DE10325460A1

DE10325460A1 - Spatially high-resolution imaging

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Publication number: DE10325460A1
Application number: DE10325460A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Hell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2003-04-13
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2004-11-11
Also published as: DE10325459A1

Abstract

Bei einem Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit einer Substanz markierten Struktur einer Probe, mit den Schritten: Auswählen der Substanz aus einer Gruppe von Substanzen, die mit einem optischen Umschaltsignal (3) wiederholt aus einem ersten Zustand (1) mit ersten optischen Eigenschaften in einen zweiten Zustand (2) mit zweiten optischen Eigenschaften überführbar sind und die aus dem zweiten Zustand (2) in den ersten Zustand (1) zurückkehren können, Überführen der Substanz in Bereichen der Probe (7) mit dem Umschaltsignal (3) in den zweiten Zustand (2), wobei ein definierter Bereich gezielt ausgelassen wird, und Registrieren eines optischen Messsignals (5), das der Substanz in dem ersten Zustand (1) zuzuordnen ist, für einen Registrierbereich, der neben Bereichen, in denen die Substanz in den zweiten Zustand überführt ist, den gezielt ausgelassenen Bereich umfasst, wird die Substanz aus einer Untergruppe von Substanzen ausgewählt, bei denen sich die beiden Zustände (1, 2) mindestens hinsichtlich eines der folgenden Kriterien unterscheiden: Konformationszustand eines Moleküls, Strukturformel eines Moleküls, räumliche Anordnung von Atomen innerhalb eines Moleküls, räumliche Anordnung von Bindungen innerhalb eines Moleküls, Anlagerung weiterer Atome oder Moleküle an ein Molekül, Gruppierung von Atomen und/oder Molekülen, räumliche Orientierung eines Moleküls, Orientierung benachbarter Moleküle zueinander und von einer Vielzahl von Molekülen und/oder ...In a method for spatially high-resolution imaging of a structure of a sample marked with a substance, with the steps: selecting the substance from a group of substances which is repeated with an optical switching signal (3) from a first state (1) with first optical properties a second state (2) with second optical properties can be transferred and which can return from the second state (2) to the first state (1), transferring the substance in areas of the sample (7) with the switching signal (3) into the second State (2), a defined area being deliberately omitted, and registering an optical measurement signal (5), which is to be assigned to the substance in the first state (1), for a registration area which, in addition to areas in which the substance is in the second Condition has been transferred, encompassing the deliberately omitted area, the substance is selected from a subset of substances in which the distinguish the states (1, 2) at least with regard to one of the following criteria: conformational state of a molecule, structural formula of a molecule, spatial arrangement of atoms within a molecule, spatial arrangement of bonds within a molecule, attachment of further atoms or molecules to a molecule, grouping of Atoms and / or molecules, spatial orientation of a molecule, orientation of neighboring molecules to one another and of a large number of molecules and / or ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit einer Substanz markierten Struktur einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1.The The invention relates to a method for spatially high-resolution imaging a structure of a sample marked with a substance with the characteristics the preamble of claim 1.

Die Substanz kann natürlich in der abzubildenden Struktur der Probe vorkommen. Anderenfalls muss die Struktur der Probe künstlich mit der Substanz markiert werden.The Substance can be natural occur in the structure of the sample to be imaged. Otherwise it must the structure of the sample artificially be marked with the substance.

STAND DER TECHNIKSTATE OF TECHNOLOGY

Die räumliche Auflösung abbildender optischer Verfahren wird grundsätzlich durch die Beugungsgrenze (Abbe'sche Grenze) bei der Wellenlänge des relevanten optischen Signals gesetzt.The spatial resolution imaging optical processes is fundamentally determined by the diffraction limit (Abbe's border) at the wavelength of the relevant optical signal.

