞溶解前，将细胞酸洗，以便除去细胞表面结合的放射性。数据显示了代表耐酸的放射性，并且用三个独立的单层的平均数±S.E.表示。(B)[3H][Dmt1]DALDA与细胞膜的特异性结合。在25℃将从SH-SY5Y细胞和Caco-2细胞制备的细胞膜与[3H][Dmt1]DALDA(15-960pM)孵育1小时。通过1μM未标记的[Dmt1]DALDA的包含物评估非特异性结合。通过快过滤将游离的放射性配体与结合的放射性配体分离。没有看到与Caco-2细胞的特异性结合。对于SH-SY5Y细胞，Kd值是118pM(范围是87-149)，而Bmax值是96fmol/mg蛋白质。
图4.(A)[3H][Dmt1]DALDA(填充柱)和[14C]Gly-Sar(空心柱)的泄漏。在37℃或4℃用[3H][Dmt1]DALDA(250nM，47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50μM，56.7mCi/mmol)将Caco-2细胞预先加载1小时。随后用培养基冲洗细胞，并在37℃或4℃与培养基孵育1小时。在培养基和细胞溶解产物中均测定放射性，而数据用泄漏入培养基中的肽的百分数表示。(B)DEPC对[3H][Dmt1]DALDA泄漏的影响。在用[3H][Dmt1]DALDA加载前，在25℃将细胞与0.2mMDEPC预先孵育10分钟。(C)异搏定，一种p-糖蛋白抑制剂，对[3H][Dmt1]DALDA的泄漏(C)和摄取(D)的影响。
图5.[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar穿过Caco-2单层的转运。将Caco-2细胞(2×105)接种在转孔细胞培养容器内的多微孔膜上。通过将[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar加入到顶部隔间来测定肽从顶部到底侧的转运，并且在加入肽后的不同时间将20-μl等分试样从顶部和底侧隔间移出，以便测定放射性。
图6.[Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA的细胞摄取。在37℃将Caco-2细胞与0.1μ4M[Dmt1，dnsDap4]DALDA孵育15分钟。随后用PBS冲洗和覆盖细胞。在室温下10分钟内进行显微镜观察。在340nm进行激发，在520nm测量发射。出现的荧光扩散到整个细胞质，但是完全排除在细胞核外。在37℃小泡浓度的缺乏表明非内吞性摄取。
图7.三种肽与交联剂SMCC结合的质谱分析确认。将SMCC(1μg)和肽(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、然后在4℃贮存。将所述样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，然后将其点样在不锈钢的靶向平板(target plate)上。通过基质辅助的激光解吸电离-飞行时间质谱分析(MALDI-TOFMS)分析样品。所述肽和它们各自的SMCC结合物的分子量显示在质谱图上。
图8.肽增加β-半乳糖苷酶(β-Gal)被摄取入N2A神经母细胞瘤细胞的能力。将细胞(N2A神经母细胞瘤细胞或Caco-2)平铺在96孔板内(2×104个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与β-半乳糖苷酶或与肽结合(经由SMCC)的β-半乳糖苷酶孵育1小时。然后用磷酸盐缓冲液将细胞洗4次。随后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系统(Roche)将细胞染色至少2小时，随后在显微镜下检查。(A)当Caco-2细胞与β-半乳糖苷酶孵育时，没有观察到β-半乳糖苷酶的摄取。(B)蓝色细胞的存在表明Caco-2细胞内与[Dmt1]DALDA共轭结合的β-半乳糖苷酶的摄取。(C)Caco-2细胞内与[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]结合的β-半乳糖苷酶的摄取增加。(D)Caco-2细胞内与[Phe1]DALDA结合的β-半乳糖苷酶的摄取增加。β-半乳糖苷酶与单独的SMCC的结合没有增加摄取。
图9.与[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物的共同孵育增加了绿色荧光蛋白(GFP)进入Huh7细胞的摄取。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与0.5ml DMEM孵育60分钟，该DMEM：仅包含3μg GFP(A)；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA(B)；或者包含3μg GFP和40μl与SMCC共轭结合的[Dmt1]DALDA(C)。随后将2ml细胞培养基加入到细胞中，并且将其在细胞孵育器中孵育额外的24小时。孵育后，在细胞培养基中将细胞冲洗四次，随后通过激光共聚焦扫描显微镜观察保留在活细胞中的GFP。在340nm处进行激发，而在520nm处测量发射。顶部的板块代表通过Huh7细胞的0.8μm厚的中部的水平光学部分的GFP的图像。底部的板块代表同一区域内的不同界面的对比图像。
图10.[Dmt1]DALDA与RNA低聚物的共轭结合。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端将合成的RNA低聚物(长度为40个核苷酸)磷酸化。通过凝胶电泳将产物纯化。在1mg EDC(N-[3-二甲基氨基丙基-N’-乙基碳酰亚胺])存在时，500,000cpm凝胶-纯化的RNA低聚物与[Dmt1]DALDA共轭结合。将共轭反应的产物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)与单独的RNA低聚物在15％的聚丙烯酰胺基脲凝胶上分析。
图11.[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物的共轭结合物被摄取入Caco-2细胞。将Caco-2细胞(1×106)在DMEM培养基中洗三次，并且在DMEM中预先孵育5分钟。随后，将细胞与[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物的共轭结合物或对照RNA(接近20,000cpm)在37℃孵育60分钟。孵育后，冲洗、溶解细胞，并且测定细胞溶解产物中的放射性。[Dmt1]DALDA-[32P]RNA共轭结合物的摄取与单独的RNA的摄取相比高(＞)三倍多(图11)。
图12.肽-SMCC共轭结合物对增加RNA低聚物被摄取入Huh7细胞的影响。(A)时间对细胞摄取RNA低聚物的影响。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃将该细胞与1.0mlDMEM孵育15或60分钟，该DMEM中包含单独的[32P]RNA低聚物(单链，11个碱基，～100,000cpm)，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物。随后将细胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸钠溶液中洗一次，以便将其在溶解缓冲液中孵育30分钟之前除去非特异性结合，随后测定保留的放射性。RNA低聚物与[Dmt1]DALDA-SMCC在37℃共同孵育提高了RNA低聚物的摄取，在15分钟的孵育后提高了10倍，在60分钟的孵育后提高了20倍。(B)温度对细胞摄取RNA低聚物的影响。4℃时[Dmt1]DALDA-SMCC提高RNA摄取的能力更小，虽然它仍将摄取增加了10倍。(C)借助不同的肽-SMCC共轭结合物增加细胞对RNA的摄取。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃将该细胞与1.0ml DMEM孵育15分钟，该DMEM中包含单独的[32P]RNA低聚物，或者包含[32P]RNA低聚物和40ml肽-SMCC共轭结合物。全部三种肽-SMCC共轭结合物均增加了RNA的摄取。
图13.与[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物的共同孵育增加了两种不同长度的RNA的摄取。将[Dmt1]DALDA与SMCC共轭结合，并通过质谱分析确认。在室温下将11-merRNA低聚物和1350-mer RNA与[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物混合15分钟。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃和5％CO2下将该细胞与1ml DMEM孵育60分钟，该DMEM中包含单独的RNA(～100,000cpm)，或者包含与[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物混合的RNA。随后将细胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸钠溶液中洗一次，以便除去非特异性结合。将冲洗后的细胞在溶解缓冲液中孵育30分钟，随后对保留的放射性计数。相较于与单独的RNA孵育，与[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物的共同孵育增加了11-merRNA的摄取达22倍，而增加了1350-mer RNA的摄取达3倍。
图14.DNA低聚物与[Dmt1]DALDA的共轭结合。将SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、随后在4℃与去保护的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小时。孵育后，将样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，并且将其点样在不锈钢的靶向平板上。通过MALDI-TOF MS分析样品(A)。已发现3’-硫醇基DNA低聚物和[Dmt1]DALDA-DNA共价复合物的分子量分别为6392和7171。在与多聚核苷酸激酶的反应中，利用γ-32P-ATP将位于5’-末端的共轭结合和非共轭结合的低聚物磷酸化，而激酶反应的产物在15％的聚丙烯酰胺脲凝胶上分析，并且被凝胶-纯化，用于细胞摄取研究(B)。
图15.与[Dmt1]DALDA共轭结合的DNA低聚物的细胞摄取。利用SMCC将3’-硫醇修饰的20-基体DNA共轭结合到[Dmt1]DALDA上，并且通过质谱分析确认共轭结合物的形成。用32P将共轭结合和非共轭结合的DNA低聚物在其5’-末端用放射性同位素标记，并凝胶提纯。用DMEM冲洗神经N2A(1×106个细胞/孔)细胞，然后在37℃和5％CO2的条件下将该细胞与1mlDMEM孵育2小时或19小时，该DMEM中包含有或没有与DNA低聚物(～100,000cpm)共轭结合的[Dmt1]DALDA。然后将细胞在DMEM中冲洗四次，在醋酸钠溶液中冲洗一次，以便除去非特异性结合。随后将所述细胞在溶解缓冲液中孵育30分钟，随后确定保留的放射性。Y-轴表示DNA的摄取，用总放射性的百分数表示。
图16.[Dmt1]DALDA对培养的细胞是没有毒性的。将神经N2A细胞与[Dmt1]DALDA(1nM到10μM)孵育，并且通过MTT实验测定细胞的生存能力。
图17.[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物没有在Huh7细胞中引起凋亡。将Huh7细胞(1×106个细胞/孔)在DMEM中冲洗三次，并且加入1ml新鲜的培养基。随后，将50ul PBS中[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物(1mM)或仅PBS(对照)加入到所述细胞培养基中，并且在37℃和5％CO2的条件下孵育24小时。孵育后，将1μl可以使凋亡的细胞核染色的Hoechst染料加入到细胞中，并且孵育额外的15分钟。通过用细胞培养基(不含pH指示剂)冲洗细胞除去过多的Hoechst染料，然后利用荧光显微镜(在350nm处激发，而在461nm处测量发射)比较经[Dmt1]DALDA-SMCC共轭结合物处理的细胞和对照细胞。
具体实施方式
本发明基于发明人的令人惊奇的发现，该发现为：包括至少一个分子和芳香族阳离子肽的一些载体复合物能够以不依赖能量的机制穿过细胞膜，并且将该分子递送到细胞内。
芳香族阳离子肽
本发明中所用的芳香族阳离子肽具有如下所述的净正电荷，是水溶性和高极性的。该肽包括最少三个氨基酸，优选包括最少四个氨基酸，通过肽键共价连接。
该芳香族阳离子肽中存在的氨基酸的最大数目是十个，优选约八个，最优选约六个。最佳地，该肽中存在的氨基酸的数目是约四个。用于限定氨基酸的最大数目的术语“约”是指增加或者减少一个氨基酸。
本发明中所用的芳香族阳离子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。正如本文中所使用的，术语“氨基酸”指的是包括至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。优选地，至少一个氨基位于相对于羧基的α位。
该氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，通常存在于蛋白质中的二十种最常见的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷胺酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及缬氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括，例如，在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在产生尿的过程中哺乳动物代谢合成的氨基酸：鸟氨酸。
本发明所用的芳香族阳离子肽可选地包括一个或多个非天然存在的氨基酸。在一个具体实施例中，该肽没有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是这样的氨基酸，其通常不在生物机体的正常代谢过程中合成，并且不天然存在于蛋白质中。
此外，本发明中所用的非天然存在的氨基酸优选不被常见的蛋白酶所识别。因此，非天然存在的氨基酸优选对常见的蛋白酶有抗性，并且更优选对常见的蛋白酶不敏感。
非天然存在的氨基酸可以存在于该肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以在N-末端、C-末端、和/或N-末端和C-末端之间的任何一个或多个位置。
