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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion der Ionen in hochauflösenden Flugzeitmassenspektrometern,
die mit sekundärelektronenverstärkenden
Vielkanalplatten betrieben und in denen viele Einzelspektren aufgenommen
und zu einem Summenspektrum verarbeitet werden.
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Die
Erfindung besteht darin, statt der bisher für höchste Signalauflösungen benutzten
Ereigniszähler (Time-to-Digital-Converter,
TDC) einen Analog-Digital-Wandler (Analog-to-Digital-Converter, ADC) für die Wandlung
der Elektronenströme
aus den Sekundärelektronenvervielfachern
(SEV) zu verwenden, für
jedes Einzelspektrum jedoch mit einem schnellen Rechenverfahren
eine eigene Peakerkennung der Ionensignale durchzuführen, und
die so ermittelten gemittelten Flugzeiten der Ionen und deren Intensitäten zu einem
Flugzeit-Intensitäts-Histogramm
zusammenzustellen, das wie bei TDC-Verfahren als Flugzeitspektrum
weiterverarbeitet wird. Die Erfindung bewahrt die wesentlich höhere Messdynamik
eines ADC und erzielt das bessere Auflösungsvermögen eines TDC, ohne jedoch
dessen bekannte Signalverzerrung durch Totzeiten zu zeigen.
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Stand der
Technik
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Viele
Flugzeitmassenspektrometer akquirieren in schneller Folge Einzelflugzeitspektren,
die jeweils nur die Signale weniger Ionen enthalten und so jeweils
sehr lückenhafte
Einzelspektren aufweisen. Tausende dieser Einzelflugzeitspektren,
die mit einer sehr hohen Frequenz von Zehntausenden von Spektren
pro Sekunde aufgenommen werden, werden dann sofort zu einem Summenspektrum
verarbeitet, um brauchbare Flugzeitspektren mit einigermaßen gut
ausgeprägten
Signalen für
die Ionensorten verschiedener Massen zu erhalten.
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Aus
diesen Flugzeitspektren werden Massenspektren berechnet. Es ist
das Ziel dieser Flugzeitmassenspektrometer, die Massen der einzelnen
Ionenspezies möglichst
genau zu bestimmen. Zur Zeit sind die Entwickler von Massenspektrometern
dabei, die erzielbare Massengenauigkeit je nach Spektrometerart
von 30 auf 10 ppm, oder von 10 auf 5 ppm zu verbessern, aber es
steht schon das Ziel von 3 ppm oder gar 2 ppm real am Horizont.
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Unter
der Angabe „ppm" (parts per million)
für die
Genauigkeit wird dabei die relative Genauigkeit der Massenbestimmung
in Millionsteln der Masse verstanden. Die Genauigkeit ist wiederum
statistisch und unter der stillschweigenden Annahme einer Normalverteilung
der Messstreuung als deren Breiteparameter Sigma festgelegt. Dieser
Breiteparameter gibt den Abstand zwischen Wendepunkt und Maximum
der Gaußschen Normalverteilungskurve
an. Definitionsgemäß gilt dann
folgendes: Wird die Massenbestimmung vielfach wiederholt, so befinden
sich 68% der Werte im beidseitig aufgespannten einfachen Sigma-Intervall
(also zwischen den Wendepunkten), 95,57% im doppelten Sigma-Intervall,
99,74% im dreifachen Sigma-Intervall und 99,9936% im vierfachen
Sigma-Intervall der normalverteilten Fehlerstreukurve.
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Massenspektrometer
dieser Art werden besonders in der molekularen Biochemie eingesetzt,
beispielsweise, um die Massen der Peptide eines tryptischen Verdaus
eines Eiweißes
zu bestimmen. Aus den genau bestimmten Massen dieser Verdaupeptide
lässt sich
das Eiweiß durch
Suche in einer Proteinsequenzdatenbank identifizieren, wobei die
Güte der
Identifizie rung von der Genauigkeit der Massenbestimmung abhängt. Die
Genauigkeit wird für
die Angabe einer Massentoleranz für die Suche benötigt: Möchte man,
dass kein virtuelles Verdaupeptid der Datenbank bei der Suche verloren
geht und für
die Identifizierung unberücksichtigt
bleibt, so gibt man beispielsweise den vierfachen Wert der erzielten
Genauigkeit ein (definiert als einfaches Sigma der Normalverteilung).
Bei einer massenspektrometischen Genauigkeit von 10 ppm gibt man also
eine Massentoleranz von 40 ppm an, um mit einer Sicherheit von 99,9936%
alle virtuellen Verdaupeptide für
die Identifizierung zu berücksichtigen.
Dabei können
jedoch auch andere Eiweiße,
mit virtuellen Verdaupeptiden zufällig ähnlicher Gruppierung, in die
Suche einfließen:
die Suche ist nicht mehr eindeutig. Die Eingabe einer geringeren
Massentoleranz kann helfen, aber dabei können wiederum Verdaupeptide
wegen zu ungenauer Massenmessung ausgeschlossen werden und somit
zu einer schlechten Bewertung der Suche führen. Es ist somit der einzige
Ausweg, zu einem Massenspektrometer mit höherer Genauigkeit der Massenbestimmung
zu greifen.
Tabelle
1: Fehlerverteilungsbreiten 2×Sigma
als Funktion der Masse und der Genauigkeit
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Die
doppelseitigen Verteilungsbreiten 2×Sigma der Fehler in der Flugzeitbestimmung,
die der Massenbestimmung vorausgeht, sind in Tabelle 1 für ein Flugzeitmassenspektrometer
wiedergegeben, das für
Ionen der Masse 5000 vereinheitlichten atomaren Masseneinheiten
gerade eine Flugzeit von 50 Mikrosekunden aufweist. (Die "vereinheitlichte
atomare Masseneinheit" ist
eine inkohärente
SI-Einheit mit der Abkürzung "u", in Deutschland eine gesetzlich vorgeschriebene
Maßeinheit).
Die Verteilungsbreiten 2×Sigma
entsprechen dem Abstand zwischen den beiden Wendepunkten der Gaußschen Normalverteilung;
sie sind in Nanosekunden angegeben. Für eine Genauigkeit von 5 ppm
muss die (gemittelte) Flugzeit der Ionen einer Masse von 1000 atomaren
Masseneinheiten auf 56 Picosekunden (plus/minus 28 Picosekunden)
genau bestimmt werden. (Die Flugzeiten der Ionen müssen relativ
jeweils doppelt so genau bestimmt werden, wie die erforderliche
relative Massengenauigkeit, da die Massen dem Quadrat der Flugzeiten
proportional sind). Diese Zahlen sind unabhängig von der Fluglänge des
Apparates, eine kürzere
Fluglänge
bedarf dann einer geringeren Beschleunigungsspannung für die Ionen.
