CN1863910A

CN1863910A - 导入核酸的方法

Info

Publication number: CN1863910A
Application number: CN200480029594.3A
Authority: CN
Inventors: 岩田博夫; 加藤功一; 山内文生
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2006-11-15
Also published as: WO2005035755A1; US20070059832A1; US7846731B2; EP1672063B1; JPWO2005035755A1; JP4534043B2; AU2004280029A1; EP1672063A4; DE602004023631D1; AU2004280029B2; EP1672063A1

Abstract

本发明涉及通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，包括：步骤(A)核酸装载至电极的表面上；步骤(B)细胞附着在获得的装载有核酸的电极的表面上；以及步骤(C)对附着的细胞施加电脉冲。按照本方法，不仅可以将基因有效地导入细胞，而且基因的导入可以在所需的时间和所需的位点进行，并且不损伤附着的细胞。

Description

导入核酸的方法

技术领域

本发明涉及导入核酸的方法，更具体来说，涉及通过电穿孔将核酸导入细胞的方法。

技术背景

将基因导入细胞的方法被用来阐明基因的功能和基因编码的蛋白的性质，以及用于大量地生产重组蛋白。此外，将基因导入细胞的方法也用于将目的酶或细胞因子的基因导入受试者的细胞，通过基因在体内产生目的物质，从而提供对疾病的治疗。

人类基因组DNA的测序已经接近完成，可以预料到存在具有各种未知功能的基因。今后，对新的人类基因的功能分析是研究中的极大挑战，但是为了对多达几万种基因进行功能分析，需要能够过量表达和彻底地敲除基因、并且是高通量的方法。

将基因导入细胞的技术可以粗略地分成生物学方法、也就是利用来自腺病毒、逆转录病毒和慢病毒的病毒载体的导入方法、利用物理学方法例如脂转染方法(脂质体方法)的导入方法、电穿孔方法(电穿孔方法)、微注射方法和微粒枪方法。

在这些方法中，利用病毒载体的方法具有高的基因导入效率，但是也具有缺点，病毒载体的制备复杂，在安全性方面发现有问题。尽管脂转染方法安全性高，它们的缺点是基因导入效率低、细胞毒性强等。

直接的导入方法例如微注射方法和微粒枪方法的缺点在于细胞损伤严重、有效导入基因的条件的最适化烦琐，为了用于技术操作需要特别的技术和仪器。

此外，常规的电穿孔方法采用的方法是在电极例如平行板之间安排了培养基，其中悬浮有基因和细胞，然后在两个电极之间施加电脉冲，以便在细胞膜中产生小孔，并在它们恢复之前将外源基因导入细胞(非专利文献1：EMBO Journal，1982，Vol.1，第841-845页；非专利文献2：Bioelectrochem.&Bioenerg.，1999，Vol.48，第3-16页)。尽管该方法导入基因的效率高，其缺点是细胞损伤严重，导入基因的时机和位点难以自由选择等。

此外，最近已经开发了转染阵列，其中将细胞培养在已经印刷(print)了表达质粒的玻璃基材上，通过脂转染方法将基因导入细胞，以高通量地分析基因的功能(非专利文献3：Nature 2001，Vol.411，第107-110页)。因为该方法使用了脂转染方法进行转染，上面提到的由脂转染方法引起的缺点仍然存在。

另一方面，报道了另一种吸附方法，该方法将生物分子例如核酸和蛋白以保持活性的状态固定在基材的表面上(非专利文献4：Biosensors & Bioelectronics，1994，Vol.9，第677-684页)。该方法通过将具有不同静电荷的聚合物交替地吸附到基材上，继而通过静电相互作用层压聚合物薄膜(形成聚合高分子电解质复合物)，但是应用这种方法导入基因的例子还没有报道。

发明公内容

本发明解决的问题

本发明的一个目的是提供一种导入基因的方法以解决常规的电穿孔方法的问题，更具体来说，提供了一种方法，其中不仅可以将基因有效地导入细胞，而且基因的导入可以在所需的时间和所需的位点进行，并且不损伤细胞。此外，本发明的另一个目的是提供能够执行上述基因导入的方法，该方法使用了能够在细胞的显微观察中提供良好观察环境的电极基材。

解决问题的方法

本发明人试图改进通过常规的电穿孔导入基因的方法，结果发现通过将核酸放置在电极表面，使细胞附着到获得的装载核酸的电极表面，然后对附着的细胞施加电脉冲，不仅能够有效地将基因导入细胞，而且可以在所需的时间和所需的位点导入基因，并且不损伤细胞。此外，本发明人研究了更多的方法，结果发现当使用透明的半导体电极作为电极时，细胞的显微镜观察可以被执行得很好。基于上述的发现本发明人完成了本发明。

也就是说，本发明是

(1)一种通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，包括：

步骤(A)将核酸装在电极的表面上；

步骤(B)将细胞附着在获得的装载核酸的电极的表面上；以及

步骤(C)对附着的细胞施加电脉冲，

(2)一种通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，包括：

步骤(a)提供具有阳离子表面的电极；

步骤(b)将核酸吸附并装在电极的阳离子表面上；

步骤(c)将细胞附着在步骤(b)中获得的装载有核酸的电极的表面上；以及

步骤(d)对细胞施加电脉冲，

(3)上面(2)的方法，其中具有阳离子表面的电极是这样的阳离子表面电极，其中有在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的单层，阳离子聚合物吸附在单层的表面上，

(4)上面(2)的方法，其中具有阳离子表面的电极是这样的电极，其中有在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化剂形成的单层，阴离子聚合物吸附在单层的表面上，阳离子聚合物进一步吸附在它的表面上，

(5)上面(2)的方法，其中具有阳离子表面的电极是透明的电极，其上吸附了阳离子聚合物，

(6)上面(2)的方法，其中步骤(b)的执行是通过一次直接将核酸吸附在电极的阳离子表面上，或者将核酸和阳离子聚合物通过交替吸附方法按照核酸、阳离子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上，

(7)上面(3)或(4)的方法，其中的电极是使用从铂、金和铝中选择的金属制成的，

(8)上面(3)或(4)的方法，其中的电极是金电极基材，

(9)上面(8)的方法，其中的金电极是其上沉积有金的玻璃基材或透明塑料基材，

(10)上面(5)的方法，其中的透明电极是其上沉积有氧化铟锡、氧化铟、掺有铝的氧化锌或掺有锑的氧化锡的玻璃基材或透明塑料基材，

(11)上面(5)的方法，其中的透明电极是其上沉积有氧化铟锡的玻璃物基材或透明塑料基材，

(12)上面(3)的方法，其中的在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物：

R¹(CH₂)_n-SH (1)

(其中R¹代表阴离子官能团，n代表1-40之间的整数)，

(13)上面(12)的方法，其中的R¹是从羧酸、磷酸、磺酸基团和膦酸中选择的基团，

(14)上面(12)的方法，其中的由通式(1)代表的硫醇化合物是从11-巯基-十一烷酸、8-巯基-辛酸和15-巯基棕榈酸中选择的巯基烷酸，

(15)上面(3)、(4)或(5)的方法，其中的阳离子聚合物是从聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙缩醛化的聚乙烯醇、在侧链末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸处理的明胶、鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、壳聚糖、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺型胺类枝状聚合物中选择的聚合物。

