Die vorliegende Erfindung umfaßt gemäss den Ansprüchen die Herstellung
chemisch modifizierter, vernetzter Hämoglobine mit verbesserten funktionellen
Eigenschaften, die nach diesem Verfahren hergestellten vernetzten Hämoglobine,
sowie ihre Verwendung als künstliche Sauerstoffträger. Das Herstellungsverfahren
ist gekennzeichnet sowohl durch technisch Einfachheit als auch hohe Ausbeuten.
Hochreines desoxygeniertes Hämoglobin wird unter dem Schutz eines
Antioxidationsmittels mit einem Effektor der Sauerstoffbindung, insbesondere
Pyridoxal-5-phopshat, kovalent konjugiert, danach erfolgt die Polymerisierung des
Hämoglobins mit Glutardialdehyd bei sehr starker Zunahme des Volumens des
Reaktionsgemisches und somit sehr starker Verdünnung der Reaktanden
während der Zugabe des Vernetzers. Anschließend wird nach Verdünnung mit
Wasser an die vernetzten Hämoglobine ein Polyethylenoxid-Derivat chemisch
angeknüpft. Erhalten werden mit Blutplasma vertägliche Polymere mit optimierter
Sauerstoffbindungs-Charakteristik, die als künstliche Sauerstoffträger, insbe
sondere aufgeteilt in einen nieder- und einen hochmolekularen Anteil als
Blutsubstitut bzw. als Blutadditiv, beispielsweise bei der Behandlung von
Sauerstoffmangelzuständen, Verwendung finden können.
In der Medizin ist es aus verschiedenen klinischen Indikationen wünschenswert,
ein künstliches Unterstützungssystem für den Sauerstofftransport verfügbar zu
haben. Im Falle eines akuten Blutverlustes erscheint es nämlich nicht nur sinnvoll,
das Flüssigkeitsvolumen isoton und isonkotisch zu ersetzen, sondern auch eine
weitere wesentliche Funktion des Blutes, nämlich die des Sauerstofftransports zu
restituieren. Bei sinkender Bereitschaft zur Blutspende stehen immer seltener im
akuten Katastrophenfall (u. a. auch im Kriegsfall) passende Blutkonserven zur
Verfügung, um insbesondere einen unvorhersehbaren Bedarf decken zu können.
Die momentane Verfügbarkeit geeigneter Blutkonserven bringt zudem erhebliche
logistische Probleme mit sich. Ferner lassen sich Blutkonserven in der Regel nur
etwa 35 Tage lagern und müssen deshalb ständig erneuert werden - was
erhebliche Kosten bereitet - während künstliche Lösungen wesentlich länger auf
zubewahren sind, da sie gegebenenfalls eingefroren werden können. Abhängig
von der Lagerzeit säuern sich Blutkonserven intrazellulär an, dadurch ist ihre
Sauerstoffbindungscharakteristik akut keineswegs optimal, vielmehr muß diese im
Organismus zunächst wieder regeneriert werden. Dagegen funktioniert ein künst
licher Sauerstoffträger vom ersten Moment an optimal. Der zunehmend mangeln
den Bereitschaft zur Blutspende steht auf der anderen Seite die steigende Über
alterung der Bevölkerung bedarfserhöhend gegenüber. Zugleich vermindert sich
wegen der Überalterung auch die Zahl der potentiellen Blutspender. Ebenso ist
wegen unübersehbarer Infektionsrisiken (Immunschwäche, Hepatitis) die
Bevölkerung der Vorstädte ("slums") als Blutspender ausgefallen. Ein künstlicher
Sauerstoff-transportierender Blutersatz wäre auch, unabhängig von der Blut
gruppe, universal. Es ist zudem möglich, daß mit einem solchen Blutersatz ein
Volumenmangelschock eher durchbrochen werden kann als mit einer Blut
konserve, da die Erythrozyten in der Konserve versteift sind und dadurch eine
verringerte Kapillardurchgängigkeit aufweisen. Jedenfalls haben Tierversuche
ergeben, daß ein Volumenmangelschock mit sauerstofftransportierendem Blut
ersatz wirksamer bekämpft werden kann, als mit einfachen Plasmaexpandern
(Pabst R. (1977): "Sauerstofftransport mit stromafreien Hämoglobinlösungen und
Fluorocarbonen", Med. Klin. 72: 1555-1562, Keipert P. E., Chang T. M. S.
(1985): "Pyridoxylated Polyhemoglobin as a Red Cell Substitute for Resuscitation
of Lethal Hemorrhagic Shock in Conscious Rats", Biomater., Med. Dev., Artif.
Organs 13: 1-15). Weitere Anwendungen eines künstlichen Sauerstoffträgers
kommen hinzu: Komplizierte operative Eingriffe, welche notwendig mit hohen
Blutverlusten einhergehen, lassen sich zunehmend weniger durchführen, weil die
entsprechenden Blutkonserven fehlen. Demgegenüber erarbeitet man immer
größere und invasivere operative Eingriffe - wozu insbesondere auch Trans
plantationen zählen -, deren Ausführung im Einzelfall entscheidend von der
Verfügbarkeit ausreichend vieler geeigneter Blutkonserven abhängt. Weiterhin
sind für eine Transplantation vorgesehene Organe weit besser zu konservieren,
wenn sie mit (künstlichen) Sauerstoffträgern perfundiert werden. Allein eine
Lebertransplantation benötigt bis zu 100 Transfusionseinheiten zu je 450 mL. In
Fällen polytraumatischer Schädigungen (beispielsweise durch einen Autounfall)
werden ähnliche große Mengen benötigt.
Aber nicht nur im Falle eines akuten Blutverlustes, sondern auch im Falle
chronischer Durchblutungsstörungen (insbesondere cerebrale, koronare, renale
und periphere - beispielsweise beim Hörsturz - oder einer anämischen Krise etwa
im Falle chronischer Osteomyelitis oder nach Tumor-Chemotherapie) besteht ein
Bedarf für einen künstlichen Sauerstoff-transportierenden Blutzusatz. Auch um im
Falle eines fetalen Sauerstoffmangels durch eine Plazenta-Insuffizienz einen
drohenden Abort zu verhindern oder zur Verhinderung von Sauerstoffmangel
schäden unter der Geburt, bietet sich die Anwendung des Additivs an oder aber
zur Entwöhnung von der Beatmung. Ein Bedarf solcher Art ist sogar wesentlich
größer als für den vorher genannten Fall eines akuten Blutverlustes: Jährlich sind
für etwa 750 000 Menschen in Deutschland solche chronischen Durchblutungs
störungen die Todesursache. Hinzu kommen noch die Krankheitsfälle aus dieser
Ursache. An Krebs dagegen sterben jährlich lediglich etwa die Hälfte Menschen.
Man versucht bekanntermaßen chronische Sauerstoffgewebsmängel durch
hyperbare Sauerstoffzufuhr zu therapieren. Abgesehen davon, daß diese Therapie
nur solange wirkt, wie der Sauerstoffüberdruck herrscht und abgesehen davon,
daß das Vorgehen nicht ungefährlich ist, besteht hierbei die Gefahr oxidativer
Gewebeschädigung durch radikalische Sauerstoffreaktionen, die über entspre
chende Reaktionsprodukte nachweisbar sind. Ein künstlicher Sauerstoffträger
wirkt, solange er vorhanden ist, und er offeriert dem Gewebe sogenannten
Niederdruck-Sauerstoff, so dass die genannten Schäden nicht aufträten.
Die Anwendung eines sauerstofftransportierenden Blutadditivs als vorüber
gehende Unterstützung des endogenen Sauerstofftransportsystems stellt eine
weitere Möglichkeit und Alternative zur Bekämpfung des chronischen geweblichen
Sauerstoffmangels dar, den man bisher mit durchblutungsfördernden Mitteln(z. B.
Gefäßdilatoren) zu therapieren versucht.
Für die Art der Anwendung kommt dem Konzept sehr zu gute, daß es sich um
eine funktionelle Sauerstoff-Therapie handelt: Nicht das Substrat (der Sauerstoff)
wird appliziert, sondern die Funktion des Trägersystems wird verbessert, das den
Sauerstoff zu den Geweben bringt. Dies macht die Therapie in ihrer Wirkung
multiplikativ, somit sehr effektiv, und gibt ihr gleichsam einen katalytischen
Charakter. Hinzu kommen noch deutliche Hinweise, daß ein im Plasma gelöster
Sauerstoffträger viel wirksamer ist, als ein in Erythrozyten "abgepackter".
Weiterhin kann ein solcher künstlicher Blutersatz frei von bekannten Erregern
hergestellt werden; Infektionsprobleme, wie Hepatitis und erworbener Immun
defekt (AIDS) sind auf diese Weise vermeidbar.
