DE10248258A1

DE10248258A1 - Mutant nucleic acid of a Cel I endonuclease and method for the production of the recombinant complete Cel I protein

Info

Publication number: DE10248258A1
Application number: DE2002148258
Authority: DE
Inventors: Udo Dr. Baron; Ulrike Dr. Imhoff; Jürgen Dr. Koch; Marco Dr. Leuer; Jürgen Dr. Weber; Klaus Prof. Dr. Olek
Original assignee: BIOPSYTEC ANALYTIK GmbH
Current assignee: BIOPSYTEC ANALYTIK GmbH
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2002-10-16
Publication date: 2004-05-06
Also published as: AU2003268932A1; WO2004035771A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein rekombinantes vollständiges CEL I-Protein, einer Pflanzenendonuklease sowie Teile derselben durch Expression synthetischer DNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die für diese Zwecke hergestellten DNA-Sequenzen selber. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung des rekombinant hergestellten CEL I-Enzyms zum Nachweis von Punktmutationen sowie größeren mutierten Bereichen, wie z. B. Deletionen/Insertionen.The invention relates to a production method for a recombinant complete CEL I protein, a plant endonuclease and parts thereof by expression of synthetic DNA sequences. The invention also relates to the DNA sequences themselves produced for these purposes. Furthermore, the invention relates to the use of the recombinantly produced CEL I enzyme for the detection of point mutations and larger mutated areas, such as. B. Deletions / insertions.

Description

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein rekombinantes vollständiges CEL I-Protein, einer Pflanzenendonuklease, sowie Teile derselben durch Expression synthetischer DNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die für diese Zwecke hergestellten DNA-Sequenzen selber. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung des rekombinant hergestellten CEL I-Enzyms zum Nachweis von Punktmutationen sowie größeren mutierten Bereichen, wie z.B. Deletionen/Insertionen.The invention relates to a manufacturing method for a recombinant full CEL I protein, one Plant endonuclease, as well as parts thereof, by expression of synthetic DNA sequences. The invention also relates to the same DNA sequences prepared for the purpose himself. The invention further relates to the use of the recombinant prepared CEL I enzyme for the detection of point mutations as well larger mutated Areas such as Deletions / insertions.

Das CEL I-Enzym ist eine im Sellerie entdeckte Endonuklease (Oleykowski et al. 1998), die einzelne Unebenheiten innerhalb der DNA-Doppelhelix erkennt und dort spezifisch schneidet. Das Enzym stellt somit ein sehr nützliches Hilfsmittel zum Auffinden von Mutationen dar. Es erkennt speziell auch Einzelbasen-Fehlpaarungen (Punktmutationen) und schneidet unmittelbar an einem der beiden DNA-Stränge 3'-wärts der Mutation in den Doppelstrang ein.The CEL I enzyme is one in celery discovered endonuclease (Oleykowski et al. 1998), the individual bumps recognizes within the DNA double helix and cuts there specifically. The enzyme is therefore a very useful tool to find of mutations. It specifically detects single-base mismatches (Point mutations) and cuts directly on one of the two DNA strands 3 'to the Mutation in the double strand.

CEL I weist für die hier gewünschte Anwendung im Vergleich zu anderen bekannten Nukleasen, welche ebenfalls die Fähigkeit des Einschneidens von DNA-Strängen an Unebenheiten der Doppelhelixstruktur aufweisen, einige Vorteile auf:
Das Hauptproblem der bislang bekannten, teilweise auch im Handel erhältlichen, „mismatch"-erkennenden Endonukleasen liegt in der nicht hundertprozentig effektiven Identifizierbarkeit aller möglichen Mismach- bzw. Mutationsarten durch diese, sowie dem Auftreten von unspezifischem DNA-Abbau. So schneiden z.B. die S1 Nukleasen nicht an einzelnen Basenfehlpaarungen (Loeb and Silber, 1981). Die Mung bean-Nuklease besitzt eine fünffach höhere Effektivität bei einem pH-Wert von 5, als z.B. im neutralen pH-Bereich (Kowalski and Sandford, 1982). Die T4 Endonuklease VII schneidet nicht nur einen Strang einer Doppelhelix, sondern stets auch den komplementären Strang (Solaro et al., 1993). Des weiteren ist für die aus T4-Phagen isolierte Endonuklease eine deutlich höhere unspezifische Aktivität in Form von wahllosem DNA-Abbau beschrieben, als sie bei dem in dem vorliegenden Verfahren synthetisierten CEL I Enzyms zu verzeichnen ist (Cotton et al., 1999). Außerdem weist der Grad der Spezifität der T4 Endonuklease VII eine starke Abhängigkeit von Substratlänge sowie von der Sequenzumgebung des zu detektierenden Fehlpaarungen auf (Babon et al., 1999; Norberg et al., 2001).For the application desired here, CEL I has several advantages over other known nucleases, which also have the ability to cut DNA strands on bumps in the double helix structure:
The main problem of the hitherto known, partly also commercially available, “mismatch” -recognizing endonucleases lies in the fact that all possible types of mismach or mutation cannot be identified by them, and the occurrence of unspecific DNA degradation. The S1 nucleases, for example, cut not on single base mismatches (Loeb and Silber, 1981) The Mung bean nuclease is five times more effective at pH 5 than, for example, in the neutral pH range (Kowalski and Sandford, 1982) The T4 endonuclease VII cuts not only one strand of a double helix, but also always the complementary strand (Solaro et al., 1993). Furthermore, the endonuclease isolated from T4 phages has a significantly higher non-specific activity in the form of random DNA degradation than that described in the CEL I enzyme synthesized in the present process can be found (Cotton et al., 1999) does T4 endonuclease VII have a strong dependence on substrate length and on the sequence environment of the mismatches to be detected (Babon et al., 1999; Norberg et al., 2001).

Insbesondere für eine spezifische Selektion von nicht zuvor bekannten Mutationen, wie es für die hier beschriebene Anwendung besonders benötigt wird, ist dies als deutlicher Nachteil zu vermerken.Especially for a specific selection of mutations not previously known, as is the case for the application described here especially needed this should be noted as a clear disadvantage.

CEL I gehört zu einer eigenen Gruppe von Nukleasen, die in vielen Pflanzenarten zu finden sind und sich besonders durch spezifisches Aktivitätsmaximum bei neutralem pH-Wert auszeichnet (Oleykowski et al., 1998), wenn gleich auch eine Aktivität von CEL I auch in einem Bereich von pH 5 bis pH 9,5 zu verzeichnen ist (Oleykowski et al., 1998).CEL I belongs to a separate group of nucleases that can be found in many plant species and themselves especially due to the specific activity maximum at neutral pH distinguished (Oleykowski et al., 1998), although an activity of CEL I can also be found in a range from pH 5 to pH 9.5 (Oleykowski et al., 1998).

Die Fähigkeit, jede Form der Basenfehlpaarung auch unabhängig vom AT-Gehalt der Umgebung der Mutation zu erkennen und zu schneiden, unterscheidet das isolierte CEL I-Enzym von anderen Nukleasen aus der Familie der Pflanzennukleasen mit Aktivitätsmaximum bei neutralem pH-Wert, wie z.B. der aus Spinat isolierten SP Nuklease (Yang et al., 2000; Oleykowski et al., 1999).The ability to mismatch any form of base also independently recognize and cut from the AT content of the environment of the mutation, distinguishes the isolated CEL I enzyme from other nucleases from the Family of plant nucleases with maximum activity at neutral pH, such as. the SP nuclease isolated from spinach (Yang et al., 2000; Oleykowski et al., 1999).

Bislang ist es aufgrund seiner toxischen Eigenschaft für nicht kompartimentierte Zellsysteme nicht möglich, CEL I erfolgreich rekombinant zu exprimieren und auf diese Weise CEL I-Enzym zu gewinnen, ohne den aufwendigen Weg der nativen Reinigung aus der Pflanze gehen zu müssen.So far it is due to its toxic Property for not compartmentalized cell systems not possible, CEL I successfully recombinant to express and in this way to obtain the CEL I enzyme without the complex To have to go out of the plant for native cleaning.

