DE102012010208A1 - Microscope e.g. laser scanning microscope for modern cell biological research field, has main color divider and deflecting mirror that are arranged on common optical carrier or substrate for mechanical rigid connection - Google Patents

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Abstract

The microscope has a main color divider for the spectral separation of illuminating light and sample light detected by a detector. The main color divider and a deflecting mirror in a detection optical path are arranged on a common optical carrier or substrate for mechanical rigid connection. An illumination beam path and the detection beam path are provided with a pinhole arrangement.

Description

Stand der TechnikState of the art

Die Forschung in der modernen Zellbiologie möchte im zunehmenden Maße auf optisch sehr stabile Geräte zurückgreifen können. Insbesondere in der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie muss der Anregungsstrahlengang sehr genau zum Detektionsstrahlengang ausgerichtet sein, andernfalls können die ultra-geringen Lichtmengen aus dem konfokalem Fokusvolumen von z. B. 10^–15 cm^3 nicht detektiert werden, d. h. das Detektionslicht würde verlorengehen. Die Mikroskop-Hersteller setzen bisher im Allgemeinen auf die motorisierte Kalibrierung (Überlagerung) der beiden Strahlengänge (Beleuchtung und Detektion) individuell für jeden dichroitischen Farbteiler, wobei die Positionen der Farbteiler gespeichert werden ( DE 19702753 A ). Es gibt auch aktiv geregelte Systeme die Signale von Positionssensoren (pixelierten Detektoren) für die Beleuchtung und Detektion auswerten und entsprechend in Regelkreisen zur Korrektur des Überlapps verwenden. Eine Methode zur Gewährleistung der Stabilität des Überlapps zwischen den beiden Strahlengängen hat Prairie Technologies entwickelt ( US 6,856,457 B2 ) und besteht darin, dass das Pinhole oder eine mehrfache Anordnung davon vom Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang starr miteinander verbunden sind (siehe ). Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengänge bei der Fluoreszenzdetektion mit einander vereint bzw. rückwärtig getrennt werden müssen.The research in modern cell biology wants to increasingly resort to optically very stable devices. In confocal fluorescence microscopy in particular, the excitation beam path must be aligned very precisely with the detection beam path, otherwise the ultra-small amounts of light from the confocal focus volume of z. B. 10 ^ -15 cm ^ 3 are not detected, ie the detection light would be lost. The microscope manufacturers generally rely on the motorized calibration (superimposition) of the two beam paths (illumination and detection) individually for each dichroic color divider, whereby the positions of the color splitters are stored ( DE 19702753 A ). There are also actively controlled systems which evaluate signals from position sensors (pixelated detectors) for illumination and detection and use them accordingly in control circuits to correct the overlap. A method for ensuring the stability of the overlap between the two beam paths has been developed by Prairie Technologies ( US 6,856,457 B2 ) and is that the pinhole or a multiple arrangement thereof are rigidly connected by the illumination and detection beam path (see ). A disadvantage of this method is that illumination and detection beam paths in fluorescence detection must be combined with each other or backward separated.

