DE112005001895B4

DE112005001895B4 - Methoden und Systeme für die Detektion biomolekularer Bindung mithilfe von Terahertz-Strahlung

Info

Publication number: DE112005001895B4
Application number: DE112005001895T
Authority: DE
Inventors: Tae-Woong Koo; Andrew Berlin; Ken Salsman; Brian Ostrovsky
Original assignee: Intel Corp
Current assignee: Intel Corp
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2011-12-08
Anticipated expiration: 2025-07-21
Also published as: US20060216742A1; TW200609506A; US20100278697A1; WO2006137824A2; TWI303314B; JP4676983B2; DE112005001895T5; JP2008509391A; WO2006137824A3; US20060029941A1; GB0700616D0; US7709247B2; GB2433987A; US8852955B2; GB2433987B; US20060216743A1

Abstract

Es werden Verfahren und Systeme zum Detektieren biomolekularer Bindungsereignisse mittels Gigahertz- und Terahertzstrahlung bereitgestellt. Die Verfahren und Systeme verwenden Niedrig-Energie-Spektroskopie zum Detektieren biomolekularer Bindungsereignisse zwischen Molekülen in einer wäßrigen Lösung. Die detektierten biomolekularen Bindungsereignisse umfassen beispielsweise Nukleinsäurehybridisierung, Antikörper-/Antigenbindung und Rezeptor-/Ligandbindung.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein das Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses und insbesondere das Detektieren solcher Ereignisse mittels Spektroskopie.
HINTERGRUNDINFORMATIONEN
Viele derzeitige Verfahren zum Feststellen einer Erkrankung oder des Risikos der Entwicklung einer Erkrankung beruhen auf der Detektion einer oder mehrerer biomolekularer Wechselwirkungen zwischen einem Zielmolekül in der biologischen Probe und einem detektierbaren Sondenmolekül. Das Sondenmolekül ist typischerweise detektierbar, weil es an einen erkennbaren Marker gebunden ist. Beispielsweise kann eine Infektion in einem Individuum, die durch einen infektiösen Erreger, wie beispielsweise ein Virus, verursacht wird, durch die Detektion der Bindung einer markierten Antikörpersonde an ein virales Protein detektiert werden. Auf Basis dieses allgemeinen Konzeptes sind viele Bioassays entwickelt worden.
Einige neuere Verfahren zum Feststellen einer Krankheit beruhen auf der Feststellung (detection) bzw. Bestimmung (determination) einer Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe. Sequenzselektive Feststellung von Nukleinsäuremolekülen wurde zunehmend wichtig, da Wissenschaftler die genetische Basis der Erkrankung aufklären und diese neuen Informationen verwenden, um die medizinische Diagnose und Behandlung zu verbessern.
Nukleinsäurehybridisierungsassays sind spezifische biomolekulare Bindungsassays, die üblicherweise verwendet werden, um das Vorhandensein spezifischer Nukleinsäuresequenzen in einer Probe festzustellen. Beispielsweise lässt sich ein infektiöser Erreger (agent) feststellen, indem die Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde an eine Nukleinsäure des Virus festgestellt wird. Alternativ kann das Verfahren der Feststellung einer Krankheit die Feststellung oder Bestimmung der gesamten oder eines Teils der eigenen Nukleinsäuresequenzen des Patienten zugrunde legen. Beispielsweise lässt sich das Risiko eines Patienten zur Entwicklung einer Krankheit durch Erkennung einer genetischen Mutation feststellen.
Wie andere Verfahren, die biomolekulare Wechselwirkungen feststellen, verwenden Nukleinsäurehybridisierungsassays in der Regel eine markierte Sonde. Als Marker sind traditionell Radioisotope verwendet worden. In jüngerer Zeit sind fluoreszierende, chemilumineszente und bioaktive Reportergruppen (reporter group) verwendet worden. Die Verwendung von Markern in einem Assay macht ihn aber häufig teurer und komplizierter und erhöht das Hintergrundsignal des Assays.
Hybridisierungsassays können nicht nur zur Feststellung des Vorhandenseins eines Nukleinsäuremoleküls verwendet werden, sondern erkennen auch die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls. Traditionelle Ansätze zur Sequenzbestimmung beruhen auf der Synthese markierter Nukleinsäuren, die an einem der vier Nukleotide enden. Diese Verfahren sind jedoch relativ langsam und teuer. In jüngerer Zeit wurden Verfahren entwickelt, bei denen Oligonukleotide auf einem Glasträger synthetisiert werden und die Hybridisierung mit radioaktiv oder fluoreszent markierter Test-DNA stattfindet, und die Nukleotidsequenz auf der Basis einer Datenanalyse rekonstruiert wird (E. Southern et al., PCT/GB 89/00460 , 1989, WO 89/10977 A1 ). Eine Vorrichtung zur Durchführung solcher Verfahren umfasst eine Trägerschicht oder eine Glasplatte und eine Anordnung von Nukleotiden, die kovalent an deren Oberfläche befestigt sind. Die Anordnung enthält einen Satz von Oligonukleotiden gewünschter Länge, die an einer Hybridisierungsreaktion teilnehmen können.
Das oben erörterte Verfahren der Sequenzierung durch Hybridisierung liefert zwar ein weniger teures Verfahren mit höherem Durchsatz, hat aber bestimmte Nachteile. Beispielsweise erfordert es typischerweise die Markierung von Nukleinsäureproben oder -sonden. Wie oben erläutert, erhöht dies die Kosten und Komplexität des Verfahrens und erhöht die Hintergrundwerte, wodurch sich die Empfindlichkeit verringert. Darüber hinaus verringern Einschluss und Feststellung von Markern den Durchsatz des Assays.
In einem Versuch zur effizienteren Bestimmung von Nukleinsäuresequenzinformationen wurde Spektroskopie im ultravioletten/sichtbaren/Nahinfrarot-Bereich verwendet, um die Hybridisierung direkt festzustellen. Diese Art der Spektroskopie hat zwar Ereignisse für kleinere Moleküle (z. B. CO₂) erfolgreich festgestellt, konnte aber nicht den gewünschten Grad an Effizienz und Genauigkeit für Biomoleküle liefern, die tendenziell größer sind. Die Frequenzverschiebung im Vibrationsspektrum bei größeren Biomolekülen (z. B. DNA) bei der Bindung ist zu klein, um mittels Spektroskopie im ultravioletten/sichtbaren/Nahinfrarot-Bereich genau und effizient festgestellt zu werden. Darüber hinaus bewirkt die Strahlung im ultravioletten/sichtbaren/Nahinfrarot-Bereich eine Fluoreszenz der Moleküle, wodurch Hintergrundrauschen entsteht, welches die Spektrumsignale beeinträchtigt. Darüber hinaus erfordert das Verfahren mehrere Gitter mit starker Dispersion, um die kleine Frequenzveränderung aufzulösen, was das optische Instrument zu sperrig für eine geeignete Anwendung macht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Veranschaulichung einer Ausführungsform eines Systems, bei der Terahertz-Strahlung 10 auf ein Nukleinsäuremolekül 20 auftrifft, das auf einem transparenten Substrat 22 immobilisiert ist. Die Anregung und Signalmessung können beispielsweise durch das Substrat erfolgen.
2 ist ein Diagramm, das den durch Terahertz-Strahlung verursachten Frequenzübergang bei der Raman-Spektroskopie zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die durch Terahertz-Strahlung verursachte Energieabsorption zeigt.
4 ist eine Veranschaulichung einer anderen Ausführungsform eines Systems, bei dem die totale interne Reflexionsgeometrie verwendet wird, um eine Anregungsstrahlung 42 zu liefern und die Raman-Streustrahlung 46 zu messen.
5 ist ein Diagramm, das einen Frequenzübergang bei der Raman-Spektroskopie unter Verwendung von Strahlung im ultravioletten/sichtbaren/Nahinfrarot-Bereich zur Anregung einer Nukleinsäure zeigt.
6 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur Feststellung eines biomolekularen Bindungsereignisses.
7 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Identifizierung eines Mittels, das eine biomolekulare Bindung beeinflusst.