举例来说，非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基、或者烷芳基。烷基氨基酸的一些实例包括：α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸、以及ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些实例包括邻-、间-、以及对-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些实例包括邻-、间-、以及对-氨基苯乙酸，以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸还包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括，例如，在天然存在的氨基酸上添加一个或多个化学基团。
例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’、或6’位置中的一个或多个，或者色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’、或7’位置中的一个或多个。该基团可以是能被添加到芳香环上的任何化学基团。这样的基团的一些实例包括：支链的或直链的C1-C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基、C1-C4烃氧基(即烷氧烷)、氨基、C1-C4烷基胺(例如，甲胺基)以及C1-C4二烷基胺(例如，二甲胺基)、硝基、羟基、卤素(即，氟、氯、溴、或碘)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊实例包括：正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、以及羟脯氨酸(Hyp)。
本发明所用的肽中的氨基酸的修饰的另一实例是该肽中的天冬氨酸或者谷氨酸残基的羧基的衍生作用(衍生化)。衍生作用的一个实例是用氨或者用伯胺或仲胺，例如，甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺，进行氨基化。衍生作用的另一实例包括利用，例如，甲醇或乙醇，进行酯化作用。
另一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基的修饰。例如，这样的氨基可以被酰化。一些合适的酰基包括，例如，包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。
非天然存在的氨基酸通常可以是左旋型(L-)、右旋型(D-)、或者其混合物。合适的非天然存在的氨基酸的实例还包括上述任何天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。在这点上，应该注意：虽然已发现D-氨基酸存在于某些肽类抗生素中(该肽类抗生素是利用除细胞的正常核糖体蛋白合成器以外的方式合成的)，但是它们通常不存在于蛋白中。用于此处时，这样的D-氨基酸指的是非天然存在的氨基酸。
为了使对蛋白酶的敏感性最小，本发明中所用的肽应该具有少于五个，优选少于四个，更优选少于三个，以及最优选地少于两个相邻的能被常见蛋白酶识别的L-氨基酸，而不管这些氨基酸是天然存在的或是非天然存在的。在一个具体实施例中，该肽仅有D-氨基酸，而没有L-氨基酸。
如果该肽包含对蛋白酶敏感的氨基酸序列，那么氨基酸中至少有一个优选为非天然存在的D-氨基酸，由此使其具有蛋白酶抗性。对蛋白酶敏感的序列的实例包括能够被常见的蛋白酶，如肽链内切酶和胰蛋白酶，切开的两个或多个相邻的碱性氨基酸。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸。
在生理pH下，相较于芳香族阳离子肽中氨基酸残基的总数，该肽具有最小数目的净正电荷，这是很重要的。生理pH下，净正电荷的最小数目下文中表示为(pm)。该肽中氨基酸残基的总数表示为(r)。
下述的净正电荷的最小数目均是在生理pH下。这里所用的术语“生理pH”指的是哺乳动物机体的组织和器官的细胞内的正常pH。例如，人类的生理pH正常时接近7.4，但哺乳动物的正常生理pH可以是从约7.0到约7.8的任何pH。
这里所用的“净电荷”指的是存在于该肽中的氨基酸所携带的正电荷的数目与负电荷的数目的差值。在本说明书中，可以理解为净电荷是在生理pH下测定的。在生理pH下具有正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸、以及L-组氨酸。在生理pH下具有负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有带正电荷的N-末端氨基和带负电荷的C-末端羧基。在生理pH下该电荷互相抵消。作为计算净电荷的实例，肽：酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一个带负电荷的氨基酸(即谷氨酸)和四个带正电荷的氨基酸(即，两个精氨酸残基，一个赖氨酸，以及一个组氨酸)。因此，上述肽具有三个净正电荷。
在本发明的一个具体实施例中，该芳香族阳离子肽在生理pH下的净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数。在这个具体实施例中，净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
  (r)   3   4   5   6   7   8   9   10
  (pm)   1   1   2   2   2   3   3   3
在另一具体实施例中，该芳香族阳离子肽在净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中2pm是小于或等于r+1的最大数。在这个具体实施例中，净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
  (r)   3   4   5   6   7   8   9   10
  (pm)   2   2   3   3   4   4   5   5
在一个具体实施例中，净正电荷的数目(pm)与氨基酸残基的数目(r)相等。在另一优选的具体实施例中，该肽具有三个或四个氨基酸残基以及最少一个净正电荷，优选为最少两个净正电荷，以及更优选地，最少三个净正电荷。
芳香族阳离子肽具有相较于净正电荷总数(pt)的最小数目的芳香基，这也是重要的。芳香基的最小数目在下文表示为(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括这些氨基酸：组氨酸、色氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。例如，六肽：赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸具有两个净正电荷(由赖氨酸和精氨酸残基提供)和三个芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸残基提供)。
在本发明的一个具体实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽在芳香基的最小数目(a)与生理pH下净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当pt为1时，a也可以为1。在这个具体实施例中，芳香基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系如下：
  (pt)   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  (a)   1   1   1   1   2   2   2   3   3   3
在另一具体实施例中，该芳香族阳离子肽在芳香基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数。在这个具体实施例中，芳香族氨基酸残基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系如下：
  (pt)   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  (a)   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5
在另一具体实施例中，芳香基的数目(a)与净正电荷的总数(pt)相等。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，优选用，例如，氨来酰胺化以形成C-末端酰胺。可选地，C-末端氨基酸的末端羧基可以被伯胺或仲胺酰胺化。该伯胺或仲胺可以是，例如，烷基，尤其是支链或直链的C1-C4烷基，或芳基胺。相应的，该肽的C-末端的氨基酸可以转变为酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或者N-苯基-N-乙基酰胺基。
另外，具有多于一个羧基的氨基酸残基(例如，天冬酰胺残基、谷胺酰胺残基、天冬氨酸残基及谷氨酸残基)的自由羧基基团，无论其存在于任何位置，也可以被酰胺化。在这些部位的酰胺化作用可以利用氨或上述任何伯胺或仲胺进行。
在一个具体实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一具体实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽包括但不限于下述肽的实例：
赖氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-组氨酸，
右旋酪氨酸-色氨酸-赖氨酸-NH2，
色氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2，
酪氨酸-组氨酸-右旋甘氨酸-甲硫氨酸，
苯丙氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-天冬氨酸，
酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-NH2，
甲硫氨酸-酪氨酸-右旋赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，
右旋组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸，
赖氨酸-右旋谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-组氨酸，
甘氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2，
缬氨酸-右旋赖氨酸-组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2，
色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸，
赖氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-NH2，
苏氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸，
天冬氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-赖氨酸-NH2，
右旋组氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋组氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2，以及
丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋色氨酸-组氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸。
在一个特别优选的具体实施例中，芳香族阳离子肽具有的分子式为：酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(为了方便用DALDA这个简写代表)。DALDA具有由氨基酸：酪氨酸、精氨酸、和赖氨酸提供的三个净正电荷，以及由氨基酸：苯丙氨酸和酪氨酸提供的两个芳香基。DALDA中的酪氨酸可以是酪氨酸被修饰后的衍生物，如2’，6’-二甲基酪氨酸，以便产生分子式为2’6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(即，Dmt1-DALDA)的化合物。其它经修饰的酪氨酸衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在另一个优选的具体实施例中，位于DALDA的N-末端的氨基酸可以是苯丙氨酸或其衍生物。N-末端具有苯丙氨酸的芳香族阳离子肽的分子式：苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(即，Phe1-DALDA)。优选的苯丙氨酸的衍生物包括：2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)、以及2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
在另一个具体实施例中，Dmt1-DALDA的氨基酸序列被重新排列，使Dmt不位于N-末端。这样的芳香族阳离子肽的实例具有的分子式为：右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2。
本文中提及的任何特定的肽，如那些上面提及的肽和下面提及的肽，例如，表1中提及的肽，包括Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2以及它们的衍生物可以进一步包括功能类似物。如果该类似物与Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2具有同样的功能，那么这样的肽被认为是Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2的功能类似物。该类似物可以是，例如，Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2的取代变体，其中一个或多个氨基酸被另外的氨基酸取代。