Eine zusätzliche potentielle Empfängergruppe für künstliche sauerstofftranspor
tierende Lösungen sind Patienten, welche eine allergische Reaktion, beispiels
weise auf HLA-Antigene, erwarten lassen. Bisher versucht man die Leukozyten
durch eine Filtration über Baumwolle aus Blutkonserven zu entfernen. Künstliche
Blutersatzlösungen wären dagegen völlig frei von Leukozyten. In neuerer Zeit hat
man an Schweinen beobachtet, dass nach Verbesserung der Sauerstoff
versorgung (Herabsetzung der Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins) das Schlag
volumen des Herzens verringert wird und die Herzfrequenz unbeeinflusst bleibt
(Villereal M. C., et al. (1987): "Engineered Red Blood Cells with Modified Oxygen
Transport Properties: A New Oxygen Carrier", Biomater., Med. Dev., Artif. Organs
15: 397). In einer anderen Arbeit (Bosman R. J., et al. (1992): "Free Polymerized
Hemoglobin Versus Hyroxyethyl Starch in Resuscitation of hypovolemic Dogs",
Anesth. Analg. 75: 811-817) wurde gezeigt, daß die Applikation sauerstofftrans
portierender Lösungen nach einem Volumenmangelschock beim Hund die
Zunahme des Herzzeitvolumens verhindert und somit das Herz schont. Hier
eröffnet sich die Möglichkeit, durch Verbesserung der Sauerstoffversorgung eine
funktionelle kardiale Protektion zu erreichen, was beispielsweise im Falle eines
Infarkts hilfreich ist. Das wäre ein völlig neuer Aspekt für die Anwendung
sauerstofftransportierender Lösungen.
Eine weitere Anwendung solcher künstlicher Sauerstoffträger wäre die Erhöhung
der Strahlungsempfindlichkeit von Tumoren, zumal sich mehr und mehr andeutet,
daß molekulare, im Plasma gelöste Sauerstoffträger sehr viel effektiver Sauerstoff
an das Gewebe abgeben, als Vollblut: Solche künstlichen Träger bewirken eine
Synergie mit dem nativen (intraerythrozyteren) Träger. D. h., dass der mole
kular-disperse künstliche Träger im Blutplasma nicht nur per se am besten
Sauerstoff aus der Kapillare abgibt, sondern zudem die Sauerstoffabgabe des
vorhandenen nativen Systems verstärkt, und zwar über den Mechanismus der
erleichterten Diffusion. Das bedeutet, daß man für diesen Zweck nur eine geringe
Konzentration des künstlichen Trägers im Plasma benötigt. Trotzdem bleibt diese
funktionelle Therapie (siehe oben) äußerst effektiv.
Alles Gesagte verdeutlicht den Bedarf eines künstlichen Sauerstofftransporteurs.
Unerläßlich für die Nutzung eines künstlichen Sauerstoffträgers ist, dass sein
Ausgangsmaterial in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Verfallene
Blutkonserven lösen das Problem somit nicht. Deshalb ist es notwendig, Tier
hämoglobine zu verwenden, vorzugsweise von den wichtigsten Schlachttieren:
Rind und/oder Schwein.
Aus der Darstellung des Bedarfs künstlichen Sauerstoffträger ergeben sich grob
zwei Typen der Anwendung: einerseits im Falle eines starken Blutverlustes und
andererseits im Falle eines chronischen Sauerstoffmangels. Im ersten Fall benö
tigt man zur Kompensation ein iso-onkotisches, Sauerstoff transportierendes
Volumensubstitut (künstliche Sauerstoffträger der ersten Generation), im zweiten
Fall dagegen ein Sauerstoff transportierendes Blutadditiv (künstliche Sauerstoff
träger einer zweiten und neuen Generation). Wie erwähnt, ist der letzte Fall der
weitaus häufigere. Im übrigen erlaubt ein entsprechendes Blutadditiv, in Kombi
nation mit einem sogenannte Plasmaexpander, auch die Therapie eines akuten
Blutverlustes mit dem großen Vorteil, daß der Arzt die Möglichkeit hat, sowohl die
Gabe von Sauerstoffträgern als auch des Flüssigkeitsvolumen, auf den Bedarf des
einzelnen Patienten abzustimmen.
Auch der Organismus vermag beides (Menge des Sauerstoffträgers und Blut
volumen) unabhängig voneinander zu verändern, nämlich die Erythrozytenbildung
über Erythropoetin und das Plasmavolumen über ein eigenes Regulationssystem.
Beide Größen sind dadurch entkoppelt, daß der Träger im Blut einen sehr viel
kleineren kolloidosmotischen Druck hat als das Plasma.
Bisher wurden von anderen drei grundsätzlich verschiedene Strategien zur Ent
wicklung eines künstlichen Sauerstoffträgers für das Blut verfolgt (Stand der
Technik: Rudolph A. S. et al. (Hrsg.): Red Blood Cell Substitutes: Basic Principles
and Clinical Applications, Marcel Dekker, New York u. a. 1998; Tsuchida E.
(Hrsg.): Blood Substitutes: Present and Future Perspectives, Elsevier Science,
Amsterdam 1998; Chang T. M. S. (Autor bzw. Hrsg.): Blood Substitutes: Prin
ciples, Methods, Products and Clinical Trials, Volume 1 und ~ Volume 2, Karger
Landes, Basel u. a. 1997 und 1998)
Verwendung von Emulsionen mit Fluorkohlenwasserstoffen - neuerdings setzt
man auch andere Halogene wie Brom ein -, in welchen Sauerstoff besonders gut
löslich ist (Hirlinger W. K., et al. (1982): Auswirkungen eines teilweisen
Blutaustausches mit Fluosol DA 20% auf den intakten Organismus des
Schweines", Anästhesist 31 660-666). Da die Fluokarbone lipophil sind, ist
jedoch zu erwarten, daß Wechselwirkungen und Störungen in den Lipidschichten
der Zellmembranen auftreten. Letztere sind integrierende funktionelle Bestandteile
der Zelle. Zudem müssen die Fluokarbone mit Emulgatoren, wie Phospholipide
dispergiert werden, welche zusätzlich mit den Membranen der Zellen interferieren
können (so benannte künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Fluorkarbonen der
ersten Generation).
Eine weitere Strategie stellt die Mikroverkapselung hochkonzentrierter Lösungen
natürlichen und auch chemisch modifizierten Hämoglobins in Phospholipidvesikeln
unter Zusatz geeigneter Effektoren der Hämoglobinbindung ("künstliche Erythro
zyten oder Hämosomen") dar (Ogata Y. (1994): "Characteristics of Neo Red Cells,
Their Function and Safety: In-Vivo Studies", Artificial Cells, Blood Substitutes, and
Immobilization Biotechnologies 22: 875-881). Auf diesem Felde sind auch erste
Tierversuche gelungen (Hunt C. A., et al. (1985): "Synthesis and Evaluation of a
Protypal Artificial Red Cell", Science 230: 1165-1168). Die Vesikel hatten einen
Durchmesser von weniger als 0,05 µm und waren damit vom Volumen her um gut
zwei Zehnerpotenzen kleiner als natürliche rote Blutzellen.
Die dritte Strategie besteht in der Herstellung infundierbarer Hämoglobinlösungen.
Der künstliche Sauerstoffträger liegt dann im Blut extrazellulär vor. Während man
die beiden ersten Problemlösungen als Herstellen eines künstlichen Blutes
ansehen kann, so daß die Schwierigkeit einer kolloidosmotischen Interferenz
nicht auftreten kann, stand bei dieser Problemlösung ein Plasmaexpander am
Anfang, dessen Makromoleküle auch Sauerstoff transportieren können (so
benannte künstliche Sauerstoffträger auf der Basis von Hämoglobin der ersten
Generation).
Natives Hämoglobin ist hierfür nicht brauchbar, da es beispielsweise zu schnell
über die Niere ausgeschieden wird. Eine chemische Modifikation ist deshalb
unerläßlich. Im Rahmen dieser Strategie hat man beispielsweise das Hämoglobin
über seine Aminogruppen kovalent an Dextrane gebunden oder selbst bis zu
einem Molekulargewicht von etwa 700 000 g/mol polymerisiert. Ersteres wurde
beispielsweise von der Firma Fresenius (Fresenius E. (1976): "Blood and Plasma
Substitute - Comprising a Colloidal Solution of Hydroxyethyl Starch Coupled to
Haemoglobin Free Stroma", Patentschrift DE-P 26 16-086) und letzteres von der
Firma Biotest (Bonhard K., et al. (1983): "Verfahren zur Gewinnung von hepatitis
sicheren, sterilen, pyrogenfreien und stromafreien Hämoglobinlösungen", Patent
schrift DE-O 31 30 770) und der Firma Alza (Bonsen P. (1976): "Water-soluble
Polymerized Hemoglobin", Patentschrift DE-O 26 07 706) verfolgt. Eine weitere
Strategie bezüglich extrazellulärer Lösungen ist, das Hämoglobin zu stabilisieren,
indem man es intratetramer vernetzt oder indem man Seitengruppen anhängt
(Oligo-Ethylenglykol), ohne das (tetramere) Molekulargewicht wesentlich zu
erhöhen (stabilisierte Hämoglobine (Matsushita M., et al. (1987): "In vivo Evalua
tion of Pyridoxylated Hemoglobin-Polyoxyethylene Conjugate", Biomat., Artif.