8 ist eine Veranschaulichung einer Ausführungsform eines mikro-elektromechanischen Systems (MEMS), das die in 1 und/oder 4 veranschaulichten Systeme beinhaltet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hierin bereitgestellten Verfahren und Systeme beruhen auf der Verwendung von Terahertz-Strahlung zur Feststellung biomolekularer Bindungsereignisse. Die Verwendung einer Terahertz-Strahlung zur Feststellung biomolekularer Bindungsereignisse bietet zahlreiche Vorteile gegenüber derzeit verfügbaren Feststellungsverfahren (detection methods). Erstens ist das Hintergrundniveau reduziert, da keine Marken erforderlich sind und da eine Terahertz-Strahlung mit niedriger Energie keine Fluoreszenz verursacht Zweitens ist durch Verwendung von Terahertz-Strahlung mit niedriger Energie anstelle von Strahlung im ultravioletten/sichtbaren/Nahinfrarot-Bereich nur ein Gitter erforderlich, um ein aussagekräftiges Spektroskopieergebnis zu erhalten. Aufgrund der Tatsache, dass mehrere Gitter überflüssig sind, kann das Instrument kompakter und günstiger werden. Drittens erlaubt die Verwendung von Terahertz-Strahlung, dass die biomolekulare Signatur der Probe in einem Ruhezustand (dormant state) erhalten werden kann, ohne dass die Moleküle der Probe auf ein unnötig hohes Energieniveau angeregt und die Moleküle oder deren Wechselwirkungen gegebenenfalls verändert werden.
Die Erfindung stützt sich, zumindest zum Teil, auf die Entdeckung, dass Spektroskopie mit Terahertz/Gigahertz-Strahlung ein effizientes und genaues Überwachen biomolekularer Bindungsereignisse ohne die Nachteile und hohen Hintergründe ermöglicht, die mit den derzeit verfügbaren Verfahren verbunden sind. Das Terahertz/Gigahertz-Strahlungsinstrument der Erfindung regt die Moleküle spezifisch in den Niedrigfrequenzschwingungsbändern an, wodurch Hintergrundrauschen in den Signalen erheblich reduziert und gleichzeitig die Notwendigkeit mehrerer Gitter überflüssig wird.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren das Präparieren einer Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfaßt, das Richten einer Eingangsstrahlung auf die Probe, wobei es sich bei der Eingangsstrahlung um Gigahertz- oder Terahertzstrahlung handelt, und Detektieren der Ausgangsstrahlung, die von der Probe ausgeht. Eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung im Vergleich zur Ausgangsstrahlung, die von einem ersten Molekül detektiert wird, das nicht an das zweite Molekül gebunden ist, zeigt eine biomolekulare Wechselwirkung an. Mindestens eines der Moleküle ist typischerweise ein Biomolekül. In einem veranschaulichenden Beispiel handelt es sich bei dem biomolekularen Bindungsereignis um die Hybridisierung eines ersten Nukleinsäuremoleküls an ein zweites Nukleinsäuremolekül.
In einer anderen Ausführungsform ist ein Verfahren des Detektierens eines biomolekularen Bindungsereignisses durch Präparieren einer Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfaßt, durch Richten einer Eingangsstrahlung auf die Probe bereitgestellt. Die Eingangsstrahlung regt die Probe an, ohne Fluoreszenz zu verursachen. Die Ausgangsstrahlung, die von der Probe ausgeht, wird hinsichtlich einer Verschiebung der Schwingungsfrequenz untersucht, wobei eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung gegenüber der von einem ersten, nicht an das zweite Molekül gebundenen Molekül detektieren Ausgangsstrahlung eine biomolekulare Wechselwirkung anzeigt.
In einer anderen Ausführungsform ist eine Vorrichtung zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses bereitgestellt. Die Vorrichtung umfasst eine Terahertz-Lichtquelle bzw. eine Terahertz-Strahlungsquelle, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung auf eine Probe zu richten, und einen Detektor zum Empfangen einer Ausgangsstrahlung, die von der Probe reflektiert. Es ist auch ein Prozessor bereitgestellt, um die Daten von dem Detektor zu empfangen und die Daten zu analysieren. In manchen Ausführungsformen befinden sich die Lichtquelle, der Detektor und der Prozessor in einem Gehäuse. Zwischen der Lichtquelle und der Probe kann sich auch ein Filter befinden. Es kann auch eine optionale Probenhalterung bereitgestellt sein.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein System zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses bereitgestellt. Das System umfasst eine Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfaßt, eine Gigahertz- oder Terahertzstrahlungsquelle, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung auf die Probe zu richten, und einen Detektor zum Empfangen einer Ausgangsstrahlung, die von der Probe reflektiert. Das System detektiert Ausgangsstrahlung, die bei Anregung durch die Eingangsstrahlung von der Probe ausgeht, wobei eine Verschiebung in der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung im Intensitätsniveau der Ausgangsstrahlung gegenüber der von einem ersten, nicht an das zweite Molekül gebundenen Molekül detektierten Ausgangsstrahlung eine biomolekulare Wechselwirkung anzeigt.
In hierin bereitgestellten Verfahren ist das erste Molekül typischerweise ein Biomolekül. Auch das zweite Molekül kann ein Biomolekül sein. Beispielsweise ist ein zweites Molekül, das typischerweise ein durch das Verfahren festzustellendes Molekül ist, ein Virus, ein Bakterium oder ein Analyt, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Peptid, ein Polysaccharid oder eine Fettsäure.
Wie hierin verwendet, bedeutet „ein” oder „eines” eines oder mehr als eines einer Sache.
„Nukleinsäure” umfasst DNA, RNA, einzelsträngig, doppelsträngig oder dreisträngig und jede chemische Modifikation davon. Es wird praktisch jede Modifikation der Nukleinsäure in Betracht gezogen. Wie hierin verwendet kann eine einzelsträngige Nukleinsäure mit der Vorsilbe „ss”, eine doppelsträngige Nukleinsäure mit der Vorsilbe „ds” und eine dreisträngige Nukleinsäure mit der Vorsilbe „ts” bezeichnet sein. Für hierin bereitgestellte Verfahren handelt es sich bei einem Biomolekül in veranschaulichenden Beispielen um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül. Nukleinsäuren in den hierin bereitgestellten Verfahren umfassen virale, bakterielle und tierische, beispielsweise von Säugern, oder insbesondere humane Nukleinsäuren.
Eine „Nukleinsäure” kann fast jede Länge aufweisen, beispielsweise von 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 75.000, 100.000, 150.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 1.500.000, 2.000.000, 5.000.000 oder noch mehr Basen in der Länge, bis zu einem chromosomalen DNA-Molekül in voller Länge.
Zu analysierende Nukleinsäuremoleküle können durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren natürlich vorkommende DNA- oder RNA-Moleküle. Es kann praktisch jede natürlich vorkommende Nukleinsäure mit den beschrieben Verfahren präpariert und sequenziert werden, einschließlich, ohne Einschränkung, chromosomaler, mitochondrialer und Chloroplasten-DNA und ribosomaler, Transfer-, heterogener Kern- und Boten-RNA.
Eine „biologische” Probe umfasst beispielsweise Harn, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Samen, Stuhl, Sputum, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Tränen, Mukus, Ejakulat, zerebrospinale Flüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, Aszitesflüssigkeit oder eine Biopsieprobe.
In bestimmten Fällen stammt die biologische Probe von einem Säugerindividuum, beispielsweise von einem humanen Individuum. Bei der biologischen Probe kann es sich um praktisch jede biologische Probe handeln, sofern die Probe ein zweites spezifisches Bindungspaarelement enthält oder enthalten kann. Beispielsweise könnte die Probe ein Protein enthalten, das über ein Epitop verfügt, welches von einem als das erste spezifische Bindungspaarelement enthaltenen Antikörper erkannt wird. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe sein, die beispielsweise 1 bis 10.000.000; 1000 bis 10.000.000; oder 1.000.000 bis 10.000.000 somatische Zellen enthält. Die Probe braucht keine intakten Zellen zu enthalten, so lange sie ausreichende Mengen eines spezifischen Bindungspaarelements für die bereitgestellten Verfahren enthält. Nach Aspekten der hierin bereitgestellten Verfahren, wobei die biologische Probe von einem Säugerindividuum stammt, kann die biologische Probe oder Gewebeprobe von jedem Gewebe stammen. Beispielsweise kann das Gewebe durch eine Operation, Biopsie, Abstrich, Stuhl oder ein anderes Sammelverfahren erhalten werden. In anderen Aspekten enthält die biologische Probe ein Pathogen, beispielsweise ein virales oder bakterielles Pathogen, oder könnte ein solches Pathogen enthalten oder es besteht das Risiko des Vorhandenseins eines solchen Pathogens.