(16)上面(4)的方法，其中的在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物：

R²(CH₂)_n-SH (2)

(其中R²代表阳离子官能团，n代表1-40之间的整数)，

(17)上面(16)的方法，其中的R²是氨基基团

(18)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反义核酸、siRNA或它们的表达载体，

(19)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是编码蛋白的DNA或其一部分，

(20)上面(1)的方法，其中步骤(B)是通过在含有核酸的电极表面上温育细胞来进行的，

(21)上面(2)的方法，其中的步骤(c)是通过在含有核酸的电极的表面上温育细胞来进行的，

(22)上面(1)的方法，其中步骤(C)是通过在附着了细胞的含有核酸的电极的对面提供对电极、然后在两个电极之间产生电脉冲来进行的，

(23)上面(2)的方法，其中步骤(d)是通过在附着了细胞的含有核酸的电极的对面提供对电极、然后在两个电极之间产生电脉冲来进行的，以及

(24)上面(2)的方法，其中具有阳离子表面的电极是具有微型图案(micropatterned)表面的电极。

此外，本发明是

(25)具有阳离子表面的电极，其中有在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的单层，阳离子聚合物吸附在单层的表面上，以及

(26)具有阳离子表面的电极，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的单层形成在通过在玻璃基材上沉积金而制成的金电极的表面上，阳离子聚合物然后被吸附在单层的表面上：

R¹(CH₂)_n-SH (1)

(其中R¹代表阴离子官能团，n代表1-40之间的整数)。

本发明的效果

本发明提供了通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，通过该方法不仅能够将核酸有效地导入到细胞中，而且核酸的导入可以在所需的时间和所需的位点进行，并且不损伤细胞。

附图简述

图1显示了用于对在装载有核酸的金电极上的附着细胞进行电穿孔的装备以及电脉冲系统。

图2显示了HEK293细胞在施加电脉冲(电场强度75V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数1)48小时后的相差显微照片(A)和荧光显微照片(B)。比例尺：200μm。

图3是一个条形图，显示了电场强度对转染效率的影响。

图4显示了细胞存活率与电场强度之间的关系。

图5显示了聚乙烯亚胺和聚烯丙胺的分子量对转染效率的影响。

图6显示了装载于具有各种不同阳离子聚合物的电极上的DNA的量。

图7显示了在电脉冲后从具有各种不同阳离子聚合物的电极上释放的DNA的量。

图8显示了转染效率与释放的DNA的量之间的相关性。

图9显示了HEK293细胞在电脉冲48小时后的荧光照片。电脉冲的施加是在细胞接种于装载有DNA的电极后(A)24、(B)48和(C)72小时。

图10显示了在施加电脉冲前细胞温育时间改变时的转染效率。

图11显示了原代海马神经元在装载有pEGFP和pDsRed混合物的表面上电脉冲48小时后的相差显微照片(左)和荧光显微照片(中，右)。上部和下部的照片显示了不同视野的图象，电穿孔在同样的条件下进行。

图12显示了HEK293细胞在装载有pEGFP或pDsRed的表面上在限定位点进行电穿孔48小时后的相差显微照片(左)和荧光显微照片(右)。

图13显示了在不同的交替吸附循环数后获得的ITO表面的ATR红外吸收光谱。

图14显示了交替吸附循环数和磷酸基团的两个吸收带的峰面积之间的关系。

图15显示了交替吸附循环数与ITO表面的水接触角度之间的关系。

图16显示了HEK293细胞在装载有DNA的ITO表面上进行电脉冲(电场强度250V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数1)48小时后的相差显微照片(A)和荧光显微照片(B)。

图17显示了电场强度对装载有DNA的ITO表面上的转染效率和细胞存活率的影响。

图18显示了交替吸附循环数对装载有DNA的ITO表面上的转染效率和细胞存活率的影响。

图19显示了在不同的交替吸附循环数后装载到ITO表面上的DNA的量。

图20是显示了转染效率和释放的DNA的量之间的关系的相关性图。

图21显示了海马神经元在装载有pEGFP和pDsRed混合物的ITO表面上电脉冲48小时后的相差显微照片(左)和荧光显微照片(中，右)。上部和下部的照片显示了不同视野的图象，电穿孔在同样的条件下进行。

图22是HEK293细胞在ITO表面上电脉冲48小时后的荧光显微照片，在ITO表面上以阵列的形式吸附有不同的质粒(pEGFP或pDsRed或二者的混合物)。

代码描述

图1中的符号的意义如下：

A：电穿孔仪

B：电穿孔缓冲液

C：细胞

D：核酸-阳离子聚合物复合层 E：金薄膜电极(阴极)

F：金电极(阳极)

G：硅酮间隔物

实施本发明的最佳方式

本发明的一个方面是通过电穿孔将核酸导入到细胞的方法，包括：

步骤(A)将核酸装在电极的表面上；

步骤(B)将细胞附着在获得的装载有核酸的电极的表面上；以及

步骤(C)对附着的细胞施加电脉冲，

上面提到的相应步骤继续说明如下。

步骤(A)：

为了在电极上装载核酸，可以采取例如

(A1)提供具有阳离子表面的电极，然后将核酸吸附到电极的阳离子表面上的方法，

(A2)提供具有阳离子表面的电极，然后将核酸和阳离子聚合物交替地吸附到电极的阳离子表面上，并形成例如阳离子聚合物-核酸-阳离子聚合物-核酸等的多层的方法。

(阳离子表面电极基材的描述)

具有阳离子表面的电极可以从电极的表面具有正电荷的电极中选择，这样的电极的例子包括

(a1)电极，其上有在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的单层，阳离子聚合物被吸附在单层的表面上，

(a2)电极，其上有在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化剂形成的单层，阴离子聚合物被吸附在单层的表面上，阳离子聚合物进一步吸附在其表面上，

(a3)电极，其上有阳离子聚合物吸附在表面上，等。

上述的具有阳离子表面的电极(a1)可以通过例如下面的方法来产生：1)在电极基材表面上形成在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物的单层，以及2)在单层表面上吸附阳离子聚合物。

此外，上述的具有阳离子表面的电极(a2)可以通过例如下面的方法来产生：1)在电极基材的表面上形成在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物、二硫化物、硫化物或硅烷化剂的单层，2)在单层表面上吸附阴离子聚合物，以及然后3)在阴离子聚合物表面上吸附阳离子聚合物。

此外，上述的具有阳离子表面的电极(a3)可以通过例如在电极的表面上吸附阳离子聚合物来产生。

电极由基材(substrate)来支持，例如平板、芯片(包括微芯片)、阵列等。构成成它们的基本材料没有具体的限制，只要它们是能够支持电极的绝缘材料就行，例如可以使用无机绝缘材料例如玻璃、云母、石英、矾土、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅、二氧化硅和氮化硅；有机绝缘材料例如聚乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和的聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树酯、三聚氰胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜。

