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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation und Reinigung
von in vivo und in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexen.
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HINTERGRUND
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RNA-Moleküle dienen
nicht nur als wesentliche Mittler zwischen Genen und Proteinen,
sondern spielen auch bei einer schnell wachsenden Anzahl biologischer
Prozesse strukturelle und regulatorische Rollen.
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Dazu
gehören
die grundlegenden Schritte Transkriptionseinleitung, Spleißen, Lokalisation,
Translation und Stabilität
(Dreyfuss et al., 2002; Szymanski et al., 2003; Doudna und Rath,
2002; Erdmann et al., 2001; Pesole et al., 2001; Berkhout et al.,
1989) sowie Prozesse wie Dosiskompensation (Bell et al., 1988; Lee
und Jaenisch, 1997; Meller et al., 2000; Salido et al., 1992), Heterochromatinbildung
(Lee et al., 1997) und Telomererhaltung (Le et al., 2000). Zu beachten
ist, dass die Genome vieler Viren eher als RNA als als DNA kodiert sind
und ein großer
Teil ihrer Infektionszyklen über
die RNA-Biochemie gesteuert wird (Berkhout et al., 1989), was auch
für das
Abwehrsystem der Wirte gilt, das den Infektionsprozess blockiert
(Mahalingam et al., 2002). Es ist eindeutig, dass diese Moleküle und Prozesse
für die
Lebensfähigkeit
von Zellen und Pathogenen entscheidend und somit hervorragende Ziele
für eine
pharmakologische Intervention sind.
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Der
kürzlich
geprägte
Begriff Ribonomik wurde als das vollständige Verständnis des Stoffwechsels, der
Struktur, der Wechselwirkungen und Funktion der mRNA definiert (Keene
2001; Tenenbaum et al., 2000). Eine umfassende Katalogisierung aller
Ribonukleinprotein (RNP)-Komplexe ist ein wesentlicher Aspekt dieses großen Unterfangens.
Die derzeit verwendeten Methodologien zur Identifizierung von RNA-assoziierten
Molekülen
eignen sich jedoch nicht sehr gut für ein derartiges Unterfangen.
So haben beispielsweise RNA-Bindungsproteine
im Allgemeinen nicht dieselbe Spezifität wie DNA-Bindungsproteine.
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Folglich
werden mit Techniken, die individuelle RNA-Protein-Wechselwirkungen
identifizieren, häufig Proteine
isoliert, die für
die zu untersuchenden Prozesse irrelevant sind. Tatsächlich nehmen
die Hinweise darauf zu, dass zahlreiche hoch affine RNA/Protein-Wechselwirkungen
mehrere Kontakte zwischen cis-agierenden Elementen und mehreren
Proteinen innerhalb eines Komplexes verlangen (Chartrand et al.,
2001). Diese Komplexität
hat mehrere nachteilige Auswirkungen auf die Erkennung von Wechselwirkungen
in vitro. Zum einen treten sie möglicherweise
nicht in vitro auf, wenn die individuellen Wechselwirkungen schwach
sind. Zum anderen stehen einzelne Komponenten möglicherweise nicht für eine de
novo Assemblierung zur Verfügung, wenn
die vorgebildeten multimeren Komplexe stabil sind.
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Dies
würde zu
einer Isolierung anderer, zugänglicherer
und häufigerer
Moleküle
führen,
die für
den untersuchten Prozess irrelevant sind.
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Ein
Verfahren, das im Stande ist, spezifische in vivo gebildete RNA-Protein-Komplexe
zu isolieren, würde
zahlreiche der vorstehend genannten Probleme vermeiden. Wenn ein ähnliches
Verfahren zur In-vitro-Analyse von Komplexen verwendet werden könnte, würde eine Ähnlichkeit
der Ergebnisse anzeigen, ob der In-vivo-Prozess zur Untersuchung
des fraglichen RNA-Protein-Komplexes erforderlich war oder nicht.
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KURZDARSTELLUNG
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung eines in vitro gebildeten
RNA-Protein-Komplexes bereit, umfassend das Bereitstellen eines
RNA-Fusionsmoleküls,
das eine Ziel-RNA-Sequenz
und wenigstens zwei unterschiedliche RNA-Marker („RNA-Tags") umfasst, wobei
wenigstens ein RNA-Marker mit einem Liganden reversibel in Wechselwirkung
tritt; das Kontaktieren des RNA-Fusionsmoleküls mit einem zellulären Extrakt;
das Bereitstellen von Bedingungen, welche die Bildung eines RNA-Protein-Komplexes
auf der Ziel-RNA-Sequenz ermöglichen,
und das Unterwerfen des RNA-Protein-Komplexes wenigstens zweier
verschiedener Affinitätsreinigungsschritte,
wobei jeder Schritt die Bindung eines RNA-Markers an ein Affinitätsharz umfasst,
das im Stande ist, einen RNA-Marker
selektiv zu binden, und Eluieren des RNA-Markers nach dem Entfernen
von nicht an das Affinitätsharz
gebundenen Stoffen aus dem Affinitätsharz. In einer Ausführungsform
wird das RNA-Fusionsmolekül
mit einer Proteinmischung anstatt einem zellulären Extrakt in Kontakt gebracht.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reinigung eines in vivo
gebildeten RNA-Protein-Komplexes bereit, umfassend Expression eines
RNA-Fusionsmoleküls,
das eine Ziel-RNA-Sequenz
und wenigstens zwei unterschiedliche RNA-Marker umfasst, in einer
eukaryotischen Zelle, wobei wenigstens ein RNA-Marker mit einem
Liganden reversibel in Wechselwirkung tritt; Bereitstellen von Bedingungen,
die die Bildung eines RNA-Protein-Komplexes auf der Ziel-RNA-Sequenz
ermöglichen;
Erzeugen eines zellulären
Extrakts; Unterwerfen des zellulären
Extrakts wenigstens zweier verschiedener Affinitätsreinigungsschritte, wobei
jeder Schritt die Bindung eines RNA-Markers an ein Affinitätsharz umfasst,
das im Stande ist; einen RNA-Marker selektiv zu binden, und Eluieren
des RNA-Markers nach dem Entfernen von nicht an das Affinitätsharz gebundenen
Stoffen aus dem Affinitätsharz.
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Die
Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das durch die Isolierung
eines in vitro oder in vivo gebildeten RNA-Protein-Komplexes gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
identifiziert wird.
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In
einer Ausführungsform
bindet wenigstens ein RNA-Marker über ein Fusionsprotein, das
ein Polypeptid, das spezifisch an den RNA-Marker bindet, und ein
Polypeptid, das spezifisch an das Affinitätsharz bindet, umfasst, an
das Affinitätsharz.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Polypeptid, das spezifisch an das Affinitätsharz bindet,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Maltosebindungsprotein, einem
6-Histidin-Peptid,
Glutathion-S-Transferase und einem Anteil davon, der für die spezifische
Bindung an das Affinitätsharz
ausreicht.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein RNA-Fusionsmolekül, das eine
Ziel-RNA-Sequenz und wenigstens zwei unterschiedliche RNA-Marker
umfasst, wobei wenigstens ein RNA-Marker mit einem Liganden reversibel
in Wechselwirkung tritt.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
wiederholt sich wenigstens einer der RNA-Marker. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind die RNA-Marker ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einer Streptavidin-Bindungssequenz
(S1), einer MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz,
einer Streptomycin-Bindungssequenz (Streptotag), einer Sephadex-Bindungssequenz
(D8), einer N-Protein-Bindungssequenz (Nut), einer REV-Bindungssequenz,
einer TAT-Bindungssequenz und einer R17-Hüllprotein-Bindungssequenz. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
weisen die RNA-Marker wenigstens eine MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz
und wenigstens eine Streptavidin-Bindungssequenz
auf. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weisen die RNA-Marker
wenigstens sechs MS2-Hüllprotein-Bindungssequenzen
und wenigstens zwei Streptavidin-Bindungssequenzen auf.
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In
einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfassen die RNA-Fusionsmoleküle
weiterhin wenigstens eine Isolatorsequenz.
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Die
Erfindung stellt auch isolierte DNA-Konstrukte, die für die erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküle kodieren,
sowie Vektoren und Wirtszellen, welche die isolierten DNA-Konstrukte exprimieren,
bereit.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen von Testverbindungen
oder Proteinen auf ihre Fähigkeit,
einen RNA-Protein-Komplex zu modulieren oder zu regulieren, mittels
Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Reinigung der in vitro oder in vivo gebildeten RNA-Protein-Komplexe
und Erfassen eines möglicherweise
vorhandenen Unterschieds zwischen RNA-Protein-Komplexen, die in
Gegenwart der Testverbindungen oder Proteine und in Abwesenheit
der Testverbindungen oder Proteine gereinigt wurden, wobei ein Unterschied
anzeigt, dass die Testverbindungen oder Proteine den RNA-Protein-Komplex
modulieren.
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Die
Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Konstrukt bereit, das eine Transkriptionskassette
umfasst, welche eine Promotor-Sequenz,
eine Ködersequenz,
die wirksam an den Promotor gebunden ist, eine Transkriptionsterminationssequenz,
die ein Stoppsignal für
RNA-Polymerase und ein Polyadenylationssignal für Polyadenylase umfasst, und
wenigstens zwei Marker-Sequenzen
umfasst.