Der Begriff „bindet spezifisch” oder „spezifische Bindungsaktivität” bedeutet bei Verwendung in Bezug auf einen Antikörper, dass eine Wechselwirkung des Antikörpers und eines bestimmten Epitops eine Dissoziationskonstante von mindestens etwa 1 × 10^–6, im Allgemeinen mindestens etwa 1 × 10^–7, gewöhnlich mindestens etwa 1 × 10^–8 und insbesondere mindestens etwa 1 × 10^–9 oder 1 × 10^–10 oder weniger aufweist. Als solche sind Fab-, F(ab')₂-, Fd- und Fv-Fragmente eines Antikörpers, die spezifische Bindungsaktivität beibehalten, in der Definition eines Antikörpers eingeschlossen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „spezifisches Bindungspaarelement” auf ein Molekül, das spezifisch an ein anderes Element eines spezifischen Bindungspaares bindet, selektiv damit hybridisiert oder damit wechselwirkt. Spezifische Bindungspaarelemente umfassen beispielsweise Analyte und Biomoleküle.
Ein „Biomolekül” ist ein spezifisches Bindungspaarelement, das in der Natur vorkommt oder von einem in der Natur vorkommenden Molekül abstammt. Biomoleküle können beispielsweise Biomoleküle mit einem Molekulargewicht von mindestens 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 50 kDa oder 100 kDa einschließen. Biomoleküle schließen beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide, Proteine, Liganden, Lipide, Kohlenhydrate oder Polysaccharide, aber nicht Wasser, ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Analyt” auf jede(s) für die Detektion und/oder Identifizierung in Frage kommende Atom, Chemikalie, Molekül, Verbindung, Zusammensetzung oder jeden Komplex. Nicht einschränkende Beispiele von Analyten umfassen Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Nukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Zucker, Kohlenhydrate, Oligosaceharide, Polysaccharide, Fettsäuren, Lipide, Hormone, Metabolite, Zytokine, Chemokine, Rezeptoren, Neurotransmitter, Antigene, Allergene, Antikörper, Substrate, Metabolite, Cofaktoren, Inhibitoren, Wirkstoffe, Pharmazeutika, Nährstoffe, Prionen, Toxine, Gifte, Sprengstoffe, Pestizide, chemische Kampfstoffe, biologisch gefährliche Stoffe, Radioisotope, Vitamine, heterozyklische aromatische Verbindungen, Karzinogene, Mutagene, Narkotika, Amphetamine, Barbiturate, Halluzinogene, Abfallprodukte, Viren, Bakterien, Protozoen und/oder Verunreinigungsmittel.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Antikörper” in seinem weitesten Sinn verwendet, um polyklonale und monoklonale Antikörper einzuschließen. Der Begriff „Antikörper”, wie hierin verwendet, soll intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie beispielsweise Fab- und F(ab')₂-, Fv- und EKA-Fragmente (SCA fragments), beinhalten, die an eine Epitopdeterminante binden können.

(1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten antigenbindenden Fragment eines Antikörpermoleküls und kann durch Digestion eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Papain produziert werden, um ein Fragment zu erhalten, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht.
(2) Ein Fab'-Fragment eines Antikörpermoleküls kann erhalten werden, indem ein ganzes Antikörpermolekül mit Pepsin behandelt wird, gefolgt von einer Reduktion, um ein Molekül zu erhalten, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht. Je Antikörpermolekül, das auf diese Weise behandelt wird, werden zwei Fab'-Fragmente erhalten.
(3) Ein F(ab')₂-Fragment eines Antikörpers kann erhalten werden, indem ein ganzes Antikörpermolekül ohne anschließende Reduktion mit dem Enzym Pepsin behandelt wird. Ein F(ab')₂-Fragment ist ein Dimer aus zwei Fab'-Fragmenten, das von zwei Disulfidbrücken zusammengehalten wird.
(4) Ein Fv-Fragment ist definiert als ein gentechnisch hergestelltes Fragment, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette, exprimiert (expressed) als zwei Ketten, enthält.
(5) Ein Einzelkettenantikörper (EKA) ist ein gentechnisch hergestelltes Einzelkettenmolekül, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette, verbunden durch einen geeigneten flexiblen Polypeptidlinker, enthält.

Der Begriff „Antikörper”, wie hierin verwendet, umfasst natürlich vorkommende Antikörper sowie nicht natürlich vorkommende Antikörper, einschließlich beispielsweise Einzelkettenantikörper, chimäre, bifunktionale und humanisierte Antikörper sowie antigenbindende Fragmente davon. Solche nicht natürlich vorkommenden Antikörper können durch Festphasenpeptidsynthese konstruiert, rekombinant produziert oder beispielsweise durch Screening von kombinatorischen Bibliotheken erhalten werden, die aus variablen schweren Ketten und variablen leichten Ketten bestehen (vgl. Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989)). Diese und andere Verfahren des Herstellens von beispielsweise chimären, humanisierten, CDR-grafted, einzelkettigen und bifunktionalen Antikörpern sind einem Fachmann gut bekannt (Winter and Harris, Immunol. Today 14: 243–246, 1993; Ward et al., Nature 341: 544–546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2. Auflage (Oxford University Press 1995)).
Verfahren zum Erzeugen polyklonaler Antikörper, beispielsweise bei einem Kaninchen, einer Ziege, einer Maus oder einem anderen Säuger, sind im Stand der Technik gut bekannt (vgl. beispielsweise Green et al., „Production of Polyclonal Antisera” in Immunochemical Protocols (Manson, Hrsg., Humana Press 1992), Seite 1–5; Coligan et al., „Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters” in Curr. Protocols Immunol. (1992), Abschnitt 2.4.1). Darüber hinaus lassen sich monoklonale Antikörper anhand von Verfahren erhalten, die aus dem Stand der Technik gut bekannt und Routine sind (Harlow and Lane, oben, 1988).
Wie in dieser Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „Epitop” auf eine Antigendeterminante auf einem Antigen, an das das Paratop eines Antikörpers bindet. Antigendeterminanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie beispielsweise Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und können spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften sowie spezifische Ladungseigenschaften aufweisen.
Beispiele von Arten erfindungsgemäßer Immunassays umfassen kompetitive (competitive) und nicht kompetitive Immunassays entweder in einem direkten oder einem indirekten Format. Ein Fachmann kennt andere Immunassayformate ohne überflüssiges Experimentieren oder kann solche einfach erkennen.
Bei der Durchführung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung können in dem Inkubationsmedium „Blockierungsmittel” enthalten sein. „Blockierungsmittel” werden zugegeben, um unspezifische Bindung an eine Oberfläche und zwischen Molekülen zu minimieren.
Ein „biomolekulares Bindungsereignis” oder eine „biomolekulare Wechselwirkung” ist eine spezifische Bindung spezifischer Bindungspaarelemente, wobei mindestens eines der spezifischen Bindungspaarelemente ein Biomolekül ist. Es können hierin bereitgestellte Verfahren verwendet werden, um molekulare Wechselwirkungen (d. h. Bindung) praktisch jedes Biomoleküls mit einem anderen Molekül zu detektieren. Beispielsweise können die Verfahren eine Wechselwirkung eines Analyten und eines Biomoleküls erkennen.
Der Begriff „Rezeptor” wird verwendet, um ein Protein oder Fragment davon oder eine Gruppe von assoziierten Proteinen zu bezeichnen, die eine spezifische Substanz, den so genannten Liganden, selektiv binden. Bei Bindung seines Liganden löst der Rezeptor eine spezifische Reaktion in einer Zelle aus.
