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Die
Erfindung betrifft eine Probenmanipulationsvorrichtung, die eine
Beobachtungseinheit, mit der eine Probe beobachtet und eine Soll-Position,
an der sich ein zu entnehmender Teil der Probe befindet, ausgewählt wird,
einen Probentisch, der die Probe aufnimmt, ein räumlich relativ zur Beobachtungseinheit
verstellbares Manipulationswerkzeug mit einer auswechselbaren Manipulationsspitze,
mit der der Probe Teile entnommen werden, eine Steuereinheit, mit
der die Verstellung des Manipulationswerkzeugs gesteuert wird, sowie
eine mit der Steuereinheit verbundene optische Positionsmeßeinheit
umfaßt.
Die Erfindung betrifft Schwierigkeiten in der Handhabung, die auftreten,
wenn eine Probe beobachtet wird und gleichzeitig an ihr Manipulationen
vorgenommen werden, die über
die Beobachtungseinheit überwacht werden.
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In
der medizinischen, biologischen und biochemischen Forschung gewinnen
Fragestellungen, bei denen Experimente mit einzelnen Zellen durchgeführt werden,
immer mehr an Bedeutung. Ein wichtiges Beispiel hierfür ist die
Analyse und Aufklärung molekularer
Regelmechanismen bzw. sogenannter Molekülkaskaden. Dabei wird die interessierende Zelle
aus dem Zellverband herausgelöst
und in eine für
den Fortbestand der Zelle geeignete Nährlösung transferiert. Unter günstigen
Bedingungen wird die Ausgangszelle solange vermehrt, bis ausreichend Material
für das
vorgesehene analytische Verfahren vorhanden ist; es werden sogenannte
Zelllinien hergestellt. Ein wesentlicher Nachteil der Methode der Herstellung
von Zelllinien ist, daß die
Ausgangszelle und die von dieser abstammenden Zellen idealisierte Umweltbedingungen
vorfinden. Analytische Ergebnisse, die auf diesem Weg erzielt werden,
geben nicht die Bedingungen wieder, die im Organismus tatsächlich vorliegen.
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Auch
neurobiologische Fragestellungen können auf diese Weise nicht
oder nur unzureichend beantwortet werden. Beispielsweise repräsentiert
ein aus einem Netzwerk von Nervenzellen herausgelöstes Neuron
nach einer gewissen Zeit nicht mehr diejenige Zelle, die sie noch
im Netzwerk dargestellt hatte. Derzeit ist kein Verfahren bekannt,
bei dem der Zustand der Zelle innerhalb des Netzwerks bei gleichzeitiger
Vermehrung konserviert werden kann.
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Auf
der anderen Seite können
jedoch biochemische Fragestellungen angegangen werden, wenn empfindliche
analytische Methoden verwendet werden, die mit geringen Materialmengen – insbesondere
mit einzelnen Zellen – auskommen.
Voraussetzung dabei ist, daß einzelne
Zellen der Probe entnommen und innerhalb einer bestimmten Zeit in
die Analyseapparatur transferiert werden. Nur so kann sichergestellt
werden, daß zellinterne
Abbauprozesse die zu untersuchenden Stoffe nicht zersetzt haben.
Eine Vorraussetzung dafür
ist die zielgerichtete Entnahme einer einzelnen, identifizierten
und ausgewählten
Zelle. Eine Möglichkeit
zur Identifikation ist die Ausnutzung morphologischer Unterschiede,
die mittels Mikroskopie festgestellt werden können. Eine andere Möglichkeit
der Identifikation besteht in der Nutzung von Farbstoffen. Diese
Farbstoffe können mittels
Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden und ermöglichen
auf diese Weise eine Identifikation derjenigen Zellen, die mit diesem
Farbstoff markiert sind.