Tabelle
2: Linienbreiten als Funktion der Masse und der Massenauflösung
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Die
Tabelle 2 gibt die vollen Breiten der Ionensignale (oft als Ionenpeaks
bezeichnet) in halber Maximalhöhe
(FWHM = full width at half maximum) wieder, die für vorgegebene
Massenauflösungen
maximal erlaubt sind. Diese Peakbreiten sind ebenfalls in Nanosekunden
angegeben.
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Die
oben besprochenen Genauigkeitsanforderungen sind nur zu erfüllen, wenn
eine gute Massenauflösung
erreicht wird. Die Massenauflösung
R ist definiert als Massenwert m geteilt durch die Linienbreite Δm in halber
Signalhöhe,
wobei die Linienbreite Δm
in denselben Masseneinheiten zu messen ist wie die Masse m (R =
m/Δm). Es
gibt keine strenge Beziehung zwischen der Massenauflösung und
der daraus resultierenden Genauigkeit der Massenbestimmung; es ist
jedoch so, dass bei gleicher Ionenanzahl in einem Ionenpeak eine bessere
Auflösung
auch eine bessere Massengenauigkeit ergibt. Die zur Verfügung stehenden
Ionen sind in einem schmaleren Signalband vereinigt, das Signal
ist höher
und das Signal zeigt in der Nähe
der Signalspitze weniger Rauschen.
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Als
sehr grobe Faustregel kann hier gelten, dass die Lage eines Signals
auf etwa 1/20 seiner Breite genau festgelegt werden kann. Das bedeutet,
dass für
eine angestrebte Genauigkeit von 5 ppm für die Massenberechnung eine
Auflösung
von etwa R = 20000 angestrebt werden muss. Das gilt aber nur für einzeln
stehende Linien. Für
die Peaks einer Isotopengruppe gilt das nur, wenn die Isotopenlinien
des Ionensignals relativ gut aufgelöst sind, wenn also die Täler zwischen
den Maxima recht gut eingeschnitten sind, und wenn nur eine einzelne
Linie für
die Massenbestimmung herangezogen wird. Überlappen sich die Peaks einer
Isotopengruppe, so lässt
sich die erwünschte
Massengenauigkeit nicht erreichen.
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Da
die organischen Ionen höherer
Massen eine Vielzahl von Isotopenlinien aufweisen (siehe dazu
1),
kann man im Fall einer Isotopenauflösung ein besonderes Verfahren
der Massenbestimmung anwenden, das in
DE 198 03 309 (entsprechend
US 6,188,064 ) beschrieben
ist. Dieses Verfahren ergibt eine erhöhte Massengenauigkeit. Dieses
hier zur Vereinfachung „SNAP" genannte Verfahren
besteht darin, nicht die Ionensignale der Isotopenpeaks einzeln
zur Massenbestimmung heranzuziehen, sondern die an sich recht gut
bekannte reale Isotopenstruktur gemeinsam in die gemessene Signalgruppe
einzupassen. Dabei erhöht
sich die Massengenauigkeit mit der Wurzel aus der Anzahl der zur
Verfügung
stehenden Flanken, da diese die Güte der Einpassung bestimmen.
Bei acht gut ausgeprägten
Flanken lässt
sich so die Massengenauigkeit um einen Faktor zwei verbessern, wobei
allerdings vorauszusetzen ist, dass die Massenkalibrierkurve diese
Genauigkeit hergeben kann. Es lässt
sich mit diesem Verfahren eine Massengenauigkeit von 5 ppm bereits
erreichen, wenn eine Massenauflösung
von etwa 10000 erreicht wird. (Es soll aber nicht aus den Augen
verloren werden, dass sich das Ziel auf 3 oder sogar 2 ppm Genauigkeit
richtet).
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Aus
der Tabelle 2 ersieht man, dass man es mit sehr schmalen Signalbreiten
zu tun hat, wenn man ein Auflösungsvermögen in der
Gegend von 20000 anstrebt. Die Signalbreiten liegen (immer als volle
Breiten in halber Höhe
gemessen) bei 0,3 bis etwa 2,5 Nanosekunden für Massen von 100 bis 5000 atomaren
Masseneinheiten. Selbst für
eine Auflösung
von R = 10000 sind Signalbreiten von 0,7 bis 5 Nanosekunden erforderlich.
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In
den Massenspektrometern dieser Art werden ausnahmslos Sekundärelektronenvervielfacher
(SEV) für
die Messung der Ionenströme
eingesetzt. Sie sind als so genannte Vielkanalplatten ausgebildet
(multi-channel plates) mit Kanälen
von etwa 3 bis 25 Mikrometer Durchmesser, die schräg zur Plattenebene
angeordnet sind, damit die Ionen nicht einfach hindurchfliegen können. Es
werden regelmäßig zwei
Kanalplatten mit versetzten Winkeln der Kanäle hintereinander geschaltet,
um eine stärkere
Verstärkung
der Elektronenströme
zu erzielen. Die Verstärkung
kann auf Werte von 105 bis 107 eingestellt
werden, aus einem Ion können also
105 bis 107 Sekundärelektronen
werden, die auf einer nachgeschalteten Elektrode aufgefangen werden. Die
Detektoren sind kompliziert aufgebaut (siehe dazu 5),
um keine Signalverzerrungen zu erzeugen; der Fachmann kennt aber
die Anordnungen, so dass hier nicht weiter auf diese Detektoren
eingegangen zu werden braucht. In Verbindung mit einem Nachverstärker lassen
sie sich grundsätzlich
so einstellen, dass ein einzelnes Ion ein Signal ergibt, das sich
aus dem elektronischen Rauschen signifikant heraushebt.
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Der
Prozess der lawinenartigen Sekundärelektronenverstärkung in
den einzelnen Kanälen
der Platten führt
aber auch zu einer Verbreiterung des Elektronenstromsignals. Aus
einem einzigen auftreffenden Ion wird ein Signal von 1,1 Nanosekunden
Breite erzeugt, und das nur mit den besten Kanalplattenpaaren, die
heute kommerziell erhältlich
sind. Die Signalbreiten preiswerterer Kanalplattenpaare liegen bei
1,4 bis 2 Nanosekunden. Es ist nicht zu erwarten, dass hier in Zukunft
wesentliche Fortschritte erzielt werden können, da die Technik im Wesentlichen
ausentwickelt ist.
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Für die Abtastung
des verstärkten
Ionenstroms lassen sich so genannte Transientenrekorder einsetzen,
die mit Abtastraten bis zu 4 Gigahertz arbeiten. Interessanterweise
ist auch hier festzustellen, dass diese Technik weitgehend ausgereift
ist. Während
für andere
elektronische Bauteile und Systeme festzustellen ist, dass sich
die Verarbeitungsgeschwindigkeit etwa alle 1,5 bis maximal 3 Jahre
verdoppelt, ist auf dem Gebiet der Transientenrekorder trotz scharfer
Konkurrenz einiger Firmen seit etwa 6 Jahren keine Erhöhung der
Abtastrate mehr erfolgt – und
es ist abzusehen, dass auch in den nächsten Jahren keine wesentliche Änderung eintreten
wird.