Cells, Artif. Org. 15: 377). Wie weiter oben erwähnt, haben extrazelluläre Bluter
satzlösungen in Tierversuchen bezüglich einer Schockbehandlung erfolgver
sprechende Ergebnisse gebracht.
Vorteil der Verwendung von Hämoglobinen als künstliche Sauerstoffträger -
gegenüber Fluorkarbonen - ist, daß sich die günstigen Eigenschaften der natür
lichen Sauerstoffbindung nutzen lassen. Dazu gehören die optimal angepaßte
mittlere Sauerstoffaffinität, die homotrope Kooperativität, also die S-Form der
Sauerstoffbindungskurve, sowie der (alkalische) Bohreffekt, der die Basis eines
natürlichen selbstregulatorischen Mechanismus zur gezielten Sauerstoffabgabe an
mangelversorgte Gewebe bildet.
Aus der diesbezüglichen Literatur geht klar hervor, daß eine intra-tetramere
kovalente Verknüpfung der Hämoglobinuntereinheiten (Keipert P. E., et al. (1989):
"Metabolism, Distribution, and Excretion of HbXL: A Nondissociation Interdime
rically Crosslinked Hemoglobin with Exceptional Oxygen Offloading Capability", -
in: Chang T. M. S., Geyer R. P. (Eds.): Blood Substitutes, Marcel Dekker, New
York 1989) und/oder eine Polymerisation des Hämoglobins zu einer starken
Erhöhung der Verweildauer im Blut führt (Chang T. M. S. (1987): "Modified Hemo
globin as Red Cell Blood Substitutes", Biomater, Med. Devices Artif. Organs 14:
323-328; Friedman H. J., et al. (1984): "In Vivo Evaluation of Pyridoxylated-
Polymerized Hemoglobin Solution", Surg., Gynecol., Obstet. 159: 429-435). Dies
ist eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Brauchbarkeit solcher
Lösungen.
Im Fall der extrazellulären molekular-dispersen künstlichen Sauerstoffträger hat
man jedoch bisher an einem sehr großen Bedarfsfeld - dem chronischen
Sauerstoffmangel - vorbeientwickelt, indem isonkotische Lösungen angestrebt
wurden. Die, wie bereits erwähnt, wesentlich häufiger auftretenden Folgen
chronischer Durchblutungsstörungen lassen sich jedoch nur durch
sauerstofftransportierende Lösungen bessern, deren kolloidosmotischer Druck
gegen den normalen (35 mbar) zu vernachlässigen ist, also nur mit Hilfe eines
sauerstofftransportierenden Blutadditivs, gewissermaßen eines "molekularen
Erythrozytenkonzentrats". Dies sind künstliche Sauerstoffträger auf der Basis von
Hämoglobin einer zweiten Generation.
Bei den verschiedenen Ansätzen, einen künstlichen Sauerstofftransporteur zu
entwickeln, traten nachfolgend genannte Probleme auf:
- - Erhöhung der Sauerstoff-Hämoglobin-Affinität: der Halbsättigungsdruck (P50)
nimmt durch die chemische Modifikation am Hämoglobinmolekül ab. Dadurch
wird die Abgabe des Sauerstoffs an das Gewebe erschwert. Dies tritt ausge
prägt bei der Bindung des Hämoglobins an Dextran auf. Um die Erhöhung der
Sauerstoffaffinität zu vermeiden, hat man geeignete Effektoren (beispielsweise
Pyridoxalphosphat) an die prosthetische Gruppe des Hämoglobins gebunden.
- - Oftmals verkleinert sich zugleich der sogenannte n50-Wert (HILL-Index) als
Ausdruck verringerter homotroper Kooperativität (abgeschwächte S-Förmigkeit
der Sauerstoff-Hämoglobin-Bindungskurve), was ebenfalls die Versorgung der
Gewebe mit Sauerstoff erschwert. Diese S-Förmigkeit der Sauerstoff-
Hämoglobin-Bindungskurve erleichtert zugleich die Aufnahme des Sauerstoffs
in der Lunge und dessen Abgabe an die Zellen. Fluorkarbone besitzen
dagegen eine lineare "Sauerstoffbindungskurve" und haben daher nicht diesen
funktionellen Vorteil.
- - Der künstliche Sauerstoffträger hat oftmals eine zu geringe Verweildauer im
Organismus, die Ausscheidung der gelösten Hämoglobine erfolgt über die
Niere. Im Falle extrazellulärer Hämoglobinlösungen als künstliche Sauerstoff
träger hat man versucht, die Ausscheidung durch intermolekulare Vernetzung
zu verhindern; jedoch bleibt trotzdem die Verweildauer der extrazellulären
Hämoglobine kleiner als gewünscht. Hämosomen werden dagegen durch das
Retikuloendotheliale System des Organismus aus dem Plasma entfernt. Beispielsweise
betrug die Halbwertszeit der künstlichen Erythrozyten (siehe oben)
nur 5,8 Stunden.
- - Zu großer kolloidosmotischer Druck: Dadurch kann es zum Volumenverlust
kommen (Volumenmangelschock). Dieser Effekt tritt auf, wenn das Molekular
gewicht des künstlichen Sauerstoffträgers mit dem der Plasmaproteine
vergleichbar ist. Auch ist man hierdurch mit der Dosierung des künstlichen
Sauerstoffträgers nicht frei, sondern muß auf die onkotischen Verhältnisse
Rücksicht nehmen.
- - Das onkotische Milieu des Plasmas wird weiterhin entscheidend durch den
sogenannte zweiten Virialkoeffizienten (A2-Wert) bestimmt: Dieser charakteri
siert die Wechselwirkung des (stets makromolekularen) Sauerstoffträgers mit
dem Lösungsmittel (Wasser). Die Synthese ist so einzurichten, daß dieser
Wert nahe null ist.
- - Zu hohe Viskosität der Trägerlösung: Diese geht in der Regel mit einem zu
großen A2-Wert einher, und sie tritt bevorzugt auf, wenn ein Träger aus Ketten
molekülen besteht. Eine zu große Viskosität tritt dem EINSTEINschen Visko
sitätsgesetz gemäß nicht auf, wenn die polymeren Trägermoleküle kugelig und
kompakt sind.
- - In vitro-Stabilität der Trägermoleküle. Diese bezieht sich einerseits auf den
Zerfall der Moleküle und andererseits auf die oxidative Bildung von Met-
Hämoglobin, welches keinen Sauerstoff mehr zu binden vermag und schließ
lich auf die Viskosität durch sich langsam ändernde Wechselwirkungen
zwischen dem Träger und dem Albumin des Plasmas.
- - Übermäßige Reaktion des retikuloendothelialen Systems (RES): Haupt
sächlicher Einflußfaktor ist die molekulare Größe des künstlichen Trägers. Es
gibt dafür eine kritische Grenze bei rund 0,3 µm: Größere Teilchen aktivieren
das RES.
- - Nieren- und Leberschädigung: Ein Nierenschock tritt vor allem dann auf, wenn
stromahaltige Hämoglobinlösung verwendet wurde. Seit man die Lösungen
ultrafiltriert, wurde eine Nierenschädigung nicht mehr beobachtet. Leber
schädigungen wurden mit Hilfe des Plasmatransaminase-Spiegels indiziert, sie
beruhen vermutlich auf zellulären Membran-Wechselwirkungen: die Leber
besitzt eine offene Strombahn (fenestrierte Kapillaren).
- - Zu überprüfen ist auch die Blutstillung; es sind Störungen im Sinne einer
Förderung und einer Hemmung denkbar, zu achten ist insbesondere auf die
Thrombozytenaggregation.
- - Antigene Wirkung: Dazu wurde neuerdings in Homologversuchen an Ratten
gezeigt, daß natives Hämoglobin nicht antigen wirksam ist und daß die
Polymerisation mit Glutardialdehyd die Antigenität nicht erhöht (Hertzman C.
M., et al. (1986): "Serum Antibody Titers in Rats Receiving Repeated Small
Subcutaneous Injection of Hemoglobin or Polyhemoglobin: A Preliminary
Report", Int. J Artif. Organs 9: 179-182). In der gleichen Arbeit wird gezeigt,
daß natives und polymerisiertes Human-Hämoglobin bei Ratten wenig antigen
wirkt und daß der Effekt durch die Polymerisation höchstens geringgradig
verstärkt wird.