Dmt1-DALDA、DALDA、Phe1-DALDA、或者右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2的合适的取代变体包括保守的氨基酸替代物。氨基酸可以根据其理化特性分组如下：
(a)非极性氨基酸：丙氨酸(A)丝氨酸(S)苏氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)；
(b)酸性氨基酸：天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)；
(c)碱性氨基酸：组氨酸(H)精氨酸(R)赖氨酸(K)；
(d)疏水氨基酸：甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)异亮氨酸(I)缬氨酸(V)；以及
(e)芳香族氨基酸：苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)组氨酸(H)。
肽中的氨基酸被同组的另外的氨基酸取代(替代)称为保守取代。保守取代有助于保持原有肽的理化特性。相反，肽中的氨基酸被不同组的另外的氨基酸取代通常更有可能改变原有肽的理化特性。
在本发明的实施中所用的类似物的实例包括，但不限于，表1和表2中所示的芳香族阳离子肽。
                                                                 表1
  氨基酸   氨基酸   氨基酸   氨基酸   氨基酸   C-末端
  位置1   位置2   位置3   位置4  位置5(如果存在)   修饰
  酪氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸半胱氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸-NH(CH2)2-NH-dns   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸-NH(CH2)2-NH-atn   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   dns赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋瓜氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋瓜氨酸   苯丙氨酸   Ahp   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Ahp(2-氨基庚酸)   NH2
  Bio-2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   酪氨酸   赖氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   酪氨酸   鸟氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   酪氨酸   Dab   NH2
  酪氨酸   右旋精氨酸   酪氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   酪氨酸   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   酪氨酸   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   酪氨酸   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   酪氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   2’6’Dmt   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   2’6’Dmt   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   2’6’Dmt   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   2’6’Dmt   Dap   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   3’5’Dmt   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   3’5’Dmt   赖氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   3’5’Dmt   鸟氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   3’5’Dmt   Dab   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   酪氨酸   赖氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   酪氨酸   鸟氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   酪氨酸   Dab   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   酪氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   酪氨酸   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   酪氨酸   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   酪氨酸   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   酪氨酸   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   2’6’Dmt   赖氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   2’6’Dmt   鸟氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   2’6’Dmt   Dab   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   2’6’Dmt   Dap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   dnsDap   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   atnDap   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   3’5’Dmt   赖氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   3’5’Dmt   鸟氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   3’5’Dmt   Dab   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   3’5’Dmt   Dap   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋Dab   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋Dap   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋Dab   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋Dap   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋赖氨酸   酪氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋鸟氨酸   酪氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋Dab   酪氨酸   精氨酸   NH2
  酪氨酸   右旋Dap   酪氨酸   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋精氨酸   2’6’Dmt   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋赖氨酸   2’6’Dmt   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋鸟氨酸   2’6’Dmt   精氨酸   NH2
  2’6’Dmt   右旋Dab   2’6’Dmt   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋Dap   3’5’Dmt   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋精氨酸   3’5’Dmt   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋赖氨酸   3’5’Dmt   精氨酸   NH2
  3’5’Dmt   右旋鸟氨酸   3’5’Dmt   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Mmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Mmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Mmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Tmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Tmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Tmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Tmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Hmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Hmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Hmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Hmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   鸟氨酸   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dab   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   Dap   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋Dab   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋Dap   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Mmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋Dab   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋Dap   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Tmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋赖氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋鸟氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋Dab   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋Dap   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
  Hmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   精氨酸   NH2
Dab＝二氨基丁酸
Dap＝二氨基丙酸
Dmt＝二甲基酪氨酸
Mmt＝2’-甲基酪氨酸
Tmt＝N，2’，6’-三甲基酪氨酸
Hmt＝2’-羟基，6’-甲基酪氨酸
dnsDap＝β-丹磺酰基-L-α，β-二氨基丙酸
atnDap＝β-邻氨基苯甲酰基-L-α，β-二氨基丙酸
Bio＝生物素
                                                       表2
  氨基酸   氨基酸   氨基酸   氨基酸   C-末端
  位置1   位置2   位置3   位置4   修饰
  右旋精氨酸   Dmt   赖氨酸   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   Dmt   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   Dmt   NH2
  右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dmt   赖氨酸   NH2