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Tastet
man den Elektronenstromverlauf aus den Kanalplatten Punkt für Punkt
ab, beispielsweise durch solch einen Transientenrekorder mit 4 Gigahertz,
so erhält
man bei Verwendung bester Gerätschaften
Mindestsignalbreiten von 1,1 Nanosekunden für jedes einzelne Ion, unabhängig von
der Masse des Ions. Werden die Signalprofile für mehrere Ionen aufaddiert,
oder treffen mehrere Ionen der gleichen Masse gleichzeitig ein, so
sind die Signalbreiten noch größer, da
ja auch noch Fokussierungfehler der Massenspektrometer, nicht kompensierte
Einflüsse
anfänglicher
Energieverteilungen der Ionen vor dem Auspulsen und andere Einflüsse eine
Rolle spielen. Diese Einflüsse
ergeben zusätzliche
Signalverschmierungen in der Größenordnung
von einer Nanosekunde, meist ebenfalls abhängig von der Masse der Ionen.
Vor allem sind auch die verschiedenen Eindringtiefen der Ionen in
die Kanäle
der Vielkanalplatten zu berücksichtigen,
die zu verschiedenen Auslösezeiten
für die
Elektronenlawinen führen.
Eine Streuung der Eindringtiefen über nur 10 Mikrometer bringt
bei einer effektiven Flugweglänge
von einem Meter eine Streuung der Flugzeiten um plus/minus 5 ppm,
und damit eine Streuung der Massen um plus/minus 10 ppm. Bei einer
Verdoppelung der Flugstrecke halbieren sich diese Werte – dieser
Effekt auf die Signalbreite ist übrigens
der einzige, der sich (bei gegebener Streuung der Eindringtiefen)
nur über
eine Verlängerung
der Flugwegstrecke verbessern lässt.
Da sich der Erfahrung nach alle diese Beiträge zur Signalbreite pythagoräisch addieren
(also die Wurzel aus den addierten Breitenquadraten bilden), lassen
sich Signalbreiten unter 1,1 Nanosekunden überhaupt nicht und unter 1,5
Nanosekun den auch nur mit den allerbesten Spektrometern und Detektoren
erzielen, meist liegen die realen Signalbreiten im Bereich von 2
bis 5 Nanosekunden.
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Diese
Werte liegen aber erheblich über
den Wegen, die für
eine gewünschte
Auflösung
von R = 20000 (oder auch nur für
R = 10000) notwendig sind. Nach der oben genannten Faustregel lassen
sich damit die gewünschten
Massengenauigkeiten von 5 ppm nicht erreichen, jedenfalls nicht über den
ganzen Massenbereich. Schlussfolgerung: Man kann nicht einfach den
Elektronenstrom mit einem Transientenrekorder abtasten und die Einzelspektren
addieren; die Signalbreiten werden dann zu schlecht. In der Praxis
werden daher auch andere Verfahren eingesetzt, die hier, zusammen
mit dem Stand der Technik der Flugzeitmassenspektrometer, kurz beschrieben
werden sollen.
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In
Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss in Form
eines kontinuierlichen Ionenstrahles werden Ausschnitte aus diesem
Ionenstrahl durch einen Pulser periodisch in die Driftstrecke des Massenspektrometers
eingeschossen. Dabei werden anfängliche
Verteilungen der Ionen in Raum und Geschwindigkeit so weit wie möglich kompensiert.
Die Ionen werden gewöhnlich
außerhalb
des massenspektrometrischen Vakuumsystems durch Elektrosprühen erzeugt.
Es werden Pulswiederholungsraten, und somit auch Spektrenaufnahmeraten
von 10 bis 30 Kilohertz eingestellt. Die Daten der obigen Tabellen
beruhen auf einem Massenspektrometer, das eine Pulswiederholungsfrequenz
von 20 Kilohertz aufweist, entsprechend ist für die schwersten Ionen eine
Flugzeit von 50 Mikrosekunden erlaubt. In den einzelnen Ionenpulsen,
die jeweils ein Einzelspektrum ergeben, befinden sich nach bisheriger
Technik (an deren Verbesserung aber allerortens gearbeitet wird)
nur jeweils sehr wenige Ionen. Es kommt insbesondere sehr selten
vor, dass in einem Massensignal für die Ionensorte einer Masse
zwei oder mehr Ionen befinden, normalerweise setzt sich ein Ionensignal
einer Masse aus wenigen Ionen zusammen, die aus einer sehr viel
größeren Anzahl
von Spektrenaufnahmen stammen. (Es ist jedoch zu beachten, dass
hier starke Verbesserungen der Ionenquellen zu erwarten sind, die
zu Ionenströmen
führen
werden, die mit dem nachfolgend geschilderten Aufnahmeverfahren nicht
mehr zu bewältigen
sind).
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Wegen
der wenigen Ionen pro Puls werden in allen kommerziell erhältlichen
Geräten
dieser An Ereigniszähler
(Time-to-Digital-Converter: TDC) eingesetzt. Überschreitet der aus den Vielkanalplatten
kommende und von einer Elektrode aufgenommene Elektronenstrom eine
bestimmte Schwelle, so wird ein Ereignis registriert. Dieses Ereignis
wird als reiner Zeitwert festgehalten, eine dazugehörige Intensität gibt es
nicht. Ein einzelnes Ion löst
bereits dieses Ereignis aus. Ein Unterschied zwischen einem Ereignis
aus einem einzelnen Ion und einem Ereignis aus vielen gleichzeitig
ankommenden Ionen kann mit dem Ereigniszähler nicht festgestellt werden.
Die Zeitwerte werden sodann in ein Histogramm der Ereignisse eingestellt.
Dieses Histogramm besteht aus vielen einzelnen, jeweils gleich großen Zeitintervallen.
Für jedes
Zeitintervall existiert ein Zähler
für die
Ereignisse, die innerhalb dieses Zeitintervalls stattfinden. Das
Histogramm wird normalerweise in einem Abschnitt eines Computerspeichers
gebildet, wobei für
jedes Zeitintervall eine Speicherzelle zum Zählen der Ereignisse vorgesehen
ist. Beispielsweise kann für
jeweils 250 Picosekunden eine solche Speicherzelle als Zähler vorhanden
sein. Ein Spektrum über
50 Mikrosekunden maximaler Zeitdauer würde dann in 200 000 Speicherzellen
für die
Zeitintervalle zu je 250 Picosekunden bestehen. In diesen Speicherzellen
werden die Ereignisse der zugehörigen
Zeitwerte addiert, es ergibt sich eine histogrammartige Darstellung
des Flugzeitspektrums.
