DE10127247A1 - Electrode chamber, for the electromanipulation of suspended biological cells, has an electrode carrier at the suspension container with paired electrodes at the flat carrier sides - Google Patents
Electrode chamber, for the electromanipulation of suspended biological cells, has an electrode carrier at the suspension container with paired electrodes at the flat carrier sidesInfo
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- DE10127247A1 DE10127247A1 DE2001127247 DE10127247A DE10127247A1 DE 10127247 A1 DE10127247 A1 DE 10127247A1 DE 2001127247 DE2001127247 DE 2001127247 DE 10127247 A DE10127247 A DE 10127247A DE 10127247 A1 DE10127247 A1 DE 10127247A1
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Behandlung suspendier ter biologischer Partikel mit elektrischen Feldern, insbesondere Elektrodenkammern zur Elektroporation und/oder Elektrofusion von biologischen Zellen oder Zellbestandteilen, Elektrodenträger für derartige Vorrichtungen und Verfahren zur Behandlung suspendier ter biologischer Partikel mit elektrischen Feldern, insbesondere Elektroporations- und Elektrofusionsverfahren.The invention relates to devices for the treatment of suspenders ter biological particles with electric fields, in particular Electrode chambers for electroporation and / or electrofusion of biological cells or cell components, electrode carriers for suspend such treatment devices and methods ter biological particles with electric fields, in particular Electroporation and electrofusion processes.
Die Behandlung von biologischen Zellen oder Zellbestandteilen mit elektrischen Feldern zur Modifizierung der Struktur und/oder stofflichen Zusammensetzung der behandelten Partikel ist allge mein bekannt (siehe U. Zimmermann, G. A. Neil, Eds. CRC Press, London, 1996 Electromanipulation of Cells). Bei der Elektropora tion wird die Membran biologischer Zellen unter Wirkung elektri scher Felder kurzzeitig reversibel durchbrochen, so dass Sub stanzen aus einer Suspensionsflüssigkeit in das Zellinnere ge schleust werden können. Bei der Elektrofusion werden zwei (oder mehr) Zellen oder Zellbestandteile unter Wirkung eines elektrischen Feldes miteinander fusioniert. Aufgaben der Elekt rofusion bestehen bspw. in der Erzeugung von Hybridzellen, die in einem gemeinsamen Zellkern genetische Materialen beider Fusi onspartner enthalten, oder von modifizierten Zellen, bei denen die Fusionsprodukte aus Zellen des einen Fusionspartners und Zellbestandteilen des zweiten Fusionspartners bestehen. Die zu letzt genannte Anwendung ist insbesondere bei der Modifizierung von antigentragenden Zellen (z. B. dendritischen Zellen) mit Be standteilen von Tumorzellen von Interesse.The treatment of biological cells or cell components with electrical fields to modify the structure and / or The material composition of the treated particles is general my known (see U. Zimmermann, G.A. Neil, Eds. CRC Press, London, 1996 Electromanipulation of Cells). At the Elektropora tion, the membrane of biological cells under the effect of electri fields are briefly reversibly broken, so that Sub punch out of a suspension liquid into the interior of the cell can be smuggled. In electro fusion, two (or more) cells or cell components under the action of a electric field fused together. Tasks of the electrical rofusion exist, for example, in the production of hybrid cells that genetic materials of both fusis in a common cell nucleus contain partners, or of modified cells in which the fusion products from cells of the one fusion partner and Cell components of the second fusion partner exist. The too the latter application is particularly in the modification of antigen-bearing cells (e.g. dendritic cells) with Be components of tumor cells of interest.
Herkömmliche Kammern zur Elektroporation oder -fusion biologi scher Partikel bestehen aus einem Suspensionsbehälter zur Auf nahme einer Zellsuspension und mehreren im Suspensionsbehälter angeordneten Elektroden. Die Elektroden sind elektrisch mit ei ner Steuereinrichtung verbunden, um anwendungsabhängig mit be stimmten Spannungen oder Spannungsfolgen beaufschlagt zu werden. Die Elektroden sind so geformt und angeordnet, dass in der Sus pensionsflüssigkeit inhomogene elektrische Felder zu elektri schen Behandlung der Zellen erzeugt werden. Erfahrungen mit den im Folgenden erläuterten Bauformen herkömmlicher Porations- oder Fusionskammern haben gezeigt, dass die Behandlungsergebnisse insbesondere von geometrischen Eigenschaften des Suspensionsbe hälters und der Elektrodenanordnung abhängen. Es ist insbesonde re erforderlich, dass die Suspensionsdichte zwischen den Elekt roden nicht zu hoch ist, da sonst bspw. bei der Elektroporation auf die Partikel verschieden starke elektrische Felder wirken oder bei der Elektrofusion unkontrollierbare Mehrfachfusionen auftreten. Überhöhte Suspensionsdichten ergeben nicht reproduzierbare Porations- oder Fusionsergebnisse.Conventional chambers for electroporation or biological fusion Shear particles consist of a suspension container for opening took one cell suspension and several in the suspension container arranged electrodes. The electrodes are electric with egg ner control device connected to be depending on the application tensions or voltage sequences to be applied. The electrodes are shaped and arranged so that in the Sus board liquid inhomogeneous electric fields to electri treatment of the cells. Experience with the In the following, designs of conventional Porations- or Fusion chambers have shown treatment results especially of geometric properties of the suspension depending on the holder and the electrode arrangement. It is in particular re required that the suspension density between the elect clearing is not too high, as otherwise, for example, during electroporation Electric fields of different strength act on the particles or uncontrollable multiple fusions in electrofusion occur. Excessive suspension densities do not result reproducible portioning or fusion results.
Bei hohen Suspensionsdichten ist zwar eine reversible Permeabi lisierung (Elektroporation) möglich. Es tritt jedoch das Problem auf, dass bspw. suspendierte Zellen je nach ihrer Position rela tiv zu den Elektroden unterschiedlichen Feldstärken ausgesetzt werden. Da die Elektroporation auf der Grundlage der integrier ten Laplace-Gleichung empfindlich von der Feldstärke abhängig ist, ergibt sich eine Variationsbreite des Permeabilisierungs grades der Zellen und damit der Transfektionsraten. Für eine möglichst gleichförmige Aufnahme von Fremdmolekülen in die per meabilisierten Zellen (geringe Variationsbreite) sollte die Zelldichte in der Suspension geringer als rund 106 Zellen/ml sein.At high suspension densities, reversible permeabilization (electroporation) is possible. However, the problem arises that, for example, suspended cells are exposed to different field strengths depending on their position relative to the electrodes. Since electroporation is sensitive to the field strength on the basis of the integrated Laplace equation, there is a range of variation in the degree of permeabilization of the cells and thus in the transfection rates. The cell density in the suspension should be less than around 10 6 cells / ml in order to ensure that foreign molecules are taken up as uniformly as possible in the cells that are meabilized (small variation range).
Bei der Erzeugung von Hybridzellen durch Elektrofusion ist die Hybridausbeute in der Regel wesentlich geringer als die Fusions ausbeute. Besonders hohe Hybridausbeuten wurden bisher mit der sog. Helixkammer (siehe z. B. DE 33 17 415) erzielt. In Fig. 9 ist die Helixkammer 101' zur Elektrofusion biologischer Zellen schematisch illustriert. Die Helixkammer 101' besteht aus einem zylinderförmigen Suspensionsbehälter 10', in dem ein tubusförmi ger Elektrodenträger 20' angeordnet ist. Auf den stark gekrümm ten Elektrodenträger 20' mit einem Durchmesser von rd. 1 cm ist ein Elektrodenpaar 30' gewickelt, das aus zwei parallelen Elekt rodendrähten 31', 32' mit einem Abstand von rund 200 µm besteht (siehe vergrößerte Ausschnittsdarstellung im unteren Teil von Fig. 9). Das Elektrodenpaar 30' ist über die Verbindungsleitun gen 40' mit einer Steuereinrichtung verbunden. Zur Durchführung einer Zellfusion wird eine Zellsuspension mit den Fusionspart nern in den Suspensionsbehälter 10' gefüllt. Anschließend wird der Elektrodenträger 20' eingeführt und das Elektrodenpaar 30' mit bestimmten Steuerspannungen beaufschlagt. Zunächst werden mittels Dielektrophorese Zellen aus der Suspension kettenartig zwischen den Elektrodendrähten ausgerichtet. Anschließend er folgt die Beaufschlagung des Elektrodenpaares 30' mit der ei gentlichen Fusionsspannung, unter deren Wirkung benachbarte Zel len in der ausgerichteten Kette Fusionsprodukte bilden.When generating hybrid cells by electrofusion, the hybrid yield is generally much lower than the fusion yield. To date, particularly high hybrid yields have been achieved with the so-called helix chamber (see, for example, DE 33 17 415). The helical chamber 101 'for the electrofusion of biological cells is illustrated schematically in FIG. 9. The helical chamber 101 'consists of a cylindrical suspension container 10 ', in which a tubular electrode carrier 20 'is arranged. On the strongly curved electrode carrier 20 'with a diameter of approx. 1 cm is a pair of electrodes 30 'wound, which consists of two parallel elect rod wires 31 ', 32 'with a distance of around 200 microns (see enlarged detail in the lower part of Fig. 9). The pair of electrodes 30 'is connected to a control device via the connecting lines 40 '. To carry out a cell fusion, a cell suspension is filled with the fusion partners in the suspension container 10 '. The electrode carrier 20 'is then inserted and the electrode pair 30 ' is subjected to certain control voltages. First, cells from the suspension are aligned in a chain-like manner between the electrode wires by means of dielectrophoresis. Then he follows the application of the electrode pair 30 'with the actual fusion voltage, under the effect of which neighboring cells form fusion products in the aligned chain.