Der Begriff „Polypeptid” wird hierin im weiten Sinn verwendet, um zwei oder mehrere Aminosäuren zu bezeichnen, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind. Der Begriff „Fragment” oder „proteolytisches Fragment” wird hierin ebenfalls verwendet und bezieht sich auf ein Produkt, das durch eine proteolytische Reaktion gegenüber einem Polypeptid produziert werden kann, d. h. ein Peptid, das durch Spaltung einer Peptidbindung in dem Polypeptid hergestellt wird. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält mindestens etwa sechs Aminosäuren, enthält in der Regel etwa zehn Aminosäuren und kann fünfzehn oder mehr Aminosäuren, insbesondere zwanzig oder mehr Aminosäuren, enthalten. Es versteht sich, dass der Begriff „Polypeptid” hierin nicht verwendet wird, um eine bestimmte Größe oder Anzahl von Aminosäuren nahe zu legen, welche das Molekül umfassen, und dass ein erfindungsgemäßes Peptid bis zu mehrere Aminosäurereste oder mehr enthalten kann. Ein Protein ist ein Polypeptid, das außer Aminosäuren weitere chemische Einheiten enthält, wie beispielsweise Phosphatgruppen oder Kohlenhydrateinheiten.
Der Begriff „Terahertz- (d. h. THz) oder Gigahertz-Strahlung” bedeutet Strahlung zwischen dem fernen Infrarot und hochfrequenten HF-Bereichen. Beispielsweise kann Terahertz-Strahlung eine Bandbreite im Bereich zwischen 0,1 bis 100 THz aufweisen, was einer Wellenlänge von etwa 3 Millimetern bis etwa 3 Mikrometern entspricht. Der Puls einer Terahertz-Strahlung ist typischerweise kurz und kann in der Größenordnung von 10^–12 Sekunden liegen, die damit eine relativ hohe Spitzenleistung und eine kurze Zeitauflösung aufweist.
Eine „Eingangsstrahlung”, wie hierin verwendet, ist die Strahlung, die aus der Strahlungsquelle kommt, bevor sie auf die Probe auftrifft. Eine „Ausgangsstrahlung” ist die Strahlung, die zum Detektor wandert, nachdem sie von der Probe gestreut oder reflektiert worden ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein Verfahren zum Feststellen bzw. Detektieren eines Biomoleküls bereitgestellt, das das Treffen des Biomoleküls mit Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung und das Feststellen einer Ausgangsstrahlung umfasst. Eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz der Ausgangsstrahlung oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung gegenüber der von einer nicht das Biomolekül aufweisenden Kontrollprobe festgestellten Ausgangsstrahlung zeigt das Vorhandensein des Biomoleküls an. In bestimmten Fällen wird die Ausgangsstrahlung durch Raman-Spektroskopie detektiert. In anderen Fällen wird die Absorption detektiert, indem eine Verringerung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung festgestellt wird. In bestimmten Beispielen wird das Biomolekül isoliert und gegebenenfalls immobilisiert, bevor es von der Eingangsstrahlung getroffen wird.
Das Verfahren zum Detektieren eines Biomoleküls unter Verwendung von Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung kann verwendet werden, um eine biomolekulare Wechselwirkung festzustellen, die hierin auch als ein biomolekulares Bindungsereignis bezeichnet ist. In einer anderen Ausführungsform ist demnach hierin ein Verfahren zum Detektieren einer biomolekularen Wechselwirkung bereitgestellt, einschließlich: Inberührungbringen (contacting) eines ersten Moleküls mit einem zweiten Molekül, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Biomolekül handelt, das an das zweite Molekül binden könnte; und Bestrahlen des ersten Moleküls mit Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung; und Feststellen einer Ausgangsstrahlung. Eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung gegenüber der von einem nicht an das zweite Molekül gebundenen ersten Molekül detektierten Ausgangsstrahlung zeigt eine biomolekulare Wechselwirkung an.
1 zeigt eine Ausführungsform des Systems 5, wobei Terahertz-Strahlung von einer Strahlungsquelle 112 auf eine Population von immobilisierten ersten Molekülen 20 auftrifft. Ein Pfeil 10 zeigt die Richtung an, in der die Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung auf die immobilisierten Biomoleküle 20 zuläuft. Die immobilisierten Biomoleküle 20 sind an ein Substrat 22 gebunden und in eine Reaktionslösung 24 getaucht. In bestimmten Beispielen hat die Eingangsstrahlung 10 von der Strahlungsquelle 112 eine Bandbreite von zwischen 0,001 und 1000 Terahertz, beispielsweise zwischen 0,01 und 100 Terahertz oder zwischen 0,1 und 10 Terahertz.
Nachdem das erste Molekül 20 von der Eingangsstrahlung 10 getroffen wird, wird Ausgangsstrahlung 30 erzeugt und wandert zu einem Terahertz-Detektor 116, der die Ausgangsstrahlung 30 detektiert. Die detektierte Strahlung wird von einem Prozessor 118 auf etwaige Änderungen im Schwingungsspektrum oder Veränderungen des Intensitätsniveaus hin analysiert. Wenn die immobilisierten Biomoleküle 20 ein Bindungsereignis mit freien Molekülen in der Lösung 24 erfahren, zeigt die Ausgangsstrahlung eine Frequenzverschiebung im Schwingungsspektrum und/oder eine Energieabsorption im Vergleich zu dem Schwingungsspektrum oder Energieabsorption der immobilisierten Biomoleküle 20, wenn sie nicht an das zweite Molekül gebunden sind. Eine Veränderung der Schwingungsspektren und/oder das Auftreten von Absorption, die sich von der für ungebundene immobilisierte Biomoleküle 20 beobachteten oder erwarteten unterscheidet, zeigt an, dass die immobilisierten Moleküle 20 und die freien Moleküle binden. Beispielsweise kann eine Verringerung des Intensitätsniveaus um 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 und 50% das Stattfinden eines biomolekularen Bindungsereignisses anzeigen. In einem anderen Beispiel kann die Frequenzverschiebung von 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 THz das Stattfinden eines biomolekularen Bindungsereignisses anzeigen. Es können Schwingungsspektren für ein erstes Molekül erzeugt und aufgezeichnet werden, das nicht an ein zweites Molekül gebunden ist, und verwendet werden, um sie mit Schwingungsspektren in Gegenwart einer Probe, die möglicherweise das zweite Molekül enthalten könnte, zu vergleichen.
Wie in 5 veranschaulicht, regt die durch Strahlung im ultravioletten/sichtbaren/nahen infraroten Bereich 60 verursachte Anregung eines Biomoleküls das Biomolekül zu einem virtuellen Zustand 65 an und führt zur Erzeugung von Raman-Streulicht 62, regt das Biomolekül aber auch von einem Grundzustand 58 auf einen unnötigen Elektronen-Anregungszustand 66 an, was zu Fluoreszenz 68 führt. 2 ist ein Diagramm, das den molekularen Energieniveau-Übergang zeigt, der von Terahertz-Strahlung 50 verursacht wird, welche aufgrund ihres niedrigen Energieniveaus das Biomolekül auf niedrigere und wünschenswertere virtuelle Zustände 54 und Schwingungszustände 56 anregt, während Raman-Streulicht 52 erzeugt wird. Indem das Anregungsniveau niedrig gehalten wird, wird Fluoreszenz 68 vermieden. Da Fluoreszenz 68 für Hintergrundrauschen in dem Signal verantwortlich ist, führt die Verwendung von Terahertz-Strahlung zu einem Signal mit verringerten Hintergrundemissionen. Eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz, die als Ergebnis der Bestrahlung eines Biomoleküls mit Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung entsteht, kann unter Verwendung von Raman-Spektroskopie festgestellt werden. 3 liefert ein Schaubild, in dem der molekulare Energiezustand gezeigt ist, der durch Absorption 70 der Terahertz-Strahlung von dem Biomolekül verursacht wird. Die Energie der Terahertz-Strahlung wird absorbiert 70, wenn das Energieniveau der Terahertz-Strahlung dem Energieniveau des Schwingungszustandes 59 entspricht.
