CN1815236A - 电化学生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种测量血糖水平的方法，该方法使用提供有逆向型薄层电化学电池的电化学生物传感器。所述电化学电池包含：形成在扁平绝缘衬底上的工作电极；形成在分开的扁平绝缘衬底上以面对工作电极的辅助电极；流度测定电极，该电极形成在用于工作电极或辅助电极的扁平绝缘衬底上与工作电极相距预定距离的地方；粘合剂隔板，该粘合剂隔板拥有具有微通道的样品引入部分，通过将该粘合剂隔板插在工作电极和辅助电极之间，将它们在空间上分开；电极连接器，该电极连接器是在部分辅助电极上用厚的导电材料印刷而成的，用于将工作电极和辅助电极三维连接；和试剂层，该试剂层含有电子传递介体和氧化酶。

Description

电化学生物传感器
技术领域
本发明涉及一种使用电化学生物传感器测量血糖水平的方法。
背景技术
为了诊断和预防糖尿病，定期监测血糖水平的重要性已经被日益强调。现今，为手持读数装置所设计的条形生物传感器，其通常基于比色法或电化学方法，使得个人能够容易地监测血液中的葡萄糖水平。
下面反应式I解释了应用于生物传感器的电化学，使用电子传递介体是其特征。电子传递介体的实例包括：二茂铁及其衍生物；奎宁及其衍生物；含有过渡金属的有机或无机化合物，如六胺钌、含锇聚合物、铁氰化钾等；有机导电盐；和紫罗碱。
反应式I
其中，GOx表示葡萄糖氧化酶；GOx-FAD和GOx-FADH2分别表示氧化和还原状态的葡萄糖-相关的FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)，一种葡萄糖氧化酶的催化剂所需的辅因子；Mox和Mred分别表示电子传递介体的氧化和还原状态。
如反应式I所示，(1)通过葡萄糖氧化酶的催化，血液中的葡萄糖被氧化成葡糖酸，同时辅因子FAD被还原成FADH2。(2)然后，还原的辅因子FADH2将电子传递给介体，使FADH2回到其氧化状态；即，FAD和介体被还原。还原的介体扩散到电极表面。反应循环系列是由施加在工作电极上的阳极电势以及与测量的葡萄糖水平成比例的氧化还原电流驱动的。
与基于比色法的生物传感器相比，电化学生物传感器(例如，基于电化学的生物传感器)的优点在于：不受氧的影响，并且即使是混浊的，也可以不经预处理而使用样品。
电化学生物传感器，尽管对于监测和控制血糖水平是便利的，但是其精确度极大地依赖于血液样品中各种易氧化物种的存在，所述的易氧化物种如抗坏血酸、醋氨酚、尿酸等。
另一严重的测量偏差来自血液血细胞比容(红细胞体积与总血液体积的百分比的度量)。大的血细胞比容水平-依赖性偏差可能导致对那些必须用一次性生物传感器条定期监测血糖水平的人的错误判断，甚至可能造成生命的丧失。
为了减少来自血细胞比容的测量偏差而提出的方法包括使用额外的血细胞比容计分离；或者分配在试剂层上的红细胞排除层(JP 1134461，JP2000338076和US 5658444)；与硅石填料复配的可丝网印刷的试剂/血液分离膏(US 6241862 B1)，以及与双激发电压相结合的化学计量校正方法(WO01/57510 A2)。
但是，这些公开的方法的难点在于，分配的试剂在工作电极上混合(cocktail)，从而需要额外的制造工艺步骤或者印刷试剂层时试剂的大量损失。
从使用者的便利考虑，使用生物传感器在短时间内精确测量少量血液样品中的葡萄糖水平是非常重要的。少量样品，其体积小于1μl、优选0.5μl或更优选0.3μl，这样的样品的精确测量使得可以使用任何身体区域，例如前臂，作为取血位置，从而极大地减少了取血时患者的痛苦。
测量的响应时间周期优选在10秒之内，更优选在5秒之内，最优选在3秒之内。但是，使用迄今已知的技术几乎不可能达到这个所希望的目的。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种使用生物传感器测量血糖水平的方法，该方法可以基于样品流度信息而显著地降低来自血细胞比容的测量偏差。
本发明的另一目的是提供一种使用生物传感器测量血糖水平的方法，该方法通过排除具有异常高的或低的流度的血液样品来降低获得错误信息的可能性。
本发明的再一目的是提供一种使用生物传感器测量血糖水平的方法，该方法可以检测由生物传感器老化造成的血液取样速度的变化，从而提供有关制造时质量控制的信息。
本发明的还有一目的是提供一种使用生物传感器测量血糖水平的方法，该方法可以在不经过预处理的情况下快速而持续地引入血液样品，并且精确而快速地分析血糖水平。
上述目的可以通过提供一种测量血糖水平的方法来实现：该方法使用提供有逆向型薄层电化学电池的电化学生物传感器，所述逆向型薄层电化学电池包含：工作电极，该工作电极形成在扁平绝缘衬底上；辅助电极，该辅助电极形成在分开的扁平绝缘衬底上，使其面对工作电极；流度测定电极，该流度测定电极形成在用于工作电极或辅助电极的扁平绝缘衬底上与工作电极相距预定距离的地方；粘合剂隔板，该粘合剂隔板拥有具有微通道的样品引入部分，通过将该粘合剂隔板插在工作电极和辅助电极之间，将它们在空间上分开；电极连接器，该电极连接器是在部分辅助电极上用厚的导电材料印刷而成的，用于将工作电极和辅助电极三维连接；以及试剂层，该试剂层含有电子传递介体和氧化酶，所述的方法包括以下步骤：(1)将血液样品引入到插入传感器条的读数装置中；(2)在工作电极和辅助电极之间以及流度测定电极和辅助电极之间施加预定的相应势差；(3)随着血液样品的引入，引起工作电极和辅助电极之间电流的第一个改变，从而使这些电极具有相同的电压；(4)用流度测定电极检测血液样品的流量，引起辅助电极和流度之间电流的第二个变化，以将辅助电极和流度测定电极之间的电压调节为相同的值，从而从工作电极检测到的变化中提供有关时差的信息；(5)将试剂层与血液样品充分混合，以在工作电极和辅助电极之间施加预定的电压，引起逆向型薄层电化学电池内的周期性反应；(6)基于步骤(4)中获得的时间信息和步骤(5)中获得的稳态电流，测定血液样品中的葡萄糖水平。
在所述方法中，步骤(1)的血液样品的体积在0.1到0.7μl的范围内，并且在不经预处理的情况下引入到传感器条中。
在所述方法中，步骤(2)的势差是由施加直流电、低频或高频交流电、高阻抗，或者选自方波、三角波、半正弦波和高斯波中的脉冲后，工作电极和辅助电极之间的和流度测定电极和辅助电极之间的电学变化而引起的。
在所述方法中，电学变化归结于电压、电流、阻抗或电容的变化。
