DE10049527A1

DE10049527A1 - A new electrochemical nucleic acid probe comprises an oligonucleotide bound to a thermostable photosynthetic reaction center is useful to detect hybridized nucleic acids

Info

Publication number: DE10049527A1
Application number: DE10049527A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich; Michael Bandilla
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: MIKROGEN MOLEKULARBIOLOGISCHE ENTWICKLUNGS GMB, DE
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2001-09-06
Also published as: WO2002029092A3; WO2002029092A2

Abstract

An oligonucleotide modified by binding to a thermostable photo-inducible redox-active unit, where the unit is thermostable up to 40 deg C, is new.

Description

Technical field

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische Bindung einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit modifiziert ist.The present invention relates to a nucleic acid oligomer by chemical Binding of a thermostable, photoinducible redox-active unit is modified.

State of the art

In der WO 00/42217 wird ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäureoligomerhybridisierungsereignissen beschrieben, bei dem der Unterschied der Leitfähigkeit von Einzelstrang-Nukleinsäure-Oligomer und Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer das entscheidende Kriterium für die Detektion eines Hybridisierungsereignisses darstellt. Bei geeigneter Anordnung des Nukleinsäure- Oligomers als Teil einer elektrochemischen Zelle kann der Leitfähigkeitsunterschied als "molekularer Schalter" innerhalb eines ansonsten geschlossenen Stromkreises verwendet werden. Im nicht-hybridisierten Zustand (als Einzelstrang) fungiert das Nukleinsäure-Oligomer als offener Schalter, bei Hybridisierung mit dem komplementären Gegenstrang ist der Schalter geschlossen.WO 00/42217 describes a method for the electrochemical detection of described sequence-specific nucleic acid oligomer hybridization events, at which is the difference in conductivity of single-stranded nucleic acid oligomer and Double-stranded nucleic acid oligomer is the decisive criterion for detection of a hybridization event. With a suitable arrangement of the nucleic acid Oligomers as part of an electrochemical cell can account for the difference in conductivity "Molecular switch" within an otherwise closed circuit be used. This functions in the non-hybridized state (as a single strand) Nucleic acid oligomer as an open switch when hybridizing with complementary counter strand, the switch is closed.

Eine molekulare Anordnung zur Detektion von Hybridisierungsereignissen gemäß der WO 00/42217 ist in Fig. 1 dargestellt. Die Sonden-Oligonukleotide der einzelnen Test- Sites (dots mit Sonden-Oligonukleotiden identischer Sequenz) sind auf einer Elektrode immobilisiert, am freien Ende der Sonden-Oligonukleotide wird eine "Redox-Einheit" als Elektromarkierung kovalent an die Sonden-Oligonukleotide gebunden.A molecular arrangement for the detection of hybridization events according to WO 00/42217 is shown in FIG. 1. The probe oligonucleotides of the individual test sites (dots with probe oligonucleotides of identical sequence) are immobilized on an electrode, at the free end of the probe oligonucleotides a "redox unit" is covalently bound to the probe oligonucleotides as an electrical label.

Die Redox-Einheit (Elektromarkierung), z. B. ein Komplex aus Elektron-Donor "D" und Elektron-Akzeptor "A" wird extern durch Licht zur Ladungstrennung angeregt. Dabei wird ein Elektron vom Donor auf den Akzeptor übertragen und es entsteht ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- ("+ -" in Fig. 1). Die Leitfähigkeit des hybridisierten Sonden-Oligonukleotids ist hoch, d. h. ein Elektron kann, bei geeignetem Elektrodenpotential, von A^- auf die Elektrode übertragen und detektiert werden. Bei Gegenwart eines löslichen Reduktionsmittels X^-, das D⁺ zu D reduziert, wird die Redox- Einheit in den Zustand vor Lichtabsorption versetzt. Weitere Lichtabsorption startet den Zyklus erneut und erzeugt einen deutlichen Strom (Fall A). Die Leitfähigkeit des Sonden-Oligonukleotids ohne komplementäres Target ist dagegen gering, das Elektron kann nicht von A^- auf die Elektrode übertragen werden, der Zyklus ist unterbrochen, es fließt kein Strom (Fall B).The redox unit (electrical marking), e.g. B. a complex of electron donor "D" and electron acceptor "A" is externally excited by light to separate the charge. An electron is transferred from the donor to the acceptor and a charge-separated state D ⁺ A ^- ("+ -" in FIG. 1) is created. The conductivity of the hybridized probe oligonucleotide is high, that an electron can, with suitable electrode potential of A ^- are transferred to the electrode and detected. In the presence of a soluble reducing agent X ^- , which reduces D ⁺ to D, the redox unit is brought into the state before light absorption. Further light absorption starts the cycle again and generates a significant current (case A). In contrast, the conductivity of the probe oligonucleotide without a complementary target is low, the electron cannot be transferred from A ^- to the electrode, the cycle is interrupted, no current flows (case B).

Es liegen also sozusagen zwei Schalter im Stromkreis vor. Den ersten Schalter stellt die Elektromarkierung dar, der durch Lichteinstrahlung geschlossen werden kann. Der zweite Schalter ist durch das Sonden-Oligonukleotid verwirklicht und wird durch Hybridisierung mit dem passenden Target geschlossen. Nur wenn beide Schalter geschlossen sind, fließt Strom. Diese Kombination ermöglicht es, die einzelnen Test- Sites optisch zu adressieren und elektrisch auszulesen. Nur die Test-Sites, bei denen z. B. über eine Laser-Anregung der erste Schalter geschlossen ist, werden angesprochen (adressiert) und Hybridisierungsereignisse (geschlossener zweiter Schalter) im beleuchteten Segment registriert. Folglich sind keine einzeln adressierbaren Mikroelektroden für die jeweiligen Test-Sites notwendig, sondern es können alle Test-Sites auf einer durchgängigen, elektrisch leitenden Oberfläche aufgebracht werden.So there are, so to speak, two switches in the circuit. The first switch represents the electrical marking, which can be closed by exposure to light. The second switch is realized by the probe oligonucleotide and is by Hybridization closed with the right target. Only if both switches are closed, electricity flows. This combination enables the individual test Addressing sites optically and reading them out electrically. Only the test sites where e.g. B. the first switch is closed via a laser excitation addressed (addressed) and hybridization events (closed second Switch) registered in the illuminated segment. As a result, none are individual addressable microelectrodes necessary for the respective test sites, but it can all test sites on a continuous, electrically conductive surface be applied.

Gemäß der WO 00/42217 wird z. B. Thiol-modifizierte ss-DNA über self-assambled monolayer (SAM) auf Goldoberflächen kovalent immobilisiert (Ausbildung von Au-S- Oligo auf 100 nm Gold (111) auf Muskovit). Die ss-DNA trägt am freien Ende eine Amino-Gruppe über die eine "regenerierbare, lichtadressierbare Elektronenpumpe" gebunden wird. Als "regenerierbare, lichtadressierbare Elektronenpumpe" kann ein photosynthetisches Reaktionszentrum (RC), z. B. dasjenige der Purpurbakterien von Rb. sphaeroides, verwendet werden. Solche RCs bestehen im Wesentlichen aus Proteinmatrix, eingebettetem Elektrondonor P und eingebettetem Elektronakzeptor Q. Durch Lichtinduktion kommt es zur Ladungstrennung P⁺Q^-, wobei P⁺ z. B. durch lösliches externes Cytochrom rereduziert werden kann (somit entspricht RC der Redoxeinheit und Cytochrom dem X^- in Fig. 1). Durch die Absorption von Licht zur photoinduzierten Ladungstrennung wird dem System PQ zusätzliche Energie bereit gestellt, die dazu ausreicht, dass Q^- leichter reduziert wird als Cytochrom, womit eine interferierende Reaktion des Cytochroms an der Elektrode ausgeschlossen ist. Das Reaktionszentrum kann in einer einfachen Manipulation in die beiden Bestandteile Q und Q-freie RCs zerlegt werden. Damit ist die Anbindung der RC-Einheit an die immobilisierte ss-DNA in zwei einfachen Schritten durchzuführen: Anbindung des Chinons und Rekonstitution des Q-freien RC-Komplexes an das angebundene Chinon. Die RCs bieten einige inherente Vorteile: Zum einen liegt die Quantenausbeute der photoinduzierten Ladungstrennung (Effizienz des Schalters eins) bei mehr als 99% (Wraight et al., Biochimica Biophysica Acta (1974), 333, 246-260), zum anderen sind die an der photoinduzierten Ladungstrennung beteiligten Kofaktoren in eine Proteinmatrix eingebettet, die elektrisch isolierend wirkt, womit auch bei direktem Kontakt des RCs mit der Elektrode ein "Kurzschluss" (Elektrontransfer von Q^- direkt auf die Elektrode ohne den "Umweg" über die DNA) verhindert wird. Daneben sind die "Schaltzeiten" enorm kurz (photoinduzierte Ladungstrennung zu P⁺Q^- innerhalb von 100 ps, die Rereduktion des P+ durch Cytochrom in ca. 1 µs) und das System ist "natürlicherweise" dazu geeignet, nahezu beliebig viele photoinduzierte Elektrontransfer-Zyklen zu durchlaufen.According to WO 00/42217 z. B. Thiol-modified ss-DNA covalently immobilized on self-assambled monolayer (SAM) on gold surfaces (formation of Au-S-oligo on 100 nm gold (111) on muscovite). The ss-DNA carries an amino group at the free end via which a "regenerable, light-addressable electron pump" is bound. As a "regenerable, light-addressable electron pump", a photosynthetic reaction center (RC), for. B. that of the purple bacteria of Rb. sphaeroides. Such RCs essentially consist of a protein matrix, an embedded electron donor P and an embedded electron acceptor Q. Charge induction leads to charge separation P ⁺ Q ^- , where P ⁺ z. B. can be reduced by soluble external cytochrome (thus RC corresponds to the redox unit and cytochrome to X ^- in Fig. 1). By absorbing light for photo-induced charge separation, the PQ system is provided with additional energy which is sufficient for Q ^{- to} be reduced more easily than cytochrome, which prevents an interfering reaction of the cytochrome at the electrode. The reaction center can be broken down into the two components Q and Q-free RCs in a simple manipulation. The connection of the RC unit to the immobilized ss-DNA can thus be carried out in two simple steps: connection of the quinone and reconstitution of the Q-free RC complex to the attached quinone. The RCs offer some inherent advantages: on the one hand, the quantum yield of photo-induced charge separation (efficiency of switch one) is more than 99% (Wraight et al., Biochimica Biophysica Acta (1974), 333, 246-260), on the other hand they are cofactors involved in the photo-induced charge separation are embedded in a protein matrix, which has an electrically insulating effect, thus preventing a "short circuit" (electron transfer from Q ^- directly to the electrode without the "detour" via the DNA) even when the RC is in direct contact with the electrode . In addition, the "switching times" are extremely short (photo-induced charge separation to P ⁺ Q ^- within 100 ps, the reduction of P + by cytochrome in approx. 1 µs) and the system is "naturally" suitable for almost any number of photo-induced electron transfer cycles to go through.

Diese amperometrische Detektion gemäß WO 00/42217 bietet mehrere Vorteile: Sie ist apparativ wenig aufwendig und damit weniger kostenintensiv als z. B. ein Fluoreszenz basiertes Ausleseprinzip. Unspezifische Adsorption von Target-Oligonukleotiden, die bei der Fluoreszenz-basierten Detektion große Probleme verursachen, spielen nahezu keine Rolle und eventuell auftretender unspezifischer Untergrund-Strom kann durch Messung des Differenzsignals aus Strom bei Beleuchtung und Strom ohne Beleuchtung eliminiert werden, wodurch der Einfluss anderer Zellbestandteile un terdrückt werden kann und eine vorherige Isolierung der DNA bzw. RNA entfällt.This amperometric detection according to WO 00/42217 offers several advantages: It is little equipment and thus less expensive than z. B. fluorescence based selection principle. Nonspecific adsorption of target oligonucleotides that cause great problems in fluorescence-based detection, almost play no role and possibly occurring unspecific underground current can Measurement of the difference signal from current with lighting and current without Illumination can be eliminated, reducing the influence of other cell components can be suppressed and there is no need for prior isolation of the DNA or RNA.

