CN1879017B - 用于提取生物学标记物的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从生物学样品中提取标记物的方法,并涉及在这些方法中所使用的系统、装置、试剂盒和试剂。本发明也涉及用于测定样品中的多种不同的生物体类型的方法、试剂盒、试剂和组合物。本发明的特殊优点之一是能从一个体积内的含有复杂生物学基质的单一样品中同时提取一种以上的微生物或病毒颗粒标记物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2002年12月26日提交的美国临时专利申请No.60/435,591的优先权,将该申请并入本申请作为参考。
技术领域
本发明涉及从一或多种样品中提取一或多种标记物并优选地同时测定这些标记物的方法。发明也涉及在这些方法中使用的系统、装置、设备、试剂盒和试剂。
背景技术
50年代早期到60年代早期的研究者就认识到临床样品中的粘液对在样品中所进行的临床测定有着不利的作用。为了将粘液粘度对临床样品的影响最小化,已经发展出用于液化粘液基质,例如痰液的特异的方法和组合物。这些提取方案包括使用DNA酶(Lieberman,Amer.Rev.Resp.Disease,Vol.97,pp.662-672(1968))或含巯基的还原剂例如N-乙酰-L-半胱氨酸(Webb,J.Thoracic & Cardiovascular Surg.,Vol.44,pp.330-343(1962))或二硫苏糖醇(美国专利No.3,502,779(Mar.24,1970))。已经单独或联合使用这些试剂(Lightowler & Lightowler,Arch.InPharmacodyn.,Vol.189,pp.53-58(1971))。
有很多用于鉴定病毒颗粒的免疫测定法或凝集试验的试剂盒,最近几年已经出现在市场中(QuickVue by Quidel,RSVAbbott TestPack byAbbott Laboratories,FluOIA by Biostar,Inc.,和Directigen Flu和DirectigenRSV by Becton Dickinson and Company)。市场中的大多数试剂盒都联合使 用去污剂和还原剂预处理临床样品以降解粘液基质并溶解抗原。在Horaud等的美国专利No.6,248,513、Crosby等的美国专利No.6,207,445、Rehg等的美国专利No.6,194,221、Hansen等的美国专利No.5,993,826、Maul等的美国专利No.5,995,377、Bogart等的美国专利No.5,869,272、Imrich等的美国专利No.5,415,994和Snyder等的美国专利No.5,334,503中描述了联合使用去污剂和还原剂提取抗原的实例,在此将各个专利一同并入作为参考。或者,尽管少见,但在本领域也使用有机溶剂提取(Porcelli等的美国专利No.6,238,676,在此一同并入作为参考)。
通过测定已知的蛋白标记物来测定一些细菌株可以采用与对病毒颗粒所采用的那些方法相似的提取方法。例如,对于用免疫化学方法测定嗜肺性军团菌(Legionella pneumophilia),用含有Triton X-100去污剂和EDTA磷酸缓冲盐水的提取溶液预处理含有痰样品的拭子(美国专利No.5,415,994(May16,1995))。
亚硝酸已经被用于从链球菌(Streptococci)和肠球菌属(Enterococci)的细胞壁中提取糖类抗原(Petts,J.Clinical Microbiol.,Vol.33(4),pp.1016-18(1995);Facldam,Infections in Medicine,Vol.14(11),pp.891-898(1997))。其他的实例包括Bogart等的美国专利No.5,494,801和Sand等的美国专利No.5,536,646,在此将两者一同并入作为参考。亚硝酸提取只被用于从这些生物体中提取细胞壁相关的糖类标记物。从来没有预见到亚硝酸提取能用于或成功地提取其他标记物,例如蛋白标记物,或从单一样品内的多种类型的微生物中,特别是从含有复杂的生物学基质的样品例如粘液分泌物中,提取标记物。相反地,甚至认为使用亚硝酸对于蛋白标记物的测定可能是有害的。当用亚硝酸处理时,蛋白进行脱氮作用(氨基的丢失)。预计这个分解过程将造成变性和/或沉淀。这也可以改变蛋白的抗原特性(即抗体可能不能结合于蛋白的表面,因为当氨基被去除时,改变了与抗体结合发特性)。脱氮作用、变性和/或沉淀被认为可能减少可溶性标记物的量和可利用性,剩下的标记物的量不足以用于分 析。另外,在本领域普遍认为广泛暴露于酸性条件会对抗原的可溶性或对测定技术中所利用的抗体的反应性造成不良影响(美国专利No.Re.33,850)。
发明内容
发明涉及处理一或多种样品以便用于分析的新方法,以及在这些方法中所使用的试剂、组合物和试剂盒。更优选地,发明涉及用于从一或多种样品的基质中(优选地从一或多种复杂样品例如粘液中)提取出一或多种标记物的提取方法和/或使得样品更适合于分析的提取方法(例如,通过减少样品的粘度)。
令人惊异的是,本发明的优选的实施方案可以优选地用单一提取方案从相同的样品中提取并测定多种标记物,优选地是多种不同生物体的标记物。因此,不同于用不同的提取方法处理分离的样品以测定两种或多种标记物,可用单一的提取方案处理相同的样品。本发明因此能以比以往所达到的更高的速度和效率处理患者的样品。本发明也更适合用于快速现场检测装置,特别是进行多分析物测定的基于微量盒(cartridge)、微液或生物芯片的方法;使用单一的提取方法可以显著地降低用户或仪器所必须进行的样品制备的复杂性。
此外,本发明的优选的实施方案的提取方法可以有效地处理多种来自多种微生物的标记物,包括蛋白、糖类、核酸或脂类标记物。标记物可以是非糖类标记物(例如,被识别由非糖类部分所构成的抗原决定簇的抗体所结合的抗原)。
本发明的一个实施方案是一种用于测定样品中的多种不同生物体的方法。测定包括检测是否存在代表生物体的标记物、定量标记物的量、鉴定已知的标记物、确定以往未知标记物的特性等。所述生物体的至少一种优选地是革兰氏阳性细菌,更优选地是链球菌属或肠球菌属的细菌(例如,A、B、F和G组链球菌)。通过从所述细菌中提取并测定一种标 记物来测定这些细菌,标记物优选地是细胞壁相关抗原,更优选地是组特异性抗原。优选地,所测定的其他的生物体的至少一种是选自由真菌和革兰氏阴性细菌所组成的组,和/或通过测定蛋白(例如,被抗体所识别的一种由氨基酸所构成的抗原决定簇)、糖类、核酸和/或脂类标记物测定其他的生物体的至少一种。所测定的病毒优选地选自由鼻病毒、副流感病毒、A、B或C型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠状病毒、腺病毒、柯萨奇A病毒、单纯疱疹病毒、肠病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和乳头瘤病毒所组成的组。