在所述方法中，当控制工作电极和辅助电极使它们具有相同的电压时，同时限制血液样品和试剂层进行氧化还原反应。
优选生物传感器的样品引入部分中有宽度为0.5至2mm并且高度为50至250μm范围内的通道，从而便于血液样品的引入。
在所述方法中，含有酶和电子传递介体的试剂层形成在工作电极或辅助电极中的任一个上。
在所述方法的优选实施方案中，生物传感器的试剂层形成在工作电极和流度测定电极或者其中之一上，并且如此安排两个电极，使它们的稳态电流时间常数都在0.05和8.0之间，包括0.05和8.0。
在所述方法的优选实施方案中，电子传递介体是适于促进电子从酶传递给最终电子受体的六胺氯化钌(III)，并且试剂层还包含脂肪酸或其盐和季铵盐，以基本上减少血细胞比容水平依赖性偏差。
根据本发明的方法，可以在不经预处理的情况下快速而持续地引入血液样品，并且在5秒之内精确分析血糖水平。
附图说明
本发明优选实施方案的应用的最佳理解是参考附图，附图中相似的数字用于相似的和相应的部分，其中：
图1是显示根据本发明一个优选实施方案的薄层电化学电池的分解透视图；
图2是显示根据本发明一个优选实施方案的逆向型生物传感器的分解透视图；
图3a是显示根据本发明一个优选实施方案的拥有样品引入部分的逆向型电化学生物传感器的分解透视图，其中在上衬底上形成流度测定电极；
图3b是显示根据本发明一个优选实施方案的拥有样品引入部分的逆向型电化学生物传感器的分解透视图，其中在下衬底上形成流度测定电极；
图4a是插入传感器条的双向读数装置的平面图；
图4b是举例说明根据本发明一个优选实施方案的生物传感器的操作过程的内部电路图；
图5是根据本发明一个优选实施方案的逆向型生物传感器的循环伏安图；
图6是显示根据本发明一个优选实施方案的逆向型(conserve-type)电极与扁平型电极之间响应时间比较的计时电流图；
图7是显示根据本发明一个优选实施方案的逆向型(conserve-type)电极在不同葡萄糖浓度下的响应时间结果的计时电流图；
图8所示的是干扰组分对根据本发明一个优选实施方案的逆向型(conserve-type)电极的影响；
图9所示的是逆向型葡萄糖传感器对葡萄糖标准溶液灵敏度的校正曲线；
图10显示的是通过计时电流法获得的葡萄糖标准溶液逆向型葡萄糖传感器的动态曲线；和
图11是举例说明样品流度(时间函数形式)和血细胞比容水平之间关系的图。
具体实施方式
参考附图，其中在贯穿不同附图使用的相同的参考数字指的是相同或类似的组分(组件)。
根据本发明用于测量血糖水平的生物传感器具有薄层电化学电池，其中分别形成在两个扁平绝缘衬底上的工作电极104和辅助电极105在空间上是被50-250μm厚的压力粘合剂(pressure-adhesive)隔板彼此隔开的，对称或不对称地相互面对，并且通过和工作电极104一起形成在同一衬底上的连接线相互导电相连，该连接线具有印刷在其部分上并且与辅助电极105三维相连的厚导电材料(参见，逆向型电极：E.K.Bauman等，AnalyticalChemistry，vol 37，p 1378，1965；K.B.Oldham in“Microelectrodes：Theoryand Applications，”Kluwer Academic Publishers，1991)。
在薄隔板中，提供微升体积数量级的微通道，用于将血液样品注射到由工作电极104和辅助电极105限定的测量空间中并且将样品保留其中。在薄隔板中，流度测定电极优选位于离工作电极(或辅助电极105)预定的距离处，使得血球体积为40％的氟化血液可以沿着0.5-2mm宽和50-250μm高的微通道在约600ms之内到达工作电极(或辅助电极)，更优选在离工作电极(或辅助电极105)预定的距离处，使得未氟化的血液可以沿着0.5-2mm宽和50-250μm高的微通道在300ms之内、还更优选在200ms之内到达工作电极(或辅助电极)。
参考图3a，显示了根据本发明一个实施方案的逆向型生物传感器，其中与流度测定电极107一起形成在同一衬底上的工作电极104面向辅助电极105，所述辅助电极105形成在隔开的衬底上，起到参比电极作用。图3b显示了根据本发明另一实施方案的逆向型生物传感器，其中与流度测定电极107一起形成在相同衬底上的充当参比电极的辅助电极面向工作电极104。
生物传感器具有这样的结构，其中试剂层组合物溶液可以形成在工作电极104或辅助电极105中的任一个上，并且优选形成在流度测定电极107，以及工作电极104或辅助电极105中的任一个上。
如图3a所示，根据本发明一个实施方案的电化学生物传感器包含下衬底400，下衬底400上构建有工作电极和流度测定电极，这两个电极均涂有试剂层组合物溶液，还构建有由导电材料制成的电极连接器106，用于将工作电极与辅助电极三维连接；中衬底(薄隔板)，其拥有样品引入部分100的切出图案，所述样品引入部分100由样品引入湾101、空气排出通道102和额外的空隙空间组成，其中样品引入湾与空气排出通道交叉，在交叉处留下空隙空间；和上衬底300，上衬底300上构建有起到参比电极作用的辅助电极105，在对应于下衬底流度测定电极的位置处还有电极连接器106，所述的衬底全部以这样一种方式顺序分层，使上衬底上的结构体面对下衬底上的结构体，其中优选试剂层是单独或者和流度测定电极组合形成在工作电极104上的。
具体地，含有酶和电子传递介体的试剂层可以只形成在工作电极104或辅助电极中的任一个上，同时将两个电极排列，使得“稳态电流时间常数”(定义为电子传递介体的扩散系数和稳态电流的乘积与两个电极之间间隙的平方的比率)在0.05至8.0之间，包括0.05和8.0。任选地，试剂层还可以含有脂肪酸和季铵盐。
通过工作电极104和辅助电极105之间的连接线，读数装置与在和工作电极104相同衬底上的生物传感器相连。同样，位于工作电极104的绝缘衬底或辅助电极105的绝缘衬底中任一个上，起到测量样品流度作用的流度测定电极107，形成在离工作电极104或辅助电极105合适的距离处。