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Im
Stand der Technik gibt es derzeit mehrere Möglichkeiten für die Entnahme
einzelner Zellen aus einer Probe. Eine Methode besteht in der manuellen Präparation,
bei der der Experimentator die Probe durch ein Stereomikroskop beobachtet
und ihr mittels mechanischer Werkzeuge einzelne Zellen entnimmt. Diese
Methode ist jedoch sehr aufwendig, langwierig und setzt eine überdurchschnittliche
Fingerfertigkeit des Experimentators voraus, die in der Regel nur
im Laufe von Jahren erworben werden kann. Eine andere Möglichkeit
der Präparation
besteht in der Mikrodissektion, bei der beispielsweise UV-Laser
zum Schneiden verwendet werden. Bei dieser Art der Präparation
ist man jedoch auf Gewebeschnitte angewiesen, die keine lebenden
Zellen repräsentieren. Darüber hinaus
müssen
inverse Mikroskope verwendet werden, d.h. die notwendige manuelle
Präparation
einerseits und die Beobachtung andererseits erfolgen von entgegengesetzten
Richtungen auf das Präparat.
Zwar läßt sich
dies durch die aufeinanderfolgende Anwendung von Stereomikroskop
und inversem Mikroskop umgehen, diese letztgenannte Methode ist
jedoch aufgrund des sich ständig
wiederholenden Wechsels der Mikroskope erhöht fehleranfällig.
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In
der WO 99/28725 A1 wird ein automatisiertes System zur Mikrodissektion
beschrieben. Um einen mehr oder weniger automatischen Ablauf der Mikrodissektion
gewährleisten
zu können,
werden die Werkzeuge zunächst
kalibriert. Dies geschieht, indem zunächst mit Hilfe von zwei CCD-Kameras und
einem Mikroskop die Position eines ersten Mikro-Werkzeuges bestimmt
und geeicht wird. Ein zweites Mikro-Werkzeug wird nur noch durch
die CCD-Kameras analysiert, wobei die Differenz der beiden „Null"-Positionen vom ersten
zum zweiten Werkzeug bestimmt wird. Durch die Positionsbestimmung
des ersten Werkzeuges ist es daher möglich, beliebig viele weitere
Werkzeuge zu verwenden, wobei jeweils nur die Differenz zur Eichungsposition
des ersten Werkzeuges bestimmt werden muß. Diese Differenzen werden
gespeichert und können
beim Wechsel eines Werkzeuges beispielsweise durch den Bediener
ausgewählt
werden.
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In
der
EP 0 577 084 A2 wird
ebenfalls eine Probenmanipulationsvorrichtung beschrieben. Die Vorrichtung
verfügt über eine
TV-Kamera mit einem Objektiv. Die Kamera dient der Beobachtung bei
der Bestimmung der räumlichen
Lage einer Manipulationsspitze. Abwechselnd werden Bewegungen in
der x-y-Ebene und der y-z-Ebene bzw. x-z-Ebene durchgeführt, d.h.
einmal in der Ebene der Probe, und einmal senkrecht dazu. Eine räumliche
Bewegung wird somit über
eine rein zweidimensionale Eingabe mit Hilfe von Computermäusen erreicht.
Die Kamera dient ausschließlich
der visuellen Kontrolle der Position.
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In
der
DE 37 18 066 A1 wird
eine Vorrichtung beschrieben, mit der einzelne Zellen manipuliert
werden können,
wobei Zellen mittels einer Marke ausgewählt werden. Die Koordinaten
der Zellen im Bild werden dann in das Koordinatensystem des Positioniersystems
für die
Kapillare umgerechnet. Dies setzt allerdings voraus, daß die Transformationsvorschrift für die Transformation
der Koordinaten von einem ins andere System bekannt ist. Dazu muß die Manipulationsspitze
justiert bzw. kalibriert werden. Dies geschieht ausschließlich manuell
in einem umständlichen
Verfahren, bei dem in eine Zelle, deren Position aufgrund einer
vor Inbetriebnahme erfolgten geometrischen Kalibrierung bekannt
ist, eine Testinjektion ausgeführt
wird. Wird die Injektion erfolgreich durchgeführt, dann ist die Position
der Manipulationsspitze identisch mit der bekannten Position der
Zelle und kann auf diese Weise kalibriert werden. Die Kalibrierung
ist unter anderem auch deswegen so kompliziert, da zur Beobachtung
ein inverses Mikroskop verwendet wird, welches die Bewegungen in
x-y- und z-Richtung entgegengesetzt zur tatsächlichen Bewegung eines Bedieners
wiedergibt. Es erfordert daher eine gewisse Übung, die zur Positionsbestimmung erforderliche
Testinjektion erfolgreich durchzuführen.