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Es
sei hier zur Klärung
die Definition eines „Histogramms" wiedergegeben (aus
Brockhaus Naturwissenschaften und Technik, 1989): „Histogramm,
Abbildung einer aus einer Stichprobe gebildeten Treppenfunktion
zur Darstellung der Verteilung eines Merkmals. Der Wertebereich
der unabhängigen
Variablen wird in gleich große
Abschnitte eingeteilt, innerhalb derer die abhängige Variable einen konstanten
Wert hat."
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Mit
der Verwendung eines TDC werden also die Zeiten der Anstiegsflanken
der elektrischen Signale festgehalten, gleichgültig, ob das elektrische Signal
durch ein einzelnes Ion oder durch einen Schwarm aus mehreren Ionen
gleicher Masse und somit gleicher Flugzeit erzeugt wird. Die Breite
des Elektronenlawinensignals geht überhaupt nicht ein; daher lassen
sich höhere
Auflösungsvermögen erzielen
als mit der Verwendung von ADC. Die Verwendung von TDC hat aber
schwerwiegende Nachteile.
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Ein
erster Nachteil der Verwendung von Ereigniszählern ist die eingeschränkte Messdynamik.
Wenn der in das Flugzeitmassenspektrometer eingeschossene Ionenstrahl
so intensiv wird, dass häufiger
mehrere Ionen gleicher Masse in einem Puls in die Driftstrecke des
Flugzeitmassenspektrometers beschleunigt werden, geht die Information über die
Anzahl dieser Ionen gleicher Masse verloren. Sie kann zwar in gewisser
Weise durch statistische Betrachtungen der Häufigkeit der einzelnen Ereignisse
wieder korrigiert werden, doch versagt auch diese Korrektur sehr
rasch mit weiter ansteigender Strahlintensität.
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Ein
zweiter Nachteil, der mit der Verwendung von Ereigniszählern verbunden
ist, wird durch die Totzeit des Zählers nach Eintreten eines
Ereignisses gebildet. Es ist ohne weiteres einsehbar, dass nach
Auslösen eines
Ereignisses das nächste
Ereignis erst dann wieder gemessen werden kann, wenn die Auslöseschwelle vom
Elektronenstromverlauf wieder unterschritten wurde. Der Detektor
ist also für
die Zeit der Breite des Signals blind. Diese Totzeit vergrößert sich,
wenn in der Zeit der Signalbreite ein zweites oder sogar drittes
Ereignis eintritt, da sich dann die Signalbreite immer weiter verbreitert
und die Auslöseschwelle
nicht mehr unterschreitet. Das zweite oder dritte Ion muss gar nicht
die gleiche Masse besitzen, es kann sich durchaus um ein Ion handeln,
das um eine oder sogar zwei atomare Masseneinheiten größer ist
und zu einer anderen Isotopenlinie gehört. Dieses Verhalten kann man
künstlich
etwas verbessern, wenn man nicht eine absolute Schwelle benutzt,
sondern eine Schwelle der Anstiegssteilheit, also eine Schwelle
der ersten Ableitung. Aber auch das hilft nur sehr beschränkt.
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Dieses
Verhalten von Ereigniszählern
führt zu
einer Verzerrung der Signalintensitäten, wenn sich die Totzeit
auf die benachbarten Isotopensignale auswirkt. Die Verzerrung ist
umso größer, je
höher die
Intensität des
Ionenstrahls wird, da dann immer mehr Nachbarereignisse unterdrückt werden.
Das Verhalten wird durch die 1 und 3 (mit
zugehörigem
Text) dargestellt: 1 zeigt die theoretisch berechnete
Isotopenhäufigkeit
von fünffach
geladenem Insulin (monoisotopisches Molekulargewicht 5735,65 u),
deren Signalgruppe sich auf der Massenskala etwa zwischen m/z =
1147 und m/z = 1149,5 u befindet (m = Masse, z = Anzahl der Elementarladungen
des Ions). 3 dagegen zeigt das mit einem
TDC aufgenommene häufigkeitsverzerrte
Spektrum. Das Verhältnis
von Peak 5 zu Peak 2 sollte etwa 2:1 betragen, ergibt sich aber
durch die Einwirkung der Totzeit zu etwa 1:1.
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Setzt
man dagegen statt des Ereigniszählers
(TDC) einen vielkanaligen Analog-zu-Digital-Wandler (ADC) mit schnellem Addierwerk
für die
Spektren ein, wie sie unter dem Namen „addierende Transientenrekorder" auf dem Markt sind,
und addiert man einfach die durch Vielkanalplatten und Nachverstärker wiedergegebenen
Ionenstromprofile, so reduziert man zwar das Auflösungsvermögen, erhält aber
die richtige Isotopenverteilung. Genügt das Auflösungsvermögen für die Anwendung des SNAP-Verfahrens
(etwa im Bereich hoher Massen), so erhält man zufrieden stellende
Massengenauigkeiten. Häufig
genügt
jedoch das Auflösungsvermögen nicht,
wie man an der Isotopengruppe des fünffach geladenen Insulins in 2 (mit
zugehörigem
Text) erkennen kann. Es wurde hier ein 2-Megahertz-Transientenrekorder
benutzt. Die 2 ist durchaus typisch, da große Molekülionen,
die durch Elektrosprüh-Ionisierung
erzeugt wurden, immer so viele Ladungen erhalten, dass sie im Bereich
zwischen m/z = 1000 und m/z = 2000 die Isotopengruppe mit der größten Intensität zeigen. Gerade
in diesem m/z-Bereich möchte
man daher die größte Auflösung erzeugen.
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Die
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss eines kontinuierlichen
Ionenstrahles ist aber nicht das einzige Problemgebiet für eine Minderung
der Auflösung
durch den Detektor. Ein sehr ähnliches Problem
besteht bei Flugzeitmassenspektrometern mit einer pulsförmigen Ionisierung
durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI). Hier werden grundsätzlich nur Transientenrekorder
mit ADC eingesetzt, weil überwiegend
in einem zusammengehörigen
Ionensignal eines Ionisierungspulses viele Ionen der gleichen Masse
vorkommen können.
Es werden hier typischerweise 50 bis 500, in einigen Geräten aber
auch einige Tausend Spektren addiert. Auch für diese MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
ist die Peakbreite der Ionensignale für Ionen der gleichen Masse
vielfach durch die Breite der Elektronenlawine in der Vielkanalplatte
begrenzt.
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Als
nächstliegender
Stand der Technik für
die Auswertung von histogrammartigen Spektren kann hier
US 6,253,162 B1 (K.
H. Jarman et al.) angesehen werden, in dem zur Identifizierung von
charakteristischen Strukturen im Spektrum dispersionskritische Werte
berechnet und zum Vergleich herangezogen werden. Dadurch werden
insbesondere Signale besser vom Rauschen unterschieden.
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In
der Patentschrift
DE
198 08 584 C1 (J. Franzen) wird ein Verfahren zur Schnellauswertung
von Massenspektren, insbesondere Flugzeitmassenspektren, für das Auftreten
von Ionensignalen an vorher bekannten Stellen angegeben, indem die
gemessenen Ionenstromwerte an der vorbekannten Stelle mit einem
Profil von Gewichten multipliziert werden, mit dem auch sehr schwache
Ionenstromsignale erkannt werden können.