在用于在空间上将工作电极104与辅助电极105分开的隔板的一端，形成样品引入部分100，用于通过该部分将恒量的样品引入到生物传感器中。具体而言，样品引入部分100包括样品引入湾101、空气排出通道102和额外的空隙空间103。样品引入湾101与湾末端下面的空气排出通道102交叉，其中在交叉处形成额外的空隙空间。如此以Γ形状形成的样品引入部分100可以将血液样品从生物传感器条的前端精确而便利地引入。特别是，样品引入湾101与空气排出通道102在湾型通道略下处以粗略垂直方式相通，在相通点后形成额外的空隙空间103。此处使用的术语“交叉”是指样品引入湾101和空气排出通道102不是线性排列的，而是在预定点彼此相交。测量过程中，额外的空隙空间103有助于将恒定和精确体积的血液样品保持在湾内，同时将过量的样品通过空气排出通道102排出。此外，额外的空隙空间103起到防止形成气泡的作用，所述气泡经常出现在样品引入湾101和空气排出通道102之间的相通点。气泡的形成可能导致测量不精确。为了确保在不形成气泡的情况下精确取样，将包括额外的空隙空间103的样品引入湾101进行亲水处理是适宜的。
空气排出通道102和样品引入湾101宽度之间的比率不大于1∶2，并且优选在1∶5至1∶2范围内。小于1∶2的比率确保了在样品引入湾101中保留精确量的样品，并且可以使样品高速进到空气排出通道102。
图1中，所示的样品引入湾101和空气排出通道102之间的交角(φ)为90°。但是，该角度可以在从约45°至135°的范围内、优选在从约60°至105°的范围内、最优选在从约75°至105°的范围内变化。
优选样品引入部分100具有用于保留0.1-3.0μl样品的容积。更优选容积在0.1至1.0μl范围内，最优选在0.3至0.7μl范围内。小于0.1μl的样品体积太小而不能给出在生物传感器误差范围内的精确的测量值。另一方面，大于3.0μl的样品体积对于取样而言是过多的。样品引入湾101被用作在其上定位流度测定电极107的地方。
在样品引入部分100和通道的合作下，流度测定电极107进行整个血液样品的流度的测量。由于血细胞比容改变整个血液的流度和电导率，本发明中建议随着整个血液样品的血细胞比容水平成比例地改变通过Γ-形毛细管通道的取样时间。血液样品流度的变化，该变化是由流度测定电极107检测的，可用于校正血糖测量中的血细胞比容水平-依赖性偏差。同时，血液流度在旧的条中或者在形成于工作电极104上的试剂层具有不合适的组成的情况下有极大的变化。因此，由流度测定电极107检测的血液流速可用于计算生物传感器制造的时间或者用于校正在其制造过程中产生的任何误差。
在血液样品从薄层电化学电池的入口顺序或以相反次序通过工作电极104和流度测定电极107的同时，血液样品两次引起电压、电流、阻抗或电容的电学变化，从而提供样品从通道通过期间的信息。因此，利用薄层电化学电池微通道上的样品的流速，生物传感器提供精确测定样品中底物水平或者其制造年限或误差信息的功能。
另外，本发明的生物传感器在上衬底300上可以拥有视窗301，该视窗位于下衬底的流度测定电极部分的上方。视窗301使得可以目测是否填充有样品。
在上述电极结构中，由于酶、样品中含有的底物以及电子传递介体形成的氧化还原反应的周期性作用，电流在几秒钟内达到稳态。在这点上，形成在工作电极或辅助电极中任一个上的试剂层必须容易被由样品通道引入的样品溶解。
当以适当的浓度使用时，六胺氯化钌(III)可以比Fe-基电子传递介体快数十倍地传递电子。根据本发明，试剂层是由包含六胺氯化钌(III)、脂肪酸、季铵盐和辅助酶分散剂的组合物制成的，该组合物易溶于血液并且能够基本上减小血细胞比容水平-依赖性偏差。
因此，本发明的生物传感器包含能够降低由血液血细胞比容水平造成的测量误差的试剂层组合物溶液。即，试剂层组合物溶液包含酶、电子传递介体、水溶性聚合物、脂肪酸和季铵盐。
在生物传感器中，试剂层组合物溶液起到除排除诸如抗坏血酸、醋氨酚和尿酸的干扰组分之外，还显著减小血细胞比容影响的作用。
如从反应式I可见，酶与所关心的代谢物反应，同时辅因子被还原。然后，还原的辅因子将电子传递给电子传递介体，从而定量地分析所关心的代谢物。
此处，应该注意的是，尽管本发明被描述为用于分子血糖水平的生物传感器，但是本发明可以将合适的酶和电子传递介体引入到电极体系中，从而可以定量分析多种样品，包括生物材料，如代谢物，例如胆固醇、乳酸、肌酸酐、蛋白质、过氧化氢、醇类、氨基酸，以及酶，例如GPT(谷丙转氨酶)和GOT(谷氨酸草酰醋酸氨基移转酶)，环境材料、农业和工业材料，以及食品材料。即，一旦选择和电子传递介体相呼应的合适的酶，就可以分析多用途的代谢物的水平。例如，类似用于定量分析葡萄糖水平的葡萄糖氧化酶，乳酸氧化酶可用于乳酸、胆固醇氧化酶用于胆固醇、谷氨酸氧化酶用于谷氨酸、辣根过氧化物用于过氧化氢，以及醇氧化酶用于醇。优选地，用于本发明的酶选自GOx(葡萄糖氧化酶)、GDH(葡萄糖脱氢酶)、胆固醇氧化酶、胆固醇酯化酶、乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脱氢酶、胆红素氧化酶、葡萄糖脱氢酶。在本发明的实施例中，生物传感器采用葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶来分析血糖水平。
当与还原的酶辅因子反应时，电子传递介体被还原。还原的电子传递介体向电极表面的扩散造成向工作电极施加阳极电势，从而产生电力。
至于电子传递介体，可以使用二茂铁或其衍生物、醌或其衍生物、有机导电盐或者紫罗碱。优选地，电子传递介体是能够形成氧化还原电对的混合价态化合物，包括六胺氯化钌(III)、铁氰化钾、亚铁氰化钾、DMF(二甲基二茂铁)、二茂铁鎓(ferricinium)、FCOOH(二茂铁一羧酸)、TCNQ(7，7，8，8-四氰基喹啉并二甲烷)、TTF(四硫富瓦烯)、Nc(二茂镍)、NMA+(N-甲基吖啶鎓)(N-methylacidinium)，TTT(四硫并四苯)，NMP+(N-甲基吩嗪鎓)、氢醌、MBTHDMAB(3-二甲基氨基苯甲酸)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮(benzothiozolinone)腙、2-甲氧基-4-烯丙基苯酚、AAP(4-氨基安替比林)、二甲基苯胺、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrene)、4-甲氧基萘酚、TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)、2，2-连氮基-二-[3-乙基苯噻唑啉磺酸酯]、邻联茴香胺、邻甲苯胺、2，4-二氯苯酚、4-氨基非那宗、联苯胺和普鲁士蓝。
它们当中，六胺氯化钌(III)是优选的，因为其表观电位低到足以使各种干扰组分如抗坏血酸、醋氨酚和尿酸的影响最小化。