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In
der
EP 1 502 649 A1 wird
eine Vorrichtung beschrieben, bei der ebenfalls Zellen anhand ihrer optischen
Eigenschaften ausgewählt
und anschließend
aufgenommen werden, wobei dieser Vorgang automatisch abläuft. Die
Position der Manipulationseinheit ist während des Ablaufs aufgrund
einer nicht näher
beschriebenen Vorkalibrierung bekannt und muß damit nicht bestimmt werden.
Die Vorrichtung verfügt
auch über
eine Kamera, die jedoch nicht der Positionsbestimmung dient und
in bezug auf die Manipulationsspitzen fest montiert ist. Außerdem verfügt die Vorrichtung über einen
Detektor, dem ein Langpaßfilter
vorgeschaltet ist. Dieser Detektor dient dazu, spezielle Wellenlängen durchzulassen
und andere zu blockieren, beispielsweise das blaue Licht der Leuchtdioden
im Leuchttisch zu blockieren und von den Proben emittierte Fluoreszenzstrahlung
zu detektieren. Bei den Manipulationsspitzen handelt es sich um
festmontierte Edelstahlkapillaren, eine Auswechslung und erneute
Kalibrierung ist nicht vorgesehen.
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In
der
EP 1 470 863 A1 ist
eine Anordnung beschrieben, mit der Proteinkristalle in einer Lösung eingefangen
und aufgenommen werden können.
Die Probe wird dabei mit einer Lichtquelle beleuchtet. Unterhalb
des Probenträgers
befindet sich ein inverses Mikroskop, welches an einen Computer
angeschlossen ist. Das Mikroskop wird dazu genutzt, die Größe des Proteinkri stalls
zu bestimmen und die entsprechende Größe eines Entnahmegerätes festzulegen, wobei
die Größenbestimmung
auch automatisch erfolgen kann.
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In
der
US 6,821,484 B1 wird
eine Vorrichtung zur Isolation von kleinen Teilchen, insbesondere
von Zellclustern beschrieben. Die Vorrichtung ist dabei in der Lage,
automatisch Zellcluster mit Hilfe einer digitalen Bildverarbeitung
zu erkennen. Sie verfügt über eine
Kamera und eine Pipette, beide können
unabhängig
voneinander computergesteuert bewegt werden. Der Prozeß der Isolierung
von Teilchen und ihre Entnahme kann dabei im wesentlichen automatisch erfolgen.
Die Ist-Position der Pipette wird bestimmt, indem eine Kamera auf
diese fokussiert wird. Anschließend
können
mit Hilfe der Kamera manuell oder automatisch Teilchen zur Entnahme
ausgewählt und
dann entnommen werden. Die Kamera dient also sowohl zur Beobachtung
als auch zur Positionsbestimmung. Mit der in der
US 6,821,484 B1 beschriebenen
Anordnung läßt sich
allerdings nicht die notwendige hohe Präzision, wie sie für die Entnahme einzelner
Zellen notwendig ist, erreichen.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, eine Probenmanipulationsvorrichtung
der eingangs genannten Art dahingehend weiterzuentwickeln, daß die Präparation
und Manipulation einzelner Zellen vereinfacht wird, sowie ein einfacheres
und weniger störanfälliges Verfahren
zur Entnahme von Teilen einer Probe durchführbar ist.