Es ist daher eine die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Enzymmaterial in Form von (möglichst reinem) aktivem CEL I-Enzym in beliebiger Menge auf einfachem Wege herstellen zu können und somit in ausreichender Menge zur Verfügung zu stellen.It is therefore a task of present invention, enzyme material in the form of (if possible pure) active CEL I enzyme in any amount in a simple way to be able to manufacture and thus to make it available in sufficient quantities.

Diese Aufgabe der Erfindung wird durch eine, für diese Zwecke besondere Abänderung der bekannten DNA-Sequenz von Cel I gelöst. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit diese neu entworfene Sequenz.This object of the invention will by one, for these purposes special amendment the known DNA sequence of Cel I solved. Another aspect of The present invention is thus this redesigned sequence.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung für das rekombinante, vollständige CEL I-Protein, das folgende Schritte umfaßt: Zunächst wird ein Entwurf der zu synthetisierenden DNA-Sequenz erstellt. Als Basis dient die cDNA-Sequenz des aus Sellerie, Apium greveolens L., isolierten CEL I-Proteins (Olekowski et al. 2000).Another aspect of the present The invention then relates to a process for the production of the recombinant full CEL I protein, comprising the following steps: First, a draft of the synthesizing DNA sequence created. The basis is the cDNA sequence from celery, Apium greveolens L., isolated CEL I protein (Olekowski et al. 2000).

Diese DNA-Sequenz wird für eine Expression in Hefe auf die im Hefegenom üblichen Codon-Häufigkeit unter Beibehaltung der Aminosäuresequenz des CEL I-Proteins umgeschrieben (Abb.: 1). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde somit die Expression von Cel I in der Hefe Pichia pastoris überhaupt erst ermöglicht bzw. begünstigt. Ein Verfahren zur Codon-Optimierung wird zum Beispiel bei Outchkourov NS et al. für den Fall des Proteins Equistatin aus einer Seeanemone beschrieben. Dieses Verfahren für nicht exprimierbare, für die Zelle toxische Enzyme anzuwenden, wird dort weder beschrieben, noch nahegelegt.This DNA sequence is used for expression in yeast to those common in the yeast genome Codon frequency while maintaining the amino acid sequence of the CEL I protein (Fig .: 1). As part of the present The expression of Cel I in the yeast Pichia was thus invented pastoris at all only made possible or favored. A method for codon optimization is, for example, at Outchkourov NS et al. for the Case of the protein equistatin from a sea anemone is described. This Procedure for not expressible, for using toxic enzymes in the cell is not described there, still suggested.

Im einzelnen betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung einer in Wirtszellen rekombinant exprimierbaren, für das vollständige CEL I-Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: zur Verfügung stellen der für CEL I-Protein kodierenden Sequenz aus einem geeigneten Organismus, insbesondere Apium graveolens L., und entsprechender Veränderung der Codon-Häufigkeit der zu exprimierenden Sequenz gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz im Hinblick auf den für die Expression verwendeten Wirtsorganismus. Diese Veränderung wird durch die Schritte von a) Einteilung der entworfenen Sequenz in eine gerade Zahl x, insbesondere 8, überlappende Regionen, b) Synthese von 2x mutierten Oligonukleotiden, insbesondere Oligonukleotide 1-16 bis 16-16, die jeweils die gesamte Länge einer überlappenden Region beider Stränge der kodierenden Sequenz umfassen, c) erste PCR-Amplifikation zur Erzeugung von x/2, insbesondere 4, überlappenden Fragmente unter der Verwendung der Oligonukleotide aus Schritt b), d) zweite PCR-Amplifikation zur Erzeugung von x/4, insbesondere 2, überlappenden Regionen unter der Verwendung der Fragmente aus Schritt c), und e) dritte PCR-Amplifikation zur Erzeugung von x/8, insbesondere 1, Fragment, das die kodierende Region von CEL I enthält, erreicht. Eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform ist in 3 gezeigt.In particular, the invention thus relates to a method for producing a nucleic acid sequence which is recombinantly expressible in host cells and which codes for the complete CEL I protein, the method comprising the steps of: providing the sequence coding for CEL I protein from a suitable organism, in particular Apium graveolens L., and a corresponding change in the frequency of codons sequence to be expressed compared to the naturally occurring sequence with regard to the host organism used for the expression. This change is achieved by the steps of a) dividing the designed sequence into an even number x, in particular 8, overlapping regions, b) synthesis of 2x mutated oligonucleotides, in particular oligonucleotides 1-16 to 16-16, each of which overlaps the entire length Region of both strands of the coding sequence include, c) first PCR amplification to generate x / 2, in particular 4, overlapping fragments using the oligonucleotides from step b), d) second PCR amplification to generate x / 4, in particular 2, overlapping regions using the fragments from step c), and e) third PCR amplification to generate x / 8, in particular 1, fragment which contains the coding region of CEL I. A schematic representation of a preferred embodiment is shown in 3 shown.

Als Alternative kann ein erfindungsgemäßes Verfahren auch dadurch gekennzeichnet sein, daß an Stelle von Schritt e) folgende Schritte durchgeführt werden: e') Klonierung der in Schritt d) erzeugten Fragmente in einen geeigneten Vektor, und f) geeigneter Verdau der Vektoren und Ligation der Fragmente zur Fusion des gesamten Fragments, das die kodierende Region von CEL I enthält. So können dadurch weitere Modifikationen der Sequenz in Vektorsystemen durchgeführt werden, falls dies erwünscht ist. Solche Verfahren sind dem Fachmann im Stand der Technik der Nukleinsäurehandhabung bekannt und in, unter anderem, den Standardwerken „Molecular cloning. A Laboratory Manual. Sambrook & Russell 3rd Edition. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Current Protocols in Molecular Biology . Ausubel et al. (1994ff) Harvard Medical School.As an alternative, a method according to the invention also be characterized in that instead of step e) carried out the following steps are: e ') cloning the fragments generated in step d) into a suitable vector, and f) appropriate digestion of the vectors and ligation of the fragments to fuse the entire fragment that encodes the coding region of CEL I contains. So can thereby further modifications of the sequence are carried out in vector systems, if desired is. Such methods are known to the person skilled in the art nucleic acid handling known and in, among others, the standard works “Molecular cloning. A Laboratory Manual. Sambrook & Russell 3rd Edition. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al. (1994ff) Harvard Medical School.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Codon-Häufigkeit der zu exprimierenden Sequenz entsprechend der Codon-Häufigkeit für Hefe verändert wird, da Hefe als Expressionswirt besondere Vorteile aufweist (dazu siehe unten).A method according to the invention is preferred at which the codon frequency the sequence to be expressed according to the codon frequency for yeast changed because yeast has particular advantages as an expression host (see see below).