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein Detektionsverfahren zu finden,
das die Zeitauflösung
eines TDC mit der Messdynamik und der Intensitätstreue eines ADC verbindet.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Es
ist die Grundidee der Erfindung, zwar einen Analog-Digital-Wandler
(ADC) für
die Abtastung der durch Detektor und Nachverstärker verstärkten Ionenströme zu verwenden,
aber die Einzelflugzeitspektren nicht einfach von Messwert zu Messwert
zu einem Summenflugzeitspektrum schlechter Auflösung aufzuaddieren, sondern
jedes Einzelflugzeitspektrum einem Peakfindungsalgorithmus zu unterwerfen,
und aus den so gefundenen „gemittelten" Flugzeiten der zusammengehörigen Ionenpeaks
ein Flugzeit-Intensitäts-Histogramm
zu erstellen, wobei – anders
als bei der Verwendung von TDC – in
den Speicherzellen des Histogramms die „gemittelten" Intensitäten der
Peaks addiert werden. Bei diesem Vorgehen geht die Breite der Flugzeitsignale
nicht in das Ergebnis ein (ähnlich
wie bei Verwendung eines TDC), wohl aber gehen die Intensitäten der
Peaks ein, so dass die richtigen Isotopenverteilungen gemessen werden,
auch wenn höhere
Ionenströme
vorliegen, die viele Ionen in einem Peak eines Einzelspektrums zur
Folge haben.
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Unter „gemittelten" Flugzeiten sollen
hier nicht einfach die rechnerischen Mittelwerte verstanden werden,
sondern die Ergebnisse der Flugzeitberechnungen des betreffenden
Peakfindungsalgorithmus. Gleiches betrifft die „gemittelten" Intensitäten der
Peaks. Auch sie sind Ergebnisse der Berechnungen des jeweiligen Peakfindungsalgorithmus.
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Die
Breite der Signalpeaks im Histogramm wird jetzt nur noch durch die
Streuungen der Flugzeiten gebildet, nicht mehr durch die zeitliche
Breite der Elektronenlawine in den Vielkanalplatten. Die Streuungen
der Ionenflugzeiten werden ausschließlich durch fehlerhafte Fokussierungen
der Ionen gleicher Masse im Flugzeitspektrometer, durch nicht korrigierte
Anfangsenergiestreuungen, durch die Streuung der Eindringtiefen
der Ionen in die Vielkanalplatte, und durch statistische Peakverzerrungen
(Rauschen) in den Einzelspektren erzeugt. Die meisten dieser Ursachen
unterliegen der Beeinflussung durch den Entwickler; eine Verbesserung der
Auflösungsvermögen ist
somit in Reichweite.
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Die
Algorithmen zur Peakfindung müssen
notgedrungen sehr einfach sein, da sie mit der Geschwindigkeit der
Digitalisierung mithalten müssen,
um keinen Datenstau zu erzeugen. Es ist besonders günstig, wenn
auch die Peakfindung im Takt der Datenaufnahme erfolgt. Das geht
bei Digitalisierungsraten von 2 oder sogar 4 Gighertz nur mit sehr
speziellen Rechennetzwerken (beispielsweise mit sehr schnellen „field
programmable gate arrays",
FPGA), die eine parallele Datenverarbeitung erlauben, um mit der
Aufnahmerate Schritt zu halten.
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Es
ist daher eine weitere Grundidee der Erfindung, für die Peakfindung
eine Differenzenbildung zur Berechnung einer ersten Ableitung zu
verwenden, wobei der Nulldurchgang aufeinander folgender Differenzen das
Peakmaximum anzeigt. Die Intensität wird als Summe über zwei
oder mehr Messpunkte errechnet, im Grenzfall genügt der Messwert des Maximums
selbst. Der ganze Rechenvorgang kann im Rechennetzwerk vernetzt-parallel
ausgeführt
werden. Für
genauere Berechnungen können
geglättete
Differenzenbildungen aus jeweils insgesamt 4 oder mehr Messwerten
gebildet werden, für
die Intensität
Summen von 4 oder mehr Messwerten. Listen mit Flugzeiten und Intensitäten können an
andere Rechner weitergegeben werden, die das Histogramm erstellen.
Die Transientenrekorder werden so erheblich einfacher, da sie nicht
mehr die schwierige Aufgabe haben, die ganzen Spektren zu addieren.
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Zusätzliche
Schwellenprüfungen
für die
Intensitätssumme
oder für
das Maximum der Ableitung kurz vor dem Nulldurchgang können verhindern,
dass Rauschpeaks in das Histogramm übernommen werden.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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Die 1 bis 4 stellen
alle die fünffach
geladene Isotopengruppe des Insulins dar. Das Molekulargewicht beträgt etwa
5700 atomare Masseneinheiten. Die Peakgruppe erscheint auf der Massenskala etwa
bei m/z = 1147.
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1 zeigt
die berechnete Isotopenverteilung, gewonnen aus einer Überlagerung
von Gauß-Kurven, deren
Breite so gewählt
wurden, dass sich ein Auflösungsvermögen von
R = 8200 ergibt.
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2 gibt
eine Messkurve wieder, die mit einem Transientenrekorder mit 2 Gigahertz
Aufnahmerate seines Analog-zu-Digital-Wandlers erzeugt wurde. Das
Massenauflösungsvermögen kommt
dabei über
R = 6000 nicht hinaus, ungenügend
für eine
genaue Massenbestimmung. Es wurden hier 10000 Einzelspektren summiert.
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3 zeigt
wiederum eine Messkurve, dieses Mal mit einem TDC in Form eines
Flugzeithistogramms aufgenommen. Das Auflösungsvermögen ist deutlich besser als
bei der ADC-Aufnahme der 2, jedoch stimmt die Häufigkeitsverteilung
der Isotopenlinien wegen des Totzeit-Effekts nicht mit der theoretisch
berechneten Verteilung aus 1 überein.
Die fünfte
Isotopenlinie ist hier nur etwa so groß wie die zweite Linie, während sie
eigentlich doppelt so groß sein
müsste.
Es wurden hier die Ereignisse aus 250000 Einzelaufnahmen addiert,
um Verfälschungen
durch Rauschen auszuschließen.
Diese Messkurve eignet sich nicht zur Anwendung des SNAP-Verfahrens
zur Berechnung der Masse mit erhöhter
Massengenauigkeit, da in diesem Verfahren das theoretische Isotopenmuster
(das in 1 gezeigt ist) eingepasst wird
und entsprechend passen muss.
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4 schließlich zeigt
eine Messkurve, das mit dem Verfahren nach dieser Erfindung aufgenommen wurde.