  右旋精氨酸   赖氨酸   Dmt   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   赖氨酸   苯丙氨酸   Dmt   NH2
  苯丙氨酸   赖氨酸   Dmt   右旋精氨酸   NH2
  苯丙氨酸   赖氨酸   右旋精氨酸   Dmt   NH2
  苯丙氨酸   右旋精氨酸   Dmt   赖氨酸   NH2
  苯丙氨酸   右旋精氨酸   赖氨酸   Dmt   NH2
  苯丙氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  苯丙氨酸   Dmt   右旋精氨酸   赖氨酸   NH2
  苯丙氨酸   Dmt   赖氨酸   右旋精氨酸   NH2
  赖氨酸   苯丙氨酸   右旋精氨酸   Dmt   NH2
  赖氨酸   苯丙氨酸   Dmt   右旋精氨酸   NH2
  赖氨酸   Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   NH2
  赖氨酸   Dmt   苯丙氨酸   右旋精氨酸   NH2
  赖氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   Dmt   NH2
  赖氨酸   右旋精氨酸   Dmt   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   Dmt   右旋精氨酸   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   Dmt   右旋精氨酸   Dmt   NH2
  右旋精氨酸   Dmt   右旋精氨酸   酪氨酸   NH2
  右旋精氨酸   Dmt   右旋精氨酸   色氨酸   NH2
  色氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  色氨酸   右旋精氨酸   酪氨酸   赖氨酸   NH2
  色氨酸   右旋精氨酸   色氨酸   赖氨酸   NH2
  色氨酸   右旋精氨酸   Dmt   赖氨酸   NH2
  右旋精氨酸   色氨酸   赖氨酸   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   色氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  右旋精氨酸   色氨酸   赖氨酸   Dmt   NH2
  右旋精氨酸   色氨酸   Dmt   赖氨酸   NH2
  右旋精氨酸   赖氨酸   色氨酸   苯丙氨酸   NH2
  右旋精氨酸   赖氨酸   色氨酸   Dmt   NH2
  Cha   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
  丙氨酸   右旋精氨酸   苯丙氨酸   赖氨酸   NH2
Cha＝环己基
表1和表2中所示的肽中的氨基酸可以是L-构型或者D-构型。
更多的阳离子肽可以在2003年2月4日提交的美国临时申请第60/444,777号中找到，其以引用方式结合于本文。
分子
该分子可以是生物分子或者小分子。优选地，该生物分子或者小分子是具有药物活性的分子。这里所用的具有药物活性的分子，是能够在体内施加有益的影响的任何分子。
生物分子是包含核酸或者氨基酸序列的任何分子，并且分子量大于450。这样的核酸和氨基酸序列在本文中分别指的是“多(聚)核苷酸”和“多(聚)氨基酸”。
生物分子包括多聚核苷酸、肽核苷酸、以及多聚氨基酸，如肽、多肽，以及蛋白质。具有药物活性的生物分子的实例包括：内源性肽(如，血管加压素、谷胱甘肽)、蛋白质(如，干扰素)、激素(如，人类生长激素)、酶(如，α-半乳糖苷酶)、抗体(如，抗β-淀粉状蛋白的抗体，其可以用于治疗阿尔茨海默氏病)、神经生长因子(如，神经生长因子NGF，脑部起源的神经因子BDNF)、细胞因子(如，血小板起源的生长因子PDGF，血管内皮细胞生长因子VEGF)、以及低聚核苷酸。
该低聚核苷酸可以包括任何序列的多核苷酸，如DNA或者RNA。该DNA和RNA序列可以是单链或者双链的。例如，编码有利于在应激期间帮助细胞存活的蛋白的DNA可以与本发明的多肽结合。这样的蛋白的实例包括热休克蛋白(如，hsp60、hsp70等)。
单链的RNA分子的实例包括：核酶、RNA诱饵(decoy)、核酶的外部指导序列、反义RNA和mRNA。对于这些单链RNA分子的评述，参见Sullenger等(Nature 2002，418：252-247)。Sullenger披露的对这些单链DNA分子的描述，以及对可以用核酶、RNA诱饵、核酶的外部指导序列、反义RNA和mRNA分子治疗的疾病和病变的描述以引用方式结合于本文。
双链RNA的实例是RNA干扰分子(即，RNAi，例如，siRNA，(即，小干扰RNA))。该siRNA可以是任何本领域的技术人员已知的。
该siRNA可以，例如，与mRNA充分地互补，以便抑制与疾病、病症或者病变相关的蛋白质的转录。这样的蛋白质的实例包括，例如，与阿尔茨海默氏病相关的β-淀粉状蛋白和与癌相关的ras蛋白。
可选地，该siRNA可以，例如，与由病毒产生的RNA充分地互补。该由病毒产生的RNA可以是病毒感染宿主细胞、病毒的存活、和/或病毒的繁殖通常需要的任何RNA。这样的RNA的实例包括：内部核糖体进入位点、RNA依赖的聚合酶起始位点、以及编码病毒包膜蛋白、病毒核酸酶、和病毒蛋白酶(的RNA)。
病毒的实例包括，例如，肝炎病毒，如A(甲)、B(乙)、C(丙)型肝炎、人类免疫缺陷病毒、EB病毒、巨细胞病毒、以及人类乳头瘤病毒。
针对病毒RNA的siRNA对于本领域的技术人员来说是已知的。例如，针对C型肝炎病毒的RNA的siRNA对于本领域的技术人员来说是已知的，参见Randall等，PNAS，2003，100：235-240。
该分子可以是小分子。小分子包括：有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属化合物的盐、单糖、氨基酸、以及核苷酸。小分子可以进一步包括不被认为是生物分子的分子，只要它们的分子量不大于450。因此，小分子可以是分子量为450或更小的脂质、低聚糖、低聚肽、和低聚核苷酸、以及它们的衍生物。
要强调的是小分子可以具有任何分子量。它们被称作小分子仅仅因为它们不被称作生物分子，并且通常具有小于450的分子量。小分子包括自然界发现的化合物，也包括合成的化合物。具有药物活性的小分子的实例包括：抗生素(如，四环素、青霉素、红霉素)、细胞毒性剂(如，链霉素、阿霉素)、以及抗氧化剂(如，维生素E、维生素C、β-胡萝卜素)。
载体复合物
至少一个上述分子，以及至少一个上述芳香族阳离子肽，结合(缔合)形成载体复合物。该分子和芳香族阳离子肽可以通过本领域的技术人员已知的任何方法结合。合适的结合类型包括化学性结合和物理性结合。化学性结合包括，例如通过共价键结合和通过配位键结合。物理性结合包括，例如，通过氢键、偶极相互作用、范瓦耳斯力、静电相互作用、疏水性相互作用和芳香族的堆积作用(aromatic stacking)结合。
该分子和芳香族阳离子肽之间的结合的类型通常依赖于，例如，该分子上可利用的官能团和该芳香族阳离子肽上可利用的官能团。
对于物理性结合或者化学性结合，该分子上的官能团通常与该芳香族阳离子肽上的官能团结合。可选地，该芳香族阳离子肽上的官能团与该分子上的官能团缔合。
该分子和芳香族阳离子肽上的官能团可以直接结合。例如，分子上的官能团(如，巯基)与芳香族阳离子肽上的官能团(如，巯基)结合，以便形成二硫化物。
可选地，该官能团可以通过交联剂(如，连接剂)结合。交联剂的一些实例如下所述。交联剂可以连接到该分子或者芳香族阳离子肽中的任意一个。
该连接剂可以影响也可以不影响芳香族阳离子肽的净电荷的数目。该连接剂通常不影响芳香族阳离子肽的净电荷。存在于连接剂中的每个氨基，如果有的话，将影响芳香族阳离子肽的净正电荷。存在于连接剂中的每个羧基，如果有的话，将影响芳香族阳离子肽的净负电荷。
该载体复合物中分子或者芳香族阳离子肽的数目受限于该肽容纳多个分子的能力或者该分子容纳多个肽的能力。例如，空间位阻可以妨碍该肽容纳尤其是大分子的能力。可选地，空间位阻可以妨碍该分子容纳相对较大的(如，长度为七、八、九或十个氨基酸)芳香族阳离子肽的能力。
该载体复合物中分子或者芳香族阳离子肽的数目还受限于存在于对方上的官能团的数目。例如，与肽结合的分子的最大数目取决于存在于该肽上的官能团的数目。可选地，与分子结合的肽的最大数目取决于存在于该分子上的官能团的数目。
在一个具体实施例中，该载体复合物包括至少一个与芳香族阳离子肽结合的分子，并且优选的情况是至少两个分子。包含多个(如，3，4，5或者更多)官能团的相对较大的肽(如，长度为八个、十个氨基酸)可以与多个(如，3，4，5或者更多)分子结合。
在另一具体实施例中，该载体复合物包括至少一个与分子结合的芳香族-阳离子肽，并且优选的情况是至少两个芳香族阳离子肽。例如，包含多个(如，3，4，5或者更多)官能基团的分子可以与多个(如，3，4，5或者更多)肽结合。
在另一具体实施例中，该载体复合物包括一个与一个分子结合的芳香族-阳离子肽。
在一个具体实施例中，载体复合物包括至少一个与至少一个芳香族阳离子肽化学结合(如，共轭结合)的分子。该分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法与芳香族阳离子肽化学性结合。例如，该分子上的官能团可以直接连接到芳香族阳离子肽上的官能团。合适的官能团的一些实例包括，例如，氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺基、异氰酸基、异硫氰酸基以及羟基。
该分子还可以借助交联剂，如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、以及类似物，与芳香族阳离子肽化学性结合。交联剂可以，例如，从伊利诺斯州罗克福德市的Pierce生物技术公司获得。PierceBiotechnology公司，网址为URLhttp：//www.piercenet.com/products/browse.cfm？fldID＝26436A16-60A0-4A56-85F7-213A50830440，可以提供帮助。另外的交联剂包括荷兰阿姆斯特丹市Kreatech Biotechnology B.V.的美国专利第5,580,990号、5,985,566号和6,133,028号中描述的铂交联剂。
该分子的官能团可以不同于肽的官能团。例如，如果巯基存在于该分子上，如在β-半乳糖苷酶内或者在5’-和/或3’-末端硫醇基修饰的DNA和RNA低聚核苷酸内，该分子可以借助来自PierceBiotechnology的交联试剂SMCC(即，琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基-1-羧酸酯(盐))，通过赖氨酸的4-氨基交联到肽上，如，[Dmt1]DALDA(参见下面的实施例10)。在另一实例中，DALDA的赖氨酸的4-氨基可以借助来自Pierce Biotechnology的交联剂EDC(即，(N-[3-二甲基氨基丙基-N’-乙基碳酰亚胺])，直接共轭结合到位于RNA或者DNA的5’-末端的α-磷酸基上(参见下面的实施例13)。
可选地，该分子和肽的官能团可以相同。同型双官能(homobifunctional)交联剂通常可以用于交联同样的官能团。同型双官能交联剂的实例包括：EGS(即，乙二醇二[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯])、DSS(即，二琥珀酰亚胺基辛二酸盐)、DMA(即，二甲基己二酰亚胺盐·2HCl)、DTSSP(即，3，3’-联硫基[硫代琥珀酰亚胺基丙酸盐])、DPDBP(即，1，4-二-[3’-(2’-吡啶基联硫基)-丙酰胺基]丁烷、以及BMH(即，二-马来酰亚胺己烷)。这样的同型双官能交联剂也可以从Pierce Biotechnology公司得到。
为了使该分子和肽化学性地结合，通常将该分子、肽、和交联剂混合在一起。该分子、肽、和交联剂的加入顺序是不重要的。例如，可以先将该肽与交联剂混合，随后加入该分子。可选地，可以先将该分子与交联剂混合，随后加入该肽。最佳地，可以先将该分子与肽混合，随后加入交联剂。
该化学性结合的载体复合物可以将分子递送到细胞。在一些实例中，该分子在细胞内起作用时没有与芳香族阳离子肽分开。例如，如果该芳香族阳离子肽不妨碍分子的催化位点，那么将分子与芳香族阳离子肽分开不是必需的(参见下面的实施例11)。
在另一些实施例中，将该分子与芳香族化合物分开可能是有利的。上述Pierce Biotechnology公司的网址还在选择合适的能够被，例如，细胞内的酶，分开的交联剂方面为本领域的技术人员提供帮助。因此，该分子可以与芳香族阳离子肽分开。可被分开的连接剂的实例包括：SMPT(即，4-琥珀酰亚胺基氧化羰基-甲基-a-[2-吡啶基联硫基]甲苯、Sulfo-LC-SPDP(即，硫代琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰胺基)己酸盐)、LC-SPDP(即，琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰胺基)己酸盐)、Sulfo-LC-SPDP(即，硫代琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰胺基)己酸盐)、SPDP(即，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰胺基己酸盐)、以及AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)联硫基]-丙酸·HCl)。
在另一具体实施例中，载体复合物包括至少一个与至少一个芳香族阳离子肽物理性结合的分子。该分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法与芳香族阳离子肽物理性结合。
例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将该芳香族阳离子肽与分子混合在一起。混合顺序是不重要的。例如，分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法与修饰过或未修饰过的芳香族阳离子肽物理性混合。可选地，该修饰过或未修饰过的芳香族阳离子肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法与分子物理性混合。