Es sind aber bereits Verfahren auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie bekannt, bei denen durch Ausnutzung von nichtlinearen Zusammenhängen zwischen der Schärfe des effektiven fokalen Spots und der eingestrahlten Intensität eines optischen Anregungssignals die Beugungsgrenze bei der Abbildung einer Struktur einer Probe effektiv unterschritten wird. Beispiele sind die Multiphotonenabsorption in der Probe oder die Erzeugung höherer Harmonischer des optischen Anregungssignals. Auch eine Sättigung eines optisch induzierten Übergangs kann als nichtlinearen Zusammenhang ausgenutzt werden, wie beispielsweise bei einer Entvölkerung des fluoreszierenden Zustands durch stimulierte Emission (englisch: stimulated emission depletion = STED) oder einer Entvölkerung des Grundzustands (englisch: ground state depletion = GSD). Bei diesen beiden Verfahren, die prinzipiell molekulare Auflösungen erreichen können, wird ein Fluoreszenzfarbstoff, mit dem die interessierende Struktur einer Probe markiert ist, überall dort, wo ein optisches Umschaltsignal einen charakteristischen Grenzwert, der in dieser Beschreibung als Sättigungsgrenzwert bezeichnet wird, überschreitet, in einen Energiezustand versetzt, aus dem heraus keine Fluoreszenz (mehr) erfolgt. Wenn dabei der räumliche Bereich, aus dem dann noch ein Messsignal registriert wird, durch ein lokales Intensitätsminimum des optischen Umschaltsignals festgelegt wird, das eine Nullstelle aufweist und beispielsweise durch Interferenz erzeugt wird, sind seine Abmessungen und damit die erreichte Ortsauflösung kleiner als die Beugungsgrenze. Der Grund ist, dass der räumliche begrenzte Teilbereich, aus dem das Messsignal registriert wird, mit zunehmenden Sättigungsgrad der Entvölkerung des an der Fluoreszenz beteiligten Zustands eingeengt wird. Genauso wird die Kante eines fokalen Spots oder Streifens steiler, was ebenfalls zu einer erhöhten Ortsauflösung führt.It are already processes in the field of fluorescence microscopy known in which by using non-linear relationships between the sharpness the effective focal spot and the irradiated intensity of a optical excitation signal the diffraction limit in the image a structure of a sample is effectively undershot. Examples are the multiphoton absorption in the sample or the generation higher harmonic of the optical excitation signal. Also a saturation of an optically induced transition can be used as a nonlinear relationship, such as with depopulation of the fluorescent state through stimulated emission stimulated emission depletion = STED) or depopulation the ground state depletion (GSD). at these two processes, which in principle achieve molecular resolutions can, becomes a fluorescent dye with which the structure of interest a sample is marked, everywhere where an optical switching signal has a characteristic limit, which in this description as the saturation limit designated, exceeds placed in an energy state from which there is no fluorescence (more) is done. If the spatial Area from which a measurement signal is then registered by a local intensity minimum of the optical switching signal is set, which is a zero and is generated for example by interference its dimensions and thus the spatial resolution achieved is smaller than the diffraction limit. The reason is that the spatial limited sub-area from which the measurement signal is registered, with increasing degree of saturation depopulation of the state involved in fluorescence is concentrated. Just like that the edge of a focal spot or strip becomes steeper, which also leads to an increased spatial resolution.

Ein STED-Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 ist aus der WO 95/21393 A1 bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine Probe bzw. ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe durch ein optisches Anregungssignal zur Fluoreszenz angeregt. Der räumliche Bereich der Anregung, für den die Beugungsgrenze gilt, wird dann verkleinert, indem er mit einem Intensitätsminimum eines Interferenzmusters eines Abregungslichtstrahls als Umschaltsignal überlagert wird. Überall dort, wo das Umschaltsignal einen Sättigungsgrenzwert übersteigt, wird der Fluoreszenzfarbstoff vollständig durch stimulierte Emission ausgeschaltet, d.h. aus dem zuvor angeregten Energiezustand wieder abgeregt. Der verbleibende räumliche Bereich, aus dem anschließend noch Fluoreszenzlicht spontan emittiert wird, entspricht nur noch einem verkleinerten Gebiet um die Nullstelle des Intensitätsminimums, in dem das Umschaltsignal nischt oder nicht mit ausreichender Intensität vorlag. Obwohl dieses Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie nachvollziehbar eine Ortsauflösung unterhalb der Beugungsgrenze liefert, ist es auch mit Nachteilen verbunden. Die Lebensdauer des Energiezustands des Fluoreszenzfarbstoffs, der mit dem Anregungsstrahl angeregt wird, ist nur kurz. Damit das Umschalten effektiv innerhalb einer noch kürzeren Zeitspanne komplettiert ist, muss daher eine vergleichsweise hohe Intensität des Umschaltsignals angewandt werden. Damit bei der Abregung durch das Umschaltsignal ein nichtlinearer Zusammenhang zwischen der verbleibenden Fluoreszenz und der Intensität des Umschaltsignals hergestellt wird, d.h. Sättigung erreicht wird, muss die Intensität des Abregungsstrahls zusätzlich sehr hoch sein. So wird in der Regel ein gepulster Hochleistungslaser für den Abregungslichtstrahl benötigt, der die Durchführung des bekannten Verfahrens recht kostspielig macht.On STED method with the features of the preamble of the claim 1 is known from WO 95/21393 A1. In this procedure, a Sample or a fluorescent dye in the sample by an optical Excitation signal excited to fluorescence. The spatial area of excitation for which the Diffraction limit applies, is then reduced by using an intensity minimum an interference pattern of an excitation light beam superimposed as a switching signal becomes. All over where the switching signal exceeds a saturation limit, the fluorescent dye becomes completely stimulated by emission switched off, i.e. from the previously excited energy state again energized. The remaining spatial Area from which subsequently fluorescent light is still emitted spontaneously, only corresponds a reduced area around the zero of the intensity minimum, in which the changeover signal is niche or not available with sufficient intensity. Although this method of fluorescence microscopy is understandable a spatial resolution supplies below the diffraction limit, it also has disadvantages connected. The lifetime of the energy state of the fluorescent dye, that is excited with the excitation beam is short. So that Switching is effectively completed within an even shorter period of time is therefore a comparatively high intensity of the switching signal be applied. So when de-energized by the changeover signal a nonlinear relationship between the remaining fluorescence and the intensity of the switching signal is established, i.e. Saturation is reached the intensity of the De-excitation beam additionally be very high. This is how a pulsed high-power laser is usually made for the De-excitation light beam required of performing makes the known method quite expensive.

Dieselben Nachteile gelten auch für bekannte GSD-Verfahren, da auch hier Zeitbeschränkungen und Leistungsanforderungen durch kurze Lebensdauern der beteiligten Energiezustände gesetzt werden.the same Disadvantages also apply to Known GSD procedures, as time restrictions and performance requirements apply here too set by short lifetimes of the energy states involved become.