- - Toxische Wirkungen lassen sich als pyrogen, vasokonstriktorisch - beispiels
weise an den Koronargefäßen - und endotoxisch differenzieren. Die vasokon
striktorische Wirkung beruht vermutlich auf dem Einfangen der Stickstoff
monoxid-Radikale, welche bekanntlich endogene vasodilatorische Steuer
substanzen sind; die vasokonstriktorische Wirkung lässt sich jedoch auch
durch die hohe Wirksamkeit der künstlichen Träger erklären, indem die glatte
Muskulatur "zu gut" mit Sauerstoff versorgt wird.
- - in vivo-Stabilität: Zu denken ist an einen endogenen enzymatischen Abbau,
beispielsweise durch Proteasen.
- - Überlastung des Organismus mit Lipoiden (Emulgatoren): Diese Komplikation
tritt bei der Anwendung mikroverkapselter Hämoglobinlösungen und
Fluokarbonen auf; hierbei wurde an Ratten eine Komplementaktivierung über
den alternativen Weg sowie eine Antikörperbildung festgestellt.
- - Verträglichkeit der künstlichen Träger mit frischem menschlichen Blutplasma,
abhängig vom pH-Wert kann es zu Fällungen kommen.
Vermutlich wegen der hier angeführten Probleme steht bislang ein künstlicher
Sauerstoffträger für die klinische Routineanwendung nicht zur Verfügung.
Aus der Nennung der manigfachen Probleme geht hervor, dass es nach wie vor
einen großen Anforderungskatalog an einen brauchbaren künstlichen
Sauerstoffträger gibt.
In der Natur wird Sauerstoff stets in mikroskopischen Riesenaggregaten trans
portiert. Es haben sich hier zwei grundsätzlich verschiedene "Problemlösungen"
entwickelt. Bei höheren Tieren (und auch beim Menschen) ist der molekulare
Sauerstoffträger in Zellen (in den Erythrozyten) abgepackt. Zweitens entwickelten
sich Sauerstoff bindende Riesenmoleküle, die sich nicht intrazellulär, sondern
extrazellulär in einer Hämolymphe gelöst finden, diese Variante trifft man vorwie
gend bei niederen Tieren in verschiedener Ausprägung an. Anneliden besitzen
beispielsweise hochmolekulare Hämoglobine mit einem mittleren Molekular
gewicht um 3 000 000 g/Mol als Sauerstoffträger. Ferner gibt es sogenannte Häm
erythrine, bei welchen das Eisen, als Sauerstoffbinder, selbst direkt mit dem
Protein molekular verknüpft ist. Schließlich findet man die Hämocyanine mit einem
Molekulargewicht um 8 000 000 g/Mol, bei welchen Kupfer das Sauerstoff
bindende Schwermetall-Ion ist, vgl. auch Barnikol W. K. R., et al. (1996):
"Hyperpolymere Hämoglobine als künstliche Sauerstoffträger. Ein innovativer
Ansatz der medizinischen Entwicklung", Therapiewoche 46: 811-815.
Der entwicklungsgeschichtliche Übergang vom extrazellulär gelösten Sauerstoff
träger zum Erythrozyten hat dazu geführt, daß sich der Sauerstoffgehalt der
Blutflüssigkeit um den Faktor drei erhöht: Während 1 mL "Blut" des Regenwurms
nur 3,6 µmol Sauerstoff maximal zu binden vermag, werden in dem gleichen
Volumen des Menschenbluts bis zu 9,0 µmol Sauerstoff gebunden.
Der Regenwurm besitzt in seinem Blut Riesenmoleküle (Erythrocruorin) als
Sauerstoffträger mit einem Molekulargewicht von etwa 3400000 g/mol mit rund
200 Bindungsstellen für Sauerstoff. Zudem ist das Molekül sehr kompakt und
seine Quartärstruktur hochgeordnet. Das Molekül ist so groß, daß man es mit Hilfe
des Elektronenmikroskops direkt sichtbar machen kann. Seine Konzentration in
der Hämolymphe beträgt mindestens 6 g/dL. Vermessen der Sauerstoffbindungs
kurve unter simulierten In-vivo-Bedingungen ergibt einen Halbsättigungsdruck
(P50) von 9,1 Torr (Barnikol W. K. R., Burkhard O. (1987): "Highly Polymerized
Human Haemoglobin as an Oxygen Carrying Blood Substitute", Advances in
Experimental Medicine and Biology Volume 215: 129-134; Barnikol W. K. R.
(1986): "The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human
Hemoglobin", Pflügers Archiv 406: R 61). Dieses System versorgt also die Zellen
des Regenwurms ausreichend mit Sauerstoff. Durch das extrem hohe
Molekulargewicht hat das Hämoglobin des Regenwurms praktisch keine kolloid
osmotische Wirkung mehr (nur etwa 0,4 mbar). Damit sind, wie im Blut des
Säugers - der onkotische Druck der Erythrozyten beträgt nur 10-7 Torr - die
beiden Funktionen Kolloidosmolarität und Sauerstoffbindung entkoppelt, und beide
können als Stellgrößen vom Organismus frei variiert werden.
Will man das Prinzip des Regenwurm-Systems auf künstliche Sauerstoffträger, die
auf menschlichem oder tierischem Hämoglobin beruhen, übertragen, so muß das
Hämoglobin-Molekül so verändert werden, daß es als extrazelluläres
Riesenmolekül mit vernachlässigbarem onkotischen Druck den normalen
Sauerstofftransport der Erythrozyten zumindest zeitweilig unterstützen kann.
Solche künstlichen Sauerstoffträger sind dann hochpolymerisiertes Hämoglobin,
welches allen oben erwähnten Problematiken Rechnung tragen muß.
Regenwurm-"Hämoglobin", welches zwar die Anforderungen an onkotischen
Druck erfüllt, wird sich zu diesem Zweck für den Menschen nicht verwenden
lassen, weil es eine vermutlich zu große Antigenität besitzt; zudem ist der
Halbsättigungsdruck mit 9 Torr zu niedrig (Barnikol W. K. R., Burkhard O. (1987):
"Highly Polymerized Human Haemoglobin as an Oxygen Carrying Blood
Substitute", Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 215: 129-
134; Barnikol W. K. R. (1986): "The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen
Cooperativity of Human Hemoglobin", Pflügers Archiv 406: R 61). Zudem ist es
vermutlich nicht in den erforderlichen Mengen gewinnbar.
Bisher wurde bei der Entwicklung künstlicher Sauerstoffträger deren
Halbsättigungdruck genau auf den für den Menschen normalen Wert von etwa 26
Torr einzustellen versucht. Tierversuche zeigen allerdings, daß ein molekular
disperser künstlicher Sauerstoffträger mit einem Halbsättigungsdruck von etwa 15
Torr Organe am besten oxygeniert (Conover et al. (1999), Art. Cells, Blood Subst.,
and Immobil. Biotech. 27 93-107). Andererseits zeigen aber Tierversuche auch,
daß für eine ausreichende Sauerstoffversorgung mindestens ebenso wichtig eine
genügend große Sauerstoffkapazität des Blutes ist (Moss G. S., et al. (1984):
"Hemoglobin Solution - From Tetramer to Polymer", - in: The Red Cell: Sixth Aven
Arbor Conference, Alan R. Riss, New York 1984: 191-210). Diese hängt
wiederum von der möglichen Konzentration des Sauerstoffträgers im Plasma ab.
Weiterhin zeigte sich hierbei, daß ein Halbsättigungsdruck von 26 Torr nicht
unbedingt eingehalten werden muß. Wesentlich ist vielmehr, daß ein bestimmter
kritischer Wert nicht unterschritten werdem darf.
Zu den Forderungen bei der Entwicklung eines künstlichen Sauerstoffsträgers
kommt hinzu, dass ein Herstellungsverfahren möglichst einfach und damit
wirtschaftlich sein soll, vor allem, da ab initio steril gearbeitet werden muss. Das
Produkt soll in möglichst großer Ausbeute erhalten werden können. Es sollte
zugleich Material zur Verwendung als Blut-Additiv sowie solches zur Verwendung
als Sauerstoff-transportierende Blutvolumen-Substitut während der Ver
netzungsreaktion entstehen.
Insbesondere ist ferner bei der Herstellung der künstlichen Polymeren aus
Hämoglobin durch Verknüpfung der Hämoglobin-Moleküle über ihre
Aminogruppen mittels geeigneter bifunktioneller Vernetzer darauf zu achten, dass
sich nicht molekulare Netzwerke bilden, die unlöslich sind und daher die Produkt
ausbeute verringern. Daher ist das Entstehen der sogenannten sogenannte
Perkolations-Verteilung des Molekulargewichts zu verhindern:
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, hypo-onkotische künstliche
Sauerstoffträger aus vernetztem Hämoglobin, die optimierte gute funktionelle
Eigenschaften, insbesondere der Charakteristik der Sauerstoffbindung, besitzen
und die geeignet sind als Pharmazeutikum im Menschen angewendet zu werden,
in einem technisch einfachen Prozess in großer Ausbeute herstellen zu können.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß, wie nachfolgend beschrieben, gelöst. Das
fundamentale Problem der Entstehung einer Perkolationsverteilung der
Multimerisationsgrade und Molekulargewichte durch die Vernetzung der polyfunk
tionellen Hämoglobine mit dem bifunktionellen Vernetzer Glutardialdehyd konnte
überraschenderweise dadurch beseitigt werden, indem während der Vernetzung
das Volumen des Reaktionsgemisches sehr stark (insgesamt 2- bis 10-fach)
vergrößert wird, und zwar, indem zunächst zugleich der Vernetzer in verdünnter
Lösung zugegeben und anschließend zusätzlich mit Wasser verdünnt wird.