例如，可以将该芳香族-阳离子肽和分子置于容器中，并且通过，例如，摇动该容器来搅拌，以便混合该芳香族-阳离子肽和分子。
该芳香族阳离子肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法被修饰。例如，该芳香族阳离子肽可以借助如上所述的交联剂或者官能基团而被修饰。该连接剂可以影响也可以不影响芳香族阳离子肽的净电荷的数目。典型地，该连接剂不会影响芳香族阳离子肽的净电荷。存在于连接剂中的每个氨基，如果有的话，将影响(增加)芳香族阳离子肽的净正电荷。存在于连接剂中的每个羧基，如果有的话，将影响芳香族阳离子肽的净负电荷。
例如，[Dmt1]DALDA可以通过来自Pierce Biotechnology的交联试剂SMCC(即，琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基-1-羧酸盐)，通过赖氨酸的4-氨基而被修饰(参见下面的实施例10)。为了形成载体复合物，该修饰后的芳香族-阳离子肽通常首先形成，然后与该分子混合。
物理性结合的载体复合物的一个优点是：该分子在细胞内起作用时不需要除去芳香族阳离子肽，如那些其中分子与芳香族阳离子肽化学性结合的载体复合物。此外，如果该芳香族阳离子肽不妨碍分子的催化位点，那么该复合物的解离也不是必需的(参见下面的实施例12)。
芳香族阳离子肽的合成
本发明的方法中所用的肽可以通过本领域公知的任何方法化学合成。用于合成该蛋白的合适的方法包括，例如，通过Stuart andYoung in“Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，”secondEdition，Pierce Chemical Company(1984)，and in“Solid PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)，”Methods Enzymol， 289，AcademicPress，Inc，New York(1997)中描述的那些方法。
施用方式
在一个具体实施例中，本发明涉及将分子递送到细胞的方法。本方法包括将分子和芳香族阳离子肽与细胞接触。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将该分子和芳香族阳离子肽与细胞接触。例如，细胞可以与分子和芳香族阳离子肽在体外孵育。一方面，该细胞和芳香族阳离子肽可以以载体复合物的形式存在，如上述那些载体复合物，包括化学性结合或者物理性结合的分子和芳香族阳离子肽。
在另一具体实施例中，将分子递送到细胞的方法包括将载体复合物与细胞接触。通过将包括该分子和芳香族阳离子肽的载体复合物与细胞接触，该分子被递送到细胞。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将载体复合物与细胞接触。
例如，可以在体外将细胞与该载体复合物孵育。该细胞可以是任何细胞。细胞可以来源于植物、动物、或者细菌。植物细胞的实例包括阿布属细胞。细菌的细胞的实例包括酵母菌属和乳酸杆菌属。动物细胞包括哺乳动物细胞，如神经细胞、肾上皮细胞、肾细胞、血管内皮细胞、神经胶质细胞、肠上皮细胞和肝细胞。血管内皮细胞的实例是血脑屏障内皮细胞。
可选的，该载体复合物可以在体内被施用于哺乳动物。有效剂量的载体复合物，优选药用组合物，可以在其需要时，通过多种用于施用药用化合物的公知的方法中的任何一种来施用于哺乳动物。
该载体复合物可以全身或局部施用。在一个具体实施例中，该载体复合物通过静脉施用。例如，该载体复合物可以经由快速的静脉推注施用。然而，优选地，该载体复合物以恒速静脉注射施用。
该载体复合物可以被局部施用于哺乳动物的组织。例如，通过注射进入注射器易于到达的组织。例如，如果该载体复合物包含将被递送到哺乳动物的肿瘤处的细胞毒性剂，优选地，该肿瘤易于局部施用。这样的肿瘤包括，例如，皮肤癌和乳腺癌。
该载体复合物还可以口服施用、局部施用、鼻内施用、肌肉内施用、皮下施用、或者透皮施用。在一优选的具体实施例中，载体复合物的透皮施用是通过离子电渗疗法，其中该载体复合物通过电流透皮递送。
其它的施用途径包括脑室内或者鞘内施用。脑室内施用涉及施用入脑的脑室系统。鞘内施用涉及施用入脑或脊髓的蛛网膜下的空间。因而脑室内或鞘内施用可以优选用于影响中枢神经系统的器官或组织的那些疾病或病变。
本发明的方法中所用的载体复合物可以通过持续释放的方式给哺乳动物施用，这在本领域是已知的。持续释放施用是药物递送的方法，其可以使该药物在特定时间段达到某个水平。该水平通常通过血清浓度测定。
药学领域已知的任何剂型均适用于该载体复合物的施用。对于口服施用，可以使用液体或固体剂型。剂型的一些实例包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)、口嚼剂(chewing gum)及类似的剂型。该肽可以与合适的药物载体(媒介物)或赋形剂混合，这一点为本领域的技术人员所了解。载体和赋形剂的实例包括淀粉、乳剂、糖、某些种类的粘土、胶、乳酸、硬脂酸或其盐，包括硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物油脂或植物油、树胶及乙二醇。
对于全身施用、脑室内施用、鞘内施用、局部施用、鼻内施用、皮下施用、或者透皮施用，该载体复合物的剂型可以利用传统的稀释剂、载体、或赋形剂等，这在本领域是已知的，其可以用来递送该载体复合物。例如，该剂型可以包括下面的一种或多种：稳定剂、表面活性剂，优选非离子性的表面活性剂、以及可选的盐和/或缓冲剂。该载体复合物可以以水溶液的形式、或以冻干的形式被递送。
该稳定剂可以是，例如，氨基酸，如举例来说，甘氨酸；或者低聚糖，如举例来说，蔗糖、四糖、乳糖或葡聚糖。可选地，稳定剂还可以是糖醇，如举例来说，甘露醇；或其组合物。优选地，该稳定剂或稳定剂的组合物的构成占该载体复合物的重量的约0.1％到约10％。
该表面活性剂优选非离子性的表面活性剂，例如聚山梨醇酯。合适的表面活性剂的一些实例包括：吐温20、吐温80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，如从约0.001％(w/v)到约10％(w/v)的Pluronic F-68。
该盐或缓冲剂可以是任何盐或缓冲剂，如举例来说，分别为，氯化钠、或者磷酸钠/磷酸钾。优选地，该缓冲剂将药物组合物的pH维持在约5.5到约7.5的范围内。该盐和/或缓冲剂也用于将摩尔渗透压浓度维持在适合于给人或动物施用的水平。优选地，该盐或缓冲剂以约150mM到约300mM的粗略的等渗浓度存在。
本发明的方法中所用的载体复合物的组分还可以包含一种或多种传统的添加剂。这样的添加剂的一些实例包括：增溶剂，如，举例来说，甘油；抗氧化剂，如举例来说，苯扎氯铵(季铵化合物的混合物，称为“季铵化合物组(quats)”)，苯甲醇、氯惹酮或氯丁醇；麻醉剂，如举例来说，吗啡衍生物；或者等渗剂等，如上述的等渗剂。作为进一步防止氧化或其它腐败的预防措施，该药物组合物可以用不渗透的塞子封装在小瓶中在氮气下贮存。
该哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括，例如，家畜，如羊、猪、牛、及马；玩赏动物，如狗和猫；实验动物，如大鼠、小鼠和兔。在优选的具体实施例中，该哺乳动物是人。
应用
由于该载体复合物能够以不依赖能量的机制穿过细胞膜，因此在体内和体外可以有很多应用。
该载体复合物能够，例如，在体外用作研究工具。例如，该载体复合物可以将分子，如蛋白质，递送至细胞内，以便研究该分子的功能角色。这样的分子包括，例如，细胞信号蛋白(如，细胞核因子NF-κB、激酶，如JAK)。
体外的另一应用包括，例如，将标记物，如β-半乳糖苷酶，递送至细胞内，如干细胞、造血细胞、或者胚细胞，以便确定细胞的后代(谱系)。
体外的其它应用包括，例如，将检测性抗体递送至细胞内，以便确定该细胞内特定蛋白的存在。
该载体复合物还在体内具有治疗性用途。例如，该芳香族阳离子肽可以用于将反义多聚核苷酸递送至哺乳动物的细胞内，以便下调蛋白质的过度表达。此外，该芳香族阳离子肽可以用于递送低聚核苷酸，该低聚核苷酸可以用于RNA干扰(RNAi)。
这里所用的RNAi涉及细胞机制，该细胞机制用于调节基因的表达或者病毒或细菌的复制。该机制包括导入双链RNA(如，siRNA)至目标基因的产物(通常为RNA)。
血脑屏障具有特殊的选择性。因此，体内的另一应用包括递送分子穿过血脑屏障。这样的分子可以包括，例如，在阿尔茨海默氏病患者的治疗中针对β-淀粉状蛋白的抗体。
与化学治疗剂相关的典型的问题是在细胞内达到足够的水平。例如，该化学治疗剂可能太大或者不是芳香族化合物，不足以穿过细胞膜。因此，体内的又一应用包括将化学治疗剂，如上述细胞毒性剂，递送至细胞内。
实施例
实施例1：材料和方法
药物和化学制品。[Dmt1]DALDA和[3H][Dmt1]DALDA(47Ci/mmol)按照先前描述的方法合成(Schiller等，Eur.J.Med.Chem.2000，35：895-901；Zhao等，J. Phermacol.Exp.Ther.2002，302：188-196)。[14C]Gly-Sar(56.7mCi/mmol)和[3H][D-Ala2，N-Me-Phe4，Gly5-ol]-脑啡肽(50Ci/mmol)购自AmershamBiosciences(皮斯卡塔韦市，新泽西州)。所有的其它药品和化学制品来自Sigma-Aldrich(圣路易斯市，密苏里州)。
细胞培养。所有的细胞系来自美国典型培养物收集中心(American Type Culture Collection)(马纳萨斯镇，弗吉尼亚州)，而细胞培养所需的供给物品来自Invitrogen(卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)。Caco-2细胞在MEM中生长，而SH-SY5Y、HEK293、和Huh7细胞在Dulbecco的改良的Eagle培养基中生长。生长培养基中添加了10％胎牛血清、200μg/ml青霉素、以及100μg/ml硫酸链霉素。CRFK细胞在MEM+10％马血清、非必需氨基酸、以及青霉素/链霉素中生长。所有的细胞系维持在37℃、含95％空气和5％CO2的湿润气体中。
肽摄取实验。首先利用Caco-2细胞研究肽的内在化，随后利用SH-SY5Y、HEK293、和CRFK细胞确认。细胞的单层在覆盖有胶原蛋白的12孔板上(5×105个细胞/孔)生长3天。第4天，用预热的HBSS将细胞洗两次，随后在37℃将细胞与包含250nM[3H][Dmt1]DALDA或者50μM[14C]Gly-Sar的0.2ml HBSS孵育不同的时间至1小时。在一分开的实验中，在未标记的[Dmt1]DALDA(1μM-3mM)存在的情况下，将细胞与同样浓度的[3H][Dmt1]DALDA在37℃孵育1小时。为了研究在4℃时的摄取，在细胞与[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar孵育前，将细胞放在冰上20分钟。该孵育期结束后，用HBSS将细胞洗四次，并且将具有1％SDS的0.2ml 0.1N NaOH加到每个孔中。随后将细胞内容物转移到闪烁管中，并且计算放射性。细胞溶解产物的等分试样用于借助Bradford(Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚州)的方法测定蛋白质含量。为了区分内在的放射性和表面结合的放射性，包括了酸洗步骤。细胞溶解前，将细胞与0.2ml 0.2M乙酸/0.05M NaCl在冰上孵育5分钟。
源自CaCo-2细胞的肽的泄漏实验。单层Caco-2细胞在12孔板上(5×105个细胞/孔)生长3天。第4天，在37℃利用[3H][Dmt1]DALDA或者[14C]Gly-Sar将细胞预载(preload)1小时。然后用1ml冰冷的孵育液将细胞洗四次，以便终止摄取，随后在37℃或4℃将细胞与0.5ml MEM孵育1小时，以便测定肽从细胞到该孵育培养基的泄漏量。在细胞溶解产物和孵育培养基中测定放射性的数量。为了检测P-糖蛋白在肽摄取和从细胞中泄漏出时所起的作用，还在100μM异搏定存在时测定了[Dmt1]DALDA的摄取和泄漏量。
肽穿过Caco-2单层的易位实验。如前所述制备Caco-2细胞的单层(Irie等，J. Pharmacol.Exp.Ther.2001，298：711-717)。将Caco-2细胞(2×105)接种在转孔细胞培养容器(Corning Glassworks，科宁市，纽约州)内的多微孔膜过滤器上(24mm，0.4μm)。每个转孔容器在其顶部隔间充有1.5ml培养基，在其底侧隔间充有2.5ml培养基。每1到2天给予该细胞单层新鲜的培养基，在第28天将细胞单层用于转运实验。通过将0.2μM[3H][Dmt1]DALDA或者100μM[14C]Gly-Sar加入到顶部隔间来测定肽从顶部隔间到底侧隔间的转运，并且在加入肽后的不同时间将50-μl等分试样从顶部和底侧隔间除去，以便测定放射性计数。
按照下面的公式计算表观渗透系数：Papp＝X/(t·A·Co)，其中X/t是接收隔间内的摄取率，A是扩散面积(4.72cm2)，而Co是供体隔间内的初始浓度。
激光共聚焦扫描显微镜。芳香族-阳离子肽被摄取入细胞通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)利用两种荧光肽来确认，该荧光肽为：[Dmt1，dnsDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2，其中dnsDap是β-丹酰-1-α，β-二氨基-丙酸)和[Dmt1，atnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2，其中atnDap是β-邻氨基苯甲酰基-L-α，β-二氨基丙酸)。Caco-2细胞或SH-SY5Y细胞如上所述的那样生长，然后被平铺在(35-mm)玻璃底盘上(MatTek，阿什兰市，马萨诸塞州)持续两天。随后此培养基被移除，并且细胞与包含0.1μM荧光肽的1ml HBSS在4℃或37℃孵育15分钟。然后用冰冷的HBSS将细胞洗三次，接着用200μl PBS覆盖细胞，随后在室温下用具有C-复消色差透镜63×/1.2W校正物镜的激光共聚焦扫描显微镜(Nikon，东京，日本)在10分钟内进行显微镜检查。[Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA的激发/发射波长分别设定在340/520nm和320/420nm。对于z轴的光学切片，每2.0μm切5-10帧。