In veranschaulichenden Beispielen wird Absorption detektiert, indem eine Verringerung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung gegenüber dem Intensitätsniveau der entsprechenden Eingangsstrahlung detektiert wird. In Beispielen, bei denen eine Verringerung des Intensitätsniveaus festgestellt wird, kann die Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung eine Zielwellenlänge oder einen Bereich von Wellenlängen umfassen, welche bekannterweise von dem ersten Molekül und/oder einem Komplex, der das erste Molekül, gebunden an ein zweites Molekül, umfasst, absorbiert werden. Es versteht sich, dass Wellenlängenabtastung durchgeführt werden kann, um Wellenlängen zu identifizieren, die von dem ersten Molekül absorbiert werden, um eine Zielwellenlänge oder einen Zielbereich von Wellenlängen zu identifizieren. Darüber hinaus kann ein Abtasten verschiedener Emissionsenergieniveaus durchgeführt werden, um ein Schwingungsniveau zu identifizieren, unter dem Raman-Transmissionen minimiert sind. In einer alternativen Ausführungsform kann eine Breitband-Terahertz-Lichtquelle in Verbindung mit einer Spektralanalysevorrichtung oder einer ähnlichen Vorrichtung verwendet werden, welche das Absorptionsspektrum über einen Wellenlängenbereich hinweg analysieren kann.
In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, welche die Detektion biomolekularer Wechselwirkungen betreffen, ist ein zweites Molekül, das bekannterweise oder höchstwahrscheinlich an das erste Molekül bindet, in der Reaktionslösung 24 vorhanden, worin es die immobilisierten ersten Moleküle 20 berührt. Alternativ kann die Reaktionslösung eine biologische Probe enthalten, von der angenommen wird, dass sie das zweite Molekül enthält, bei dem es sich um einen Analyt handeln kann. Entsprechend ist in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren bereitgestellt, um einen Analyt in einer biologischen Probe festzustellen, einschließlich: Inberührungbringen der biologischen Probe mit einem ersten Molekül, das auf einem Substrat immobilisiert ist, wobei das erste Molekül an den Analyt bindet oder angenommen wird, dass es an den Analyt bindet; Bestrahlen des ersten Moleküls mit einer Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung; und Detektieren eines Schwingungsspektrums des ersten Moleküls. Eine Verschiebung im Schwingungsspektrums oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus des Schwingungsspektrums gegenüber einem Schwingungsspektrum eines ersten Moleküls, das nicht mit dem Analyt assoziiert (associated) ist, zeigt das Vorhandensein des Analyts in der Probe an.
Wegen der bekannten Wasserabsorptionseigenschaft von Terahertz-Strahlung kann in einer Ausführungsform der Erfindung die Strahlungsquelle so angeordnet sein, dass die Eingangsstrahlung die immobilisierten Moleküle 20 von der Substratseite her trifft, wo die Strahlung durch das Substrat wandert und daher durch eine minimale Lösungstiefe wandert, um die immobilisierten Moleküle 20 zu erreichen. In bestimmten veranschaulichenden Beispielen trifft daher die Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung durch das Substrat auf das erste Molekül 20 auf. Die Strahlung wird nach dem Auftreffen auf die immobilisierten Moleküle 20 in der von einem Pfeil 30 angezeigten Richtung reflektiert oder gestreut.
Geeignete Bedingungen zum Durchführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen jede Bedingung, die zulässt, das ein erstes Molekül mit einem zweiten Molekül spezifisch wechselwirkt. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie ermöglicht, Terahertz-Strahlung zu verwenden, um biomolekulare Bindungsereignisse in wässrigen (d. h. wasserhaltigen) Proben festzustellen. Die Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur und Zusammensetzung der Reaktionslösung, können solche sein, wie sie typischerweise für die Art der analysierten biomolekularen Bindung verwendet werden. Beispielsweise können in Beispielen, bei denen das Verfahren angewandt wird, um die Bindung eines Antikörpers an einen Analyt festzustellen (d. h. ein Immunassay), typische Immunassaybedingungen verwendet werden.
In Ausführungsformen, bei denen Nukleinsäurehybridisierung festgestellt wird, können Bedingungen für Hybridisierungsreaktionen verwendet werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. Beispielsweise kann eine Hybridisierung eines ersten Nukleinsäuremoleküls mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül unter moderat stringenten oder hoch stringenten physiologischen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Ein Beispiel von progressiv ansteigenden Stringenzbedingungen, die in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, ist wie folgt: 2X SSC/0,1% SDS bei etwa Raumtemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2X SSC/0,1% SDS bei etwa Raumtemperatur (niedrig stringente Bedingungen); 0,2X SSC/0,1% SDS bei etwa 42°C (moderat stringente Bedingungen); und 0,1X SSC bei etwa 68°C (hoch stringente Bedingungen). Waschen kann unter Verwendung von nur einer dieser Bedingungen erfolgen, beispielsweise unter hoch stringenten Bedingungen, oder es kann jede der Bedingungen für beispielsweise jeweils 10 bis 15 Minuten in der oben aufgeführten Reihenfolge verwendet werden, wobei beliebige oder alle der aufgeführten Schritte wiederholt werden.
Bestimmte veranschaulichende Ausführungsformen der Erfindung sind hierin im Zusammenhang mit der Verwendung von Terahertz-Strahlung zur Feststellung von Nukleinsäurehybridisierung bereitgestellt. Es versteht sich aber, dass die hierin bereitgestellten Ausführungsformen veranschaulichende Ausführungsformen sind und der Umfang der Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen Anwendungen oder Ausführungsformen beschränkt ist.
Die hierin beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um praktisch jedes biomolekulare Bindungsereignis festzustellen, das eine Frequenzverschiebung im Schwingungsspektrum zeigt. Das biomolekulare Bindungsereignis umfasst typischerweise die spezifische Bindung eines ersten und zweiten spezifischen Bindungspaarelements, wobei mindestens eines der spezifischen Bindungspaarelemente ein Biomolekül ist. Wie hierin angezeigt, ist das erste spezifische Bindungspaarelement typischerweise ein Biomolekül mit einem Molekulargewicht von mindestens 1 kDa. Außer Nukleinsäuren umfassen die Biomoleküle auch beispielsweise einen Rezeptor und einen Liganden oder ein Antigen und einen Antikörper. In einem Aspekt ist das erste Molekül ein Protein, wie beispielsweise ein Antikörpermolekül oder ein Fragment davon, und das zweite Molekül ist ein Protein, das ein Epitop aufweist, welches von dem Antikörper erkannt wird. In einem anderen Beispiel ist das erste Molekül ein Rezeptor und das zweite Molekül ein Ligand. In einem veranschaulichenden Aspekt ist das erste oder zweite Molekül ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem anderen Molekül wechselwirkt. Entsprechend kann diese Ausführungsform verwendet werden, um die Bindung von Nukleinsäuremolekülen an ein Protein oder die Bindung eines Proteins an ein Nukleinsäuremolekül festzustellen.
Die Verwendung erster und zweiter Moleküle ist veranschaulichend. Es kann aber auch weitere Moleküle geben. Beispielsweise kann ein drittes Molekül enthalten sein, das an das erste Molekül bindet. Die Bindung des zweiten Moleküls kann das dritte Molekül in einer kompetitiven Weise verdrängen und als Ergebnis die Schwingungsfrequenz verschieben oder das Intensitätsniveau der Ausgangsstrahlung verändern.
Entsprechend kann es sich bei dem immobilisierten Biomolekül 20 um jedes Biomolekül handeln, das mit einem anderen Molekül ein spezifisches Bindungspaar ausbilden kann. Das immobilisierte Biomolekül kann beispielsweise eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Antigen, ein Antikörper, ein Rezeptor oder ein Ligand sein. Die Reaktionslösung 24 enthält freie Moleküle, die an die immobilisierten Biomoleküle 20 binden können oder nicht. Die Erfindung kann daher verwendet werden um festzustellen, ob eine Bindung, beispielsweise eine Nukleinsäurehybridisierung, stattgefunden hat, indem eine Verschiebung der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung festgestellt wird.