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß weiterhin für N-terminale oder C-terminale vorhandene zusätzliche Aminosäuren-Tags, insbesondere aus 6 Histidinen bestehende Tags, kodierende Nukleotide angefügt sind. Gegebenenfalls kann an die Originalsequenz in einem Falle C-terminal und in einem anderen Falle N-terminal eine 6 Histidine kodierende Basenabfolge in Form eines „His-Tags" angefügt werden. Diese sollen aufgrund ihrer starken Affinität zu Nickelionen die Reinigung des exprimierten Proteins mittels immobilisierten Nickelmolekülen bei Bedarf erleichtern. Paula de Mattos Areas et al. beschreiben unter anderem die Verwendung solcher „His-Tags" in Escherichia coli. Das N-terminal mit His-Tag-Sequenz versehene Fragment weist 3'wärts von dieser eine Faktor Xa Schnittstelle auf. Diese ermöglicht eine nachträgliche Prozessierung des exprimierten Enzyms durch Abtrennung der, ev. für die Aktivität hinderlichen, His-Tag-Sequenz. Die so entworfene Sequenz wird im weiteren Verlauf der vorliegenden Erfindung als 6His-Xa-Cel I-Sequenz bezeichnet. Das C-terminal mit His-Tag versehene Fragment wird im weiteren Verlauf der vorliegenden Erfindung als Cel I-6His bezeichnet.A method according to the invention is particularly preferred which is characterized in that continues for N-terminals or C-terminal additional available Amino acids tags in particular tags consisting of 6 histidines, coding nucleotides added are. If necessary, the original sequence in one case C-terminal and in another case N-terminal a 6 histidines coding base sequence in the form of a "His tag" are added their strong affinity to nickel ions, the purification of the expressed protein by means of immobilized nickel molecules lighten if necessary. Paula de Mattos Areas et al. describe including the use of such "His tags" in Escherichia coli. The N-terminal fragment provided with His tag sequence points 3 ' from this a factor Xa interface. This enables one subsequent Processing of the expressed enzyme by separating the, possibly. for the activity cumbersome, His-Tag sequence. The sequence so designed will become apparent in the further course of the present invention referred to as the 6His-Xa-Cel I sequence. The C-terminal with His tag provided fragment will be in the further course of the present invention referred to as Cel I-6His.

Zur Erleichterung der einzelnen Verfahrensschritte sind die oben in Schritt (c) synthetisierten Oligonukleotide durchschnittlich 70 Nukleotide lang sind und überlappen jeweils um ca. 20 Basen. Diese Werte sind aber lediglich als Anhaltspunkt zu sehen und können in Abhängigkeit der jeweiligen Anwendung variieren. Geeignete Variationen sind für den Fachmann leicht auf Basis von bekannten Reaktions- und Kinetikparametern zu bestimme und hängen besonders von der Temperatur und der Basenfolge ab.To facilitate the individual process steps the oligonucleotides synthesized in step (c) above are average Are 70 nucleotides long and overlap each around 20 bases. However, these values are only a guide to see and can dependent on of the respective application vary. Suitable variations are for the person skilled in the art easily based on known reaction and kinetic parameters determine and hang especially on the temperature and the base sequence.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten vollständigen CEL I-Proteins aus Apium graveolens L., umfassend a) Durchführung des oben genannten Verfahrens und b) Expression der Nukleinsäuresequenz mittels eines geeigneten Expressionssystems.Another aspect of the invention relates to a method for producing a recombinant complete CEL I protein from Apium graveolens L., comprising a) carrying out the above method and b) expression of the nucleic acid sequence using a suitable expression system.

Besonders bevorzugt sind dabei Expressionssysteme mittels Vektoren, ausgewählt aus pPIC 9, pPIC 3,5 und pQE-Vektoren. Es können auch andere Expressionselemente verwendet werden, die allgemein bekannt sind und von dem verwendeten Wirtsstamm abhängen. Bevorzugt ist dabei die Expression der Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle, die ausgewählt ist aus Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa-Zellen, CHO-Zellen, Toxoplasma gondii und Leishmania. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der verwendete Pichia pastoris Stamm der Stamm GS115 ist.Expression systems are particularly preferred by means of vectors from pPIC 9, pPIC 3.5 and pQE vectors. Other expression elements can also be used are used, which are generally known and used by the Depend on host strain. Expression of the nucleic acid sequence in a host cell is preferred, the selected is from Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa cells, CHO cells, Toxoplasma gondii and Leishmania. A is particularly preferred Process in which the Pichia pastoris strain used is the strain GS115 is.

Die Erfindung betrifft auch die vollständige, zur Expression geeignete DNA-Sequenz des CEL I-Proteins oder exprimierbare Teile davon aus Apium graveolens, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Der Begriff „exprimierbare Teile" davon betrifft Teile der Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidkette kodieren, die eine enzymatische Funktion aufweist, insbesondere die Funktion des nativen CelI Enzyms. Es sind aber auch für Epitope kodierende Nukleinsäuren umfaßt.The invention also relates to the complete Expression suitable DNA sequence of the CEL I protein or expressible Portions thereof from Apium graveolens by a method of the present Invention available is. The term "expressible Parts "of it Parts of the nucleic acid sequence, the for encode a polypeptide chain that has an enzymatic function, especially the function of the native CelI enzyme. But there are also for Nucleic acids encoding epitopes includes.

Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz des CEL I-Proteins von Apium graveolens, die dadurch gekennzeichnet ist, daß weiterhin für N-terminale oder C-terminale vorhandene zusätzliche Aminosäuren-Tags, insbesondere aus 6 Histidinen bestehende Tags, kodierende Nukleotide angefügt sind. Weiter bevorzugt sind an ihren beiden Enden Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angebracht, die in der übrigen Sequenz und in einem zu verwendenden Vektor nicht vorkommen. Eine ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäße Sequenz des CEL I-Proteins von Apium graveolens oder Teile davon ist in Seq ID No. 7 dargestellt. Als „Teile" sollen hier insbesondere als Sonden dienende Fragmente, aber auch die zur Erzeugung und Klonierung verwendeten überlappenden Oligonukleotide verstanden werden (dazu siehe 2).Preferred is a DNA sequence according to the invention of the Apium graveolens CEL I protein, which is characterized in that nucleotides coding for N-terminal or C-terminal additional amino acid tags, in particular tags consisting of 6 histidines, are also added. Further preferably, interfaces for restriction endonucleases are attached at their two ends which do not occur in the rest of the sequence and in a vector to be used. A very particularly preferred sequence according to the invention of the CEL I protein from Apium graveolens or parts thereof is described in Seq ID No. 7 shown. Fragments serving as probes, but also those for generation, are intended to be "parts" here overlapping oligonucleotides and cloning (see 2 ).

Beide CEL I kodierenden Sequenzvarianten wurden an ihren Enden mit für nachfolgende weitere Klonierungsschritte hilfreichen Sequenzen von Restriktionsschnittstellen versehen, wie zum Beispiel der EcoRI-Schnittstelle an beiden Enden bzw. der XhoI-Schnittstelle am Cterminalen Ende (Abb.: 2). Des weiteren wurde bei beiden Sequenzvarianten der Translationsstart ATG in eine Kozak-Sequenz (Konsensussequenz zur Translationsinitiation) integriert (ACC ATG G) (Kozak 1987; Kozak 1990). Im weiteren Verfahren wurden entsprechend der entworfenen Sequenz 16 Desoxyoligonukleotide synthetisiert, die die gesamte Länge der c- DNA abdeckten. Die Desoxyoligonukleotide wurden so synthetisiert, daß ihre Sequenz abwechselnd dem 5'-3' bzw. dem komplementären 3'-5' DNA-Strang entsprach. Die Länge der Desoxyoligonukleotide lag zwischen 40 bis 93 Basen und sie überlappten mit den benachbarten Sequenzen um durchschnittlich 20 Basen (Abb.: 2). Das künstliche CEL I-Gen wurde in zwei voneinander unabhängigen Teilfragmenten, dem N-terminalen und dem C-terminalen Fragment synthetisiert und anschließend mit Hilfe einer HindIII-Schnittstelle fusioniert (Abb.: 2).Both sequence variants coding for CEL I were at their ends with for subsequent further cloning steps of helpful sequences of Provide restriction interfaces, such as the EcoRI interface at both ends or the XhoI interface at the terminal end (Fig .: 2). Furthermore, the translation started in both sequence variants ATG into a Kozak sequence (consensus sequence for translation initiation) integrated (ACC ATG G) (Kozak 1987; Kozak 1990). In the further process 16 deoxyoligonucleotides were designed according to the designed sequence synthesized that the entire length of the c-DNA. The deoxyoligonucleotides were synthesized so that their sequence alternately corresponded to the 5'-3 'or the complementary 3'-5' DNA strand. The length the deoxyoligonucleotides were between 40 to 93 bases and they overlapped with the neighboring sequences by an average of 20 bases (Fig .: 2). The artificial CEL I gene was in two independent fragments, the N-terminal and the C-terminal fragment synthesized and then with Merged using a HindIII interface (Fig .: 2).