利用细胞膜的放射性配体结合实验。[3H][Dmt1]DALDA与细包表面受体的特异性结合是利用制备自Caco-2和SH-SY5Y细胞的膜测定的。培养4天后，用PBS缓冲液将细胞洗2次，随后刮下细胞。在500g将细胞离心5分钟，随后将沉淀贮存在-80℃。在冰冷的50mM Tris-HCl缓冲液中(5μg/ml亮肽素、2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂、10μg/ml苯丁抑制素、以及1mM EGTA，pH7.4)匀化细胞。在36,000g将匀浆离心20分钟。将沉淀重新悬浮在50mM Tris-HCl中。在25℃将膜匀浆的等分试样(～140μg蛋白质)与[3H][Dmt1]DALDA(15-960pM)孵育60分钟。非特异性结合通过混入1μM未标记的[Dmt1]DALDA来评估。借助具有细胞收集器(Brandel公司，盖瑟斯堡市，马里兰州)的GF/B过滤器(Whatman，梅德斯通市，英国)，通过快速的过滤将游离的放射性配体与结合的放射性配体分离开。用10ml Tris缓冲液将过滤器洗三次，随后通过液体闪烁计数测定放射性。利用非线性回归(GraphPad Software，圣地亚哥市，加利福尼亚州)测定结合亲和性(Kd)和受体数目(Bmax)。
蛋白质共轭结合到[Dmt1]DALDA上。利用交联剂SMCC(琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸盐)(Pierce)将[Dmt1]DALDA交联到β-半乳糖苷酶(recombinant E.coli，Sigma-Aldrich)。SMCC与含胺的分子([Dmt1]DALDA的Lys4)反应，以便形成稳定的酰胺键。随后它的马来酰亚胺基末端可以被共轭结合到含巯基的化合物上，以便形成硫醚键合(BioconjugateTechniques by Greg T.Hermanson，Academic Press，Page 234-237)。β-半乳糖苷酶在其天然状态时包含大量自由巯基。β-半乳糖苷酶的摄取提供了利用X-gal的便利的读取。简单地说，在室温下将1ml 5×10-3M[Dmt1]DALDA与1mg SMCC在磷酸盐缓冲液中混合1小时。这将形成“活化的肽”。用磷酸盐缓冲液将“活化的肽”按1∶10稀释。将1mg β-半乳糖苷酶加入到1ml该1∶10的“活化的肽”中，并且在4℃混合2小时或一整夜。
将[Dmt1]DALDA连接到交联剂SMCC上，并且通过质谱分析确认。将SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、然后在4℃贮存。将该样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，然后将其点样在不锈钢的靶平板(target plate)上。通过基质辅助的激光解吸电离-飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)(Applied Biosystems(Voyager DE Pro))以正向反射模式分析。
将RNA结合到[Dmt1]DALDA上，并且通过凝胶电泳确认。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端将合成的RNA低聚物(长度为40个核苷酸)磷酸化。通过凝胶将产物纯化。在1mg EDC(N-[3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亚胺])存在时，将500,000cpm的凝胶-纯化的RNA低聚物与[Dmt1]DALDA结合。将结合的产物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)在15％的聚丙烯酰胺基脲凝胶上单独分析。
将DNA结合到[Dmt1]DALDA上，并且通过质谱分析确认。将SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、并且在4℃与去保护的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小时。孵育后，将该样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，并且将其点样在不锈钢的靶平板上。通过MALDI-TOFMS分析样品。
通过物理性混合RNA和[Dmt1]DALDA-SMCC结合物形成载体复合物。如上该制备[Dmt1]DALDA-SMCC结合物。在用于细胞摄取研究前，在室温下将该RNA分子与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物在PBS中混合15分钟。
通过物理性混合蛋白质和[Dmt1]DALDA-SMCC结合物形成载体复合物。如上所述制备[Dmt1]DALDA-SMCC结合物。在用于细胞摄取研究前，在室温下将该蛋白质分子(即，绿色荧光蛋白，GFP)与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物混合15分钟。
[Dmt1]DALDA-RNA结合物被摄取进入细胞的实验。利用γ-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5’末端将合成的RNA低聚物磷酸化，并且通过凝胶电泳将产物纯化。在1mg N-(3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亚胺)(EDC)存在时，将500,000cpm的凝胶-纯化的RNA低聚物与[Dmt1]DALDA结合(偶合)。将Caco-2细胞(1×106)在DMEM培养基中洗三次，并且在DMEM中预先孵育5分钟。随后在37℃将细胞与[Dmt1]DALDA-[32P]RNA低聚物结合物或非结合的RNA(接近20,000cpm)孵育60分钟。孵育后，将该细胞在DMEM中洗三次，与溶解缓冲液共同稀释，随后在细胞溶解产物中测定放射性。
RNA在与[Dmt1]DALDA-交联剂结合物混合后被摄取入细胞实验。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃或4℃将细胞与1.0ml DMEM孵育60分钟，该DMEM中仅包含[32P]RNA低聚物，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC结合物。随后将细胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸钠溶液中洗一次，以便在溶解缓冲液中孵育30分钟之前减少非特异性结合，随后在细胞溶解产物中测定放射性。
[Dmt1]DALDA-蛋白质结合物被摄取入细胞的实验。将细胞(N2A神经母细胞瘤细胞或Caco-2)平铺在96孔板内(2×104个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与交联有β-半乳糖苷酶的[Dmt1]DALDA或仅与β-半乳糖苷酶孵育1小时。然后用PBS将细胞洗4次。随后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系统(Roche)将细胞染色至少2小时，随后在显微镜下检查。
蛋白质与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物孵育后被摄取入细胞的实验。用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与0.5ml DMEM孵育60分钟，该DMEM：仅包含3μg绿色荧光蛋白(GFP)(A)；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA(B)；或者包含3μg GFP和40μl与SMCC结合的[Dmt1]DALDA(C)。随后将2ml的细胞培养基加入到细胞中，在细胞培养孵育器中孵育了额外的24小时。孵育后，在细胞培养基中将细胞冲洗四次，随后通过激光共聚焦扫描显微镜观察保留在活细胞中的GFP。在340nm处进行激发，而在520nm处测量发射。
凋亡实验。利用Hoechst染料(Molecular Probes，尤金市，俄勒冈州)将凋亡的细胞核染色来确定凋亡。将Hoechst染料加载到细胞培养物中并且孵育15分钟。通过用细胞培养基(不含pH指示剂)冲洗细胞除去过多的Hoechst染料，然后利用荧光显微镜检查细胞(在350nm处激发，而在461nm处(测量)发射)。
实施例2：[Dmt 1 ]DALDA和Gly-Sar被摄取入Caco-2细胞的 时间过程。
当[3H][Dmt1]DALDA与Caco-2细胞在37℃孵育时，早在5分钟时就观察到了细胞溶解产物中的[3H][Dmt1]DALDA，而到30分钟时达到稳态水平(图1A)。1小时的孵育后，细胞溶解产物中回收的[3H][Dmt1]DALDA的总量占全部药物的约1％。与之相比，在同样的实验条件下，[14C]Gly-Sar在5到45分钟时持续增加(图1B)。可以相信测定的放射性可以反映[Dmt1]DALDA的水平，因为先前已经证实[Dmt1]DALDA可以防止肽酶的下降(Szeto等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2001，298：57-61)。为了确定测定的放射性是否与细胞膜相关，将细胞酸洗，以便除去表面结合。图1C显示80.8％的[3H][Dmt1]DALDA可以耐受酸洗，因此判定其存在于细胞内部。已发现[Dmt1]DALDA的摄取在较广的浓度范围内是浓度依赖性的(图1D)。
实施例3：DH对于[Dmt 1 ]DALDA和Gly-Sar的摄取的温度依 赖性和影响。
当在4℃进行孵育时，[3H][Dmt1]DALDA的摄取与在37℃时相比较慢，但是在45分钟时达到76.5％(图1A)，并且在1小时时达到86.3％(图1A)。与之相比，[14C]Gly-Sar的摄取在4℃时完全消除了(图1B)。已知PEPT1对Gly-Sar的摄取是pH依赖性的，在pH6.0时进行的摄取最佳(Terada等，1999，Am.J.Physiol.276：G1435-G1441)。这在我们的研究中得到了证实(图2B)。与之相比，当pH从4.0到7.4变化时，[3H][Dmt1]DALDA的摄取没有变化(图2A)。这种温度和pH依赖性缺乏表明Caco-2细胞内的[Dmt1]DALDA的摄取不是经由PEPT1(肽的转运体1)介导的。
实施例4：DEPC对于[Dmt 1 ]DALDA和Gly-Sar摄取的影响。
为了进一步表明PEPT1没有涉及[Dmt1]DALDA的转运，我们研究了DEPC(焦碳酸二乙酯；0.2mM)对于[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar摄取的影响。DEPC是一种组氨酸残基的修饰试剂，已显示其可以抑制Caco-2细胞内的PEPT1(Terada等，FEBS.Lett.，1996，394：196-200)。将DEPC添加到孵育培养基中显著抑制了[14C]Gly-Sar摄取(图2D)。令人惊奇的是，DEPC不仅没有抑制[3H][Dmt1]DALDA摄取，而且它居然将[3H][Dmt1]DALDA摄取提高了34倍(图2C)。
实施例5：[Dmt 1 ]DALDA在不同的细胞类型中的内在化。
为了证明[Dmt1]DALDA的内在化不限于Caco-2细胞，我们在许多不同的细胞系中比较了[Dmt1]DALDA的内在化。加入了酸洗步骤以便将内在的放射性(耐酸的)与表面结合的放射性(对酸敏感的)区分开来。图3A比较了Caco-2细胞、SH-SY5Y细胞、HEK293细胞、及CRFK细胞中的耐酸的放射性的水平。结果显示[3H][Dmt1]DALDA在所有的细胞类型中都被大量地摄取。
实施例6：与[ 3 H][Dmt 1 ]DALDA的放射性配体结合实验。
为了确定[Dmt1]DALDA的内在化是否经由受体介导的机制，我们进行了放射性配体([3H][Dmt1]DALDA)与制备自Caco-2细胞和SH-SY5Y细胞的膜的结合实验。图3B显示了[3H][Dmt1]DALDA与SH-SY5Y细胞膜的特异性结合。计算出的Kd值是118pM(范围是87-149)，而计算出的Bmax值是96fmol/mg蛋白质(范围是88-104)。这相当于利用中国仓鼠卵巢细胞上表达的重组的人类μ-阿片样受体得到的值(G.-M.Zhao和H.H.Szeto，未公开的数据)。没有观察到与Caco-2细胞膜的高度亲和性的特异性结合(图3B)。已知HEK293细胞没有阿片样受体(Blake等，J.Biol.Chem.，1997，272：782-790)。
实施例7：[Dmt 1 ]DALDA和Gly-Sar从Caco-2细胞中的泄漏。
Caco-2细胞中的[3H][Dmt1]DALDA在＜30分钟的孵育后达到稳态水平，这表明此时该肽从细胞中泄漏的速率与摄取的速率相等。为了测定Gly-Sar和[Dmt1]DALDA从细包中的泄漏量，用[14C]Gly-Sar或[3H][Dmt1]DALDA将Caco-2细胞预载，然后给该细胞换上不包含肽的新鲜培养基。图4A显示37℃时1小时后在培养基中发现了39％的[14C]Gly-Sar。[14C]Gly-Sar的泄漏量在4℃时显著减少了。源自Caco-2细胞的[3H][Dmt1]DALDA的泄漏要快得多，在1小时时该肽的80％泄漏到培养基中(图4A)。与[3H][Dmt1]DALDA的内在化相反(图1A)，温度对于[3H][Dmt1]DALDA从细胞中的泄漏具有重大的影响(图4A)。在用DEPC处理过的细胞中，[Dmt1]DALDA的泄漏减少了(图4B)。由DEPC所致的[3H][Dmt1]DALDA泄漏量的减少与DEPC存在时[3H][Dmt1]DALDA摄取的显著增加(图2C)相一致。另一方面，[3H][Dmt1]DALDA的泄漏不受异搏定(一种P-糖蛋白的抑制剂)的影响(图4C)。异搏定对于[3H][Dmt1]DALDA的细胞摄取也没有影响(图4D)。
如果在[Dmt1]DALDA-蛋白质结合物被细胞摄取后，其被酶切开，[Dmt1]DALDA泄漏出细胞，而蛋白质装载物仍在细胞内，那么这种[Dmt1]DALDA泄漏出细胞就是有利的。
实例8：[Dmt 1 ]DALDA和Gly-Sar的跨细胞转运。
在转孔(transwell)中生长的Caco-2单层被用于研究[3H][Dmt1]DALDA和[14C]Gly-Sar的从顶部到底侧部的转运。图5显示在转孔的顶部面加载了该肽后，在不同的时间时底侧面中的[14C]Gly-Sar和[3H][Dmt1]DALDA  的转运。在60分钟内[3H][Dmt1]DALDA从顶部面转移到底侧面的百分数(10.4％)与转移的[14C]Gly-Sar的百分数(11.9％)相当。据推算，[Dmt1]DALDA的表观渗透系数是1.24×10-5cm/s，而Gly-Sar的表观渗透系数是1.26×10-5cm/s.