Als ein veranschaulichendes Beispiel, wie beispielsweise gezeigt in 1, kann Nukleinsäurehybridisierung anhand der hierin bereitgestellten Verfahren festgestellt werden. Wenn eine einzelsträngige Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz GGCAAT auf einem Substrat 22 immobilisiert und unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäureprobe inkubiert wird, wird das Schwingungsspektrum des GGCAAT-Nukleinsäuremoleküls nach Bestrahlung mit Terahertz-Strahlung beeinflusst, wenn die Nukleinsäureprobe eine Nukleinsäure enthält, die unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an GGCAAT bindet. Das Schwingungsspektrum des GGCAAT-Nukleinsäuremoleküls nach Bestrahlung mit Terahertz-Strahlung ist daher anders, wenn die Nukleinsäure ein Nukleinsäuremolekül enthält, das an GGCAAT bindet, als das Schwingungsspektrum, das für das Nukleinsäuremolekül GGCAAT in Abwesenheit eines hybridisierenden Nukleinsäuremoleküls erzeugt wird. Dieser Unterschied zeigt an, dass die Nukleinsäureprobe ein Nukleinsäuremolekül enthält, das mit GGCAAT hybridisiert, wie beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz CCGTTA. Wie in diesem Beispiel angezeigt, führt DNA-Hybridisierung typischerweise zu Veränderungen der grundsätzlichen Schwingungs- und Rotationsmodi. Als ein anderes Beispiel können die hierin beschriebenen Verfahren zur Feststellung von Analyten, wie beispielsweise Proteinanalyten, in einer Probe verwendet werden. Handelt es sich beispielsweise bei dem immobilisierten Molekül um einen Antikörper 20, zeigt eine Veränderung des Schwingungsspektrums an, dass die Reaktionslösung 24, bei der es sich in diesem Beispiel um eine Patientenserumprobe handeln kann, ein Protein enthält, dass von dem immobilisierten Antikörper festgestellt wird. Es versteht sich, dass die Erfindung auch zur Feststellung anderer Arten von Bindungsereignissen geeignet ist, vorausgesetzt, dass sie ein Biomolekül beinhalten und eine Verschiebung des Schwingungsspektrums oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus der Ausgangsstrahlung bei der Bindung bewirken.
Da die Strahlung durch das Substrat 22 wandert, besteht das Substrat 22 vorzugsweise aus einem Material (z. B. Glas), das gegenüber der verwendeten Strahlung transparent ist. Solange das Substrat 22 gegenüber der Strahlung transparent ist, gibt es keine Restriktionen hinsichtlich seiner Dicke.
Immobilisierte Biomoleküle nach der vorliegenden Erfindung können als eine einzelne Population identischer Biomoleküle oder als eine Anordnung oder ein erwünschtes Muster immobilisierter Populationen von Biomolekülen immobilisiert sein. Diese Anordnungen können beispielsweise auf Biochips immobilisiert sein, wie hierin ausführlicher erläutert ist.
Immobilisierte Anordnungen von Nukleinsäuremolekülen können beispielsweise beim Feststellen von Nukleotidsequenzinformation anhand der Sequenzierung durch Hybridisierungsreaktionen verwendet werden. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierungsreaktionen können eine oder mehrere Oligonukleotidsonden bekannter Sequenz an eine Nukleinsäurezielsequenz hybridisieren. Bindung des markierten Oliognukleotids an das Ziel zeigt das Vorhandensein einer komplementären Sequenz im Zielstrang an. Mehrere markierte Sonden können gleichzeitig an das Zielmolekül hybridisieren und gleichzeitig festgestellt werden. In alternativen Ausführungsformen können gebundene Sonden identifiziert werden, die an einzelne Zielmoleküle gebunden sind, oder alternativ dürfen mehrere Kopien eines spezifischen Zielmoleküls gleichzeitig an überlappende Sätze von Sondensequenzen binden. Einzelne Moleküle oder eine Unterpopulation davon können beispielsweise mithilfe bekannter molekularer Kombinationstechniken, gekoppelt an ein hierin beschriebenes Detektionsverfahren, gescannt werden.
Was die Reaktionslösung 24 anbelangt, ist bevorzugt, dass die Tiefe der Reaktionslösung 24 nicht viel größer ist als 100, 50, 40, 30, 25 oder 20 Mikrometer in Fällen, in denen die Strahlungsquelle Strahlung durch die Reaktionslösung überträgt, um auf das erste Molekül zu treffen. Dreißig Mikrometer ist die ungefähre Penetrationsgrenze von Terahertz-Strahlung in Wasser. Da jede Nukleotidbase eine Länge von etwa 0,3 nm aufweist, sind in einer 30 Mikrometer tiefen Lösung für Terahertz-Spektroskopie die meisten Proben eingetaucht. Jedes gut bekannte Verfahren kann verwendet werden, um die immobilisierten Moleküle 20 an ein Substrat 22 zu binden.
4 ist eine Veranschaulichung einer Ausführungsform der Erfindung, bei der Terahertz-Strahlung auf eine immobilisierte Population erster Moleküle 20 auftrifft, beispielsweise eine immobilisierte Population von Nukleinsäuremolekülen, und wobei ein Wellenleiter 40 verwendet wird, um Eingangsstrahlung zu begrenzen, um einen Anregungsbereich 26 zu erzeugen, der die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle 20 umfasst. Wie oben unter Bezugnahme auf 1 beschrieben, sind die immobilisierten Moleküle 20 in eine Reaktionslösung 24 eingetaucht. Im Gegensatz zu der in 1 gezeigten ersten Ausführungsform sind die immobilisierten Biomoleküle 20 jedoch an einem Wellenleiter 40 angebracht, durch den Strahlung wandert. Da die Eingangsstrahlung in den Wellenleiter 40 in Bezug auf das Substrat in im Wesentlichen orthogonaler Weise aus der durch den Pfeil 42 angezeigten Richtung gelangt, ist die Lösung 24 hinsichtlich der Tiefe nicht eingeschränkt. Beispielsweise kann Eingangsstrahlung in einem Winkel von 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80 oder 85° in Bezug auf den Wellenleiter 40 in den Wellenleiter gelangen. Der Wellenleiter 40 besteht typischerweise aus einem Material, das bei der Wellenlänge der verwendeten Strahlung einen hohen Brechungsindex aufweist, wodurch das Hindurchwandern des größten Teils der Strahlung innerhalb des Wellenleiters durch die interne Gesamtreflexion bewahrt bleibt. Die den Wellenleiter 40 verlassende Ausgangsstrahlung umfasst mindestens eine der Raman-Streustrahlung und der intern total reflektierten Strahlung abzüglich etwaiger Absorption. Wenn die Strahlung durch den Wellenleiter 40 wandert, erzeugt sie eine Anregungsregion 26 in der Lösung 24. Die Anregungsregion hat typischerweise eine Tiefe von zwischen 10 und 100 μm.
In bestimmten Fällen, wo die Bindung zweiter Nukleinsäuremoleküle mit ähnlicher Länge festzustellen ist, können deren Rotationsbande sehr nahe beieinander auftreten. Durch Markieren eines der Nukleinsäuremoleküle können die Rotationsbande verschoben werden, um verschiedene Bindungssignaturen zu erhalten. Nicht einschränkende Beispiele von Markern, die verwendet werden können, umfassen TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), Texas-Rot-Farbstoff (texas red dye), Phthalsäure, Terephthalsäure, Isophthalsäure, Kresylechtviolett, Kresylblauviolett, Brillantkresylblau, Paraaminobenzoesäure, Erythrosin, Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluoreszein, 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluoreszein, 5-Carboxyfluoreszein, 5-Carboxyrhodamin, 6-Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylaminophthalocyanine, Azomethine, Cyanine, Xanthine, Succinylfluoreszeine und Aminoacridin. Polyzyklische aromatische Verbindungen können im Allgemeinen als Raman-Marker fungieren, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Diese und andere Marker sind im Handel erhältlich (z. B. Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Weitere geeignete Marker umfassen Cyanid, Thiol, Chlor, Brom, Methyl, Phosphor und Schwefel. Kohlenstoffnanoröhrchen können ebenfalls als Marker geeignet sein.
Marker können direkt an den spezifischen Bindungspaarelementen befestigt sein oder können über verschiedene Linkerverbindungen befestigt sein. Raman-Marker, die reaktive Gruppen enthalten, die konzipiert sind, um mit anderen Molekülen kovalent zu reagieren, sind im Handel erhältlich (z. B. Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
In einer anderen, in 7 veranschaulichten Ausführungsform ist ein Verfahren bereitgestellt, um ein Agens zu identifizieren, das eine biomolekulare Bindung beeinflusst, einschließlich: Inberührungbringen eines ersten Moleküls 200, eines zweiten Moleküls 205 und des Agens 210 unter geeigneten Bedingungen, wobei das erste Molekül an das zweite Molekül bindet oder binden könnte und wobei das erste Molekül auf einem Träger immobilisiert ist. Das erste Molekül wird dann mit einer Gigahertz- oder Terahertz-Lichtquelle 215 bestrahlt, und es wird ein Schwingungsspektrum des ersten Moleküls detektiert 220, wobei eine Verschiebung des Schwingungsspektrums oder eine Änderung des Intensitätsniveaus des Schwingungsspektrums gegenüber einem Schwingungsspektrum eines an das zweite Molekül in Abwesenheit des Agens gebundenen ersten Moleküls das Agens als ein Agens identifiziert, das die Biomolekülbindung beeinflusst.