Bekannt ist auch, dass die Hybridisierungsbedingungen über die Kombination aus üblicher Temperaturmodulation und Elektrostringenz optimiert werden können. Ein schnellerer und spezifischerer Hybridisierungsvorgang wird erreicht, wenn neben der Temperatur auch das Elektrodenpotential moduliert wird, um das poly-anionische Komplement des Sonden-Oligonukleotids, das aufgrund von Basenfehlpaarungen weniger stark gebunden ist, zu dehybridisieren. Basenfehlpaarungen können in situ erkannt werden, da das Elektrodenpotential, das zum Elektrontransfer über ds-DNA mit einer Basenfehlpaarung notwendig ist gegenüber der Situation einer perfekt hybridisierten ds-DNA deutlich erhöht ist (Hartwich et al., Journal of the American Chemical Society (1999), 121, 10803-10812), die Fluoreszenz-basierte Detektion dagegen ist bezüglich Basenfehlpaarungen völlig unsensitiv.It is also known that the hybridization conditions are based on the combination of usual temperature modulation and electrical stringency can be optimized. On faster and more specific hybridization process is achieved if in addition to the Temperature also modulates the electrode potential to the poly-anionic Complement of the probe oligonucleotide due to base mismatches less bound to dehybridize. Base mismatches can occur in situ can be recognized because the electrode potential, which leads to electron transfer via ds-DNA a base mismatch is perfect compared to the situation one hybridized ds-DNA is significantly increased (Hartwich et al., Journal of the American Chemical Society (1999), 121, 10803-10812), the fluorescence-based detection however, is completely insensitive to base mismatches.

Für eine stringente Hybridisierung zwischen Sonden und Target-Oligonukleotid, i. e. zum Ausschluss von Hybriden bei denen das an die Sonde hybridisierte Nukleinsäure- Oligomer eine oder mehrere nicht-komplementäre Basen umfasst, ist es im Allgemeinen notwendig den Hybridisierungsvorgang über mehrere Stunden wenige Grad unter der nach Bolton and McCarthy (1962) berechneten Schmelztemperatur für das Hybrid aus Sonden- und Target-Oligonukleotid stattfinden zu lassen oder Temperaturzyklen zu fahren, bei denen die Temperatur im Intervall zwischen Raumtemperatur und einem Hochtemperaturlimit T_h, das wenige Grad unter der berechneten Schmelztemperatur für das Hybrid aus Sonden- und Target-Oligonukleotid liegt, variiert wird.For stringent hybridization between probes and target oligonucleotide, ie to exclude hybrids in which the nucleic acid oligomer hybridized to the probe comprises one or more non-complementary bases, it is generally necessary to carry out the hybridization process over a few hours a few degrees below that Bolton and McCarthy (1962) calculated melting temperature for the hybrid of probe and target oligonucleotide to take place or drive temperature cycles in which the temperature was in the interval between room temperature and a high temperature limit T _h that was a few degrees below the calculated melting temperature for the hybrid consists of probe and target oligonucleotide is varied.

Die in der WO 00/42217 vorgeschlagene Verwendung von photosynthetischen Reaktionszentren, wie z. B. derjenigen der Purpurbakterien von Rb. sphaeroides, als Elektromarkierung zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen weist den Nachteil auf, dass die thermische Stabilität dieser Protein-Pigment-Komplexe nicht all zu hoch ist. Insbesondere kann es vorkommen, dass beim Hybridisierungsvorgang ein Teil der thermolabilen Reaktionszentren zerstört wird.The use of photosynthetic proposed in WO 00/42217 Reaction centers, such as B. that of the purple bacteria of Rb. sphaeroides, as Electrical labeling for the detection of nucleic acid oligomer Hybridization events have the disadvantage that the thermal stability of these Protein pigment complexes are not too high. In particular, it can happen that some of the thermolabile reaction centers are destroyed during the hybridization process becomes.