Dadurch entstehen vernetzte Hämoglobine mit hohem Vernetzungsgrad in großer
Ausbeute, ohne dass eine Perkolationsverteilung der Molekulargewichte unter
Bildung unlöslicher molekularer Netzwerke entsteht. Das Rohprodukt der
Vernetzung zeichnet sich vielmehr durch eine bestimmte gewünschte (ungefähre)
Obergrenze des Molekulargewichtsbereichs aus. Man erhält im Gel-
Chromatogramm eine sogenannte Viereck-Verteilung des Molekulargewichtes
(vgl. Fig. 1, Fig. 2 und Fig. 3).
Die erfindungsgemäße Herstellung umfasst also folgende Schritte:
In einer Eintopf-Reaktion wird Hämoglobin
- a) zunächst desoxygeniert, insbesondere durch Überströmen mit Stickstoff;
- b) anschließend kovalent mit einem chemisch reaktiven Effektor der Sauer
stoffbindung umgesetzt;
- c) dann die Lösung mit einem chemisch nicht reaktiven Effektor versetzt
und sodann
- d) das Hämoglobin mit Glutardialdehyd, unter sehr starker Verdünnung (2- bis
5-fach) des Volumens des Reaktionsgemisches, bei gleichzeitiger Zugabe
des Vernetzters (in Lösung), stabil kovalent miteinander vernetzt und an
schließend das Reaktionsvolumen mit Wasser weiter erhöht (Gesamt
verdünnung der Lösung auf das 2-10, insbesondere 2-7, besonders 5-6-fache
an Volumen) und sodann
- e) ein Polyethylenoxid kovalent angeknüpft.
Das erhaltene Produkt kann in bekannter Weise aufgearbeitet werden.
Bevorzugt stammt das Ausgangshämoglobin vom Schwein oder vom Menschen,
ganz besonders bevorzugt vom Schwein, besonders vom Hausschwein.
Insbesondere wird erfindungsgemäß in Schritt iii) Glutardialdehyd in einer sehr
stark verdünnten Lösung zeitgesteuert zugegeben. Bevorzugt erfolgt anschließend
eine weitere Verdünnung und Erhöhung des Reaktionsvolumens mit Wasser, so
dass die obengenannte Gesamtverdünnung erzielt wird.
Dabei ist bevorzugt, dass in Schritt iv) Glutardialdehyd in einer molaren Menge
von 6-10, insbesondere 7-9 mol/mol, bezogen auf monomeres Hämoglobin,
gelöst in 1-4, bevorzugt 1-2, insbesondere 1,5-2, ganz besonders bevorzugt 1,7-
1,9 L Wasser, pro Liter ursprünglicher Reaktionslösung zugesetzt wird.
Dieser Zusatz erfolgt zeitgesteuert zwischen etwa 3 und 15, bevorzugt 3-10,
insbesondere 4-6 Minuten.
Anschließend reagiert die Lösung zwischen 1 und 6 Stunden.
Es ist ferner bevorzugt, dass der das Hämoglobin enthaltenden Lösung vor der
Umsetzung gemäss dem Schritt ii) 2-8, insbesondere 3-6, ganz besonders
bevorzugt 3-4 Mol Natriumascorbat pro Mol unvernetztes Hämoglobin,
zugegeben wird. Diese Umsetzung erfolgt über 0,5-6 Stunden, insbesondere 70-
120 Minuten.
Ferner wird bevorzugt in Schritt ii) als Effektor Pyridoxal-5'-phosphat in einem
molaren Verhältnis, bezogen auf monomeres Hämoglobin, von 0,5 bis 3,
bevorzugt 1 bis 2,5 mol/mol kovalent über einen Zeitraum von 0,5-20,
insbesondere 1-7 Stunden angebunden.
Erfindungsgemäß weiterhin vorteilhaft und bevorzugt ist es, dass in Schritt ii)
sowie in Schritt iv) nach der kovalenten Anbindung von Pyridoxal-5'-phosphat
sowie von Glutardialdehyd jeweils reduktives Natriumborhydrid hinzugesetzt wird.
Dies wird insbesondere in Schritt ii) in einer Menge von 1-9, bevorzugt 1-5,
insbesondere 1-2,5 mol/mol z. B. für 30 bis 90 min., und in Schritt iv) in einer
Menge von 5-20, insbesondere 6-12 mol/mol, jeweils bezogen auf monomeres
Hämoglobin, für 15 bis 100 min. zugesetzt.
Besonders bevorzugt wird in Schritt iii) als chemisch nicht reaktiver Effektor 2,3-
Bisphosphoglyzerat in einer Menge von 0,5-6, insbesondere 1-4 mol/mol, bezogen
auf monomeres Hämoglobin, zugesetzt und etwa 5-50 Minuten, insbesondere 10-
20 und ganz besonders 15 Minuten danach Glutardialdehyd zugesetzt.
Als Polyethylenoxid wird bevorzugt ein Polyethylenglykol-Ether z. B. mit einem C1-
C5-Alkylrest wie Methyl, Ethyl Butyl, mit einem Molekulargewicht von 500 bis 3000 g/Mol
angeknüpft, insbesondere ein Methoxy-Polyethylenglykol-Derivat mit einem
Molekulargewicht von 1500-2500 g/Mol, insbesondere 2000 g/mol, wie insbesondere
Methoxy-Polyethylenglykol-Succinimidylpropionat-, in Mengen von 2-12,
insbesondere 3-8 mol/mol Hämoglobin. Andere Derivatisierungsprodukte sind
Methoxy-Polyethylenglykol-Succinimidyl-Succinamid und Methoxy-Polyethylen
glykol-Succinimidyl-Oxyacetat.
Die Anknüpfung von Polyalkylenoxid an nicht vernetzte Hämoglobine ist beschrie
ben in US A-4 179 337, US 5 478 805, US 5 386 014, EP-A 0 206 448, EP-A 0 067 029,
DE-OS 30 26 398.
Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise über 1-4, insbesondere 2-3 Stunden.
Es ist ferner vorteilhaft, dass alle Herstellungsreaktionen in insbesondere durch
Tonometrie mit sauerstofffreien Gasen vom Sauerstoff befreiten Lösungen
erfolgen. Das verwendete Verfahren ist beschrieben in: Pötzschke H.: Hyperpoly
mere des menschlichen Hämoglobins: Entwicklung präparativer Verfahren zu ihrer
Synthese, Validierung analytischer Methoden und Geräte zu ihrer Charakteri
sierung, Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Wien, 1997.
Das erhaltene Produkt kann auf übliche Weise, wie nachfolgend geschildert,
aufgearbeitet werden. Es weist insbesondere eine Verteilung der
Molekulargewichte von 50 000 bis zu 5 000 000 auf, gegebenenfalls bis zu
10 000 000 g/Mol oder mehr.
Bevorzugt kann das erhaltene Produkt durch eine präparative stoff
trennende Methode, wie beispielsweise eine präparative Volumenausschluss-
Chromatographie, eine Ultrafiltration, eine fraktionierte Fällung, z. B. mit
Polyalkylenoxiden oder Salzen wie Ammoniumsulfat als Fällmittel, oder eine Feld-
Fluss-Fraktionier-Methode (vgl. Curling J. M. (Hrsg.) Methods of Plasma Protein
Fractionation, Academic Press, London u. a. 1980, sowie die Patentschriften EP-A 0 854 151
und EP-A 95 107 280) in eine Fraktion mit großer und eine Fraktion mit
niederer mittlerer molekularer Masse getrennt werden, wobei bevorzugt die
Trenngrenze bei 700 000 g/mol liegt.
Aus dem Produkt mit hochmolekularer Masse und aus dem Produkt mit nieder
molekularer Masse kann je eine pharmazeutische Zubereitung hergestellt werden,
wobei aus dem niedermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales Blut
substitut und aus dem höhermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales
Blutadditiv erhalten wird.
Die pH-Wert-Einstellung vor (und nach) den einzelnen Reaktionsschritent erfolgt
vorzugsweise mit Milchsäure oder Natronlauge auf Werte zwischen 6 und 10, je
nach Reaktionsschritt, z. B. 6,5-7,5 vor Schritt ii), anschließend auf 7,5-8,5 und
nachfolgend wieder auf 6,5-7,5 vor Schritt iii), danach auf 7,5 bis 9, sowie vor
Schritt v) auf 7,5-10.