帮助酶反应的水溶性聚合物基于固态试剂层组合物总重量的含量为0.1至10重量％。适合用于本发明的水溶性聚合物的实例包括PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、全氟磺酸酯、HEC(羟乙基纤维素)、HPC(羟丙基纤维素)、CMC(羧甲基纤维素)、乙酸纤维素和聚酰胺，其中优选PVP和HPC。
由于在减小血细胞比容水平-依赖性偏差中起重要作用，在本发明的试剂层组合物溶液中既含脂肪酸又含季铵盐。
使用时，除了极大地有助于降低血细胞比容水平-依赖性偏差外，脂肪酸还趋向于缩短生物传感器的线性动态范围，特别是在高浓度区域。
在加入到溶液中之前，将脂肪酸溶解在水或与水混溶的溶剂中。脂肪酸的用量为溶液中所有固体组分的0.1至20重量％。合适的是含有4-20碳原子的脂肪酸或其盐。优选具有6-12碳原子的烷基链的饱和脂肪酸或其盐。适合用于本发明的脂肪酸的实例包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸和月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸和花生四烯酸。
和脂肪酸合作，季铵盐可以进一步减小血细胞比容水平-依赖性偏差。
合适的季铵盐可以示例为以下的卤化物：十二烷基三甲铵、ecyl三甲铵(ecyltrimethylammonium)、肉豆蔻基三甲铵、鲸蜡基三甲铵、十八烷基三甲铵、四己铵等。季铵盐的用量为试剂层组合物溶液所有组分的0.1至30重量％。
试剂层是通过将一滴试剂层组合物溶液借助于分配器分配而简单地形成在工作电极上的。试剂层组合物液滴优选为约300-500nl，或更优选200nl或更少。
现在将描述使用本发明的生物传感器测量血糖水平的方法。该方法是使用读数装置按照如下步骤进行的，其中如图4a所示，将传感器条509应用于读数装置。生物传感器的操作概念示意性地举例说明于图4b的电路图中。
在步骤1中，将取自前臂的血液样品引入到读数装置500，读数装置500中插有传感器条(薄层电化学电池)509。
适合在患者最小痛苦情况下定量分析的样品体积在0.1至0.7μl范围内。本发明的生物传感器不仅不要求处理用于分析的血液样品，而且能够精确和快速地测量血糖水平。这部分归因于在宽为0.5至2mm且高为50至250μm范围内的通道，该通道形成在生物传感器的样品引入部分100，以便于通过毛细管作用引入血液样品。
在步骤2中，分别在工作电极104和辅助电极105之间以及在流度测定电极107和辅助电极105之间产生恒定势差。
生物传感器一检测到生物传感器条插入到读数装置中(步骤1)，就在工作电极104和辅助电极105之间以及在流度测定电极107和辅助电极105之间施加预定恒定的电势。在总的电路形成开路的情况下，施加在工作电极104的电势独立于施加在辅助电极107的电势。根据样品引入的电学变化变成了开路状态的势差，并且势差信号被用作生物传感器测量进程开始的信号。
含有酶和电子传递介体的试剂层形成在工作电极104或辅助电极中的任一个上，同时将这些电极以这样的一个间隔排列，使得稳态电流时间常数在0.05至8.0范围内。为了测量血糖水平，生物传感器中采用GOx(葡萄糖氧化酶)或GDH(葡萄糖脱氢酶)。此外，选择六胺氯化钌(III)作为电子传递介体。出于上述原因，试剂层还可以含有脂肪酸和季铵盐。
将试剂层组合物溶液只分配在工作电极104或者同时分配在工作电极104和流度测定电极107上，并且优选将这些电极以这样的一个间隔排列，使得稳态电流时间常数在0.05至8.0范围内。
在步骤3中，血液样品的引入引起工作电极104和辅助电极105之间的初步电学变化，并且控制电极使它们具有相等的电压。为了获得相等的电压，让电流在它们之间流动，同时将样品和试剂层之间的氧化还原反应限制在几秒钟之内。持续保持氧化还原反应的限制0.001至3秒。
条插入到读数装置中不造成整个电路的连接。当血液样品通过样品引入部分100引入时，一级瞬间电流被感应，并且开始流动期间的测量。引入到条的通道口的样品中含有电解质，因此起到将电路切换到开的状态，使电流在工作电极104和辅助电极105之间通过它们之间的电极连接器106流动。在使工作电极104和辅助电极105之间的电压相同的情况下，电流将样品的氧化还原反应限制在样品与试剂层混合的期间，该期间优选3秒，并且更优选2秒或更短。在该步过程中，电路保持闭合。
在步骤2中，当接触血液样品时，流度测定电极107感应其流度以引起二级电学变化，该变化导致将辅助电极105和流度测定电极107之间的电压控制在相同的电压。因此，检测到关于一级和二级电学变化之间的时差的信息。
一旦样品接触额外的空隙空间103，第二瞬间电流被感应，并且记录第一和第二瞬间电流之间的时间间隔。具体而言，当被引入到薄层电化学电池的口时，样品通过工作电极104和流度测定电极107(顺序或以相反次序)，引起电压、电流、阻抗或电容的电学变化两次，该电学变化产生关于样品通过通道的流动期间的信息。
优选将流度测定电极107定位在离工作电极104预定的距离处，使得具有40％血球体积的氟化血液可以沿着0.5-2mm宽、50-250μm高的通道在约600ms内到达工作电极，并且非氟化的血液可以沿着0.5-2mm宽、50-250μm高的通道在300ms内、更优选在200ms内到达工作电极。
与流度测定电极107一起，样品引入部分100和通道形成一个适合测量整个血液样品流度的结构。样品的流度是作为速度的函数而测定的，所述的速度是样品填充样品引入部分100口附近的电极的第一接触点和流度测定电极107之间空间的速度，流度测定电极107位于空隙103或空气排出通道102中的任一个处。
形成在50-250μm厚的薄隔板中的通道包括线形样品引入湾101和空气排出通道102，所述样品引入湾101中保持恒定体积的样品，而所述空气排出通道102有助于样品引入部分100的毛细管作用。由于血细胞比容改变整个血液的流度和电导率，所以血液通过生物传感器条Γ-型毛细管通道的时间间隔与整个血液样品的血细胞比容水平成比例地变化。通过流度测定电极107所检测的，血液样品流度的这种变化可用于校正血糖测量中的血细胞比容水平-依赖性偏差。此外，在旧的条中或者在形成在工作电极104上的试剂层具有不合适的组成的情况下，血液流度也有极大的变化。因此，流度测定电极107检测的血液流速可用于计算生物传感器制造的时间或用于校正其制造过程中的误差。