Es wurde ein ADC mit einer Taktrate von 2 Megahertz benutzt, aber
aus jedem Einzelspektrum wurden eine gemittelte Flugzeit der Ionen
eines zusammengehörigen
Ionensignals und eine gemittelte Intensität ermittelt. Aus den ermittelten
Flugzeiten und Intensitäten
wurde das abgebildete Flugzeithistogramm erstellt. Es wurden hier
nur 10000 Einzelspektren aufgenommen, also 25-mal weniger als in 3.
Das Messsignal zeigt daher mehr Rauschen, entspricht aber mehr den
praktisch erzielbaren Messbedingungen. Diese Messkurve lässt sich
hervorragend zur Massenbestimmung heranziehen, insbesondere auch
unter Verwendung des SNAP-Verfahrens, da die Isotopenhäufigkeitsverhältnisse
richtig wiedergegeben werden, wie man durch Vergleich mit 1 feststellen
kann. Es sei darauf hingewiesen, dass die restliche Breite der Signale
von nicht kompensierten Anfangsenergiestreuungen, von Fokussierungsfehlern
und von Streuungen der Eindringtiefen in Kanalplatten herrühren und
daher durch weitere Entwicklung der Geräte verbessert werden können.
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5 zeigt
ein Prinzipschema eines Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem
Ioneneinschuss. Durch eine Öffnung
(1) einer Vakuumkammer (2) tritt ein Bündel von
Ionen verschiedener Anfangsenergien und Anfangsrichtungen in ein
Ionenleitsystem (4) ein. Gleichzeitig tritt auch Dämpfungsgas
mit in das Ionenleitsystem ein. Im Gas werden die eintretenden Ionen
durch Stöße abgebremst.
Da im Ionenleitsystem ein Pseudopotential für die Ionen herrscht, das in
der Achse (5) am geringsten ist, sammeln sich die Ionen
in der Achse (5). Die Ionen breiten sich in der Achse (5)
bis zum Ende des Ionenleitsystems (4) aus. Das Gas aus
dem Ionenleitsystem wird durch die Vakuumpumpe (6) an der
Vakuumkammer (2) abgepumpt.
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Am
Ende des Ionenleitsystems (4) befindet sich das Ziehlinsensystem
(7), das in die Wand (8) zwischen Vakuumkammer
(2) für
das Ionenleitsystem (4) und Vakuumkammer (9) für das Flugzeitmassenspektrometer
integriert ist. Das Ziehlinsensystem (7) besteht hier aus
fünf Lochblenden;
es zieht die Ionen aus dem Ionenleitsystem (4) heraus und
formt einen feinen Ionenstrahl mit geringem Phasenvolumen, der in
den Pulser (12) fokussiert wird. Der Ionenstrahl wird in
x-Richtung in einen Pulser eingeschossen. Ist der Pulser mit durchfliegenden
Ionen der bevorzugt untersuchten Masse gerade gefüllt, so
treibt ein kurzer Spannungspuls ein breites Paket an Ionen quer
zur bisherigen Flugrichtung aus und bildet einen breiten Ionenstrahl,
der in einem Reflektor (13) reflektiert und von einem Ionendetektor
(14, 15) zeitlich hochaufgelöst gemessen wird. Im Ionendetektor
wird das Ionensignal, das in einem Sekundärelektronenverstärker in
Form einer doppelten Vielkanalplatte (14) verstärkt wird,
kapazitiv auf einen 50-Ω-Konus
(15) übertragen,
Das so bereits verstärkte
Signal wird über
ein 50-Ω-Kabel
an einen Analog-Vorverstärker
weitergegeben. Der 50-Ω-Konus
dient dazu, das Kabel eingangsseitig abzuschließen, so dass hier keine Signalreflektionen
stattfinden können.
Da es sich um Signale handelt, die nur wenige Nanosekunden breit
sind, muss auf extrem gute Weiterleitung der elektrischen Signale geachtet
werden, um jede weitere Verzerrung zu vermeiden. Die Signale des
Vorverstärkers
werden dann dem Digitalisierungssystem zugeführt.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
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Es
werde hier zunächst
eine Ausführungform
des Verfahren und des Gerätes
geschildert, die auf eine maximal erreichbare Auflösung abzielt.
In einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss,
wie es in 5 dargestellt ist, werde ein
qualitativ hochwertiges Vielkanalplattenpaar mit 1,1 Nanosekunden
Breite der Elektronenlawine und ein Transientenrekorder mit 4 Gigahertz
Abtastrate zur Abtastung des elektronenverstärkten Ionenstromes eingesetzt.
Dieser Transientenrekorder besitzt ein besonderes Rechennetzwerk.
Dieses Rechennetzwerk untersucht in Echtzeit die Einzelflugzeitspektren
auf das Auftreten von Ionenpeaks, berechnet deren Flugzeit und deren
Intensität,
und stellt diese Werte für
die addierende Einstellung in die Intervalle eines Histogramms zur
Verfügung.
Das Histogramm wird durch Speicherzellen in einem Speicherabschnitt
realisiert: für
jedes Zeitintervall des Histogramms ist eine Speicherzelle vorhanden.
Die Zeitintervalle des Histogramms sind in diesem bevorzugten Beispiel
gerade so lang wie die Taktzeiten des Transientenrekorders, entsprechen
also jeweils 250 Picosekunden. Da die maximale Spektrenaufnahmezeit
50 Mikrosekunden beträgt,
um 20 Kilohertz Spektrenaufnahmerate einhalten zu können, besteht
der Speicher zur Aufnahme des Histogramms aus 200 000 Speicherzellen.
Das Erstellen des Histogramms kann in einem Rechner erfolgen, der
vom Transientenrekorder getrennt ist, da zwischen Transientenrekorder
und Histogrammrechner nur relativ wenige Daten ausgetauscht werden.
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Untersuchungen
haben ergeben, dass bei dem unten detailliert geschilderte Rechenverfahren
zur Ermittlung von Flugzeit und Ionenintensität für einen optimalen Erfolg so
viele Messwerte der Wertefolge des Einzelflugzeitspektrums heranzuziehen
sind, dass die zur jeweiligen Berechnung der Ableitungsdifferenz
und der Intensitätssumme
benutzten Werte etwa 80% der Signalpeakbreite, gemessen in halber
Maximalhöhe, überdecken.
Für eine
Peakbreite von 1,1 Nanosekunden ist also die Verwendung von vier
Werten der 4-Gigahertz-Abtastung optimal. Es ist daher die nachfolgende
Schilderung ganz auf einen Algorithmus unter Verwendung von vier
Messwerten eingestellt.
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Die
in den Transientenrekordern benutzten ADCs haben Wandlungsbreiten
von acht Bit, daher können sie
Werte von 0 bis 255 Counts liefern. Nimmt man an, dass die Verstärkungen
von Kanalplatten und Vorverstärker
so eingestellt sind, dass ein einzelnes Ion zur sicheren Erkennung
einen Wert von fünf
Counts liefert, so beginnt bei etwa 50 Ionen gleichzeitig eine Sättigung
des Signals, die bei Überschreitung
zu einer Intensitätsverfälschung
führen
würde.