Die Konzentration an Hämoglobin beträgt vorzugsweise 200-380 g/L,
insbesondere 240-360 g/L, die Lösung enthält weiterhin 10 bis 150 mmol/L
NaHCO3 sowie 10 bis 150 mmol/L NaCl.
Die Temperatur während der "Eintopf-Reaktion" beträgt 2-42°C, insbesondere 3-
25°C, bevorzugt 4-22°C.
Der erfindungsgemäß hergestellte künstliche Sauerstoffträger weist vorzugsweise
einen n50-Wert (Kooperativität) von 1,6 bis 2,5 und einen p50-Wert (Halbsätti
gungsdruck) von 16 bis 24 Torr auf.
Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt mit den genannten Charakteristiken kann
verwendet werden zur Herstellung eines Mittels zur intravasalen oder biomedizi
nischen Anwendung als künstlicher Sauerstoffträger, oder in Form einer pharma
zeutischen Zubereitung als ein Ersatz des Blutes (Blutsubstitut) oder als ein
Zusatz zum Blut zur Erhöhung der Sauerstofftransport-Kapazität (Blutadditiv) oder
zu einer Nährlösung, im menschlichen und tierischen Organismus, in einzelnen
Organen oder in biotechnischen Anwendungen, insbesondere zur Behandlung
eines chronischen Sauerstoffmangels beim Menschen.
Zur Herstellung der zu verabreichenden Produkte werden die erfindungsgemäßen
Hämoglobin-Derivate in geeigneten Medien, wie Infusionslösungen,
beispielsweise in wässriger Kochsalz- oder Glukoselösung, vorzugsweise in dem
Blutplasma isotonischen Konzentrationen, gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf einzelnen aufeinander
abgestimmten Reaktionsschritten, deren Bedeutung und Auswirkung nachfolgend
erläutert wird.
Als Ausgangsmaterial dient sehr reines Hämoglobin. Dieses kann nach bekannten
Verfahren aus frischem Blut von Schlachttieren oder beispielsweise aus
überalterten Blutkonserven gewonnen werden. Verfahren zur Gewinnung
gereinigten Hämoglobins sind beschrieben in: Antonini E. et al. (Hrsg.):
Hemoglobin (Colowick S. P., Kaplan N. O. (Hrsg.): Methods in Enzymology, Volume
76), Academic Press, New York u. a. 1981.
Wie erwähnt, ist erfindungsgemäß während der Vernetzung mit Glutardialdehyd,
welche an sich bekannt ist, vgl. DE 24 99 885, US 4 857 636, US-A 4 001 200,
US-A 4 001 401, DE 449 885, US 5 439 882, EP-A 0 201 618, das Hämoglobin
desoxygeniert (d. h. von seinem physiologischen Liganden Sauerstoff befreit),
denn nur aus während der Vernetzung desoxygeniertem Hämoglobin hergestellte
Polymere besitzen Sauerstoffbindungseigenschaften, die einen Einsatz als
künstlicher Sauerstoffträger in den gewünschten Indikationen ermöglichen.
Vorzugsweise kann zum weiteren Schutz vor Oxidation des Hämoglobins durch
Spuren von verbliebenem Sauerstoff dieser durch chemische Reaktion mit
Ascorbat-Ionen entfernt werden.
Als Effektor der Sauerstoffbindung wird insbesondere Pyridoxal-5'-phosphat, in
einer an den funktionellen Eigenschaften des Endproduktes optimierten Menge,
kovalent an das Schweine- oder Humanhämoglobin angebunden. Diese Anbin
dung von Pyridoxal-5'-phosphat an Hämoglobin ist prinzipiell bekannt, beispiels
weise beschreibt die Patentschrift EP-P 0 528 841 ein Verfahren zur Herstellung
pyridoxilierten Hämoglobins. Die Pyridoxilierung führt zu dem gewünschten
Halbsättigungsdruck-Werten, wenn so wie erfindungsgemäß beschrieben,
vorgegangen wird.
Die Verknüpfungsstellen (Aldimine = Schiffsche Basen) der nicht stabilen kova
lenten Anknüpfung von Pyridoxal-5'-phosphat können bekanntlich (s. o.) durch
Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert (es entstehen Amine) werden, wobei
erfindungsgemäß die genannten besonderen Bedingungen eingehalten werden.
Zum Schutz der Fähigkeit der Hämoglobinmoleküle zu einer homotropen Koope
rativität der Sauerstoffbindungsstellen mit einander, die durch die Vernetzung des
Hämoglobins mit dem Vernetzer Glutardialdehyd meist deutlich verloren geht, wird
erfindungsgemäß vor der Vernetzung 2,3-Bisphosphoglyzerat, ein (heterotroper)
chemisch nicht reaktiver Effektor der Sauerstoffbindung des Hämoglobins,
zugegeben. Dieser kann somit während der Vernetzung reversibel an seine
Bindungsstelle im Hämoglobinmolekül angelagert sein. Nach der Synthese wird
2,3-Bisphosphoglyzerat zusammen mit unverbrauchten Reaktanden sowie
überflüssigen Reaktionsprodukten vollständig entfernt (siehe weiter unten).
Als bifunktioneller Vernetzer wird Glutardialdehyd unter den erfindungsgemäßen
oben angegebenen Bedingungen eingesetzt.
Die Verknüpfungsstellen (Aldimine = Schiffsche Basen) der vernetzenden moleku
laren Glutardialdehyd-Brücken werden wie beschrieben durch Reduktion mit
Natriumborhydrid stabilisiert (es entstehen Amine), wobei die erfindungsgemäßen
Bedingungen einzuhalten sind.
Durch die Vernetzung entstehen vernetzte Hämoglobine mit einer Verteilung der
Molekulargewichte zwischen etwa 50 000 und 5 000 000 g/mol (und größer, z. B.
10-15 000 000 g/mol).
Zur Verbesserung der Verträglichkeit mit Plasmaproteinen wird an das vernetzte
Hämoglobin ein Polyethylenoxid (MW)-Derivat, insbesondere das oben erwähnte
monofunktionell aktivierte (Methoxy-)Polyethylenglykol mit einem Molekular
gewicht von 1500-2500 g/mol angeknüpft. Die Anknüpfung von Polyethylenglykol
(PEG), die sogenannte Pegylierung an als auch die Vernetzung von
Hämoglolbinen ist an sich bekannt (vgl. auch E. Tsucheda (Hfsg): Blood
Substituts: Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Amsterdam 1998).
Neu sind jedoch sowohl Pegylierung als auch Vernetzung von Hämoglobinen
zusammen, sowie die Anwendung des chemisch nicht wirksamen Effektors vor
der Vernetzung, was insbesondere zum Erhalt der Kooperativität beiträgt, als auch
insbesondere die geschilderten Vernetzungsbedingungen. Durch die hier
vorgenommene Pegylierung wird nunmehr die ohnehin schwache Reaktion des
RES und auch der enzymatische Abbau durch Proteasen verhindert.
Die pH-Wert-Einstellung erfolgt wie oben geschildert.
Durch die erhaltene Reaktionsabfolge und Bedingungen hierfür kann so zum
einen die Entstehung einer Perkolationsverteilung verhindert werden (durch die
erfindungsgemäße Verdünnung), andererseits können auch die durch Vernetzung
und kovalente Anbindungen an Hämoglobin z. B. von Glutardialdehyd,
Pyridoxalphosphat und Polyethylenoxid bedingten unerwünschten Änderungen
der Sauerstoffaffinität und Kooperativität vermieden werden und insbesondere
auch eine hohe Plasmaverträglichkeit erzielt werden.
Alle Reaktionsschritte tragen zusammen zu diesen besonderen Eigenschaften des
erfindungsgemäß hergestellten Produktes bei.
Die weitere Aufarbeitung liegt im Rahmen der Kenntnis des Fachmannes:
Unlösliche Bestandteile können durch Zentrifugation (beispielsweise für 20
Minuten mit einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 20000 g) abgetrennt
werden.
Die vernetzten Hämoglobine werden durch einen (bekannten) präparativen
Verfahrensschritt, beispielsweise durch eine Volumenausschluss-Chromato
graphie oder eine Ultrafiltration, eine fraktionierte Fällung oder eine Feld-Fluss-
Fraktionierung, in einen nieder- und einen höher molekularen Anteil aufgetrennt.
Bei Wahl geeigneter Methoden (besonders wichtig sind beispielsweise die
Nominelle Molekulargewichts-Trenngrenze der Ultrafiltrationsmembrane oder der
Molekulargewichts-Trennbereich des verwendeten Gels) werden dabei zugleich
alle unverbrauchten Reaktanden sowie unerwünschte Reaktionsprodukte entfernt.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist anhand des
nachfolgenden Herstellungsbeispiels näher erläutert:
Gereinigtes Schweine- oder Humanhämoglobin mit einer Konzentration zwischen
200 und 380 g/L, bevorzugt zwischen 240 und 360 g/L, ist in einem wässrigen
Elektrolyten gelöst. Dieser enthält Natriumhydrogenkarbonat mit einer
Konzentration zwischen 10 und 150 mmol/L, bevorzugt zwischen 40 und 60 mmol/L,
sowie Natriumchlorid mit einer Konzentration zwischen 10 und 150 mmol/L,
bevorzugt zwischen 50 und 100 mmol/L.