Aus The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 84, Seiten 25879–25882 (2000), ist ein Protein bekannt, das durch grünes Licht in zunehmendem Maße zur Fluoreszenz im roten Bereich anregbar ist, das aber bei Bestrahlung mit blauem Licht seine Fluoreszenzeigenschaften verliert. Dieser Prozess ist umkehrbar. Offenbar schaltet das grüne Licht das Protein in einen Konformationszustand, in dem es die Fluoreszenzeigenschaft hat, und regt gleichzeitig die Fluoreszenz an, während das blaue Licht das Protein in einen Konformationszustand ohne die Fluoreszenzeigenschaften umschaltet. Das Protein ist ein in der Seeanemone Anemonia sulcata vorkommendes natürliches Protein, dessen hier beschriebenen Funktionen durch gezielten Austausch einer Aminosäure verstärkt werden können.From The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 84, pages 25879-25882 (2000), a protein is known which is increasingly stimulable to fluorescence in the red region by green light, but which loses its fluorescence properties when irradiated with blue light. This process is reversible. Apparently, the green light switches the protein into a conformational state in which it has the fluorescent property and at the same time stimulates fluorescence, while the blue light switches the protein into a conformational state without the fluorescent properties. The protein is found in the sea anemone Anemonia sulcata natural protein, the functions of which can be enhanced by the targeted exchange of an amino acid.

Weiterhin ist es aus der Zeitschrift Nature Vol. 388, Seiten 355–358, (1997) bekannt, dass das Grün-Fluoreszierende-Protein (englisch: green-fluorescent protein, GFP) und Mutanten davon zwischen zwei Zuständen geschaltet werden können, wobei der eine sich von dem anderen spektral unterscheidet. Beide Proteine können als Fluoreszenzmarker in lebenden Zellen eingesetzt werden.Farther it is from the magazine Nature Vol. 388, pages 355-358, (1997) known to be the green fluorescent protein (English: green-fluorescent protein, GFP) and mutants thereof between two states can be switched one being spectrally different from the other. Both Proteins can can be used as fluorescent markers in living cells.

Aus der Publikation Nature, Vol. 420, Seiten 759–760, (2002) sind fluoreszierende Moleküle aus der Familie der Diarylethene bekannt, die sich zwischen einem fluoreszierenden und einem nichtfluoreszierenden Zustand beliebig hin- und herschalten lassen. Beide Zustände sind thermisch stabil, so dass der Schaltprozess, bei dem es sich um eine Photoisomerisierung oder Photocyclisierung handelt, mit vergleichsweise niedrigen Intensitäten eines optischen Signals erzwungen werden kann. Moleküle, die unter Lichteinfluss ihre Farbe verändern, werden allgemein als photochromenen Moleküle bezeichnet.Out of the publication Nature, Vol. 420, pages 759-760, (2002) are fluorescent molecules known from the family of diarylethenes, which is between one fluorescent and a non-fluorescent state any toggle back and forth. Both states are thermally stable, so the switching process, which is photoisomerization or photocyclization, with comparatively low intensities optical signal can be forced. Molecules under the influence of light change their color, are commonly referred to as photochromic molecules.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 aufzuzeigen, das mit vergleichsweise geringem apparativem Aufwand durchführbar ist.The The invention is based on the object of a method for spatially high-resolution imaging a structure of a sample with the features of the preamble of the claim 1 to show that with comparatively little equipment feasible is.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.The The object of the invention is achieved by a method with the features of claim 1 solved.

Vorteilhafte Ausführungsformen des neuen Verfahrens sind in den Unteransprüchen beschrieben.advantageous embodiments of the new method are described in the subclaims.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDESCRIPTION THE INVENTION

Die Verwendung von Substanzen, die zwei Zustände mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften aufweisen, ist ein zentraler Aspekt der Erfindung. Dabei kann mit einem Umschaltsignal die Substanz gezielt von dem ersten in den zweiten Zustand geschaltet werden. Dieser Vorgang ist umkehrbar. D.h., die Substanz kann auch wieder zurück in den ersten Zustand gebracht werden. Die optischen Eigenschaften der Substanz in dem ersten Zustand unterscheiden sich von denjenigen in dem zweiten Zustand dadurch, dass nur sie das Messsignal unterstützen. Es ist jedoch nicht zwingend, dass die relevanten optischen Eigenschaften „binär" sind, d.h. in dem einen Zustand zu 100 % und in dem anderen Zustand zu 0% vorliegen. Es ist vielmehr ausreichend, wenn bei den relevanten optischen Eigenschaften so große Unterschiede gegeben sind, dass sie eine zumindest überwiegende Zuordnung des Messsignals zu dem ersten Zustand erlauben.The Use of substances that have two states with different optical Having properties is a central aspect of the invention. In this case, the substance can be deliberately removed from the substance using a switchover signal first to be switched to the second state. This process is reversible. This means that the substance can also return to the first Condition. The optical properties of the substance in the first state are different from those in the second Condition because only they support the measurement signal. It However, it is not mandatory that the relevant optical properties are "binary", i.e. in the one state is 100% and the other state is 0%. Rather, it is sufficient if the relevant optical properties so big Differences exist that they are at least predominant Allow the measurement signal to be assigned to the first state.