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In
einer Ausführungsform
umfasst das isolierte DNA-Konstrukt wenigstens eine Streptavidin-Bindungssequenz
[SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ NO 17] und wenigstens eine MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz [SEQ
ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ NO 18]. In einer weiteren
Ausführungsform
umfasst das isolierte DNA-Konstrukt wenigstens eine Marker-Sequenz,
die zur Streptavidin-Bindungssequenz [SEQ ID NO:2], und wenigstens
eine Marker-Sequenz, die mit der MS2-Hüllprotein- Bindungssequenz [SEQ ID NO:4] jeweils
unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
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Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes DNA-Konstrukt bereit, das eine
Transkriptionskassette umfasst, welches Konstrukt eine Promotorsequenz,
eine Ködersequenz,
die funktionsfähig
mit dem Promotor verknüpft ist,
eine Transkriptionsterminationssequenz, die ein Stoppsignal für RNA-Polymerase
und ein Polyadenylationssignal für
Polyadenylase umfasst, und wenigstens drei Marker-Sequenzen umfasst.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das isolierte DNA-Konstrukt
wenigstens eine Streptavidin-Bindungssequenz [SEQ ID NO:2, SEQ NO
17] und wenigstens zwei MS2-Hüllprotein-Bindungssequenzen [SEQ
ID NO:7, SEQ NO 18]. In noch einer Ausführungsform umfasst das isolierte
DNA-Konstrukt wenigstens eine Marker-Sequenz, die mit der Streptavidin-Bindungssequenz [SEQ
ID NO:2, SEQ ID NO 17], und wenigstens zwei Marker-Sequenzen, die
mit der MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz
[SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:18] jeweils unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisieren.
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In
einer Ausführungsform
umfassen die isolierten DNA-Konstrukte
weiterhin wenigstens drei Isolator-Sequenzen und in einer weiteren
Ausführungsform
wenigstens vier Isolator-Sequenzen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Expressionsvektoren und Wirtszellen,
welche die isolierten DNA-Konstrukte umfassen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein RNA-Fusionsmolekül, das eine
Ziel-RNA-Sequenz und wenigstens zwei RNA-Marker umfasst, wobei wenigstens
einer der RNA-Marker mit einem Liganden reversibel in Wechselwirkung
tritt. In einer Ausführungsform
umfasst das RNA-Fusionsmolekül
wenigstens einen Streptavidin-Bindungsmarker [SEQ ID NO:3] und wenigstens
einen MS2-Hüllprotein-Bindungsmarker
[SEQ ID NO:5].
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein RNA-Fusionsmolekül, das eine
Ziel-RNA-Sequenz und wenigstens drei RNA-Marker umfasst, wobei wenigstens zwei
der RNA-Marker mit einem Liganden reversibel in Wechselwirkung treten.
In einer weiteren Ausführungsform
umfasst das RNA-Fusionsmolekül
wenigstens einen Streptavidin-Bindungsmarker [SEQ ID NO:3] und wenigstens
zwei MS2-Hüllprotein-Bindungsmarker [SEQ
ID NO:8].
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In
einer Ausführungsform
umfassen die RNA-Fusionsmoleküle
weiterhin wenigstens drei Isolatoren und in einer weiteren Ausführungsform
wenigstens vier Isolatoren.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung eines in vivo gebildeten
RNA-Protein-Komplexes bereit, umfassend die Expression eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls in einer
eukaryotischen Zelle, Herstellen eines Gesamtzellextrakts, Leiten
des Extrakts über
einen ersten festen Träger,
der Streptavidin-Protein umfasst, Eluieren eines ersten Eluats unter
Zugabe von Biotin, Sammeln des ersten Eluats, Leiten des ersten
Eluats über
einen zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel,
und Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex enthält.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines
Proteins in einem RNA-Protein-Komplex bereit, umfassend das Isolieren
eines in vivo gebildeten RNA-Protein-Komplexes,
umfassend die Expression eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls in einer
eukaryotischen Zelle, Herstellung eines Gesamtzellextrakts, Leiten
des Extrakts über
einen ersten festen Träger,
der Streptavidin-Protein umfasst, Eluieren eines ersten Eluats unter
Zugabe von Biotin, Sammeln des ersten Eluats, Leiten des ersten
Eluats über einen
zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel, und
Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex enthält,
und das Identifizieren des Proteins im RNA-Protein-Komplex.
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Die
Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das mittels Durchführung der
Verfahren zur Isolierung eines in vivo gebildeten RNA-Protein-Komplexes
identifiziert wurde.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Isolierung eines in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexes, umfassend (a) die In-vitro-Expression
eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls, (b)
Erhalten eines Gesamtzellextrakts, (c) Leiten des Gesamtzellextrakts über einen
ersten festen Träger,
der Streptavidin-Protein umfasst, (d) Eluieren eines ersten Eluats
unter Zugabe von Biotin, (e) Sammeln des ersten Eluats, (f) Leiten
des ersten Eluats über
einen zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, (g) Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel,
und (h) Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex
enthält.
In einer Ausführungsform
werden die Schritte (c) bis (e) wiederholt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines
Proteins in einem RNA-Protein-Komplex bereit, umfassend das Isolieren
eines in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexes, umfassend (a) die
In-vitro-Expression eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls, (b)
Erhalten eines Gesamtzellextrakts, (c) Leiten des Gesamtzellextrakts über einen
ersten festen Träger,
der Streptavidin-Protein umfasst, (d) Eluieren eines ersten Eluats
unter Zugabe von Biotin, (e) Sammeln des ersten Eluats, (f) Leiten
des ersten Eluats über
einen zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, (g) Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel,
und (h) Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex enthält,
und das Identifizieren des Proteins im RNA-Protein-Komplex. In einer
Ausführungsform
werden die Schritte (c) bis (e) wiederholt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das mittels Durchführung der
Verfahren zur Isolierung eines in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexes
identifiziert wurde.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Screenen hinsichtlich
einer Verbindung, welche die Bildung eines in vivo gebildeten RNA-Protein-Komplexes
moduliert, umfassend die Expression eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls in einer
eukaryotischen Zelle in Gegenwart einer Testverbindung, Erzeugen
eines Gesamtzellextrakts, Leiten des Extrakts über einen ersten festen Träger, der
Streptavidin-Protein umfasst, Eluieren eines ersten Eluats unter
Zugabe von Biotin, Sammeln des ersten Eluats, Leiten des ersten Eluats über einen
zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel,
Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex enthält,
Ermitteln der vorhandenen Menge an isoliertem RNA-Protein-Komplex und Vergleichen
mit der Menge an vorhandenem isoliertem RNA-Protein-Komplex in Abwesenheit
der Testverbindung.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Screenen hinsichtlich
einer Verbindung, welche die Bildung eines in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexes
moduliert, bereit, umfassend (a) die In-vitro-Expression eines erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküls, (b)
Erhalten eines Gesamtzellextrakts, (c) Leiten des Gesamtzellextrakts über einen
ersten festen Träger,
der Streptavidin-Protein umfasst, (d) Eluieren eines ersten Eluats
unter Zugabe von Biotin, (e) Sammeln des ersten Eluats, (f) Leiten
des ersten Eluats über
einen zweiten festen Träger,
der MS2-Hüllprotein
umfasst, (g) Eluieren eines zweiten Eluats unter Zugabe eines Reagenzes, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Glutathion, RNAse oder einem Denaturierungsmittel,
(h) Sammeln des zweiten Eluats, wobei das zweite Eluat den isolierten
RNA-Protein-Komplex enthält,
(i) Ermitteln der vorhandenen Menge an isoliertem RNA-Protein-Komplex und
(j) Vergleichen mit der Menge an vorhandenem isoliertem RNA-Protein-Komplex
in Abwesenheit der Testverbindung. In einer Ausführungsform werden die Schritte
(c) bis (e) wiederholt.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verbindungen oder Proteine, welche die
RNA-Protein-Komplexe modulieren und welche die durch die erfindungsgemäßen Screening-Verfahren
identifiziert werden.
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Die
Erfindung stellt auch Kits für
den Nachweis eines RNA-Protein-Komplexes
bereit, welche die erfindungsgemäßen RNA-Fusionsmoleküle, die
erfindungsgemäßen isolierten
DNA-Konstrukte und
die erfindungsgemäßen Vektoren
umfassen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Bevorzugte
erfindungsgemäße Ausführungsformen
sind unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Es zeigen
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1. Tandem-RNA-Affinitätsreinigung
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A)
RNAs von Interesse werden an ihrem 5'- oder 3'-Ende mit zwei verschiedenen RNA-Markern markiert.
Die markierten RNAs werden dann entweder in vitro oder in vivo exprimiert
und auf ihre Funktion hin geprüft.
B) Funktionelle Komplexe, die die markierte RNA enthalten, werden
aus Extrakten mit zwei verschiedenen Affinitätsharzen gereinigt, die jeweils
im Stande sind, einen der Marker zu binden. Ein wichtiger Aspekt
der verwendeten Marker, insbesondere des ersten Markers, ist die
Tatsache, dass dieser im Stande sein muss, sich unter Bedingungen,
die den RNA-Protein-Komplex nicht zerstören, von seinem Affinitätsharz dissoziieren zu
lassen. Proteine, die aus dem zweiten Harz eluiert werden, sind
im Allgemeinen rein genug, um mittels SDS-PAGE, Silberfärbung und
Massenspektrometrie identifiziert werden zu können. Gebundene RNA können auch
mittels RTPCR oder Mikroarrayanalyse identifiziert werden. C) Sequenz
der TRAP-Kassette. Sequenzen in Klammern geben jeweils die verschiedenen
funktionellen Motive in der TRAP-Kassette
an.
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2. Reinigung
mit TRAP-Markern unter Verwendung von in vitro transkribierter RNA.