Die Entstehung eines Teilfragmentes erfolgte jeweils nach folgendem Prinzip: Es wurden in einem ersten Schritt je Fragment vier DNA-Sequenzen von doppelter Länge je zweier benachbarter Desoxyoligonukleotide (abzüglich der überlappenden Sequenzen) durch asymmetrische PCR erstellt. Die Amplifikation erfolgte so, daß die benachbarten, angereicherten DNA-Stränge jeweils den gegenüberliegenden Strang repräsentierten.The emergence of a partial fragment was carried out according to the following principle: In a first Step four DNA sequences of double length per fragment, two each of neighboring deoxyoligonucleotides (minus the overlapping sequences) created asymmetric PCR. The amplification was carried out so that the neighboring, enriched strands of DNA the opposite Represented strand.

In einem zweiten Amplifikationsschritt ließen sich somit Zweitprodukte der Länge von vier Ursprungsoligonukleotiden entsprechend (abzüglich überlappender Bereiche) synthetisieren (Fragmente E und F, Abb.: 3).In a second amplification step could thus second products of length corresponding to four original oligonucleotides (less overlapping Areas) synthesize (fragments E and F, Fig .: 3).

Eine erneute Überführung der so entstandenen Produkte in vornehmlich aus einzelsträngiger DNA bestehende Präparate durch asymmetrische PCR mit endständigen Oligonukleotiden ermöglichte in zwei weiteren Amplifikationsschritten die Entstehung eines ca. 400 Basenpaare langen doppelsträngigen DNA-Fragments (Fragment G Abb.: 3).Another transfer of the resulting products primarily from single-stranded DNA existing preparations enabled by asymmetric PCR with terminal oligonucleotides in two further amplification steps the formation of an approx. 400 base pairs long double-stranded DNA fragments (fragment G Fig .: 3).

Die beiden so synthetisierten Fragmente wurden anschließend in E. coli kloniert und sequenzüberprüft. Fehlerhafte Sequenzabschnitte wurden mit Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen ausgeschnitten und durch den entsprechenden fehlerfreien Teilsequenz eines anderen Klons ersetzt. Nach fehlerfreier Vorlage des N-terminalen sowie der C-terminalen Fragmentes des CEL I kodierenden DNA-Abschnittes wurden beide Teilfragmente mit Hilfe der oben genannten HindIII-Schnittstelle in einem geeigneten Vektor verbunden und in E.coli kloniert.The two fragments so synthesized were subsequently cloned in E. coli and sequence checked. faulty Sequence sections were constructed using suitable restriction enzymes cut out and by the appropriate error-free part-sequence another clone. After correct submission of the N-terminal and the C-terminal fragment of the CEL I coding DNA section were both partial fragments using the HindIII interface mentioned above linked in a suitable vector and cloned in E. coli.

Bevorzugterweise kann im weiteren Verlauf des Herstellungsverfahrens das so entstandene künstliche CEL I-Gen in geeignete Expressionsvektoren transferiert werden. Es bieten sich hier als Beispiele unter anderen für das Pichia pastoris Expressionssystem geeignete Expressionsvektoren, wie der pPIC 9 oder der pPIC 3,5 Vektor (Invitrogen) an. Ebenso lassen sich jedoch auch andere Expressionsvektoren und andere Wirtsorganismen als Hefe denken, die dem Fachmann bekannt sind. Der Gegenstand der Erfindung ist somit nicht auf ein bestimmtes Wirtssystem beschränkt.Preferably further The course of the manufacturing process the resulting artificial CEL I gene can be transferred into suitable expression vectors. Here are examples of the Pichia pastoris expression system suitable expression vectors, such as the pPIC 9 or the pPIC 3.5 vector (Invitrogen). Likewise, however also expression vectors and host organisms other than yeast think that are known to the expert. The object of the invention is therefore not limited to a specific host system.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit einen Wirtsorganismus, der in der Lage ist, eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz zu integrieren und zu exprimieren. Dieser Wirt ist bevorzugterweise ausgewählt aus Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa-Zellen, CHO-Zellen, Toxoplasma gondii und Leishmania. Insbesondere wird der Pichia pastoris Stamm der Stamm GS115 verwendet. Es können jedoch auch Pflanzenzellen oder Insektenzellen verwendet werden.Another aspect of the present The invention thus relates to a host organism which is capable of a DNA sequence according to the invention to integrate and express. This host is preferably selected from Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa cells, CHO cells, Toxoplasma gondii and Leishmania. In particular the Pichia pastoris strain of strain GS115 is used. However, it can plant cells or insect cells can also be used.

Ein in dieser Erfindung bevorzugter Wirtsorganismus für die Expression ist die Hefe Pichia pastoris (Invitrogen), wobei der bevorzugte Hefestamm GS115 (Invitrogen) ist. Hefe ist insgesamt als Expressionssystem bevorzugt, da es als ein eukaryontischer Organismus viele Vorteile gegenüber bakteriellen Systemen bei der Expression aufweist, wie z. B. posttranslationale Proteinprozessierung. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Verwendung eines eukaryontischen Expressionssystemes besteht in der vorhandenen Zellkompartimentierung eukaryontischer Organismen. Die Expression von Nukleasen mit Hilfe von rekombinanten Expressionssystemen in prokaryontischen Wirtsorganismen wie in Bakterien ist aufgrund ihrer Eigenschaft DNA-Moleküle anzugreifen toxisch für die Zellen und deshalb mehrfach als extrem schwierig beschrieben (Golz et al., 1995; Kosak and Kemper, 1990).One preferred in this invention Host organism for the expression is the yeast Pichia pastoris (Invitrogen), whereby the preferred yeast strain is GS115 (Invitrogen). Yeast is whole preferred as an expression system since it acts as a eukaryotic organism many advantages over bacterial systems in expression, such as. B. post-translational Protein processing. Another important advantage of using it of an eukaryotic expression system exists in the existing one Cell compartmentation of eukaryotic organisms. The expression of nucleases using recombinant expression systems in prokaryotic host organisms as in bacteria is due to their Property of DNA molecules to attack toxic for the cells and therefore several times described as extremely difficult (Golz et al., 1995; Kosak and Kemper, 1990).

Pichia pastoris ist zudem in der Lage, Methanol als Kohlenhydratquelle zu verstoffwechseln. Dabei wird der erste Schritt des Methanolabbaus durch die Alkoholoxidase katalysiert. Pichia besitzt zwei Gene für die Codierung dieses Enzyms, das AOX1- und das AOX2-Gen, wobei das AOX1-Gen den weitaus größeren Anteil an aktiver Alkoholoxidase in den Zellen bereitstellt. Die Expression des AOX1-Gens wird durch Methanol reguliert und induziert. Für das in dieser Erfindung bevorzugte Expressionssystem wurde das AOX1-Gen isoliert und der AOX1-Promoter zur Expression eines beliebigen Gens verwendet (Ellis et al.,1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a).Pichia pastoris is also in the Able to metabolize methanol as a carbohydrate source. Doing so the first step of methanol degradation catalyzed by the alcohol oxidase. Pichia has two genes for that Coding of this enzyme, the AOX1 and AOX2 genes, the AOX1 gene the much larger proportion of active alcohol oxidase in the cells. The expression of the AOX1 gene is regulated and induced by methanol. For that in The preferred expression system of this invention was the AOX1 gene isolated and the AOX1 promoter for expression of any gene used (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a).

Die in dieser Erfindung bevorzugte Form der heterologen Expression des CEL I-Enzyms in Pichia pastoris ist die sekretorische Proteinexpression. Die sekretorische Proteinexpression bei Pichia pastoris hat den Vorteil, daß aufgrund der sehr geringen Menge an nativer Protein sekretion dieser Hefe der Hauptbestandteil des Totalproteins im Medium das gewünschte Protein darstellt. Dies erleichtert weiterführende Reinigungschritte des heterologen Proteins bzw. macht diese unter Umständen überflüssig.The preferred form of heterologous expression of the CEL I enzyme in Pichia pastoris in this invention is secretory protein expression. The secretory protein expression in Pichia pastoris has the Advantage that due to the very small amount of native protein secretion of this yeast, the main component of the total protein in the medium is the desired protein. This facilitates further purification steps of the heterologous protein or may make them unnecessary.