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Diese
Aufgabe wird bei einer Probenmanipulationsvorrichtung der eingangs
beschriebenen Art dadurch gelöst,
daß Positionsmesseinheit
und Beobachtungseinheit jeweils als Mikroskope ausgestaltet sind,
wobei der Probentisch zwischen der Beobachtungseinheit und der optischen
Positionsmesseinheit angeordnet ist, und wobei die Positionsmesseinheit ein
Objektiv mit einer Tiefenschärfe
von der Größenordnung
der Manipulationsspitze aufweist, und daß mit der optischen Positionsmeßeinheit
im Gebrauch die Ist-Position der Manipulationsspitze bestimmt wird,
so daß eine
gezielte Verstellung der Manipulationsspitze zur Soll-Position durchführbar ist.
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Ein
Experimentator beobachtet also die Probe in der Beobachtungseinheit
und wählt
einen Teil der Probe aus, der entnommen werden soll. Diese Auswahl
kann beispielsweise erfolgen, indem der zu entnehmende Teil der
Probe ins Zentrum des Blickfeldes der Beobachtungseinheit geführt wird.
Zur Erleichterung kann dabei ein Fadenkreuz in der Mitte des Blickfeldes
dienen. Der Teil der Probe im Fadenkreuz entspricht in diesem Fall
der Soll-Position. Eine andere Möglichkeit
ergibt sich, wenn das Bild der Probe beispielsweise auf einen Bildschirm
dargestellt wird und eine entsprechende Region im Bild mit einer Computermaus
o.ä. ausgewählt wird.
Die Steuereinheit kann dann die Manipulationsspitze des Manipulationswerkzeugs
an die entsprechende Soll-Position bewegen. Voraussetzung ist allerdings,
daß die
gegenwärtige
Ist-Position der Manipulationsspitze bekannt ist. Zur Bestimmung
der Ist-Position der Manipulationsspitze dient die optische Position
der Meßeinheit.
Die Manipulationsspitze wird manuell oder automa tisch ins Gesichtsfeld
der Positionsmeßeinheit
gefahren und so lange bewegt, bis sie von der Positionsmeßeinheit
erfaßt
wird. Da die die Positionsmeßeinheit
und die Beobachtungseinheit mit ihren jeweiligen Koordinatensystemen
fest zueinander positioniert sind, können die von der optischen
Positionsmeßeinheit
in deren Koordinatensystem bestimmten Koordinaten in die Koordinaten
der Beobachtungseinheit transformiert werden. Man erhält auf diese
Weise den dreidimensionalen Abstandsvektor von der Manipulationsspitze
zur Soll-Position und kann eine entsprechende Verstellung durchführen.
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Platzsparend
ist der Probentisch zwischen Beobachtungs- und Positionsmeßeinheit
angeordnet. Die Manipulationsspitze befindet sich in diesem Fall
auf der Seite der Beobachtungseinheit. Entsprechend müssen die
optischen Eigenschaften des Probentisches bei der Bestimmung der
Position der Manipulationsspitze berücksichtigt werden.
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Dabei
sind die Beobachtungs- und Positionsmeßeinheit jeweils als Mikroskope
ausgestaltet, ihre Vergrößerung hat
eine höhere
Genauigkeit zur Folge. Die Positionsmeßeinheit kann entlang ihrer
optischen Achse verstellbar ausgeführt sein.
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Die
Positionsmeßeinheit
weist ein Objektiv mit einer Tiefenschärfe von einer Größenordnung
der Manipulationsspitze auf. Auf diese Weise wird gewährleistet,
daß der
Fehler bei der Vermessung der Spitze möglichst klein ist, ohne jedoch
den Zeitaufwand für
die Vermessung in die Höhe
zu treiben, wie es bei einem Objektiv mit noch geringerer Tiefenschärfe der
Fall wäre.
Das Manipulationswerkzeug ist dabei vorteilhaft so gestaltet, daß die Manipulationsspitze,
bei der es sich beispielsweise um ein eine Kapillare zur Entnahme
von Zellen handeln kann, ausgewechselt werden kann.
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Bevorzugt
ist dabei bei der Positionsmeßeinheit
eine Bildaufnahme- und Bildverarbeitungseinheit vorhanden. Auf diese
Weise läßt sich
der Prozeß der Koordinatenbestimmung
und – transformation
automatisch durchführen,
wenn die Bildverarbeitungseinheit auch mit der Steuereinheit verbunden
ist. Die Bildverarbeitungseinheit ist dabei in der Lage, selbstständig zu
erkennen, wann die Manipulationsspitze schart gestellt ist.