本发明包括用于提取一或多种标记物,优选的两种或多种标记物的方法,包括用包括氧化酸(优选的亚硝酸)以及任选地去污剂的提取试剂接触样品(优选地是含粘液的样品,例如咽部和/或鼻咽部拭子或鼻拭子)。标记物优选地是来源于微生物(更优选地选自造成上呼吸道疾病或病变的致病性微生物)。提取试剂从样品中提取标记物并使得它们可用于测定(优选地通过免疫测定法、更优选地通过多种免疫测定法、甚至更优选地用直接指向标记物的固定化抗体的模式化阵列(patterned array))。
有利地,可以用本方法提取蛋白标记物和/或病毒的标记物。更有利地,本方法被用于用单一的通用提取方法从相同的样品中提取至少一种蛋白标记物(优选地来自病毒)和至少一种糖类标记物(优选地来自细菌,更优选地是革兰氏阳性细菌的细胞壁标记物)。方法也可以包括制备提取试剂的步骤,优选地通过组合一种氧化盐(最优选地是亚硝酸盐)和一种酸(优选地是盐酸、硫酸、乙酸或枸橼酸)而制备。
本发明也包括用于分析在一个样品中是否存在至少一种微生物,或更优选地分析多种相关微生物的任一种微生物的方法。这些微生物优选地选自造成上呼吸道疾病或病变的致病性微生物。方法包括用包括一种氧化酸(优选地是亚硝酸)和任选地去污剂的提取试剂接触样品(优选地是含粘液的样品例如咽部和/或鼻咽部拭子或鼻拭子)。提取试剂从样品基质和/或相关的微生物中提取标记物,使得它们可被测定(优选地通过 免疫测定法、更优选地通过多种免疫测定法、甚至更优选地用针对标记物的固定化抗体的模式化阵列)。然后分析所处理的样品以测定所提取的标记物并因此测定所对应的相关微生物。有利地,可以用本方法测定蛋白标记物例如病毒的标记物。更有利地,本方法被用于用单一的通用提取方法测定相同样品中的至少一种蛋白标记物(优选地来自病毒)以及至少一种糖类标记物(优选地来自细菌,最优选地是来自革兰氏阳性细菌的细胞壁标记物)。方法也包括制备提取试剂的步骤,优选地通过组合一种氧化盐(最优选地是亚硝酸盐)和一种酸(优选地是盐酸、硫酸、乙酸或枸橼酸)制备。
在本发明的一个具体的实施方案中,通过用电化学发光剂标记的抗体的免疫测定法可以进一步地改善测定(即,标记物是抗体所识别的抗原)。结果可被用于治疗监测和指导治疗计划。
本发明也涉及包括一种氧化酸(优选地是亚硝酸)和优选地一种表面活性物质的提取试剂。本发明还涉及一种组合物,其包括提取试剂和一或多种以下成分:(a)样品、(b)检测试剂、(c)标记的试剂,及其组合。本发明仍还涉及一种试剂盒,其在一或多种容器包括:试管或室隔、提取试剂(或其部分)以及优选地,一或多种其他的提取和/或检测成分。
在一个优选的实施方案中,试剂盒也包括具有针对感兴趣的标记物的固定化的抗体的模式化阵列的固相支持物,优选地包括含有针对第一标记物的第一结合试剂的第一区以及含有针对第二标记物的第二结合试剂的第二区。试剂盒也可包含用于中和提取试剂的碱或pH缓冲剂。
具体实施方案
提取指的是使得标记物更容易被检测的样品处理。举例来说,提取包括例如通过(i)破碎或溶解细胞膜、细胞壁、或包膜等以释放出包括或包装、附着和/或结合于细胞膜、细胞壁、包膜等的标记物;(ii)从更大的化学成分中解离出标记物;(iii)降解和/或溶解多糖层和/或(iv)降 解或溶解凝胶层,从而从细胞、微生物或细胞器中游离和/或溶解标记物。提取也包括从周围的样品基质的成分中游离出标记物、细胞、细胞器和/或微生物。基质可以包括其中存在生物体或标记物的培养基。本发明的方法特别适用于从包括粘液的样品基质中提取标记物。
本发明的提取方法可以用于用单一反应体积(volume)中的单一提取方案利用本发明的提取试剂从单一样品中提取一或多种不同病变或疾病的标记物,提取试剂优选地包括一种氧化酸,更优选是亚硝酸,和任选地一种表面活性物质。
适合于用本发明提取和/或测定的标记物包括为一种生物体或一组相关的生物体的特征的并能被用于测定感兴趣的生物体或生物体类型的物质(或其片段或衍生物)。微生物在此应当理解为包括病毒、细菌、真菌和原虫。测定在此理解为包括定量和定性测定,以及包括用于各种目的所进行的测定,包括但不限定于在样品中检测分析物的存在、定量分析物的量、鉴定已知的分析物、和/或确定未知分析物的特性。
在一个优选的实施方案中,本发明的有用的标记物是造成疾病或疾病病变,优选地为呼吸道感染或性病、更优选地为咽炎、鼻窦炎、肺炎、支气管炎、流感和/或感冒的致病性微生物和/或致病性微生物类型的特征。优选的标记物包括蛋白(例如,肽、蛋白、毒素和抗生素)、糖类、核酸或脂类性质的分子或其组合(例如糖蛋白)。最优选的本发明的标记物是蛋白、肽和多糖。多种标记物的至少一种优选地是蛋白质。
适用于用本发明提取和/或测定的标记物的具体实例是:(a)革兰氏阳性细菌的细胞壁多糖,例如A、B、F、G组链球菌的组特异性抗原(这些主要由N-乙酰-葡糖胺和鼠李糖组成的链球菌抗原可被用于A、B、F、G组链球菌之间的鉴定和区分);(b)脂磷壁酸质酸(这些细菌的糖脂抗原可被用于鉴定D组肠球菌);(c)可以鉴定流感的流感特异性蛋白例如流感核蛋白、基质蛋白、血凝素、唾液酸苷酶和/或其肽类衍生物,优选地是A型流感和/或B型流感核蛋白和/或其衍生物,以及(d)可以用于鉴 定呼吸道合胞病毒(RSV)的RSV特异性蛋白,例如G、F、基质、核蛋白和/或其肽类衍生物,优选地是G或F蛋白和/或其衍生物。另一个优选的标记物组包括细菌毒素(例如,大环毒素)。
本发明已经被发展用于复杂的生物学基质例如含有多种类型的生物学的及小的有机分子的复杂的粘性生物学液体,例如富含蛋白物质的粘性渗出液。令人惊异的是,本发明的提取方法减少了与样品的基质相关的非特异性结合,且同时通过用本发明的提取试剂溶解和/或降解样品基质的粘性或固体成分降低了基质粘度,提取试剂优选地是一种氧化酸,更优选地是亚硝酸,和任选地一种表面活性物质。
本发明的优选的实施方案使用简单的一步或两步样品制备方案,该方案从生物体中游离出标记物或降解和/或液化生物学基质。用本发明的方法可以分析的生物学基质包括环境样品(例如,水、食物、除去了水或空气的淤泥、环境试纸等)、血清、血浆、血液、滑膜液、脑脊液、皮脂分泌物、脓液、尿道或阴道分泌物、和这些膜表面的清洗物。最优选地,样品是含粘液的样品,例如鼻分泌物、痰、粘痰、咽部渗出物、尿道或阴道分泌物和这些膜表面的清洗物。在本发明的一个优选的实施方案中,提取方案同时从相同样品的一或多种不同的生物体中同时游离两种或多种标记物,优选地是糖类和/或蛋白质性质的标记物。有利地,本发明的方法可以被用于同时提取不同的标记物组,以及例如可以被用于从一种生物体中提取蛋白抗原和从不同生物体中提取糖类抗原(优选地是革兰氏阳性细菌的糖类细胞壁抗原)。当不同生物体的组合造成了复合的病变以及患者需要药物的组合治疗时,这个优选的实施方案是特别有利的。根据另一个优选的实施方案,如果疾病的临床表现不能确定出诊断时,可以进行多种分析物测定以鉴定感染的生物体。
本发明的相关的生物体选自细菌、病毒和真菌的组。造成病变及与本发明特别相关的感染性微生物包括,但不限定于:
a)菌株,例如细菌株GABHS(A组链球菌)、溶血隐秘杆菌 (Arcanobacterium haemolyticum)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、肠球菌属(Enterococcus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis))、副流感(Parainfluenza)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、荚膜菌属(Calymatobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、梭菌属(Clostridium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、嗜肺性军团菌(Legionellapneumophila)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)、解脲尿枝原体(Ureaplasma urealyticum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、肺炎枝原体(Mycoplasmapneumoniae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis);
b)病毒株,例如鼻病毒、副流感病毒、A、B或C型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠状病毒、腺病毒、柯萨奇A病毒、单纯疱疹病毒、肠病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒或乳头瘤病毒的病毒株;以及
c)真菌,例如念珠菌属(Candida spp.),白色念珠菌(Candidaalbicans)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、芽生菌属(Blastomyces)、球孢菌属(Coccidioides)、或隐球菌属(Cryptococcus);
d)原虫,例如微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡晏环孢子球虫(Cyclospora cayetanensis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)或兰伯贾第虫(Giardia lamblia)。
令人惊异的是,可以用本发明的方法和试剂盒处理多种样品。优选地,样品时生物学样品,更优选的时含有致病性生物体的临床样品。通过擦拭或清洗粘膜或通过清除从粘膜分泌的液体可以收集样品。根据优选的实施方案,用取样器(例如,抽吸器、拭子、吸引器或刮勺),优选地用拭子(例如鼻部、鼻咽部、咽部或生殖器拭子)或灌洗液(例如鼻部或咽部灌洗液)从患者中收集样品。在另一个具体的实施方案中,浓缩或培养样品以增加细胞或病毒颗粒的数目。然后将样品用于使用提取试剂的提取方案,本发明的提取试剂优选是一种氧化酸、更优选地是亚硝酸,和任选地表面活性物质。
优选地,随后用本领域人员可得到的大量技术中的任何一种技术测定所提取的标记物,例如用免疫检测法和免疫层析检测法。本发明的一个优选的实施方案用多路检测格式(multiplexed assay format)、优选地用多路免疫检测格式(multiplexed immunoassay format)、最优选地用针对标记物的固定化抗体的模式化阵列测定样品中的多种感兴趣的标记物。
因此,本发明的一个宽泛的方面涉及处理一或多种可疑含有一或多种标记物的样品以制备这些用于分析的样品的方法。优选地,将样品开始与本发明的提取试剂,优选地是一种氧化酸、更优选地是亚硝酸,和任选地表面活性物质,接触一段足以提取感兴趣的标记物的时间。同时,任选地在pH中和和/或稀释后,标记物可以被彼此分离。联合样品的标记物的提取和分离可以多路分析分离的标记物或当分开分析时可以简化处理。优选地,本方法还包括分析所处理的样品的步骤。
根据一个优选的实施方案,样品是单一的生物学样品,更优选地是临床样品,甚至更优选地是来自单一患者的单一体积的单一样品。根据另一个优选的实施方案,本方法从一系列患者的一系列样品中提取一或多种标记物,在不同的单一体积中处理每个样品。
一个实施方案涉及一种利用本发明的提取试剂,优选地一种氧化酸, 更优选地亚硝酸,和任选地一种表面活性物质,从样品中提取一或多种标记物,优选地两种或多种标记物、更优选地三种或多种标记物、甚至更优选地五种或多种标记物以及最优选地十种或多种标记物的方法。优选地,至少一种标记物的性质是蛋白质、核酸或脂类(例如,不含有糖类成分且能被结合试剂所识别的抗原决定簇)。根据另一个实施方案,至少一种标记物是病毒或真菌标记物。
另一个实施方案包括同时从含有复杂生物学基质的单一样品中提取单一体积内的超过一种的标记物。更具体地,采用利用本发明的提取试剂的简单快速方法(提取试剂优选是一种氧化酸,更优选是亚硝酸,和任选地一种表面活性物质),单一样品可以被处理以提取并测定与多种不同的生物体所相关的标记物,优选地是一组致病性微生物,最优选地是一组与上呼吸道感染相关的致病性微生物。例如,及时地鉴定出造成疾病或病变(例如感冒、咽炎、气管支气管炎、喉炎、鼻窦炎、支气管炎、肺炎等)的致病性微生物有助于改善患者健康状况和治疗。因此,在本发明的一个实施方案中,提取方案成功地提取(以及优选地也分离)了多种标记物。优选地,这些标记物是生物体标记物,更优选地是不同生物体的标记物,以及甚至更优选地是细菌、病毒和/或真菌的标记物。
根据一个优选的实施方案,利用本发明的提取试剂的化学提取不仅提取微生物的抗原,也同时液化或减少样品或样品的基质的粘度,优选地是粘液分泌物(渗出物)的基质的粘度,提取试剂优选地是一种氧化酸、更优选地是亚硝酸,和任选地表面活性物质。
仍另一个实施方案涉及通过将含有一或多种生物体(优选的两种或多种生物体)的样品与提取试剂接触,测定两种或多种标记物的方法,优选地是生物体标记物,优选地是各种生物体标记物,更优选地是细菌、病毒和/或真菌标记物,提取试剂优选地是一种氧化酸、更优选地是亚硝酸,和任选地表面活性物质。优选地,方法包括从基质中分离两种或多种标记物,由此制备一种检测组合物,优选地还包括中和检测组合物的pH(例 如,加入碱和/或缓冲液使得pH在6.0和8.5之间),以及检测或测定所述检测组合物中的两种或多种标记物,优选地在单一体积内,或者,在两个或多个含有部分相同样品的检测体积内。
本发明的提取方法可以包括在将样品与提取试剂接触之前或在测定之前,优选地通过过滤或离心而预浓缩样品。也可用离心或过滤优选地在测定溶解标记物之前去除溶解后所残留的颗粒碎片。
根据本发明的一个特异的实施方案,测定方法是一种针对疑似患有感染性疾病或病变的患者的诊断性测试,优选地是一种上呼吸道的感染性疾病或病变和/或性病。