在这些物质当中，具有上述(a1)和(a2)的阳离子表面的电极的基材的基本材料优选为无机绝缘材料，例如玻璃、云母、石英、矾土、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅、二氧化硅和氮化硅，或者是透明的塑料。具有上述(a3)的阳离子表面的电极的基材的基本材料优选为玻璃或透明塑料，而玻璃是特别优选的。对上述的透明塑料没有具体的限制，只要它是没有自身荧光的透明聚合物材料就行，可以是已知的材料。作为透明塑料，例如上述的有机材料等是示例性的，但是在其中，聚对苯二甲酸乙二酯是优选的。

另一方面，对电极没有特别的限制，只要它是可以在电穿孔方法中使用的电极就行，但是由金属材料例如铂、金和铝制成的电极是优选的。此外，透明电极被优选提及，以便利细胞的显微镜观察。透明电极包括氧化铟锡(ITO：In₂O₃-SnO₃)、掺有铝的氧化锌(ZnO)、掺有锑的氧化锡(SnO₃)等，氧化铟锡是特别优选的。

包含上述的“基材”和“电极”的优选的电极基材包括了那些电极，其中在玻璃基材、塑料基材或云母基材的一侧提供了金属电极例如铂、金或铝电极或透明电极基材基材基材。前者的优选例子包括在玻璃基材、云母基材或透明塑料基材的一侧提供了金电极基材基材基材的电极，后者的优选例子包括在透明基材例如玻璃基材和透明塑料基从的一侧提供了氧化铟锡透明电极基材基材基材的电极。

可以按照现有的方法执行以在基材的一侧提供电极，例如提到了使用现有程序的一种方法，其中上述的金属被加热或/和压在将被结合的无机绝缘基材上。此外，除了上述的方法之外，真空镀膜方法、喷镀方法、离子注射方法、电镀法等也被提及。

对于被用来在电极表面形成单层的在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物来说，提及了例如由下面的通式(1)代表的硫醇化合物：

R¹(CH₂)_n-SH (1)

(其中的符号具有前面定义的同样的意义)。化合物(1)的优选的例子包括了那些化合物，其中代表阴离子官能团的R¹是羧酸、磷酸、磺酸或膦酸，n是1到40，优选为7到18。

此外，为了代替硫醇化合物(1)，也可以使用由下面的通式(1A)或(1B)代表的二硫化物或硫化物：

R¹(CH₂)_n-S-S-(CH₂)_m-R¹ (1A)

R¹(CH₂)_n-S-(CH₂)_m-R¹ (1B)

(其中R¹和n具有上面定义的同样意义，m代表1到40的整数)。尽管二硫化物或硫化物可以是对称型或非对称型的，优选的为对称型的，因为可以形成均匀的单层。

优选化合物(1)或其二硫化物或硫化物的具体的例子包括例如11-巯基-十一烷酸、8-巯基-辛酸和15-巯基棕榈酸、10-羧基癸基二硫化物等。

此外，对于被用来在电极表面形成单层的在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物来说，示例了例如由下面的通式(2)代表的硫醇化合物：

R²(CH₂)_n-SH (2)

(其中R²代表了阳离子官能团，n具有上面定义的同样意义)。对于R²代表的阳离子官能团而言，示例的为例如氨基基团；n是1到40的整数，优选为7到18。

此外，为了代替硫醇化合物(2)，也可以使用由下面的通式(2A)或(2B)代表的二硫化物或硫化物：

R²(CH₂)_n-S-S-(CH₂)_m-R² (2A)

R²(CH₂)_n-S-(CH₂)_m-R² (2B)

(其中R²和n具有上面定义的同样意义，m代表1到40的整数)。尽管二硫化物或硫化物可以是对称型或非对称型的，优选使用对称型的，因为它可以形成均匀的单层。

优选化合物(2)或其二硫化物或硫化物的具体的例子优选包括例如11-氨基-1-十一烷硫醇等。

对于被用来在电极表面形成单层的在末端具有阳离子官能团的硅烷化剂来说，示例了例如由下面的通式(3)代表的硅烷化合物：

R²(CH₂)_p-Si(OR)₃ (3)

(其中R²具有上面定义的同样的意义，p代表1到40的整数，OR代表烷氧基团)。对于R²代表的阳离子官能团而言，提及了例如氨基基团。p被提及是1到40的整数，优选为7到18，OR被提及是具有碳原子数为1到6、优选为1到3的低级烷氧基团。

可以执行常规的方法以在电极表面形成单层。例如，将电极基材浸泡在硫醇化合物(通式1或2)、它的二硫化物(通式1A或2A)、硫化物(通式1B或2B)或硅烷化剂(3)的溶液中，从而在电极上形成具有高密度和高方向性的单层。

当在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物(1)或其二硫化物或硫化物(1A或1B)被用作硫醇化合物时，具有上面提到的阳离子表面的电极(a1)是通过在这些化合物的单层表面上吸附阳离子聚合物而获得的。

本文使用的“阳离子聚合物”可以是通过与在电极表面上形成的单层之间的静电相互作用(例如离子键)而吸附到单层的表面上的阳离子聚合物。这样的阳离子聚合物的例子包括聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙缩醛化的聚乙烯醇、在侧链末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物(例如聚(N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸)等)、酸处理的明胶、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、多聚精氨酸、鱼精蛋白、壳聚糖、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺基氨类枝状聚合物(阳离子性枝状聚合物)等。其中聚乙烯亚胺和聚烯丙胺是特别优选的。

阳离子聚合物的平均分子量是500到5000000，优选为600到100000。例如，在聚乙烯亚胺的情况下，其平均分子量优选为200到25000，特别优选的是500到10000。此外，在聚烯丙胺的情况下，其平均分子量优选为500到150000，特别优选的是1000到70000。

阳离子聚合物吸附到单层的表面可以通过将阳离子聚合物溶液带到单层表面上来执行。例如，它可以优选通过将阳离子聚合物溶解在适当缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中形成的溶液加入到单层的表面上并将其保留在室温下来执行。对阳离子聚合物的浓度没有特别的限制，但是优选为0.1％到10％。因此，单层和阳离子聚合物通过离子相互作用吸附，并提供了具有上述的阳离子表面的电极(a1)。

当在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物(2)或其二硫化物或硫化物被用作硫醇化合物时，或当在末端具有阳离子官能团的硅烷化剂(3)被用作硅烷化剂时，阴离子聚合物首先被吸附到这些化合物的单层表面上。

本文使用的“阴离子聚合物”可以是通过与在电极表面上形成的单层之间的静电相互作用(例如离子键)而吸附到单层的表面上的阴离子聚合物。这样的阴离子聚合物的例子包括合成的聚合物例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸，以及天然的聚合物例如褐藻酸(arginic acid)、透明质酸、硫酸软骨素和碱处理的明胶。

阴离子聚合物吸附到单层的表面可以通过将阴离子聚合物溶液带到并与单层表面相接触来执行。例如，它可以优选通过将阴离子聚合物溶解在适当缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中形成的溶液加入到单层的表面上并将其保留在室温下来执行。