Im Gegensatz zum Stand der Technik auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie macht die Erfindung keinen Gebrauch von zwei einfachen Energiezuständen eines Moleküls zwischen denen das Molekül durch einfache energetische Anregung überführbar ist. Vielmehr unterscheiden sich die beiden Zustände mindestens hinsichtlich eines der folgenden Kriterien:

– Konformationszustand eines Moleküls,
– Strukturformel eines Moleküls,
– räumliche Anordnung von Atomen innerhalb eines Moleküls,
– räumliche Anordnung von Bindungen innerhalb eines Moleküls,
– Anlagerung weiterer Atome oder Moleküle an ein Molekül,
– Gruppierung von Atomen und/oder Molekülen,
– räumliche Orientierung eines Moleküls,
– Orientierung benachbarter Moleküle zueinander,
– von einer Vielzahl von Molekülen und/oder Atomen ausgebildete Ordnung.

In contrast to the prior art in the field of fluorescence microscopy, the invention makes no use of two simple energy states of a molecule between which the molecule can be transferred by simple energetic excitation. Rather, the two states differ in at least one of the following criteria:

- conformational state of a molecule,
- structural formula of a molecule,
Spatial arrangement of atoms within a molecule,
Spatial arrangement of bonds within a molecule,
Attachment of further atoms or molecules to a molecule,
Grouping of atoms and / or molecules,
- spatial orientation of a molecule,
Orientation of neighboring molecules to one another,
- Order formed by a large number of molecules and / or atoms.

Zum Überführen der entsprechenden Substanzen von ihrem ersten in ihren zweiten Zustand bewirkt das optische Umschaltsignal also beispielsweise eine Umlagerungen von Atomgruppen, eine Photoisomerisierung, insbesondere eine cis-trans Isomerisierung, eine Photozyklisierung, eine Protonierung oder De-Protonierungen, eine Spin-Umklappung, einen Elektronentransfer und/oder Energietransfer zwischen verbundenen Molekülen oder Moleküluntereinheiten.To transfer the corresponding substances from their first to their second state the optical switching signal, for example, a rearrangement of atomic groups, photoisomerization, in particular cis-trans isomerization, photocyclization, protonation or de-protonation, a spin flip, electron transfer and / or energy transfer between connected molecules or molecular subunits.

Ein Vorteil der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass die Zustände der in Frage kommenden Substanzen in der Regel eine um ein Vielfaches längere Lebensdauer als die an der Fluoreszenz beteiligten Energiezustände aufweisen. Die Lebensdauer des zweiten Zustands beträgt daher in der Regel mindestens 1 ns. Bevorzugt ist eine Lebensdauer von mindestens 10 ns. Besonders bevorzugt sind thermisch stabile Zustände. Zudem sind die Intensitäten, die zum Erreichen der Zustandsänderung mit dem Umschaltsignal erforderlich sind, relativ gering. Zahlreiche Umschaltprozesse, bei denen der Ausgangs- und/oder Endzustand relativ langlebig (> 10 ns) ist, können mit vergleichsweise niedrigen Intensitäten ausgelöst und in die Sättigung gebracht werden, weil es nur verhältnismäßig langsame oder manchmal sogar keine Prozesse gibt, die mit dem Umschaltprozess konkurrieren.On Advantage of the invention over the state of the art in the field of fluorescence microscopy is that the states of the substances in question is usually a multiple longer Have lifetime than the energy states involved in fluorescence. The The lifespan of the second state is therefore usually at least 1 ns. A lifespan of at least 10 ns is preferred. Especially thermally stable states are preferred. In addition, the intensities are to achieve the change of state with the switching signal are required, relatively low. numerous Switching processes in which the initial and / or final state are relative durable (> 10 ns) is, can triggered with comparatively low intensities and into saturation be brought up because it's only relatively slow or sometimes there are no processes that compete with the switching process.

Die unterschiedlichen optischen Eigenschaften der beiden Zustände der Substanz können unterschiedliche spektrale Eigenschaften sein. Beispielsweise können die ersten optischen Eigenschaften gegenüber den zweiten optischen Eigenschaften unterschiedliche Absorptionen für ein optisches Testsignal aufweisen, wobei das Messsignal in Transmission oder auch in Reflektion beobachtet werden kann. Als unterschiedliche spektrale Eigenschaften bevorzugt sind unterschiedliche Lumineszenzen aus der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Elektrolumineszenz und Chemolumineszenz umfassenden Gruppe. Moleküle, die ihre spektralen Eigenschaften, insbesondere ihre Farbe verändern und die ebenfalls als Substanz zur Markierung der interessierenden Struktur im Rahmen der Erfindung geeignet sind, werden auch als photochrom bezeichnet.The different optical properties of the two states of the Substance can be different spectral properties. For example, the first optical properties compared to the second optical properties different absorptions for have an optical test signal, the measurement signal in transmission or can also be observed in reflection. As different different luminescences are preferred from fluorescence, phosphorescence, electroluminescence and chemiluminescence comprehensive group. molecules that change their spectral properties, especially their color, and which is also used as a substance to mark the structure of interest in the Suitable for the purposes of the invention are also referred to as photochromic.

Statt unterschiedlicher spektraler Eigenschaften können die beiden Zustände der Substanz auch unterschiedliche Polarisationseigenschaften, beispielsweise in Bezug auf ein optisches Testsignal oder ein von der Probe selbst emittiertes Messsignal, aufweisen.Instead of The two states of the Substance also have different polarization properties, for example with respect to an optical test signal or from the sample itself emitted measurement signal.