根据仍另一个优选的实施方案,本方法包括测定标记物。本发明的提取方案生成适用于通过包括本领域熟知的多种用于检测一或多种微生物标记物的检测格式的各种诊断性检测格式进行分析的检测组合物。
根据发明的另一个实施方案,本发明的方法还优选地包括测定样品中的标记物的步骤。在一个具体实施方案中,本发明提供了用于测定样品中的一或多种、优选地两种或多种标记物的方法,其中至少一种标记物是蛋白质、糖类、核酸、脂类分子或其组合。根据另一个实施方案,本发明提供了一种用于测定样品中的一或多种、优选地两种或多种标记物的方法,其中至少一种标记物是病毒、细菌或真菌标记物。优选地,通过应用多路测定法测定两种或多种标记物。
本发明的一个实施方案是一种用于测定样品的多种不同的生物体的方法。至少一种生物体优选地是革兰氏阳性细菌,更优选地是链球菌或肠球菌(例如,A、B、F和G组链球菌)。通过提取并测定所述细菌的标记物测定该细菌,标记物优选地是细胞壁相关抗原,更优选地是组特异性抗原。优选地,至少一种被测定的其他生物体选自真菌、病毒和革兰氏阴性细菌,和/或通过测定蛋白质、糖类、核酸和/或脂类标记物而测定至少一种其他生物体。所测定的病毒优选地选自鼻病毒、副流感病毒、A、B或C型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠状病毒、腺病毒、柯萨奇 A病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、肠病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和乳头瘤病毒。
在提取步骤之后可有多种用于测定微生物或与微生物相关的标记物的方法。这些技术包括但不限定于,基于细胞培养的检测法、凝集试验、免疫检测法(或其他基于使用感兴趣的分析物的特异性结合配偶体的检测格式)、免疫层析检测法、酶检测法等。一些技术可以允许肉眼观察所进行的测定,其他技术可能要求或借助于使用装置进行测定。可有大量的用于分析结合检测法的产物的测定技术。这些技术包括在表面上形成结合反应产物的固相结合检测技术以及结合产物仍保留在溶液中的均质结合检测技术。技术通过测定标记的结合试剂的参与量(例如,通过测定具有荧光、化学发光、放射性、磁性、酶的特征的标记的这些特征的活性)可以测定结合事件,或不需要使用标记(例如依据测定量的变化或屈光率例如表面声波和表面等离子体共振的测定的技术)。另外,还有化学测试,其中当暴露于特定的化学物时,特定的分析物引起颜色改变。其他适合的测定方法包括应用酶的生物传感器,其中酶识别特定的分析物、催化一种分析物化学转化为一或多种反应产物,并用眼或装置测定反应产物。
可被用于测定的技术的其他实例包括质谱法、色谱法、电泳、凝集反应、western印迹、特异结合检测法、免疫检测法、免疫荧光和免疫色谱检测法。本发明优选的方法是特异结合检测法,优选地是免疫检测法或免疫色谱检测法。
根据本发明的优选的实施方案的免疫检测法或特异结合检测法可以涉及多种本领域可获得的格式。可以用标记物标记抗体和/或特异结合配偶体,或将其固定化于表面。名词“抗体”包括完整的抗体分子(包括抗体亚基的体外重新组合所装配成的杂交抗体)、抗体片段和包括抗体的抗原结合区的重组蛋白构建体(如例如在Porter,R.R.and Weir,R.C.J.CellPhysio.,67(Suppl1):51-64(1966)和Hochman,J.Inbar,D.and Givol,D. Biochemistry12:1130(1973)中所描述的,在此并入作为参考)。该名词也包括已经被化学修饰的例如通过引入一种标记物所修饰的完整的抗体分子、抗体片段和抗体构建体。
优选地,测定方法是一种结合检测法,更优选地是一种免疫检测法,以及通过将检测组合物与一或多种能与感兴趣的标记物特异性结合的测定分子接触进行测定。更优选地,测定使用三明治或竞争性结合检测格式。在Grubb等的美国专利No.4,168,146和Tom等的美国专利No.4,366,241中描述了在测试带中进行的三明治免疫检测法的实例,在此将这两者内容一同并入作为参考。适合用于本发明的竞争性免疫检测设备的实例包括在Deutsh等的美国专利No.4,235,601、Liotta等的美国专利No.4,442,204以及Buechler等的美国专利No.5,208,535中所描述的设备,在此将其完全内容一同并入作为参考。最优选地,在这样一种检测法中所采用的至少一种结合试剂被固定化于固相支持物上。
根据本发明的优选的实施方案,用本发明的提取方法处理样品,随后用基于电化学发光的检测格式、最优选地是用基于电化学发光(ECL)的免疫检测法测定标记物。ECL的高敏感性、大的动态范围以及选择性是用于医学诊断的重要因素。商业可获得的ECL仪器已经表现出特殊的性能。因为包括它们的接触敏感性、动态范围、精确性以及对复合样品基质的可耐受性的原因,它们已经被广泛地使用。
优选地,在固相三明治免疫检测法中测定标记物,最优选地,采用ECL测定。在固相三明治免疫检测法中,使用了两种针对标记物的抗体:i)被连接于或能被连接于固相的捕获抗体(例如,通过形成特异的结合对,例如生物素-链亲和素相互作用)和ii)连接于或能被连接于一种标记优选地是ECL标记的检测抗体(例如,通过形成特异的结合对,例如生物素-链亲和素相互作用)。将包括溶解标记物的样品与两种抗体和固相接触,使得在存在标记物时,两种抗体与标记物结合并在包括标记的固相上形成“三明治复合物”。测定固相上的标记以测定出样品中的标记物。
特定的商业化可获得的仪器使用利用永久的可再用流动细胞的基于流动细胞的设计。在这些类型的仪器中实施的大多数结合检测法都使用磁反应性粒子作为用于固相结合检测法的固相支持物。在磁铁的帮助下,将与粒子结合的ECL标记收集于流动细胞中的电极上。通过将电压应用于电极上诱导所收集的粒子上的标记发射ECL并测定ECL以测定标记的量。ECL检测方法也可以包括在应用ECL诱导电压之前引入ECL共反应剂的步骤。
最近,已经阐述了使用固定化于电极上用于诱导ECL的试剂的ECL仪器(见,例如美国专利No.6,140,045、6,066,448、6,090,545、6,207,369和已出版的PCT申请No.W098/12539)。在这种情况中,电极本身是固相支持物。最近也阐述了具有整合的适用于这些ECL仪器的电极的多孔板(见,例如未决美国申请No.10/185,274和10/185,363,名为“用于发光测试测定的检测板、读数系统和方法”,均在2002年6月28日提交,在此一同并入作为参考)。这些具有整合电极的多孔板包括在孔内具有多个检测区的板,其中多个结合试剂可以被固定化。应用多孔检测板允许平行处理和分析分布于板的多个孔内的多个样品。通常在多孔检测板中储存、处理和/或分析样品和试剂(也已知为微量板和微滴定板)。