Lösungsolution

Dieser Nachteil der kann erfindungsgemäß dadurch behoben werden, dass ein dichroitischer Strahlvereiniger mit einem Spiegel zur Umlenkung des Probenlichtes in Richtung des Detektionsstrahlengang gekoppelt wird, d. h. eine Spiegelschicht für die Detektionsstrahlung und die dielektrische Schicht für die Strahlvereinigung sich auf einem gemeinsamen optischen Träger (Substrat) befinden. Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen Darstellungen näher erläutert. zeigt einen erfindungsgemäßen Hauptfarbteiler HFT und einen Beleuchtungsstrahlengang in Richtung der Probe Pr der an HFT reflektiert wird sowie das rückkehrende Probenlicht das durch HFT hindurchgeht und nach zweimaliger Umlenkung auf einen Spiegel SP gelangt, der auf einem gemeinsamen Grundkörper G mit HFT angeordnet ist und das Probenlicht dadurch ortsstabil in Richtung der Detektion umleitet (siehe auch ). Die stabile Ortslage entspricht in der Pupille des Mikroskopobjektives einem stabilen Winkel zwischen Beleuchtung und Detektion. Vorteilhaft befinden sich also HFT und Spiegel S beispielsweise auf einem Glassubstrat, das an unterschiedlichen Stellen zur Erzeugung von HFT und SP unterschiedlich beschichtet ist. Damit sollte der Überlapp (die Überlagerung der Strahlengänge), nachdem er einmal justiert wurde, bei Wechsel des Farbteilers HFT sich nicht verändern. Damit die Winkeldrift im Beleuchtungsstrahlengang, verursacht durch die Bewegung des Hauptfarbteilers, durch die Kopplung von HFT und einem spiegelnden Element im Detektionsstrahlengang kompensiert werden kann, müssen sich zwei oder ein ganzzahliges Vielfaches von zwei weiteren spiegelnden Umlenkelementen (siehe die zwei Umlenkspiegel in 1b, Spiegel S2 und S3 in 3) im Detektionsstrahlengang vor der fokussierenden Detektionsoptik befinden, andernfalls kann die HFT-Drift nicht kompensiert werden. Ohne diese Umlenkspiegel würde die Ablenkung nicht kompensiert sondern in die falsche Richtung verstärkt werden. Erfindungsgemäß kann vorteilhaft ein weiterer Nachteil behoben werden: Und zwar kann nun der Effekt auftreten, dass das Pinhole selbst seitlich wegdriftet Dies kann beispielsweise im Unendlich-Raum wie im parallelen Strahlengang nach dem Objektiv in Detektionsrichtung durch Verkippen eines Spiegels, der über eine geeignete mechanische Verbindung, vorzugsweise ein Festkörpergelenk mit dem Pinhole selbst bzw. seinem Aufbau, d. h. mit dem Ortsraum verbunden ist, kompensiert werden. Mittels eines geeigneten Festkörpergelenkes kann vorteilhaft die Ortsänderung des Pinholes in eine Winkeländerung des Spiegels transformiert und dadurch kompensiert werden (siehe ).This disadvantage can be eliminated according to the invention by coupling a dichroic beam combiner with a mirror for deflecting the sample light in the direction of the detection beam path, ie a mirror layer for the detection radiation and the dielectric layer for the beam combination are located on a common optical carrier (substrate) , The invention will be explained in more detail with reference to the schematic representations. shows a main color splitter HFT according to the invention and an illumination beam path in the direction of the sample Pr on HFT is reflected and the returning sample light which passes through HFT and after two redirection on a mirror SP, which is arranged on a common base G with HFT and the sample light thereby Stable in the direction of the detection redirects (see also ). The stable spatial position corresponds to a stable angle between illumination and detection in the pupil of the microscope objective. Thus, HFT and mirror S are advantageously located, for example, on a glass substrate which is differently coated at different locations for producing HFT and SP. Thus, the overlap (the superimposition of the beam paths), once it has been adjusted, should not change when changing the color divider HFT. In order for the angular drift in the illumination beam path, caused by the movement of the main color splitter, to be compensated by the coupling of HFT and a specular element in the detection beam path, two or an integer multiple of two further specular deflecting elements (see the two deflection mirrors in FIG 1b , Mirrors S2 and S3 in 3 ) in the detection beam path in front of the focusing detection optics, otherwise the HFT drift can not be compensated. Without this deflection mirror, the deflection would not be compensated but reinforced in the wrong direction. According to the invention, a further disadvantage can advantageously be remedied: Namely, the effect can now occur that the pinhole itself drifts sideways. This can be done, for example, in infinite space as in the parallel beam path to the objective in the detection direction by tilting a mirror which has a suitable mechanical connection , Preferably, a solid-state joint with the pinhole itself or its structure, that is connected to the physical space, be compensated. By means of a suitable solid-state joint, the change in position of the pinhole can advantageously be transformed into an angle change of the mirror and thereby compensated (see ).

zeigt eine erfindungsgemäße Pinhole-Ortskompensationseinheit: Eine mögliche laterale Pinhole-Bewegung der Pinholeanordnung PH wird mittels eines Festkörpergelenks FK über einen Drehpunkt D in eine Winkeländerung eines Spiegels S oder die laterale Verschiebung einer Linse umgewandelt die zu diesem Zweck wie in 2 anhand des Spiegels S und in 3 anhand der Linse L2 zu sehen mit dem verkippbaren Teil des Drehgelenks verbunden sind. shows a pinhole location compensation unit according to the invention: A possible lateral pinhole movement of Pinholeanordnung PH is converted by means of a solid state joint FK via a pivot point D in an angular change of a mirror S or the lateral displacement of a lens for this purpose as in 2 based on the mirror S and in 3 seen by the lens L2 are connected to the tilting part of the rotary joint.

In wird der prinzipielle Strahlengang eines konfokalen Multi-Line-Mikroskops mit einem Zylinderlinsenarray ZL zur Erzeugung mehrerer Beleuchtungslinien dargestellt, wobei sowohl der Strahlvereinigerspiegel gemäß als auch eine Pinhole-Ortskompensationseinheit ähnlich zu verwendet werden kann. Der Unterschied an dieser Stelle zu besteht darin, dass hier die Bewegung des Pinhole in einem einstellbarem Verhältnis durch Wahl der Hebel des Festkörpergelenkes FK auf die Linse L2 vor dem Pinhole lateral zur optischen Achse übertragen wird. Dadurch wird die optische Achse in Richtung des Pinholes PH seitlich verschoben und das Fluoreszenzlicht trifft weiterhin zuverlässig das Pinhole.In the principal ray path of a confocal multi-line microscope is shown with a cylindrical lens array ZL for generating a plurality of illumination lines, wherein both the Strahlvereinigerspiegel according to as well as a pinhole location compensation unit similar to can be used. The difference at this point too is that here the movement of the pinhole is transmitted in an adjustable ratio by selecting the levers of the solid-state joint FK on the lens L2 in front of the pinhole lateral to the optical axis. As a result, the optical axis is displaced laterally in the direction of the pinhole PH and the fluorescent light continues to reliably hit the pinhole.