Das erste Molekül, das zweite Molekül und das Agens können in jeder gewünschten Reihenfolge in Berührung gebracht werden. Das Untersuchungsverfahren als solches kann verwendet werden, um Agenzien, welche eine Bindung des ersten Moleküls an das zweite Molekül kompetitiv oder nicht kompetitiv hemmen, Agenzien, die eine Bindung des ersten Moleküls an das zweite Molekül vermitteln oder verstärken können, und Agenzien, die eine Dissoziation eines spezifisch gebundenen ersten Moleküls von einem spezifischen gebundenen zweiten Molekül auslösen können, zu identifizieren. Es können geeignete Kontrollreaktionen durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Wirkung des Agens in Bezug auf das erste Molekül und das zweite Molekül spezifisch ist.
Ein Untersuchungsverfahren der Erfindung kann auch unter Verwendung von molekularem Modelling durchgeführt werden, um Kandidatenagenzien zu identifizieren. Die Nutzung eines molekularen Modellingverfahrens bietet eine praktische, kostenwirksame Möglichkeit in einer großen Population, wie beispielsweise einer kombinatorischen Bibliothek potenzieller Agenzien, solche Agenzien zu identifizieren, bei denen die Wahrscheinlichkeit am größten ist, dass sie spezifisch mit einem Biomolekül Wechselwirken, wodurch die Anzahl potenzieller Agenzien, die mit einem Assay untersucht werden müssen, reduziert wird.
Der Begriff „Testagens” oder „Testmolekül” wird hierin im weiten Sinn verwendet, um jedes Agens zu betreffen, das in einem erfindungsgemäßen Verfahren auf Agonisten- oder Antagonistenaktivität untersucht wird. Obgleich das Verfahren üblicherweise als ein Untersuchungsassay zur Identifizierung zuvor unbekannter Moleküle verwendet wird, die als Agonisten- oder Antagonistenagenzien, wie hierin beschrieben, wirken können, können die Verfahren auch verwendet werden, um zu bestätigen, dass ein Agens, von dem bekannt ist, dass es eine bestimmte Aktivität aufweist, tatsächlich Aktivität aufweist, beispielsweise bei der Standardisierung der Aktivität des Agens.
Ein Untersuchungsverfahren der Erfindung bietet den Vorteil, dass es sich an eine Analyse mit hohem Durchsatz anpassen lässt und daher verwendet werden kann, um kombinatorische Bibliotheken von Testagenzien zu untersuchen, um solche Agenzien zu identifizieren, die eine Bindung des ersten Moleküls an das zweite Molekül modulieren können. Verfahren zum Herstellen einer kombinatorischen Bibliothek von Molekülen, die hinsichtlich einer gewünschten Aktivität getestet werden können, sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise Verfahren zum Herstellen einer Phagendisplay-Bibliothek von Peptiden, bei denen es sich um eingeschränkte Peptide handeln kann (vgl. beispielsweise US-Patent Nr. 5,622,699 A ; US-Patent Nr. 5,206,347 A ; Scott and Smith, Science 249: 386–390, 1992; Markland et al., Gene 109: 13–19, 1991; von denen jedes hierin durch Bezugnahme enthalten ist); eine Peptidbibliothek ( US-Patent Nr. 5,264,563 A , das hierin durch Bezugnahme enthalten ist); eine peptidomimetische Bibliothek (Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14: 83–92, 1995) eine Nukleinsäurebibliothek (O'Connell et al., oben, 1996; Tuerk und Gold, oben, 1990; Gold et al., oben, 1995; von denen jedes hierin durch Bezugnahme enthalten ist); eine Oligosaccharid-Bibliothek (York et al., Carb. Res., 285: 99–128, 1996; Liang et al., Science, 274: 1520–1522, 1996; Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol., 376: 261–269, 1995; von denen jedes hierin durch Bezugnahme enthalten ist); eine Lipoprotein-Bibliothek (de Kruif et al., FEBS Lett., 399: 232–236, 1996, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist); eine Glykoprotein- oder Glykolipid-Bibliothek (Karaoglu et al., J. Cell Biol., 130: 567–577, 1995, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist); oder eine chemische Bibliothek, die beispielsweise Wirkstoffe oder andere pharmazeutische Agenzien enthält (Gordon et al., J. Med. Chem., 37: 1385–1401, 1994; Ecker and Crooke, Bio/Technology, 13: 351–360, 1995; von denen jedes hierin durch Bezugnahme enthalten ist).
In einer anderen Ausführungsform ist eine Terahertz/Gigahertz-Detektionseinheitsvorrichtung 100 zum Feststellen eines biomolekularen Bindungsereignisses bereitgestellt. Die Vorrichtung 100 umfasst eine Terahertz-Lichtquelle bzw. eine Terahertz-Strahlungsquelle 112, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung 10, 42 auf die Probe 120 und einen Detektor 116 zu richten, um eine Ausgangsstrahlung 30, 46 zu erhalten, welche von der Probe 120 reflektiert. Es ist auch ein Prozessor 118 bereitgestellt, um die Daten 117 von dem Detektor 116 zu empfangen und die Daten zu analysieren. In manchen Ausführungsformen befinden sich die Lichtquelle 112, der Detektor 116 und der Prozessor 118 in einem Gehäuse 124. Zwischen der Lichtquelle 112 und der Probe 120 kann auch ein Filter 114 positioniert sein, um eine vorbestimmte Bandbreite des von der Lichtquelle emittierten Lichtstrahls 113 auszuwählen. Es kann auch gegebenenfalls eine Probenhalterung 122 bereitgestellt sein, um die Probe 120 während der Untersuchung zu positionieren und/oder in der richtigen Position zu halten. In manchen Ausführungsformen kann das Substrat Teil der Probenhalterung sein. In anderen Ausführungsformen kann der Wellenleiter Teil der Probenhalterung sein. In weiteren Ausführungsformen sichert die Probenhalterung die Probe in einem bevorzugten Abstand und/oder einer bevorzugten Ausrichtung zu der Lichtquelle und dem Detektor. In anderen Ausführungsformen können die Lichtquelle und/oder der Detektor zu einer bevorzugten Ausrichtung gedreht, ausgerichtet oder eingestellt sein.
In einer anderen Ausführungsform ist hierin ein System 150 zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses bereitgestellt, einschließlich einer Probe 120, die ein erstes Molekül und ein zweites Molekül enthält, wobei das erste Molekül an das zweite Molekül bindet oder binden könnte; einer Terahertz- oder Gigahertz-Strahlungsquelle 112, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung 10, 42 auf die Probe 120 zu richten; und eines Detektors 116 zum Empfangen einer Ausgangsstrahlung 30, 46, die von der Probe reflektiert. In bestimmten veranschaulichenden Beispielen umfasst das System 150 des Weiteren ein Substrat 22, das gegenüber der Terahertz- oder Gigahertz-Strahlung transparent ist, wobei das erste Molekül auf dem Substrat 22 immobilisiert ist.
Das System umfasst typischerweise eine Reaktionskammer neben dem Substrat, um mindestens eines der Biomoleküle und die Reaktionslösung zu enthalten. Die Reaktionslösung kann eine organische Lösung sein, ist aber typischerweise eine wässrige Lösung, die daher Wasser enthält. Das System kann auch einen Wellenleiter 40 umfassen, wie in 4 veranschaulicht. Das Substrat 22 kann eine Fläche eines Wellenleiters 40 sein. Das System kann auch Beugungsgitter aufweisen, weist aber typischerweise höchstens ein Beugungsgitter auf, das zwischen der Probe und dem Detektor positioniert ist.