根据本发明,利用网板印刷的碳墨电极(screen-printed carbon inkelectrodes)进行电化学发光测定,例如排列于特殊设计的微量盒或多孔板(例如24、96、384等孔板)的底部的碳墨电极。如在未决美国申请No.10/185,274和10/185,363(两者都称为“用于发光测试测定的检测板、读数系统和方法”,在2002年6月28日提交,在此一同并入作为参考)中所描述的那样,诱导并用显像的板读数器测定碳电极表面的ECL标记的电化学发光。现在可商业化获得类似的板和板读数器(Sector HTSinstrument,Meso Scale Discovery)。
因此,为了进一步提高对相关生物体的测定或其他分析的敏感性和选择性,本发明优选的实施方案在免疫检测法和被标记的试剂中采用电 化学发光(ECL)标记,优选地是被ECL标记所标记的抗体。同时,有多种用于分析测定的商业化可获得的ECL标记。在美国专利No.5,093,268、5,147,806、5,324,457、5,591,581、5,597,910、5,641,623、5,643,713、5,679,519、5,705,402、5,846,485、5,866,434、5,786,141、5,731,147、6,066,448、6,136,268、5,776,672、5,308,754、5,240,863、6,207,369和5,589,136以及出版的PCT No.WO99/63347、WO00/03233、WO99/58962、WO99/32662、WO99/14599、WO98/12539、WO97/36931、WO98/57154、和PCT/US02/19788中描述了电化学发光标记、共反应剂以及检测或测定方法和系统的实例,在此将所有的文献一同并入作为参考。ECL标记的实例包括:i)有机金属化合物,其中金属是来自例如VIII组的贵金属,包括含Ru和含Os有机金属化合物,例如顺-二毗啶-钌(tris-bipyridyl-ruthenium(RuBpy))部分以及ii)鲁米诺和相关化合物。在ECL过程中与ECL标记反应的种类在此被称为ECL共反应剂。常用的共反应剂包括叔胺(例如,见美国专利No.5,846,485,在此将其并入作为参考)、草酸盐以及用于RuBpy的ECL的过硫酸盐以及用于鲁米诺的ECL的过氧化氢(见,例如美国专利No.5,240,863,在此将其并入作为参考)。ECL标记所生成的光子可以被用作为诊断方法中的报告信号(Bard等,美国专利No.5,238,808,在此将其并入作为参考)。例如,ECL标记可以被共价地结合到结合试剂例如抗体上,并且通过测定ECL标记所发射的ECL可监测结合试剂在结合相互反应中所参与的量。
本发明的一个实施方案涉及一种测定一或多种标记物(优选地是两种或多种标记物)的方法,包括:
(a)将含有一或多种标记物的样品与本发明的提取试剂接触以形成含有一或多种所提取的标记物的组合物;
(b)将所述组合物与含有一或多种能与所述一或多种所提取的标记物结合的结合试剂接触,所述结合试剂连接了ECL标记;
(c)诱导所述标记以诱导电化学发光;以及
(d)测定所发射的电化学发光。
本发明的一个实施方案涉及一种测定样品中的多种不同的生物体类型的方法,包括:
(a)将所述样品与包含亚硝酸的提取试剂接触,以形成检测组合物;以及
(b)在所述检测组合物中测定所述多种生物体种类的标记物以测定出所述多种生物体种类。
优选地,试剂进一步包括一或多种能与所述一或多种所提取的标记物结合的捕获试剂,其中捕获试剂被连接到珠上或连接到固相支持物上(例如,用于诱导电化学发光的工作电极)。
优选地,方法进一步包括在步骤(a)后调整或中和组合物的pH值。
优选地,试剂包括多种不同的能结合多种不同的标记物的结合试剂,以及任选地多种不同的捕获试剂。
本发明的另一种优选的实施方案涉及一种用于同时从一或多个患有呼吸道疾病的患者中提取各种微生物标记物,优选地是不同的和/或不一样的化学特性的标记物(例如,蛋白、糖类等)的临床方法。优选地用咽拭子或鼻拭子从患者或优选地从患上呼吸道病变的患者中取到样品。将样品与本发明的提取试剂接触,提取试剂优选地是一种氧化酸、更优选地是亚硝酸,和任选地表面活性物质,它游离出微生物标记物并有利地液化粘液渗出物以形成检测组合物。所形成的检测组合物或被直接测定感兴趣的微生物的存在或被用pH缓冲剂中和后再进行测定。优选地,感兴趣的微生物是A组链球菌、A/B型流感病毒以及RSV。可以在“诊所内”便利地处理并测定样品,优选地当患者在医生的诊所时。本发明的一个主要的优点是单一的提取步骤可以与对各种不同的微生物的测定结合。快速的结果可以帮助医师(i)提供适当的和及时的治疗计划;(ii)正确地处方出抗病毒药物以及(iii)减少抗生素的不必要的使用。
本发明的另一个方面涉及用于本发明的提取试剂。一个实施方案涉 及一种包括氧化酸的提取试剂。优选地,试剂还包括一种表面活性物质。令人惊异的是,本发明的提取试剂被广泛地应用于各种微生物和基质。
另一个实施方案涉及一种基本上由一种氧化酸、优选地为一种氧化酸,和一种表面活性物质的水溶液组成的提取试剂。根据另一个实施方案,提取试剂基本上由一种氧化酸、一种表面活性物质以及一或多种选自以下一组的成分组成,所述的组由(a)检测标记(例如,ECL标记)、(b)能与一或多种标记物结合的结合试剂、(c)ECL共反应剂、以及(d)封闭试剂(例如,BSA)组成。可以通过加入碱和/或缓冲剂中和溶液使得pH值在6.0和8.5之间。
优选地,氧化酸是亚硝酸。在本领域,已知亚硝酸是适用于暴露出A组链球菌的A组抗原,但以前认为它对蛋白、核酸和脂类标记物的提取是非常有害的。优选地将亚硝酸与一种表面活性物质例如非离子型去污剂联合使用以进一步改善提取的效率。
在本发明的一个优选的实施方案中,联合亚硝酸盐和一种酸制备所用的亚硝酸。有用的亚硝酸盐包括无机盐例如亚硝酸钠、钾、锂以及有机的亚硝酸盐。优选地,亚硝酸盐是亚硝酸钠。有用的酸包括无机酸例如盐酸和硫酸以及有机酸例如乙酸和柠檬酸。优选地,酸是有机酸,更优选地是乙酸。
用于本发明提取试剂的适合的表面活性物质包括,但不限定于Tween、TRITON、CYMAL、ZWITTERGENT、IPTG、CHAPS、CHAPSO、Anapoe、BAM、FOS-胆碱、Pluronics、四聚醇胺、Brij、Span、HEGA、C-HEGA、正-十二(十三、十四、十六、十一)烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Do(Tri,Tetra,Hexa,Un)decyl-β-D-maltoside)和L-、D-DAO表面活性物质家族。
根据一个优选的实施方案,通过将一种亚硝酸盐例如亚硝酸钠和一种酸以及任选地一种表面活性物质混合生成提取试剂。优选地,通过混合等体积的亚硝酸钠溶液和乙酸钠,且任选地两种成分均(或任一成分)含有表面活性物质,优选地是Tween-20,而生成提取试剂。更优选地, 混合从0.5M到10M亚硝酸钠溶液和匹配浓度的范围从0.1M到0.5M的酸(优选地是乙酸),且任选地各种溶液均含有从0.5%到5%表面活性物质(优选地是Tween-20)(或任一溶液含有该剂量的两倍),最优选地,混合2M到7.5M亚硝酸钠溶液与从0.125M到0.188M的酸(优选地是乙酸),且任选地各种溶液均含有从1%到3%的表面活性物质(优选地是Tween-20)。