Die Temperatur beträgt von 2 bis 42°C, bevorzugt zwischen 3 und 25°C.
Diese Hämoglobinlösung wird gerührt, durch Überströmen reinen Stickstoffs
erfolgt eine Desoxygenierung des Hämoglobins.
Zu dieser Lösung werden 2 bis 8, bevorzugt 3 bis 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1-
molare Lösung in Wasser) pro Mol Hämoglobin zugegeben und zwischen 0,5 und
6 h, bevorzugt zwischen 70 und 120 Minuten, reagieren lassen.
Der pH-Wert der Lösung wird nun mit Milchsäure oder Natronlauge (einer
Konzentration zwischen 0,1 und 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf
einen Wert zwischen 6,5 und 7,5, bevorzugt zwischen 6,9 und 7,3 titriert.
Nun werden 0,5 bis 3,0, bevorzugt 1,0 bis 2,5 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol
Hämoglobin zugegeben und zwischen 0,5 und 20, bevorzugt zwischen 1 und 7 h,
reagieren lassen.
Der pH-Wert wird mit Natronlauge oder Milchsäure (einer Konzentration zwischen
0,1 und 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 7,5
und 8,5, bevorzugt zwischen 7, 7 und 8,2, eingestellt.
Jetzt werden 1,0 bis 9,0, bevorzugt etwa 1,0 bis 2,5 Mol Natriumborhydrid (als 1-
molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) zugegeben und zwischen 30 und 90,
bevorzugt zwischen 50 und 70 Minuten, reagieren lassen.
Der pH-Wert der Lösung wird mit Milchsäure oder Natronlauge (einer
Konzentration zwischen 0,1 und 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf
einen Wert zwischen 6,5 und 7,5, bevorzugt zwischen 6,9 und 7,5 titriert.
Nun werden 0,5 bis 6,0, bevorzugt 1,0 bis 4,0 Mol 2,3-Bisphosphoglyzerat je Mol
Hämoglobin zugegeben und zwischen 5 und 50, vorzugsweise zwischen 10 und
20 Minuten, reagieren lassen.
Anschließend erfolgt die kontrollierte zeitgesteuerte Zugabe des bifunktionellen
Vernetzers, es werden zwischen 6 und 10, bevorzugt zwischen 7 und 9 Mol
Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1-4, bevorzugt in 1,5 bis 2 L Wasser
je Liter Hämoglobinlösung, innerhalb 3 bis 10, bevorzugt innerhalb 4 bis 6 Minuten
zugegeben und zwischen 1 und 6, bevorzugt zwischen 2 und 3 h, reagieren
lassen.
Der pH-Wert wird mit Natronlauge oder Milchsäure (einer Konzentration zwischen
0,1 und 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 7,5
und 9,0, bevorzugt zwischen 7,6 und 8,8, eingestellt.
Es werden 5 bis 20, bevorzugt 6 bis 12 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare
Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin zugegeben und zwischen
15 und 100, bevorzugt zwischen 30 und 80 Minuten, reagieren lassen.
Dann erfolgt eine Zugabe von 0 bis 4, bevorzugt zwischen 0,5 und 3 L Wasser je
Liter der ursprünglichen Hämoglobinlösung.
Der pH-Wert wird, falls erforderlich, mit Natronlauge oder Milchsäure (einer Kon
zentration zwischen 0,1 und 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen
Wert zwischen 7,5 und 10, bevorzugt zwischen 8 und 9, eingestellt.
Nun werden je Mol monomeren Hämoglobins zwischen 2 und 12, bevorzugt
zwischen 3 und 8 mol eines aktivierten Polyethylenoxid-Derivat, bevorzugt
Methoxy-Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol, mit einem Molekulargewicht
zwischen 500 und 3000, bevorzugt 1000 und 2500 g/Mol, insbesondere 2000 g/Mol
zugegeben.
Anschließend wird, bei weiterem Rühren der Hämoglobinlösung, die Stickstoff
atmosphäre für 1 bis 3 Stunden durch reinen Sauerstoff ersetzt und das
Hämoglobin so zügig oxygeniert.
Die Aufarbeitung erfolgt wie oben geschildert.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich somit wie folgt
zusammenfassen:
Durch die erfindungsgemäße Reaktionsabfolge, insbesondere die Reaktionsvolu
menerhöhung in Schritt iv) des Verfahrens, wird ein Produkt erhalten, welches
vollständig zur Herstellung künstlicher Sauerstoffträger verwendet werden kann,
und zwar je etwa hälftig als Blut-Additiv (die Fraktion mit den vernetzten
Hämoglobine höherer Polymerisationsgrade: Fraktion I) und als Blutvolumen-
Substitut (Fraktion II, mit den niedermolekularen Anteilen). Die Trennung kann in
einfacher Weise mit bekanntem Verfahren erfolgen, einige mögliche Methoden
sind beispielsweise in den Patentschriften EP-A 95 107 280 und EP-A 97 100 790
angeführt. Die Polymeren der Fraktion I, vorzugsweise bis zu einem
Molekulargewicht von größer 700 000 g/Mol sind so hinreichend molekular
einheitlich, dass sie in der wünschenswerten therapeutischen Plasma
konzentration einen ausreichend geringen kolloidosmotischen Druck besitzen.
Durch diese Molekulareinheitlichkeit wird zugleich ein kleiner Virialkoeffizient, wie
auch eine geringe Viskosität erreicht. Die Verträglichkeit mit den Proteinen des
Blutplasmas, ausreichend große Immunverträglichkeit und intravasale
Verweildauer, wie auch eine ausreichend geringe vasokonstriktorische
Nebenwirkungen, d. h. eine geringe Extravasation, der Polymeren der
Molekülfraktion I wird durch eine kovalente Anknüpfung von Polyalkylenoxiden
erzielt. Darüberhinaus wird der Forderung nach Einfachheit und Wirtschaftlichkeit
bei diesem neuen Verfahren in entscheidender Weise insofern Rechnung
getragen, als die gesamte Herstellung in einem einzigem Gefäß stattfindet
(sogenannte Eintopf-Herstellung) und hohe Ausbeuten von über 70% erzielt
werden, wobei die Ausbeute an Polymeren mit einem Molekulargewicht von über
700 000 g/mol mehr als 15% beträgt.
Das Herstellungsverfahren ermöglicht die Präparation modifizierter und vernetzter
Hämoglobine in wenigen Verfahrensschritten. Die gewählten Verfahrensparameter
führen dabei zu einer definierten Verteilung modifizierter Hämoglobin-Polymeren,
die als künstliche Sauerstoffträger geeignet auch den physiologischen
Gegebenheiten im Blutserum Rechnung trägt.
Weiterhin ist die Kooperativität des unvernetzten Hämoglobins im vernetzten
Produkt weitgehend erhalten und der Halbsättigungsdruck geeignet justierbar.
Die erfindungsgemäß hergestellten künstlichen Sauerstoffträger aus vernetztem
Hämoglobin sind bei parenteraler Applikation plasmaverträglich, und können
klinisch wie geschildert angewendet werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Dabei zeigen die Fig. 1-3 folgendes:
Fig. 1: Eine massen-gewichtete Verteilung der Molekülgrößen und Molekular
gewichte (M) des Schweinehämoglobin-Polymeren aus Beispiel 1, dargestellt als
Volumenausschluss-Chromatogramm (erhalten mit Sephacryl S-400 HR-Gel,
Pharmacia, Freiburg, D). E425 nm ist die Extinktion im Chromatographie-Eluat bei
425 nm. Eingezeichnet sind die Abszisssenwerte 700 000 und 5 000 000 g/Mol.
Fig. 2: Chromatogramm für Anwendungsbeispiel 2, Erläuterungen vgl. Fig. 1
Fig. 3: Chromatogramm für Anwendungbeisiel 3, Erläuterungen vgl. Fig. 1
Ferner wurden folgende Bestimmungsmethoden angewendet:
- 1. Hämoglobingehalte wurden fotometrisch mit der modifizierten
Cyanhämiglobin-Methode nach Drabkin ("Hämoglobin-Farbtest MRP 3", Boeh
rimger Mannheim, D),
- 2. pH-Werte wurden potentiometrisch (pH-Glaselektrode) mit einem Blutgas
analysator ("ABL 5", Radiometer, Willich, D) gemessen.
- 3. Bestimmungen der Molekulargewichtsverteilung der vernetzten Hämoglobine
erfolgten durch Volumenausschluss-Chromatografie (gemäß: Pötzschke H. et al.