然后，具有上面提到的阳离子表面的电极(a2)通过将阳离子聚合物吸附到被吸附的阴离子聚合物的表面上而获得。对于本文使用的阳离子聚合物来说，可以使用与上述的那些相同的阳离子聚合物，吸附也可以以与上述相同的方式来进行。

此外，例如当上述的透明电极如氧化铟锡和氧化铟被用作电极时，在电极表面吸附了阳离子聚合物的上述具有阳离子表面的电极(a3)可以通过用阳离子聚合物处理电极基材的表面而获得。对于这里所用的阳离子聚合物而言，可以使用与上述相同的阳离子聚合物，用阳离子聚合物的处理可以优选通过将阳离子聚合物溶液加入到电极基材的表面上并将其保留在室温下来执行。

(将核酸装载于具有阳离子表面的电极上)

装载有核酸的电极是通过将核酸装载于如上述提供的电极的阳离子表面上而获得的。

本发明中使用的“核酸”可以是多核苷酸或寡核苷酸，可以是DNA或RNA。DNA可以是质粒DNA、cDNA、基因组DNA或合成的DNA。“核酸”包括DNA衍生物和RNA衍生物。衍生物是指具有硫代磷酸酯键的核酸或在核苷酸间的磷酸部分、糖基部分和碱基部分进行了化学修饰以防止酶降解的核酸。

“核酸”包括了编码具有生物学活性能够有效治疗或改善疾病症状的蛋白的质粒DNA、编码能够诱导免疫反应有效阻止、治疗或改善疾病症状的蛋白的质粒DNA、以及这些DNA的一部分。

核酸也包括反义核酸。“反义核酸”是与特定的mRNA分子的至少一部分互补、通过被导入细胞而与相应的mRNA杂交、从而形成双链分子的DNA分子或RNA分子。因为细胞不翻译双链mRNA，反义核酸干扰了RNA的翻译。“核酸”还包括siRNA(刺激RNA干扰的小干扰RNA)。此外，“核酸”包括了用于反义核酸和siRNA的表达载体。

当核酸是编码蛋白的质粒DNA时，优选的质粒被构建成能够在核酸导入细胞后在细胞中表达遗传密码，它含有表达目的基因所需的片段例如启动子。此外，当需要证实目的基因是否被导入到细胞中时，除了目的基因之外可能还需要在DNA中包含报告基因。

对“核酸”的大小没有特别的限制，但是一般来说它是10bp到200kbp，优选为15bp到100kbp。

将核酸装载于电极的阳离子表面可以通过将核酸溶液与电极的阳离子表面接触来进行，例如，可以优选通过将核酸溶解在适当的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中形成的溶液加入到电极的阳离子表面上并在室温放置来进行。未吸附的核酸可以通过用适当的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)淋洗电极表面来除去。因此获得了装载有核酸的电极基材。

此外，装载有核酸的电极可以通过将核酸和阳离子聚合物按照核酸、阳离子聚合物和核酸的次序交替吸附在电极的阳离子表面上来获得。这里，所执行的核酸和阳离子聚合物的交替吸附可以以与上述相同的方式来进行。

步骤B

本步骤是一个将细胞附着于前面获得的装载有核酸的电极的表面上的步骤。

本发明中使用的“细胞”可以是来自生物体的任何细胞，只要它具有粘附性就行，例如，可以是任意种类(例如细菌、酵母)或多细胞生物(例如动物如脊椎动物、无脊椎动物)、植物(例如单子叶植物、双子叶植物)等。例如，可以使用来自脊椎动物(例如盲鳗、七鳃鳗、软骨鱼(chondrichtian)、硬骨鱼纲、两栖动物、爬行动物、鸟纲、哺乳动物等)的细胞。更具体来说，可以使用来自哺乳动物(例如单孔类动物、有袋动物、贫齿目动物、皮翼目动物、翼手目动物、食肉目动物、食虫目动物、长鼻类动物、奇蹄目动物、偶蹄目动物、管齿目动物、鳞甲目、海牛目动物、鲸目动物、灵长目动物等)的细胞。在一个实施方案中，使用了来自灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴和人类)的细胞，特别是来自人类的细胞。人类来源细胞的具体例子包括例如人类来源的已建立的细胞株例如人类宫颈癌细胞(HeLa)；人类来源的原代培养细胞例如人类胎肾细胞、人类脐带静脉血管壁内皮细胞、人类血管壁内皮细胞、人类动脉平滑肌细胞、人类肝细胞、人类成纤维细胞、人类角膜上皮细胞和人类角膜内皮细胞；来自人的干细胞例如间质干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞。

将细胞附着于装载有核酸的电极表面的方法没有特别的限制，例如可以通过在电极上加入细胞悬浮液来进行，或将细胞悬浮于适当的培养基中，将获得的细胞悬浮液滴加电极上，在对细胞适合的条件下温育。但是，从细胞种群的转染效率和对转染位点的限制的视角来看优选的是在装载有核酸的电极上进行细胞的培养。通过培养细胞，它们附着在电极表面并繁殖。在优选情况下未附着的细胞在施加电脉冲前应该除去。未附着细胞的除去可以通过例如用适当的缓冲液更换培养基来进行。

步骤C

对细胞施加电脉冲可以通过放置其上附着了细胞的装载有核酸的电极(称为第一电极)、面对第一电极上的细胞提供对电极(称为第二电极)、然后使用电穿孔仪在第一和第二电极之间产生电脉冲来进行。这时，尽管可以使用交流电或直流电来产生电脉冲，一般来说优选通过直流电产生电脉冲。

当用直流电产生电脉冲时装载有核酸的第一电极被用作阴极(-)，第二电极被设为阳极(+)，或与此相反。优选情况下第一电极被设为阴极(-)，第二电极被设为阳极(+)。对第二电极的材料没有特别的限制，只要它是导电的就行，但是包括金属例如金、铂、铜、铝、不锈钢、钨、钛、钴-铬合金、钴-铬-钼合金(活合金(vitallium))、或透明的电极材料例如ITO(氧化铟锡)和氧化铟。

至于电脉冲的条件，电场强度、电脉冲的时间长短、施加的脉冲的数量等可以依赖电极材料、细胞、导入的核酸、基材上的阳离子聚合物等的种类来进行适当的选择。通常来说，电场强度是10到500V/cm，优选为25到300V/cm，电脉冲的时间长度是1到99毫秒，优选为1到50毫秒，施加的脉冲的数量是1到99，优选为1到5，但是它们不受限于此。

对施加电脉冲的时间没有特别的限制，可以被适当地选择。也就是说，在细胞被接种于装载有核酸的电极、温育并附着于基材后，通常不应该马上施加电脉冲，但是可以在任何时间施加，只要这个时间在细胞接种后大约4到5天之内就行。通过施加电脉冲，核酸被有效地导入到细胞中。