Der bevorzugt in diesem Expressionsverfahren verwendete Sekretionsmechanismus beruht auf das im vorgefertigten Expressionsvektor pPIC 9 (Invitrogen) bereits integrierte Sekretionssignal α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae (Barr et al., 1992).Which is preferred in this expression process Secretion mechanism used is based on that in the prefabricated Expression vector pPIC 9 (Invitrogen) already integrated secretion signal α-factor Saccharomyces cerevisiae (Barr et al., 1992).

Ein weiterer Grund der Bevorzugung des Pichia-Systems vor z.B. prokaryontischen Expressionssystemen ist die Fähigkeit von Pichia pastoris zur post-translationalen Modifikation wie zum Beispiel der N-glycosidischen Verknüpfung von Zuckern, ohne allerdings eine Hyperglycosilierung hervorzurufen, wie es bei S. cerevisiae beispielsweise der Fall ist (Grinna and Tschopp, 1989; Tschopp et al., 1987b). Post-translationale Modifikationen können für die Funktionstüchtigkeit eines Enzyms essentiell sein.Another reason for preference of the Pichia system before e.g. prokaryotic expression systems is the ability by Pichia pastoris for post-translational modification such as Example of the N-glycosidic linkage of sugars, however without cause hyperglycosylation, as is the case with S. cerevisiae for example, the case (Grinna and Tschopp, 1989; Tschopp et al., 1987b). Post-translational modifications can work for functionality of an enzyme.

Das in dieser Erfindung bevorzugte Konstrukt zur Expression aktiven CEL I-Enzyms besteht aus dem Cel I-6His-Sequenzmolekül, welches in entsprechender Orientierung in die EcoRI-Schnittstelle des Expressionsvektors pPIC 9 ligiert wird und in dieser Form im offenen Leseraster mit dem Signalpeptid fusioniert vorliegt. Durch die Klonierung in die EcoRI-Schnittstelle des Vektors wird das CEL I-Gen, vorzugsweise das Cel I-6His-Konstrukt, unter die Kontrolle des 5'-wärts liegenden AOX1-Promotors gestellt. Für Klonierungsarbeiten in E. coli besitzt der Vektor eine Ampicillinresistenz sowie ein E. coli-Replikationsursprung (Abb.: 4).The preferred in this invention Construct for the expression of active CEL I enzyme consists of the Cel I-6His sequence molecule, which is oriented in the EcoRI interface of the Expression vector pPIC 9 is ligated and in this form in the open Reading frame fused to the signal peptide is present. By cloning into the EcoRI interface of the vector is the CEL I gene, preferably the Cel I-6His construct, under the control of the 5'-lying AOX1 promoter. For Cloning work in E. coli, the vector has ampicillin resistance and an E. coli origin of replication (Fig .: 4).

Zur Expression des CEL I-Gens ist die Integration des Gens in das Hefegenom erforderlich. Die Integration erfolgt in diesem, hier bevorzugten Fall, durch eine homologe Rekombination, und zwar durch ein crossing over zwischen dem His4-Lokus des Chromosoms und dem His4 Lokus auf dem Vektor. Zur Selektion stabiler Transformanden findet das His4-Gen von Pichia pastoris Verwendung. Zu diesem Zwecke liegt das His4-Gen, welches für die Codierung von Histidin verantwortlich ist, im Hefegenom in mutierter Form vor, das auf dem Vektor befindliche His4-Gen jedoch als Wildtyp.For the expression of the CEL I gene integration of the gene into the yeast genome is required. The integration in this case, preferred here, by homologous recombination, by crossing over between the His4 locus of the chromosome and the His4 locus on the vector. For the selection of stable transformants the His4 gene from Pichia pastoris is used. For this purpose is the His4 gene, which for The coding of histidine is responsible in the mutant yeast genome Form before, but the His4 gene on the vector as a wild type.

Dies führt dazu, daß Hefezellen ohne integrierten Vektor nicht in der Lage sind, auf Histidinfreiem Medium zu wachsen, wohingegen erfolgreich mit pPIC9 transformierte Hefezellen auf Medium ohne Histidin Kolonien zu bilden vermögen. Da der Vektor keinen Hefereplikationsursprung besitzt, können nur Hefezellkolonien entstehen, bei deren Ausgangszelle eine Rekombination zwischen Plasmid und Hefegenom stattgefunden hat und der Vektor mitsamt Zielgen in das Hefegenom integriert vorliegt.This leads to yeast cells without an integrated vector are unable to histidine-free Medium to grow, whereas successfully transformed with pPIC9 Yeast cells on medium without histidine colonies are able to form. There the vector has no origin of yeast replication, only Yeast cell colonies develop, with their starting cell a recombination between plasmid and yeast genome and the vector together with the target gene is integrated into the yeast genome.

Die bevorzugte Art der Tranformation in diesem Verfahren ist die Hefetransformation mittels Elektroporation. Es werden hierfür 20-30μg linearisierte und anschließend durch Phenolextraktion gereinigte Vektor-DNA zu 80μl frisch kompetenter Zellen des Hefestammes GS115 in einer sterilen Küvette gegeben. Das CEL I-6His-pPIC9 Konstrukt wird in diesem Verfahren mit Hilfe der einmal vorhandenen Restriktionsschnittstelle SalI (Abb.: 4) linearisiert. Die Elektroporation erfolgt mit Hilfe des Gene Pulser II Systems von Biorad mit 50μF/200Ω/ 1,8V und einer Pulsdauer von ca. 10msec.The preferred type of transformation in this process is the yeast transformation using electroporation. It will do this 20-30μg linearized and then vector DNA purified by phenol extraction to 80μl fresh competent cells of the yeast strain GS115 in a sterile cuvette. The CEL I-6His-pPIC9 construct is used in this procedure the existing SalI restriction interface (Fig .: 4) linearized. The electroporation takes place with the help of the gene pulser II systems from Biorad with 50μF / 200Ω / 1.8V and a pulse duration of approx. 10 msec.

Erfolgreich transformierte Zellen können nach 5 Tagen Inkubation auf Histidin-freiem Medium als gut gewachsene Kolonien identifiziert werden. Weitere Überprüfung bezüglich der stabilen Transformation erfolgt durch den PCR basierenden Nachweis des Zielgens im Hefegenom.Successfully transformed cells can after 5 days of incubation on histidine-free medium as well grown Colonies are identified. Further review regarding stable transformation is carried out by the PCR-based detection of the target gene in the yeast genome.

Als Startprimer für die PCR wird ein CEL I-spezifischer Primer Testf: 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3' (SEQ ID No. 1; Abb.:2) und als Gegenprimer ein zur Vektorkassette komplementärer Primer AOX3' 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' verwendet (SEQ ID No. 2; Abb.:4). Die Größe des erwarteten PCR-Produktes beträgt ca. 1000bp. Als Positivkontrolle dient das Vektorkonstrukt Cel I-6His-pPIC9 als Template. Als Negativkontrolle dient genomische Hefe-DNA des mit parenteralem Vektor pPIC9 ohne CEL I-Insert transformierten Klons, sowie eine Templat-freie Probe zum Ausschluß von „Falsch-Positiven" aufgrund von Kontaminationen.A CEL I-specific one will be the starting primer for the PCR Primer Testf: 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3 '(SEQ ID No. 1; Fig.:2) and a primer complementary to the vector cassette AOX3 '5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' (SEQ ID No. 2; Abb.:4). The size of the expected PCR product is about 1000bp. The vector construct Cel I-6His-pPIC9 serves as a positive control as a template. Genomic yeast DNA of the serves as a negative control transformed with parenteral vector pPIC9 without a CEL I insert Clones, and a template-free sample to exclude "false positives" due to contamination.