根据本发明也可以使用浓缩的提取试剂。更高的试剂浓度造成更快的提取,而更低的提取试剂浓度可以是优选的,因为它使得中和过程更容易,使得蛋白变性和脱氮作用更小化以及保持标记物的抗原性和试剂稳定性。在一个优选的实施方案,例如,将一种2M亚硝酸钠、1%Tween-20的溶液与一种0.125M乙酸、1%Tween-20的溶液混合。在另一个具体的实施方案中,将一种7.5M亚硝酸钠、3%Tween-20的溶液与一种0.188M乙酸和3%Tween-20的溶液混合。
在本发明的一个优选的实施方案中,混合生成亚硝酸的两种试剂中的其中一种试剂是干燥形式的,优选地是干燥形式的有机酸或干燥形式的任何亚硝酸盐。
本发明的另一个方面涉及用于从样品例如复杂生物学基质中提取并优选地测定标记物的改良的组合物。
一个实施方案涉及一种组合物,该组合物包含:(a)两种或多种标记物(优选地是两种或多种提取的标记物),优选地是生物体标记物,优选地是微生物标记物,优选地是不同生物体的标记物,更优选地是细菌、病毒和/或真菌的标记物;以及(b)一种氧化酸,优选地是一种氧化酸以及一种表面活性物质,优选地是非离子型表面活性物质,组合物的pH值为从2到5,优选地在测定前对pH值进行中和。优选地,组合物是一种检测组合物,它们能被用于快速诊断造成疾病的多种感染性微生物。
仍是本发明的另一个实施方案涉及一种组合物,它含有一或多种提取的标记物,优选地是生物体标记物,优选地是微生物标记物,优选地 是不同生物体的标记物,更优选地是细菌、病毒和/或真菌的标记物,以及一种pH值范围从2到5的氧化酸,优选地是一种氧化酸和一种表面活性物质,优选地是非离子型表面活性物质,优选地在测定前对pH值进行中和,以及至少一种标记物是蛋白、肽、毒素、核酸或脂类,或至少一种标记物是病毒或真菌的标记物。优选地,检测组合物也可以包括一或多种检测分子或能特异地与感兴趣的标记物结合的捕获分子(即结合试剂)、检测标记、和/或共反应剂等。
在一个实施方案中,检测组合物包括一种样品和一种提取试剂,其中样品包括生物体、毒素和/或病毒颗粒以及一种本发明的提取试剂。在一个优选的实施方案中,检测组合物还可以包括pH缓冲剂或碱,它们能中和提取试剂。例如,在将样品与提取试剂孵育足够长的一段时间之后,将中和缓冲剂(优选地是Tris或PBS,更优选地是1M到2M的Tris)加入到生物学样品中。检测组合物的最终pH值优选地是中性的,优选地pH值为从6.0到8.5。在本发明的一个特异的实施方案中,可以加入干燥形式的中和缓冲液。
本发明的另一个方面涉及用于利用本发明的提取方法从样品中提取一或多种(优选地是两种或多种)标记物以及优选地用于测定标记物的试剂盒。
本发明也涉及用于测定样品中的多种不同生物体类型的试剂盒,其在一或多个容器中包括:(a)一种酸、(b)一种亚硝酸盐、(c)一种表面活性物质、(d)一种与所述多种不同的生物体类型的第一种生物体的第一种标记物结合的第一结合试剂,以及(e)一种与所述多种不同的生物体类型的第二种生物体的第二种标记物结合的第二结合试剂。优选地,第一和第二结合试剂是抗体。
试剂盒将优选地在一或多种容器内包括提取试剂,优选地是亚硝酸,以及任选地一种表面活性物质。优选地,试剂盒孩包括一或多种检测成分。更优选地,试剂盒包括在分开的容器或隔室内的亚硝酸盐、一种酸 和一种非离子型表面活性物质,以容许快速重新组合以生成本发明的提取试剂。
本发明也涉及一种用于从样品中提取两种或多种标记物以及在一或多种检测法中所使用的试剂盒,所述标记物优选地是生物体标记物,优选地是微生物标记物,优选地是不同生物体的标记物,更优选地是细菌、病毒和/或真菌的标记物,所述试剂盒在一或多个容器、小瓶或隔室中包括:(a)一种酸、(b)一种亚硝酸盐、(c)一种表面活性物质,优选地是非离子型表面活性物质以及(d)至少一种提取成分,所述提取成分选自由(i)pH缓冲剂/pH中和剂、(ii)取样设备(例如,拭子、抽吸、拭子、吸引或刮勺)、(iii)防腐剂、(iv)稳定剂、(v)提取容器、(vi)漂白剂、(vii)干燥剂、(viii)捕获部分、和(ix)检测部分所组成的组。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于从样品中提取一或多种标记物以及在一或多种检测法中所使用的试剂盒,所述标记物优选地是生物体标记物,优选地是微生物标记物,优选地是不同生物体的标记物,更优选地是细菌、病毒和/或真菌的标记物,所述试剂盒在一或多个容器、小瓶或隔室中包括:(a)一种酸、(b)一种亚硝酸盐、(c)一种表面活性物质,优选地是非离子型表面活性物质以及(d)至少一种提取成分,所述提取成分选自由(i)pH缓冲剂/pH中和剂、(ii)取样设备(例如,拭子、抽吸器、拭子、吸引器或刮勺)、(iii)防腐剂、(iv)稳定剂、(v)提取容器、(vi)漂白剂、(vii)干燥剂、(viii)捕获部分、和(ix)检测部分所组成的组,其中至少一种标记物是蛋白、肽、毒素、核酸或脂类,或至少一种标记物是一种病毒或真菌的标记物。本发明的试剂盒还可以包括一或多种能结合感兴趣的标记物的结合试剂。试剂盒也可以包括混合形成亚硝酸的干燥或溶液形式的亚硝酸盐以及干燥或溶液形式的酸,以及作为pH缓冲剂/pH中和剂的Tris碱或缓冲剂或PBS。
优选地,试剂盒还包括取样装置(例如,抽吸器、拭子、吸引器、刮勺等)、提取容器、pH缓冲剂、防腐剂、稳定剂、干燥剂和漂白剂。
试剂盒被优选地适合用于或兼容于各种检测方法,例如免疫检测法、免疫色谱检测法、特异性结合检测法、色谱和质谱检测法,且并不限定于一种具体的检测技术。
同样,根据一个优选的实施方案,试剂盒还包括特异性结合配偶体,优选地是标记的特异性结合配偶体,更优选地是ECL标记的特异性结合配偶体。本发明的试剂盒的结合配偶体可以包括各种物质,包括但不限定于抗体、肽或非肽的模拟物、外源性凝集素、抗原、DNA和/或RNA适体、生物素、链亲和素、抗生物素蛋白、半抗原、抗半抗原、抗生素等。
在一个优选的实施方案中,试剂盒包括两种结合配偶体,其中第一配偶体被固定化于固相支持物上,例如多孔板底部或珠,以及用标记优选地用ECL标记来标记第二配偶体。ECL检测试剂盒的实例包括那些来自IGEN国际公司(Gaithersburg,Maryland)、Meso Scale Diagnostics(Gaithersburg,Maryland)、以及Roche Diagnostics的试剂盒。这些试剂盒可以与本发明的提取试剂组合。在上述的电化学发光专利中描述了其他适合的试剂盒,在此一同并入作为参考。
在一个优选的实施方案中,固相支持物具有固定化于其上的结合试剂(优选地是抗体)的模式化阵列,以形成具有第一结合试剂的第一区以及具有第二结合试剂的第二区。这些结合试剂优选地是针对感兴趣的标记物,例如感兴趣的生物体的标记物。