Um bei dem neuen Verfahren die Beugungsgrenze bei der Ortsauflösung zu unterschreiten, sind die Substanz und das Umschaltsignal so aufeinander abzustimmen, dass das Überführen von dem ersten Zustand mit dem Umschaltsignal in den zweiten Zustand nichtlinear von der Intensität des Umschaltsignals abhängt. Dies wird erreicht, wenn die Überführung der Substanz in den zweiten Zustand überall dort vollständig bzw. im Wesentlichen vollständig erfolgt, wo das Umschaltsignal einen Sättigungsgrenzwert überschreitet. Konkret muss die Intensität des Umschaltsignals in dem gesamten Registrierbereich außerhalb des gezielt ausgelassenen räumlichen Bereichs den Sättigungsgrenzwert überschreiten, und gleichzeitig muss der gezielt ausgelassene räumliche Bereich ein lokales Intensitätsminimum des Umschaltsignals sein. Ein solches lokales Intensitätsminimum mit Nullstelle der Intensität kann durch ein Interferenzmuster bereitgestellt werden. Grundsätzlich können hierzu aber auch Projektionen eingesetzt werden; man kann das Umschaltsignal weiterhin unter einem spitzen oder stumpfen Winkel von der Seite einstrahlen. Darüber hinaus sind Hologramme zur Erzeugung lokaler Intensitätsminima des Umschaltsignals möglich. Mit den Intensitätsminima einfacher Interferenzmustern sind aber besonders leicht kleinste räumliche Bereiche definierbar, die von dem Umschaltsignal ausgelassen werden.Around the diffraction limit for the spatial resolution in the new method fall below, the substance and the switching signal are to be coordinated so that convicting the first state with the switchover signal to the second state non-linear in intensity of the switching signal depends. This is achieved when the transfer of the Substance in the second state everywhere there Completely or essentially complete takes place where the changeover signal exceeds a saturation limit. The intensity must be concrete of the switching signal in the entire registration area outside the deliberately omitted spatial Range exceed the saturation limit, and at the same time the deliberately omitted spatial area must be a local one intensity minimum of the switching signal. Such a local intensity minimum with zero of the intensity can be provided by an interference pattern. Basically you can do this but projections are also used; you can see the switch signal continue to shine from the side at an acute or obtuse angle. About that In addition, holograms are used to generate local intensity minima of the changeover signal possible. With the intensity minima simple interference patterns are particularly easily the smallest spatial Ranges definable that are omitted from the switchover signal.

Bevorzugt werden bei den neuen Verfahren Substanzen eingesetzt, die mit einem anderen Schaltsignal von dem zweiten in den ersten Zustand überführbar sind. Bei dem andern Schaltsignal kann es sich wie bei dem Umschaltsignal um ein optisches Signal handeln. Es kann beispielsweise aber auch eine elektrisches oder thermisches Signal sein. Es ist weiterhin möglich, dass die Rückschaltung in den ersten Zustand spontan, d.h. bereits bei Umgebungstemperatur thermisch getrieben, erfolgt. So ist es bekannt, dass Moleküle die eine photoinduzierte cis-trans-Insomerisierung durchlaufen, rein thermisch in den ersten Zustand zurück kommen können. Mit dem anderen Schaltsignal kann die Substanz aber gezielt in den ersten Zustand zurück gebracht werden, was vorteilhaft sein kann, um das Verfahren insgesamt zu beschleunigen.Prefers substances are used in the new processes, which with a another switching signal can be converted from the second to the first state. The other switching signal can be the same as the switching signal is an optical signal. But it can also be, for example electrical or thermal signal. It is still possible that the downshift in the first state spontaneously, i.e. already at ambient temperature thermally driven, takes place. So it is known that molecules are the one undergo photo-induced cis-trans insomerization, purely thermal back to the first state can come. With the other switching signal, the substance can be targeted in the first Condition back brought, which can be beneficial to the process as a whole to accelerate.

Das andere Schaltsignal wird bevorzugt vor dem Umschaltsignal bzw. nach dem Registrieren des Messsignals angewandt. Sofern das Umschalten mit dem Umschaltsignal durch das andere Schaltsignal nicht wesentlich beeinträchtigt wird, kann das andere Schaltsignal auch noch während des Aufbringens des Umschaltsignals auf die Probe aufgebracht werden. Es ist weiterhin nicht erforderlich, das andere Schaltsignal auf den interessierenden räumlichen Bereich einzugrenzen, was den Aufwand für das Aufbringen bei optischen Schaltsignalen reduziert und andere Arten von anderen Schaltsignalen überhaupt erst ermöglicht.The other switching signal is preferred before or after the switching signal the registration of the measurement signal applied. If switching with the switching signal by the other switching signal is not essential impaired is, the other switching signal can also while the switching signal is being applied be applied to the sample. It’s still not necessary the other switching signal to the spatial area of interest narrow down what the effort for the application of optical switching signals is reduced and others Types of other switching signals possible in the first place.

Wenn ein Testsignal auf die Probe gerichtet wird, um das zu registrierende Messsignal zu erzeugen, wird dies nach dem Umschaltsignal auf die Probe aufgebracht. Dabei kann auch das Testsignal über einen den gezielt ausgelassenen räumlichen Bereich einschließenden größeren Bereich auf die Probe aufgebracht werden. Die für die Erhöhung der Ortsauflösung des neuen Verfahrens erforderliche räumliche Eingrenzung wird von dem optischen Umschaltsignal geleistet.If a test signal is directed at the sample to register the one Generate measurement signal, this is after the switchover signal to the Sample applied. The test signal can also be via a the deliberately omitted spatial Area enclosing larger area be applied to the sample. The for increasing the spatial resolution of the spatial limitation required by the new process is performed by the optical switching signal.