Presentation of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, modifizierte Nukleinsäure- Oligomere bereitzustellen, die zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden verwendet werden können und die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen. The object of the present invention is therefore to use modified nucleic acid To provide oligomers for the detection of nucleic acid-oligomer hybrids can be used and the disadvantages of the prior art are not exhibit.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und dessen Verwendung gemäß unabhängigem Anspruch 11 gelöst.According to the invention, this object is achieved by the modified nucleic acid oligomer according to independent claim 1 and its use according to independent claim 11 solved.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
DNA = Desoxyribonukleinsäure
RNA = Ribonukleinsäure
PNA = Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH₂)₂- (N(COCH₂-Base)-CH₂CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin
U = Uracil
Base = A, G, T, C oder U
Bp = Basenpaar
Nukleinsäure = wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio- Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure-Oligomer = Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- und/oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer = Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid = Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo = Abkürzung für Oligonukleotid.
Mismatch = Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss = single strand (Einzelstrang)
ds = double strand (Doppelstrang)
Elektron-Donor = Der Begriff Elektron-Donor bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Bei einem Elektron- Donor handelt es sich um ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron an einen Elektron-Akzeptor transferieren kann. Ein solcher äußerer Umstand ist z. B. die Lichtabsorption durch den Elektron-Donor oder -Akzeptor einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor "D" an den/einen Elektron-Akzeptor "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Die Fähigkeit als Elektron-Donor oder -Akzeptor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül als Elektron- Donor wirkt, kann gegenüber diesem Molekül unter abweichenden experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül unter gleichen oder abweichenden experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Akzeptor wirken.
Elekron-Akzeptor = Der Begriff Elektron-Akzeptor bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Bei einem Elektron- Akzeptor handelt es sich um ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron von einem Elektron-Donor aufnehmen kann. Ein solcher äußerer Umstand ist z. B. die Lichtabsorption durch den Elektron-Donor oder -Akzeptor einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor "D" an den/einen der Elektron-Akzeptor "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Die Fähigkeit als Elektron-Akzeptor oder -Donor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül als Elektron- Akzeptor wirkt, kann gegenüber diesem Molekül unter abweichenden experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül unter gleichen oder abweichenden experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Donor wirken.
Elektron-Donor-Molekül = entspricht einem Elektron-Donor.
Elektron-Akzeptor-Molekül = entspricht einem Elektron-Akzeptor.
redoxaktive Einheit = Einheit, die ein oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle umfasst.
Oxidationsmittel = chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron- Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) oxidiert. Ein Oxidationsmittel verhält sich analog zu einem Elektron- Akzeptor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Akzeptor verwendet. Nicht unmittelbar bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Oxidationsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder dass das Oxidationsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin- Basen von der kovalenten Anbindungstelle der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Oxidationsmittel darstellen.
Reduktionsmittel = chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron-Donor, Elektron- Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) reduziert. Ein Reduktionsmittel verhält sich analog zu einem Elektron- Donor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Donor verwendet. Nicht unmittelbar bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Reduktionsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder dass das Reduktionsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin- Basen von der kovalenten Anbindungstelle der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Reduktionsmittel darstellen.
photoinduzierbar = photoinduzierbar bedeutet, dass eine gewisse Eigenschaft erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. So entfaltet z. B. die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, unter bestimmten äußeren Umständen innerhalb der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit eine Ladungstrennung durchzuführen, also z. B. den Zustand D⁺A^- auszubilden, und an ein anderes geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem anderen geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge.
redoxaktiv = redoxaktiv bezeichnet die Eigenschaft einer Einheit unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen bzw. die Eigenschaft einer redoxaktiven Substanz unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen.
freie, redoxaktive Substanz = freies, nicht kovalent mit der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure-Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbundes, aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt stehendes Oxidations- oder Reduktionsmittel, wobei die freie redoxaktive Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, dass sie den oxidierten Donor (bzw. den reduzierten Akzeptor) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit re reduzieren (bzw. re-oxidieren) kann. Die freie redoxaktive Substanz ist bei einem Potential ϕ oxidierbar und reduzierbar, wobei ϕ der Bedingung 2,0 V p ≧ ϕ ≧ -2,0 V genügt. Das Potential bezieht sich hierbei auf das freie redoxaktive Molekül in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Bevorzugt sind die Potentialbereiche 1,7 V ≧ ϕ ≧ -1.7 V und 1,4 V ≧ ϕ ≧ -1,2 V, wobei der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ -0,7 V, in dem die redoxaktiven Substanzen der Anwendungsbeispiele oxidiert (bzw. reduziert) werden, ganz besonders bevorzugt ist. Geeignet sind, neben den üblichen organischen und anorganischen redoxaktiven Molekülen wie z. B. Hexacyanoferraten, Ferrocenen, Cobaltocenen und Chinonen, vor allem die Ascorbinsäure (oder das Na⁺ Salz davon), [Ru(NH₃)₆]²⁺, oder Cytochrom c (cyt c)²⁺, eine Gruppe frei beweglicher eisenhaltiger Proteine.
thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit = Einheit, die ein oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle enthält, wobei dieses (diese) Elektron-Donor-Molekül(e) und/oder dieses (diese) Elektron-Akzeptor-Molekül(e) in ein oder mehrere Makromoleküle eingebettet sein können. Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) können untereinander durch eine oder mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, von der-Waals-Brücken, durch π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander verbunden sein, wobei kovalente Verbindungen direkte oder indirekte (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure-Oligomer) Verbindungen sein können. Daneben können die Elektron-Donor(en) und/oder Elektron- Akzeptor(en), falls sie in ein oder mehrere Makromolekül(e) eingebettet sind, mit dem (den) Makromolekül(en) durch kovalente Anbindung an das (die) Makromolekül(e), durch Einkapseln in passende molekulare Kavitäten (Bindungstaschen) des Makromoleküls (der Makromoleküle), durch ionische Bindungen, Wasserstoff-Brücken-Bindungen, von der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation zwischen dem(n) Makromolekül(en) und dem(n) Elektron-Donor-Molekül(en) und/oder dem(n) Elektron- Akzeptor-Molekül(en) verbunden sein. Sind mehrere Makromoleküle Bestandteil der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, so kann die Bindung der Makromoleküle untereinander ebenfalls kovalent, ionisch, durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, von der-Waals- Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation erfolgen. Wesentliche Merkmale der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten sind neben der Thermostabilität und der Zusammensetzung aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) und Makromolekül(en): (i) die Einheit ist in den Erscheinungsformen "Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) im ursprünglichen bzw. oxidierten oder reduzierten Zustand" stabil und dissoziiert nicht in ihre Bestandteile, (ii) Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) sind nicht über Nukleinsäuren miteinander verbunden und (iii) die Zusammensetzung der Einheit aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) und Makromolekül(en) kann - unabhängig von der Bindung zwischen den Bestandteilen - vom Fachmann erkannt werden, da die Bestandteile prinzipiell auch als Einzelmoleküle vorkommen. Die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym sein. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der/ein Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus einem oxidierten Donor und einem reduzierten Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, an einen geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst im ladungsgetrennten Zustand, da das Reduktionsmittel (bzw. Oxidationsmittel) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen überträgt (bzw. aufnimmt), z. B. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduzieren kann (bzw. in Gegenwart eines Oxidationsmittels das A^- jedoch nicht A, oxidieren kann). Insbesondere kann dieses Oxidations- bzw. Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, wobei die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^- jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird. Wird als thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein thermostabiles photosynthetisches Reaktionszentrum verwendet, so handelt es sich im Allgemeinen um einen sogenannten Pigment/Protein- Komplex aus Apoprotein mit mehreren Proteinuntereinheiten und mehreren Cofaktoren (im Beispiel RC sogenannte Pigmente). In solchen Pigment/Protein-Komplexen spielen sich die ersten Schritte der lichtgetriebenen Ladungstrennung der bakteriellen oder pflanzlichen Photosynthese ab. Das RC der Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides z. B. (vgl. Struktur 1) besteht aus drei Protein-Untereinheiten und acht Cofaktoren (Pigmenten). Die Cofaktoren, ein Bakteriochlorophyll-Dimer P, zwei Bakteriochlorophyll-Monomere B_A und B_B, zwei Bakteriopheophytin-Monomere H_A und H_B und zwei Ubichinon-50 (UQ) Moleküle Q_A und Q_B, sind in den jeweiligen Protein-Bindungstaschen (also der P-, B_A- etc. Bindungstasche) lokalisiert.
thermostabiles, photoinduzierbar redoxaktives Protein/Enzym = besteht in der Regel aus sogenanntem Apoprotein und Cofaktoren, den Elektron-Donor(en) und Elektron Akzeptor(en) im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die photoinduzierte Ladungstrennung innerhalb des thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms wird durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. So sind zum Beispiel im photosynthetischen Reaktionszentrum (reaction center, RC) als Cofaktoren ein primärer Elektron-Donor P und mehrere verschiedene Elektron-Akzeptoren A, darunter auch Quinon- Cofaktor(en) Q, in eine Proteinmatrix eingebettet und bilden so eine "polymolekulare" Einheit (vgl. Struktur 1). Die Einbettung erfolgt in diesem Fall durch Einkapselung der Cofaktoren in passende Kavitäten, sogenannte Bindungstaschen der Proteinmatrix aus mehreren Protein- Untereinheiten. Sowohl die Protein-Untereinheiten als auch die Einkapselung der Cofaktoren in die Proteinmatrix ist im Fall einiger natürlich vorkommender RCs durch nicht kovalente Bindungen realisiert. Bei Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge gibt der primäre Donor ein Elektron an einen der Elektron-Akzeptoren ab und es bildet sich, zumindest temporär, aus den anfänglich neutralen Cofaktoren ein ladungsgetrennter RC-Zustand P⁺A^- insbesondere auch der Zustand P⁺Q^-.
RC = Reaktionszentrum.
Q_A-Protein-Bindungstasche = Proteinbindungstasche bzw. Proteinumgebung, in der sich der Chinon-Cofaktor Q_A befindet. In RC von z. B. Rhodobacter sphaeroides ist der Chinon-Cofaktor Q_A ein Ubichinon-50 (vgl. Struktur 1), ebenso bei den RC aus Chromatien; bei RC aus den Chloroflexaceae ist das Chinon der Q_A-Protein- Bindungstasche ein Menachinon.
Q_A-Bindungstasche = Q_A-Protein-Bindungstasche
Q = allgemein für Chinon (engl. Quinone).
UQ = Ubichinon-50, RC-Cofaktor und temporärer Elektron-Akzeptor z. B. im RC der Photosynthese betreibenden Bakterien aus z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodopseudomonas viridis.
MQ = Menachinon; RC-Cofaktor und temporärer Elektron-Akzeptor z. B. im RC der photosynthese betreibenden Bakterien aus Chloroflexaceae wie Chloroflexus aurantiacus.
(cyt c)²⁺ = reduzierte Form des Cytochrom c, ein frei bewegliches Häm- Protein, das in der bakteriellen Photosynthese in Rhodobacter sphaeroides den oxidierten primären Donor P⁺ zu P reduziert;
Beispiel für eine redoxaktive Substanz.
EDTA = Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
sulfo-NHS = N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC = (3-Dimethylaminopropyl)-carbodümid
HEPES = N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Linker = molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero- Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-30, insbesondere der Kettenlänge 1-20, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer = Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-30, insbesondere der Kettenlänge 1-20, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
(n × HS-Spacer)-oligo = Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n × R-S-S-Spacer)-oligo = Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum kann an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter n ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo = zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure-Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
Mica = Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH₂)₂)-ss-oligo-Spacer-MQ(RC) = Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem 12Bp Einzelstrang DNA-Oligonukleotid (Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO- (CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S- R Bindung bewirkt. Die endständige Base Thymin am 5'- Ende des Oligonukleotids ist am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH- CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert, wobei dieser Rest wiederum über seine freie Aminogruppe durch Amidbildung mit der Carbonsäuregruppe des modifizierten Menachinon-50 (bzw. Menachinon₁₀, 2-Methyl-3-(deca-Isoprenyl)-1,4- Naphtochinon) verbunden ist. Anschließend wird das MQ mit dem restlichen RC rekonstituiert.
Au-S-(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-MQ(RC) = Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-MQ(RC) hybridisiert mit dem zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid.
E = Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
E_Ox = Potential beim Strom-Maximum der Oxidation einer reversiblen Elektrooxidation oder -reduktion.
i = Stromdichte (Strom pro cm Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie = Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie = Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.The following abbreviations and terms are used in the context of the present invention:
DNA = deoxyribonucleic acid
RNA = ribonucleic acid
PNA = peptide nucleic acid (synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid. When the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH ₂ ) ₂ - (N (COCH ₂ base) -CH ₂ CO unit hybridizes PNA with DNA.)
A = adenine
G = guanine
C = cytosine
T = thymine
U = uracil
Base = A, G, T, C or U
Bp = base pair
Nucleic acid = at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine). The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone). An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA in a sequence-specific manner.
Nucleic acid oligomer = nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine and / or purine bases are covalently bound to one another).
Oligomer = equivalent to nucleic acid oligomer.
Oligonucleotide = equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer, e.g. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
Oligo = Abbreviation for oligonucleotide.
Mismatch = To form the Watson Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in RNA, T is replaced by uracil ). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch".
ss = single strand
ds = double strand
Electron donor = The term electron donor in the context of the present invention denotes a component of the thermostable, photoinducible redox-active unit. An electron donor is a molecule that can transfer an electron to an electron acceptor immediately or after exposure to certain external circumstances. Such an external circumstance is e.g. B. the light absorption by the electron donor or acceptor of a thermostable, photoinducible redox-active unit. By irradiating light of a certain or arbitrary wavelength, the electron donor "D" releases an electron to the electron acceptor "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- consisting of oxidized donor and reduced acceptor ^{- is} formed . The ability to act as an electron donor or acceptor is relative, ie a molecule that acts as an electron donor to another molecule immediately or after the action of certain external circumstances can subordinate to that molecule under different experimental conditions or to a third molecule same or different experimental conditions also act as an electron acceptor.
Electron acceptor = the term electron acceptor in the context of the present invention denotes a component of the thermostable, photoinducible redox-active unit. An electron acceptor is a molecule that can accept an electron from an electron donor immediately or after exposure to certain external circumstances. Such an external circumstance is e.g. B. the light absorption by the electron donor or acceptor of a thermostable, photoinducible redox-active unit. By irradiating light of a certain or any wavelength, the electron donor "D" releases an electron to the one or the electron acceptor "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- of oxidized donor and reduced ^{- is} formed Acceptor. The ability to act as an electron acceptor or donor is relative, ie a molecule which acts as an electron acceptor immediately after or after the action of certain external circumstances can act against this molecule under different experimental conditions or against a third molecule same or different experimental conditions also act as an electron donor.
Electron donor molecule = corresponds to an electron donor.
Electron acceptor molecule = corresponds to an electron acceptor.
redox-active unit = unit which comprises one or more electron-donor molecules and one or more electron-acceptor molecules.
Oxidizing agent = chemical compound (chemical substance) that oxidizes this other chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor) by taking up electrons from another chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor). An oxidizing agent behaves analogously to an electron acceptor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron acceptor that does not directly belong to the thermostable, photoinducible redox-active unit. In this context, not directly means that the oxidizing agent is either a free redox-active substance that is not bound to the nucleic acid oligomer but is in contact with it, or that the oxidizing agent is covalently bound to the nucleic acid oligomer, but at one point of the nucleic acid oligomer which is at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases from the covalent attachment point of the thermostable, photoinducible redox-active unit. In particular, the electrode can be the oxidizing agent.
Reducing agent = chemical compound (chemical substance) which, by donating electrons to another chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor), reduces this other chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor). A reducing agent behaves analogously to an electron donor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron donor which does not directly belong to the thermostable, photoinducible redox-active unit. In this context, not directly means that the reducing agent is either a free redox-active substance that is not bound to the nucleic acid oligomer but is in contact with it, or that the reducing agent is covalently linked to the nucleic acid oligomer, but at one point of the nucleic acid oligomer which is at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases from the covalent attachment point of the thermostable, photoinducible redox-active unit. In particular, the electrode can represent the reducing agent.
photo-inducible = photo-inducible means that a certain property is only developed by irradiation with light of a certain or any wavelength. So unfolds z. B. the thermostable, photo-inducible redox-active unit its redox activity, that is, its property to carry out a charge separation under certain external circumstances within the thermostable, photo-inducible redox-active unit, B. the state D ⁺ A ^- and to give electrons to another suitable oxidizing agent or to take up electrons from another suitable reducing agent, only by irradiating light of a certain or any wavelength.
redoxaktiv = redoxaktiv describes the property of a unit under certain external circumstances to donate electrons to a suitable oxidizing agent or to take up electrons from a suitable reducing agent or the property of a redoxactive substance under certain external circumstances to donate electrons to a suitable electron acceptor or from a suitable electron- To accept donor electrons.
free, redox-active substance = free, not covalently bonded with the thermostable, photo-inducible redox-active unit, the nucleic acid oligomer or the conductive surface, but with these, e.g. B. on the modified conductive surface added solution, contacting oxidizing or reducing agent, the free redox active substance z. B. can be an uncharged molecule, any salt or a redox-active protein or enzyme (Oxydoreductase). The free redox-active substance is characterized in that it can reduce (or re-oxidize) the oxidized donor (or the reduced acceptor) of the thermostable, photo-inducible redox-active unit. The free redox-active substance can be oxidized and reduced at a potential ϕ, where ϕ satisfies the condition 2.0 V p ≧ ϕ ≧ -2.0 V. The potential here relates to the free redox-active molecule in a suitable solvent, measured against a normal hydrogen electrode. The potential ranges are 1.7 V ≧ ϕ ≧ -1.7 V and 1.4 V ≧ ϕ ≧ -1.2 V, the range 0.9 V ≧ ϕ ϕ -0.7 V, in which the redox-active substances of Application examples are oxidized (or reduced), is very particularly preferred. Are suitable, in addition to the usual organic and inorganic redox-active molecules such. B. hexacyanoferrates, ferrocenes, cobaltocenes and quinones, especially ascorbic acid (or the Na ⁺ salt thereof), [Ru (NH ₃ ) ₆ ] ²⁺ , or cytochrome c (cyt c) ²⁺ , a group of freely mobile iron-containing proteins .
thermostable, photoinducible redox-active unit = unit which contains one or more electron donor molecules and one or more electron acceptor molecules, this electron donor molecule (s) and / or this electron electron Acceptor molecule (s) can be embedded in one or more macromolecules. Electron donor (s) and electron acceptor (s) can be linked to one another by one or more covalent or ionic bonds, by hydrogen bonds, by von Waals bridges, by π-π interaction or by coordination using electron pair Donation and acceptance can be linked to one another, where covalent compounds can be direct or indirect (eg via a spacer but not via a nucleic acid oligomer) compounds. In addition, if the electron donor (s) and / or electron acceptor (s) are embedded in one or more macromolecule (s), they can be linked to the macromolecule (s) by covalent attachment to the macromolecule (s) (e), by encapsulation in suitable molecular cavities (binding pockets) of the macromolecule (the macromolecules), by ionic bonds, hydrogen bridge bonds, by the Waals bridge, π-π interaction or by coordination by means of electron pair donation and Acceptance between the macromolecule (s) and the electron donor molecule (s) and / or the electron acceptor molecule (s). If several macromolecules are part of the thermostable, photoinducible redox-active unit, the binding of the macromolecules to each other can also be covalent, ionic, through hydrogen bonds, von Waals bridges, π-π interaction or through coordination by means of electron pair donation and -Accept. In addition to the thermostability and the composition of electron donor (s) and electron acceptor (s) or of electron donor (s) and electron acceptor (s) and macromolecule (s), essential features of the thermostable, photoinducible redox-active units are: (i) the unit is stable in the manifestations "electron donor (s) and electron acceptor (s) in the original or oxidized or reduced state" and does not dissociate into its components, (ii) electron donor (s) and Electron acceptor (s) are not linked to one another via nucleic acids and (iii) the composition of the unit from electron donor (s) and electron acceptor (s) or from electron donor (s) and electron acceptor (s) and Macromolecule (s) can be recognized by a person skilled in the art, regardless of the bond between the constituents, since the constituents in principle also occur as individual molecules. The thermostable, photo-inducible redox-active unit can e.g. B. any thermostable, photoinducible redox-active protein / enzyme. By irradiation with light of a specific or any given wavelength is the / an electron donor to one of the electron acceptors an electron, and it is formed, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- of an oxidized donor and a reduced acceptor. This process within the thermostable, photo-inducible redox-active units is called photo-induced charge separation. If the external circumstances are chosen accordingly, the thermostable, photoinducible redox-active unit only develops its redox activity, i.e. its property of donating electrons to a suitable oxidizing agent or taking up electrons from a suitable reducing agent, only in the charge-separated state, since the reducing agent (or oxidizing agent) only on the oxidized one Donor (or from the reduced acceptor) of the thermostable, photo-inducible redox-active unit transfers (or receives) electrons, e.g. B. in the presence of a reducing agent that D ⁺ , but not D, can reduce (or in the presence of an oxidizing agent that can oxidize A ^- but not A). In particular, this oxidizing or reducing agent can also be an electrode, the thermostable, photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up) an electron from an electrode only after the photo-induced charge separation, for. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- but not A, is oxidized (or D ⁺ , but not D, reduced). If a thermostable photosynthetic reaction center is used as the thermostable, photoinducible redox-active unit, it is generally a so-called pigment / protein complex of apoprotein with several protein subunits and several cofactors (in the example RC so-called pigments). The first steps of light-driven charge separation in bacterial or plant photosynthesis take place in such pigment / protein complexes. The RC of photosynthetic bacteria of the strain Rhodobacter sphaeroides z. B. (see Structure 1) consists of three protein subunits and eight cofactors (pigments). The cofactors, a bacteriochlorophyll dimer P, two bacteriochlorophyll monomers B _A and B _B , two bacteriopheophytin monomers H _A and H _B and two ubiquinone-50 (UQ) molecules Q _A and Q _B , are in the respective protein binding pockets (i.e. the P-, B _A - etc. binding pocket) localized.
thermostable, photo-inducible redox-active protein / enzyme = usually consists of so-called apoprotein and cofactors, the electron donor (s) and electron acceptor (s) in the sense of the present invention. The photo-induced charge separation within the thermostable, photo-inducible redox-active protein / enzyme is triggered by light of certain or any wavelength. In the photosynthetic reaction center (RC), for example, a primary electron donor P and several different electron acceptors A, including quinone cofactor (s) Q, are embedded as cofactors in a protein matrix and thus form a "polymolecular" Unity (see Structure 1). In this case, the embedding takes place by encapsulating the cofactors in suitable cavities, so-called binding pockets of the protein matrix from several protein subunits. In the case of some naturally occurring RCs, both the protein subunits and the encapsulation of the cofactors in the protein matrix are realized by non-covalent bonds. In the case of light radiation of a suitable wavelength, the primary donor emits an electron to one of the electron acceptors and, at least temporarily, a charge-separated RC state P ⁺ A ^- in particular also the state P ⁺ Q ^- is formed from the initially neutral cofactors.
RC = reaction center.
Q _A protein binding pocket = protein binding pocket or protein environment in which the quinone cofactor Q _A is located. In RC from z. B. Rhodobacter sphaeroides, the quinone cofactor Q _{A is} an ubiquinone-50 (cf. structure 1), as is the case with RC from chromates; in RC from the Chloroflexaceae, the quinone of the Q _A protein binding pocket is a menaquinone.
Q _A binding pocket = Q _A protein binding pocket
Q = general for quinone.
UQ = ubiquinone-50, RC cofactor and temporary electron acceptor e.g. B. in the RC of photosynthetic bacteria from z. B. Rhodobacter sphaeroides or Rhodopseudomonas viridis.
MQ = menaquinone; RC cofactor and temporary electron acceptor e.g. B. in the RC of photosynthetic bacteria from Chloroflexaceae such as Chloroflexus aurantiacus.
(cyt c) ²⁺ = reduced form of cytochrome c, a free-moving heme protein that reduces the oxidized primary donor P ⁺ to P in bacterial photosynthesis in Rhodobacter sphaeroides;
Example of a redox active substance.
EDTA = ethylenediamine tetraacetate (sodium salt)
sulfo-NHS = N-hydroxysulfosuccinimide
EDC = (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
HEPES = N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid]
Tris = tris (hydroxymethyl) aminomethane
Linker = molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule. As a rule, linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partners. The reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength. Preferred linkers are those of chain length 1-30, in particular chain length 1-20, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, that is to say between the two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule , represents.
Spacer = linker that is covalently attached to one or both of the structures to be connected (see linker) via the reactive groups. Preferred spacers are those of chain length 1-30, in particular chain length 1-20, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
(n × HS spacer) oligo = nucleic acid oligomer to which n thiol functions are each connected via a spacer, the spacers each having a different chain length (shortest continuous connection between thiol function and nucleic acid oligomer), in particular any one Chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to it by modification and “n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
(n × RSS spacer) -oligo = nucleic acid oligomer to which n disulfide functions are each connected via a spacer, with any radical R saturating the disulfide function. The spacer for connecting the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between the disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be connected to various naturally on the nucleic acid Oligomeric reactive groups attached or attached to this by modification. The placeholder n is any integer, in particular a number between 1 and 20.
oligo-spacer-SS-spacer-oligo = two identical or different nucleic acid oligomers which are connected to one another via a disulfide bridge, the disulfide bridge being linked to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers having a different chain length ( can have the shortest continuous connection between the disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14, and these spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to them by modification.
Mica = muscovite plate, carrier material for applying thin layers.
Au-S- (CH ₂ ) ₂ ) -ss-oligo-spacer-MQ (RC) = gold film on mica with covalently applied monolayer made from derivatized 12 bp single-stranded DNA oligonucleotide (sequence: TAGTCGGAAGCA). The terminal phosphate group of the oligonucleotide is esterified at the 3 'end with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-S- R bond. The terminal base thymine at the 5 'end of the oligonucleotide is modified at the C-5 carbon with -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ , this residue in turn via its free amino group by amide formation with the carboxylic acid group of the modified menaquinone-50 (or menaquinone ₁₀ , 2-methyl-3- (deca-isoprenyl) -1,4-naphthoquinone) is connected. The MQ is then reconstituted with the rest of the RC.
Au-S- (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-MQ (RC) = Au-S- (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-MQ (RC) hybridizes with that to ss-oligo (sequence : TAGTCGGAAGCA) complementary oligonucleotide.
E = electrode potential applied to the working electrode.
E _Ox = potential at the current maximum of the oxidation of a reversible electro-oxidation or reduction.
i = current density (current per cm electrode surface)
Cyclic voltametry = recording a current / voltage curve. The potential of a stationary working electrode is changed linearly as a function of time, starting from a potential at which no electrooxidation or reduction takes place up to a potential at which a dissolved or adsorbed species is oxidized or reduced (i.e. current flows). After passing through the oxidation or reduction process, which generates an initially rising current in the current / voltage curve and a gradually falling current after reaching a maximum, the direction of the potential feed is reversed. The behavior of the products of electrooxidation or reduction is then recorded in the return.
Amperometry = recording a current / time curve. Here, the potential of a stationary working electrode z. B. by a potential jump to a potential at which the electro-oxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the flowing current is recorded as a function of time.