图1显示了一套带有装载有核酸的电极的电脉冲装置，用于执行上面提到的本发明的方法。本发明的详细情况使用附图来说明。例如，金薄膜电极(E)形成在玻璃基材的表面上。核酸-阳离子聚合物复合层(D)形成在电极上，细胞(C)附着于层的表面上。此外，细胞被例如硅酮间隔物(G)分隔开，孔中充满电穿孔缓冲液(B)。作为对电极的金电极(F)被放置在硅酮间隔物(G)上，与带有细胞的底部电极(E)平行。第一电极(E)和第二电极(F)被连接到电穿孔仪(A)上，它能产生电脉冲(A)。在本实施例中，第一电极(E)和第二电极(F)之间的距离被设置为2mm，孔的面积被设定为13×13mm²。至于电脉冲的极性，第一电极(E)被设置为阴极(-)，第二电极(F)被设置为阳极(+)。通过用电穿孔仪(A)产生电脉冲将核酸(DNA)导入细胞(C)。

作为本发明的另一方面，上述的核酸导入方法可以使用具有微型图案表面的基材来进行。微型图案的制作可以通过已知的方法来进行。具有微型图案的含有核酸的电极可以通过用适当的方法分隔电极的阳离子表面、将多种核酸分别装载到各部分来制备。此外，电极基材的表面用有机硅烷化合物(例如十八烷基三乙氧基甲硅烷)或烷基硫醇来处理以形成它们自我装配的单层，覆盖上光学屏蔽物，用紫外光照射以分解自我装配的单层，从而获得具有微型图案的电极基材；从而可以使用基材来排列核酸。因此，当使用上述的具有微型图案的装载有核酸的电极执行本发明时，核酸导入的位点可以被限定。

在下面通过实施例将对本发明进行进一步解释，但是应该解释的是本发明的技术范围不受这些实施例的限制。

实施例1

制备具有阳离子表面的电极用于静电吸附DNA。首先在一个玻璃板上形成在末端具有羧基基团的硫醇化合物(11-巯基十一烷酸，由Sigma-Aldrich Co.生产)单层，玻璃板在一侧沉积有金薄膜。在单层上加入含有聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，聚乙烯亚胺的平均分子量为800(在以后称为PEI800，Aldrich Co.，Ltd.生产)，浓度为1％，在室温放置30分钟。获得的基材表面用水充分清洗，在氮气下干燥，以获得具有阳离子表面的金电极。

然后，将用乙醇消毒的硅酮间隔物(内部面积1.3×1.3cm²，高度2mm)固定到前面获得的金电极的阳离子表面上。然后，含有0.05mg/ml编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP-C1由Clontech Laboratories Inc.生产)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)加入到硅酮间隔物中金电极的阳离子表面，在室温放置2小时以便将DNA静电吸附到表面上。用磷酸盐缓冲液充分清洗表面以除去没有吸附的DNA，从而获得装载有DNA的金电极基材。

来自人类胚胎肾脏的细胞(HEK293：从人类科学基金会获得)被悬浮在含有血清的培养基中(培养基成分：最低基本培养基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素)，将悬浮液铺在装载有DNA的金电极的表面上。细胞在37℃和5％CO₂环境下温育以附着到电极表面。24小时后，用4℃的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)代替培养基以除去没有附着的细胞，再在表面上加入新鲜的磷酸盐缓冲液。然后，将一侧沉积有金薄膜的玻璃基材固定在硅酮间隔物上作为第二电极。它们的排列显示在图1中。

然后，装载有DNA的金电极被设置为阴极(-)，第二电极被设置为阳极(+)。它们被连接到高压脉冲产生装置(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部制造)上并施加电脉冲，条件为电场强度75V/cm，脉冲时间10毫秒，执行电穿孔施加的脉冲数为1。在施加脉冲后，将细胞在室温保温5分钟，然后用事先在37℃保温的含血清培养基替换磷酸盐缓冲液，在37℃和5％CO₂环境下培养细胞。

在电穿孔48小时后分析导入的基因的瞬时表达。在荧光显微镜下计数由于表达了绿色荧光蛋白(EGFP)而发射绿色荧光的细胞，转染效率被定为总细胞数中EGFP阳性细胞的数量。

图2显示了HEK293细胞在电穿孔48小时后的相差显微照片(A)和荧光显微照片(B)。从照片中可以看出，电极表面的细胞表达了EGFP，没有可察觉的损伤。EGFP阳性细胞的百分数、即转染效率是80％。这个结果清楚地表明本发明的方法是允许有效地导入基因的方法。

实施例2

采用与实施例1相似的方式，将HEK293细胞接种在装载了DNA的金电极上以便附着。然后对细胞施加电脉冲以进行电穿孔。这时，电脉冲的电压被改变并研究了电场强度对转染效率的影响。此外，除了电压之外的施加脉冲的条件与实施例1相同(脉冲时间10毫秒，脉冲次数1次)。转染效率被评估为施加电脉冲48小时后的EGFP阳性细胞百分数。结果显示在图3中。此外，电场强度对细胞存活率的影响被同时研究。细胞存活率通过锥虫蓝染料排斥方法来评估，其中细胞在施加电脉冲后3小时用锥虫蓝处理并回收细胞。也就是说没有被锥虫蓝染色的细胞数量(活细胞数)被确定，然后按照下面的公式计算存活率。结果显示在图4中。

(公式1)

如图3所示，当没有施加电脉冲时，EGFP完全不表达。相反，在电脉冲过的细胞中观察到了转染。转染效率通过下面的公式计算，使用了从亮视野显微镜图象确定的附着的细胞数和从荧光显微镜图象确定的表达荧光蛋白的细胞数。

(公式2)

在电场强度为75V/cm时转染效率最高。当施加200V/cm或以上的电脉冲时，转染效率显著降低。此外，如图4所示，对于通过锥虫蓝染料排斥方法来估计的施加电脉冲后的细胞存活率来说，当电场强度是100V/cm或以下时细胞存活率高。在150V/cm或以上时，施加电脉冲后许多细胞脱离并死亡。还观察到保留在电极上的细胞受到明显损伤。没有脉冲时观察不到转染这个结果说明电脉冲使DNA从电极表面释放，释放的DNA通过由电脉冲导致的不稳定的细胞膜或由脉冲在细胞膜上形成的微孔被导入到细胞中。

实施例3

采用与实施例1相似的方式，将HEK293细胞接种并附着在装载了DNA的金电极上。然后施加电脉冲(电场强度75V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数为1)以进行电穿孔。在装载有核酸的的电极的制备中，具有不同分子量的阳离子聚合物被装载，以研究阳离子聚合物的分子量对转染效率的影响。作为阳离子聚合物，使用了分子量为800、25000和750000的聚乙烯亚胺(被称为PEI800、PEI25000和PEI750000，它们都是由Aldrich Co.生产的)和分子量为15000和70000的聚烯丙胺盐酸(称为PAA15000和PAA70000，它们都是由Aldrich Co.生产的)。