Die Helixkammer 101' gemäß Fig. 9 hat sich zwar wegen der rela tiv hohen Hybridausbeute als vorteilhaft erwiesen. Sie besitzt aber auch eine Reihe von Nachteilen. Erstens ist es technisch extrem aufwendig, den Elektrodenträger 20' mit dem Elektroden paar 30' herzustellen. Die Elektrodendrähte 31', 32' besitzen jeweils eine Länge von rund einem Meter. Sie müssen auf dem Elektrodenträger 20' parallel mit Abstand voneinander aufgewi ckelt werden. Zweitens ist die Anwendung der Elektroden auf ei ner stark gekrümmten Oberfläche nachteilig für die Ausbildung definierter Feldbedingungen. Drittens ist die Anwendung der He lixkammer insbesondere in der Medizin nur beschränkt möglich. Wegen der unterschiedlichen Ausdehnungskoeffizienten der Elekt rodendrähte und des Elektrodenträgers können Helixkammern nicht autoklaviert werden. Es ist zwar eine Alkoholsterilisierung mög lich, die jedoch bei medizinischen Anwendungen nicht erlaubt ist. Des Weiteren eignet sich die Helixkammer nur für relativ geringe Suspensionsvolumina im ml-Bereich. Eine Mehrfachnutzung zur Fusionsbehandlung eines größeren Suspensionsvolumens würde aufwendige Reinigungsschritte erfordern und wäre daher sehr zeitaufwendig. Eine Neubefüllung der Kammer ist nur mit einem vollständig getrockneten Probenträger möglich. Schließlich ist die Helixkammer wegen der hohen Herstellungskosten nicht als Einwegprodukt (sog. Disposable-Produkt) geeignet.The helical chamber 101 'according to FIG. 9 has proven to be advantageous because of the relatively high hybrid yield. But it also has a number of disadvantages. First, it is technically extremely complex to manufacture the electrode carrier 20 'with the pair of electrodes 30 '. The electrode wires 31 ', 32 ' each have a length of around one meter. They have to be wound on the electrode carrier 20 'in parallel at a distance from one another. Second, the use of the electrodes on a strongly curved surface is disadvantageous for the formation of defined field conditions. Third, the use of the He lixkammer is only possible to a limited extent, particularly in medicine. Because of the different expansion coefficients of the electrical rod wires and the electrode carrier, helical chambers cannot be autoclaved. Alcohol sterilization is possible, but is not permitted in medical applications. Furthermore, the helix chamber is only suitable for relatively small suspension volumes in the ml range. A multiple use for the fusion treatment of a larger suspension volume would require complex cleaning steps and would therefore be very time consuming. The chamber can only be refilled with a completely dried sample holder. Finally, because of the high manufacturing costs, the helix chamber is not suitable as a disposable product.
Eine weitere, aus der Praxis allgemein bekannte Fusionskammer 102' ist schematisch in Fig. 10 illustriert. In einem Suspensi onsbehälter 10' sind mehrere Elektrodenträger 21' bis 24' angeordnet, die einseitig (21', 24') oder beidseitig (22', 23') auf ihren Seitenflächen jeweils aus einer einzigen flächigen Elektrode bestehen. Zwei gegenüberliegende Elektroden bilden ein Elektrodenpaar 30'. Die Elektrodenträger 21' bis 24' sind an ei ner gemeinsamen Halterung 25' angebracht, durch die auch Verbin dungsleitungen 40' zur Ansteuerung der Elektroden geführt sind. Die Seitenflächen der Elektrodenträger sind strukturiert gebil det, um zwischen den Elektroden benachbarter Elektrodenträger die zur Elektrofusion erforderlichen inhomogenen elektrischen Felder zu formen.Another fusion chamber 102 'which is generally known in practice is illustrated schematically in FIG. 10. In a suspension container 10 ', a plurality of electrode carriers 21 ' to 24 'are arranged, which on one side ( 21 ', 24 ') or on both sides ( 22 ', 23 ') each consist of a single flat electrode on their side faces. Two opposite electrodes form a pair of electrodes 30 '. The electrode carriers 21 'to 24 ' are attached to a common holder 25 ', through which connecting lines 40 ' are also guided to control the electrodes. The side faces of the electrode carriers are structured to form the inhomogeneous electric fields required for electrofusion between the electrodes of adjacent electrode carriers.
Zur Durchführung einer Elektrofusion wird die Fusionskammer 102' gemäß Fig. 10 mit einer Zellsuspension befüllt. Die Halterung 25' mit den Elektrodenträgern 21' bis 24' wird in den Suspensi onsbehälter 10' eingehängt. Zwischen den Elektroden benachbarter Elektrodenträger wird eine Spannung angelegt, so dass Zellen un ter Wirkung von Dielektrophorese kettenförmig zwischen den Elektroden ausgerichtet werden (siehe vergrößerter Ausschnitt in Fig. 10). Anschließend wird ein elektrischer Fusionspuls zur Fusion benachbarter Zellen ausgeübt. Mit der Fusionskammer gemäß Fig. 10 können zwar wegen der flächigen Ausbildung der Elektro den entsprechend den Seitenflächen der Elektrodenträger viele Zellen gleichzeitig fusioniert werden. Es ergeben sich aber auch eine Reihe von Nachteilen.To carry out an electrofusion, the fusion chamber 102 'according to FIG. 10 is filled with a cell suspension. The bracket 25 'with the electrode carriers 21 ' to 24 'is suspended in the suspension container 10 '. A voltage is applied between the electrodes of adjacent electrode carriers, so that cells are aligned in a chain-like manner between the electrodes under the effect of dielectrophoresis (see enlarged section in FIG. 10). An electrical fusion pulse is then applied to fuse neighboring cells. With the fusion chamber according to FIG. 10, many cells can be fused simultaneously because of the flat design of the electrodes corresponding to the side faces of the electrode carriers. However, there are also a number of disadvantages.
Zur Erzeugung einer genügend hohen Feldstärke dürfen die Elekt rodenträger lediglich Abstände im Submillimeter-Bereich besit zen. Die Ausrichtung der Elektrodenträger an der Halterung 25 muss mit hoher Präzision erfolgen. Die Herstellung der Fusions kammer ist teuer und aufwendig. Die enge Geometrie besitzt aber auch Nachteile für die Handhabbarkeit der Fusionskammer. In den Spalten zwischen den Elektrodenträgern können Luftblasen haften, so dass ggf. ganze Elektrodenbereiche ohne Kontakt mit der Zell suspension bleiben. Nach Durchführung der Fusion ist die Fusi onskammer schwer zu entleeren. Zellen bleiben aufgrund von Ka pillarkräften zwischen den Elektroden haften. Dies erschwert auch die Reinigung der Fusionskammer.To generate a sufficiently high field strength, the electrical rod carriers may only have distances in the submillimeter range. The alignment of the electrode carrier on the holder 25 must be done with high precision. The preparation of the fusion chamber is expensive and time-consuming. The narrow geometry also has disadvantages for the manageability of the fusion chamber. Air bubbles can adhere in the gaps between the electrode carriers, so that entire electrode areas may remain without contact with the cell suspension. After the merger has been carried out, the fuse chamber is difficult to empty. Cells stick between the electrodes due to capillary forces. This also makes cleaning the fusion chamber more difficult.
Ein weiterer Nachteil der Fusionskammer 102' gemäß Fig. 10 be steht in deren relativ hohen Totvolumen. Zellen außerhalb der äußeren Elektrodenträger 21' und 24' und Zellen in Bereichen mit verminderter Feldstärke (siehe z. B. bei 26') sind von der Elektrofusion ausgeschlossen. Die Effektivität der Fusionskammer gemäß Fig. 10 wird noch weiter dadurch verringert, dass sie nur geringe Hybridausbeuten ermöglicht. Die Anwendbarkeit der Fusi onskammer 102' ist wegen deren geringer Eignung zur Einwegnut zung in der Medizin nur beschränkt möglich.Another disadvantage of the fusion chamber 102 'shown in FIG. 10 is its relatively high dead volume. Cells outside the outer electrode carriers 21 'and 24 ' and cells in areas with reduced field strength (see eg at 26 ') are excluded from the electrofusion. The effectiveness of the fusion chamber according to FIG. 10 is reduced even further by the fact that it enables only low hybrid yields. The applicability of the fuse chamber 102 'is only possible to a limited extent because of its low suitability for one-way use in medicine.