Unter der Thermostabilität einer photoinduzierbar redoxaktive Einheit wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass photoinduzierbar redoxaktive Einheit bei erhöhten Temperaturen von wenigstens 40°C stabil ist. Im Gegensatz dazu neigen nicht thermostabile z. B. Proteine/Enzyme bei erhöhten Temperaturen (Temperaturen über dem physiologischen Temperaturbereich, also über 40°C) dazu zu denaturieren, d. h. ihre Tertiär- und Quartärstruktur bei unveränderter Primär- und Sekundärstruktur irreversibel zu verändern, was im allgemeinen mit einem Verlust der spezifischen Funktion des Proteins/Enzyms einhergeht. Thermostabile Proteine/Enzyme besitzen im allgemeinen eine höhere Denaturierungstemperatur. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden photoinduzierbar redoxaktive Einheiten als thermostabil bis zur Temperatur T_T bezeichnet, wenn nach zweistündiger Erwärmung auf T_T noch mehr als 90% der photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten in ihrer erfindungsrelevanten Form funktionsfähig sind, also mehr als 90% der Einheiten ihre Eigenschaft, photoinduzierte Ladungstrennung auszuführen, beibehalten. In the context of the present invention, the thermal stability of a photo-inducible redox-active unit is understood to mean that the photo-inducible redox-active unit is stable at elevated temperatures of at least 40 ° C. In contrast, thermostable z. B. proteins / enzymes at elevated temperatures (temperatures above the physiological temperature range, ie above 40 ° C) to denature, ie to irreversibly change their tertiary and quaternary structure with unchanged primary and secondary structure, which generally means a loss of specific function of the protein / enzyme goes hand in hand. Thermostable proteins / enzymes generally have a higher denaturation temperature. In the context of the present invention, photo-inducible redox-active units are referred to as thermostable up to the temperature T _T if, after heating for two hours to T _T , more than 90% of the photo-inducible redox-active units are still functional in their form relevant to the invention, i.e. more than 90% of the units are functional to carry out photo-induced charge separation.

Die Verwendung thermostabiler, photoinduzierbar redoxaktiver Einheiten als Elektromarkierung zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen bietet den Vorteil, dass die Hybridisierung bei höheren Temperaturen oder - bei Temperaturzyklen - bei höheren Hochtemperaturlimits T_h stattfinden kann und somit die für eine stringente Hybridisierung zwischen Sonden und Target-Oligonukleotid notwendigen Temperaturbedingungen auch an längerkettige (Sonden-) Nukleinsäureoligomere angepasst werden können.The use of thermostable, photoinducible redox-active units as electrical markers for the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events offers the advantage that the hybridization can take place at higher temperatures or - at temperature cycles - at higher high temperature limits T _h and thus for a stringent hybridization between probes and target -Oligonucleotide necessary temperature conditions can also be adapted to longer-chain (probe) nucleic acid oligomers.

Erfindungsgemäß weist die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit eine thermische Stabilität bis zu einer Temperatur von wenigstens 40°C auf. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit mit einer thermischen Stabilität bis zu einer Temperatur von wenigstens 50°C, ganz besonders bevorzugt bis zu einer Temperatur von wenigstens 60°C.According to the invention, the thermostable, photo-inducible redox-active unit has one thermal stability up to a temperature of at least 40 ° C. According to one preferred embodiment is a thermostable, photoinducible redox-active unit with thermal stability up to a temperature of at least 50 ° C, most preferably up to a temperature of at least 60 ° C.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit um ein thermostabiles, photoinduzierbar redoxaktives Protein oder Enzym.According to a preferred embodiment of the present invention in the thermostable, photoinducible redox active unit by a thermostable, photo-inducible redox-active protein or enzyme.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der als thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein thermostabiles, photosynthetisches Reaktionszentrum verwendet wird, wobei insbesondere ein thermostabiles, photosynthetisches bakterielles Reaktionszentrum bevorzugt wird.An embodiment in which the thermostable, photo-inducible redox-active unit a thermostable, photosynthetic Reaction center is used, in particular a thermostable, photosynthetic bacterial reaction center is preferred.

Besonders günstige Eigenschaften weisen das Reaktionszentrum der Chloroflexaceae, insbesondere das Reaktionszentrum aus Chloroflexus aurantiacus, sowie das Reaktionszentrum der Chromatiaceae, insbesondere das Reaktionszentrum aus Chromatium tepidum, auf, wobei es sich hierbei in jedem Fall um thermostabile, photosynthetische bakterielle Reaktionszentren handelt.The reaction center of Chloroflexaceae has particularly favorable properties, especially the reaction center from Chloroflexus aurantiacus, as well as the Reaction center of the Chromatiaceae, especially the reaction center Chromatium tepidum, which is in any case thermostable, photosynthetic bacterial reaction centers.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen modifizierten Nukleinsäure-Oligomere in einem Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen, bei dem die Detektion bevorzugt cyclovoltametrisch, amperometrisch oder durch Leitfähigkeitsmessung erfolgt.The present invention also relates to the use of the invention modified nucleic acid oligomers in an electrochemical process Detection of nucleic acid oligomer hybridization events in which the Detection preferably cyclic voltametric, amperometric or by Conductivity measurement takes place.

Struktur 1: Reaktionszentrum bestehend aus den Cofaktoren P (primärer Donor, ein Bakteriochlorophyll Dimer), B_A und B_B (Bakteriochlorophyll Monomere), H_A und H_B (Bakteriopheophytine), Q_A und Q_B (Ubichinon-50) und den Proteinuntereinheiten L, M, und H (nicht gezeigt), die die Cofaktoren einhüllen.
Structure 1: reaction center consisting of the cofactors P (primary donor, a bacteriochlorophyll dimer), B _A and B _B (bacteriochlorophyll monomers), H _A and H _B (bacteriopheophytine), Q _A and Q _B (ubiquinone-50) and the protein subunits L, M, and H (not shown) that envelop the cofactors.