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A)
In-vitro-Reinigung von Proteinen aus Extrakten. Cytoplasmatische
Embryonalextrakte wurden mit TRAP-markierter RNA oder nicht markierter
Kontroll-RNA vermischt und mittels TRAP gereinigt. Eluate wurden
SDS-PAGE und Silberfärbung
unterzogen. Spur 1: keine RNA-Zugabe zum Extrakt. Spur 2: Keine
Köder-RNA
mit TRAP-RNA verschmolzen. Spur 3: Reinigung mittels TRAP-RNA, die
mit einem Lokalisationselement (WLE1) des 3'UTR der Drosophila wingless-Gen-mRNA
verschmolzen ist. Spur 4: Proteinreinigung mittels TRAP-RNA, die
mit einem zweiten Transkript-Lokalisationselement (WLE2) des 3'UTR der wingless-mRNA
verschmolzen ist. Es sei bemerkt, dass die RNAs, die die beiden
Köder (WLE1
und WLE2) enthalten, Proteine binden, die nicht von den Harzen oder
TRAP-RNA alleine gebunden werden. B) In-vitro-Reinigung von Bic-D
aus Embryonalextrakten. Im Anschluss an die vorstehend beschriebene
Reinigung wurden die eluierten Proteine SDS-PAGE unterzogen und
dann für
Westernblots mit Anti-Bic-D-Antiserum auf Membranen überführt. Spur
2–4 sind
wie oben beschrieben. Es sei bemerkt, dass das Bic-D-Signal in Spur
3 und 4 nach der TRAP-Reinigung mit den Lokalisationselementen WLE1
und WLE2 hoch angereichert ist. Bic-D wurde im Rohextrakt (Spur
1) nach sehr viel längerer
Exposition nachgewiesen (nicht dargestellt).
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3. Lokalisation
von TRAP-markierten WLE-RNAs in Drosophila-Embryos.
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Um
sicherzustellen, dass der TRAP-Marker nicht die RNA-Köderfunktion stört, wurden
WLE-Lokalisationselemente, die mit TRAP-RNAs verschmolzen sind,
auf Lokalisationsaktivität
bei Embryos untersucht. A) Fluorescein-gekennzeichnete nicht markierte
WLE2-RNA (rot) bewegt sich nach der Injektion in einen synzytialen
Embryo im Blastoderm-Stadium zu dem apikalen Cytoplasma oberhalb
des Kerns (grün).
B) Ein mutiertes WLE2-Element ohne Lokalisationsaktivität. Gekennzeichnete
RNA bleibt unterhalb des Kerns. C) TRAP-markierte WLE2-RNA bewegt
sich apikal auf dieselbe Weise wie nicht markierte WLE2-RNA, was
anzeigt, dass die Zugabe der TRAP-Sequenz keine offensichtliche
Auswirkung auf die Lokalisationsfunktion hat.
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4. In-vivo-TRAP
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- A) TRAP-Reinigung mit Extrakten, in denen TRAP-markierte
WLE-RNAs in vivo
exprimiert wurden. Spur 1: TRAP-RNA ohne Köder; Spur 2: TRAP-RNA mit einem
hohen Anteil an Wg-3'UTR,
zu dem WLE2 gehört; Spur
3: TRAP-Marker, der mit einer Tandem-Duplikation von WLE2 verschmolzen ist;
Spur 4: TRAP-markiertes
WLE2, Spur 5: Trap-markiertes WLE1:
- B) Westernblot von mit TRAP gereinigten Proteinen mit Anti-Bic-D-Antikörper. Die
auf jede Spur aufgebrachten Proteine wurden mit den vorstehend aufgeführten TRAP-Konstrukten
gereinigt. Fraktionen der Beschickung, des Eluats der Streptavidin-Säule und
des Eluats der MS2-Säule
sind wie nachstehend angegeben.
- C) Quantifizierung der Bic-D-Signale. ECL-erzeugte Bandenintensitäten wurden
mithilfe eines Phosphoimagers ermittelt. Die Werte sind relativ
zum Hintergrund angezeigt.
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5. Tandem-RNA-Affinitätsreinigung.
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- A) TRAP-Kassette einer DNA-Sequenz. Das MS2-
und S1-Motiv (angezeigt) werden von Isolator-Sequenzen und Restriktions stellen
flankiert, welche das Mischen der Motive und die Insertion in verschiedene
Vektoren erleichtern.
- B) Schematische Karte der Kassetten 2XS1 und 2XMS2, die in In-vitro-
(oben) oder In-vivo-Expressionsvektoren (unten) eingeführt wurden.
Die RNAs von Interesse können
an ihrem 5'- oder 3'-Ende mit zwei verschiedenen
RNA-Markern markiert sein. Hier ist die Markierung am 5'-Ende dargestellt.
- C) Überblick über das
TRAP-Reinigungsverfahren. Auf der zweiten Affinitätssäule kann
eine Eluierung mittels RNAse (angezeigt), hoher Salzkonzentration,
Glutathion oder Denaturierungsmitteln erreicht werden. Alternativ
können,
wenn RNA-Komponenten
identifiziert werden, Proteasen verwendet werden.
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Tabelle 1
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Eignung
von Markern für
die TRAP-Marker-Reinigung.
Die für
die Affinitätsreinigung
verwendeten Marker sind in der linken Spalte angeführt. Größen, Affinitätsmatrices,
Eluierungsreagenzen und Effizienz gehen aus den Spalten rechts daneben
hervor. Bindungs- und Elutionseffizienzen wurden unter Verwendung
von 32P-gekennzeichneten in vitro exprimierten
RNA ermittelt und als prozentualer Anteil der aufgebrachten Kennzeichnung
ausgedrückt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf
die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen
dargestellt sind. Die Erfindung kann jedoch auf unterschiedliche
Weise ausgeführt
werden und darf nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie durch
die hier beschriebenen Ausführungsformen
begrenzt ist. Vielmehr werden diese Ausführungsformen zum umfassenden
und vollständigen
Verständnis
der Beschreibung bereitgestellt und erläutern dem Fachmann den vollen
Umfang der Erfindung.
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Der
Begriff "Köder-Sequenz", wie vorliegend
verwendet, bedeutet eine cDNA- oder DNA-Sequenz, die eine Ziel-RNA-Sequenz kodiert.
Beispiele für
geeignete Köder-Sequenzen
umfassen RNAs, wie das HIV-Tat-bindende Tar-Element, das N-Protein von E. coli
bindende Box-B-Element und verschiedene Erkennungselemente an RNA-Spleißstellen.
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Der
Begriff "isolierte
DNA-Sequenz", wie
vorliegend verwendet, umfasst sowohl einsträngige als auch doppelsträngige DNA.
Die Sequenz wird isoliert und/oder gereinigt (d. h. aus der natürlichen
Umgebung) und liegt in im Wesentlichen reiner oder homogener Form
vor, frei oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäuren oder Genen der fraglichen
Spezies oder der ursprünglichen
Spezies, abgesehen von der Promotor- oder Promotorfragment-Sequenz.
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Die
erfindungsgemäße DNA-Sequenz
kann ganz oder teilweise synthetisch sein. Der Begriff "isoliert" umfasst alle diese
Möglichkeiten.
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Der
Begriff "funktionsfähig verknüpft", wie vorliegend
verwendet, bedeutet als Teil desselben Nukleinsäuremoleküls verbunden, geeignet positioniert
und orientiert für
eine vom Promotor zu initiierende Transkription.
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Der
Begriff "Promotor", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, von der aus eine
Transkription von DNA, die stromabwärts (d. h. in 3'-Richtung des Sense-Strangs
der doppelsträngigen DNA)
funktionsfähig
verknüpft
ist, beginnen kann. Der Promotor oder das Promoterfragment können ein
oder mehrere Sequenzmotive oder -elemente umfassen, die eine entwicklungs-
und/oder gewebespezifische regulatorische Expressionskontrolle ermöglichen.
Beispielsweise kann der Promotor oder das Promoterfragment ein neurales
oder darmspezifisches regulatorisches Kontrollelement umfassen.
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Der
Begriff "DNA-Marker" („DNA-Tags"), wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf kurze DNA- oder cDNA-Sequenzen, die
einen Bindungspartner eines Liganden kodieren. Der Ligand kann jedes
Molekül
sein, das spezifisch an den Bindungspartner bindet, wie Antibiotika,
Antikörper
oder bestimmte Proteine. Die erfindungsgemäßen DNA-Marker können in
3'-Position oder
5'-Position zur
Köder-Sequenz
angeordnet sein. DNA-Marker kodieren RNA-Marker.
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Der
Begriff "RNA-Marker"(„RNA-Tags"), wie vorliegend verwendet, bezieht
sich auf kurze RNA-Sequenzen, die als Bindungspartner eines Liganden
dienen. Die RNA-Marker müssen
kurz und voll modular sein und dürfen
nicht einander oder die Ziel-RNA-Sequenz stören. Wenigstens einer der RNA-Marker
muss mit seinem Bindungspartner reversibel in Wechselwirkung treten.
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Der
Begriff "Transkriptionskassette", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäure kodiert,
die transkribiert wird. Vorliegend beschriebene Kassetten enthalten
mehrere Komponenten, wie Marker, Isolatoren und geeignete Restriktionsstellen.
Um die Transkription zu erleichtern, umfasst die Transkriptionskassette üblicherweise
Nukleinsäureelemente,
wie Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminationssequenzen und
Polyadenylationssequenzen.