根据本发明的优选的实施方案,试剂盒包括一种预先装配的含有优选地被储存于一或多个隔室中的包括本发明的提取试剂的一或多种必需的试剂的系统或装置,例如微量盒或多孔板。这些试剂盒将容许“在诊所内”进行快速的标记物提取并随后进行分析。
下面的实施例进一步举例说明了本发明。
实施例
以下的实施例是在本发明的范围内的一些提取物、板、试剂盒和方法的举例说明。因此,在任何情况下它们都不能被认为是对发明的限制。本领域人员不需要过多的试验就可以对本发明进行大量的变更和修饰。
材料和方法:
提取试剂:
在使用前通过混合等体积的亚硝酸钠储存溶液(2M亚硝酸钠,1%Tween-20)以及乙酸储存溶液(0.125M乙酸,1%Tween-20)新鲜制备提取溶液,使得终浓度为1M亚硝酸、0.5%Tween-20、0.0625M乙酸。
在一些实施方案中,使用更浓缩的提取试剂。在使用前通过混合等体积的亚硝酸钠储存溶液(7.5M亚硝酸钠)、乙酸储存溶液(0.188M乙酸)以及3%Tween储存溶液新鲜制备该溶液。当使用高浓度的提取试剂时,将特别地提及。
细菌和病毒的制备:
将化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌,ATCC12385)在5%CO2大气、37℃下培养于胰酶解酪蛋白大豆肉汤培养基中直到混浊。用PBS(100mM磷酸缓冲液、150mM NaCl,pH7.5)按1:10稀释该储存液。
从Advanced Biotechnologies Inc.购得A型流感病毒、B型流感病毒以及呼吸道合胞病毒的病毒样品(2.25x1012病毒颗粒/ml),并在使用前用PBS将其稀释到所需的浓度。
粘液制备:
从没有上呼吸道疾病症状的个体中取得人支气管粘液样品或鼻分泌物样品。超声处理高度粘性的样品和低粘性的样品,直到获得均质溶液。
ECL标记:
用如下所示的标记化合物1(Sulfo-TAGTM NHS Ester,Meso ScaleDiscovery,a division of Meso Scale Diagnostics,LLC,Gaithersburg,MD)标记用于电化学发光测定的生物分子。
通过将sulfo-TAG NHS酯加入到pH8.0的生物分子的磷酸缓冲盐溶液中进行生物分子的标记。通常用分子排阻色谱法(例如,用SuperdexPeptide Gel或Sephadex G50,Pharmacia Biosciences)或反相HPLC将标记的生物分子从未结合的标记中纯化出来。对于标记的蛋白,从标记浓度(从Sulfo-TAG标记在455nm,ε455~15,400M-1cm-1的消光系数计算得到)和蛋白浓度(用BCA蛋白检测法测定得到,Pierce Chemicals)中计算出每份蛋白的标记浓度。分别从Virostat Inc.,Fitzgerald IndustriesInternational,Research Diagnostics Inc.和Accurate Chemical and ScientificCorp.购得多克隆的抗A组链球菌抗体和单克隆抗A型流感、抗B型流感、抗RSV抗体。
多孔板
用特别设计的96孔多孔板(Multi-ArrayTM或Multi-SpotTM plates, Meso Scale Discovery,a division of Meso Scale Diagnostics,LLC,Gaithersburg,MD)进行电化学发光测试。
测试设备:
诱导电化学发光并用Sector HTSTM读数器或Sector pRTM读数器(Meso Scale Discovery,a division of Meso Scale Diagnostics,LLC,Gaithersburg,MD)测定。
实施例1:对化脓性链球菌的检测和定量
用粘液溶液(1:4体积比)稀释化脓性链球菌(A组链球菌)、混合并在室温下孵育2个小时。
将粘液中的A组链球菌溶液(50μl)与450μl提取试剂或两种对照溶液中的其中一种溶液(4%Tween-20的PBS溶液或无表面活性物质的PBS溶液)混合。在混合并孵育15分钟后,将溶液与等体积的含有150mM磷酸的磷酸缓冲液(PBS)混合并中和提取体积的酸度。将无A组链球菌的PBS用作为阴性对照以测定检测背景。
通过将2.5μl50mg/ml抗体的PBS溶液直接沉积在电极表面,用对排列在特别设计的96孔板(High Bind Multi-Arrayplates,MSD)底部的网板印刷的碳墨电极的被动吸附固定化多克隆抗链球菌抗体(针对A组糖类)。在溶液被干燥后,往每个孔中加入250μl5%BSA(小牛血清白蛋白,Seracare Inc),在使用前将板在4℃下储存过夜。然后在使用前即刻用每孔300μl PBS冲洗板两次。用ECL免疫检测法测定板中的A组链球菌抗原。将25μl处理样品和25μl用Sulfo-TAG(3μg/ml)标记的缀合的抗A组链球菌抗体一起加入到板的分隔的孔中。将板孵育1个小时,洗涤并添加ECL检测缓冲液(125mM三丙胺,溶于200M磷酸缓冲液,pH7.5),用ECL定量A组链球菌抗原的量。
数据(表I)说明粘液的存在完全抑制了免疫检测,除非用亚硝酸或 表面活性物质处理样品以及先前的处理可以改进的A组链球菌的定量。
表I
实施例2:对A型流感病毒的检测和定量
用PBS1:10稀释纯化的A型流感病毒(2.25x1012病毒颗粒/ml,Advanced Biotechnologies Inc.)。然后用低粘度粘液制品稀释(1:4)该制品、混合并在室温下孵育2个小时。
将粘液中的流感病毒溶液(50μl)与450μl提取试剂或两种对照溶液中的其中一种溶液(4%Tween-20的PBS溶液或无表面活性物质的PBS溶液)混合。在混合并孵育15分钟后,将溶液与等体积的含有150mM磷酸的磷酸缓冲液(PBS)混合并中和提取试剂的酸度。将无A型流感病毒的PBS用作为阴性对照以测定检测背景。
通过沉积2.5μl50mg/ml抗体的PBS溶液用对排列在特别设计的96孔板(High Bind Multi-Array plates,MSD)底部的网板印刷的碳墨电极的被动吸附固定化多克隆抗A组流感病毒抗体。在溶液被干燥后,往每个孔中加入250μl5%BSA,在使用前将板在4℃下储存过夜。然后在使用前即刻用每孔300μl PBS冲洗板两次。用ECL免疫检测法测定板中的A型流感病毒抗原。将25μl提取的粘液/抗原溶液或PBS和25μl用TAG(3μg/ml)标记的缀合的抗A型流感病毒抗体一起加入到板的分隔的孔中。将板孵育1个小时,洗涤并添加ECL检测缓冲液,用ECL定量A型流感病毒抗原的量。
数据(表II)说明粘液的存在抑制了对病毒分析物的定量,除非用表 面活性物质处理样品。此外,令人惊异的是,亚硝酸的处理没有负面地影响检测。
表II
实施例3:对多种分析物的同步检测和定量