Die thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten können nach photoinduzierter Abgabe eines Elektrons an ein externes Oxidationsmittel, z. B. eine Elektrode, oder Aufnahme eines Elektrons von einem externen Reduktionsmittel, z. B. einer Elektrode, durch eine freie redoxaktive Substanz rereduziert bzw. reoxidiert, also in ihren ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.The thermostable, photoinducible redox-active units can after photo-induced delivery of an electron to an external oxidant, e.g. Legs Electrode, or receiving an electron from an external reducing agent, e.g. B. an electrode, reduced or reoxidized by a free redox-active substance be restored to their original condition.

Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) und/oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA- Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-) Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.A nucleic acid oligomer is used in the context of the present invention Connection from at least two covalently linked nucleotides or from at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) and / or purine bases (e.g. adenine or guanine), preferably a DNA, RNA or PNA Fragment, used. In the present invention, the term refers Nucleic acid on any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or Purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous backbone structures, such as e.g. B. a Thio-phosphate, a dithio-phosphate or a phosphoramide backbone. Essentials A characteristic of a nucleic acid is that it is a naturally occurring cDNA or RNA can bind sequence-specifically. Alternative to the term "nucleic acid oligomer" the terms "(probe) oligonucleotide", "nucleic acid" or "oligomer" used.

"Photoinduzierbar" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Redoxaktivität der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor "D" an einen der Elektron-Akzeptoren "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität erst im ladungsgetrennten Zustand, da das Reduktionsmittel (bzw. das Oxidationsmittel) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen kann (bzw. aufnehmen kann), z. B. in Gegenwart eines Oxidationsmittels, das A^- jedoch nicht A, oxidieren kann (bzw. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduzieren kann).In the context of the present invention, “photoinducible” means that the redox activity of the thermostable, photoinducible redoxactive unit, that is to say its property, under certain external circumstances, of releasing electrons to a suitable oxidizing agent or of accepting electrons from a suitable reducing agent, only by irradiating light of a certain or any wavelength is unfolded. By irradiating light of a certain or arbitrary wavelength, the electron donor "D" releases an electron to one of the electron acceptors "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- consisting of oxidized donor and reduced acceptor ^{- is} formed. This process within the thermostable, photo-inducible redox-active unit is called photo-induced charge separation. If the external circumstances are chosen accordingly, the thermostable, photo-inducible redox-active unit only develops its redox activity in the charge-separated state, since the reducing agent (or the oxidizing agent) can only transfer electrons to the oxidized donor (or from the reduced acceptor) of the thermostable, photo-inducible redox-active unit ( or can record), e.g. B. in the presence of an oxidizing agent that can oxidize A ^- but not A (or in the presence of a reducing agent that can reduce D ⁺ , but not D).

Als Oxidations- bzw. Reduktionsmittel kann eine Elektrode fungieren, wobei die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an die Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^- jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird. Daneben kann das Oxidations- bzw. Reduktionsmittel eine freie, redoxaktive Substanz sein, wobei die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an die freie, redoxaktive Substanz abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die freie redoxaktive Substanz A^-, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert).An electrode can act as an oxidizing or reducing agent, the thermostable, photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up) an electron from the electrode only after the photo-induced charge separation, for. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- but not A, is oxidized (or D ⁺ , but not D, reduced). In addition, the oxidizing or reducing agent can be a free, redox-active substance, the thermostable, photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up from) an electron to the free, redox-active substance only after the photo-induced charge separation, for. B. if the free redox-active substance A ^- , but not A, oxidizes (or D ⁺ , but not D, reduces).

Unter dem Begriff "modifizierte leitfähige Oberfläche" wird eine leitfähige Oberfläche verstanden, die durch Anbindung eines mit einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit modifizierten Nukleinsäure-Oligomers modifiziert ist.The term "modified conductive surface" is a conductive surface understood that by connecting one with a thermostable, photoinducible redox-active unit modified nucleic acid oligomer is modified.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen, durch Anbindung einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit modifizierten Nukleinsäure-Oligomere können DNA-/RNA-/PNA-Fragmente in einer Probenlösung durch sequenzspezifische Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierung detektiert werden. Die Detektion der Hybridisierungsereignisse durch elektrische Signale ist eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer batteriebetriebenen Variante den Einsatz vor Ort.Using the inventive, by connecting a thermostable, Photo-inducible redox-active unit modified nucleic acid oligomers can DNA / RNA / PNA fragments in a sample solution by sequence-specific Nucleic acid-oligomer hybridization can be detected. The detection of the Hybridization events through electrical signals is a simple and cost-effective method and enables in a battery-powered variant Use on site.

Die Detektion von Hybridisierungsereignissen auf einem Oligomer-Chip kann durch ein photoadressierbares Ausleseverfahren erfolgen, so z. B. durch Messung elektrischer Signale. Ein photoadressierbares (Oligomer-Chip-) Ausleseverfahren ist ein Verfahren, bei dem die Detektion der Hybridisierungsereignisse auf ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe innerhalb des Gesamtsystems (des kompletten Oligomer-Chips) begrenzt wird, indem Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge zur Induktion der Redoxaktivität der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit räumlich auf diese Test-Site (-Gruppe) fokussiert (begrenzt) wird.The detection of hybridization events on an oligomer chip can be carried out by a Photo-addressable readout process take place, so z. B. by measuring electrical Signals. A photo-addressable (oligomer chip) readout process is a process in which the detection of the hybridization events on a specific test site or a specific test site group within the overall system (the complete Oligomer chips) is limited by using light of specific or arbitrary wavelength Induction of the redox activity of the thermostable, photo-inducible redox-active unit is spatially focused (limited) on this test site (group).

Binding of a thermostable, photo-inducible redox-active unit to one Nucleic acid oligomer

Die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit wird an ein Nukleinsäure- Oligomer kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäure-Oligomers mit der redoxaktiven Einheit oder Teilen davon gebunden. Die Bindung von redoxaktiven Einheiten an ein Nukleinsäure-Oligomer ist in der WO 00/42217 detailliert beschrieben. Sämtliche dort genannten Verfahren können auch zur Bindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten an ein Nukleinsäure-Oligomer angewendet werden.The thermostable, photo-inducible redox-active unit is attached to a nucleic acid Oligomer covalently through the reaction of the nucleic acid oligomer with the redox active Unit or parts thereof. The binding of redox-active units to one Nucleic acid oligomer is described in detail in WO 00/42217. All there mentioned methods can also be used to bind the thermostable, photoinducible redox-active units can be applied to a nucleic acid oligomer.

The conductive surface

Das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer ist direkt oder indirekt (über einen Spacer) an eine leitfähige Oberfläche gebunden. Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jede elektrisch leitfähige Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Metall wie z. B. Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan, daneben Oberflächen aus Metallegierungen, sowie dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen, wobei sämtliche Halbleiter als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden können. Beispiele hierfür sind Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985. Die leitfähige Oberfläche kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung selbsttragend oder auf einem beliebigen Trägermaterial, wie z. B. Glas, aufgebracht vorliegen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Elektrode" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.The modified nucleic acid oligomer is on directly or indirectly (via a spacer) bound a conductive surface. The term "conductive surface" is used understood any electrically conductive surface of any thickness, in particular Metal surfaces such as B. platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, Zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum and manganese, besides Metal alloy surfaces, as well as doped or undoped Semiconductor surfaces, with all semiconductors as pure substances or as Mixtures can be used. Examples include carbon, silicon, Germanium, α-tin, Cu (I) and Ag (I) halides of any crystal structure. Suitable are also all binary compounds of any composition and any structure from the elements of groups 14 and 16, the elements of Groups 13 and 15, as well as the elements of groups 15 and 16. In addition, ternary compounds of any composition and structure from the Group 11, 13 and 16 elements or group 12, 13 and 16 elements be used. The names of the groups in the periodic table of the Elements refer to the 1985 IUPAC recommendation. The conductive surface can be self-supporting within the scope of the present invention or on any Backing material, such as. B. glass, applied. As part of the present Invention, the term "electrode" is used as an alternative to "conductive surface".

Binding of a nucleic acid oligomer to the conductive surface

Zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen ist es erforderlich, ein Nukleinsäure-Oligomer an ein eine leitfähige Oberfläche zu binden. Diese Bindung kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen Oberfläche der oben beschriebenen Art erfolgen. Die Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:
For the electrochemical detection of nucleic acid-oligomer hybridization events, it is necessary to bind a nucleic acid oligomer to a conductive surface. This binding can take place directly or via a linker / spacer with the surface atoms or molecules of a conductive surface of the type described above. The binding can be done in three different ways:

a) The surface is modified so that a reactive group of molecules is accessible. This can be done by direct derivatization of the surface molecules, e.g. B. by wet chemical or electrochemical oxidation / reduction happen. details such a surface modification can be found in WO 00/42217.
b) The nucleic acid oligomer that is applied to the conductive surface is, is via a covalently attached spacer of any composition and Chain length modified with a reactive group, the reactive group is preferably located near one end of the nucleic acid oligomer. Both reactive groups are groups that work directly with the unmodified Surface can react. Details of the bond between the reactive group and unmodified surface can be found in WO 00/42217.
c) As a reactive group on the nucleic acid oligomer, the phosphoric acid, thiol, Sugar C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups of the oligonucleotide backbone, especially terminal groups used. The necessary coupling group for covalent attachment to the phosphoric acid, thiol, sugar C-3-hydroxy, In this case, carboxylic acid or amine group is part of the Surface derivatization with any (monomolecular) layer Molecular length as described under a) in this section, or the phosphoric acid, Thiol, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group can directly with the unmodified surface react as described under b) in this section. Details of this bond to the conductive surface can be found in WO 00/42217 be removed.

Die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche kann vor oder nach der Anbindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer erfolgen. Im Falle eines thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und Cofaktor(en) kann statt der kompletten thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein oder Cofaktor angebunden sein und die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden Teilen komplettiert. Alternativ kann die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer bzw. nach der Anbindung von Teilen der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) in diesem Abschnitt beschrieben.The nucleic acid oligomer can be bound to the conductive surface before or after connecting the thermostable, photoinducible redox-active unit to the Nucleic acid oligomer take place. In the case of a thermostable, photoinducible redox-active protein / enzyme from apoprotein and cofactor (s) can be used instead of complete thermostable, photo-inducible redox-active unit just that Apoprotein or cofactor bound and the thermostable, photoinducible redox-active unit is then reconstituted with the missing ones Parts completed. Alternatively, the binding of the nucleic acid oligomer to the conductive surface before or after attaching it with a reactive group provided spacers for binding the thermostable, photo-inducible redox-active Unity. The binding of the already modified nucleic acid oligomer to the conductive surface, d. H. the bond to the surface after connecting the thermostable, photoinducible redox-active unit to the nucleic acid oligomer or after the connection of parts of the thermostable, photo-inducible redox-active Unit or after connecting the spacer provided with a reactive group for The thermostable, photoinducible redox-active unit is also bound as described under a) to c) in this section.

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang- Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen den einzelnen Nukleinsäure-Oligomeren ein genügend großer Abstand verbleibt, um zum einen den für eine Hybridisierung mit dem Target-Nukleinsäure-Oligomer nötigen Freiraum und zum anderen den für die Anbindung der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich insbesondere drei verschiedene Vorgehensweisen (und Kombinationen daraus) an:
When producing the test sites, when connecting the single-stranded nucleic acid oligomers to the surface, care must be taken to ensure that there is a sufficiently large distance between the individual nucleic acid oligomers, on the one hand, for the hybridization with the target nucleic acid To provide the oligomer with the necessary free space and, on the other hand, the free space required for connecting the thermostable, photo-inducible redox-active unit. There are three different approaches (and combinations thereof) in particular:

1. Production of a modified surface by connecting a hybridized Nucleic acid oligomers, i.e. a surface derivatization with hybridized Sample nucleic acid oligomer instead of single stranded sample oligonucleotide. The for Hybridization used nucleic acid oligomer strand is unmodified (the Surface connection is carried out as under a) -c) in this section described). Then the hybridized nucleic acid-oligomer double strand thermally dehybridized, resulting in a single-stranded nucleic acid oligomer modified surface with a larger distance between the sample nucleic acid Oligomers is produced.
2. Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded nucleic acid oligomers, whereby during the surface Derivatization with single-stranded sample nucleic acid oligomer an appropriate monofunctional linker is added, which in addition to the single-stranded or Double-stranded nucleic acid oligomer is also bound to the surface (which Surface connection is carried out as under a) -c) in this section described). The monofunctional linker has a chain length that the chain length of the spacer between the surface and the nucleic acid oligomer is identical or deviates by a maximum of four chain atoms. When using double strand Nucleic acid oligomer together with a suitable monofunctional linker The nucleic acid-oligomer double strand after the surface derivatization joint binding of the double-stranded nucleic acid oligomer and the linker thermally dehybridized to the surface.
3. Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded oligonucleotide to which the thermostable, photoinducible redox-active unit is already connected, the thermostable, photo-inducible redox-active unit has a diameter of greater than 30 Å. In the Using double-stranded oligonucleotide becomes the oligonucleotide double-strand after the attachment of the double-stranded oligonucleotide to the surface thermally dehybridized.