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Der
Begriff "zellulärer Extrakt", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf Proteine oder isolierte lysierte Zellen,
beispielsweise nukleäre,
cytoplasmatische oder Organellen-Extrakte
oder Fraktionen davon oder eine Mischung aus gereinigten oder rekombinanten
Proteinen oder eine Kombination davon.
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Der
Begriff "S1", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf die Streptavidin-Bindungssequenz in
Form von DNA [SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2] oder RNA [SEQ ID NO:3].
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Der
Begriff "2xS1", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf die Streptavidin-Bindungssequenz in Form
von DNA [SEQ ID NO:17].
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Der
Begriff "MS2", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf die MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz in
Form von DNA [SEQ ID NO:4] oder RNA [SEQ ID NO:5].
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Der
Begriff "2xMS2", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf zwei MS2-Hüllprotein-Bindungssequenzen
in Form von DNA [SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO 18] oder
RNA [SEQ ID NO:8].
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Weitere
Einzelheiten über
die Sequenzen und ihre Zusammensetzung:
SEQ ID NO:1 – S1-DNA-Sequenz
mit Isolatoren mit BglII-Enden
SEQ ID NO:2 – S1-DNA-Sequenz
gaccgaccagaatcatgcaagtgcgtaagatagtcgcgggccggg
BglII-Klonierungsstelle
+ Spacer = 5'ATCGATAAAAA
und 3'AAAAAATCGAT
SEQ
ID NO:3 – S1-RNA-Sequenz
SEQ
ID NO:4 – MS2-DNA-Sequenz
SEQ
ID NO:5 – MS2-RNA-Sequenz
SEQ
ID NO:6 – 2x
MS2-DNA-Sequenz mit Isolatoren mit SacII-Enden
SEQ ID NO:7 – 2X MS2-DNA-Sequenz
SEQ
ID NO:8 – 2X
MS2-RNA-Sequenz
SEQ ID NO:9 – Streptotag (Streptomycin-Bindung)-Marker-DNA-Sequenz mit Isolatoren
und KpnI
SEQ ID NO:10 – Streptotag
(Streptomycin-Bindung)-Marker-DNA-Sequenz
SEQ ID NO:11 – Streptotag-RNA-Sequenz
SEQ
ID NO:12 – Nut-DNA-Sequenz
(N-Bindung) mit Isolatoren und KpnI-Enden
SEQ ID NO:13 – Nut-DNA-Sequenz
(N-Bindung)
SEQ ID NO:14 – Nut-RNA-Sequenz
(N-Bindung). Das ist die von SEQ NO 12 gebildete RNA.
SEQ ID
NO:15 – D8-DNA-Sequenz
(Sephadex-Bindung)
SEQ ID NO:16 – D8-RNA-Sequenz
SEQ ID
NO:17 – TRAPS1-DNA – S1-Marker
mit BglII-, ClaI-Restriktionsstellen
und Spacern.
SEQ ID NO:18 – TRAPMS2 – MS2-Marker
mit ScaI-Restriktionsstellen und Spacern.
SEQ ID NO:19 – TAR-DNA-Sequenz
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Die
in der Beschreibung der Erfindung verwendete Terminologie dient
nur dazu, bestimmte Ausführungsformen
zu beschreiben und ist nicht als eine Begrenzung der Erfindung zu
betrachten.
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Wie
in der Beschreibung der Erfindung und den anhängenden Ansprüchen verwendet,
umfassen die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" auch die Pluralformen,
sofern aus dem Kontext nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht.
In Ermanglung anderer Definitionen haben alle hier benutzten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise
von einem Fachmann mit normalem Wissen auf dem Gebiet der Erfindung
vorausgesetzt werden. Alle vorliegend genannten Veröffentlichungen,
Patentanmeldungen, Patente und anderen zitierten Schriften sind
vorliegend vollständig
durch Bezugnahme eingeschlossen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung spezifischer
in vivo gebildeter RNA-Protein-Komplexe.
Sie kann jedoch auch zur Isolierung und Bestätigung von in vitro gebildeten
Komplexen verwendet werden.
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Die
Komplexbildung und Reinigung in vivo wird durch die Expression von
markierten Versionen der RNA von Interesse in vivo erreicht, wonach
der Marker zur Isolierung der assoziierten funktionellen RNP-Komplexe
verwendet wird. Marker in Form von kurzen RNA-Sequenzen, die mit
den spezifischen Proteinen, Antibiotika oder synthetischen Liganden
in Wechselwirkung treten, können
problemlos 5' oder
3' der RNA von Interesse
eingeführt
werden (siehe 1A). Zwar existiert eine Anzahl
dieser potenziellen RNA-Marker bereits, die Reinigung mit diesen
Markern führt
aber bestenfalls zu einer tausendfachen Reinigung der assoziierten RNAs.
Durch die Verwendung von zwei RNA-Markern bietet das erfindungsgemäße Verfahren
mit TRAP-Markern eine ungefähr
millionenfache Reinigung der assoziierten RNAs, was für die Identifizierung
der meisten Zellproteine ausreichend ist. Die erfindungsgemäßen Marker
müssen
relativ kurz und voll modular sein und dürfen nicht einander oder die
RNA von Interesse stören.
Außerdem
muss wenigstens einer der Marker mit seinem Liganden reversibel
in Wechselwirkung treten, sodass RNP-Komplexe intakt aus der ersten Ligandenmatrix
eluiert und an die zweite Matrix gebunden werden können (siehe 1B).
Bei der In-vivo-Expression lagern sich TRAP-markierte RNA zu funktionellen
Komplexen zusammen, die problemlos bis zur Homogenität gereinigt
werden.
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Nukleinsäuremoleküle
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Funktionell äquivalentes
Nukleinsäuremolekül oder Polypeptidsequenz
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Der
Begriff "isolierte
DNA-Sequenz" bezieht
sich auf eine DNA-Sequenz, deren Struktur mit keiner natürlich vorkommenden
DNA-Sequenz oder keinem Fragment einer natürlich vorkommenden DNA-Sequenz, das
sich über
mehr als drei getrennte Gene erstreckt, identisch ist. Somit umfasst
der Begriff beispielsweise (a) DNA, welche die Sequenz eines Teils
eines natürlich
vorkommenden genomischen DNA-Moleküls hat; (b) eine DNA-Sequenz,
die derart in einen Vektor oder die genomische DNA eines Prokaryoten
bzw. Eukaryoten eingebaut ist, dass das gebildete Molekül nicht
mit einem natürlich
vorkommenden Vektor oder natürlich
vorkommender genomischer DNA identisch ist; (c) ein separates Molekül, wie cDNA,
ein genomisches Fragment, ein Fragment, das durch reverse Transkription
von PolyA-RNA, die durch PCR amplifiziert werden kann, erzeugt wurde,
oder ein Restriktionsfragment, und (d) eine rekombinante DNA-Sequenz,
die Teil eines Hybridgens ist, d. h. eines Gens, das ein Fusionsprotein
kodiert. Insbesondere ausgeschlossen von dieser Definition sind
Nukleinsäuren,
die in Mischungen aus (i) DNA-Molekülen, (ii) transfizierten Zellen
und (iii) Zellklonen vorhanden sind, beispielsweise wie sie in einer
DNA-Bibliothek, z.B. einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek,
auftreten.
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Modifikationen
der DNA-Sequenz, die zur Bildung einer chemisch äquivalenten oder chemisch ähnlichen
Aminosäuresequenz
führen,
fallen unter den Schutzumfang der Erfindung.
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Zu
Modifikationen gehören
Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden oder die Veränderung der
relativen Positionen oder Reihenfolge von Nukleotiden.
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Sequenzidentität
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Die
Erfindung umfasst modifizierte Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenzidentität von wenigstens ungefähr: > 95% mit den DNA-Sequenzen
aus SEQ ID NO:1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO
7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID
NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 (oder einer Teilsequenz
davon oder deren Komplementärsequenz).
Vorzugsweise ungefähr
1, 2, 3, 4, 5, 6 bis 10, 10 bis 25, 26 bis 50 oder 51 bis 100 oder
101 bis 250 Nukleotide sind modifiziert. Die Sequenzidentität wird am
meisten bevorzugt anhand des Algorithmus der erweiterten Suche des
Programms BLAST Version 2.1 (Parameter wie oben) beurteilt. Blast
setzt sich aus einer Reihe von Programmen zusammen, die online unter
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST erhältlich sind.
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Verweise zu BLAST-Suchen
finden sich in:
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- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J.
(1990) "Basic local
alignment search tool." J. Mol.
Biol. 215:403-410.
- Gish, W. & States,
D. J. (1993) "Identification
of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3:
266–272.
- Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network
BLAST server" Meth.
Enzymol. 266: 131–141.
- Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang,
Z., Miller, W. & Lipman,
D. J. (1997) "Gapped BLAST
and PSI BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res.
25: 3389–3402.
- Zhang, J., & Madden,
T. L. (1997) "PowerBLAST:
A new network BLAST application for interactive or automated sequence
analysis and annotation." Genome
Res. 7: 649–656.
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Zur
Ermittlung der Sequenzidentität
stehen auch andere Programme zur Verfügung, wie das Programm Clustal
W (vorzugsweise unter Verwendung der Vorgabeparameter; Thompson,
JD et al., Nucleic Acid Res. 22: 4673–4680).
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DNA-Sequenzen
mit funktioneller Äquivalenz
zu S1 SEQ ID NO:2 oder MS2 SEQ ID NO:4 können, wie vorstehend beschrieben,
in einer Vielzahl von Formen auftreten.