Die Elektrofusion ist auch mit einem fluidischen Mikrosystem 103' durchführbar, wie es schematisch in Fig. 11 illustriert ist (siehe WO 00/37628). Im fluidischen Mikrosystem 103' wird der Suspensionsbehälter durch einen von Chipwänden 11', 12' be grenzten Fluidkanal 10' gebildet. Die Chipwände (Seitenwände oder Boden- und Deckwände) bilden die Elektrodenträger für die Elektroden 31', 32'. Jeweils zwei Elektroden auf einander gege nüberliegenden Seiten des Fluidkanals 10' bilden ein Elektroden paar 30'. Wie bei der Fusionskammer 102' erfolgt somit auch beim Mikrosystem 103' die Ausbildung der Fusionsfelder quer durch den Suspensionsbehälter 10'. Im Mikrosystem 103' können Zellen zell spezifisch im stehenden oder fließenden Medium fusioniert wer den. Die einzelnen Fusionsergebnisse können mit geeigneten Beo bachtungsmitteln (optische oder elektrische Messungen) sofort kontrolliert werden. Die praktische Anwendbarkeit für Zellfusio nen bspw. in der Medizin ist jedoch stark eingeschränkt, da die Effektivität der Fusion gering ist und die Herstellung der Mik rosysteme gegenwärtig relativ teuer ist.The electrofusion can also be carried out with a fluidic microsystem 103 ', as is illustrated schematically in FIG. 11 (see WO 00/37628). In the fluidic microsystem 103 ', the suspension container is formed by a fluid channel 10 ' delimited by chip walls 11 ', 12 '. The chip walls (side walls or bottom and top walls) form the electrode carriers for the electrodes 31 ', 32 '. Two electrodes each on opposite sides of the fluid channel 10 'form an electrode pair 30 '. As with the fusion chamber 102 ', the formation of the fusion fields also takes place across the suspension container 10 ' in the microsystem 103 '. In the microsystem 103 ', cells can be fused specifically to the cell in the standing or flowing medium. The individual fusion results can be checked immediately using suitable observation equipment (optical or electrical measurements). However, the practical applicability for cell fusions, for example in medicine, is severely restricted, since the effectiveness of the fusion is low and the manufacture of the microsystems is currently relatively expensive.
Ein generelles Problem herkömmlicher Porations- und Fusionskam mern besteht darin, dass die Zellsuspensionen in der Regel mit relativ hohen Zelldichten (z. B. rund 109 Zellen/ml) bereitge stellt werden, die Poration oder Fusion jedoch bei geringen Dichten im Bereich von 105 bis 106 Zellen/ml durchgeführt werden sollte. Es besteht zwar die Möglichkeit, die optimale Zelldichte durch Verdünnung einzustellen. Dadurch ergeben sich jedoch große Flüssigkeitsvolumen, zu deren Behandlung die herkömmlichen Kam mern nicht geeignet sind, da sie sich nicht einfach vergrößern lassen. Größere Elektrodenabstände würden höhere Spannungen zur Poration oder Fusion und eine Verringerung der Leitfähigkeit der Suspensionsflüssigkeit erfordern. Die zur Bereitstellung höherer Spannungen (im Bereich von bspw. 10 kV und darüber) notwendigen Geräte wären für praktische, insbesondere massenhafte Anwendun gen in der Medizin zu teuer und zu schwer.A general problem with conventional poration and fusion chambers is that the cell suspensions are usually provided with relatively high cell densities (e.g. around 10 9 cells / ml), but the poration or fusion at low densities in the range of 10 5 to 10 6 cells / ml should be performed. It is possible to set the optimal cell density by dilution. However, this results in large volumes of liquid, for the treatment of which the conventional chambers are not suitable, since they cannot simply be enlarged. Larger electrode spacings would require higher voltages for poration or fusion and a reduction in the conductivity of the suspension liquid. The devices required to provide higher voltages (in the range of, for example, 10 kV and above) would be too expensive and too heavy for practical, in particular mass applications in medicine.
Ein weiteres Problem herkömmlicher Kammern besteht in der be schränkten Beobachtbarkeit des Behandlungsergebnisses. Eine Überwachung bspw. einer Zellfusion ist zwar mit dem Mikrosystem 103' möglich, kann aber nur einzelzellspezifisch durchgeführt werden. Die simultane Überwachung einer Vielzahl von Fusionsvor gängen ist mit den herkömmlichen Vorrichtungen ausgeschlossen.Another problem with conventional chambers is the limited observability of the treatment result. Monitoring of a cell fusion, for example, is possible with microsystem 103 ', but can only be carried out on a cell-specific basis. The simultaneous monitoring of a variety of fusion processes is excluded with the conventional devices.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Vorrichtungen und Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Partikel be reitzustellen, mit denen die Nachteile der herkömmlichen Techni ken überwunden werden und die insbesondere die Behandlung größe rer Zellsuspensionsvolumen unter definierten und reproduzierba ren Feldbedingungen mit einer hohen Ausbeute ermöglichen. Die Erfindung soll ferner den praktischen Einsatz von Porations- und Fusionsverfahren in der Medizin vereinfachen. Erfindungsgemäße Vorrichtungen sollen ferner für eine vereinfachte Beobachtbar keit des Behandlungsergebnisses ausgelegt sein.The object of the invention is to provide improved devices and Process for the electrical treatment of biological particles with which the disadvantages of conventional techni can be overcome and the treatment size in particular rer cell suspension volume under defined and reproducible enable high-yield field conditions. The The invention is also intended for the practical use of portions and Simplify medical fusion procedures. invention Devices are also intended to be easier to observe be designed for the treatment result.
Diese Aufgaben werden mit einer Elektrodenkammer, einem Elektro denträger und einem Verfahren mit den Merkmalen gemäß den Pa tentansprüchen 1, 10 und 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsfor men und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängi gen Ansprüchen.These tasks are done with an electrode chamber, an electric carrier and a method with the features according to Pa claims 1, 10 and 12 solved. Advantageous execution Men and applications of the invention result from the dependent against claims.
Die Grundidee der Erfindung ist es, bei einer Elektrodenkammer, insbesondere zur Behandlung suspendierter biologischer Zellen oder Zellbestandteile, mindestens einen Elektrodenträger mit mindestens einem Elektrodenpaar vorzusehen, wobei der Elektro denträger einen Trägerkörper mit mindestens einer planaren Sei tenfläche besitzt, auf der das mindestens eine Elektrodenpaar angeordnet ist. Die Anordnung des mindestens einen Elektroden paares, dass insbesondere zur Erzeugung von Porations- oder Fu sionsfeldern eingerichtet ist, auf der planaren Seitenfläche des Elektrodenträgers besitzt den Vorteil, dass einerseits die güns tigen Feldverhältnisse realisiert werden können, wie sie an sich von der Helixkammer bekannt sind, und andererseits eine systema tische Behandlung großer Suspensionsvolumen mit hoher Ausbeute ermöglicht wird. Mit der mindestens einen planaren Seitenfläche des Elektrodenträgers wird eine Bezugsebene definiert. An die Bezugsebene angrenzend wird ein Halbraum gebildet, aus dem die zu behandelnden Partikel unter Wirkung negativer oder positiver Dielektrophorese zu den Elektroden abgestoßen oder angezogen werden können. In diesem Halbraum kann bei geeigneter Ansteue rung der Elektroden eine Elektroporationsbehandlung durchgeführt werden. Eine Elektrofusionsbehandlung hingegen erfolgt transver sal innerhalb der Bezugsebene oder parallel zur Ausrichtung der jeweils im Wesentlichen planaren Seitenfläche des Trägerkörpers.The basic idea of the invention is, in an electrode chamber, especially for the treatment of suspended biological cells or cell components, with at least one electrode carrier to provide at least one pair of electrodes, the electro a carrier body with at least one planar be ten surface on which the at least one pair of electrodes is arranged. The arrangement of the at least one electrodes couple that in particular for the production of Portions- or Fu Sionsfelder is set up on the planar side surface of the Electrode holder has the advantage that on the one hand the guns field conditions can be realized as they are are known from the helical chamber, and on the other hand a systema table treatment of large suspension volumes with high yield is made possible. With the at least one planar side surface a reference plane is defined for the electrode carrier. To the A half space is formed from the reference plane, from which the particles to be treated under the effect of negative or positive Dielectrophoresis repelled or attracted to the electrodes can be. In this half space, with suitable control an electroporation treatment become. Electrofusion treatment, on the other hand, takes place transversely sal within the reference plane or parallel to the orientation of the each essentially planar side surface of the carrier body.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind in einem Suspensionsbehälter mehrere Kompartimente gebildet, denen jeweils mindestens ein Elektrodenträger mit mindestens einem planar ausgerichteten Elektrodenpaar zugeordnet ist. Die Kompar timente können durch den Körper oder die Wände des Suspensions behälters gebildet werden, wie es bspw. von Titerplatten bekannt ist. In diesem Fall wird vorzugsweise in jedem Kompartiment min destens ein Elektrodenträger an den Boden- und/oder Deckflächen des Kompartimentes angeordnet. Es ist auch möglich, dass die Kompartimente durch die Elektrodenträger selbst gebildet werden. Der Suspensionsbehälter ist bspw. eine Wanne zur Aufnahme der Zellsuspension, in die mehrere Elektrodenträger als innere Teil wände einsetzbar sind. Diese Ausführungsform der Erfindung eig net sich besonders gut für die Behandlung großer Suspensionsvo lumina, wobei die einzelnen Elektrodenträger vorzugsweise se quenziell angesteuert werden, wie dies unten erläutert wird.According to a preferred embodiment of the invention, in formed a compartment several compartments, the in each case at least one electrode carrier with at least one planar aligned pair of electrodes is assigned. The Kompar moments can pass through the body or the walls of the suspension container are formed, as known for example from titer plates is. In this case min at least an electrode carrier on the floor and / or top surfaces of the compartment arranged. It is also possible that the Compartments are formed by the electrode carrier itself. The suspension container is, for example, a tub for receiving the Cell suspension in which several electrode carriers as an inner part walls can be used. This embodiment of the invention is particularly good for the treatment of large suspension voids lumina, the individual electrode carriers preferably se be controlled sequentially, as explained below.