样品填充时间X和血细胞比容水平Y之间的拟合等式如下：
数学式I
Y＝-72.23+0.58691X-0.00084073X2-1.1211×10-6X3+5.7521×10-9X4-9.1172×10-12X5
流度测定电极107鉴别血液样品的异常流度，所述异常流度可能来自血液样品过高或过低的血细胞比容或者含气泡的血液样品的引入。在这样的异常情况下，根据安装的程序，在读数装置上出现警告信息或错误代码。
在步骤5中，当血液样品与在工作电极104上的试剂层充分混合时，在工作电极104和辅助电极105之间施加预定的电压，从而引起逆向型薄层电化学电池中的周期性反应，接着读出如此获得的稳态电流。所述稳态是在数秒内，如2-10秒达到的。与常规的扁平型电极相比，本发明的逆向型电极的优势在于响应时间快和高稳态电流。尽管依赖于反应速率和所用的电子传递介体的电子传递速度，但是逆向型电极在短时间内即提供稳态电流。
在步骤6中，利用步骤4中获得的时间信息和步骤5中获得的稳态电流，生物传感器测定样品中底物的水平。根据本发明，血糖水平的测量是在5秒之内、优选在4秒之内、更优选在3秒之内进行的。
如上所述，根据本发明的血糖水平的测量是用以下方法实现的：借助于合适的酶和电子传递介体，将取自血液的所关心的分析物进行氧化还原反应的连续循环，然后测定反应过程中传递的电子量，从而定量分析底物。此外，样品流经薄层电化学电池微通道的速度的信息有助于更精确地测定底物的量和获得关于生物传感器制造或储存状态的信息。
备选地，可以将步骤1至步骤6改进如下：
(1)将血液样品引入到插入条的读数装置(步骤1)。
(2)在工作电极104和辅助电极105之间以及流度测定电极107和辅助电极105之间施加具有高恒定频率的交流电。施加到工作电极104和流度测定电极107的电压是独立的，其中总的电路形成开路(步骤2)。尽管将交流电施加在工作电极104和辅助电极105之间以及流度测定电极107和辅助电极105之间，但是根据样品引入的电学变化表现在电容上，使得它可以用作生物传感器测量进程的开始信号。
(3)引入到条中通道口的样品引起工作电极104和辅助电极105之间的电容的一级变化。在让相同的电压施加在工作电极和辅助电极105上的情况下，这种电容变化使氧化还原反应终止几秒，这期间样品与试剂层混合，混合时间优选为3秒或更短，更优选2秒或更短。在该过程中，电路保持闭合(步骤3)。
(4)当样品接触流度测定电极107时，二级电容变化发生，并且使辅助电极105和流度测定电极107具有相同的电压，从而提供有关由工作电极104检测的变化的时差的信息(步骤4)。
(5)当血液样品与试剂层在工作电极104上充分混合时，将预定的恒定势差施加在工作电极104和辅助电极105之间，从而开始逆向型薄层电化学电池的周期性反应特性。在几秒之内，并且优选在2秒之内，电极之间流动的电流达到稳态并且读数(步骤5)。
(6)基于步骤4中获得的时间信息和步骤5中获得的稳态电流。测定测试样品中的底物水平。整个过程，从样品引入到底物水平的测定，是在数秒钟内、优选4秒之内、更优选3秒之内完成的。
所述方法的另一个实施方案实现如下：
(1)当将血液样品引入到插入条的读数装置中时，工作电极104和辅助电极105之间以及流度测定电极107和辅助电极105之间的高阻抗输出电路在读数装置中被激活(步骤1)。
(2)由于引入到条中通道的口中的样品含有电解质，在电极和样品的界面处形成一级势差(步骤2)。
(3)检测该变化，让相同的电压施加到工作电极上，从而使氧化还原反应终止几秒，这期间样品与试剂层混合，混合时间优选为3秒或更短，更优选2秒或更短。在该过程中，电路保持闭合(步骤3)。
(4)当样品接触流度测定电极107时，二级电压变化发生，并且使辅助电极105和流度测定电极107具有相同的电压，从而提供有关由工作电极104检测的变化的时差的信息(步骤4)。
(5)当血液样品与试剂层在工作电极104上充分混合时，将预定的恒定势差施加在工作电极104和辅助电极105之间，从而开始逆向型薄层电化学电池的周期性反应特性。在几秒之内，优选在2秒之内，电极之间流动的电流达到稳态并且读数(步骤5)。
(6)基于步骤4中获得的时间信息和步骤5中读出的稳态电流，测定测试样品中的底物水平。整个过程，从样品引入到底物水平的测定，是在数秒钟内、优选4秒之内、更优选3秒之内完成的。
另外，可以在工作电极104和辅助电极105之间以及流度测定电极107和辅助电极105之间施加直流电、低频或高频交流电、高阻抗，或者各种脉冲，如方波、三角波、半正弦波或高斯波，以定量分析所关心的底物。但是在这些情况下，基于样品引入后发生的化学变化的取样时间的确定独立于在工作电极104和参比及辅助电极105之间施加和测量电信号的时间，而是与关于样品在工作电极和流度测定电极之间通过时间的信息一起，用于校正由化学反应造成的电化学变化。这是用预先安装的软件进行的。
利用样品流度信息，除了通过排除具有异常高或低流度的血液样品而降低获得错误信息的可能性，根据本发明的测量方法还可以基本上减小血细胞比容水平-依赖性偏差。此外，生物传感器本身可以检测由其老化造成的血液取样速度的变化，从而提供有关制造时的质量控制的信息。而且，本发明测量方法的优点在于，可以在不进行预处理的情况下，快速和不变地引入血液样品，并且在5秒内精确分析血糖水平。
拥有样品引入部分100的生物传感器的优点在于以下：
(1)气袋现象，该现象在通过毛细管作用快速引入样品时可能出现在样品引入湾和空气排出通道的交点处，通过在相通点后面提供额外的空隙空间而得以消除。
(2)由于样品引入部分100被窄口很好地围住，并且空气排出通道和整个通道被上衬底300覆盖，本发明的生物传感器泄漏引入的样品而使使用者的手被样品污染的可能性几乎没有。此外，生物传感器中可以含有具有最小蒸发作用的一致的样品浓度，从而改善分析的再现性。
(3)提供有样品引入部分100的生物传感器，其中样品引入湾101与空气排出通道102以大致垂直的方式相通，能够快速引入预定量的取样血液，并且提高精确度和再现性。
(4)最后，本发明的生物传感器的血液取样更加便利，因为尖端经过改装的样品引入部分100可以容易地与主体部分接触。
如下实施例将用于更好地理解本发明，所列出的这些实施例是为了举例说明，而不是限制本发明。
实施例1：制备不含脂肪酸的试剂层组合物溶液