Method for the electrochemical detection of nucleic acid-oligomer hybrids

Vorteilhafterweise werden zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybriden mehrere Sonden-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz auf einem Oligomer (DNA) -Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA zu detektieren bzw. um Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer leitfähigen Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA- Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Der DNA-Chip kann aber auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure- Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 8 bis 25 verwendet.Advantageously, for the electrochemical detection of nucleic acid Oligomeric hybrids are multiple probe nucleic acid oligomers of different types Sequence applied to an oligomer (DNA) chip to sequence a any target nucleic acid oligomer or a (fragmented) target DNA detect or to detect mutations in the target and sequence-specific to prove. For this purpose, the surface atoms are on a conductive surface or molecules of a defined area (a test site) with DNA / RNA / PNA Nucleic acid oligomers of known but any sequence, as described above, connected. The DNA chip can also be used with a single probe oligonucleotide be derivatized. As probe-nucleic acid oligomers, nucleic acid Oligomers (e.g. DNA, RNA or PNA fragments) with a base length of 3 to 50 are preferred the length 5 to 30, particularly preferably the length 8 to 25 used.

Es entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer-Einheit, wobei "Einheit" repräsentativ für eine Elektromarkierung mit einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit steht. Die Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer (Elek-ss-oligo-Spacer- Einheit bzw. Elek-Spacer-ss-oligo-Einheit) durchgeführt werden.A surface hybrid of the general structure Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer unit, where "unit" is representative of an electrical marking with a thermostable, photo-inducible redox-active unit. The bridges can of course also be used without a spacer or with only one spacer (Elek-ss-oligo-Spacer- Unit or Elek-Spacer-ss-oligo unit) are carried out.

In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden Nukleinsäure-Oligomer-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. In Fig. 2 ist die Sequenz der Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) im Detail gezeigt.In a next step, the test sites are brought into contact with the nucleic acid oligomer solution (target) to be examined. Hybridization only occurs in the case in which the solution contains nucleic acid-oligomer strands which are complementary to the probe-nucleic acid oligomers bound to the conductive surface, or at least are complementary in a wide range. In Fig. 2 the sequence of the electron transfer steps in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-UQ (RC) is shown in detail.

Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.Because of the hybridization of probe nucleic acid oligomer and the related complementary nucleic acid oligomer strand (target) changes the electrical Communication between the (conductive) surface and the thermostable, photo-inducible redox-active unit. A sequence-specific Hybridization event by electrochemical processes such. B. cyclic voltammetry, Amperometry or conductivity measurements can be detected.

Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom, dann einen Maximalstrom (Peak) und schließlich einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.With cyclic voltammetry the potential of a stationary working electrode changed linearly depending on time. Starting from a potential with no Electrooxidation or reduction takes place, the potential is changed until the thermostable, photo-inducible redox-active substance is oxidized or reduced (i.e. Current flows). After going through the oxidation or reduction process in the Current / voltage curve an initially increasing current, then a maximum current (Peak) and finally generates a gradually falling current, the direction becomes reverse of the potential feed. The behavior of the products then returns electrooxidation or reduction.

Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch ermöglicht, dass die thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive Einheit durch Anlegen eines geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) werden kann, die Rereduktion (Reoxidation) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit in den ursprünglichen Zustand aber nicht wie in der Cyclovoltametrie durch Änderung des Elektrodenpotentials erfolgt, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), der "redoxaktiven Substanz", wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange solches Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange das verbrauchte Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.This creates an alternative electrical detection method, amperometry enables the thermostable, photo-inducible redox-active unit by applying of a suitable, constant electrode potential is electro-oxidized (electroreduction), the re-reduction (reoxidation) of the thermostable, photo-inducible redox-active unit in the original state but not as in Cyclic voltametry is done by changing the electrode potential, but by a suitable reducing agent (oxidizing agent) added to the target solution, which "redox-active substance", which closes the circuit of the entire system becomes. As long as such reducing agent (oxidizing agent) is present or as long the used reducing agent (oxidizing agent) is reduced on the counter electrode (reoxidized), current flows which can be detected amperometrically and which is proportional to the number of hybridization events.

Die Redoxaktivität der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. Diese Eigenschaft wird dadurch ausgenutzt, dass die elektrochemische Detektion erst durch Einstrahlen von Licht auf das Oberflächenhybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer- Einheit (Oberflächenhybrid mit hybridisiertem Target) ausgelöst wird und maximal solange aufrechterhalten wird wie die Lichteinstrahlung andauert. Insbesondere bei der amperometrischen Detektion fließt somit unter bestimmten äußeren Umständen erst dann (längeranhaltend) Strom, wenn Licht auf das Oberfächenhybrid eingestrahlt wird. The redox activity of the thermostable, photo-inducible redox-active unit only becomes triggered by light of certain or any wavelength. This property will exploited in that the electrochemical detection only by irradiation of Light on the surface hybrid of the general structure Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer- Unit (surface hybrid with hybridized target) is triggered and maximum is maintained as long as the light exposure lasts. Especially with the amperometric detection therefore only flows under certain external circumstances then (longer-lasting) electricity when light is irradiated onto the surface hybrid.

Solche äußere Umstände sind z. B. die Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels (bzw. Oxidationsmittels), um einen durch Photoinduktion gebildeten, oxidierten Donor D⁺ (bzw. reduzierten Akzeptor A^-) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit zu reduzieren (bzw. zu reduzieren) und das Anliegen eines Potentials an der Elektrode, bei dem zwar ein durch Photoinduktion gebildeter reduzierter Akzeptor A^- (bzw. oxidierter Donor D⁺) der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, nicht jedoch der nicht reduzierte Akzeptor A (bzw. der nicht oxidierte Donor D) oxidiert (bzw. reduziert) werden kann. Somit kann die Detektion bei Verwendung einer thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit auf ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe des Oligomer-Chips räumlich beschränkt werden, indem das Licht auf dieses Test-Site oder auf diese Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Es können also verschiedene Test-Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer-Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden. Ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test- Site-Gruppe kann einfach durch Anlegen eines geeigneten äußeren Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei Lichteinstrahlung auf genau dieses Test-Site oder diese Test- Site Gruppe adressiert und amperometrisch detektiert werden. Die verschiedenen Test- Sites müssen also nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-) Elektroden aufgebracht werden.Such external circumstances are e.g. B. the presence of a suitable reducing agent (or oxidizing agent) in order to reduce (or reduce) an oxidized donor D ⁺ (or reduced acceptor A ^- ) formed by photoinduction of the thermostable, photoinducible redox-active unit and the application of a potential at the electrode at which a reduced acceptor A ^- (or oxidized donor D ⁺ ) of the thermostable, photoinducible redox-active unit formed by photoinduction, but not the non-reduced acceptor A (or the non-oxidized donor D) oxidizes (or can be reduced). Thus, when a thermostable, photoinducible redox-active unit is used, the detection can be spatially restricted to a specific test site or a specific test site group of the oligomer chip by the light being directed onto this test site or onto this test site group is limited. Different test sites (nucleic acid-oligomer combinations) of an oligomer chip can therefore be applied to a common, continuous, electrically conductive surface. A specific test site or a specific test site group can be addressed and amperometrically detected simply by applying a suitable external potential to the (entire) surface in the event of light irradiation onto precisely this test site or this test site group. The various test sites therefore do not have to be applied to individual (micro) electrodes which are electrically insulated from one another and can be controlled individually in order to apply a potential and read out the current.

Brief description of the drawings

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigenIn the following, the invention will be described in connection with exemplary embodiments are explained in more detail with the drawings. Show it

Fig. 1 Schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen mittels amperometrischer Detektion; Fig. 1 Schematic representation of the detection of nucleic acid oligomer hybridization events using amperometric detection;

Fig. 2 Schematische Darstellung der photoinduzierten amperometrischen Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss oligo-Spacer-MQ(RC); hν: Einstrahlung von Licht, P: primärer Donor des RC, MQ: Menachinon-50, Elektron Akzeptor in der Q_A-Protein- Bindungstasche des RC, Red/Ox: reduzierte bzw. oxidierte Form der freien, der Targetlösung zugesetzten redoxaktiven Substanz, z. B. cyt c₂ ²⁺, Natriumascorbat oder Fe(CN)₆ ²⁺, die die oxidierte Form P⁺ in den ursprünglich neutralen Zustand P rereduzieren können, E_Ox: Potential der Elektrode, bei dem MQ^- durch Elektronabgabe an die Elektode zu MQ oxidiert wird, "hν an": Beginn der Lichteinstrahlung, "hν aus": Ende der Lichteinstrahlung. Fig. 2 Schematic diagram of the photoinduced amperometric measurement method using the example of the surface hybrid elec-spacer-ss oligo-spacer-MQ (RC); hν: radiation of light, P: primary donor of the RC, MQ: menaquinone-50, electron acceptor in the Q _A protein binding pocket of the RC, Red / Ox: reduced or oxidized form of the free redox-active substance added to the target solution, e.g. B. cyt c ₂ ²⁺ , sodium ascorbate or Fe (CN) ₆ ²⁺ , which can re-reduce the oxidized form P ⁺ to the originally neutral state P, E _Ox : potential of the electrode at which MQ ^- by electron donation to the electrode MQ is oxidized, "hν on": start of light irradiation, "hν off": end of light irradiation.

Ways of Carrying Out the Invention

Eine Bildungseinheit einer exemplarischen Test-Site mit hybridisiertem Target, Au- S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-MQ(RC) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo- Spacer-Einheit ist schematisch in Fig. 2 dargestellt. Unter Bildungseinheit wird die kleinste sich wiederholende Einheit einer Test-Site verstanden. Die Elektromarkierung im Beispiel der Fig. 2 ist das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien Cloroflexus aurantiacus, ein thermostabiles, photoinduzierbar redoxaktives Protein bestehend aus Apoprotein und Cofaktoren. Das Reaktionszentrum aus Chloroflexus aurantiacus kann durch einfache Manipulation von den beiden Menachinon-Cofaktoren in der Q_A- bzw. Q_B-Bindungstasche befreit werden (Gunner et al., Journal of Physical Chemistry, 1986, Vol. 90, S. 3783-3795), so dass man Menachinon getrennt vom restlichen RC (Apoprotein einschließlich aller Cofaktoren außer Menachinon in der Q_A- bzw. Q_B-Bindungstasche) erhält. Das RC ist über seinen Cofaktor Menachinon-50 (MQ) in der sogenannten Q_A-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden, wobei zuerst freies MQ mit einer reaktiven Carbonsäuregruppe versehen wird, dann freies MQ über diese Carbonsäure-Gruppe kovalent an das Sonden-Oligonukleotid angebunden wird und schließlich das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer MQ) an MQ rekonstituiert wird.A formation unit of an exemplary test site with hybridized target, Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-MQ (RC) of the general structure elek-spacer-ds-oligo-spacer unit is shown schematically in FIG. 2 shown. Education unit is the smallest repeating unit of a test site. The electric marker in the example of Fig. 2 is the reaction center (RC) of the photosynthesizing bacteria Cloroflexus aurantiacus, a thermostable, photoinducibly redox-active protein consisting of apoprotein and cofactors. The reaction center from Chloroflexus aurantiacus can be freed from the two menaquinone cofactors in the Q _A or Q _B binding pocket by simple manipulation (Gunner et al., Journal of Physical Chemistry, 1986, Vol. 90, pp. 3783-3795 ), so that menaquinone is obtained separately from the rest of the RC (apoprotein including all cofactors except menaquinone in the Q _A or Q _B binding pocket). The RC is covalently linked to the oligonucleotide via its cofactor menaquinone-50 (MQ) in the so-called Q _A binding pocket of the RC, first free MQ being provided with a reactive carboxylic acid group, then free MQ via this carboxylic acid group covalently to the probes Oligonucleotide is attached and finally the remaining RC (apoprotein with all cofactors except MQ) is reconstituted on MQ.