实施例9：利用CLSM观察芳香族-阳离子肽的细胞摄取。
为了观察芳香族-阳离子肽的细胞内在化的摄取和模式，借助CLSM研究了两种荧光肽([Dmt1，dnsDap4]DALDA和[Dmt1，atnDap4]DALDA)。图6显示了在Caco-2细胞与0.1μM[Dmt1，dnsDap4]DALDA在37℃孵育15分钟后，该荧光肽的内在化进入Caco-2细胞。出现的荧光弥散于整个细胞质，而没有明显的泡状分布，表明该肽的摄取没有涉及内吞作用，并且该肽没有被封闭在内涵体内。还注意到，该肽被完全排除于细胞核外。在SH-SY5Y细胞与0.1μM[Dmt1，atnDap4]DALDA在4℃孵育30分钟后，[Dmt1，atnDap4]DALDA内在化进入SH-SY5Y细胞，这清楚地支持非能量依赖性的非内吞的摄取机制，原因是内吞是一种依赖能量的过程。
实施例10：肽连接到交联剂SMCC上，并且通过质谱分析确 认。
将SMCC(1μg)和5μg的[Dmt1]DALDA，[Phe1]DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、然后在4℃贮存。将该样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，然后将其点样在不锈钢的靶平板上。通过基质辅助的激光解吸电离-飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)(Applied Biosystems(Voyager DE Pro))以正向反射模式分析样品。该肽的分子量和它们各自的肽-SMCC共轭结合物显示在质谱上(图7)。
实施例11：与蛋白质装载物结合的肽将蛋白质装载物带入细 胞。
利用交联剂SMCC(Pierce)将各种肽交联到β-半乳糖苷酶上(recombinant E.coli，Sigma-Aldrich)。SMCC与含胺的分子([Dmt1]DALDA的Lys4)反应，以便形成稳定的酰胺键。通过质谱分析确认肽-SMCC共轭结合物的形成(图7)。随后它的马来酰亚胺基末端可以被共轭结合到含巯基的化合物上，以便形成硫醚键(Greg T.Hermanson的Bioconjugate Techniques，Academic出版社，234-237页)。β-半乳糖苷酶在其天然状态时包含大量自由巯基。β-半乳糖苷酶的摄取提供了利用X-gal的便利的读取。
简单地说，室温下将1ml 5×10-3M[Dmt1]DALDA、[Phe1]DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]与1mg SMCC在磷酸盐缓冲液中混合1小时。这形成“活化的肽”。用磷酸盐缓冲液将“活化的肽”按1∶10稀释。将1mg β-半乳糖苷酶加入到1ml该1∶10的“活化的肽”中，并且在4℃混合2小时或一整夜。
将细胞(N2A神经母细胞瘤细胞或Caco-2)平铺在96孔板内(2×104个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与β-半乳糖苷酶或与[Dmt1]DALDA交联的β-半乳糖苷酶、[Phe1]DALDA或者[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]孵育1小时。然后用磷酸盐缓冲液将细胞洗4次。随后在37℃用β-半乳糖苷酶染色系统(Roche)将细胞染色至少2小时，随后在显微镜下检查。
当Caco-2细胞与β-半乳糖苷酶孵育时，没有观察到β-半乳糖苷酶的摄取(图8A)。蓝色细胞的存在表明Caco-2细胞内与[Dmt1]DALDA共轭结合的β-半乳糖苷酶的摄取(图8B)。在β-半乳糖苷酶与[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2](图8C)或[Phe1]DALDA(图8D)共轭结合时，也发现了β-半乳糖苷酶的摄取增加。β-半乳糖苷酶仅与SMCC的共轭结合没有增加摄取。
在利用神经N2A细胞或CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)时，也得到了同样的结果。
实施例12：与[Dmt 1 ]DALDA-SMCC结合物的孵育增加了绿色 荧光蛋白(GFP)进入Huh7细胞的摄取。
用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃将细胞与0.5ml DMEM孵育60分钟，该DMEM：仅包含3μgGFP；包含3μg GFP和40μl[Dmt1]DALDA；或者包含3μg GFP和40μl与SMCC结合的[Dmt1]DALDA。随后将2ml细胞培养基加入到细胞中，并在细胞培养孵育器中孵育额外的24小时。孵育后，在细胞培养基中将细胞冲洗四次，随后通过激光共聚焦扫描显微镜观察保留在活细胞中的GFP。在340nm处进行激发，而在520nm处测量发射。
图9(顶部的板块)代表通过Huh7细胞的0.8μm厚的中部的水平光学部分的GFP的图像。图9(底部的板块)代表同一区域内的不同界面的对比图像。
GFP与[Dmt1]DALDA的孵育显示：与仅与GFP孵育相比，细胞胞质内的绿色荧光适中地增加(图9B)。在细胞核内没有观察到绿色荧光。GFP与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物的孵育甚至显示了更多的GFP的摄取(图9C)。这些数据表明：[Dmt1]DALDA可以仅通过修饰的肽与蛋白质的物理性混合增加蛋白质进入细胞的摄取，而该肽与蛋白质之间的化学性结合不是必需的。
实施例13：[Dmt 1 ]DALDA与RNA装载物的结合。
在与多聚核苷酸激酶的反应中，利用γ-32P-ATP在5’末端将合成的RNA低聚物(长度为40个核苷酸)磷酸化。通过凝胶将产物纯化。在1mg EDC(N-[3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳酰亚胺])存在时，500,000计数/分钟的凝胶-纯化的RNA低聚物在与10mM[Dmt1]DALDA的反应中与其共轭连接。将结合反应的产物([Dmt1]DALDA-RNA低聚物)与单独的对照RNA低聚物在15％的聚丙烯酰胺基脲凝胶上分析。在该凝胶上的两条独立的带表示单独的RNA低聚物和[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的结合物(图10)。
实施例14：[Dmt 1 ]DALDA-RNA低聚物的结合物被摄取入 Caco-2细胞。
将Caco-2细胞(1×106)在DMEM培养基中洗三次，并且在加入低聚物之前在DMEM中预先孵育5分钟。随后，将[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的结合物或非结合的RNA(每个接近20,000计数/每分钟)加入到该细胞培养基中，并且在37℃孵育60分钟。
孵育后，除去反应培养基，用DMEM将细胞洗四次，并且在醋酸钠溶液中洗一次，以便减少非特异性结合。最后，将细胞在溶解缓冲液中孵育30分钟，随后在细胞溶解产物中测定放射性。
Caco-2细胞显示：对[Dmt1]DALDA-RNA低聚物的结合物的摄取比对单独的非共轭结合的RNA低聚物的摄取多了三倍多(图11)。因此，[Dmt1]DALDA可以促进RNA低聚物穿过细胞膜。
实施例15：RNA与[Dmt 1 ]DALDA-SMCC连接剂的混合增强 了RNA被摄取入细胞。
通过将RNA和[Dmt1]DALDA-SMCC结合物物理性混合形成该载体复合物。如下所述，通过将[Dmt1]DALDA与交联剂SMCC混合来制备[Dmt1]DALDA-SMCC结合物。在用于细胞摄取研究前，将单链的11-mer[32P]RNA低聚物与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物在室温下混合15分钟。
用DMEM冲洗Huh7细胞(1×106个细胞/孔)，随后在37℃或4℃将该细胞与1.0ml DMEM孵育，该DMEM中仅包含[32P]RNA低聚物(～100,000cpm)，或者包含[32P]RNA低聚物和40μl[Dmt1]DALDA-SMCC结合物。随后将细胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸钠溶液中洗一次，以便将其在溶解缓冲液中孵育30分钟之前除去非特异性结合，随后测定保留的放射性。
RNA低聚物与[Dmt1]DALDA-SMCC在37℃孵育提高了作为时间函数的RNA低聚物的摄取(图12A)。在一小时时，RNA低聚物的摄取在[Dmt1]DALDA-SMCC结合物存在时与单独的RNA孵育相比提高了～20倍。RNA的摄取被[Dmt1]DALDA-SMCC显著地提高了(图12B)。这些数据表明：可以不经过与[Dmt1]DALDA的化学结合物提高RNA的摄取。4℃时的摄取提高了非能量依赖性的非胞吞过程，与[Dmt1]DALDA通过被动扩散进入细胞膜的能力一致。
除了[Dmt1]DALDA-SMCC，与[Phe1]DALDA-SMCC结合物的孵育也可以提高11-mer RNA低聚物的摄取。图12C显示RNA摄取的增加，在37℃与三种不同的肽-SMCC结合物孵育15分钟。
如图13所示，与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物的孵育也可以促进大的多的RNA分子(1350-mer)的细胞摄取，虽然没有对较小的低聚物那么多。
实施例16：[Dmt 1 ]DALDA与DNA低聚物的结合。
将SMCC(1μg)和[Dmt1]DALDA(SS002；5μg)一起溶解在2ml PBS中、在室温下孵育30分钟、随后在4℃与去保护的3’-硫醇基DNA低聚物混合24小时。孵育后，将样品的等分试样与基质(50％的乙腈中饱和的3-羟基吡啶羧酸(HPA)，10mg/ml的柠檬酸铵)以1∶10的比率混合，并且将其点样在不锈钢的靶向平板上。
通过MALDI-TOF MS确认DNA-[Dmt1]DALDA结合物的形成。已发现3’-硫醇基DNA低聚物和[Dmt1]DALDA-DNA共价复合物的分子量分别为6392和7171(图14A)。
实施例17：[Dmt 1 ]DALDA-DNA低聚物的结合物被摄取入细 胞。
利用SMCC将3’-硫醇修饰的20-mer DNA共轭结合到[Dmt1]DALDA上，并且通过质谱分析确认结合物的形成。用32P将结合和非结合的DNA低聚物在其5’-末端用放射性同位素标记(图14B)。
用DMEM冲洗神经N2A(1×106个细胞/孔)细胞，然后在37℃和5％CO2的条件下将该细胞与1ml DMEM孵育2小时或19小时，该DMEM中包含有或没有与DNA低聚物(～100,000cpm)结合的[Dmt1]DALDA。然后将细胞在DMEM中冲洗四次，在醋酸钠溶液中冲洗一次，以便减少非特异性结合。随后将该细胞在溶解缓冲液中孵育30分钟，随后确定保留的放射性。
19小时的孵育后，与[Dmt1]DALDA结合的DNA的摄取多于没有结合的DNA(图15)，表明与[Dmt1]DALDA的结合可以增加DNA的摄取。
实施例18：肽和肽-SMCC结合物对细胞没有毒性。
不管是该肽还是肽-SMCC结合物对培养的细胞是没有毒性的。用[Dmt1]DALDA(1nM到10μM)处理24小时对细胞的生存能力没有影响，这一点通过对N2A细胞、SH-SY5Y细胞或Caco-2细胞的MTT实验测定(MTS assay，Promega，麦迪逊市，威斯康星州)(图16)。对[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]的同样的研究也表明对细胞生存能力没有影响。
将培养的细胞与肽-SMCC结合物孵育对细胞的生存能力也没有影响，这一点通过台盼蓝的摄取测定。台盼蓝仅被细胞膜通透性增加的细胞摄取。在DMEM、和1ml新鲜的培养基、或包含50μl的1mM [Dmt1]DALDA-SMCC结合物、[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]-SMCC结合物、或[Phe1]DALDA-SMCC结合物中将Huh7细胞(1×106)冲洗三次，并且在37℃和5％CO2的条件下孵育24小时。随后用DMEM将细胞冲洗三次，然后将1ml 0.4％台盼蓝加入到该细胞中达2分钟。通过在细胞培养基中冲洗细胞除去过多的染料，通过光学显微镜检查该细胞。
通过光学显微镜对细胞的检查表明：仅与介质孵育的细胞显示了最小的台盼蓝摄取。在与[Dmt1]DALDA-SMCC、[右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2]-SMCC、或[Phe1]DALDA孵育的细胞中没有观察到台盼蓝的摄取增加。与之相比，与DEPC(焦碳酸二乙酯)孵育的细胞产生台盼蓝摄取的显著增加。
培养的细胞与[Dmt1]DALDA-SMCC结合物的孵育也没有引起培养的Huh7细胞的凋亡。将Huh7细胞(1×106个细胞/孔)在DMEM中冲洗三次，并且加入1ml新鲜的培养基。随后，将50μl PBS中经修饰的[Dmt1]DALDA(1mM)或仅PBS(对照)加入到该细胞培养基中，并且在37℃和5％CO2的条件下孵育24小时。孵育后，将1ml可以将凋亡的细胞核染色的Hoechst染料(Molecular Probes，尤金，俄勒冈州)加入到细胞中，并且再孵育15分钟。通过用细胞培养基(不含pH指示剂)冲洗细胞除去过多的Hoechst染料，然后利用荧光显微镜(在350nm处激发，而在461nm处测量发射)比较经[Dmt1]DALDA-SMCC结合物处理的细胞和对照细胞。通过细胞核中的荧光浓度显示凋亡。图17表明：经[Dmt1]DALDA-SMCC处理的Huh7细胞中凋亡的水平与对照细胞中的凋亡水平相同。

Claims (123)