通过稀释纯化的储存液制备A型流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒(Advanced Biotechnologies,Inc.)的PBS溶液。也制备混浊的化脓性链球菌培养物的PBS的1:100的稀释溶液。每个溶液(50μl)与450μl新鲜制备的提取试剂混合并孵育5分钟。然后用等体积的PBS中和溶液。
制备4点96孔多点板(Meso Scale Discovery)使得每个孔含有4个分离的点,将特异于四种分析物中的每种分析物的抗体固定化于分离的点上。通过将250nl50μg/ml抗体的PBS溶液沉积于每个孔被动地固定化抗体。在溶液被干燥后,往每个孔中加入250μl5%BSA并将板在4℃下储存过夜。然后在使用前用每孔300μl PBS冲洗板两次。
将分析物溶液分散到各个孔中(25μl/ml),再加入含有四种TAG标记的缀合抗体(每种抗体特异于一种分析物)的混合物的溶液(25μl,每种抗体的终浓度为1.5μg/ml)。在混合1个小时后,洗涤板,加入200μl ECL检测缓冲液(125mM三丙胺,溶于200M磷酸缓冲液,pH7.5),用ECL定量每个点上所捕获的抗原的量(表III)。
试验证实了可使用相同的酸预处理对病毒和化脓性链球菌进行检测。
表III
实施例4:亚硝酸和表面活性物质对粘液的作用
取得非常粘性的鼻分泌物形式的粘液样品。将样品分成两部分(每部分500μl)并放置于干净的塑料管中。涡旋处理样品,但是这对样品的物理性质无影响——两管都没有液体能够从管子中倒出。
将200μl提取试剂(用1:1的7.5M亚硝酸钠和0.188M乙酸新鲜制备)加入到一个样品中。将200μl20%Tween-20(w/v)加入到另一个样品中。将两个样品都简单涡旋并在室温下孵育2分钟。注意到用表面活性物质处理没有改变样品的粘度。但是,酸处理的样品具有更低的粘度,并且可以容易地从管中倒出。在另外孵育30分钟后,观察到酸处理粘液的粘性出现更大的减低。
实施例5:在含粘液样品中同时检测A组链球菌和A型流感病毒
通过超声处理用水稀释的粘稠的鼻分泌物制备均质的粘液溶液。通过将粘液溶液与A型流感病毒和A组链球菌的浓缩的储存液(最终稀释1:500)混合制备阳性测试样品,以模拟从患病个体中取得的鼻部样品。通过仅仅用PBS掺和粘液溶液制备阴性对照样品。在进行测试前,将这些溶液冰浴放置1.5个小时。通过加入等体积的0.188M乙酸、3M亚硝酸钠和3%Tween-20新鲜制备高浓度的提取试剂。通过用水替代3%Tween-20也可制备缺乏表面活性物质的提取试剂。
将每种阳性或阴性样品(100μl)与450μl提取试剂(有或无表面活性物质)混合。在孵育5分钟后,加入50μl2M TRIS缓冲液(pH7.5)以中和所述溶液。将这些溶液(75μl)与含有抗A组链球菌和抗A型流感病毒的标记抗体(每种10μl,25μg/ml)的溶液混合,并将50μl这些溶液加入到含有预先吸附于不同点的A组链球菌和A型流感病毒捕获抗体的MSD4点多点板,孵育10分钟不进行搅动。然后洗涤板,加入检测缓冲液,并使用Sector HTSTM设备(Meso Scale Discovery,a division of Meso ScaleDiagnostics,LLC,Gaithersburg,MD)进行ECL测定。
数据(表IV)证实可以在用亚硝酸处理的相同的含粘液样品中同时测定A组链球菌和A型流感病毒。表面活性物质的作用使得病毒检测信号几乎被加倍,但对A组链球菌的检测只有很少的影响。
表IV
实施例6:用亚硝酸提取法检测临床样品中的A型流感病毒和A组链球菌抗原
从两个患A型流感病毒的个体以及两个患A组链球菌感染的个体中取得咽喉拭子。拭子被储存冷冻在-20℃。在融化后,将每个拭子放置在450μl新鲜制备的提取试剂中并孵育1分钟,届时取出拭子并通过加入50μl2M TRIS缓冲液(pH7.5)中和溶液。
在每个孔内的分离的点上用特异于A型流感病毒和A组链球菌的固定化抗体制备四点多点板。用BSA包被每个孔中的另一个点以作为背景 测定。将所中和的拭子提取物(75μl)与10μl TAG标记的A型流感病毒和A组链球菌抗体(每种标记抗体的终抗体浓度为1μg/ml)的混合物混合。将溶液(50μl)分散到孔内并孵育板8分钟,不搅动。然后洗涤板,加入检测缓冲液并用ECL定量A型流感病毒和A组链球菌的量(表V)。令人惊异的是,用本发明的提取试剂可以同时提取病毒颗粒和细菌的标记物。
表V
参考文献的并入
本发明不限定于在此所描述的具体实施方案的范围。事实上,除了在此所描述的内容,显而易见的是本领域人员根据前述的描述和附图可以对本发明进行各种改变。预计这些改变也属于权利要求书的范围内。对于在此引用的各种文献,在此将其全部内容一同并入作为参考。
Claims (14)
1.一种用于测定一种样品中的多种不同的生物体类型的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)具有固定化于其上的结合试剂的模式化阵列的固相支持物,所述模式化阵列包括:
(i)固定化于所述固相支持物的第一区的第一结合试剂,其中所述第一结合试剂与所述多种不同生物体类型的第一生物体的第一标记物特异性结合;和
(ii)固定化于所述固相支持物的第二区的第二结合试剂,其中所述第二结合试剂与所述多种不同生物体类型的第二生物体的第二标记物特异性结合;和
(b)容器或隔室,其包括:
(i)作为分开的组分的0.1M至0.5M的酸和0.5M至10M的亚硝酸盐;和
(ii)0.5%至10%的表面活性物质;
其中所述第一生物体是革兰氏阳性细菌,而所述第二生物体选自由真菌、病毒和革兰氏阴性细菌组成的组。
2.权利要求1的试剂盒,其中所述第一和第二结合试剂是抗体。
3.权利要求1的试剂盒,其中所述革兰氏阳性细菌是链球菌或肠球菌细菌且所述第一标记物是细胞壁相关抗原。
4.权利要求3的试剂盒,其中所述革兰氏阳性细菌是A、B、F或G组链球菌且所述第一标记物是组特异性抗原。
5.权利要求4的试剂盒,其中所述第二标记物是蛋白、核酸和/或脂类标记物。
6.权利要求1的试剂盒,其中所述结合试剂包括抗体。
7.权利要求1的试剂盒,还包括用于中和所述酸的碱或pH缓冲剂。
8.权利要求1的试剂盒,其中所述试剂盒包括所述酸和亚硝酸盐,且所述亚硝酸盐和/或所述酸是干燥形式的。
9.权利要求1的试剂盒,其中所述试剂盒包括所述酸和亚硝酸盐,且所述亚硝酸盐和/或所述酸是溶液形式的。
10.权利要求1的试剂盒,其中所述试剂盒包括亚硝酸。
11.权利要求1的试剂盒,其中组分(a)和(b)位于微量盒中。
12.权利要求1的试剂盒,其中组分(a)和(b)位于多孔板中。
13.权利要求1的试剂盒,其中组分(a)位于微量盒中。
14.权利要求1的试剂盒,其中组分(a)位于多孔板中。
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CX01 | Expiry of patent term | ||
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