将含有30mg六胺氯化钌(III)(41.6重量％)、1mg羧甲基纤维素(1.4重量％)、1mg Triton X-100(14重量％)和40mg葡萄糖氧化酶(55.6重量％)的混合物溶解在1ml PBS缓冲液(pH 6.4)中，随后滤除未溶解的粒子。将如此获得的试剂溶液放在气动分配器(EFD XL100)的注射器中。
实施例2：制备含有脂肪酸的试剂层组合物溶液
将含有30mg六胺氯化钌(III)(41.6重量％)、1mg羧甲基纤维素(1.4重量％)、5mg聚乙烯吡咯烷酮(4重量％)、1mg Triton X-100(1.4重量％)、20mg月桂酸(15.7重量％)、30mg肉豆蔻基三甲基溴化铵(23.6重量％)和40mg葡萄糖氧化酶(55.6重量％)的混合物溶解在1ml PBS缓冲液(pH 6.4)中，随后滤除未溶解的粒子。将如此获得的试剂溶液放在气动分配器(EFDXL100)的注射器中。
实施例3
在该实施例中，描述测量血糖水平的方法。使用图2和3b所示的辅助电极105作为薄层电化学电池型生物传感器中的参比电极。用以下方法制造用于测量血糖水平的薄层电化学电池。
如图2、3a和3b所示，将工作电极104，以及电极连接器106，该电极连接器106足够厚以和辅助电极三维连接，用导电碳膏进行丝网印刷，然后在140℃固化5分钟。接着，将电路连接器用银膏丝网印刷在电极连接器106的一端上至中衬底200的厚度。同样，将参比(辅助)电极105用碳膏丝网印刷在上衬底300上并且在与下衬底400的电极相同的条件下固化。最后，将银膏丝网印刷在参比电极105的末端以提供电路连接器。
通过压制双面聚酯带而制备中衬底200，其中样品引入湾101、空气排出通道102和额外的空隙空间103以这样一种方式排列，使得流度测定电极107的末端位于额外的空隙空间。在这种连接中，中衬底的结构被设计成空气排出通道102与样品引入湾101的宽度比为2∶1，并且样品引入部分100的容积为0.5μl。
为了在生物传感器中组装衬底，如图2、3a和3b所示，将中衬底200压在印刷了电极的下衬底400上，随后将实施例1和2中制备的试剂层组合物溶液涂敷于通过样品通道暴露的工作电极104上。在将工作电极在45℃干燥30分钟后，以这样的方式将上衬底300压在中衬底200上，使形成在各自衬底上的电路连接器彼此接触，从而制造出逆向型生物传感器。图3a和3b分别显示了具有形成在下衬底和上衬底上的流度测定电极的生物传感器。
为了使用制造的传感器测量血糖水平，用传感器条从患者前臂取0.5μl血液。一旦条插入读数装置，它就开始操作。将条插入到读数装置中使得200mV的势差施加在电池中的工作电极104和辅助电极105上。
更具体而言，插入条的读数装置操作如下。
当通过将传感器条与读数装置500合并而引入血液样品时，(步骤1)，在工作电极104和辅助电极105之间以及流度测定电极107和辅助电极105之间给出预定的势差(步骤2)。引入到条的通道口的样品引起工作电极104和辅助电极105之间电信号的一级变化，该一级变化导致将相同的电压施加在工作电极和辅助电极105(步骤3)。然后，当感应样品流时，流度测定电极107产生二级电变化，该电变化也使辅助电极105和流度测定电极107具有相同的电压，从而从工作电极104检测的变化提供有关时差的信息(步骤4)。当血液样品与试剂层在工作电极104上充分混合时，在工作电极104和辅助电极105之间施加200mV，以开始逆向型薄层电化学电池中的周期性反应，随后读出如此获得的就绪电流(步骤5)。最后，基于步骤4中获得的时间信息和步骤5中读出的稳态电流测定样品中的底物水平(步骤6)。
经过这一系列步骤，本发明的生物传感器可能容易、快速和精确地测量血糖水平。
实验实施例1：依赖于逆向型葡萄糖传感器扫描速度的循环伏安图
使用实施例3制造的逆向型电极，根据扫描速度检测循环伏安图。
测试是在含有0.05mM[Fe(CN)6/[Fe(CN))6]4-的1M KCl溶液中进行的。在3mV/s或更小的扫描速度下，本发明的电极显示出S-曲线，这是微电极稳态电流的特征。在限制条件下，在两个电极表面的浓度变为零，同时它们之间的电流与电势无关，而且，限制电流也与电势无关。随着扫描速度的提高，可逆和不可逆阶段之间的滞后也增加。当v变为20mV/s或更大时，本发明逆向型电极中的CV显示出与扁平型电极相同的信号形状，而不是S信号形状。结果示于图5中。峰分离发生在约55mV的CV处，表示高度可逆的电子传递在电极和[Fe(CN)6]3-/4-之间进行。
总之，由于在线性扫描伏安计上将半球形扩散改变为径向扩散，这些结果类似于随机组装的微电极的研究结果，表明本发明的碳电极具有与由随机大小的碳粒子形成的微电极类似的性质。
实验实施例2：逆向型葡萄糖传感器和扁平型传感器之间计时电流响应时间的比较
下面，将实施例3中制造的逆向型电极的计时电流响应时间与排列在一个绝缘衬底上的扁平型电极的计时电流响应时间进行比较。
与扁平型电极相比，逆向型电极具有更高的样品响应速度和更大的稳态电流。结果示于图6。如果反应速率和所用电子传递介体的电子传递速率恰当，则逆向型电极在非常短的时间内提供稳态电流。就此而论，引入稳态时间常数(t*＝Dt/d2)来确定随电极排列和试剂层组成而变化的稳态电流的条件。
在根据本发明一个实施方案制造的生物传感器的响应曲线中，在电极之间100-μm间隙的情况下，达到稳态电流所需的时间约2秒，电子传递介体六胺氯化钌(III)的扩散系数为1.8×10-5cm2/s，因此t*＝0.36。
先前的研究结果(J.F.Cassidy等，Analyst，118，415(1993))的教导是，当t*＞0.01时获得稳态电流。本发明提出的生物传感器满足0.05≤t*≤8的条件。
图7显示了随着葡萄糖浓度从2.77增加到33.3mM的计时电流响应时间结果。响应时间随着葡萄糖浓度而增加。但是，如图中所示，测试的所有情况下都可以在2秒之内决定稳态电流。这样的快速和完全的稳态电流响应使得其可以以更快的速度处理数据，并且增强电极的分析工具(analytical implement)。
实验实施例3：干扰组分对逆向型葡萄糖传感器的影响
测量干扰组分如抗坏血酸、醋氨酚和尿酸对如实施例3所述制造的具有0.5μl样品引入部分100的逆向型葡萄糖传感器的影响。
具体地，测量在(a)177mg/dL葡萄糖在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的溶液、(b)177mg/dL葡萄糖+660μM醋氨酚在PBS缓冲液中的溶液、(c)177mg/dL葡萄糖+570μM抗坏血酸在PBS缓冲液中的溶液和(d)177mg/dL葡萄糖+916μM尿酸在PBS缓冲液中的溶液的相应的响应电流。