Wenn es sich bei dem Messsignal um von der Probe emittiertes Licht handelt, kann ein entsprechendes Anregungssignal, das als Testsignal eingesetzt wird, auch gleichzeitig mit dem Umschaltsignal auf die Probe aufgebracht werden. Es sollte aber in jedem Fall später oder frühestens gleichzeitig mit dem anderen Schaltsignal auf die Probe aufgebracht werden, soweit das Anregungssignal und das andere Schaltsignal nicht sowieso identisch sind.If the measurement signal is light emitted by the sample, can be a corresponding excitation signal that is used as a test signal is also applied to the sample at the same time as the switchover signal become. In any case, it should be later or at the earliest at the same time as the other switching signal to be applied to the sample, insofar as that Excitation signal and the other switching signal are not identical anyway are.

Um eine Probe vollständig abzubilden, ist es erforderlich, dass die Probe mit dem von dem Umschaltsignal gezielt ausgelassenen Bereich abgerastert, d.h. an allen Punkten abgetastet, wird. Dabei kann die Probe zu einem Zeitpunkt auch in mehreren voneinander beabstandeten Punkten, d.h. definierten Bereichen, gleichzeitig gemessen werden. Dabei werden mehrere optische Messsignale, die der Substanz in dem ersten Zustand zuzuordnen sind, für mehrere Registrierbereiche, die jeweils neben Bereichen, in denen die Substanz in den zweiten Zustand überführt ist, einen gezielt ausgelassenen Bereich umfassen, zwar gleichzeitig aber getrennt voneinander registriert. Die Rasterung kann jeweils durch eine räumliche Verschiebung der verwendeten Schaltsignale, insbesondere des Umschaltsignals, gegenüber den Koordinaten der Probe erfolgen. Da alle von dem Umschaltsignal gezielt ausgelassenen räumlichen Bereiche vorzugsweise Intensitätsminima eines Interferenz musters sind, kann die Rasterung durch die Verschiebung einer oder mehrerer Interferenzminima des Umschaltsignals erfolgen. Dabei kann diese Verschiebung durch eine reine Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewerkstelligt werden.In order to completely image a sample, it is necessary that the sample is scanned with the area specifically omitted by the switchover signal, that is to say scanned at all points. The sample can also be measured at the same time in several points that are spaced apart, ie defined areas. In this case, a plurality of optical measurement signals, which are to be assigned to the substance in the first state, are used for a plurality of registration regions, each of which, in addition to regions in which the substance is transferred to the second state, comprise a specifically omitted region, but at the same time separately from one another who registered. The rasterization can take place by spatially shifting the switching signals used, in particular the switching signal, with respect to the coordinates of the sample. Since all spatial areas deliberately omitted by the switchover signal are preferably intensity minima of an interference pattern, the rasterization can be carried out by shifting one or more interference minima of the switchover signal. This shift can be brought about by a pure phase shift of the interfering beams.

Beim Abrastern einer Probe nach dem neuen Verfahren ergibt sich eine zyklische Abfolge der Schritte: Überführen der Substanz in Bereichen der Probe mit dem Umschaltsignal in den zweiten Zustand, wobei ein definierter Bereich gezielt ausgelassen wird; Registrieren des optischen Messsignals, das der Substanz in dem ersten Zustand zuzuordnen ist, für einen den jeweils gezielt ausgelassenen Bereich umfassenden Registrierbereich; und Überführen der Substanz in den ersten Zustand. Dabei reicht es, wie bereits angedeutet wurde, aus, wenn nur das Umschaltsignal mit seinem Intensitätsminimum genau auf den jeweils interessierenden definierten Bereich der Probe ausgerichtet wird.At the Scanning a sample according to the new method results in a Cyclic sequence of steps: transfer the Substance in areas of the sample with the switching signal in the second State in which a defined area is deliberately omitted; Register the optical measurement signal that the substance in the first state can be assigned for a registration area comprising the area specifically omitted; and transfer the Substance in the first state. It is enough, as already indicated was off, if only the switching signal with its intensity minimum exactly on the defined area of interest of the sample is aligned.

Vorzugsweise wird die Substanz mit den unterschiedlichen optischen Eigenschaften aus der Gruppe der Proteine ausgewählt. Hierzu gehören insbesondere die bekannten Proteine asCP (asF595) und T70a/A148S/S165V, welche über zwei Konformationszustände mit geeigneten spektralen Eigenschaften verfügen, oder auch das Green-Fluorescent-Protein (GFP) und davon abgeleitete Mutanten.Preferably becomes the substance with the different optical properties selected from the group of proteins. These include in particular the known proteins asCP (asF595) and T70a / A148S / S165V, which have two conformational with suitable spectral properties, or also the green fluorescent protein (GFP) and mutants derived from it.