图5显示了转染效率与聚乙烯亚胺和聚烯丙胺的分子量之间的关系。从图中可以看出，随着聚乙烯亚胺分子量的增加转染效率降低了。图6显示了装载于这些表面上的DNA的量。此外，在施加电脉冲(电场强度75V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数为1)后，从表面上释放的DNA的量通过用PicoGreen测量上清液中含有的DNA的量来估计。结果显示在图7中。从这些图中可以明显看出，当阳离子聚合物的分子量变高时装载的DNA的量增加，但是在施加电脉冲后从表面释放的DNA的量，当阳离子聚合物具有较高分子量时比具有较低分子量时少。尽管在用低分子量聚乙烯亚胺(PEI 800)制备的表面上装载的DNA的量少，在施加电脉冲后有大约30％装载的DNA被释放。

图8显示了用不同阳离子聚合物制备的表面上的转染效率与施加脉冲后释放的DNA量之间的关系。从图中可以明显看出，观察到在转染效率和释放的DNA的量之间的正相关。结果表明在本发明中转染效率强烈地依赖于从电极表面释放的DNA的量。

实施例4

采用与实施例1相似的方式，将HEK293细胞接种并附着在装载了DNA的金电极基材上，然后对细胞施加电脉冲以进行电穿孔。在本实验中，施加电脉冲前的培养时间被改变以研究培养时间对转染效率的影响。

图9显示了在细胞接种后24、48和72小时时施加电脉冲48小时后细胞的相差显微照片。从图中可以看出，在电脉冲之前培养了24、48和72小时的细胞中基因被有效地表达。此外，图10显示了电脉冲前的培养时间与转染效率(％)之间的关系。结果表明，细胞在电脉冲前培养了12、24、48和72小时任何一种情况下都能够达到有效的转染，因此可以在所需的时间将基因导入到附着的细胞中。

实施例5

(原代细胞的实验验证)

从大鼠胚胎脑中收集海马以获得神经细胞。采用与实施例1相似的方式将编码EGFP或红色荧光蛋白(DsRed)的质粒DNA导入原代神经细胞。

也就是说，采用与实施例1相同的方式，编码绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(DsRed)的质粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生产)被装载到金电极的阳离子表面上(阳离子聚合物：PEI 800)，原代神经细胞在表面上培养3天，施加电脉冲(125V/cm，10毫秒，单次脉冲)。被导入的基因的瞬时表达分析在施加电脉冲后48小时时进行。

(结果)

图11显示了海马神经元在电脉冲48小时后的相差显微照片(左：相差)和荧光显微照片(中：EGFP，右：DsRed)。从相差照片中可以看出在电穿孔后细胞没有可以注意到的损伤。此外，从中间(EGFP)和右边(DsRed)的显微照片可以看出pEGFP和pDsRed都被导入到细胞中，被这些质粒编码的荧光蛋白EGFP和DsRed得到了表达。这些结果显示多个基因可以通过本方法有效地导入到原代培养细胞中。

当采用与HEK293细胞的情况相似的方式测定时，对海马神经元的转染效率是20％。当通过常规的脂转染方法(参考下面描述的对比实施例1)和电穿孔方法(参考下面描述的参比实施例2)将pEGFP和pDsRed导入原代神经细胞作为对比时，转染效率是10％到20％，在这些方法和本发明之间没有观察到明显的区别。但是在常规的方法中观察到极大程度的细胞损伤，许多细胞死亡了。死亡细胞百分率达到20％到30％。另一方面，使用本发明的基因导入方法完全没有观察到细胞损伤。

(对比实施例1)

收集的海马神经元被接种到用聚L-赖氨酸包被的24孔板中至70％到80％满底，使用Lipofectamine 2000(由Invitrogene Inc.生产)进行基因导入。使用1μg质粒DNA和2μl Lipofectamine 2000。Lipofection2000和DNA分别用50μl Opti-MEM(无血清培养基)稀释。这些溶液被混合，在室温保温20分钟，然后将溶液加入到细胞中以进行脂转染。在脂转染48小时后使用荧光显微镜分析EGFP的表达。如上所述，转染效率是10％到20％。

(对比实施例2)

海马神经元用PBS清洗，悬浮在PBS中使浓度为1×10⁶细胞/ml。在悬浮液(200μl)中加入15μg质粒DNA(pEGFP)，然后混合。将悬浮液注射到电穿孔杯中，在冰上放置10分钟。然后进行电穿孔，条件为电场强度625V/cm(电极间的距离：4mm)、脉冲时间10毫秒、脉冲数1。在脉冲后，将悬浮液保留在杯中，在室温放置10分钟，然后接种于60mm的PLL包被的细胞培养皿。电穿孔48小时后，使用荧光显微镜分析EGFP的表达。如上所述，转染效率是10％到20％。

实施例6

在以与实施例1中相似的方式制备的电极的阳离子表面上，将两种质粒(pEGFP或pDsRed)分别装载在小的区域(直径5mm)内。采用与实施例1相似的方式，将HEK293细胞附着并生长在装载了DNA的金电极上，在细胞接种后24小时移除未附着的细胞，然后施加电脉冲(75V/cm，10毫秒，脉冲数1)。

图12显示了电脉冲48小时后HEK293细胞的相差显微照片(左)和荧光显微照片(右)。照片在低放大倍数下获得以便观察电极上的较大区域(大约1.5×1.5cm²)。可以看到细胞均匀地附着到电极表面上。此外，获得了装载pEGFP和pDsRed的区域的荧光照片。这些照片被合并并显示在右图中。可以看出，在装载了相应基因的区域观察到了来自EGFP和DsRed的荧光。这些结果表明本发明的方法允许在限定的位点进行导入。

实施例7

使用等离子体发生器(型号PA300AT，Okuma Engineering Co.生产)用氧等离子体(输出功率30W，压力5Pa)在室温处理一侧沉积有氧化铟锡(在以后称为ITO)的玻璃基材5分钟，以便从表面除去杂质。

然后在ITO表面上加入含有聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，聚乙烯亚胺的平均分子量为800(在以后称为PEI800，AldrichCo.，Ltd.生产)，浓度为1％，在室温放置30分钟。ITO表面用水充分清洗，在氮气下干燥，以获得具有阳离子表面的ITO。然后，将用乙醇消毒的硅酮框架(内部面积1.3×1.3cm²，高度1mm)固定到前面获得的ITO电极的阳离子表面上。然后，含有0.05mg/ml编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP-Cl由Clontech Laboratories Inc.生产)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)加入到硅酮框架中ITO电极的阳离子表面，在室温放置30分钟以便将DNA静电吸附到ITO表面上。然后用磷酸盐缓冲液充分清洗表面以除去没有吸附的DNA。然后，将PEI 800和DNA以相似的方式交替吸附，然后用磷酸盐缓冲液充分清洗表面，从而获得含有DNA的透明电极基材。

接下来，未处理的ITO电极的交替吸附循环数被引用为零，每个吸附PEI和DNA的步骤被计算为1个循环。也就是说，具有PEI800-DNA-PEI800的表面的交替吸附循环被表示为3。其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的原子组成通过X-射线光电子能谱(XPS)来确定。结果显示在表1中。

表1

(单位：百分数)