Ein erfindungsgemäßer Elektrodenträger besteht vorzugsweise aus einem plattenförmigen, mindestens einseitig im Wesentlichen pla naren Trägerkörper mit zwei Seitenflächen. Je nach Anwendungs fall werden die Seitenflächen bei horizontaler Betriebsposition des Elektrodenträgers als obere und untere Seitenflächen und bei vertikaler Betriebsposition des Elektrodenträgers als vordere oder hintere Seitenflächen bezeichnet. Mindestens eine der Sei tenflächen trägt mindestens ein Elektrodenpaar, das aus zwei elektrisch voneinander getrennt angeordneten Elektroden besteht. Die Elektroden sind mit einer Steuereinrichtung verbunden und können zur Ausbildung bestimmter Feldverhältnisse im Halbraum, der an die Seitenfläche angrenzt, mit einer gemeinsamen Spannung oder zur Durchführung einer Fusionsbehandlung relativ zueinander mit vorbestimmten Fusionsspannungen beaufschlagt werden. Die Elektroden sind so geformt, dass zwischen den Elektroden eines Elektrodenpaares inhomogene elektrische Felder gebildet werden. Die Inhomogenität ist gegeben, wenn die elektrische Feldstärke im Bereich zwischen den benachbarten Elektroden ortsabhängig ist. Zur Erzeugung der Inhomogenität erfolgt vorzugsweise eine Formgebung oder Strukturierung der Elektroden und/oder der Sei tenflächen des Elektrodenträgers. Die Elektroden bilden elekt risch leitfähige Streifen, die aus der Seitenfläche des Elektro denträgers hervorragen. Sie werden bspw. durch fixierte Drähte oder Dünn- oder Dickschichten gebildet. Die ggf. vorgegebene Strukturierung des Elektrodenträgers umfasst hervorragende Teil bereiche, auf denen die Elektroden angeordnet sind.An electrode carrier according to the invention preferably consists of a plate-shaped, at least on one side essentially pla naren carrier body with two side surfaces. Depending on the application fall the side surfaces in the horizontal operating position of the electrode carrier as upper and lower side surfaces and at vertical operating position of the electrode carrier as the front or rear side surfaces. At least one of the be at least one pair of electrodes, which consists of two Electrodes are arranged separately from each other. The electrodes are connected to a control device and can be used to develop certain field conditions in the half space, that borders the side surface with a common tension or to perform a fusion treatment relative to each other be subjected to predetermined fusion voltages. The Electrodes are shaped so that between the electrodes one Electrode pair are formed inhomogeneous electric fields. The inhomogeneity is given when the electric field strength depending on the location in the area between the neighboring electrodes is. In order to generate the inhomogeneity, a preferably takes place Shaping or structuring of the electrodes and / or the screen surfaces of the electrode carrier. The electrodes form elect risch conductive strips that come from the side surface of the Elektro protrude. They are, for example, by fixed wires or thin or thick layers are formed. The default, if any Structuring the electrode carrier includes excellent part areas on which the electrodes are arranged.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Behandlung biologischer Par tikel mit elektrischen Feldern zeichnet sich dadurch aus, dass eine Suspension der zu behandelnden Teilchen, insbesondere der biologischen Zellen oder Zellbestandteile, in einen Suspensions behälter eingebracht wird, in dem eine Vielzahl von Elektroden trägern jeweils mit mindestens einem Elektrodenpaar auf mindes tens einer Seitenfläche angebracht ist, und eine Behandlung der Partikel zwischen den Elektrodenträgern erfolgt. Es ist vorzugs weise eine Vorbehandlung (z. B. Elektroporation) der Partikel zwischen den Elektrodenträgern und ein anschließendes di elektrophoretisches Sammeln der Partikel an mindestens einer Seitenfläche zwischen den Elektroden des mindestens einen Elekt rodenpaares vorgesehen. Dann erfolgt eine Elektrofusion durch dielektrophoretisches Ausrichten von Partikelketten zwischen den Elektrodenpaaren und anschließende Ausübung mindestens eines Fu sionspulses. Das Sammeln der Partikel und die Elektrofusion wer den bei Elektrodenkammern mit mehreren Kompartimenten vorzugs weise sequenziell in den einzelnen Kompartimenten zeitlich auf einanderfolgend durchgeführt.A method according to the invention for the treatment of biological par Items with electrical fields are characterized in that a suspension of the particles to be treated, especially the biological cells or cell components, in a suspension Container is introduced in which a variety of electrodes wear at least one pair of electrodes each at least one side surface is attached, and a treatment of the Particle occurs between the electrode carriers. It is preferred pretreatment (e.g. electroporation) of the particles between the electrode carriers and a subsequent di electrophoretically collecting the particles on at least one Side surface between the electrodes of the at least one elec Rodenpaares provided. Then an electrofusion takes place dielectrophoretic alignment of particle chains between the Electrode pairs and subsequent exercise of at least one foot sion pulses. Collecting the particles and electrofusion who preferred for electrode compartments with several compartments sequentially in the individual compartments carried out sequentially.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise mit der erfin dungsgemäßen Elektrodenkammer durchgeführt. Es ist aber auch möglich, insbesondere die genannte sequenzielle Behandlung einer in mehrere Kompartimente unterteilten Suspension mit gekrümmten Elektrodenträgern oder herkömmlichen Elektrodenträgern durchzu führen.The inventive method is preferably invented performed electrode chamber. It is also possible, in particular the sequential treatment of a suspension divided into several compartments with curved Electrode carriers or conventional electrode carriers to lead.
Gemäß einer vorteilhaften Gestaltung der Erfindung kann mindes tens ein Elektrodenträger mit den ausgerichteten Partikeln unter Beibehaltung der aktuellen Feldbedingungen aus dem Suspensions behälter entnommen und in eine Beobachtungs- und Messeinrichtung (z. B. Mikroskop) übertragen werden. Die unmittelbare Beobacht barkeit des aktuellen Zustandes der Partikel vor oder nach der Fusion stellt einen besonderen Vorteil der erfindungsgemäß ver wendeten planaren Elektrodenträger dar.According to an advantageous embodiment of the invention, at least least an electrode carrier with the aligned particles underneath Maintaining the current field conditions from the suspension container removed and into an observation and measuring device (e.g. microscope). The immediate observation Availability of the current state of the particles before or after Fusion represents a particular advantage of the ver used planar electrode supports.
Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Es wird erstmalig die Möglichkeit der elektrischen Behandlung suspen dierter Partikel in größeren Flüssigkeitsvolumina (1 ml bis ei nige 1) unter definierten, reproduzierbaren und gleichförmigen Feldverhältnissen geschaffen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist mit herkömmlichen Spannungsversorgungseinrichtungen kompati bel. Die erfindungsgemäßen Elektrodenträger sind kostengünstig herstellbar und als Einwegprodukte verwendbar. Der Suspensions behälter ist für alle Sterilisierungsverfahren geeignet und ins besondere autoklavierbar oder γ-sterilisierbar. Erfindungsgemäße Elektrodenkammern eignen sich damit für den massenhaften Einsatz in der Medizin. Die erfindungsgemäße Elektrodenkammer bildet ein vorteilhaftes Baukastensystem. In den Suspensionsbehälter sind anwendungsabhängig Elektrodenträger mit jeweils gleicher äußerer Form, jedoch verschiedenen Elektrodengeometrien einsetzbar. Die Elektrodenkammer ist zur Behandlung von Suspensionen mit belie bigen Dichten verwendbar, da eine Verdünnung auf beliebige Volu mina erfolgen kann. Erfindungsgemäße Elektrodenträger sind, ins besondere für eine Suspensionscharge, mehrfach nutzbar. Etwaige Benutzungsprobleme, wie sie bei der Helixkammer auftreten, wer den erfindungsgemäß vermieden. Bei Realisierung der Feldbedin gungen entsprechend den herkömmlichen Helixkammern wird erfin dungsgemäß eine hohe Hybridausbeute mit einer hohen Fusionsef fektivität bzw. einem hohen Fusionsdurchsatz verbunden.The invention has the following further advantages. It will for the first time the possibility of suspen electrical treatment dated particles in larger liquid volumes (1 ml to egg nige 1) under defined, reproducible and uniform Field relationships created. The device according to the invention is compatible with conventional voltage supply devices bel. The electrode carriers according to the invention are inexpensive producible and usable as disposable products. The suspension container is suitable for all sterilization processes and ins special autoclavable or γ-sterilizable. invention Electrode chambers are therefore suitable for mass use in the medicine. The electrode chamber according to the invention forms a advantageous modular system. Are in the suspension tank Depending on the application, the electrode holder has the same outer one Shape, but different electrode geometries can be used. The Electrode chamber is used for the treatment of suspensions other densities can be used, as a dilution to any volume mina can be done. Electrode carriers according to the invention are ins especially for a suspension batch, reusable. any Problems of use, as they occur with the helical chamber, who avoided according to the invention. When realizing the field conditions Conditions according to the conventional helical chambers are invented a high hybrid yield with a high fusion efficiency fectivity or a high fusion throughput.