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Die
Ionenpeaks, deren Flugzeiten und Intensitäten zu bestimmen sind, können unterschiedslos
von einzelnen Ionen, aber auch von Schwärmen von Ionen gleicher Masse
mit bis zu etwa 50 Ionen gleichzeitig stammen. Alle Signalpeaks,
die von nur einem einzigen Ion stammen, haben die Breite von 1,1
Nanosekunden, unabhängig
von der Masse der Ionen. Es werde nun für die weitere Behandlung angenommen,
dass durch eine hervorragende Entwicklung des Flugzeitspektrometers
und durch eine hervorragende Kühlung
der eingeschossenen Ionen die Beiträge durch Fehlfokussierungen
und nicht kompensierte Anfangsenergiestreuungen sehr klein seien,
so dass sie keinen wesentlichen Beitrag zur Aufweitung der Ionensignale
liefern.
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Der
Algorithmus soll sowohl die Lage, also die Flugzeit, wie auch die
Intensität
jedes einzelnen Peaks berechnen. Die Lage kann am besten durch eine
geglättete
Bildung der ersten Ableitung gefunden werden, wobei ein Nulldurchgang
bei aufeinanderfolgend berechneten Ableitungswerten jeweils ein
Maximum (oder Minimum) anzeigt. Die Richtung des Nulldurchgangs
gibt an, ob ein Maximum oder Minimum vorliegt. Die Intensität wird durch
eine Summenbildung über
den Hauptteil des Peaks hinweg berechnet.
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Für die geglättete Bildung
der ersten Ableitung an der Stelle n in der Wertefolge w(n) des
Flugzeitspektrums werden jeweils vier Werte w benutzt: a(n) = w(n – 2) + w(n – 1) – w(n) – w(n +
1). (1)
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Tritt
bei der fortlaufenden Berechnung der Ableitungen a ein Übergang
von negativen zu positiven Werten ein, so liegt ein Peakmaximum
vor. Es wird jetzt die Insitätssumme s(n) = w(n – 2) + w(n – 1) + w(n)
+ w(n + 1) (2)auf
das Überschreiten
einer vorgewählten
Schwelle geprüft
und im positiven Fall in die Zelle n des Histogramms hinein addiert.
Die Berechnungen für
a und s können
durch die Bildung von Zwischensummen d und e aber noch vereinfacht
werden: d = w(n – 2) + w(n – 1) (3) e = w(n) + w(n + 1) (4) a(n) = d – e (5) s(n) = d + e. (6)
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Es
sind jetzt nur noch vier Additionen oder Subtraktionen durchzuführen, außerdem ist
auf die indizierten Werte der Wertefolge des Spektrums nur jeweils
einmal zuzugreifen.
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Als
Rechennetzwerke können
sehr schnelle FPGAs (Field Programmable Gate Arrays), aber auch speziell
entwickelte Bausteine eingesetzt werden. Die Berechnungen für aufeinanderfolgende
Messwerte können
weitgehend parallel zueinander und parallel zur weiteren Aufnahme
von Messwerten ausgeführt
werden; sie sind dann wenige Nanosekunden nach Abschluss der Einzelspektrenaufnahme
abgeschlossen. Die FPGA können
in einem langsameren Takt als die ADC betrieben werden, es muss
dann aber die Anzahl paralleler Rechenstränge erhöht werden. Die originalen Messwerte
brauchen in diesem Falle gar nicht gespeichert zu werden (die schnelle
Speicherung ist mit großen
Schwierigkeiten verbunden und kann nur in paralle len Speicherblöcken vorgenommen
werden). Die Liste der Flugzeiten und Intensitäten kann an einen weiteren Rechner
weitergereicht werden, der die Erstellung des Histogramms vornimmt.
Ein solcher Transientenrekorder kann weitaus einfacher aufgebaut
sein, als ein herkömmlicher
Rekorder, der das ganze Flugzeitspektrum addierend speichern muss.
Die Liste der Flugzeiten und Intensitäten umfasst im Allgemeinen
weit weniger als 1000 Eintragungen pro Einzelspektrum, also weit
weniger als ein Prozent der Messwerte für ein Einzelflugzeitspektrum:
die Erstellung des Flugzeit-Intensitäts-Histogramms ist also nicht
mehr zeitkritisch.
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Kurz
nach Abschluss der gewünschten
Anzahl von Einzelflugzeitspektren steht das Flugzeit-Intensitäts-Histogramm
für die
weitere Verarbeitung zur Verfügung.
Die weitere Verarbeitung besteht insbesondere in der Wandlung der
Flugzeiten zu Massenwerten, wobei der oben bereits erwähnte SNAP-Algorithmus
(siehe
DE 198 03 309 ,
entsprechend
US 6,188,064 )
eine besondere Rolle spielt, da er eine erhöhte Massengenauigkeit durch
die gleichzeitige Verwendung aller Isotopenpeaks erzielt. Diese
Wandlung der Flugzeiten in Massen ist im Prinzip bekannt und braucht
hier nicht weiter behandelt werden.
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Bei
der addierenden Einstellung der Werte in das Histogramm muss nicht
jedes kleinste Signal weitergegeben werden, da es sich in den meisten
Fällen
um Rauschpeaks handeln wird. Es soll dagegen erreicht werden, dass
nur wirkliche Ionen zum Histogramm beitragen, nicht zufällige Rauschspitzen.
Die Unterdrückung
kann am einfachsten durch eine Überprüfung des
berechneten Intensitätswertes
erreicht werden: nur Intensitätswerte,
die eine vorgegebene Schwelle überschreiten,
werden zur Einstellung in das Histogramm weitergegeben.
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Bei
einem Untergrund, der nicht über
das Spektrum hinweg konstant ist, sondern variierende Untergrundintensitäten zeigt,
ist eine solche Schwellenprüfung
höchst
problematisch. An einem Ende des Spektrums werden Rauschpeaks noch
zugelassen, am anderen Ende des Spektrums gehen schwache Ionensignale
verloren. In diesem Fall, der besonders bei höchstempfindlichen Transientenrekordern
auftritt, muss daher eine andere Art der Schwellenprüfung eingesetzt
werden: Es wird dabei nicht der Intensitätswert s(n) einer Schwellenprüfung unterworfen,
sondern der Wert der Ableitung a(n – 2) kurz vor Erreichen des
Nullvorgangs. Diese Prüfung
meidet die bekannten Schwierigkeiten einer Schwellenprüfung bei
veränderlichem
Untergrund.
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Diese
Ausführungsform
kann in vielfältiger
Weise variiert werden. So kann beispielsweise ein noch einfacherer
Algorithmus zur Peakmaximumerkennung eingesetzt werden, der aus
der Bildung einer Ableitung durch Differenzenbildung von nur jeweils
zwei Messwerten besteht und damit den Nulldurchgang bestimmt. Es kann
mit bestimmten Arten von Rechenwerken auch einfach festgestellt
werden, wann eine Folge von Werten nicht mehr größer wird, auch das ist die
Feststellung eines Maximums.