(1996): "Vernetzte globuläre Proteine - eine neue Klasse halbsynthetischer
polymerer Moleküle: Charakterisierung ihrer Struktur in Lösung am Beispiel
hyperpolymeren Hämoglobins und Myoglobins mittels Volumenausschluss-
Chromatographie, Viskosimetrie, Osmometrie und Lichtstreuung", Macromolecular
Chemistry and Physics 197, 1419-1437, sowie Pötzschke H. et al. (1996): "Ein
neuartiges Verfahren zur Bestimmung Molarer Massen breit verteilter Polymerer
mit Hilfe der Gel-Chromatographie und der Viskosimetrie am Beispiel Hämoglobin-
Hyperpolymerer", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 3229-3250) am
Gel "Sephacryl S-400 HR" (Pharmacia Biotech, Freiburg, D).
- 4. Bestimmungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung durch Hämoglobine
erfolgte mittels einer eigenen Methode und Apparatur (wie beschrieben in:
Barnikol W. K. R. et al. (1978): "Eine verbesserte Modifikation der Mikromethode
nach Niesel und Thews zur Messung von O2-Hb-Bindungskurven in Vollblut und
konzentrierten Hb-Lösungen", Respiration 36, 86-95).
- 5. Die Untersuchung der Plasmaverträglichkeit vernetzter Hämoglobine erfolgte
mittels eines standardisierten in vitro - Fällungstests (Domack U. (1997), "Entwick
lung und in vivo - Evaluation eines künstlichen Sauerstoffträgers auf Basis von
Rinderhämoglobin", Dissertation, Fachbereich Chemie, Johannes Gutenberg-
Universität, Mainz 1997): Hämoglobinlösungen (Hämoglobingehalte etwa 30 g/L,
in einem wässrigen Elektrolyten (StLg) der Zusammensetzung 125 mM NaCl,
4,5 mM KCl und 3 mM NaN3) wurden mit gleichen Mengen frisch gewonnenen,
steril filtrierten menschlichen Plasmas gemischt und anschließend zu jeweils
500 µL der Mischung bis zu 20 µL 0,5-molare Milchsäure zugesetzt und
eingemischt, so dass sich für jedes zu untersuchende Hämoglobin-Derivat jeweils
pH-Werte aus einem Bereich zwischen etwa 7,4 bis 6,8 ergaben. Nach einer Inku
bation von 30 Minuten bei Raumtemperatur und Zentrifugation der Proben erfolgte
die Bestimmung des Hämoglobingehaltes als Maß für das nicht ausgefällte Hämo
globin sowie des zugehörigen pH-Wertes im Überstand, sowie die subjektiv-
optische Kontrolle auf ungefärbte Ausfällungen von Plasmaproteinen.
Ausführungsbeispiel 1
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular
modifizierten Schweinehämoglobins bei 4°C gemäss dem allgemeinen
Herstellungsverfahren
Hochreines Schweinehämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in
einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCO3 und 100 mM
NaCl, wurde bei 4°C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem,
reinen Stickstoff über der Lösung desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol
Natrium-Ascorbat (als 1-molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren)
Hämoglobins zugegeben und 6 h reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5-
molarer Milchsäure auf einen pH-Wert von 7,1 titriert, 1,1 Mol Pyridoxal-5'-
Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und für 16 h reagieren lassen. Nun
wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert von 7, 8 eingestellt, 1,1 Mol
Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) zugegeben
und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit 0,5-molarer Milchsäure ein
pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1,1 Mol 2,3-Bisphosphoglyzerat pro Mol
Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 8 Mol Glutardialdehyd je Mol
Hämoglobin, gelöst in 1,8 L reinem Wasser je Liter Hämoglobinlösung zur
Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten zugegeben und 2,5 h reagieren
lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7, 8
folgte eine Zugabe von 15 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01-
molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 1 h. Es erfolgte eine Zugabe von 2
Liter Wasser je Liter ursprünglicher Hämoglobinlösung. Der pH-Wert betrug dann
9,3, und es folgte direkt eine Zugabe von 4 Mol Methoxy-Succinimidylpropionat-
Polyethylenglykol des Molekulargewichts 2000 g/Mol für 2 h. Die Stickstoff
atmosphäre über der Lösung wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt.
Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (20000 g für 15 min)
abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine
Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25-Gel, Pharmacia, D) zu
einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCl, 4,5 mM
KCl und 20 mM NaHCO3.
Die Ausbeute betrug 77%; die Ausbeute für Molekulargewicht größer 700 000 g/Mol
ist 28%.
Fig. 1 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen
Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes.
Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen
Bedingungen (eine Temperatur von 37°C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40
Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert von 22
Torr und einen n50-Wert von 1,95.
Im "Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im pH-Bereich von
7,4 bis 6,8 keinerlei Wechselwirkungen mit menschlichem Plasma, insbesondere
keine nachweisbaren Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von
Plasmaproteinen.
Ausführungsbeispiel 2
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular
modifizierten Schweinehämoglobins bei Raumtemperatur gemäss dem
allgemeinen Herstellungsverfahren
Hochreines Schweinehämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in
einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCO3 und 100 mM
NaCl, wurde bei 22°C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem,
reinen Stickstoff desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Natrium-Ascorbat (als
1-molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und
90 min reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5-molarer Milchsäure auf einen
pH-Wert von 7,1 titriert, 1,1 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol Hämoglobin
zugegeben und für 2 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge
ein pH-Wert von 7,8 eingestellt, 1,5 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in
0,01-molarer Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt
wurde mit 0,5-molarer Milchsäure ein pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1,5 mol 2,3-
Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 9 Mol
Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1,8 L reinem Wasser je Liter
Hämoglobinlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten
zugegeben und 1 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge
auf einen pH-Wert von 7,8 folgte eine Zugabe von 10 Mol Natriumborhydrid (als 1-
molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 0,5 h. Der pH-
Wert betrug 8,7 und es folgte direkt eine Zugabe von 8 Mol Methoxy-
Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol des Molekulargewichts 1000 g/Mol für 1 h.
Die Stickstoffatmosphäre wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt.
Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (10 min mit 20000 g)
abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine
Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25-Gel, Pharmacia, D) zu
einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCl, 4,5 mM
KCl und 20 mM NaHCO3.
Die Ausbeute betrug 79%; die Ausbeute für Molekulargewichte größer als
700 000 g/Mol betrug 28%.
Fig. 2 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen
Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes.
Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen
Bedingungen (eine Temperatur von 37°C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40
Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert von 22
Torr und einen n50-Wert von 1,6.
Im "Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im physiologisch und
pathophysiologisch interessanten pH-Bereich von 7,4 bis 6,8 keinerlei Wechsel
wirkungen mit menschlichem Plasma, insbesondere keine nachweisbaren
Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von Plasmaproteinen.
Anwendungsbeispiel 3
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular
modifizierten menschlichen Hämoglobins (bei 4°C) gemäss dem allgemeinen
Herstellungsverfahren
Hochreines Humanhämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in einem
wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCO3 und 100 mM NaCl,
wurde bei 4°C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem, reinen
Stickstoff desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1-
molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und 3 h
reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5-molarer Milchsäure auf einen pH-Wert
von 7,1 titriert, 1,1 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und
für 16 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert
von 7, 8 eingestellt, 1,5 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01-molarer
Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit
0,5-molarer Milchsäure ein pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1,5 mol 2,3-
Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 9 mol
Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1,8 L reinem Wasser je Liter
Hämoglobinlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten gleich
mäßig zugegeben und 2,5 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer
Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 folgte eine Zugabe von 10 Mol Natrium
borhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin
für 1 h. Dann erfolgt eine Zugabe von Wasser, 2 L pro Liter ursprüngliche
Hämoglobinlösung. Der pH-Wert betrug dann 8,6 und es folgte direkt eine Zugabe
von 4 Mol Methoxy-Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol des Molekularge
wichts 2000 g/mol für 2 h. Die Stickstoffatmosphäre wurde durch reinen Sauerstoff
ersetzt. Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (10 min mit
20000 g) abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch
eine Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25-Gel, Pharmacia, D)
zu einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCl, 4,5 mM
KCl und 20 mM NaHCO3.
Fig. 3 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen
Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes.
Die Gesamtausbeute betrug 75%; die Ausbeute an Polymerem mit einem
Molekulargewicht größer als 700 000 g/Mol betrug 17%.
Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen
Bedingungen (eine Temperatur von 37°C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40
Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert (als Maß
einer mittleren Sauerstoffaffinität) von 21 Torr und einen n50-Wert (eine mittlere
scheinbare Kooperativität der Sauerstoffbindungsstellen) von 1,74.
Im "Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im physiologisch und
pathophysiologisch interessanten pH-Bereich von 7,4 bis 6,8 keinerlei Wechsel
wirkungen mit den Proteinen menschlichen Plasmas, insbesondere keine
nachweisbaren Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von Plasmaproteinen.