Die erfindungsgemäßen Elektrodenträger können mit Vorteil an weitere Verfahrensschritte, wie z. B. eine Zellkultivierung, an gepasst sein, indem die Seitenfläche mit dem mindestens einem Elektrodenpaar selbst eine Kultivierungsfläche bildet. Im Unter schied zu herkömmlichen Fusionskammern ist die erfindungsgemäße Elektrodenkammer beliebig skalierbar. Es können insbesondere fluidische Mikrosysteme gebildet werden, bei denen die zur Elektrofusion vorgesehenen Elektroden lateral an einer gemein samen Trägerfläche (Kanalwand) vorgesehen sind. Erfindungsgemäße Elektrodenkammern sind sowohl als stationäre Systeme als auch als Durchflusssysteme geeignet.The electrode carrier according to the invention can be advantageous further process steps, such as. B. a cell cultivation be fitted by the side surface with the at least one Electrode pair itself forms a cultivation area. In the sub different from conventional fusion chambers is the invention Electrode chamber scalable as required. In particular, it can fluidic microsystems are formed, in which the for Electrofusion provided electrodes laterally on a common seed carrier surface (channel wall) are provided. invention Electrode chambers are both as stationary systems as well suitable as flow systems.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im Fol genden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:Further advantages and details of the invention are described in the fol described with reference to the accompanying drawings. Show it:
Fig. 1 eine schematische Perspektivansicht einer ers ten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Elektrodenkammer, Fig. 1 is a schematic perspective view of a ers th embodiment of an electrode chamber according to the invention,
Fig. 2 vergrößerte Schnittansichten von Seitenflächen erfindungsgemäßer Elektrodenträger, Fig. 2 are enlarged sectional views of side surfaces according to the invention the electrode support,
Fig. 3 eine schematische Schnittansicht einer weite ren Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Elektrodenkammer, Fig. 3 is a schematic sectional view of a wide ren embodiment of an electrode chamber according to the invention,
Fig. 4, 5 beispielhafte Draufsichten auf erfindungsgemä ße Elektrodenträger, Fig. 4, 5 are plan views of exemplary inventive SSE electrode carrier,
Fig. 6 eine Draufsicht auf eine Elektrodenkammer mit einer Vielzahl von Elektrodenträgern, Fig. 6 is a plan view of an electrode chamber having a plurality of electrode supports,
Fig. 7 eine vergrößerte Ausschnittsdarstellung von Elektrodenträgern gemäß Fig. 6, Fig. 7 is an enlarged detail illustration of electrode arrays of FIG. 6,
Fig. 8 eine schematische Perspektivansicht einer Elektrodenkammer mit einer Vielzahl von ge trennten Kompartimenten, und Fig. 8 is a schematic perspective view of an electrode chamber having a plurality of separated compartments ge, and
Fig. 9 bis 11 Illustrationen herkömmlicher Porations- oder Fusionskammern (Stand der Technik). Figure 9 to 11 Illustrations of conventional poration or fusion chambers (prior art)..
Gemäß der ersten, in Fig. 1 illustrierten Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Elektrodenkammer 100 einen Suspensionsbe hälter 110 mit mindestens einem Elektrodenträger 120, auf dem ein Elektrodenpaar 130 mit den Elektroden 131, 132 angeordnet ist. Der Suspensionsbehälter 110 besteht aus einer Wanne aus sterilisierbarem Kunststoff (z. B. PMMA) mit einer rechteckigen Bodenfläche 111 und senkrecht zur Bodenfläche 111 stehenden Sei tenwänden 112. Die vordere Seitenwand ist aus Übersichtlich keitsgründen in Fig. 1 nicht dargestellt.According to the first embodiment of the invention illustrated in FIG. 1, an electrode chamber 100 comprises a suspension container 110 with at least one electrode carrier 120 , on which an electrode pair 130 with the electrodes 131 , 132 is arranged. The suspension container 110 consists of a tub made of sterilizable plastic (z. B. PMMA) with a rectangular bottom surface 111 and perpendicular to the bottom surface 111 side walls 112th The front side wall is not shown for reasons of clarity in Fig. 1.
Es sind Positioniereinrichtungen 113 vorgesehen, an denen der Elektrodenträger 120 lösbar befestigt werden kann. Die Positio niereinrichtungen 113 umfassen bspw. Schienen und/oder Vorsprün ge, die vorzugsweise an der Innenseite der Bodenfläche 111 und/oder der Seitenwände 112 eine Aufnahme für die Ränder des Trägerkörpers 121 des Elektrodenträgers 120 bilden. Die Positio niereinrichtungen können ortsfest oder stufenlos verstellbar im Suspensionsbehälter angebracht sein. Alternativ können auch eine Vielzahl von Positioniereinrichtungen an verschiedenen Positio nen vorgesehen sein, um anwendungsabhängig den Elektrodenträger 120 entsprechend verschieden anzuordnen oder gleichzeitig eine Vielzahl von Elektrodenträgern vorzusehen (siehe Fig. 6). Positioning devices 113 are provided, to which the electrode carrier 120 can be detachably fastened. The positioning devices 113 comprise, for example. Rails and / or projections, which preferably form a receptacle for the edges of the carrier body 121 of the electrode carrier 120 on the inside of the bottom surface 111 and / or the side walls 112 . The positioning devices can be fixed or infinitely adjustable in the suspension container. Alternatively, a large number of positioning devices can also be provided at different positions, in order to arrange the electrode carrier 120 appropriately differently depending on the application or to provide a large number of electrode carriers at the same time (see FIG. 6).
Der mindestens eine Elektrodenträger 120 besteht aus einem plat tenförmigen Trägerkörper 121 mit einer vorderen (122) und einer hinteren (123) rechteckigen Seitenfläche. Der Trägerkörper 121 besteht aus einem ebenen, elektrisch isolierenden Material, z. B. aus Kunststoff oder Glas, und kann bspw. als Spritzgussteil hergestellt sein. Das Merkmal der Planarität des Trägerkörpers und damit der Seitenflächen bezieht sich auf deren Grundform im gesamten Bereich, in dem das Elektrodenpaar 130 angeordnet ist. Dem Merkmal der Planarität steht nicht entgegen, dass die Sei tenflächen im Bereich des Elektrodenpaares eine lokale Struktu rierung aufweisen (siehe unten, Fig. 2 und 3).The at least one electrode carrier 120 consists of a plat-shaped carrier body 121 with a front ( 122 ) and a rear ( 123 ) rectangular side surface. The carrier body 121 consists of a flat, electrically insulating material, for. B. made of plastic or glass, and can for example be made as an injection molded part. The feature of the planarity of the carrier body and thus of the side surfaces relates to their basic shape in the entire area in which the pair of electrodes 130 is arranged. The feature of planarity does not conflict with the fact that the side surfaces in the region of the pair of electrodes have a local structure (see below, FIGS . 2 and 3).
Auf mindestens einer Seitenfläche 122 ist das Elektrodenpaar 130 angeordnet. Die Elektroden 131, 132 sind jeweils aus geraden Elektrodenstreifen als ineinandergreifende Kammelektroden gebil det. Als Elektrodenmaterial kann jedes elektrisch leitfähige, gegenüber der jeweiligen Teilchensuspension inerte Material ver wendet werden. Die Elektroden bestehen vorzugsweise aus Edelme tallen, z. B. Gold oder Platin, inerten Legierungen, oder ggf. auch Kupfer oder Aluminium. Die Elektroden 131, 132 sind elekt risch voneinander getrennt und über Verbindungsleitungen 140 mit einer nicht dargestellten Steuereinrichtung verbunden.The pair of electrodes 130 is arranged on at least one side surface 122 . The electrodes 131 , 132 are each formed from straight electrode strips as interdigitated comb electrodes. Any electrically conductive material that is inert to the respective particle suspension can be used as the electrode material. The electrodes are preferably made of precious metals, e.g. As gold or platinum, inert alloys, or possibly copper or aluminum. The electrodes 131 , 132 are electrically separated from one another and connected via connecting lines 140 to a control device, not shown.