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Vorteilhaft
ist der Probentisch außerdem
relativ zur Beobachtungs- und Positionsmeßeinheit verstellbar, insbesondere
in der Ebene des Tisches, so daß die
Probe in dieser Ebene verschoben werden kann.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung liegen die optischen
Achsen der Objektive von Beobachtungs- und Positionsmeßeinheit
parallel. Die Ebene des Probentisches liegt dann zweckmäßigerweise
senkrecht zu diesen optischen Achsen. Dies erleichtert den Aufbau
der Vorrichtung, selbstverständlich
sind aber auch Ausführungen möglich, bei
denen die optischen Achsen nicht parallel stehen. Hier ist durchaus
eine Ausführung
denkbar, bei der die optischen Achsen nicht parallel verlaufen.
Sie können
jedoch so angeordnet sein, daß sich
die optischen Achsen beispielsweise an einem Punkt auf dem Probentisch
schneiden. In diesem Fall, wie auch in dem Fall, daß die optischen
Achsen nicht nur parallel verlaufen, sondern aufeinander fallen,
lassen sich vorteilhaft laseroptische Werkzeuge und/oder laseroptische
Meßeinrichtungen
in die Vorrichtung einbinden. Diese können dann durch das Objektiv
der Positionsmeßeinheit
in die Objektebene eingekoppelt werden. Beispiele für solche
Werkzeuge sind eine optische Pinzette oder auch ein Laserskalpell.
Die Verstellbarkeit entlang der optischen Achse bietet hier die
Möglichkeit,
den Fokus zu verändern
und so beispielsweise mit dem Laserskalpell parallel zur Tischebene
Gewebeschnitte in verschiedenen Höhen – gemessen von der Tischebene – an der
Probe vorzunehmen.
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Die
Werkzeuge müssen
nicht notwendigerweise in die Probenmanipulationsvorrichtung integriert
sein, sie können
auch von außen
beispielsweise über
Faser-Ports einkoppelbar sein. Auf diese Weise wird die Vorrichtung
preisgünstiger,
und Spezialwerkzeuge wie ein Lasermikrotom lassen sich nach Art
von Modulen leicht einkoppeln.
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Als
Beobachtungseinheit kann ein Auflichtmikroskop oder auch ein Stereomikroskop
vorhanden sein. Darüber
hinaus kann bei der Beobachtungseinheit eine Bildaufnahme- und Bildverarbeitungseinheit
vorhanden sein. CCD- oder CMOS-Arrays sind Beispiele für solche
Bildaufnahmeeinheiten. Im Falle eines Stereomikroskops kann eine
solche Bildaufnahmeeinheit nur mit einem der beiden Kanäle gekoppelt
sein, oder auch mit beiden Kanälen.
In diesem Fall enthält
das Bild die Summe der Intensitäten
der beiden Kanäle.
Auch die Verbindung von zwei CCD- oder
CMOS-Arrays in einer Bildaufnahmeeinheit ist im Fall eines Stereomikroskops möglich, auf
diese Weise lassen sich Stereobilder generieren.
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Mit
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
können
Teile von Proben entnommen werden. Dabei wird mittels einer Beobachtungseinheit
eine Soll-Position ausgewählt,
an der sich zu ein entnehmender Probenteil befindet. Anschließend wird
die Ist-Position einer Manipulationsspitze relativ zur Beobachtungseinheit
mit Hilfe einer optischen Positionsmeßeinheit bestimmt, die Manipulationsspitze
zur Soll-Position bewegt und der Probenteil entnommen. Der entnommene
Probenteil kann an einer vorgegebenen Position wieder abgesetzt
werden.