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Es
sind auch andere Ausführungen
des Rechenalgorithmus möglich.
Ist beispielsweise die minimale Peakbreite im Spektrum nicht gleich
vier Abtastwerten, sondern breiter (beispielsweise bei der Verwendung eines
schlechteren, aber wesentlich preiswerteren Vielkanalplattenpaars),
so müssen
die Gleichungen (1) und (2) entsprechend angepasst werden: a(n) = w(n – b) + ...
+ w(n – 1) – w(n) – ... – w(n +
b – 1), (7) s(n) = w(n – b) + ...
+ w(n – 1)
+ w(n) + ... + w(n + b – 1), (8) wobei b eine
Zahl ist, die der Anzahl von Werten über die halbe Breite des Peaks
entspricht.
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Die
Werte a der Ableitung und die Werte s der Intensitätssumme
können
für jeden
Wert von einzeln berechnet werden, in ähnlicher Weise, wie dies oben
beschrieben wurde; sie können
aber auch viel einfacher im Rechennetzwerk als fortlaufende Werte
berechnet werden, wobei Additionen entfallen. Dabei wird von folgenden
Beziehungen Gebrauch gemacht: a(n + 1) = a(n) – w(n + b) + w(n) + w(n) – w(n – b), und (9) s(n + 1) = s(n) – w(n – b) + w(n
+ b). (10)
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Das
Rechennetzwerk muss daher für
jeden aufgenommen neuen Wert sechs Additionen (oder Subtraktionen)
und zwei Vergleiche durchführen.
Nachteilig ist jedoch, dass dabei jede Berechnung verlangt, dass die
Berechnung für
den vorhergehenden Messwert abgeschlossen sein muss, bevor die Berechnung
des nächsten
beginnen kann. Das erfordert extrem schnelle Rechenwerke.
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Es
müssen
aber auch die Messtaktintervalle nicht mit den Flugzeitintervallen
des Histogramms übereinstimmen.
So kann beispielsweise das Histogramm die doppelte Anzahl von Flugzeitintervallen
haben, eventuell sogar die drei- oder vierfache Anzahl. Es ist dann
natürlich
eine genauere Bestimmung der Flugzeit aus den Messwerten erforderlich.
Diese genauere Bestimmung kann dadurch durchgeführt werden, dass festgestellt
wird, ob sich der Nulldurchgang näher am vorhergehenden Messwert
oder am nachfolgenden befindet. Für eine noch genauere Bestimmung
kann eine Interpolation zwischen den beiden Ableitungswerten um
den Nulldurchgang durchgeführt
werden, um eine genauere Lokalisierung des Nulldurchgangs zu erhalten.
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Für preiswertere
Geräte
oder für
Geräte
mit dem Zwang zu einer extrem schnellen Weiterverarbeitung der Spektren
mag auch eine Kompression des Histogramms in Frage kommen: dann
werden zwei oder mehr Flugzeitintervalle in einen Speicherplatz
zusammengezogen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
der Erstellung eines Flugzeithistogramms aus ADC-Werten hat den großen Vorteil,
eine Auflösung
wie die durch einen Ereigniszähler
zu erhalten, wie aus einem Vergleich der 3 und 4 hervorgeht.
Das erfindungsgemäße Verfahren
hat aber gegenüber
dem Verfahren mit einem Ereigniszähler den immensen Vorteil der
Intensitätstreue,
der die Anwendung sehr präziser
Massenberechnungen erlaubt. Die Intensitätstreue wird durch einen Vergleich
der 2, 3 und 4 deutlich.
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Es
gibt aber darüber
hinaus einen weiteren Vorteil, der nicht hoch genug eingeschätzt werden
kann: den Vorteil einer viel größeren Messdynamik.
Bei TDC-Verfahren wird von Herstellern empfohlen, keine höheren Ionenströme anzubieten,
als etwa einem Ion pro drei Spektrenzyklen in einem Ionenpeak entspricht.
Das ist leicht einsehbar: Tritt in einem Ionenpeak in jeder zweiten
Spektrenaufnahme ein Ion auf, so sehen wir bei 2000 Spektrenaufnahmen
(entsprechend einer Messdauer von 1/10 Sekunde für das Summenspektrum) gerade
1000 Ionen (50%). In Wirklichkeit sind aber 2000 Ionen angekommen.
In den 50% der Ereignisse, die scheinbar ein Ion enthalten, enthalten
25% der Ereignisse in Wirklichkeit zwei oder mehr Ionen, 12,5% der
Ereignisse drei oder mehr Ionen, 6,25% der Ereignisse vier oder
mehr Ionen. In der Summe sind es 100% oder 2000 Ionen statt der
vermeintlichen 1000 Ionen. Es tritt also sehr früh eine Sättigung ein, die zu der obigen Empfehlung
führt,
und die in unserer Aufnahmezeit von 1/10 Sekunde zu einer empfohlenen
Obergrenze von etwa 700 Ionen führt.
Nimmt man weiterhin an, dass etwa 5 Ionen eine gerade zuverlässig sichtbare
Ionenlinie (also nicht einfach ein Streuion) ergeben, so hat der
dynamische Messbereich, der als höchster unverzerrter Messwert
geteilt durch den Wert an der Messschwelle definiert ist, gerade
einmal den Wert 140.
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Bei
einem ADC können
wir unverzerrt (siehe die obigen Ausführungen) etwa 50 Ionen in einem
Messintervall messen, bei 2000 Einzelspektren in 1/10 Sekunde sind
das also 100 000 Ionen. Nehmen wir wieder die gleichen fünf Ionen
als Nachweisgrenze, so beträgt
der dynamische Messbereich für
das erfindungsgemäße Verfahren
20 000, ist also um etwa einen Faktor 140 höher als im Fall der Verwendung
eines Ereigniszählers.
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Es
wurden hier jeweils Aufnahmezeiten von 1/10 Sekunde für die Spektren
gewählt.
Das ist nicht zufällig
geschehen: Diese Art von Massenspektrometern hat eine viel größere Zeitauflösung als
jede andere Art von Massenspektrometer. Es ist damit hervorragend
geeignet für
die Kopplung mit sehr schnellen chromatographischen oder elektrophoretischen
Verfahren.
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Stichworte
sind hier Nano-LC und Mikro-Kapillarelektrophorese. Diese Separationsverfahren
der Zukunft können
bisher kaum eingesetzt werden, da sie neben einer schnellen Spektrenrate
(bei Ereigniszählern bereits
vorhanden) auch eine hohe Messdynamik erfordern (bei Ereigniszählern nicht
vorhanden). Durch das erfindungsgemäße Verfahren bricht hier eine
neue Zeit an.