Das Sonden-Oligonukleotid ist in der Nähe der beiden Enden jeweils über einen (beliebigen) Spacer mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen versehen. Das so modifizierte Sonden-Oligonukleotid wird in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker kovalent an die Elektrode angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend monofunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird, um zwischen den einzelnen Sonden- Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target- Oligonukleotid und für die Anbindung der redoxaktiven Einheit zur Verfügung zu stellen. Danach wird an die freie, spacerverbrückte, reaktive Gruppe des Sonden- Oligonukleotids MQ, das vorher mit einer passenden reaktiven Kopplungsgruppe versehen wurde, angebunden. Im letzten Schritt dieser Reaktionssequenz wird dann das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer MQ) an MQ rekonstituiert.The probe oligonucleotide is near each end via one Provide (any) spacer with (identical or different) reactive groups. The modified probe oligonucleotide is in the presence of a monofunctional Linkers together with the monofunctional linker covalently to the electrode connected, taking care that enough monofunctional linker suitable chain length is added to between the individual probes Oligonucleotides enough space for hybridization with the target To provide oligonucleotide and for the connection of the redox-active unit. Then the free, spacer-bridged, reactive group of the probe Oligonucleotide MQ, previously with a suitable reactive coupling group was provided. The final step of this reaction sequence is then the remaining RC (apoprotein with all cofactors except MQ) reconstituted at MQ.

Die elektrische Kommunikation zwischen der leitfähigen Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target, zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der über ein Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit.The electrical communication between the conductive surface and the one above Single strand oligonucleotide bridged thermostable, photoinducible redox active Unit in the general structure Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer unit is weak or nonexistent. By treating the test site (s) with one too investigating oligonucleotide solution, it happens in the case of hybridization between probe and target, for increased conductivity between the surface and the thermostable bridged by a double-stranded oligonucleotide, photo-inducible redox-active unit.

Durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge auf das RC wird der Cofaktor P, der sogenannte primäre Donor, elektronisch angeregt und es kommt innerhalb der Cofaktoren des RCs zur photoinduzierten Ladungstrennung, wobei ein Elektron vom angeregten primären Donor P* auf das MQ in der Q_A-Bindungstasche übertragen wird. Liegt an der Elektrode ein geeignetes Potential an, um vom reduzierten Menachinon (MQ^-) ein Elektron auf die Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Sonden-Oligonukleotids trotzdem zu keinem Stromfluß, da die Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer- MQ(RC) sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand (Au- S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-MQ(RC)) jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, ein Elektron kann von MQ^- zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von MQ) und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven Substanz, die P⁺ zu P reduziert, wird der Stromkreis geschlossen und weitere Lichtabsorption durch das RC startet den Zyklus erneut. Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und photoinduzierbar redoxaktiver Einheit (Fig. 2). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden durch Amperometrie lichtinduziert zu detektieren. The cofactor P, the so-called primary donor, is electronically excited by light radiation of a suitable wavelength on the RC and photoinduced charge separation occurs within the cofactors of the RC, an electron being transferred from the excited primary donor P * to the MQ in the Q _A binding pocket becomes. If there is a suitable potential at the electrode to transfer an electron from the reduced menaquinone (MQ ^- ) to the electrode, there is still no current flow in the case of the probe oligonucleotide not hybridized with the target oligonucleotide, since the conductivity of the ss- Oligonucleotide in Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-MQ (RC) is very low or not at all. However, in the hybridized state (Au- S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-MQ (RC)) the conductivity is high, an electron can be transferred from MQ ^- to the electrode (to form MQ) and in the presence of a suitable redox-active substance, which reduces P ⁺ to P, the circuit is closed and further light absorption by the RC starts the cycle again. This is expressed amperometrically in a clear current flow between the electrode and the photo-inducible redox-active unit ( FIG. 2). This makes it possible to detect the sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides in a light-induced manner by amperometry.

Da die Redoxaktivität der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit - auch bei passendem Elektrodenpotential - erst durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge ausgelöst und maximal solange aufrechterhalten wird, wie die Lichteinstrahlung andauert, kann ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test- Site-Gruppe eines Oligomer-Chips räumlich aufgelöst werden, indem das Licht auf dieses Test-Site oder auf diese Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Dies birgt den Vorteil, dass die verschiedenen Test-Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer-Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden können und ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test- Site-Gruppen einfach durch Anlegen eines geeigneten äußeren Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei Lichteinstrahlung nur auf genau dieses Test-Site oder diese Test-Site Gruppe adressiert und amperometrisch detektiert werden kann. Die verschiedenen Test-Sites müssen also nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-) Elektroden aufgebracht werden.Because the redox activity of the thermostable, photo-inducible redox-active unit - too with suitable electrode potential - only more suitable when exposed to light Wavelength triggered and maintained for as long as the Exposure to light, a particular test site or test Site group of an oligomer chip can be spatially resolved by the light on this test site or to this test site group. This has the advantage that the different test sites (nucleic acid-oligomer combinations) have one Oligomer chips on a common, continuous, electrically conductive surface can be applied and a specific test site or test Site groups simply by applying a suitable external potential to the (entire) surface when exposed to light only on exactly this test site or this Test site group can be addressed and amperometrically detected. The Different test sites therefore do not have to be electrically isolated from each other isolated and for applying a potential and reading out the current individually controllable (micro) electrodes are applied.

Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden. Ein Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der Elektroreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronen-Transfer zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche und der thermostabilen, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid-Target.In addition, incorrect base pairings (base pair mismatches) can be caused by a changed cyclic voltammetric characteristic can be recognized. A mismatch expresses in a larger potential distance between the current maxima Electroreduction and electroreoxidation (reversal of electroreduction at reverse potential feed direction) or the electrooxidation and Electrode reduction in a cyclic voltammetric reversible electron transfer between the electrically conductive surface and the thermostable, photoinducible redox-active unit. This fact mainly affects the amperometric Detection cheap, because there the current can be tested at a potential at that the perfectly hybridizing oligonucleotide target delivers significant current, but not the incorrectly paired oligonucleotide target.

example 1 Representation of a menaquinone derivative with a reactive carboxylic acid group

1 g Menachinon-4 (Vitamin K2, 2-Methyl-3-(tetra-isoprenyl)-1,4-naphtochinon, Sigma- Aldrich) wird in 250 ml THF/100 ml H₂O gelöst. Danach wird unter Inertgasatmosphäre 2.4 g N-Brom-Hydroxysuccinimid (NBS) zugegeben, und das Reaktionsgemisch unter Inertgasatmosphäre bei 0°C 1.30 h unter Rühren inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird anschließend mit Essigsäureethylester ausgeschüttelt, mehrmals mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Na₂SO₄ getrocknet und der Essigsäureethylester bei reduziertem Druck am Rotationsverdampfer entfernt und mit Kieselgel-DC-Platten (Laufmittel Hexan: Essigsäureethylester, 3 : 1) gereinigt. Das Produkt (Addition von HOBr an die ω-Doppelbindung der Tetra-isoprenyl-Seitenkette, Rf ca. 0.4) wird in Toluol: Methanol: Hexan (1 : 3 : 1) gelöst, bei 0°C unter Inertgas mit 600 mg K₂CO₃, 50 mg pyro-Gallol und ca. 10 mg Ascorbat versetzt und unter langsamer Erwärmung auf Raumtemperatur 2 h unter Rühren inkubiert. Das Folgeprodukt (Epoxid- Bildung aus dem HOBr-Additionsprodukt an die ω-Doppelbindung der Tetra-isoprenyl- Seitenkette) wird, wie oben erwähnt über Ausschütteln und Kieselgel-DC (Rf ca. 0.3) isoliert, gereinigt und anschließend vom Epoxid zum Diol umgesetzt (Lösen in THF und bei 0°C unter Inertgas 4 ml H₂SO₄: THF (1 : 9) und ca. 5 mg Ascorbat zugegeben und 2 h rühren). Das Diol wird, wie oben beschrieben, isoliert und gereinigt (Rf ca. 0.15). Anschließend wird das Diol mit 2M H₂SO₄ zum Aldehyd und mit Cr(VI)-Oxid schließlich zur Carbonsäure oxidiert (Standardverfahren).1 g of menaquinone-4 (vitamin K2, 2-methyl-3- (tetra-isoprenyl) -1,4-naphthoquinone, Sigma-Aldrich) is dissolved in 250 ml of THF / 100 ml of H ₂ O. Then 2.4 g of N-bromo-hydroxysuccinimide (NBS) are added under an inert gas atmosphere, and the reaction mixture is incubated under an inert gas atmosphere at 0 ° C. for 1.30 h with stirring. The reaction mixture is then shaken out with ethyl acetate, washed several times with water, the organic phase is dried over Na ₂ SO ₄ and the ethyl acetate is removed under reduced pressure on a rotary evaporator and purified using silica gel TLC plates (mobile solvent hexane: ethyl acetate, 3: 1). The product (addition of HOBr to the ω double bond of the tetra-isoprenyl side chain, Rf approx. 0.4) is dissolved in toluene: methanol: hexane (1: 3: 1), at 0 ° C under inert gas with 600 mg K ₂ CO ₃ , 50 mg pyro-gallol and approx. 10 mg ascorbate are added and incubated with slow warming to room temperature for 2 hours with stirring. The subsequent product (epoxide formation from the HOBr addition product to the ω double bond of the tetra-isoprenyl side chain) is, as mentioned above, isolated by shaking and silica gel TLC (Rf approx. 0.3), purified and then converted from the epoxide to the diol (Dissolve in THF and at 0 ° C under inert gas, add 4 ml H ₂ SO ₄ : THF (1: 9) and approx. 5 mg ascorbate and stir for 2 h). The diol is isolated and purified as described above (Rf approx. 0.15). The diol is then oxidized to the aldehyde with 2M H ₂ SO ₄ and finally to the carboxylic acid using Cr (VI) oxide (standard method).

Example 2 Isolation of reaction centers from Chloroflexus aurantiacus

Zur Isolierung der Reaktionszentren werden Zellen von Chloroflexus aurantiacus, Stamm J- 10-f1, verwendet. Die Bakterien werden mit Tris-Puffer (10 mM Tris, pH = 9, 1 ml/g) suspendiert und im Potter homogenisiert. Nach Zusatz einer Spatelspitze DNAse werden die Zellen im Sonifier (Sonifier W-450, duty cycle 70%, output control 7) aufgeschlossen. Nicht aufgeschlossene Zellen werden pelletiert (Zentrifugation bei 10500 g für 30 min), der verbleibende Überstand wird anschließend bei 200000 g zentrifugiert. Das abzentrifugierte Pellet dieser Ultrazentrifugation enthält die Chromatophore (RCs in Membranen). Das Pellet wird in Tris-Puffer (10 mM), pH = 9 resuspendiert (bis zu einer optischen Dichte der Suspension von OD 12-14/cm bei 865 nm), mit 0.7% LDAO versetzt und für 1 h bei 4°C gerührt. Anschließend werden die aufgeschlossenen RCs durch Ultrazentrifugation abgetrennt (1 h bei 200000 g). Der Überstand enthält neben den RCs auch freies Bakteriochlorophyll a und c und Carotinoid, farbloses Protein, Cytochrom c₅₄₄ und andere niedermolekulare Verbindungen. Zur Aufreinigung wird der Überstand auf eine DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia, 300 × 26 mm) gegeben, die mit 10 mM Tris, pH = 9 equilibriert wurde. Die Säule wird mit 10 mM Tris, pH = 9, 0.3% LDAO gewaschen bis das Eluat farblos ist. Anschließend wird mit 10 mM Tris, pH = 9, unter Zusatz von 0.1% LDAO und 30 mM NaCl gewaschen. Die vorgereinigten RCs werden schließlich mit 10 mM Tris, pH = 9 unter Zusatz von 0.1% LDAO und 60 mM NaCl eluiert, auf das 3 fache mit 10 mM Tris, pH = 9, 0.1% LDAO verdünnt und die chromatographische Reinigung auf einer kleineren DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia, 100 × 16 mm) wiederholt. Vergleiche auch Aebersold, R. H. et al. 1986, J. Biol. Chem., Vol. 261, 4229-4238 und Shiozawa, J. A. et al. 1987, Biochemistry, Vol. 26, 8354-8359.Chloroflexus aurantiacus cells strain J-10-f1 are used to isolate the reaction centers. The bacteria are suspended with Tris buffer (10 mM Tris, pH = 9, 1 ml / g) and homogenized in the Potter. After adding a spatula tip DNAse, the cells are disrupted in the Sonifier (Sonifier W-450, duty cycle 70%, output control 7). Cells which have not been digested are pelleted (centrifugation at 10500 g for 30 min), the remaining supernatant is then centrifuged at 200000 g. The centrifuged pellet of this ultracentrifugation contains the chromatophores (RCs in membranes). The pellet is resuspended in Tris buffer (10 mM), pH = 9 (up to an optical density of the suspension of OD 12-14 / cm at 865 nm), mixed with 0.7% LDAO and stirred at 4 ° C. for 1 h . The digested RCs are then separated by ultracentrifugation (1 h at 200,000 g). In addition to the RCs, the supernatant also contains free bacteriochlorophyll a and c and carotenoid, colorless protein, cytochrome c ₅₄₄ and other low molecular weight compounds. For the purification, the supernatant is placed on a DEAE-Sephacel column (Pharmacia, 300 × 26 mm), which was equilibrated with 10 mM Tris, pH = 9. The column is washed with 10 mM Tris, pH = 9, 0.3% LDAO until the eluate is colorless. It is then washed with 10 mM Tris, pH = 9, with the addition of 0.1% LDAO and 30 mM NaCl. The pre-cleaned RCs are finally eluted with 10 mM Tris, pH = 9 with the addition of 0.1% LDAO and 60 mM NaCl, diluted 3-fold with 10 mM Tris, pH = 9, 0.1% LDAO and the chromatographic purification on a smaller DEAE -Sephacel column (Pharmacia, 100 x 16 mm) repeated. Compare also Aebersold, RH et al. 1986, J. Biol. Chem., Vol. 261, 4229-4238 and Shiozawa, JA et al. 1987, Biochemistry, vol. 26, 8354-8359.