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Die
Ist-Position wird dabei vorzugsweise bestimmt, in dem die Manipulationsspitze
mittels einer Steuereinheit zunächst
so in den Strahlengang der Positionsmeßeinheit geführt wird,
daß ihre
Umrisse für
diese erkennbar sind. Anschließend
erfolgt in mehreren Schritten eine Scharfstellung auf die Spitze,
anhand der eingestellten Parameter werden dann die Koordinaten der
Manipulationsspitze im Koordinatensystem der Beobachtungseinrichtung
bestimmt. Aus dem Ab standsvektor zwischen Soll- und Ist-Position
im Koordinatensystem der Beobachtungseinheit läßt sich dann die notwendige
Verstellung zur Anfahren der Soll-Position bestimmen.
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Die
Probenmanipulationsvorrichtung soll im folgenden anhand von einem
Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
In den dazugehörigen
Zeichnungen zeigt
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1 die
Perspektivansicht einer Probenmanipulationsvorrichtung mit einem
Manipulationswerkzeug, und
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2 eine
detaillierte Skizze der Anordnung und des Zusammenwirkens der einzelnen
Baugruppen.
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Die
in 1 dargestellte Probenmanipulationsvorrichtung
enthält
als Beobachtungseinheit ein Stereomikroskop 1. In diesem
integriert ist gleichzeitig auch die Beleuchtungseinrichtung der
Probe. Über
das Objektiv 2 des Stereomikroskops 1 fällt Licht
auf eine Probe 3, die auf einem Probentisch 4 fixiert
ist. Von der Probe 3 zurückgestrahltes Licht wird dann über das
Objektiv 2 zu den Okularen 5 des Stereomikroskops 1 gelenkt.
Der Probentisch 4 ist in der Ebene des Tisches, d.h. senkrecht
zur optischen Achse des Objektivs 2, verschiebbar. Links
vom Stereomikroskop 1 befindet sich ein Manipulationswerkzeug 6 mit
einer Manipulationsspitze 7. Das Manipulationswerkzeug 6 ist
dabei optional, Manipulationen an der Probe können auch über das Manipulationsobjektiv 8 vorgenommen
werden. Mit dem Manipulationswerkzeug 6 bzw. der Manipulationsspitze 7 werden
der Probe 3 Teile, beispielsweise einzelne Zellen, entnommen
und in einem Absetzfeld 4.1 abgesetzt. Bei dem Absetzfeld 4.1 kann
es sich beispielsweise um eine Metallplatte mit einzelnen Meßstellen handeln,
eine Mikrotiterplatte oder ähnliches.
Bei Bedarf können
die Absetzpositionen vorgegeben und zur weiteren Verwendung gespeichert
werden. Über das
Manipulationsobjektiv 8 können beispielsweise Laser 9 auf
die Probe 3 gelenkt werden. Diese Laser 9 können dabei
die Funktion von Werkzeugen wie optischen Pinzetten oder einem Laserskalpell übernehmen,
aber auch Meßaufgaben
ausführen.
Wenn ein Manipulationswerkzeug 6 vorhanden ist, so erfüllt das
Manipulationsobjektiv 8 noch eine weitere Aufgabe, nämlich ein
Bild der Manipulationsspitze 7 zu erfassen und auf eine
CCD-Kamera 10 abzubilden. Aus Bildern, die aus verschiedenen
Höhen aufgenommen
wurden läßt sich
iterativ die Manipulationsspitze 7 scharf stellen und so
deren Position in Relation zur Beobachtungseinheit bestimmen.
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In 2 sind
die einzelnen Komponenten der Probenmanipulationsvorrichtung dargestellt.
Die Vorrichtung umfaßt
ein Stereomikroskop 1 mit einem Objektiv 2, einen
motorisch verstellbaren Probentisch 4, auf dem die Probe 3 fixiert
ist, sowie ein in den drei Raumrichtung motorisch verstellbares
Manipulationswerkzeug 6, welches mit einer Manipulationsspitze 7 versehen
ist. Das Koordinatensystem des Manipulationswerkzeuges 6 wird
dabei mit den Koordinaten x',
y' und z' bezeichnet. An das
Manipulationswerkzeug 6 angeschlossen ist eine Ansaugvorrichtung 11 für Kapillaren.