Proteine als markierende Substanzen können auch auf gentechnischem Wege in eine biologische Probe eingebracht werden, so dass keine nachträgliche Markierung der Struktur der Probe mit der Substanz erforderlich ist, die die Probe negativ beeinträchtigen oder zumindest durch den Schritt des Markierens verändern kann. Wenn ein gentechnisches Markieren der interessierenden Strukturen der Probe nicht möglich ist, kann die Struktur der Probe in an sich bekannter Weise mit der Substanz markiert werden. Beispielsweise können dabei Hilfssubstanzen verwendet werden, die an die interessierende Struktur selektiv anbinden und an die wiederum die Substanz angebunden ist oder wird. Aus dem Bereich des Einfärbens von Proben für die Fluoreszenzmikroskopie sind dem Fachmann hier viele Vorgehensweisen bekannt. Die Probe kann auch von Natur aus über Moleküle mit geeigneten optischen Zuständen, die die Anforderungen an die Substanz für das neue Verfahren erfüllen.proteins as labeling substances also introduced into a biological sample by genetic engineering be, so no subsequent Labeling of the structure of the sample with the substance required is that negatively affect the sample or at least by change the marking step can. If a genetic marking of the structures of interest the sample is not possible is, the structure of the sample in a known manner with of the substance are marked. For example, auxiliary substances can be used that selectively connect to the structure of interest and to which in turn the substance is or will be bound. From the area of inking of samples for Fluorescence microscopy is a lot of procedures for a person skilled in the art known. The sample can also be inherently molecular using suitable optical molecules Conditions that meet the substance requirements for the new process.

Das neue Abbildungsverfahren kann nach dem Markieren der Strukturen mit der fluoreszierenden Substanz auf einem üblichen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, wobei der zusätzliche Aufwand für die Auflösungsverbesserung unter die Beugungsgrenze vergleichsweise gering ist und sich auf zusätzliche Mittel zum Bereitstellen des optischen Umschaltsignals beschränken kann. Diese Mittel könne beispielsweise einen einfachen Laser oder auch eine konventionelle Lampe umfassen. In einer bevorzugten Ausführung, bei der zur Beschleunigung des Verfahrens in mehreren Bereichen gleichzeitig gemessen wird, werden die Messsignale aus den einzelnen Bereichen gleichzeitig mit einer (CCD-) Kamera ausgelesen. Das Gesamtbild der Probe ergibt sich dann aus der Zusammenfügung mehrerer Bilder mit unterschiedlichen Positionen der vermessenen Bereiche in der Probe.The new mapping process can be done after marking the structures with the fluorescent substance on a conventional fluorescence microscope carried out be, the additional effort for the Resolution enhancement below the diffraction limit is comparatively low and on additional Can limit means for providing the optical switching signal. These funds can for example a simple laser or a conventional one Embrace lamp. In a preferred embodiment, in the case of acceleration the process is measured in several areas simultaneously, are the measurement signals from the individual areas simultaneously read out with a (CCD) camera. The overall picture of the sample results then from combining several Images with different positions of the measured areas in the rehearsal.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGURENSUMMARY THE FIGURES

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von in den Figuren dargestellten Details weiter erläutert und beschrieben.in the The invention is illustrated below with reference to the figures Details explained further and described.

1 zeigt symbolisch zwei Konformationszustände eines Moleküls oder Molekülkomplexes, und 1 symbolically shows two conformational states of a molecule or molecular complex, and

2 zeigt schematisch eine Anordnung zur Durchführung des neuen Verfahrens. 2 shows schematically an arrangement for performing the new method.

FIGURENBESCHREIBUNGDESCRIPTION OF THE FIGURES

1 zeigt symbolisch ein Molekül oder einen Molekülkomplex, das bzw. der sich in zwei verschiedenen Zuständen 1 und 2 befinden kann. Der erste Zustand 1 ist dabei fluoreszenztauglich, der zweite Zustand 2 dagegen nicht. Durch Beleuchtung mit einem Umschaltsignal 3 mit einer bestimmten Wellenlänge kann eine gezielter Wechsel von dem ersten Zustand 1 in den zweiten Zustand 2 induziert werden. Aus dem zweiten Zustand 2 kann das Molekül beispielsweise spontan in den ersten Zustand 1 zurückkehren. Bevorzugt ist es aber, wenn beide Zustände 1 und 2 thermisch stabil sind und zum Zurückschalten in den ersten Zustand 1 ein weiteres optisches Schaltsignal verwendet wird. 1 symbolically shows a molecule or a molecular complex that is in two different states 1 and 2 can be located. The first state 1 is suitable for fluorescence, the second state 2 not against it. By lighting with a switch signal 3 with a certain wavelength can make a targeted change from the first state 1 in the second state 2 be induced. From the second state 2 For example, the molecule can spontaneously enter the first state 1 to return. However, it is preferred if both states 1 and 2 are thermally stable and to switch back to the first state 1 another optical switching signal is used.