In einem hier aufgeführten Beispiel für das bevorzugte Verfahren ließen sich von 20 getesteten Hefeklonen 16 eindeutig als positiv identifizieren (Abb.: 5). Zur zusätzlichen Sicherheit bezüglich der Integration des Zielgens in das Hefegenom wurden PCR-positive Klone durch Hybridisierung eines Southernblots mittels einer CEL I-spezifischen Sonde untersucht. Als Kontrollen dienten hier ebenfalls zum einen Plasmid-DNA des Cel I-6His-pPIC9-Konstruktes (Positivkontrolle) sowie genomische Hefe-DNA, die mit dem parentalen Vektor pPIC9 ohne CEL I-Insert in Hefe transformiert wurden ist (Negativkontrolle).In an example listed here for the preferred methods 16 of 20 yeast clones tested clearly identify themselves as positive (Fig .: 5). For additional Security regarding The integration of the target gene into the yeast genome was PCR positive Clones by hybridizing a Southern blot using a CEL I-specific probe examined. Here, too, served as controls on the one hand plasmid DNA of the Cel I-6His-pPIC9 construct (positive control) as well as genomic yeast DNA, which with the parental vector pPIC9 without CEL I insert was transformed into yeast (negative control).

Für ein hier aufgeführte Beispiel für das bevorzugte Verfahren wurde eine Digoxigeninmarkierte Sonde von 262 Basen Länge synthetisiert. Die Synthese der Sonde erfolgt durch Amplifikation mittels zweier spezifisch im N-terminalen Bereich der codierenden CEL I-Sequenz annealende Oligonukleotide Sonde f 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3' (SEQ ID No. 3) und Sonde r 5'-GTCAGGGGTATCAATGAAATGTAA-3' (SEQ ID No. 4; Abb.: 2).For one listed here example for the preferred method was a digoxigenin-labeled probe from 262 bases in length synthesized. The probe is synthesized by amplification by means of two coding specifically in the N-terminal region CEL I sequence annealing Oligonucleotide probe for 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3 '(SEQ ID No. 3) and Probe r 5'-GTCAGGGGTATCAATGAAATGTAA-3 '(SEQ ID No. 4; Fig .: 2).

In einem hier aufgeführten Beispiel für das bevorzugte Verfahren ließen sich von 12 PCRpositiv getesteten Hefeklonen 10 Klone ebenfalls durch Southernhybridisierung als positiv bestätigen (Abb.: 6). Eindeutig in beiden Testverfahren als positiv getestete Klone wurden für die Expression eingesetzt.In an example listed here for the preferred methods 10 clones from 12 PCR-positive yeast clones as well confirmed as positive by Southern hybridization (Fig .: 6). Clearly in Both test methods as clones tested positive were used for expression used.

Die Expression des unter der Kontrolle des AOX1-Promoters (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a) stehenden CEL I-Gens erfolgte nach dem Repressions/Derepressionsmechanismus und anschließender Induktion, beschrieben für Saccharomyces cerevisiae (Johnston, 1987). Die exakte Anwendung in Pichia pastoris erfolgte nach dem Protokoll des Pichia-Expression-Systems (Invitrogen):
Anzucht und ein Wachstum der Klone erfolgte für zwei Tage in Glucose-haltigem Medium. Glucose wirkt als Repressor der unter der Kontrolle des AOX1-Promoters stehenden Gene und verhindert somit die Transkription. Nach Erreichen einer Wachstumsdichte bei OD₆₀₀ von ca. 3-5 erfolgte durch Wechsel des Mediums die Induktion der Expression bei einer OD₆₀₀ von 1 mit Hilfe des Induktors Methanol. Exprimiert wurde über einen Zeitraum von 7-8 Tagen unter 24-stündiger Zugabe der verstoffwechselten Kohlenstoffquelle Methanol.The expression of the CEL I gene under the control of the AOX1 promoter (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a) was carried out according to the repression / depression mechanism and subsequent induction, described for Saccharomyces cerevisiae (Johnston, 1987). The exact application in Pichia pastoris was carried out according to the protocol of the Pichia Expression System (Invitrogen):
The clones were grown and grown in a medium containing glucose for two days. Glucose acts as a repressor of the genes under the control of the AOX1 promoter and thus prevents transcription. After a growth density at OD ₆₀₀ of approx. 3-5 was achieved by changing the medium, expression was induced at an OD ₆₀₀ of 1 with the help of the inductor methanol. Methanol was expressed over a period of 7-8 days with the addition of the metabolized carbon source for 24 hours.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes vollständiges CEL I-Protein, hergestellt nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.Another aspect of the invention relates to a recombinant complete CEL I protein, manufactured according to a method according to the invention.

Da in dem hier bevorzugten Beispiel zur Expression von CEL I das exprimierte Protein sekretiert wurde, konnte das gewünschte Enzym leicht mittels aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus dem Überstand der Expressionskultur gewonnen werden. Nach Einengung der im Überstand befindlichen Proteine um das ca. 200fache mit Hilfe von Ultrafiltrati onsröhrchen (Vivascience) konnte das aktive CEL I-Enzym unmittelbar als Mismatcherkennendes und schneidendes Protein Verwendung finden.Because in the example preferred here the expressed protein was secreted for the expression of CEL I, could do the wanted Enzyme easily by means of methods known from the prior art from the supernatant the expression culture can be obtained. After concentration in the supernatant proteins around 200 times with the help of ultrafiltration tubes (Vivascience) could immediately recognize the active CEL I enzyme as a mismatch and cutting protein are used.

Da Pichia pastoris, wie erwähnt, sehr wenig Proteine sezerniert, konnte der Einsatz des exprimierten und sezernierten CEL I-Enzyms ohne weitere Aufarbeitungs- und Reinigungsprozesse erfolgen.Since Pichia pastoris, as mentioned, very much little protein secreted, the use of the expressed and secreted CEL I enzyme without further processing and purification processes respectively.

Für die Überprüfung der Funktionstauglichkeit des CEL I-Enzyms ist ein spezifischer Aktivitätsassay notwendig, der die Fähigkeit des Enzyms testet, alle acht Basenkombinationen der Fehlpaarungen zu erkennen.For the review of the A specific activity assay is necessary for the functionality of the CEL I enzyme, the ability of the enzyme tests all eight base combinations of the mismatches to recognize.

Beispielhaft ließen sich für diesen Zweck Konstrukte erstellen, mit denen man durch entsprechende Heterohybridkombination alle acht möglichen Mismatchkombinationen synthetisieren konnte. Für die in diesem Verfahren bevorzugte Anwendung erfolgte die Bildung der Konstrukte durch Klonierung von vier Oligonukleotiden in den EcoRI/HindIII geöffneten pUC19-Vektor. Die Oligonukleotide unterschieden sich lediglich in einer einzigen Base voneinander (Abb.: 7). Die vier klonierten Fragmente konnten als definiertes Template zur Amplifikation von Fragmenten mit Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden dienen, welche direkt für die Heterohybridbildung eingesetzt wurden. Es ließen sich je nach Kombination der Amplifikate bei der Hetero-Hybridsynthese alle acht möglichen Mismatchkombinationen kreieren.As an example, constructs could be created for this purpose, with which you can get all eight by appropriate heterohybrid combination potential Could synthesize mismatch combinations. For the preferred in this procedure The constructs were formed by cloning four oligonucleotides in the EcoRI / HindIII opened pUC19 vector. The oligonucleotides differed from each other only in a single base (Fig .: 7). The four cloned fragments could be defined as Template for the amplification of fragments with fluorescence-labeled Oligonucleotides serve which are used directly for heterohybrid formation were. Let it depending on the combination of the amplificates in hetero-hybrid synthesis all eight possible Create mismatch combinations.