通过读出在工作电极104上施加+0.2V电势(相对于参比电极)5秒后的计时电流响应，测定电流。结果示于图8。
如图8所见，在只含有177mg/dL葡萄糖(线a)和与660μM醋氨酚组合(线b)、570μM抗坏血酸(线c)或916μM尿酸(线d)的PBS缓冲溶液的结果之间没有显著差别。因此，这些数据显示在施加+0.2V电势时，干扰材料的存在对传感器没有显著的影响。
实验实施例2：逆向型葡萄糖传感器对葡萄糖标准溶液的校正曲线
用葡萄糖标准溶液试验实施例3中制备的逆向型葡萄糖传感器的灵敏度。
具体而言，在用于相对于参比电极施加0.2V电势的电场存在下，在0、50、150、300、450或600mg/dL的每一葡萄糖浓度测量十次电流值。应用到样品引入部分的样品量为0.5μl并且填充时间不超过200ms。测量是在引入样品2秒后通过施加0.2V 3秒钟而进行的，并且在5秒内读出电流值。结果示于图10。
图10显示了在0mg/dL(曲线a)、50mg/dL(曲线b)、150mg/dL(曲线c)、300mg/dL(曲线d)、450mg/dL(曲线e)和600mg/dL(曲线f)的葡萄糖浓度下获得的动态响应曲线。
如从曲线清楚的是，本发明的生物传感器可以达到稳态电流，从而确保快速和精确测量。
在本发明的生物传感器中，斜率为0.093[μA(mg/dL)]并且相关系数为0.997。这些结果证明电化学生物传感器具有优异的线性灵敏度(图9)。
实验实施例5：血液流度测量和血细胞比容偏差校正
使用如实施例3中制造的拥有流度测定电极的逆向型葡萄糖传感器，进行血液流度测量和血细胞比容偏差校正试验。
将200mV的电势施加到工作电极104和流度测定电极107(相对于参比电极105)。当通过样品引入湾101引入血液样品时，检测第一次突然的电流变化，并且开始时间测量。一旦样品到达空隙103，立即检测第二次电流波动，并且记录第一次和第二次电流波动之间的间隔。样品引入时间与血细胞比容水平之间的关系示于图11。实验是用含有180mg/dL葡萄糖并且血细胞比容水平不同的经过氟化钠处理的全血进行的。
由上述结果获得拟合等式。
[数学式1]
Y＝-72.23+0.58691X-0.00084073X2-1.1211×10-6X3+5.7521×10-9X4-9.1172×10-12X5
(其中Y是从用流度测定电极测量的样品填充时间X计算的血细胞比容水平)
表1显示了从样品填充时间的速度计算的血细胞比容水平。
   表1、从实施例3制备的生物传感器的
   样品填充时间计算的血细胞比容水平。
  制备的样品的血细胞比容(％) 速度(ms)   计算的血细胞比容(％)
  30％   326   30.3％
  35％   352   32.8％
  40％   530   41.8％
  45％   634   44.0％
  50％   1129   50.1％
  55％   1791   54.7％
在分开的实验中，校正曲线是在不同血细胞比容水平下用全血获得的，并且血细胞比容水平与响应斜率之间关系列示于下面表2。
    表2、不同血细胞比容水平下的校正曲线。
  血细胞比容   等式(y＝电流μA；x＝葡萄糖)
  30％   y＝0.035934x-1.7228
  35％   y＝0.030559x-1.31815
  40％   y＝0.025831x-1.0137
  45％   y＝0.021752x-0.80945
  50％   y＝0.018322x-0.7054
  55％   y＝0.015539x-0.70155
将以这种方式得到的校正因子用于校正相对于具有40％血细胞比容水平的全血的测量的葡萄糖水平，从而得到可以提供与血细胞比容无关的葡萄糖浓度的生物传感器。所述装置首先读取样品引入的速度，然后测定血液样品中的血细胞比容水平。并且，所述装置利用相应的校正曲线从测量的电流中确定葡萄糖水平。表3显示了如上所述进行的实验的结果。
           表3、全血中的葡萄糖浓度
血细胞比容％   葡萄糖YSI2300(mg/dL)   校正的血细胞比容(mg/dL)
30％   111202381   117186392
35％   138200276   141207277
40％   107196266   112195264
45％   103190367   105189363
50％   102142253   107143256
55％   125241332   144240331
样品引入速度是用流度测定电极测量的，并且使用表2的校正曲线来计算全血中的葡萄糖水平。
流度测定电极还区分异常流度的血液样品，即具有过高或过低血细胞比容水平的样品以及由于形成气泡而造成不正常的血液样品的引入。在这样的情况下，可以编程读数装置以发出测量的警告信息或者错误代码。
实验实施例4：由含有脂肪酸的试剂层减少的血细胞比容干扰组分
如实施例4中制备生物传感器条。将肝素化全血样品离心，以分离血浆和血球，将它们再次混合以获得血细胞比容水平为20、40和60％的三种不同的血液样品。使用用实施例1或2的试剂层制备的生物传感器在三种不同的葡萄糖浓度下测量血细胞比容对葡萄糖测量的影响。结果列于表4和5。
           表4、使用用实施例1的试剂层制备的生物传感器测量血细胞比容对葡萄
                                        糖测量的影响
  样品             1            2            3
  血细胞比容水平   20   40   60   20   40   60   20   40   60
  YSI葡萄糖水平(mg/dL) 137 126 113 264 238 228 389 377 339
  实施例1试剂-基生物传感器 175 125 88 365 231 146 544 369 114
  相对于40％血细胞比容水平的偏差％* 29 0 -22 42 0 -34 43 0 -66
*相对于40％血细胞比容水平的偏差％＝{(生物传感器测量的葡萄糖水平/YSI测量的葡萄糖水平)/(生物传感器在40％血细胞比容测量的葡萄糖水平/YSI在40％血细胞比容测量的葡萄糖水平葡萄糖)-1}×100