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Die
erfindungsgemäßen Sequenzen
können
mithilfe zahlreicher Techniken hergestellt werden. Die Erfindung
ist nicht auf eine bestimmte Herstellungsweise beschränkt. Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise
durch cDNA-Klonierung, genomische Klonierung, cDNA-Synthese, Polymerasekettenreaktion
(PCR) oder eine Kombination dieser Ansätze hergestellt werden (Current
Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausbel et al., 1989). Sequenzen
können
unter Verwendung bekannter Verfahren und Ausrüstung, wie Syntheseautomaten,
synthetisiert werden.
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Hybridisierung
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Andere
funktionell äquivalente
Formen der Moleküle
S1 SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 und MS2-DNA SEQ ID NO:4 können unter
Verwendung herkömmlicher
DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungstechniken isoliert werden.
Diese Nukleinsäuremoleküle und die
Sequenzen S1 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO 17 und MS2 SEQ
ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 18 können ohne erhebliche Beeinträchtigung
ihrer Aktivität
modifiziert werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuremoleküle, die mit einer oder mehreren
der bereitgestellten DNA-Sequenzen
S1 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17 und MS2 SEQ ID NO:4, SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:18 (oder einer Teilsequenz davon oder deren Komplementärsequenz)
hybridisieren. Derartige Nukleinsäuremoleküle hybridisieren vorzugsweise
mit allem oder einem Teil von S1 SEQ ID SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,
SEQ ID NO:17 oder MS2 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:18 oder
deren Komplementen unter niedrig, mäßig (mittleren) oder hoch stringenten
Bedingungen, wie hier definiert (vgl. Sambrook et al. (jüngste Ausgabe),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausubel et al. (Hrsg.), 1995,
Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY)). Der
Abschnitt der hybridisierenden Nukleinsäuren weist üblicherweise eine Länge von
wenigstens 15 (z. B. 20, 25, 30 oder 50) Nukleotiden auf. Der hybridisierende
Abschnitt der hybridisierenden Nukleinsäure ist zu wenigstens 80 %,
z. B. wenigstens 95 % oder wenigstens 98%, mit der Sequenz oder
einem Teil oder der Gesamtheit einer Nukleinsäure identisch, die für S1 oder
S2 oder deren Komplement kodiert. Hybridisierende Nukleinsäuren von
der hier beschriebenen Art können
beispielsweise als Klonierungssonde, Primer (z. B. PCR-Primer) oder
Diagnosesonde verwendet werden. Die Hybridisierung der Oligonukleotidsonde
mit einer Nukleinsäureprobe
wird üblicherweise
unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Nukleinsäuredoppelstrang-
oder Hybridstabilität
wird als Schmelztemperatur oder Tm ausgedrückt, wobei es sich um die Temperatur
handelt, bei der eine Sonde von der Ziel-DNA dissoziiert. Diese Schmelztemperatur
wird zur Festlegung der erforderlichen Stringenzbedingungen verwendet.
Wenn Sequenzen identifiziert werden sollen, die mit der Sonde verwandt
und im Wesentlichen identisch, anstatt identisch sind, ist es nützlich,
zuerst die niedrigste Temperatur zu bestimmen, bei der nur eine
homologe Hybridisierung bei einer bestimmten Salzkonzentration (z.
B. SSC oder SSPE) auftritt. Dann wird, unter der Annahme, dass 1
% Fehlpaarungen zu einer Tm-Verringerung von 1 °C führt, die Temperatur des letzten
Waschschrittes während
der Hybridisierungsreaktion entsprechend gesenkt (wenn beispielsweise
Sequenzen mit einer Identität
mit der Sonde von mehr als 95% erwünscht sind, wird die Temperatur
des letzten Waschschrittes um 5 °C
gesenkt). In der Praxis kann die Veränderung der Tm zwischen 0,5 °C und 1,5 °C pro 1 %
Fehlpaarung liegen. Niedrig stringente Bedingungen bedeuten eine
Hybridisierung bei etwa: 1XSSC, 0,1% SDS bei 50 °C. Hoch stringente Bedingungen
sind: 0,1XSSC, 0,1% SDS bei 65 °C.
Mäßige Stringenz
ist etwa 1XSSC, 0,1% SDS bei 60 °C.
Die Parameter für Salzkonzentration
und Temperatur können
variiert werden, um ein optimales Maß an Identität zwischen
Sonde und Zielnukleinsäure
zu erreichen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuremoleküle aus jeder Quelle, ob modifiziert
oder nicht, die mit genomischer DNA, cDNA oder synthetischen kodierenden
DNA-Molekülen hybridisieren.
Ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäuremolekül gilt als funktionell äquivalent
zu einem erfindungsgemäßen S1-Nukleinsäuremolekül SEQ ID
NO:1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 17, wenn die von dem Nukleinsäuremolekül kodierte
Sequenz auf spezifische Weise von Streptavidin erkannt wird und
mit Biotin eluierbar ist. Ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäuremolekül gilt als
funktionell äquivalent
zu einem erfindungsgemäßen MS2-Nukleinsäuremolekül SEQ ID
4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 18, wenn die von dem Nukleinsäuremolekül kodierte
Sequenz auf spezifische Weise vom MS2-Hüllprotein erkannt wird.
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Vektoren
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen Expressionsvektor bereit, der
eine Transkriptionskassette umfasst. Die Transkriptionskassette
kann auf auf dem Fachgebiet bekannte Weise in eine Vielzahl von
Vektoren kloniert werden. Ein solcher Vektor kann eine Restriktionsstelle
passender Lage oder andere Möglichkeiten
zur Insertion einer Transkriptionskassette umfassen. Der Vektor
kann auch einen selektierbaren Marker enthalten. Zur Verwendung
in einem Assay oder Experiment können
im Handel erhältliche
Vektoren, wie ein CMV-Casper-Promotor-Vektor, verwendet werden.
Zur Verwendung bei der Gentherapie können Vektoren, wie das Adenovirus,
zum Einsatz kommen. Zellkulturen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
transfiziert oder transformiert wurden, sind als Forschungsinstrumente
insbesondere bei der Untersuchung von RNA-Protein-Komplexen nützlich.
Für den
Fachmann ist es offensichtlich, dass eine große Vielfalt geeigneter Vektoren existiert.
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Wirtszellen
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Wirtszelle
bereit, die eine erfindungsgemäße Transkriptionskassette
enthält.
Beispiele für
besonders wünschenswerte
Wirtszellen umfassen Hefezellen, ES-, P19-, COS-, S2- und SF9-Zellen.
Zu auf dem Fachgebiet bekannten Methoden für die Transformation gehören, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Elektroporation, Transfektion mit Rubidiumchlorid, Calciumchlorid,
Calciumphosphat oder Chloroquin, virale Infektion, Phagentransduktion,
Mikroinjektion und die Verwendung von kationischen Lipid- und Lipid/Aminosäurekomplexen
oder von Liposomen, oder eine große Vielzahl anderer im Handel
erhältlicher
und einfach synthetisierter Transfektionshilfsmittel ist beim Transfer
der erfindungsgemäßen Vektoren
in die Wirtszellen nützlich.
Wirtszellen werden in herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert. Die Medien können
in geeigneter Weise für
die Induzierung von Promotoren, Amplifizierung von interessanten
Nukleinsäuresequenzen
oder für
die Auswahl von Transformanten modifiziert werden. Die Kultivierungsbedingungen,
wie Temperatur, Zusammensetzung und pH, sind offensichtlich. Transformanten
können
nach der Transformation auf der Grundlage eines selektierbaren Phänotyps identifiziert
werden.
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RNA-Fusionsmoleküle
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Die
vorliegende Erfindung stellt RNA-Fusionsmoleküle bereit, die RNA-Marker,
Isolatorelemente und Ziel-RNA-Sequenzen umfassen. Das RNA-Fusionsmolekül enthält wenigstens
zwei verschiedene RNA-Marker. Zu geeigneten RNA-Markern gehören, ohne
darauf beschränkt
zu sein, eine Streptavidin-Bindungssequenz,
eine MS2-Hüllprotein-Bindungssequenz,
eine Streptomycin-Bindungssequenz (Streptotag), eine Sephadex-Bindungssequenz,
eine N-Protein-Bindungssequenz, eine REV-Bindungssequenz, eine TAT-Bindungssequenz
und eine R17-Hüllprotein-Bindungssequenz.
In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
ist es nützlich,
mehr als eine Kopie des RNA-Markers zu haben.
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So
kann es beispielsweise wünschenswert
sein, 2xMS2-Hüllprotein-Bindungssequenzen
und 2XS1-Bindungssequenzen zu haben (siehe 5). In einer
anderen Ausführungsform
kann es wünschenswert
sein, 3X bis 6X MS2-Hüllprotein-Bindungssequenzen
und 3X bis 6X S1-Protein-Bindungssequenzen zu haben. Im Allgemeinen
erhöht
eine steigende Anzahl an RNA-Markern
im RNA-Fusionsmolekül
aufgrund eines Anstiegs der Affinität des RNA-Protein-Komplexes
für das
Affinitätsharz
den Reinigungsgrad des gebildeten RNA-Protein-Komplexes.
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Eine
Ziel-RNA-Sequenz kann eine Oligoribonukleotidsequenz oder eine Ribonukleinsäuresequenz sein.