2 zeigt schematisch eine mögliche Anordnung zur Durchführung der Erfindung mit zwei Strahlteilern 11 und 12 sowie einem Objektiv 13. Eine Probe 7 wird hier einerseits durch ein Anregungssignal, das als Testsignal 4 verwendet wird, von einer Fluoreszenzanregung 6 zur Fluoreszenz angeregt, andererseits aber durch das Umschaltsignal 3 von einem Fluoreszenzverhinderungsmittel 8 an definierbaren Orten an der Fluoreszenz gehindert, indem Moleküle reversibel ortsabhängig in den nicht fluoreszenzfähigen zweiten Zustand versetzt werden. Im gezeigten Beispiel geschieht dies durch gekreuzte interferenzfähige Strahlen 14. Fluoreszenz kann in diesem Fall nur noch in schmalen räumlichen Bereichen 9 erzeugt werden, die bei geeigneten Bedingungen, wie der Sättigung des Umschaltens, schmaler sind als die Beugungsgrenze. Durch rasterndes Verschieben des Interferenzmusters 15 und das sequentielle Erfassen und Auslesen der Fluoreszenz als Messsignal 5 mit einer Kamera 10 kann die ganze Probe 7 mit Hochauflösung erfasst werden. 2 shows schematically a possible arrangement for carrying out the invention with two beam splitters 11 and 12 as well as a lens 13 , A sample 7 is here on the one hand by an excitation signal, which is called a test signal 4 is used by a fluorescence excitation 6 stimulated to fluorescence, but on the other hand by the switching signal 3 from a fluorescence preventing agent 8th prevented from fluorescence at definable locations by reversibly placing molecules in the non-fluorescent second state depending on their location. In the example shown, this is done by crossing in interference-capable rays 14 , In this case, fluorescence can only occur in narrow spatial areas 9 are generated that are narrower than the diffraction limit under suitable conditions such as saturation of switching. By shifting the interference pattern 15 and sequential detection and reading of the fluorescence as a measurement signal 5 with a camera 10 can do the whole sample 7 captured with high resolution.

Claims

Method for spatially high-resolution imaging of a structure of a sample marked with a substance, with the steps: - Selecting the substance from a group of substances which is repeated with an optical switch signal from a first state with first optical properties to a second state with second optical properties can be transferred and which can return from the second state to the first state, - transferring the substance in areas of the sample with the switchover signal to the second state, a defined area being deliberately omitted, and - registering an optical measurement signal that the substance in is to be assigned to the first state, for a registration area which, in addition to areas in which the substance is transferred to the second state, comprises the specifically omitted area, characterized in that the substance is selected from a subgroup of substances in which the two Zust change ( 1 . 2 ) differentiate at least with regard to one of the following criteria: - conformational state of a molecule, - structural formula of a molecule, - spatial arrangement of atoms within a molecule, - spatial arrangement of bonds within a molecule, - attachment of further atoms or molecules to a molecule, - grouping of Atoms and / or molecules, - spatial orientation of a molecule, - orientation of neighboring molecules to one another, - order formed by a large number of molecules and / or atoms.

A method according to claim 1, characterized in that the lifetime of the second state ( 2 ) is longer than 1 ns.

Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the different optical properties of the two states ( 1 . 2 ) the substance has different spectral properties.

A method according to claim 3, characterized in that the first optical properties versus the second optical properties different absorptions for have a test signal.

A method according to claim 3, characterized in that the first optical properties versus the second optical properties different luminescence from fluorescence, phosphorescence, Have group comprising electroluminescence and chemiluminescence.

Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that that the different optical properties of the states of the Substance are different polarization properties.

Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the substance and the switching signal ( 3 ) are coordinated so that wherever the intensity of the switching signal ( 3 ) exceeds a saturation limit, the second state completely ( 2 ) of the substance.

A method according to claim 7, characterized in that the intensity of the switching signal ( 3 ) in the entire registration area outside the specifically omitted area ( 9 ) exceeds the saturation limit and that the deliberately omitted spatial area ( 9 ) a local intensity minimum of the switching signal ( 3 ) is.

A method according to claim 8, characterized in that the local intensity minimum of the switching signal ( 3 ) an intensity minimum with zero of an interference pattern ( 15 ) is.

Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the substance is selected from the group of substances which with a different switching signal from the second state ( 2 ) in the first state ( 1 ) are transferable.

A method according to claim 10, characterized in that the other switching signal before or simultaneously with the changeover signal ( 3 ) to the test ( 7 ) is applied.

A method according to claim 10 or 11, characterized in that the other switching signal on the sample over a larger area including the registration area ( 7 ) is applied.

Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that after the switchover signal ( 3 ) a test signal on the sample ( 7 ) is applied.

A method according to claim 13, characterized in that the test signal over a specifically omitted area ( 9 ) including larger area to be tested ( 7 ) is applied.

A method according to claim 5 and claim 10, characterized in that the luminescence is excited by the other switching signal, the other switching signal during the application of the switching signal ( 3 ) to the test ( 7 ) is applied.

Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that the sample ( 7 ) with the deliberately omitted area ( 9 ) is scanned.

Method according to one of claims 1 to 16, characterized in that at the same time a plurality of optical measurement signals that the substance in the first state ( 1 ) are to be assigned for several registration areas, each of which, in addition to areas in which the substance is transferred to the second state, a specifically omitted area ( 9 ) must be registered separately.

Method according to one of claims 1 to 17, characterized in that the steps - transfer of the substance in areas of the sample ( 7 ) with the changeover signal ( 3 ) in the second state ( 2 ), with a defined range ( 9 ) is specifically omitted, - registering the optical measurement signal ( 5 ), which is to be assigned to the substance in the first state, for a specifically defined area ( 9 ) comprehensive registration area, - transfer of the substance into the first state, for different defined areas of the sample ( 7 ) are carried out one after the other.

Method according to one of claims 1 to 18, characterized in that that the substance is selected from the subset of substances that Proteins include.

A method according to claim 19, characterized in that the substance is selected from the subset of substances which include fluorescent proteins.

Method according to one of claims 1 to 20, characterized in that to mark their structures, the substance is genetically engineered into a biological sample ( 7 ) is introduced.

Using a fluorescence microscope when performing the Method according to one of the claims 1 to 20.