循环数	C	N	O	P	In	Sn
循环数	C	N	O	P	In	Sn	0	8.9	0	70.5	0	17.9	2.7
1	19.7	9.3	55.5	0	13.5	2.1	0	8.9	0	70.5	0	17.9	2.7
1	19.7	9.3	55.5	0	13.5	2.1	2	35.4	15.9	38.2	3.5	5.9	1.1
3	43.3	18.2	30.1	3.2	4.5	0.77	2	35.4	15.9	38.2	3.5	5.9	1.1
3	43.3	18.2	30.1	3.2	4.5	0.77	4	48.3	16.8	27.8	4.7	1.9	0.45
5	52.2	22.3	20.9	3.7	0.75	0.19	4	48.3	16.8	27.8	4.7	1.9	0.45
5	52.2	22.3	20.9	3.7	0.75	0.19	6	48.3	20.7	26.7	3.8	0.49	0.06
7	55.8	22	18.7	3.5	0.01	0	6	48.3	20.7	26.7	3.8	0.49	0.06

在表1中可以看出，在吸附了PEI 800的表面上检测到了N，在吸附了DNA的表面上检测到了P。此外，在ITO中含有的In和Sn的原子组成随着循环数的增加而降低。这些结果表明PEI800和DNA存在于ITO电极的表面上，被吸附的层的厚度随着循环数而增加。

图13显示了对其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO电极的表面所记录的ATR-IR光谱。1065和1230cm^-1处的两个吸收带被确定为DNA骨架中的磷酸基团。从图13中可以看出，当吸附循环数增加时，这些吸收增加。在图14中，使用这两个吸收带的峰面积对吸附循环数进行了作图。峰面积随着循环数的增加而线性增加。结果表明装载于ITO表面上的DNA的量随着吸附循环数的增加而增加。

然后，测量了其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的水接触角度，以研究表面的润湿性的变化。结果显示在图15中。当PEI800出现在最外表面时，水接触角度大约为45度，而在最外层是DNA的情况下，水接触角度大约是32度。从图15中可以看出，接触角度根据最外表面的类型而交替改变。这个结果表明由PEI800和DNA制成的交替吸附层在ITO电极的表面上形成。其上吸附了一层PEI800的表面的接触角度比后面的吸附PEI800的表面的接触角度小。可能第一层PEI800没有完全地覆盖ITO表面，基本材料的基底ITO表面被部分暴露。

实施例8

在按照实施例7制备的装载有DNA的ITO电极上进行细胞的电穿孔。首先，人类胚胎肾细胞(HEK293：从人类科学基金会获得)被悬浮在含有血清的培养基中(培养基成分：最低基本培养基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素)，将悬浮液加入到含有DNA的透明电极(层数＝5，基底材料为聚对苯二甲酸乙二酯(PET))的表面上。细胞在37℃和5％CO₂环境下培养以吸附到电极表面。24小时后，用4℃的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)代替培养基以除去没有附着的细胞。用磷酸盐缓冲液充满硅酮框架的孔，然后将一侧沉积有金薄膜的玻璃板放置在硅酮框架上作为第二电极。它们的排列显示在图1中(在本实施例中假设符号E是ITO电极)。

然后，装载有DNA的ITO电极被设置为阴极(-)，上部的金电极被设置为阳极(+)。它们被连接到高压脉冲产生装置上(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部制造)并施加电脉冲，条件为电场强度250V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数为1，从而进行电穿孔。在施加脉冲后，将细胞在室温保温5分钟。然后用事先在37℃保温的含血清培养基替换孔中的磷酸盐缓冲液，在37℃和5％CO₂环境下培养细胞。

图16显示了HEK293细胞在电穿孔48小时后的相差显微照片(A)和荧光显微照片(B)。从图中可以看出，全部细胞中有大约70％表达了EGFP。这个结果清楚地显示本发明的方法允许有效地导入基因。此外，在使用荧光和相差显微镜观察细胞时获得了具有高分辨率的明亮的图像(当玻璃被用作基底材料时)。这强调了通过使用透明电极可以更好地进行细胞的观察。

实施例9

按照实施例8相似的方式，将HEK293细胞接种在装载有DNA的透明电极上并附着，然后施加电脉冲以进行电穿孔。改变电脉冲的电压以研究电场强度对转染效率的影响。除了电压之外施加脉冲的条件与实施例8中相同(脉冲时间10毫秒，脉冲次数1次)。转染效率被评估为施加电脉冲48小时后EGFP阳性细胞的百分数。此外，同时研究了电场强度对细胞存活率的影响。细胞存活率通过锥虫蓝染料排斥方法来评估，其中细胞在施加电脉冲48小时后用锥虫蓝处理并收获。也就是说没有被锥虫蓝染色的活细胞数被确定，并计算它在没有施加电脉冲时获得的活细胞数(对照)中占的比例。使用下面的公式计算细胞存活率。

(公式3)

结果显示在图17中。如图17所示，当没有施加脉冲时没有EGFP表达。另一方面，经过电脉冲的细胞中表达了EGFP。转染效率按照下面的公式计算，使用了用锥虫蓝染料排斥方法确定的电极上的总活细胞数和通过荧光图像确定的表达荧光蛋白的细胞数。

(公式4)

随着电场强度的增加转染效率线性增加。当施加300V/cm或以上的电脉冲时，转染效率达到平台水平(大约80％)。另一方面，在电场强度为250V/cm或以下时在施加电脉冲后细胞存活率保持较高。在300V/cm或以上时，施加电脉冲后许多细胞脱离并死亡。不施加脉冲时观察不到转染，这个结果表明施加电脉冲后DNA从电极上释放，以及对细胞膜去稳定化以产生微孔，这两种机制同时发生增进了DNA向细胞内的导入。

实施例10

按照实施例8相似的方式，将HEK293细胞接种在装载有DNA的ITO电极(吸附循环数＝5，基底材料为PET)上并附着，然后施加电脉冲(电场强度250V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲次数1次)以进行电穿孔。在本实施例中，改变了PEI 800和DNA的吸附循环数以研究循环数对转染效率的影响。

图18显示了转染效率与循环数之间的关系。从图中可以看出，较大的吸附循环数能够导致更有效的转染，同时保持了细胞存活率。图19显示了经过不同的吸附循环数后表面上装载的DNA的量。可以看出装载的DNA的量随着吸附循环数的增加而增加。

在施加电脉冲(电场强度200-300V/cm，脉冲时间10毫秒，脉冲数为1)后，从表面上释放的DNA的量通过用PicoGreen(由Molecular ProbeInc.生产)测量上清液中含有的DNA的量来估计。图20显示了对不同样品测定的脉冲后的转染效率与从这些表面释放的DNA的量之间的关系。可以看出，释放的DNA的量随着吸附循环数的增加而增加。在施加电脉冲后有大约10％-30％装载的DNA被释放。从图中可以明显看出，转染效率与释放的DNA的量有正相关性。因此，这表明本发明中的转染效率主要由从表面释放的DNA的量来控制。

实施例11

(原代细胞的实验验证)