Im Allgemeinen ist die Ziel-RNA-Sequenz bei der erfindungsgemäßen Verwendung
RNA, einschließlich ribosomaler
RNA, von einem Gen kodierter RNA, Messenger-RNA, UTRs, Ribozym-RNA,
katalytischer RNA, kurzer nukleärer
RNA, kurzer nukleolärer
RNA usw., aus einem Mikroorganismus, oder eine RNA, die von einer
mit einem Virus infizierten Zelle exprimiert wird, oder RNA von
einer Wirtszelle oder RNA, die von einer genomischen Sequenz kodiert
wird, oder RNA, die von einer chemisch synthetisierten DNA kodiert
wird, oder Zufalls-RNA, die von zufällig isolierter DNA kodiert
wird.
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An
jeder Seite der RNA-Marker können
Isolatorelemente angeordnet sein, die zur Sicherstellung der richtigen
Faltung der RNA-Marker und zur Unterdrückung von Wechselwirkungen
zwischen den Markern und der Ziel-RNA-Sequenz dienen. Beispiele
für geeignete
Isolatorelemente umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Folgen von 4–5 identischen
Nukleotiden (z. B. Adenosine), die mit gepaarten Restriktionsstellen
gekoppelt sind, die nicht mit dem Marker oder den Köder-Sequenzen
in Wechselwirkung treten. Die 5'-
und 3'-Restriktionsstellen
sollten identisch sein, da diese Sequenzen dann unter Ausbildung
eines Stamms, der die "Isolator"-Polynukleotidsequenzen
in den Zustand "nicht gepaart" zwingt, hybridisieren
können
und dadurch den internen Marker oder die Köderstrukturen vom Rest der
RNA-Sequenzen, die
von einem bestimmten Vektor produziert werden, isolieren. Isolatorelemente
können
auch als Spacer bezeichnet werden.
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Reinigungsverfahren
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung eines in vivo oder
in vitro gebildeten RNA-Protein-Komplexes bereit. Der isolierte
Proteinteil des RNA-Protein-Komplexes kann dann mittels verschiedener Verfahren
und Techniken, einschließlich,
aber nicht begrenzt auf, SDS-PAGE, Silberfärbung, Westernblots und Massenspektrometrie,
identifiziert werden. Beispiele für geeignete feste Träger zur
Verwendung für
die verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
umfassen Affinitätssäulen, die
gebundenes Streptavidin oder gebundenes MS2 umfassen, wobei das
MS2 an Agarose- oder Sepharose-Perlen gebunden sein kann.
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MS2-Affinitätssäulen können auch
durch Vernetzen an Harze, wie Affigel-Perlen, oder Binden als Fusionsprotein
an ein geeignetes Harz (z. B. GST-MS2 an Glutathion-Perlen) hergestellt
werden.
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Screening-Verfahren
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen einer
Verbindung, welche die Bildung eines in vivo oder in vitro gebildeten
RNA-Protein-Komplexes moduliert oder reguliert. Andere Verfahren
sowie Abwandlungen der vorstehenden Verfahren gehen aus der Beschreibung
der Erfindung hervor. Die Testverbindung kann beispielsweise entweder
fixiert oder erhöht
sein, eine Mehrzahl an Verbindungen oder Proteinen können gleichzeitig
geprüft
werden. "Modulation", "moduliert" und "modulierend" können sich
auf eine erhöhte Bildung
des RNA-Protein-Komplexes, eine abnehmende Bildung des RNA-Protein-Komplexes,
eine Veränderung
des Typs oder der Art des RNA-Protein-Komplexes oder eine vollständige Hemmung
der Bildung des RNA-Protein-Komplexes
beziehen. Geeignete verwendbare Verbindungen umfassen, ohne darauf
beschränkt zu
sein, Proteine, Nukleinsäuren,
kleine Moleküle,
Hormone, Antikörper,
Peptide, Antigene, Cytokine, Wachstumsfaktoren, pharmazeutische
Mittel, einschließlich
Chemotherapeutika, krebserregende Stoffe oder andere Zellen (d.
h. Zell-Zell-Kontakte). Screening-Assays können auch zum Kartieren von
Bindungsstellen auf RNA oder Protein verwendet werden.
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Die
Markersequenzen, die RNA-Marker kodieren, können beispielsweise mutiert
(Deletionen, Substitutionen, Additionen) und dann zur Bestimmung
der Folgen der Mutationen in Screening-Assays verwendet werden.
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Kits
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Die
Erfindung umfasst Kits für
den Nachweis von RNA-Protein-Komplexen,
die wenigstens ein erfindungsgemäßes isoliertes
DNA-Konstrukt oder wenigstens einen erfindungsgemäßen Vektor
umfassen.
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Tandem-RNA-Reinigung
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Es
liegen eine Anzahl an RNA-Motiven vor, die als RNA-Affinitätsmarker
geeignet sind. Wir testeten zuerst fünf davon für die potenzielle Verwendung
in unserem System für
doppelte Markierung. Dazu gehören "Streptotag", ein Streptomycin-Bindungsaptamer
(Bachler et al., 1999), "S1", ein Streptavidin-Bindungsaptamer
(Srisawat und Engelke, 2001), "D1", ein Sephadex-Bindungsaptamer
(Srisawat et al., 2001), die RNA, die das MS2-Phagen-Hüllprotein
bindet (Jurica et al., 2002), "TAR", eine Tat-Proteinbindungssequenz
(Puglisi et al., 1995) und die boxB-RNA des Lambda-Phagen (Lazinski
et al., 1989). Tabelle 1 zeigt die relativen Bindungs- und Elutionseffizienzen
jedes 32P-gekennzeichneten Markers und dessen
Liganden.
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Es
zeigte sich, dass zwei der fünf
Marker, die Marker für
Streptavidin (S1, SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2) und MS2-Hüllprotein (MS2), unter den
gewünschten
Reinigungsbedingungen eine effiziente Bindung und Elution ergaben.
Wichtig ist auch, dass bei keinem der Marker Kreuzreaktionen mit
einem der anderen getesteten Liganden auftraten.
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Mehr
als 95 % der S1-Marker SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 banden an Streptavidin-Agarose-Perlen,
und 95% davon konnten durch die Zugabe von Biotin zurückgewonnen
werden. Ungefähr
75% des eingetragenen MS2-Markers banden an GST-Hüllprotein-Perlen und ungefähr 70% des
eingetragenen Markers konnten mit Glutathion eluiert werden.
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Tabelle
1 – RNA-Aptamer-Marker,
getestet auf Verwendung in TRAP-Vektoren.
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Anschließend wurde
die Fähigkeit
von Streptavidin- und MS2-Hüllprotein-Markern
untersucht, gemeinsam und in Gegenwart eines RNA-Zielmoleküls wirksam
zu sein. Es wurden Kassetten mit einem T7-Promotor, den beiden RNA-Markern,
alternativen Ziel-RNA-Insertionsstellen und einem Poly-A-Ende hergestellt (1B).
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An
beiden Seiten jedes Markers wurden zur Sicherstellung der richtigen
Faltung der RNA-Marker und zur Unterdrückung von Wechselwirkungen
zwischen den Markern und der eingesetzten Ziel-RNA Isolatorelemente
aus 8–10
Adenosinen flankiert von identischen Restriktionsstellen angeordnet. 32P-gekennzeichnete RNA wurden zuerst auf
Streptavidin- und GST-Hüllprotein-Säulen bezüglich Retention
und Elution getestet. Beide Marker zeigten mehr oder weniger dieselbe
Effizienz wie bei der Einzelanwendung. Ein Konstrukt, das den 2XS1-Marker
SEQ ID NO:17 und 2XMS2-Marker SEQ ID NO:18 enthält, ist bevorzugt.
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Reinigung mit TRAP-Markern
unter Verwendung von in vitro transkribierter RNA
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Danach
wurden die Konstrukte hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, spezifische
RNA-Bindungsproteine aus einer komplexen Proteinmischung zu reinigen.
Für diesen
Zweck wurden zwei Elemente mit einer Länge von ungefähr 100 Nukleotiden
der Drosophila wingless-Gen-mRNA (WLE1 und WLE2) gewählt. Diese
Elemente sind für
die asymmetrische Lokalisation der wingless-Transkripte zu apikalem
Cytoplasma erforderlich (Simmonds et al., 2001). Die beiden Elemente
weisen keine Ähnlichkeiten
hinsichtlich der Sequenz oder der prognostizierten Sekundärstruktur
auf und zeigen deutliche Unterschiede bezüglich ihrer Fähigkeit,
Transkripte zu lokalisieren. Andererseits scheinen beide die Lokalisation über den
dynein-abhängigen
Transport durch Mikrotubuli zu vermitteln (Wilkie und Davis, 2001).
Somit treten sie wahrscheinlich in Wechselwirkung mit einmaligen,
aber überlappenden
Protein-Subsets.
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Die
markierten RNA wurden in vitro exprimiert und die kalte RNA vor
der Reinigung in den beiden Säulen
30 Minuten lang mit Drosophila-Embryonalextrakten vermischt. 2A zeigt,
dass sich jedes der markierten Lokalisationselemente tatsächlich mit
unterschiedlichen Protein-Subsets, die nicht ausschließlich von
Perlen oder Markern gebunden waren, assoziierte. Neun (9) von neunzehn
(19) Proteinen, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden,
sind bekannte oder prognostizierte RNA-Bindungsproteine (Simmonds
und Krause, in Vorbereitung). 2B zeigt,
dass eines dieser Proteine Bic-D
ist, ein Protein, von dem zuvor angenommen wurde, es sei für den apikalen
mRNA-Transport bei Drosophila-Embryos im Blastoderm-Stadium erforderlich
(Bullock und Ish-Horowicz, 2001).