Example 3 Remove the quinone cofactors from the isolated reaction centers Chloroflexus aurantiacus

Zur Entfernung der Chinon-Cofaktoren aus den isolierten Reaktionszentren (RCs) werden die RCs in TL-Puffer (10 mMM Tris, 0.1% LDAO, pH = 8) auf eine mit TL-Puffer equilibrierte DEAE-Cellulose Säule gegeben, mit einer auf 30°C temperierten Lösung aus 4 Vol.% LDAO (Lauryldimethyl-N-oxid), 10 mM Phenanthrolin, 1 mM Dithiothreit in TL-Puffer gespült (40 ml Lösung pro mmol RC) und anschließend die chinonbefreiten RCs mit TL-Puffer, der mit 300 mM NaCl versetzt ist, von der Säule gewaschen. Vergleiche auch Gunner, M. R. et al, 1986, Journal of Physical Chemistry, Vol. 90, S. 3783-3795.To remove the quinone cofactors from the isolated Reaction centers (RCs), the RCs in TL buffer (10 mMM Tris, 0.1% LDAO, pH = 8) placed on a DEAE cellulose column equilibrated with TL buffer, with one on 30 ° C tempered solution of 4 vol.% LDAO (lauryldimethyl-N-oxide), 10 mM Phenanthroline, 1 mM dithiothreitol in TL buffer (40 ml solution per mmol RC) and then the quinone-free RCs with TL buffer, which is mixed with 300 mM NaCl, washed from the column. See also Gunner, M.R. et al, 1986, Journal of Physical Chemistry, Vol. 90, pp. 3783-3795.

Example 4 Production of the Oligonucleotide Electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo- Spacer-UQ (RC)

Die Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) gliedert sich in 4 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des modifizierten Ubichinons (Redoxschritt) und der Rekonstitution des restlichen RCs (Rekonstitutionsschritt).The production of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-UQ (RC) is divided into 4 sections, namely the representation of the conductive surface, the derivatization of the surface with the probe oligonucleotide in the presence of a suitable monofunctional linker (Incubation step), the covalent attachment of the modified ubiquinone (redox step) and the reconstitution of the remaining RCs (reconstitution step).

Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon lonenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30% H₂O₂/70% H₂SO₄ von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher bereitete 1 × 10⁴ molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).The carrier material for the covalent attachment of the double-stranded oligonucleotides is formed by an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelet). For this purpose, freshly split mica was cleaned with an argon ion plasma in an electrical discharge chamber and gold (99.99%) was applied in a layer thickness of approximately 100 nm by electrical discharge. The gold film was then freed from surface impurities (oxidation of organic deposits) using 30% H ₂ O ₂ /70% H ₂ SO ₄ and immersed in ethanol for about 20 minutes in order to displace oxygen adsorbed on the surface. After rinsing the surface with bidistilled water, a previously prepared 1 × 10 ⁴ molar solution of the (modified) double-stranded oligonucleotide is applied to the horizontally stored surface, so that the entire gold surface is wetted (incubation step, see also below).

Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert. Zu einer 2 × 10⁴ molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0,1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde ca. 10^-4 bis 10^-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol gegeben (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge) und die Gold-Oberfläche eines Test- Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).For the incubation, a double-modified 12 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base thymine of the oligonucleotide on the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ . About 10 ^-4 to 10 ^-1 molar 2-hydroxy-mercaptoethanol was added to a 2 × 10 ⁴ molar solution of this oligonucleotide in HEPES buffer (0.1 molar in water, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations) given (or another thiol or disulfide linker of suitable chain length) and the gold surface of a test site completely wetted and incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxy-mercaptoethanol. The free 2-hydroxy-mercaptoethanol which is simultaneously present in the incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).

Die so mit einer Monolayer aus ss-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10^-3 molarem Chinon aus Beispiel 1, 10^-2 molarem EDC und 10^-2 molarem sulfo-NHS in HEPES-Puffer (0,1 molar (in Wasser, pH = 7.5), benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH- CH₂-CH₂-NH₂ Spacer und das modifizierte Chinonn eine kovalente Bindung aus (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der Säurefunktion des modifizierten UQ-50, Redoxschritt).The gold electrode modified with a monolayer of ss-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 ^-3 molar quinone from Example 1, 10 ^-2 molar EDC and 10 ^-2 molar sulfo -NHS in HEPES buffer (0.1 molar (in water, pH = 7.5)). After a reaction time of approx. 1-4 h, the -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ spacers and the modified quinone form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the acid function of the modified UQ-50, redox step).

Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von ca. 5 × 10^-5 molarem Ubichinon-50-freien RCs in 10 mM Tris, pH = 8, mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB bei ca. 4°C für ca. 12 h inkubiert, um das restliche RC an das Oligonukleotid-gebundene modifizierte UQ-50 zu rekonstituieren (Rekonstitutionsschritt). The gold electrode modified in this way was then washed with bidistilled water and with a solution of about 5 × 10 ^-5 molar ubiquinone-50-free RCs in 10 mM Tris, pH = 8, with 0.7 molar addition of TEATFB at about 4 ° C. incubated for approx. 12 h in order to reconstitute the remaining RC to the oligonucleotide-bound modified UQ-50 (reconstitution step).

Example 5 Comparison of the thermal stability of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides, Chromatium tepidum and Chloroflexus aurantiacus

Die thermische Stabilität von Reaktionszentren aus Chromatium tepidum, Chloroflexus aurantiacus und Rhodobacter sphaeroides wurde absorptionsspektroskopisch untersucht. Dazu wurden die isolierten RCs aus den verschiedenen Bakterien in TL-Puffer (20 mM Tris, 0.1% LDAO, pH = 8 für Rhodobacter sphaeroides bzw. pH = 8.5 für Chromatium tepidum und Chloroflexus aurantiacus) gelöst, die optische Dichte der RC-Lösungen auf OD = 1/cm bei 865 nm eingestellt und in eine temperierbare Küvette gefüllt. Die 865 nm Bande der RCs ist sensitiv für die Funktionalität der RCs, i. e. bei einen Funktionsverlust durch Denaturierung der RCs verschwindet diese Absorptionsbande zu mehr als 98%.The thermal stability of reaction centers from Chromatium tepidum, Chloroflexus aurantiacus and Rhodobacter sphaeroides was examined by absorption spectroscopy. To do this the isolated RCs from the different bacteria in TL buffer (20 mM Tris, 0.1% LDAO, pH = 8 for Rhodobacter sphaeroides and pH = 8.5 for Chromatium tepidum and Chloroflexus aurantiacus), the optical density of the RC solutions to OD = 1 / cm set at 865 nm and filled into a temperature-controlled cuvette. The 865 nm Band of the RCs is sensitive to the functionality of the RCs, i. e. at one Loss of function due to denaturation of the RCs disappears this absorption band more than 98%.

Die Temperatur wurde über einen umwälzbaren externen Thermostat eingestellt und die Absorption bei 865 nm in einem PE Lamda 40 Spektralphotometer über 2 h (Absorptionsmessungen alle 1 Minute) aufgenommen. Solche temperaturabhängigen Absorptionsmessungen wurden, beginnend bei 20°C, in 2°C-Schritten wiederholt. Die Thermostabilitäts-Temperatur T_T der RCs wird als diejenige Temperatur definiert, bei der die Absorption bei 865 nm zum ersten mal unter 92% der ursprünglichen Absorption (bei 20°C) gefallen ist. Das Reaktionszentrum Chloroflexus aurantiacus ist bis ca. 60°C stabil (T_T = 62°C), dasjenige aus Chromatium tepidum bis ca. 50°C (T_T = 48°C). RCs aus Rhodobacter sphaeroides besitzen eine thermische Stabilität bis ca. 40°C (T_T = 40°C). Vergleiche auch Nozawa, T.; Madigan, M. T.: J. Biochem. (1991) 110, 588-594.The temperature was set using a circulable external thermostat and the absorption at 865 nm was recorded in a PE Lamda 40 spectrophotometer over 2 h (absorption measurements every 1 minute). Such temperature-dependent absorption measurements were repeated in 2 ° C steps, starting at 20 ° C. The thermal stability temperature T _{T of} the RCs is defined as the temperature at which the absorption at 865 nm fell below 92% of the original absorption (at 20 ° C.) for the first time. The reaction center Chloroflexus aurantiacus is stable up to approx. 60 ° C (T _T = 62 ° C), that of Chromatium tepidum up to approx. 50 ° C (T _T = 48 ° C). RCs from Rhodobacter sphaeroides have a thermal stability up to approx. 40 ° C (T _T = 40 ° C). See also Nozawa, T .; Madigan, MT: J. Biochem. (1991) 110, 588-594.

Claims

1. By attaching a thermostable, photo-inducible redox-active unit modified nucleic acid oligomer, characterized in that the thermostable, photo-inducible redox-active unit is thermally stable up to a temperature of at least 40 ° C.

2. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1, characterized in that that the thermostable, photoinducible redox-active unit up to one Temperature of at least 50 ° C is thermally stable.

3. Modified nucleic acid oligomer according to claim 2, characterized in that that the thermostable, photoinducible redox-active unit up to one Temperature of at least 60 ° C is thermally stable.

4. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding claims, characterized in that the thermostable, photoinducible redoxactive Unit is a thermostable, photo-inducible redox-active protein or enzyme.

5. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding claims, characterized in that the thermostable, photoinducible redoxactive Unit is a thermostable photosynthetic reaction center.

6. Modified nucleic acid oligomer according to claim 5, characterized in that that the thermostable photosynthetic reaction center is a thermostable is a photosynthetic bacterial reaction center.

7. Modified nucleic acid oligomer according to claim 6, characterized in that that the thermostable photosynthetic bacterial reaction center The reaction center of the Chloroflexaceae is.

8. Modified nucleic acid oligomer according to claim 7, characterized in that that the reaction center of Chloroflexaceae is a reaction center Chloroflexus aurantiacus is.

9. Modified nucleic acid oligomer according to claim 6, characterized in that that the thermostable photosynthetic bacterial reaction center Chromatiaceae reaction center is.

10. Modified nucleic acid oligomer according to claim 9, characterized in that that the reaction center of the Chromatiaceae is a reaction center Chromatium tepidum is.

11. Use of a modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding claims in a method for electrochemical detection of nucleic acid oligomer hybridization events.

12. Use according to claim 11, wherein the detection is cyclovoltametric, done amperometrically or by conductivity measurement.