Amplifiziert wurde mit Hilfe des Fluoreszenz-markierten PUC 19 F-Primers 5'–FAM-GGATGTGCTGCAAGGCGAT–3' (SEQ ID No. 5) und des Fluoreszenz-markierten PUC 19 R-Primers 5'–JOE-GTGAGTTAGCTCACTCATTAG–3' (SEQ ID No. 6) 237bp große Fragmente. Nach Heterohybridbildung der jeweils gewünschten Partnerfragmente durch 10 minütige Denaturierung bei 95°C und anschließende stufenweiser Abkühlung erfolgte der Aktivitätsassay durch Inkubation der Heterohybride mit 1:50 verdünntem CEL I-Extrakt aus dem Hefeexpressions-Überstand bei 47°C für 10 min.Was amplified using the Fluorescence-labeled PUC 19 F primers 5'-FAM-GGATGTGCTGCAAGGCGAT-3 '(SEQ ID No. 5) and of the fluorescence-labeled PUC 19 R primer 5'-JOE-GTGAGTTAGCTCACTCATTAG-3 '(SEQ ID No. 6) 237bp size Fragments. After heterohybrid formation of the desired one Partner fragments by 10 minutes Denaturation at 95 ° C and subsequent gradual cooling the activity assay was carried out by incubation of the heterohybrids with 1:50 diluted CEL I extract from the Hefeexpressions supernatant at 47 ° C for 10 minute

CEL I schnitt einen Strang der Heterohybride spezifisch am Punkt des Mismatches. Nach Auftragen der Probe auf ein GeneScan-Gel ließen sich anstelle von 237bp langen Fragmenten ein 94bp langes und ein 143bp langes Fragment nachweisen, beim Gegenstrang entsprechhend (Abb.: 8).CEL I cut a strand of the heterohybride specifically at the point of the mismatch. After applying the sample left a GeneScan gel instead of 237bp fragments a 94bp long and a 143bp long Detect long fragment, correspondingly in the opposite strand (Fig .: 8th).

Das in diesem Verfahren mit Hilfe des künstlich synthetisierten Gens hergestellte Enzym weist exakt die von ihm gewünschte Eigenschaft auf, nämlich die präzise Erkennung aller möglichen Mismatchkombinationen sowie des darauf folgenden Einschneiden eines Stranges an der Phosphordiesterbindung unmittelbar 3'-ärts der erkannten Basenfehlpaarung (Oleykowski et al., 1998).That with the help in this procedure the artificial synthesized gene has exactly the same enzyme that it produces desired Property on, namely the precise Detection of all possible Mismatch combinations and the subsequent cutting of one Strands at the phosphorus diester bond immediately 3'art of the detected base mismatch (Oleykowski et al., 1998).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft somit die Verwendung des rekombinant hergestellten erfindungsgemäßen CEL I-Enzyms zum Nachweis von Punktmutationen sowie größeren mutierten Bereichen, wie z.B. Deletionen/Insertionen.Another aspect of the invention thus relates to the use of the recombinantly produced CEL according to the invention I-enzyme for the detection of point mutations as well as larger mutated ones Areas such as Deletions / insertions.

Im beigefügten Sequenzprotokoll zeigt:
SEQ ID No. 1: Primer Testf: 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3',
SEQ ID No. 2: Primer AOX3' 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3',
SEQ ID No. 3: Sonde f 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3',
SEQ ID No. 4: Sonde r 5'-GTCAGGGGTATCAATGAAATGTAA-3',
SEQ ID No. 5: F-Primer 5'–FAM-GGATGTGCTGCAAGGCGAT–3',
SEQ ID No. 6: Fluoreszenz-markierter PUC19 R-Primer 5'-JOE-GTGAGTTAGCTCACTCATTAG–3'
SEQ ID No. 7: erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz des reifen CEL I-Enzyms nach Umschreibung für die Expression des Enzyms in Hefe,
SEQ ID No. 8: Aminosäuresequenz des reifen CEL I-Enzyms, und
SEQ ID No. 9: Darstellung der kompletten Nukleotidsequenzfolge des synthetischen CEL I-GensThe attached sequence listing shows:
SEQ ID No. 1: Primer Testf: 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3 ',
SEQ ID No. 2: Primer AOX3 '5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3',
SEQ ID No. 3: probe for 5'-ATGACCAGACTGTACTCCGTGTTC-3 ',
SEQ ID No. 4: probe for 5'-GTCAGGGGTATCAATGAAATGTAA-3 ',
SEQ ID No. 5: F primer 5'-FAM-GGATGTGCTGCAAGGCGAT-3 ',
SEQ ID No. 6: fluorescence-labeled PUC19 R primer 5'-JOE-GTGAGTTAGCTCACTCATTAG-3 '
SEQ ID No. 7: nucleic acid sequence according to the invention of the mature CEL I enzyme after description for the expression of the enzyme in yeast,
SEQ ID No. 8: amino acid sequence of the mature CEL I enzyme, and
SEQ ID No. 9: Representation of the complete nucleotide sequence sequence of the synthetic CEL I gene

In den beigefügten Figuren zeigen:The attached figures show:

1: Eine Darstellung der für die Codierung des reifen CEL I-Enzyms notwendigen Nukleinsäuresequenz (SEQ ID No. 7) nach Umschreibung für die Expression des Enzyms in Hefe. Die Aminosäuresequenz (SEQ ID No. 8) ist ebenfalls aufgeführt. Des weiteren sind die Basenabweichungen zur veröffentlichten Originalsequenz grau aufgeführt. 1 : A representation of the nucleic acid sequence (SEQ ID No. 7) necessary for coding the mature CEL I enzyme after rewriting for the expression of the enzyme in yeast. The amino acid sequence (SEQ ID No. 8) is also listed. Furthermore, the base deviations from the published original sequence are shown in gray.

2: Die Darstellung der kompletten Nukleotidsequenz des synthetischen CEL I-Gens (SEQ ID No. 9). Die Sequenz ist doppelsträngig aufgeführt, wobei die für die Synthese erforderlichen Desoxyoligonukleotide jeweils entsprechend auf dem jeweiligen Strang fett gedruckt sind. Des weiteren sind die Sequenzmodifikationen wie Restriktionsschnittstellen, Ko zak-Sequenz sowie die His-Tags codierenden Sequenzen aufgeführt. Die am N-Terminus bzw. am C-Terminus befindlichen His-Tag kodierenden Sequenzabschnitte sind unterstrichen; die unterstrichenen Sequenzen wurden entweder N-terminal oder C-terminal angefügt, nicht beide gleichzeitig. Die für verschiedene Testversuche benötigten Oligonukleotide Test f/Sonde f bzw. Sonde r sind durch graue Hinterlegung der Sequenz herausgestellt. 2 : The representation of the complete nucleotide sequence of the synthetic CEL I gene (SEQ ID No. 9). The sequence is double-stranded, with the deoxyoligonucleotides required for the synthesis correspondingly printed in bold on the respective strand. Furthermore, the sequence modifications such as restriction sites, Ko zak sequence and the sequences encoding His tags are listed. The sequence sections coding at the N-terminus or at the C-terminus are underlined; the underlined sequences were added either N-terminal or C-terminal, not both at the same time. The oligonucleotide test f / probe f or probe r required for various test experiments are highlighted by the gray background of the sequence.

3: Schematische Darstellung zur Synthese des künstlichen CEL I-Gens mittels asymmetrischer PCR mit Hilfe 16 sich überlappender Desoxyoligonukleotiden. 3 : Schematic representation of the synthesis of the artificial CEL I gene using asymmetric PCR using 16 overlapping deoxyoligonucleotides.

4: Schematische Darstellung des vorzugsweise in dieser Erfindung verwendeten Vektors pPIC9 (Invitrogen). Es ist die Integration des künstlichen CEL I-Gens (ca. 100bp) in die EcoRI-Schnittstelle des Vektors aufgeführt sowie der für den PCR-Test benötigten Oligonukleotid-primer AOX3' . 4 : Schematic representation of the vector pPIC9 (Invitrogen) preferably used in this invention. The integration of the artificial CEL I gene (approx. 100 bp) into the EcoRI site of the vector and the oligonucleotide primers AOX3 'required for the PCR test are listed.