从大鼠胚胎脑中制备海马神经元。采用与实施例8相似的方法用编码EGFP或红色荧光蛋白(DsRed)的质粒DNA对原代神经元进行细胞的电穿孔。

也就是说，采用与实施例8相似的方式，编码绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(DsRed)的质粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生产)被装载到透明ITO电极(吸附循环数＝5，电极：ITO，基底材料为玻璃)的表面上，原代神经元在表面上培养3天，然后施加电脉冲(200V/cm，10毫秒，单次脉冲)。EGFP和DsRed的瞬时表达分析在施加电脉冲48小时后进行。

(结果)

图21显示了在电脉冲后48小时时的相差显微照片(左：相差)和荧光显微照片(中：EGFP，右：DsRed)。从左边的显微照片中可以看出在电穿孔后没有观察到细胞的损伤。荧光显微照片(图21中中间和右边的照片)显示pEGFP和pDsRed都被导入到细胞中，荧光蛋白EGFP和DsRed在细胞中得到了表达。此外，这些图表明不同的基因可以通过本方法有效地导入。该结果还表明在脉冲前细胞即使被温育3天，电穿孔也可以被成功地执行，表明本方法可以用于在细胞接种后有利的时间进行转染。

实施例12

(在ITO电极的表面安排核酸阵列，以及在阵列上电穿孔)

ITO电极(基底材料为玻璃)的表面用氧等离子体处理来清洁。然后，将ITO电极浸泡在十八烷基三乙氧基硅烷(LS-6970，Shin-EtsuChemical Co.，Ltd.)的1％甲苯溶液中，在室温放置2小时。在用甲苯和乙醇充分清洗后，将电极在80℃加热12小时。然后，在电极表面放置其中铬图案沉积在玻璃基底上的光学屏蔽物，用紫外光在室温照射图案1小时。除去光学屏蔽物后，将基材用乙醇清洗以除去由紫外线照射而分解的有机硅烷层。结果获得了有图案的表面，其中含有疏水

有机硅烷单层区域以及亲水的ITO表面被暴露的孤立区域。PEI 800和质粒DNA(pEGFP，pDsRed或二者的混合物)通过将这些溶液手工滴加到有图案的ITO电极上的不同ITO斑点上(ITO被暴露的环形斑点，直径1mm，10×10个斑点)而被交替吸附(吸附循环数＝5)。按照与实施例8相同的方式将HEK293细胞附着到装载有DNA的阵列上，在细胞接种24小时后、移除未附着的细胞之后施加电脉冲(200V/cm，10毫秒，1次脉冲)。

图22显示了电脉冲48小时后的荧光显微照片。照片在低放大倍数下获得以便观察阵列上的全部区域(大约1.7×7cm²)。对EGFP和DsRed分别进行记录的荧光照片被合并并显示在图22中。在装载了相应质粒的位点观察到了荧光。此外，两个基因被混合的位点上的细胞共表达了两种蛋白。这些结果表明本发明可以提供限定转染区域的方法。

工业实用性

本发明的方法可用于有效地将基因导入细胞而不引起细胞损伤。本方法还能够使我们在限定的时间和位点转染细胞。结果，本发明的导入核酸的方法可用于在细胞水平对基因和基因产物进行功能分析、促进细胞生物学、后基因组和蛋白质组学研究以及医学护理的发展。

Claims

1.一种通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，包括：

步骤(A)将核酸装载至电极的表面上；

步骤(C)对附着的细胞施加电脉冲。

2.一种通过电穿孔将核酸导入细胞的方法，包括

步骤(a)提供具有阳离子表面的电极；

步骤(b)将核酸吸附并装载至电极的阳离子表面上；

步骤(d)对细胞施加电脉冲。

3.权利要求2的方法，其中具有阳离子表面的电极是这样的电极，其上有在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的单层，以及阳离子聚合物吸附在单层的表面上。

4.权利要求2的方法，其中具有阳离子表面的电极是这样的电极，其上有在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化剂形成的单层，阴离子聚合物吸附在单层的表面上，而阳离子聚合物进一步吸附在它的表面上。

5.权利要求2的方法，其中具有阳离子表面的电极是透明的电极，其上吸附了阳离子聚合物。

6.权利要求2的方法，其中步骤(b)是通过仅一次直接将核酸吸附在电极的阳离子表面上，或者将核酸和阳离子聚合物采用交替吸附方法按照核酸、阳离子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上来进行的。

7.权利要求3或4的方法，其中的电极是使用从铂、金和铝中选择的金属制成的。

8.权利要求3或4的方法，其中的电极基材是金电极基材。

9.权利要求8的方法，其中的金电极是其上沉积有金的玻璃基材或透明塑料基材。

10.权利要求5的方法，其中的透明电极是其上沉积有氧化铟锡、氧化铟、掺有铝的氧化锌或掺有锑的氧化锡的玻璃基材或透明塑料基材。

11.权利要求5的方法，其中的透明电极是其上沉积有氧化铟锡的玻璃基材或透明塑料基材。

12.权利要求3的方法，其中在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物：

R¹(CH₂)_n-SH (1)

(其中R¹代表阴离子官能团，n代表1-40之间的整数)。

13.权利要求12的方法，其中的R¹是从羧酸基团、磷酸基团、磺酸基团和膦酸基团中选择的基团。

14.权利要求12的方法，其中由通式(1)代表的硫醇化合物是从11-巯基-十一烷酸、8-巯基-辛酸和15-巯基棕榈酸中选择的巯基烷酸。

15.权利要求3、4或5的方法，其中的阳离子聚合物是从聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙缩醛化的聚乙烯醇、在侧链末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸处理的明胶、鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、壳聚糖、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺型胺类枝状聚合物中选择的聚合物。

16.权利要求4的方法，其中在末端具有阳离子官能团的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物：

R²(CH₂)_n-SH (2)

(其中R²代表阳离子官能团，n代表1-40之间的整数)。

17.权利要求16的方法，其中的R²是氨基基团。

18.权利要求1或2的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反义核酸、siRNA或它们的表达载体。

19.权利要求1或2的方法，其中的核酸是编码蛋白的DNA或其一部分。

20.权利要求1的方法，其中步骤(B)是通过在装载有核酸的电极上温育细胞来进行的。

21.权利要求2的方法，其中的步骤(c)是通过在装载有核酸的电极表面上温育细胞来进行的。

22.权利要求1的方法，其中步骤(C)是通过在其上附着了细胞的装载有核酸的电极的对面提供对电极，然后在两个电极之间产生电脉冲来进行的。

23.权利要求2的方法，其中步骤(d)是通过在附着了细胞的装载有核酸的电极的对面提供对电极、然后在两个电极之间产生电脉冲来进行的。

24.权利要求2的方法，其中具有阳离子表面的电极是具有微型图案表面的电极。

25.具有阳离子表面的电极，其中在末端具有阴离子官能团的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成单层，以及阳离子聚合物吸附在单层的表面上。

26.具有阳离子表面的电极，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的单层形成在通过在玻璃基材上沉积金而制成的金电极基材的表面上，以及阳离子聚合物被吸附在单层的表面上：

R¹(CH₂)_n-SH (1)

(其中R¹代表阴离子官能团，n代表1-40之间的整数)。