Die Probe 3 wird über eine
Beleuchtungsquelle 12, die über eine Linse 13 in den
Strahlengang eingekoppelt wird, bestrahlt. Dabei kann es sich beispielsweise
um einen Laser handeln, der Fluoreszenz anregt, wenn die Probe 3 mit
entsprechenden Farbstoffen markiert ist. Der Probentisch 4 ist
in der Lage, Teile, die sich in der Objektebene befinden, in dieser
Ebene, der mit X-Y bezeichneten Ebene, zu verschieben. Das Manipulationswerkzeug 6 dient
vorzugsweise zur Aufnahme einer Kapillare und läßt sich wie angedeutet in den
drei unabhängigen
Achsen x', y' und z' verstellen. Diese Achsen
sind in der Regel nicht mit den Achsen x, y und z identisch. Unterhalb
des Probentisches 4 befindet sich das Manipulationsobjektiv 8,
welches in z-Richtung, d.h. entlang der optischen Achse bzw. senkrecht
zur Ebene des Tisches bewegt werden kann. Für das Aufsaugen ausgewählter Gewebeteilchen
ist es notwendig, die räumlichen
Koordinaten der Manipulationsspitze 7 genau zu kennen.
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Wenn
es sich bei der Manipulationsspitze 7 um eine Kapillare
handelt, so werden diese häufiger ausgewechselt,
anschließend
müssen
ihre Koordinaten neu bestimmt werden. Bei der Bestimmung der Koordinaten
der Spitze kann man die geringe Tiefenschärfe des Manipulationsobjektivs 8 ausnutzen. Durch
einen Regelkreis, der das Bild der CCD-Kamera 10, eine
entsprechenden Bildverarbeitungssoftware und die Steuerung der motorisch
verstellbaren Achsen x',
y' und z' des Manipulationswerkzeuges 6 umfaßt, ist
es möglich,
den exakten räumlichen
Ort der Manipulationsspitze 7 zu ermitteln. Während der Dauer
der Koordinatenbestimmung befindet sich das Manipulationsobjektiv 8 immer
in derselben z-Position,
die einer Steuereinheit 14, die die Messung steuert, bekannt
ist. Zunächst
wird die Manipulationsspitze 7 über die Steuereinheit 14 solange
bewegt, bis die Bildverarbeitung, die das Bild der CCD-Kamera 10 auswertet
und in die Steuereinheit 14 integriert sein kann, die Umrisse
der Manipulationsspitze 7 erkennt. Dann greift der Regelkreis
und wird über
die Steuereinheit 14 das Manipulationswerkzeug 6 mit der
Manipulationsspitze 7 so bewegt, daß am Ende der Regelung die
Manipulationsspitze 7 schart auf die CCD-Kamera 10 abgebildet
wird. Da die Abbildungsverhältnisse
des Manipulationsobjektivs 8 in Kombination mit der abbildenden
Linse 15 der Steuereinheit bekannt sind, läßt sich
so die Koordinate z der Manipulationsspitze 7 im Koordinatensystem
des Stereomikroskops bestimmen. Über
die Lage der Manipulationsspitze 7 innerhalb des von der CCD-Kamera 10 aufgenommenen
Bildes lassen sich ebenfalls die Koordinaten x und y ermitteln.
Vorteilhaft kann man den Regelkreis auch so gestalten, daß sich die
Manipulationsspitze 7 am Ende der Prozedur in der Bildmitte
befindet. Falls sich bei der Suche nach den Umrissen der Manipulationsspitze 7 Teile des
Manipulationswerkzeuges 6 schon im Tiefenschärfebereich
des Manipulationsobjektivs 8 befinden, läßt sich
dieser Umstand ebenfalls dazu nutzen, das Werkzeug so zu bewegen,
daß am
Ende der Regelung die Manipulationsspitze 7 schart abgebildet wird.
Die Achsen des Manipulationswerkzeuges 6 können dabei
beispielsweise elektromechanisch verstellt werden.