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Lokalisation
von TRAP-markierten WLE RNA in Drosophila-Embryos Mit dem letzten Versuch sollte gesichert
werden, dass die in vivo auf den markierten RNA gebildeten Komplexe
sowohl aktiv als auch einfach zu reinigen sind. Um dies zu bestätigen, wurden
markierte WLE-Konstrukte zunächst
mit Fluorescein gekennzeichnet und dann in synzytiale Embryos im
Blastoderm-Stadium
injiziert. RNA mit einem apikalen Lokalisationsmotiv bewegen sich
von der Injektionsstelle nach oben zwischen die synzytialen Kerne
hin zur apikalen Oberfläche
(Bullock und Ish-Horowicz, 2001). 3A zeigt
nicht markierte WLE2-RNA nach der Lokalisation an der apikalen Oberfläche. 3C zeigt,
dass TRAP-markierte WLE2-RNA auf nicht zu unterscheidende Weise
an der apikalen Oberfläche
lokalisiert wird. Somit scheinen die Marker die Funktion der Lokalisationselemente
nicht zu beeinträchtigen.
TRAP-markierte Lokalisationselemente
von wingless, die in transgenen Embryos exprimiert wurden, lokalisierten
ebenfalls apikal (Daten nicht dargestellt). Von diesen transgenen
Fliegenzuchtlinien wurden Extrakte gewonnen und für die Reinigung
von WLE-assoziierten Proteinen verwendet.
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Reinigung mit TRAP-Markern
unter Verwendung von in vivo exprimierter RNA
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4 zeigt,
dass jedes der markierten WLE-Konstrukte, wie in vitro, an ein anderes
Protein-Subset bindet. Die Identitäten einiger dieser Proteine
wurde mittels Massenspektrometrie bestimmt.
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Wiederum
umfasste eines der gereinigten Proteine Bic-D.
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Es
sei bemerkt, dass die Reversibilität der beiden Säulen die
fakultative Verwendung eines zweiten Reinigungsdurchgangs zum Nachweis
von Proteinen in sehr geringen Mengen und Proteinen, die den Köder nicht
stöchiometrisch
oder in allen Zelltypen binden, zulässt, obwohl die hier identifizierten
Proteine problemlos unter Verwendung einer geringen Extraktmenge
und Silberfärbung
nachgewiesen werden konnten. Der S1-Marker SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2
eignet sich besonders gut für
wiederholte Reinigungsdurchgänge.
Damit wird bei geringem Materialverlust ein hoher Reinigungsgrad
erzielt und das für
die Eluierung verwendete Biotin lässt sich leicht entfernen.
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Die
Entfernung von Biotin wird erreicht, indem das Eluat durch eine
Avidin-Säule
geleitet wird (der S1-Marker SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 bindet Avidin
nicht). Der Durchfluss wird dann an die zweite Streptavidin-Säule gebunden
und wie zuvor mit Biotin eluiert. Dieser Ansatz kann auch für die vorhergehende
Entfernung von Streptavidin-Bindungsproteinen verwendet werden,
sollten diese in größeren Mengen
in Extrakten vorhanden sein.
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Dieser
Ansatz ist eindeutig für
jede Zell- oder Gewebeart anwendbar. Die TRAP-Kassette wird einfach in
einen geeigneten Vektor überführt. Die
In-vivo-Anwendung dieses Verfahrens ist zwar die leistungsfähigste Version
dieses Ansatzes, In-vitro-Assays
sind jedoch offensichtlich ebenfalls anwendbar. Beispielsweise kann die
Bedeutung von bestimmten Nukleotiden und strukturellen Aspekten
bekannter und neu entdeckter Wechselwirkungen schnell unter Verwendung
von Mutagenese mit in vitro exprimierten RNAs untersucht und dann in
vivo bestätigt
werden. Dieser Ansatz lässt
sich auch für
Analysen mit hohem Durchsatz nutzen. Dies gilt insbesondere für die In-vitro-Arbeit
mit Extrakten und mit transfizierten oder mit einem Virus infizierten
Zellen.
-
Mit
etwas mehr Anstrengung kann der Ansatz auch auf transformierte Zellen
und transgene Gewebe ausgedehnt werden. Beispielsweise könnten TRAP-Marker,
wie dies bereits für
Hefeproteine geschah, in jedes Hefegen eingesetzt werden und durch
homologe Rekombination das endogene Gen ersetzen. Dieser Ansatz ist
jedoch wahrscheinlich bei kurzen RNAs und funktionell charakterisierten
RNA-Motiven am nützlichsten.
Es besteht außerdem
die Möglichkeit,
andere RNAs, die in den TRAP-gereinigten Komplexen gebunden sind,
zu identifizieren. Dies kann entweder mittels RTPCR oder umfassender
durch Kennzeichnung der RNA und Hybridisierung an Mikroarrays erreicht
werden.
-
In
Anbetracht der schnell wachsenden Anzahl wichtiger Prozesse, die
von RNAs und den sie bindenden Proteinen gesteuert werden, sollte
sich TRAP-Tagging als ein zentrales Instrument bei der Aufklärung dieser
Funktionen auf Genomebene erweisen. Nach der umfassenden Charakterisierung
können
funktionelle RNA-Elemente als pharmakologische Ziele (RNAi usw.)
dienen. Virale RNA, wie HIV, Hepatitis B, und die Proteine, die
diese binden, sind besonders geeignete Ziele. Beispiele für derartige
Anwendungen umfassen die Behandlung von Virusinfektionen, die Kontrolle
der Zellproliferation und die Stimulierung neuronaler Regeneration.
-
Vektorkonstruktion
-
Erste
TRAP-Vektoren wurden unter Verwendung eines auf Kassetten basierenden
Ansatzes konstruiert, um maximale Vielseitigkeit zu ermöglichen.
Kassetten wurden unter Verwendung von gepaarten Oligonukleotiden
hergestellt, die in pSP72 (Promega) kloniert waren.
-
Zur
Erleichterung der weiteren Klonierung in andere Expressionsvektoren
wurde das Plasmid unter Verwendung der gepaarten Oligonukleotide
5'SpeI TCGAGACTAGT
und 3'SpeI AGCTTGATCAG
durch eine zusätzliche
SpeI-Restriktionsstelle 3' zur
XhoI-Stelle des Polylinkers modifiziert.
-
Das
Streptavidin-Aptamer wurde durch Hybridisierung der Oligonukleotide
S1BglII5'
(ATCTAAAAGACCGACCAGAATCATGCAAGTGCGTAAGATAGTCGCGGGCCGGGAAAAAA)
und
S1BglII3'
(ATCTTTTTTCCCGGCCCGCGACTATCTTACGCACTTGCATGATTCTGGTCGGTCTTTTTA)
und
Insertion in die BglII-Stelle von pSP72 eingeführt (vgl. 5).
-
Das
MS2-Aptamer wurde durch Hybridisierung der Oligonukleotide MS2 5'
(CAAACGACTCTAGAAAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGG)
und
MS2 3'
(TCGACCTGCAGACATGGGTGATCCTCATGTTTTCTAGAGTCGTTTTTGAGC)
und
der Oligonukleotide MS2 5'
(TCGACTCTAGAAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGTCAAAAAGAGCT)
und
MS2 3'
(CTTTTTGACCTGCAGACATGGGTGATCCTCATGTTTTCTAGAG),
hergestellt,
indem die beiden Fragmente einzeln in pBluescript SKI (Stratagene)
subkloniert wurden, wonach die ausgeschnittenen Fragmente mit dem
Vektor pSP72, der mit SacII linearisiert worden war, ligiert wurden. Die
Klone wurden anschließen
sequenziert, um diejenigen mit MS2-Apatmer-Sequenzen in korrekter Orientierung
zu identifizieren. Pri mer, die für
die Herstellung anderer getesteter Marker verwendet wurden, umfassen 5'Streptotag KpnI
(CAAAAGGATCGCATTTGGACTTCTGCCCAGGGTGGCACCACGTGCGGATCCAAAAGGTAC),
3' Streptotag KpnI
(CTTTTGGATCCGACCGTGGTGCCACCCTGGGCAGAAGTCCAAATGCGATCCTTTTGGTAC),
N-5'KpnI
(GATCCTTTTCGGGTGAAAAAGGGCTTTTG)
und
N3'KpnI
(GATCCAAAAGCCCTTTTTCAGGGCAAAG).
-
Mittels
solcher Manipulationen hergestellte Plasmide werden als pTRAPS1,
pTRAPMS2, pTRAPS1MS2, pTRAPN bzw. pTRAPS1N bezeichnet. Die 3'UTR-Bereiche von
wingless, die als WLE1 (wg-3'UTR
1–181),
WLE2 (wg-3'UTR 659–773), 2x
WLE2 (Tandem-Duplikation
von WLE2), WLE2-mutiert (WLE2 mit den Resten 678–689 mutiert zur Sequenz AGATCT)
und wg-3'UTR 360–1107 bezeichnet
werden, wurden durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert
und unter Bildung der Vektoren pTRAPS1MS2+WLE1, pTRAPS1MS2+WLE2,
pTRAPS1MS2+2xWLE2, pTRAPS1MS2+WLE2 (mutiert) bzw. pTRAPS1MS2+wg
3'UTR 360–1107 in
die BamHI-Stelle des Vektors pTRAPS1MS2 kloniert. Für Konstrukte, die
in transgenen Fliegen exprimiert werden konnten, wurden HpaI-SpeI-Fragmente
von pTRAPS1MS2+WLE1, pTRAPS1MS2+WLE2, pTRAPS1MS2+wg-3'UTR 360–1107, pTRAPS1MS2+2xWLE2,
pTRAPS1MS2+WLE2 (mutiert) oder pTRAPS1MS2 (kein Insert) in BglII-StuI-gespaltenen
pCASPER-HS subkloniert (Thummel und Pirrotta 1992). Die resultierenden
Vektoren, pCASPER-TRAPWLE1, pCASPER-TRAPWLE2, pCASPERTRAP2xWLE2,
pCASPER-TRAPWLE2 (mutiert) und pCASPERTRAP, wurden über eine
P-Element-vermittelte Transformation in Drosophila-Embryos eingefügt (Spradling
und Rubin 1982). Bei jedem injizierten Konstrukt wurden wenigstens
drei unabhängige
transgene Linien isoliert.