Zur Durchführung von Elektrofusionen in den lateralen Zwischen räumen zwischen den Elektroden 131, 132 in einer Ebene parallel zur Bezugsebene des Trägerkörpers 121 werden in den Zwischenräu men inhomogene elektrische Felder gebildet. Hierzu ragen die Elektroden aus der Oberfläche des Trägerkörpers 121 hervor. Ge mäß einer ersten Gestaltungsform der Erfindung (siehe Fig. 2a, c) ist die Seitenfläche 122 des Trägerkörpers 121 unstruktu riert und glatt ausgebildet. In diesem Fall sind die Elektroden 131, 132 in Dickschichttechnik oder als Elektrodendrähte aufge bracht. Die Elektroden 131, 132 bestehen bspw. aus aufgeklebten Folienstreifen des Elektrodenmaterials (Fig. 2a) oder aufge klebten Elektrodendrähten (Fig. 2c). Gemäß einer zweiten Ges taltungsform der Erfindung ist die Seitenfläche 122 des Träger körpers strukturiert mit abwechselnden Höhen und Tiefen ausge bildet (siehe Fig. 2b). In diesem Falle ist es auch möglich, die Elektroden 131, 132 in Dünnschichttechnik (z. B. durch Dampfabscheidung) aufzubringen. In Fig. 2b ist beispielhaft ei ne sinusförmig gewellte Seitenfläche 122 illustriert. Anwen dungsabhängig können auch beliebige andere Modulationen vorgese hen sein, bei denen in vorbestimmten Abständen entsprechend den Positionen der Elektroden hervorragende Bereiche (z. B. Stege oder dergleichen) gebildet sind. Die Aufbringung der kammartig angeordneten Elektroden 131, 132 durch Dampfabscheidung erfolgt vorzugsweise mit einer Maskierungstechnik.In order to carry out electrofusions in the lateral spaces between the electrodes 131 , 132 in a plane parallel to the reference plane of the carrier body 121 , inhomogeneous electric fields are formed in the spaces. For this purpose, the electrodes protrude from the surface of the carrier body 121 . Ge according to a first embodiment of the invention (see Fig. 2a, c), the side surface 122 of the support body 121 is unstructured and smooth. In this case, the electrodes 131 , 132 are brought up in thick-film technology or as electrode wires. The electrodes 131 , 132 consist, for example, of glued-on foil strips of the electrode material ( FIG. 2a) or glued-on electrode wires ( FIG. 2c). According to a second design form of the invention, the side surface 122 of the support body is structured with alternating heights and depths (see FIG. 2b). In this case, it is also possible to apply the electrodes 131 , 132 using thin-film technology (for example by vapor deposition). In Fig. 2b ei ne sinusoidally corrugated side surface 122 is exemplified. Depending on the application, any other modulations can also be provided, in which excellent regions (for example webs or the like) are formed at predetermined intervals in accordance with the positions of the electrodes. The comb-like electrodes 131 , 132 are preferably applied by vapor deposition using a masking technique.
Die geometrischen Eigenschaften der Elektrodenanordnung und/oder der Seitenflächenstrukturierung, insbesondere die Breite b und die Höhe h des Zwischenraumes zwischen benachbarten Elektroden, werden anwendungsabhängig gewählt. Für Fusionsvorgänge werden vorzugsweise b von 50 bis 200 µm und h von 5 bis 30 µm gewählt. Die Höhe h entspricht der Dicke des Elektrodenmaterials oder der Elektrodendrähte und/oder der Modulationstiefe der Seitenflä chenstrukturierung. Aufgedampfte Elektroden besitzen typischer weise eine Dicke im Bereich von 200 nm bis 1 µm.The geometric properties of the electrode arrangement and / or the side surface structuring, in particular the width b and the height h of the space between adjacent electrodes, are chosen depending on the application. For mergers preferably b selected from 50 to 200 microns and h from 5 to 30 microns. The height h corresponds to the thickness of the electrode material or Electrode wires and / or the modulation depth of the side surface chenstrukturierung. Evaporated electrodes are more typical have a thickness in the range of 200 nm to 1 µm.
Obwohl der erfindungsgemäße Elektrodenträger aus Materialen mit verschiedenen thermischen Ausdehnungskoeffizienten besteht, be sitzt er den besonderen Vorteil, problemlos autoklavierbar zu sein. Dies ergibt sich daraus, dass insbesondere im Vergleich zur Helixkammer (siehe Fig. 9) relativ kurze Elektrodenstreifen oder -drähte auf den Trägerkörper angeordnet sind.Although the electrode carrier according to the invention consists of materials with different coefficients of thermal expansion, it has the particular advantage of being easily autoclavable. This results from the fact that, in comparison with the helix chamber (see FIG. 9), relatively short electrode strips or wires are arranged on the carrier body.
Die Ausführungsform gemäß Fig. 1 mit mindestens einem Suspensi onsbehälter 110 mit dem entnehmbaren Elektrodenträger 120 be sitzt den Vorteil, dass der Elektrodenträger 120 jederzeit aus tauschbar ist und insbesondere als Einwegprodukt verwendet wer den kann. Alternativ ist es auch möglich, die Boden- oder Sei tenwände 111, 112 des Suspensionsbehälters 110 als Elektroden träger zu verwenden, wie dies bspw. in den Fig. 2 bis 5 ge zeigt ist.The embodiment according to FIG. 1 with at least one suspension container 110 with the removable electrode carrier 120 has the advantage that the electrode carrier 120 can be replaced at any time and in particular can be used as a disposable product. Alternatively, it is also possible to use the bottom or side walls 111 , 112 of the suspension container 110 as electrode carriers, as is shown, for example, in FIGS. 2 to 5.
Fig. 3 zeigt eine erfindungsgemäße Elektrodenkammer 100 mit ei nem wannenförmigen Suspensionsbehälter 110 mit einer bspw. run den oder rechteckigen Bodenfläche 111 und umlaufenden Seitenwän den 112. In den Suspensionsbehälter 110 ist ein Deckel 114 ein gehängt. Die Bodenfläche 111 und der Deckel 114 bilden selbst Elektrodenträger. Alternativ sind die Elektrodenträger als ge trennte Elemente an den Komponenten 111, 114 angebracht. Die zu einander weisenden ebenen Oberflächen der Bodenfläche 111 und des Deckels 114 entsprechen der Seitenfläche des Elektrodenträ ger 120 gemäß Fig. 1. Die Oberflächen können glatt mit hervor stehenden Elektrodenpaaren oder strukturiert geformt sein, wie es bspw. im rechten vergrößerten Ausschnitt von Fig. 3 illust riert ist. In diesem Falle ist die Strukturierung als eine Viel zahl von parallelen, hervorragenden Stegen mit halbkreisförmigem Querschnitt ausgebildet. Die Stege 123 sind selbst elektrisch voneinander isolierte Elektroden oder Träger von Elektroden streifen. Die Breite eines Steges 123 beträgt bspw. rund 200 µm. Die Bodenfläche 111 und der Deckel 114 sind vorzugsweise so aus gerichtet, dass die Stege einander gegenüberliegen. Der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Stegen beträgt bspw. 200 µm. Al ternativ zu der Ausführungsform gemäß Fig. 3 kann erfindungsge mäß auch vorgesehen sein, dass das mindestens eine Elektroden paar entweder auf der Bodenfläche 111 oder am Deckel 114 ange bracht ist. Fig. 3 shows an electrode chamber 100 according to the invention with egg NEM trough-shaped suspension container 110 with, for example, the or rectangular bottom surface 111 and circumferential side walls 112 . In the suspension container 110 , a lid 114 is hung. The bottom surface 111 and the cover 114 themselves form electrode carriers. Alternatively, the electrode carriers are attached to the components 111 , 114 as separate elements. The facing flat surfaces of the bottom surface 111 and the cover 114 correspond to the side surface of the electrode holder 120 according to FIG. 1. The surfaces can be smooth with protruding pairs of electrodes or structured, as shown, for example, in the enlarged section on the right of FIG. 3 is illustrated. In this case, the structuring is designed as a large number of parallel, outstanding webs with a semicircular cross section. The webs 123 are themselves electrodes that are electrically insulated from one another or strips of electrodes. The width of a web 123 is, for example, around 200 μm. The bottom surface 111 and the cover 114 are preferably aligned such that the webs are opposite one another. The distance between the opposite webs is, for example, 200 µm. As an alternative to the embodiment according to FIG. 3, it can also be provided according to the invention that the at least one pair of electrodes is placed either on the bottom surface 111 or on the cover 114 .
Es wird hervorgehoben, dass auch bei der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform eine laterale Elektrofusion in den Zwischenräu men zwischen den Elektroden (z. B. 131, 132) vorgesehen ist. Die einander benachbarten Elektroden sind elektrisch von einander getrennt mit einer (nicht dargestellten) Steuereinrichtung verbunden.It is emphasized that a lateral electrofusion is also provided in the interspaces between the electrodes (for example 131, 132) in the embodiment shown in FIG. 3. The adjacent electrodes are electrically separated from one another and connected to a control device (not shown).
Die Fig. 4 und 5 illustrieren die rechteckige oder runde Grundform des Suspensionsbehälters 110 gemäß Fig. 3 und insbe sondere der entsprechenden Bodenfläche 111 und des Deckels 114. Des Weiteren ist gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Elektroden träger allgemein auch in mindestens zwei, z. B. vier, Fusions felder F1 bis F4 unterteilt sein können. Jedes Fusionsfeld um fasst mindestens ein Elektrodenpaar, dass von den Elektrodenpaa ren der anderen Fusionsfelder getrennt angesteuert werden kann. Des Weiteren ist aus Fig. 5 ersichtlich, dass die Elektroden streifen eines Elektrodenpaares in der Ebene des Elektrodenträ gers auch gekrümmt verlaufen können. FIGS. 4 and 5 illustrate the rectangular or round basic shape of the suspension container 110 according to FIG. 3 and in particular sondere the corresponding bottom surface 111 and the cover 114. Furthermore, it is shown that the electrodes according to the invention generally also in at least two, z. B. four, fusion fields F1 to F4 can be divided. Each fusion field comprises at least one pair of electrodes that can be controlled separately from the electrode pairs of the other fusion fields. Furthermore, it can be seen from FIG. 5 that the electrode strips of a pair of electrodes can also be curved in the plane of the electrode carrier.