Ein Mikroskopstativ S ist mit einer Tubuslinse TL und einem Objektiv Ob zur Fokussierung von Beleuchtungslicht in eine Probenebene PR und zur Übertragung des Probenlichtes in Richtung der Detektion D vorgesehen. Mit dem Stativ S optisch verbunden ist ein Beleuchtungs- und Detektionsmodul BDM. In diesem wird beispielsweise Laserlicht das divergent aus einer Faser F austritt über eine Kollimatorlinse KO kollimiert und über einen Spiegel ST1 und eine Zylinderlinsenanordnung ZL über eine Zwischenbildebene ZB1 und eine weitere Linse L1 an einem dichroitischen Spiegel HFT zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionswellenlängen auf einen Scanspiegel SCM zur scannenden Bewegung der durch ZL erzeugten Beleuchtungsverteilung reflektiert. Das Beleuchtungslicht gelangt über eine Scanoptik SCO, die Tubuslinse TL und das Objektiv Ob in bekannter Weise auf die Probe Pr. Das Probenlicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, gelangt rückwärts über den Scanspiegel durch den Hauptfarbteiler HFT (nur über eine Faltspiegelanordnung S2, S3, S4 und eine Pinholeoptik PO sowie einen weiteren Spiegel S5 in kompakter Bauweise fokussiert auf eine Pinholeanordnung PH, die zu der Beleuchtungslinienverteilung in ZB1 konjugierte spaltförmige Einzelpinholes aufweist. Nach der Pinholeanordnung wird das Probenlicht über einen Spiegel S1 und eine Tubuslinsenoptik L2 sowie die Rückseite des Scanspiegels SCM in Richtung der Detektion D gelenkt, bestehend aus einem dichroitischen Strahlteiler und Emissionsfiltern, jeweils vorzugsweise auswechselbar sowie in den Einzelstrahlengängen vor der CCD angeordnet.A microscope stand S is provided with a tube lens TL and a lens Ob for focusing Illumination light in a sample plane PR and for the transmission of the sample light in the direction of the detection D provided. Optically connected to the stand S is a lighting and detection module BDM. In this, for example, laser light which diverges from a fiber F emerges via a collimator lens KO and collimated via a mirror ST1 and a cylindrical lens assembly ZL via an intermediate image plane ZB1 and another lens L1 to a dichroic mirror HFT for separating illumination and detection wavelengths onto a scanning mirror SCM for scanning movement of the illumination distribution generated by ZL. The illumination light passes through a scanning optics SCO, the tube lens TL and the lens Ob on the sample Pr in a known manner. The sample light, in particular fluorescent light, passes back through the scanning mirror through the main color splitter HFT (only via a folding mirror arrangement S2, S3, S4 and a Pinholeoptik PO and another mirror S5 in a compact design focused on a Pinholeanordnung PH, which has to the illumination line distribution in ZB1 conjugated single-pinhole pinholes After Pinholeanordnung the sample light through a mirror S1 and a tube lens optics L2 and the back of the scanning mirror SCM in the direction of Detection D steered, consisting of a dichroic beam splitter and emission filters, each preferably interchangeable and arranged in the individual beam paths in front of the CCD.

Im Rahmen der Erfindung liegt es vorteilhaft auch dass wenn sich im Detektionsstrahlengang eine Kamera, beispielsweise in einem Zwischenbild befindet, auch diese über sie oben beschriebenen Mittel wie das Festkörpergelenk zum Ausgleich des Abdriftens mit einem entsprechenden Spiegel oder einer Linse wie oben beschrieben, verbunden sein kann.Within the scope of the invention, it is also advantageous that if a camera, for example in an intermediate image, is located in the detection beam path, these means such as the solid-state joint described above can also be connected to a corresponding mirror or lens as described above to compensate for drifting off ,

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • DE 19702753 A [0001] DE 19702753 A [0001]
  • US 6856457 B2 [0001] US 6856457 B2 [0001]

Claims (10)

Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang und einem Detektionsstrahlengang und mindestens einem Detektor sowie einem Hauptfarbteiler zur spektralen Trennung von Beleuchtungslicht und detektiertem Probenlicht wobei sich der Hauptfarbteiler und ein erster Umlenkspiegel im Detektionsstrahlengang auf einem gemeinsamen optischen Träger oder Substrat befinden und/oder eine mechanische, vorzugsweise starre Verbindung aufweisen.Microscope with an illumination beam path and a detection beam path and at least one detector and a main color splitter for the spectral separation of illumination light and detected sample light with the main color splitter and a first deflection mirror in the detection beam path on a common optical carrier or substrate and / or have a mechanical, preferably rigid connection , Mikroskop nach Anspruch 1, ausgebildet als Laser Scanning-Mikroskop.Microscope according to claim 1, designed as a laser scanning microscope. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich mindestens zwei oder ganzzahlige Vielfache von zwei weitere Umlenkspiegel nach dem ersten Umlenkspiegel, vorzugsweise vor einer fokussierenden Detektionsoptik im Detektionsstrahlengang befinden.Microscope according to claim 1 or 2, characterized in that there are at least two or integer multiples of two further deflection mirror after the first deflection mirror, preferably in front of a focusing detection optics in the detection beam path. Mikroskop, insbesondere nach Anspruch 1, 2 oder 3, mit einem Beleuchtungsstrahlengang und einem Detektionsstrahlengang mit einer Pinholeanordnung und mindestens einem Detektor wobei die Pinholeanordnung zum Ausgleich eines Abdriftens des Pinholes eine mechanische Verbindung zu mindestens einer Linse oder Linsengruppe oder mindestens eines Umlenkelementes in einem gemeinsamen Teil des Detektionsstrahlenganges aufweist.Microscope, in particular according to claim 1, 2 or 3, with an illumination beam path and a detection beam path with a Pinholeanordnung and at least one detector wherein the Pinholeanordnung to compensate for drifting the Pinholes a mechanical connection to at least one lens or lens group or at least one deflecting element in a common part of the detection beam path has. Mikroskop nach Anspruch 4, wobei die Verbindung über ein Festkörpergelenk erfolgt das eine translatorische Verschiebung der Pinholeanordnung, vorzugsweise senkrecht zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs in eine Verschiebung der Linse oder Linsengruppe oder in eine Verkippung des Umlenkelementes in Bezug zur optischen Achse umwandelt.Microscope according to claim 4, wherein the connection takes place via a solid-state joint which converts a translational displacement of the pinhole arrangement, preferably perpendicular to the optical axis of the detection beam path into a displacement of the lens or lens group or in a tilting of the deflection element with respect to the optical axis. Mikroskop nach Anspruch 4, wobei die Linse oder Linsengruppe oder das Umlenkelement an ihrem Rand mit einem um einen Drehpunkt verstellbaren Hebel, vorzugsweise über ein Festkörpergelenk, mit der Pinholeanordnung verbunden ist.Microscope according to claim 4, wherein the lens or lens group or the deflecting element is connected at its edge with a pivotable about a pivot lever, preferably via a solid-state joint, with the Pinholeanordnung. Mikroskop, insbesondere nach Anspruch 1, 2 oder 3, mit einem Beleuchtungsstrahlengang und einem Detektionsstrahlengang mit einer Kamera wobei die Kamera zum Ausgleich eines Abdriftens des Pinholes eine mechanische Verbindung zu mindestens einer Linse oder Linsengruppe oder mindestens eines Umlenkelementes in einem gemeinsamen Teil des Detektionsstrahlenganges aufweist.Microscope, in particular according to claim 1, 2 or 3, with an illumination beam path and a detection beam path with a camera wherein the camera has a mechanical connection to at least one lens or lens group or at least one deflection element in a common part of the detection beam path to compensate for drifting the pinhole. Mikroskop nach Anspruch 7, wobei die Verbindung über ein Festkörpergelenk erfolgt das eine translatorische Verschiebung der Kamera, vorzugsweise senkrecht zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs in eine Verschiebung der Linse oder Linsengruppe oder in eine Verkippung des Umlenkelementes in Bezug zur optischen Achse umwandelt.Microscope according to claim 7, wherein the connection is via a solid-state joint which translates a translational displacement of the camera, preferably perpendicular to the optical axis of the detection beam path in a shift of the lens or lens group or in a tilting of the deflection element with respect to the optical axis. Mikroskop nach Anspruch 7, wobei die Linse oder Linsengruppe oder das Umlenkelement an ihrem Rand mit einem um einen Drehpunkt verstellbaren Hebel, vorzugsweise über ein Festkörpergelenk, mit der Kamera verbunden ist.Microscope according to claim 7, wherein the lens or lens group or the deflecting element is connected at its edge to a pivotable about a pivot lever, preferably via a solid-state joint, with the camera. Kombination der unabhängigen Ansprüche 1, 4 und 7 und ihrer Unteransprüche miteinander.Combination of independent claims 1, 4 and 7 and their subclaims with each other.
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