-
Herstellung
von GST-MCP-Perlen
-
Durch
Subklonierung eines PCR-Fragments, das aus dem gesamten offenen
Leserahmen mit einer 3' hinzugefügten BamHI-Stelle
und einer 5' hinzugefügten XhoI-Stelle
besteht, in den Vektor pGEX4T-1 (Pharmacia) wurde eine GST-Hüllprotein-Fusion
hergestellt. Das Fusionsprotein wurde in BL21-Zellen von E. coli exprimiert,
die 3 Stunden lang (OD600 1,8) bei 37 °C kultiviert
und dann 4,5 Stunden lang mit 100 mM IPTG induziert wurden. Die
Zellen wurden in 250-ml-Aliquots pelletiert, in flüssigem Stickstoff
tiefgefroren und bis zu 2 Monate bei –70 °C aufbewahrt. Die Zellpellets
wurden durch Ultraschallbehandlung (5 min bei 50 %) lysiert und
wie vom Hersteller angegeben an Glutathion-Sepharose-Perlen (Pharmacia)
gebunden. Nach ausgiebigem Waschen wurde das Fusionsprotein unter
Verwendung von 20 mM Dimethylpimelimidat gelöst in 200 mM HEPES-Puffer (pH
8,5), mit den Perlen vernetzt (Bar-Peled et al., 1996). Das vernetzte
Affinitätsharz
kann bei –20 °C in Lagerpuffer
(HEPES pH 7,4, 80 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 40 % Glycerol) wenigstens
6 Monate lang aufbewahrt werden. Alternativ kann das Protein, wenn
eine Eluierung mit Glutathion aus den Hüllprotein-Perlen erwünscht ist,
ungekoppelt belassen werden. In diesem Fall kann das eluierte Protein
jedoch die Gegenwart anderer spezifisch gebundener Proteine verschleiern.
-
In-vitro-RNA-Expression
-
Durch
die Linearisierung von pTRAP-Konstrukten mit XhoI, Phenol/Chloroform-Extraktion
zum Entfernen des Enzyms und Ausfällung in Ethanol wurden Transkriptionsmatrizen
hergestellt. 25 μl
Transkriptionsreaktionen enthielten 1 μg linearisierte pTRAP-DNA, 5 μl 5x T7 RNA-Polymerase-Puffer
(400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 60 mM MgCl2),
5 μl 10
mM NTP-Mischung,
1 μl 0,75
mM DTT (RNAse-frei), 20 E Plazenta-RNAse-Hemmer (MBI), 15 E T7 RNA-Polymerase
und zur Auffüllung
auf 25 μl
RNAse-freies Wasser. Die Reaktionen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert,
die resultierende RNA unter Verwendung von 0,4 M LiCl und 2,5 Volumina
Ethanol ausgefällt
und die Pellets erneut in 40 μl
RNAse-freiem Wasser suspendiert (Ambion). Die Ausbeute an RNA-Produkt
beträgt
ungefähr
25 μg, was
der Menge an RNA entspricht, die 1 ml cytoplasmatischem Drosophila-Extrakt
zugegeben wurde (wie nachstehend beschrieben).
-
Extraktherstellung
-
Drosophila-Embryos
wurden über
einen Zeitraum von 4 oder 12 Stunden gesammelt und weitere 4 Stunden
gealtert. Mittels eines 30 min langen Wärmeimpulses (36,5 °C) wurden
TRAP-Konstrukte
in transgenen Embryos induziert. Cytoplasmatische Extrakte wurden
im Wesentlichen wie von Moritz (Sullivan et al., 2000) beschrieben
mit den folgenden Änderungen
hergestellt. Für
alle Schritte der Extraktherstellung wurde ein TRAP-Reinigungspuffer
(5x TPB Stammlösung
= 300 mM HEPES pH 7,4, 50 mM MgCl2, 400
mM NaCl, 0,5% Triton X-100) verwendet. Die TPB-Arbeitslösung wurde
durch Zugabe von Glycerin bis 10%, Proteasehemmer (vollständig EDTA-frei;
Roche) und DTT (1 mM endgültige
Konzentration) zur verdünnten
Stammlösung
hergestellt. Embryos ohne Chorion wurden zweimal mit 3 Volumina
TPB-Puffer im Dounce-Homogenisator gewaschen, wonach so viel Pufferlösung entfernt
wurde, dass die Embryos gerade noch bedeckt waren. Der homogenisierte
Extrakt wurde nur einmal durch ein Mira-Tuch passiert. Das erhaltene
Filtrat wurde 10 Minuten lang bei 14.000 g (abhängig vom Volumen in einer Mikrofuge
oder geeigneten Zentrifugenröhrchen)
zentrifugiert und in neue Röhrchen überführt. Das
Zentrifugieren wurde erforderlichenfalls so lange wiederholt, bis das
Filtrat klar war. Falls nicht sofort verwendet, wird der Extrakt
bis zu einer endgültigen
Konzentration von 20 % mit Glycerin versetzt, tiefgefroren und bei –70 °C aufbewahrt.
-
TRAP-Reinigung
-
Es
wurden nur RNAse-freie Bedingungen und Lösungen mit Wasser, das mit
DEPC behandelt war, verwendet. Für
die In-vitro-Reinigungen
wurde das aufgetaute Lysat 5 min lang bei 14.000 g erneut zentrifugiert
und pro ml Lysat wurden 10 μg
RNA zugesetzt. Nach 2–3-stündiger Inkubation
bei 4 °C
wurde das Lysat mit Streptavidin-Agarose-Perlen (Sigma: 200 μl Perlen/ml
Extrakt), die zuvor in 1xTPB-Lösung äquilibriert
worden waren, vermischt.
-
Nach
vorsichtigem 1-stündigem
Schütteln
bei 4 °C
wurde die Mischung in eine RNAse-freie Chromatographiesäule eingetragen
und absitzen gelassen. Dann wurden die Säulen geöffnet, das nicht gebundene Material
wurde durchfließen
gelassen und anschließend
wurde dreimal mit 1 ml TPB gewaschen. Die gebundenen Komplexe wurden
durch Verschließen
der Säule,
Einbringen von 500 μl
Biotin-Elutionspuffer, (1x TPB + 5 mM d-Biotin, Sigma), 1-stündiges Inkubieren bei 4 °C, Öffnen der
Säule und
Sammeln des Eluats eluiert. Dann wurden weitere 250 μl Biotin-Elutionspuffer
in die Säule
eingebracht und die Eluate vereinigt. Eine Möglichkeit zu diesem Zeitpunkt
ist die Wiederholung der Streptavidin-Affinitätschromatographie nachdem zuerst das
Biotin entfernt wurde (unter Verwendung von Avidin-Agarose-Perlen).
-
Die
Streptavidin-Eluate wurden dann an die GST-MCP-Perlen gebunden.
Für je
500 μl Streptavidin-Eluat
wurden ungefähr
50 μl GST-CP-Sepharose-Perlen,
die zuvor dreimal mit 1x TPB gewaschen worden waren, verwendet.
-
Nach
1-stündigem
Schütteln
bei 4 °C
wurde die Mischung in eine verschlossene RNAse-freie Minisäule überführt. Nach
Absetzen der Perlen wurde die Säule
geöffnet,
das ungebundene Material wurde durchfließen gelassen und die Perlen
wurden dreimal mit 1 ml 1x TPB gewaschen. Die gebundenen Komplexe
wurden unter Verwendung von entweder Glutathion-Elutionspuffer (Pharmacia), hoher Salzkonzentration
(5xTPB), RNAse (200 μl
2 mg/ml RNAseA + 5000 E/ml RNAse T1 (Fermentas) oder verschiedenen
Denaturierungsmitteln (z. B. Harnstoff, SDS) eluiert. Zu diesem
Zweck wurde ein Bettvolumen Elutionspuffer eingebracht, 30 min inkubiert,
eluiert, dreimal mit Elutionspuffer gewaschen und die vier Eluate
wurden vereinigt. Die Proteine wurden dann erneut durch SDS-PAGE aufgetrennt
und mittels Trypsinproteolyse, Massenspektrometrie (Fenyo 1998)
und Vergleichen mit Daten der genomischen Datenbanken für Drosophila
identifiziert (Adams 2000).
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ZUSAMMENFASSUNG
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Herkömmliche
Verfahren zur Isolierung und Identifizierung bestimmter RNA-Protein-Komplexe
weisen eine Reihe von Problemen auf, die in der Genomik und Proteomik
nicht beobachtet werden. Hier beschreiben wir ein zweistufiges Affinitätsreinigungsverfahren,
das zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen verwendet wird. Der TRAP-Marker
(Tandem-RNA-Affinitätsreinigung)
ist ein duales RNA-Tagging-System, das die schonende Reinigung von
RNA-Molekülen
zusammen mit den Proteinen, RNA und anderen kleinen Molekülen, die damit
spezifisch assoziiert sind, erleichtert.