5: PCR-Ergebnis der Überprüfung der Integration des CEL I-Gens in das Genom verschiedener Hefeklone. Als Templat wurde von 20 zu testenden Hefeklonen genomische DNA isoliert. Template für die Negativkontrolle war genomische DNA zweier untransformierter Hefeklone (-). Als Template für die Positivkontrolle diente pure Vektor-DNA zweier Ausgangskonstrukte. Die Nullprobe beinhaltet Wasser als Template zum Ausschluß von Kontaminationen. 5 : PCR result of checking the integration of the CEL I gene into the genome of various yeast clones. Genomic DNA was isolated from 20 yeast clones to be tested as a template. The template for the negative control was genomic DNA from two untransformed yeast clones (-). Pure vector DNA from two starting constructs served as the template for the positive control. The blank sample contains water as a template to exclude contamination.

Von den 20 zu testenden Klonen sind 16 eindeutig positiv. Sie zeigen gleichsam der Positivkontrollen eine ca. 1000bp große Banden. Negativkontrollen sowie Nullkontrolle sind sauber. Als Größenmarker (M) ist die 1 Kb Plus DNA Ladder von Gibco aufgeführt.Of the 20 clones to be tested 16 clearly positive. They show a kind of positive controls about 1000bp in size Gangs. Negative controls and zero controls are clean. As a size marker (M) is the 1 Kb Plus DNA Ladder from Gibco.

6: Ergebnis der Southernhybridisierung zur weiteren Überprüfung von 12 zuvor mittels PCR-Methode getesteter Hefeklone. Als Positivkontrolle sowie als Größenkontrolle wurde die 262bp große CEL I spezifische Sonde auf Plasmid-DNA (Konstrukt Abb.: 4) hybridisiert (+). 6 : Result of the Southern hybridization for further checking of 12 yeast clones previously tested using the PCR method. As a positive control and as a size control, the 262 bp CEL I-specific probe was hybridized to plasmid DNA (construct: 4) (+).

Als Negativkontrolle wurde die Sonde mit genomischer Hefe-DNA eines, den parentalen Vektor pPIC 9 ohne CEL I-Insert tragenden Klons hybridisiert (-).The probe was used as a negative control with genomic yeast DNA one, the parental vector pPIC 9 without Clones carrying the CEL I insert hybridized (-).

7: Konstrukt zur Bildung von definierten Heterohybriden für die Durchführung eines spezifischen Aktivitätsassays des CEL I-Enzyms. Die beiden dargestellten synthetischen Oligonukleotide sind so konstruiert, daß sie nach Annealing (möglich aufgrund ihrer komplementären Eigenschaft zueinander) unmittelbar in den EcoRI/HindIII restringierten pUC 19-Vektor ligiert werden können. Jedes der beiden Desoxyoligonukleotide liegt in vierfacher Ausführung vor. Die Buchstaben Y bzw. Z symbolisieren je alle vier möglichen Basen. Somit lassen sich je nach Zusammenstellung der Oligonukleotide alle acht möglichen Basenfehlpaarungen synthetisieren (AA/TT/CC/GG/AC/AG/TC/TG). 7 : Construct for the formation of defined heterohybrids for carrying out a specific activity assay of the CEL I enzyme. The two synthetic oligonucleotides shown are constructed in such a way that they can be ligated directly into the EcoRI / HindIII restricted pUC 19 vector after annealing (possibly because of their complementary properties to one another). Each of the two deoxyoligonucleotides is in a fourfold version. The letters Y and Z symbolize all four possible bases. Depending on the composition of the oligonucleotides, all eight possible base mismatches can be synthesized (AA / TT / CC / GG / AC / AG / TC / TG).

8: Exemplarisches Ergebnis des spezifischen Aktivitätsassays von rekombinantem CEL I-Enzym am Beispiel der Basenfehlpaarung AA. Das Mismatchtragende PCR-Produkt von 137bp Länge wird spezifisch an der Mutation eingeschnitten. Es wird zum Teil der Fam markierte und zum Teil der Joe markierte Strang geschnitten. Da die Mutation nicht exakt in der Mitte des PCR-Produktes vorliegt wird das Fragment asymmetrisch in ein 94bp und ein 143bp-Fragment zerlegt. 8th : Exemplary result of the specific activity assay of recombinant CEL I enzyme using the example of the base mismatch AA. The mismatch-bearing PCR product of 137 bp length is specifically cut at the mutation. Part of the Fam marked and partly the Joe marked strand is cut. Since the mutation is not exactly in the middle of the PCR product, the fragment is broken down asymmetrically into a 94bp and a 143bp fragment.

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Claims

Process for the production of in host cells recombinantly expressible, for the whole Nucleic acid sequence encoding CEL I protein comprising - make available the for Sequence encoding CEL I protein from a suitable organism, in particular Apium graveolens L., and - corresponding change the codon frequency the sequence to be expressed compared to the naturally occurring sequence with regard to for the expression used host organism, by a) Classification the designed sequence in an even number x, in particular 8, overlapping regions b) synthesis of 2x mutant oligonucleotides, in particular Oligonucleotides 1-16 to 16-16, each overlapping the entire length Region of both strands encoding sequence, c) first PCR amplification to generate x / 2, in particular 4, overlapping fragments under the use of the oligonucleotides from step b), d) second PCR amplification to generate x / 4, in particular 2, overlapping Regions using the fragments from step c), and e) third PCR amplification to generate x / 8, in particular 1, Fragment containing the coding region of CEL I.

A method according to claim 1, characterized in that at Instead of step e), the following steps are carried out: e) cloning the fragments generated in step d) into a suitable vector, and f) suitable digestion of the vectors and ligation of the fragments to fuse the entire fragment that encodes the coding region of CEL I contains.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that that the Codon frequency the sequence to be expressed according to the codon frequency for yeast changed becomes.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that continues for N-terminals or C-terminal additional available Amino acids tags in particular tags consisting of 6 histidines, coding nucleotides added are.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that that the in step (c), average oligonucleotides synthesized Are 70 nucleotides long and each overlap by approximately 20 bases.

Process for the production of a recombinant complete CEL I protein from Apium graveolens L., comprising - Implementation of the Method according to one of the claims 1 to 5, and - Expression the nucleic acid sequence using a suitable expression system.

A method according to claim 6, characterized in that as Expression system a vector selected from pPIC 9, pPIC 3.5 and pQE vectors is used.

A method according to claim 6 or 7, characterized in that that the nucleic acid sequence selected in a host cell from Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa cells, CHO cells, Toxoplasma gondii and Leishmania becomes.

A method according to claim 8, characterized in that the Pichia pastoris strain used is the GS 115 strain.

Recombinant complete Apium CEL I protein graveolens L., produced by a process of claims 6 to 9th

complete, DNA sequence of the CEL I protein suitable for expression or expressible Portions thereof from Apium graveolens, obtainable by a process according to one of the claims 1 to 5.

DNA sequence of the Apium graveolens CEL I protein according to claim 11, characterized in that further for N-terminals or C-terminal existing additional che Amino acids tags in particular tags consisting of 6 histidines, coding nucleotides added are.

DNA sequence of the Apium graveolens CEL I protein according to claim 11 or 12, characterized in that the sequence restriction endonuclease cleavage sites at both ends has in the rest Sequence and do not occur in a vector to be used.

complete, DNA sequence suitable for expression of the Apium CEL I protein graveolens according to Seq ID No. 7 or parts of it.

Host organism that has a DNA sequence according to a of claims 11 to 14 expressed.

Host organism according to claim 15, selected from Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, HeLa cells, CHO cells, Toxoplasma gondii and Leishmania.

Host organism according to claim 16, characterized in that the Pichia pastoris strain used is the GS 115 strain.

Use of the recombinantly produced CEL I enzyme according to claim 10 for the detection of point mutations and larger mutated Areas such as Deletions / insertions.