Die Fig. 6 und 7 illustrieren schematisch eine erfindungsge mäße Elektrodenkammer mit einer Vielzahl von Elektrodenträgern. Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders vorteilhaft zur Elektrobehandlung großer Suspensionsvolumen, insbesondere in der Medizin, anwendbar. Die in Fig. 6 in schematischer Drauf sicht illustrierte Elektrodenkammer 100 ist im Wesentlichen ana log zur Elektrodenkammer 100 gemäß Fig. 1 aufgebaut. Der Sus pensionsbehälter 110 besteht aus einer Wanne mit einer Bodenflä che (nicht dargestellt) und den Seitenwänden 112. In den Suspen sionsbehälter 110 sind bspw. elf Elektrodenträger 120 einge setzt. Die Elektrodenträger werden auch als Schieber bezeichnet. Als Positioniereinrichtung 113 dienen senkrecht in einer der Seitenwände 112 verlaufende Nuten mit einer Breite entsprechend der Dicke der Trägerkörper 121 der Elektrodenträger 120. Jeder Elektrodenträger 120 trägt ein- oder beidseitig mindestens ein Elektrodenpaar (nicht dargestellt), das jeweils mit einer eige nen Steuereinrichtung mit einer Spannungsversorgung verbunden ist. Vorzugsweise sind jedoch alle Elektrodenpaare gemeinsam über eine Schalteinrichtung mit der Steuereinrichtung mit einer Spannungsversorgung verbunden. FIGS. 6 and 7 schematically illustrate a erfindungsge Permitted electrode chamber having a plurality of electrode supports. This embodiment of the invention can be used particularly advantageously for the electrical treatment of large suspension volumes, in particular in medicine. The electrode chamber 100 illustrated in a schematic top view in FIG. 6 is constructed essentially analogously to the electrode chamber 100 according to FIG. 1. The suspension container 110 consists of a tub with a bottom surface (not shown) and the side walls 112 . In the suspension container 110 , for example, eleven electrode carriers 120 are inserted. The electrode carriers are also called sliders. Grooves running vertically in one of the side walls 112 and having a width corresponding to the thickness of the carrier bodies 121 of the electrode carriers 120 serve as the positioning device 113 . Each electrode carrier 120 carries on one or both sides at least one pair of electrodes (not shown), each of which is connected to its own control device with a voltage supply. However, all the electrode pairs are preferably connected to the control device with a voltage supply together via a switching device.
In Fig. 7 sind Einzelheiten der in Fig. 6 eingerahmten Elekt rodenträger 120a, 120b vergrößert dargestellt. Auf den jeweili gen Trägerkörpern sind beidseitig parallel verlaufend Elektroden in Drahtform aufgebracht. Die Elektroden besitzen bspw. eine Drahtdicke d von rund 200 µm und eine lateralen Abstand b be nachbarter Drähte von 200 µm. Auf jeder Seitenfläche jedes Elektrodenträgers 120a, 120b ist jeweils mindestens ein Elektro denpaar 130 mit zwei Elektroden 131, 132 vorgesehen. Die Elekt rodenträger sind im Suspensionsbehälter 110 parallel so angeord net, dass der Abstand a einander gegenüberliegender Elektroden rund 400 µm beträgt.In Fig. 7 details of the framed in Fig. 6 Elektro rodträger 120 a, 120 b are shown enlarged. Electrodes in wire form are applied in parallel on both sides of the respective carrier bodies. The electrodes have, for example, a wire thickness d of approximately 200 μm and a lateral distance b of adjacent wires of 200 μm. At least one pair of electrodes 130 with two electrodes 131 , 132 is provided on each side surface of each electrode carrier 120 a, 120 b. The electric rod carriers are arranged in parallel in the suspension container 110 in such a way that the distance a between opposing electrodes is around 400 μm.
Der Suspensionsbehälter 110 wird durch die Elektrodenträger 120 in Kompartimente unterteilt. Anwendungsabhängig können die Posi tioniereinrichtungen mit einem vorbestimmten Abstand vorgesehen sein, der den Abstand der Elektrodenträger und damit die Größe der Kompartimente festlegt. Alternativ können die Positionier einrichtungen auch mit einem feinen Rastermaß, bspw. wie die seitlichen Schienen eines Objektträgerkastens, angeordnet sein, so dass der Nutzer die Elektrodenträger je nach Aufgabenstellung an verschiedenen Positionen einsetzen kann.The suspension container 110 is divided into compartments by the electrode carriers 120 . Depending on the application, the positioning devices can be provided at a predetermined distance, which defines the distance between the electrode carriers and thus the size of the compartments. Alternatively, the positioning devices can also be arranged with a fine pitch, for example, like the side rails of a slide case, so that the user can use the electrode holder at different positions depending on the task.
Die Elektrodenkammer gemäß Fig. 6 ist mit besonderem Vorteil zur Durchführung von mehrschrittigen elektrischen Behandlungen biologischer Zellen oder Zellbestandteile (z. B. Membranteile, Organellen) geeignet. Sie wird insbesondere in der folgenden Weise als Porations- und Fusionskammer verwendet.The electrode chamber according to FIG. 6 is particularly suitable for carrying out multi-step electrical treatments of biological cells or cell components (e.g. membrane parts, organelles). It is used in particular in the following manner as a poration and fusion chamber.
In einem ersten Schritt wird der Suspensionsbehälter 110 der Elektrodenkammer 100 mit Elektrodenträgern in gewünschter Anzahl und gewünschten Abständen bestückt. Die Eingangssuspension mit den zu behandelnden Partikeln wird verdünnt, um eine vorbestimm te Suspensionsdichte einzustellen. Anschließend wird die ver dünnte Suspension in die Elektrodenkammer 100 eingefüllt. Alle Kompartimente sind gleichmäßig befüllt. Die Partikel umfassen bspw. Zellen oder Zellgemische, aus denen bestimmte Zellen mit einander fusioniert werden sollen. Es kann eine Vorbehandlung der Zellsuspension durch Elektroporation vorgesehen sein. Die Elektroporation ist bspw. darauf gerichtet, durch Ausübung eines kritischen Feldpulses Zellen mit einem Durchmesser oberhalb ei nes vorbestimmten kritischen Durchmessers zu zerstören. Dadurch wird die Größenverteilung der in der Suspension enthaltenen Zel len verschmälert. Die an der nachfolgenden Elektrofusion betei ligten Zellen unterliegen geringeren Größenvariationen. Die Fu sionsspannungen können dadurch optimiert und das Fusionsergebnis verbessert werden.In a first step, the suspension container 110 of the electrode chamber 100 is equipped with electrode carriers in the desired number and desired intervals. The input suspension with the particles to be treated is diluted in order to set a predetermined suspension density. The diluted suspension is then filled into the electrode chamber 100 . All compartments are filled evenly. The particles comprise, for example, cells or cell mixtures from which certain cells are to be fused with one another. Pretreatment of the cell suspension by electroporation can be provided. Electroporation is directed, for example, to destroy cells with a diameter above a predetermined critical diameter by exerting a critical field pulse. This narrows the size distribution of the cells contained in the suspension. The cells involved in the subsequent electrofusion are subject to smaller size variations. The fusion stresses can thus be optimized and the fusion result improved.
Zur Durchführung der Elektroporation werden alle Elektroden 131, 132 auf einer Seitenfläche eines Elektrodenträgers zu einer strukturierten Porationselektrode zusammengeschaltet. Zwischen die so gebildeten Porationselektroden zweier benachbarter Elekt rodenträger wird die Porationsspannung angelegt. In den Berei chen zwischen den einander gegenüberliegenden Elektrodenteilen (siehe Bezugszeichen 133 in Fig. 7) kommt es zum Porations durchschlag der Zellen. Durch Einstellung der Feldstärke kann die Zellgröße, oberhalb derer die Elektroporation erfolgt, fest gelegt werden.To carry out the electroporation, all electrodes 131 , 132 are connected together on one side surface of an electrode carrier to form a structured poration electrode. The poration voltage is applied between the poration electrodes formed in this way of two adjacent elect rod carriers. In the areas between the opposing electrode parts (see reference numeral 133 in Fig. 7) there is a porosity breakdown of the cells. By adjusting the field strength, the cell size above which the electroporation takes place can be determined.
Anschließend erfolgt ein dielektrophoretisches Sammeln der im Zwischenraum a zwischen den Elektrodenträgern befindlichen Zel len in die Nähe der Elektroden 131, 132. In diesem Zustand wer den die Elektroden zur Durchführung die Elektrofusion umgeschal tet. Zunächst wird zwischen benachbarte Elektroden 131, 132 eine Fusionsspannung zur Ausrichtung der Zellen als Kette (siehe z. B. bei Bezugszeichen 134) angelegt. Anschließend erfolgt in an sich bekannter Weise die Ausübung des Fusionspulses. Nach Ausübung des Fusionspulses kann eine Stabilisierungs- oder Alignmentspan nung angelegt werden, um die Fusionsprodukte in an sich bekann ter Weise zu stabilisieren. In weiteren Verfahrensschritten kön nen die Fusionsprodukte unter Wirkung dielektrophoretischer Kräfte in den Abstand a zwischen den Elektrodenträgern zurückge drängt werden, um dort ggf. weiteren Porationsschritten unterzo gen zu werden. Des Weiteren ist es möglich, einen oder mehrere Elektrodenträger im Zustand der ausgerichteten Zellketten mit angelegter Fusionsspannung aus dem Suspensionsbehälter 110 vorü bergehend zu entnehmen und mit einer Mess- und Beobachtungsein richtung (z. B. Mikroskop) zu untersuchen.This is followed by a dielectrophoretic collection of the cells located in the intermediate space a between the electrode carriers in the vicinity of the electrodes 131 , 132 . In this state, the electrodes are switched to carry out the electrofusion. First, a fusion voltage is applied between adjacent electrodes 131 , 132 to align the cells as a chain (see, for example, reference number 134 ). The fusion pulse is then carried out in a manner known per se. After exercise of the fusion pulse, a stabilization or alignment tension can be applied in order to stabilize the fusion products in a manner known per se. In further process steps, the fusion products can be pushed back under the effect of dielectrophoretic forces into the distance a between the electrode carriers in order to be subjected to further poration steps if necessary. Furthermore, it is possible to temporarily remove one or more electrode carriers in the state of the aligned cell chains with applied fusion voltage from the suspension container 110 and to examine them with a measuring and observation device (e.g. microscope).