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Verwendet
man eine Kapillare mit abgewinkelter Spitze, die um ihre Achse drehbar
eingespannt ist, so kann und sollte zusätzlich noch die Stellung des
Winkels bestimmt werden, damit die Spitze jeweils in den richtigen
Winkel gedreht werden kann. Dies kann eindeutig erreicht werden,
indem die Position der Spitze bei mehreren Winkelstellungen bestimmt
wird – entweder
durch Verstellung bei gleichzeitig folgender Scharfstellung oder
Drehen und anschließendem
Suchen. Aus den Positionen, die alle auf dem Umfang eines Kreises
liegen, läßt sich
dessen Mittelpunkt bestimmen. Eine abgewinkelte Kapillare bietet
in der Praxis Vorteile, da man sie fast parallel zur Objektebene
fixieren kann – dies
gibt ein besseres Gefühl
für die
Höhe beispielsweise
bei der Übergabe
von einer optischen Pinzette. Zum Absetzen des entnommenen Probenteils
wird die Kapillare dann so gedreht, daß ihre Öffnung nach unten zeigt.
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Zusätzlich zum
oder auch anstelle des Manipulationswerkzeuges 6 können laseroptische
Werkzeuge vorhanden sein. In 2 sind zwei
Laser 9, die jeweils Licht unterschiedlicher Wellenlänge ausstrahlen,
vorgesehen. Der obere der beiden Laser 9 fungiert als sogenanntes
Laserskalpell, seine Strahlung wird über den Strahlformer 16,
die Linse 17 und die Strahlteiler 18 und 19 in
das Manipulationsobjektiv 8 und von dort in die Objektebene
eingekoppelt. Der untere der beiden Laser 9 fungiert als
sogenannte optische Pinzette. Sein Licht wird über einen Strahlformer 20,
einen Umlenkspiegel 21, eine Scaneinheit 22, den
Strahlteiler 18, die Linse 17, und den Strahlteiler 19 in
das Manipulationsobjektiv 8 und von dort in die Objektebene
eingekoppelt. Mittels der Scaneinheit 22 kann die optische
Pinzette dabei innerhalb des Sichtfeldes des Manipulationsobjektivs 8 frei
bewegt werden. Stereomikroskop 1, Probentisch 4,
die Bewegung des Manipulationsobjektivs 8 entlang der z-Richtung
sowie die Bewegung des Manipulationswerkzeuges 6 können auch
zentral von einer gesonderten Einheit gesteuert werden. Dabei kann
es sich beispielsweise um einen PC 23 handeln, der mit
einem Monitor 24 verbunden ist. Auch die Steuereinheit 14 kann
in diesen PC 23 integriert sein, zumindest ist sie mit
ihm verbunden. Auf den Monitor 24 des PCs 23 lassen
sich beispielsweise das Mikroskopiebild, das von einer CCD-Kamera 25 aufgenommen
wird, sowie die Orte der laseroptischen Werkzeuge abbilden.
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Bei
der Verwendung der Vorrichtung kann jeder Schritt, angefangen bei
der Beobachtung über die
Auswahl zur Präparation,
der Aufnahme und des Transfers bis hin zur Abgabe des Gewebeteilchens genau
dokumentiert werden, wozu die CCD-Kamera 25 den wesentlichen
Teil beiträgt.
Die Positionen, an denen die entnommene Zelle oder das Gewebeteilchen
abgesetzt werden soll, können
vorgegeben und gespeichert werden, auch in Abhängigkeit von der Probe. Dies
ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn von vielen verschiedenen
Proben Gewebeteilchen entnommen werden und später noch eine eindeutige Zuordnung
möglich
sein muß,
beispielsweise in der Gerichtsmedizin.
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Bei
den laseroptischen Werkzeugen kann außerdem statt einer Scaneinheit 22 auch
ein sogenannter Spatial Light Modulator (SLM) vorgesehen sein. Mit
diesem lassen sich auch mehrere optische Pinzetten, prinzipiell
auch eine sogenannte Multi-Beam-Pinzette realisieren.