1.一种将分子递送到细胞的方法，所述方法包括将载体复合物与所述细胞接触，其中所述载体复合物包括所述分子和芳香族阳离子肽，其中所述芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中2a是小于或者等于pt+1的最大数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中a等于pt。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少两个正电荷。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少三个正电荷。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是包括两个带正电荷的氨基酸和一个芳香族氨基酸的三肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是水溶性的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个D-氨基酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸的位于C-末端的C-末端羧基被酰胺化。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个非天然存在的氨基酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少四个氨基酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约八个氨基酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约六个氨基酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有四个氨基酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是：酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(DALDA)。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是：2’，6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是：苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是：右旋精氨酸-2’，6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是：2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子是小分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述小分子是具有药物活性的分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是抗生素。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是细胞毒性剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞毒性剂是链霉素。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞毒性剂是阿霉素。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是抗氧化剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗氧化剂是维生素E。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗氧化剂是维生素C。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗氧化剂是β-胡萝卜素。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子是生物分子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物分子是聚氨基酸。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物分子是具有药物活性的分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是内源性的肽或蛋白质。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是酶。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是抗体。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是神经生长因子。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是细胞因子。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是多聚核苷酸。
39.根据权利要求32所述的方法，其中所述具有药物活性的分子是低聚核苷酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是RNA。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述RNA是双链RNA。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述双链RNA是siRNA。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是DNA。
44.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是单链RNA。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述单链RNA是信使RNA(mRNA)。
46.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是核酶。
47.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是反义RNA。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指导序列。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是RNA诱饵。
50.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物分子是多聚氨基酸。
51.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是细菌的细胞。
52.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
53.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述动物细胞是哺乳动物的细胞。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是神经细胞。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是肾上皮细胞。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是肠上皮细胞。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是血管内皮细胞。
59.根据权利要求53所述的方法，其中所述血管内皮细胞是血脑屏障内皮细胞。
60.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是神经胶质细胞。
61.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
62.根据权利要求1所述的方法，其中所述芳香族-阳离子肽包括连接剂。
63.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子包括连接剂。
64.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族阳离子肽是化学性结合。
65.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族阳离子肽是物理性结合。
66.一种包括分子和芳香族阳离子肽的载体复合物，其中所述芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
67.根据权利要求66所述的载体复合物，其中2a是小于或者等于pt+1的最大数。
68.根据权利要求66所述的载体复合物，其中a等于pt。
69.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有最少两个正电荷。
70.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有最少三个正电荷。
71.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽是包括两个带正电荷的氨基酸和一个芳香族氨基酸的三肽。
72.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽是水溶性的。
73.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽包括一个或多个D-氨基酸。
74.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述氨基酸的位于C-末端的C-末端羧基被酰胺化。
75.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽包括一个或多个非天然存在的氨基酸。
76.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有最少四个氨基酸。
77.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有最多约八个氨基酸。
78.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有最多约六个氨基酸。
79.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽具有四个氨基酸。
80.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽的分子式是：酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(DALDA)。
81.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽的分子式是：2’，6’-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
82.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽的分子式是：苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
83.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽的分子式是：右旋精氨酸-2’，6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2。
84.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述肽的分子式是：2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
85.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述分子是小分子。
86.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述小分子是生物分子。
87.根据权利要求86所述的载体复合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。
88.根据权利要求85所述的载体复合物，其中所述小分子是具有药物活性的分子。
89.根据权利要求88所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是抗生素。
90.根据权利要求88所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是细胞毒性剂。
91.根据权利要求90所述的载体复合物，其中所述细胞毒性剂是链霉素。
92.根据权利要求90所述的载体复合物，其中所述细胞毒性剂是阿霉素。
93.根据权利要求88所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是抗氧化剂。
94.根据权利要求93所述的载体复合物，其中所述抗氧化剂是维生素E。
95.根据权利要求93所述的载体复合物，其中所述抗氧化剂是维生素C。
96.根据权利要求93所述的载体复合物，其中所述抗氧化剂是β-胡萝卜素。
97.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述分子是生物分子。
98.根据权利要求97所述的载体复合物，其中所述生物分子是具有药物活性的分子。
99.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是内源性的肽或蛋白质。
100.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是酶。
101.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是抗体。
102.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是神经生长因子。
103.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是细胞因子。
104.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是多聚核苷酸。
105.根据权利要求98所述的载体复合物，其中所述具有药物活性的分子是低聚核苷酸。
106.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是RNA。
107.根据权利要求106所述的载体复合物，其中所述RNA是双链RNA。
108.根据权利要求107所述的载体复合物，其中所述双链RNA是siRNA。
109.根据权利要求106所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是DNA。
110.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是单链RNA。
111.根据权利要求110所述的载体复合物，其中所述单链RNA是信使RNA(mRNA)。
112.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是核酶。
113.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是反义RNA。
114.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指导序列。
115.根据权利要求105所述的载体复合物，其中所述低聚核苷酸是RNA诱饵。
116.根据权利要求97所述的载体复合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。
117.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述芳香族阳离子肽包括连接剂。
118.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述分子包括连接剂。
119.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述分子和芳香族阳离子肽是化学性结合。
120.根据权利要求66所述的载体复合物，其中所述分子和芳香族阳离子肽是物理性结合。
121.一种将分子递送到细胞的方法，所述方法包括将分子和芳香族阳离子肽与所述细胞接触，其中所述芳香族阳离子肽包括：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少三个氨基酸；
(c)最多十个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或者等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为，其中3a是小于或者等于pt+1的最大数，除非当a为1时，pt也可以为1。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族阳离子肽是化学性结合。
123.根据权利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族阳离子肽是物理性结合。
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