                 表5、使用用实施例2的试剂层制备的生物传感器测量血细胞比容对葡萄
                                             糖测量的影响
  样品             1              2           3
  血细胞比容水平(％)   20   40   60   20   40   60   20   40   60
  YSI葡萄糖水平(mg/dL) 120 111 107 212 199 191 435 398 374
  实施例2试剂-基生物传感器 133 114 99 241 201 185 423 382 334
  相对于40％血细胞比容水平的偏差％* 8 0 -10 13 0 -4 1 0 -7
表5总结的结果显示，基于实施例2试剂的生物传感器对于不同的血细胞比容水平(从20％至60％)具有充分减小的干扰响应，其测量偏差相对于40％血细胞比容水平小于10％。
如此前所述，利用样品流度信息，除了通过排除具有异常高或低流度的血液样品而降低获得错误信息的可能性，根据本发明的测量方法还可以基本上减小由血细胞比容造成的偏差。此外，生物传感器本身可以检测由其老化造成的血液取样速度的变化，从而提供有关制造时的质量控制的信息。而且，本发明测量方法的优点在于，可以在不进行预处理的情况下，快速和不变地引入血液样品，并且在数秒、优选5秒内精确分析血糖水平。
此外，生物传感器，该生物传感器提供有用于可以将样品不经预处理地快速和不变地引入的样品引入部分100，以及能够检测全血样品流度的流度测定电极107，具有简单的结构并且容易制造。可以将0.1-0.7μl的样品在不经预处理的情况下不变地引入到生物传感器中。生物传感器的电极显示优异的再现性。生物传感器基于逆向型(conserve-type)薄层电化学电池结构，其中工作电极104和辅助电极105对称或不对称地相互面对，在电极之间设置几百μm间隙。在这样的电极结构中，由于氧化还原反应的周期性作用，电流在2秒之内达到稳态，所述的氧化还原反应是由酶、样品中含有的底物和电子传递介体形成的。在这点上，形成在工作电极或辅助电极任一个上的试剂层容易被通过样品通道引入的样品溶解。本发明中使用的六胺氯化钌(III)可以比Fe-基电子传递介体快数十倍地传递电子，并且容易溶解。另外，生物传感器中采用的试剂层组合物可以充分减小由血细胞比容造成的测量偏差，从而排除干扰组分、电极活化组分和血细胞比容的影响。
实施例是根据本发明优选实施方案描述的。但是，应该理解这样的公开内容不限于本发明的明显描述。认为本发明的说明书和权利要求覆盖在本发明真实范围内的所有变体和修改。

Claims (13)

1、一种测量血糖水平的方法，该方法使用提供有逆向型薄层电化学电池的电化学生物传感器，所述逆向型薄层电化学电池包含：
工作电极，该工作电极形成在扁平绝缘衬底上；
辅助电极，该辅助电极形成在分开的扁平绝缘衬底上以面对工作电极；
流度测定电极，该流度测定电极形成在用于工作电极或辅助电极的扁平绝缘衬底上与工作电极相距预定距离的地方；
粘合剂隔板，该粘合剂隔板拥有具有微通道的样品引入部分，通过将该粘合剂隔板插在工作电极和辅助电极之间，将它们在空间上分开；
电极连接器，该电极连接器是在部分辅助电极上用厚的导电材料印刷而成的，用于将工作电极和辅助电极三维连接；和
试剂层，该试剂层含有电子传递介体和氧化酶，所述的方法包括以下步骤：
(1)将血液样品引入到插入传感器条的读数装置中；
(2)在工作电极和辅助电极之间以及流度测定电极和辅助电极之间施加预定的相应势差；
(3)随着血液样品的引入，引起工作电极和辅助电极之间电流的第一个改变，从而使这些电极具有相同的电压；
(4)用流度测定电极检测血液样品的流量，引起辅助电极和流度之间电流的第二个变化，以将辅助电极和流度测定电极之间的电压调节为相同的值，从而从工作电极检测到的变化中提供有关时差的信息；
(5)将试剂层与血液样品充分混合，以在工作电极和辅助电极之间施加预定的电压，引起逆向型薄层电化学电池内的周期性反应；
(6)基于步骤(4)中获得的时间信息和步骤(5)中获得的稳态电流，测定血液样品中的葡萄糖水平。
2、根据权利要求1的方法，其中步骤(1)的血液样品的体积在0.1到0.7μl的范围内，并且在不经预处理的情况下引入到传感器条中。
3、根据权利要求1的方法，其中步骤(2)的势差是由施加直流电、低频或高频交流电、高阻抗，或者选自方波、三角波、半正弦波和高斯波中的脉冲后，工作电极和辅助电极之间的和流度测定电极和辅助电极之间的电学变化而引起的。
4、根据权利要求1的方法，其中电学变化归结于电压、电流、阻抗或电容的变化。
5、根据权利要求1的方法，其中生物传感器的样品引入部分中有宽度为0.5至2mm并且高度为50至250μm范围内的通道，从而便于血液样品的引入。
6、根据权利要求1的方法，其中当控制工作电极和辅助电极使它们具有相同的电压时，同时限制血液样品和试剂层在步骤(3)中进行氧化还原反应。
7、根据权利要求1的方法，其中含有酶和电子传递介体的试剂层形成在工作电极或辅助电极中的任一个上。
8、根据权利要求7的方法，其中酶是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。
9、根据权利要求7的方法，其中电子传递介体促进电子从酶传递给最终电子受体，并且电子传递介体是六胺氯化钌(III)。
10、根据权利要求7的方法，其中试剂层还包含脂肪酸或其盐以及季铵盐，以进一步减小血细胞比容水平-依赖性偏差。
11、根据权利要求10的方法，其中脂肪酸或其盐具有4-20碳原子的烷基链，所述脂肪酸选自：饱和脂肪酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸和花生酸，并且其加入量为所有固体组分的0.1至20重量％。
12、根据权利要求10的方法，其中季铵盐选自以下的卤化物：十二烷基三甲铵、ecyl三甲铵、肉豆蔻基三甲铵、鲸蜡基三甲铵、十八烷基三甲铵和四己铵，并且其加入量为所有固体组分的0.1至30重量％。
13、根据权利要求1的方法，其中生物传感器的试剂层形成在工作电极和流度测定电极或者其中之一上，并且如此安排两个电极，使它们的稳态电流时间常数都在0.05和8.0之间，包括0.05和8.0。
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