Die erfindungsgemäße Elektrodenkammer ermöglicht eine neuartige Verfahrensweise bei der Elektrofusion, bei der auch große Sus pensionsvolumen mit herkömmlichen Spannungsquellen einer Fusi onsbehandlung unterzogen werden können. Die Suspensionsvolumen werden durch die Elektrodenträger in die Kompartimente unter teilt. Zur Elektrobehandlung der gesamten Suspension erfolgt ei ne schrittweise Behandlung der einzelnen Kompartimente, in dem sequenziell jeweils die zueinander weisenden Elektrodenpaare zweier benachbarter Elektrodenträger in der oben erläuterten Weise angesteuert werden. Zur sequenziellen Ansteuerung ist die oben genannte Schalteinrichtung vorgesehen, die nach Art eines Multiplexers jeweils zwei Elektrodenträger mit der Steuerein richtung zur Durchführung der elektrischen Behandlung der Zellen verbindet. Mit relativ geringen Feldstärken von z. B. 1.5 kV/cm können auch große Suspensionsvolumen bis in den l-Bereich behan delt werden.The electrode chamber according to the invention enables a new type Procedure for electrofusion, in which large Sus pension volume with conventional voltage sources from a Fusi ons treatment. The suspension volume are placed in the compartments by the electrode carrier Splits. For the electrical treatment of the entire suspension there is an egg ne gradual treatment of the individual compartments in which sequentially each of the electrode pairs facing each other two adjacent electrode carriers in the above Be controlled in a way. For sequential control, the Above switching device provided, which in the manner of a Multiplexers each have two electrode carriers with the control unit Direction for performing the electrical treatment of the cells combines. With relatively low field strengths of e.g. B. 1.5 kV / cm can handle large suspension volumes down to the l range be delt.
Bei der Elektrodenkammer 100 gemäß Fig. 6 ergeben sich die be sonderen Vorteile. Durch die Elektrodenträger werden einzelne Module gebildet, die zeitlich aufeinander folgend oder sequen ziell angesteuert werden können. Die Moduleinsätze sind insbe sondere bei der Realisierung mit schieberartigen Elektrodenträ gern einfach herstellbare Einwegprodukte. Dies ist eine Voraus setzung für medizinische Anwendungen. Die Suspensionsbehälter an sich können einfach sterilisiert werden. Je nach der Seitenflä chengröße der Elektrodenträger, der Zahl der Fusionsfelder (sie he Fig. 4, 5) und/oder der Zahl der Elektrodenträger können kleinere oder größere Zellmengen oder kleinere oder größere Sus pensionsvolumen bearbeitet werden. Die bisher verwendeten Proto kolle für die elektrische Behandlung von Zellen oder Zellbe standteilen, wie sie an sich von herkömmlichen Helixkammern oder Porationskammern bekannt sind, können ohne Veränderungen über nommen werden. Es wird eine hohe Fusionsausbeute erzielt. Wenn der Abstand der Elektrodenträger bis zu rund 500 µm beträgt, ist sichergestellt, dass alle Zellen zwischen den Elektrodenträgern zur Fusion in die lateralen Abstände zwischen den einzelnen Elektroden gezogen werden können. Des Weiteren können alle Zel len poriert werden. Durch die Poration kann die Suspensionsdich te und/oder die Größenverteilung der Zellen optimal eingestellt werden. Die Spannung zur Ansteuerung der Elektroden reicht aus, um sowohl die Fusion als auch die Poration in isoosmolarer Lö sung durchzuführen. Die Elektrodenkammer gemäß Fig. 6 kann auch als fluidisches Mikrosystem aufgebaut sein, bei dem die Elektro den an Kanalwänden angebracht sind und insbesondere eine latera le Behandlung der Partikel zwischen jeweils an einer Wand be nachbarten Elektroden erfolgt. In diesem Fall kann die Zahl der den Elektrodenträgern entsprechenden Ebenen um ein Vielfaches, z. B. auf 1000 oder mehr erhöht werden.In the electrode chamber 100 shown in FIG. 6, there are special advantages. Individual modules are formed by the electrode carriers, which can be controlled sequentially or sequentially. The module inserts are particularly easy to manufacture single-use products when they are realized with slide-like electrode supports. This is a requirement for medical applications. The suspension containers themselves can easily be sterilized. Depending on the side surface size of the electrode carrier, the number of fusion fields (see FIGS . 4, 5) and / or the number of electrode carriers, smaller or larger cell quantities or smaller or larger suspension volumes can be processed. The protocols previously used for the electrical treatment of cells or Zellbe components, as are known per se from conventional helical chambers or poration chambers, can be adopted without changes. A high fusion yield is achieved. If the distance between the electrode carriers is up to around 500 µm, it is ensured that all cells between the electrode carriers can be drawn into the lateral distances between the individual electrodes for fusion. Furthermore, all cells can be pored. The poration allows the suspension density and / or the size distribution of the cells to be optimally adjusted. The voltage to control the electrodes is sufficient to carry out both the fusion and the poration in isoosmolar solution. The electrode chamber of Fig. 6 may also be constructed as a fluidic microsystem, in which the electric to be mounted on duct walls and in particular a latera le treatment of the particles is performed between each be on a wall adjacent electrodes. In this case, the number of levels corresponding to the electrode carriers can be many times, e.g. B. can be increased to 1000 or more.
Ein weiterer Vorteil ergibt sich insbesondere bei Elektrodenkam mern mit dem in Fig. 8 schematisch illustrierten Aufbau. Diese Elektrodenkammern sind nach Art herkömmlicher Titer- oder Kulti vierungskammern aufgebaut. Die einzelnen Kompartimente werden durch mehrere Vertiefungen im Körper des Suspensionsbehälters 110 gebildet. In jedem Kompartiment ist mindestens ein Elektro denträger vorgesehen, wie dies oben unter Bezug auf die Fig. 3 bis 5 erläutert wurde. Bei diesen Elektrodenkammern können die Zellen nach der Poration oder der Fusion in den einzelnen Kom partimenten kultiviert werden. Eine Übertragung in andere Kulti vierungsträger wird vermieden, so dass Fehler bei der Zellzuord nung und Zellverluste ausgeschlossen sind. Another advantage arises in particular in electrode chambers with the structure schematically illustrated in FIG. 8. These electrode chambers are constructed in the manner of conventional titer or cultivation chambers. The individual compartments are formed by a plurality of depressions in the body of the suspension container 110 . In each compartment at least one electric carrier is provided, as was explained above with reference to FIGS . 3 to 5. With these electrode chambers, the cells can be cultured in the individual compartments after the poration or fusion. A transfer to other cultivation carriers is avoided, so that errors in cell assignment and cell loss are excluded.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.The in the above description, the claims and the Drawings disclosed features of the invention can both individually as well as in any combination for the entanglement chung of the invention in its various forms of Be meaningful.
Claims (15)
der Elektrodenträger (120) durch einen Trägerkörper (121) mit mindestens einer planaren Seitenfläche (122, 123) gebildet wird, und
das mindestens eine Elektrodenpaar (130) auf der Seitenfläche (122, 123) angeordnet ist.1. Electrode chamber ( 100 ), in particular for the treatment of suspended biological cells and / or cell components, with a suspension container ( 110 ) in which at least one electrode holder ( 120 ) with at least one pair of electrodes ( 130 ) is arranged, characterized in that
the electrode carrier ( 120 ) is formed by a carrier body ( 121 ) with at least one planar side surface ( 122 , 123 ), and
the at least one pair of electrodes ( 130 ) is arranged on the side surface ( 122 , 123 ).
- - Anordnen von mindestens einem Elektrodenträger (120) mit min destens einem Elektrodenpaar (130) in einem Suspensionsbehälter mit einer Suspension der zu behandelnden Zellen und/oder Zellbe standteile,
- - dielektrophoretisches Sammeln von Zellen und/oder Zellbestand teilen zwischen den Elektroden eines Elektrodenpaares, und
- - Ausrichten und Fusionieren von Zellen und/oder Zellbestandtei len zwischen den Elektroden.
- Arranging at least one electrode carrier ( 120 ) with at least one pair of electrodes ( 130 ) in a suspension container with a suspension of the cells to be treated and / or cell components,
- - Dielectrophoretic collection of cells and / or cell stock share between the electrodes of a pair of electrodes, and
- - Aligning and fusing cells and / or cell components between the electrodes.
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