Systeme 150 der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine Terahertz/Gigahertz-Detektionseinheit 100. Die Terahertz/Gigahertz-Detektionseinheit 100 umfasst eine Terahertz und/oder Gigahertz-Strahlungsquelle 112 und einen Detektor 116, bei dem es sich um einen wellenlängenselektiven Detektor handeln kann. Die Anregungsquelle 112 bestrahlt ein immobilisiertes Biomolekül und gegebenenfalls ein mit dem ersten Molekül assoziiertes (associated) zweites Molekül in einer Probe 120 mit einem Anregungsstrahl 10, 42. Der Anregungsstrahl 10, 42 tritt mit dem ersten Molekül in Wechselwirkung, was zu der Anregung von Elektronen auf einen höheren Energiezustand führt. Wenn die Elektronen auf einen niedrigeren Energiezustand zurückkehren, senden sie ein Raman-Emissionssignal aus, das von dem Raman-Detektor festgestellt wird. In anderen Ausführungsformen, wie hierin erörtert, wird Absorption der Gigahertz- und/oder Terahertz-Strahlung von dem ersten Molekül festgestellt. Es kann praktisch jede Art von Terahertz- und/oder Gigahertz-Quelle verwendet werden, um für die Systeme 150, Vorrichtung 100 und Verfahren der vorliegenden Erfindung Terahertz- und/oder Gigahertz-Strahlung zu erzeugen. Beispielsweise kann Terahertz-Strahlung mit einem Femtosekunden-Laser erzeugt werden, der in einen elektro-optischen Kristall, wie beispielsweise einen Zinkblendekristall (z. B. Zink-Tellurid-Kristall, Galliumarsenidkristall), gerichtet wird. In einem anderen Ansatz kann eine photokonduktive Dipolantenne verwendet werden (Lai et al., App. Phys. Lett. 72: 3100 (1998)). In einer anderen Ausführungsform kann Terahertz-Strahlung erhalten werden, indem mehrere Emissionen von Diodenlasern im nahen Infrarotbereich gemischt werden (NASA Jet Propulsion Laboratory, Pasadena, CA, USA., berichtet in NASA TechBriefs, Oktober 2000). Darüber hinaus kann ein Terahertz- oder Gigahertz-Transistor verwendet werden, wie beispielsweise die in einem Rechnerprozessor, beispielsweise einem Pentium^®-Prozessor, verwendeten Transistoren.
Detektoren zum Feststellen von Strahlung im Terahertz/Gigahertz-Frequenzbereich sind bekannt (siehe z. B. J. Applied Phys. 93, 1897 (2003)). In einem anderen Ansatz können Gegenstände in Nanogröße (z. B. Quantenpunkte, Nanodrähte und Nanokanäle) verwendet werden, um Terahertz/Gigahertz-Strahlung festzustellen (Xing and Liu, Semicon. Sci. Technol. 10: 1139 (1995)). Darüber hinaus kann die Feststellung reflektierter Terahertz-Strahlung erreicht werden, indem ein elektrooptischer Kristall und eine Photodiode verwendet werden. In diesem Fall kann der Detektor einen elektrooptischen Kristall umfassen, der als Reaktion auf Terahertz-Strahlung seine optischen Eigenschaften derart ändert, dass Laserstrahlung, die auf die Photodiode gerichtet ist, die Terahertz-Strahlung aufzeigt. Die optische Eigenschaft kann die Polarisierung umfassen, die von Laserstrahlung erfahren wird, welche den Kristall durchläuft.
Daten können von einem Detektor 116 erfasst und an ein Daten verarbeitendes System und Steuersystem 118 geliefert werden. Das Daten verarbeitende System und Steuersystem 118 kann aus dem Stand der Technik bekannte Standardverfahren durchführen, beispielsweise die Subtraktion von Hintergrundsignalen. Darüber hinaus kann das Daten verarbeitende System und Steuersystem 118 die Daten analysieren, um Nukleotidsequenzinformationen aus detektierten Signalen und den zeitlichen Zusammenhang dieser Signale zu bestimmen.
Wie oben angegeben, ist das erste Molekül in bestimmten Aspekten der Erfindung auf einem Immobilisierungssubstrat immobilisiert. Die Art des für die Immobilisierung des ersten Moleküls zu verwendenden Substrates ist nicht einschränkend, solange es für die Immobilisierung eines ersten Moleküls wirksam ist, während es dem ersten Molekül Zugang zu dem zweiten Molekül verschafft und in bestimmten Beispielen zulässt, dass Terahertz- und/oder Gigahertzstrahlung hindurchgelangt. In veranschaulichenden Beispielen ist das Substrat transparent. Nicht einschränkende Beispiele von Oberflächen, die verwendet werden können, umfassen Glas, Silizium, Germanium, Galliumarsenid, Quarz (silica), Silicat, Siliziumoxinitrid, Nitrozellulose, Nylon, aktiviertes Quarz, aktiviertes Glas, Polyvinylidendifluorid (PVDF), Polystyrol, Polyacrylamid, sonstige Polymere wie Poly(vinylchlorid), Poly(methylmethacrylat) oder Poly(dimethylsiloxan) und Photopolymere, die photoreaktive Arten wie beispielsweise Nitrene, Carbene und Ketylradikale enthalten. Verschiedene Verfahren zum Anbringen spezifischer Bindungspaarelemente auf Oberflächen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können angewandt werden. Beispielsweise können Vernetzungsmittel (crosslinking-agents) verwendet werden. Darüber hinaus können funktionelle Gruppen kovalent an Vernetzungsmittel gebunden werden, so dass Bindungswechselwirkungen zwischen Biomolekülen ohne sterische Behinderung (steric hindrance) stattfinden können. Typische Vernetzungsgruppen umfassen Ethylenglykololigomere und Diamine. Bei der Bindung kann es sich im eine kovalente oder eine nicht-kovalente Bindung handeln. Die Vernetzungsgruppen zum Anbringen von Biomolekülen an Immobilisierungsoberflächen werden als Immobilisierungsgruppen bezeichnet.
Als ein weiteres spezifisches Beispiel kann eine Immobilisierung erreicht werden, indem eine Oberfläche mit Streptavidin oder Avidin beschichtet und anschließend ein biotinyliertes erstes Molekül angebracht wird, wie beispielsweise ein biotinylierter Antikörper (siehe Holmstrom et al., Anal. Biochem. 209: 278–283, 1993 für Verfahren unter Verwendung von Nukleinsäuren). Immobilisierung kann das Beschichten einer Silizium-, Glas- oder anderen Oberfläche mit Poly-L-Lys (Lysin) umfassen. Durch die Verwendung von Aminosilan zur Vernetzung können Aminreste auf eine Oberfläche aufgebracht werden.
Das erste Molekül kann an Glas gebunden werden, indem zunächst die Glasfläche silanisiert und anschließend mit Carbodiimid oder Glutaraldeyhd aktiviert wird. Alternative Verfahren können Reagenzien wie beispielsweise 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOP) oder Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) verwenden. Bestimmte spezifische Bindungspaarelemente können mit ultravioletter Strahlung direkt an Membranflächen gebunden werden.
Zum Anbringen eines Biomoleküls an einer Fläche können bifunktionelle Vernetzungsreagenzien verwendet werden. Die bifunktionellen Vernetzungsreagenzien können nach der Spezifität (specifity) ihrer funktionellen Gruppen eingeteilt werden, z. B. amino-, guanidino-, indol- oder carboxylspezifische Gruppen. Von diesen sind aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit, Einfachheit der Synthese und den milden Reaktionsbedingungen, unter denen sie eingesetzt werden können, Reagenzien beliebt, die auf freie Aminogruppen abzielen. Beispielhafte Verfahren zum Vernetzen von Molekülen sind in US-Patent Nummern 5,603,872 und 5,401,511 beschrieben. Vernetzungsreagenzien umfassen Glutaraldehyd (GAD), bifunktionelles Oxiran (OXR), Ethylenglycoldiglycidylether (EGDE) und Carbodiimide wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC).
In manchen Ausführungsformen der Erfindung kann ein hierin beschriebenes Verfahren in einem mikroelektromechanischen System (MEMS) 300 ausgeführt werden, veranschaulicht in 7. MEMS 300 sind integrierte Systeme, die mechanische Elemente, Sensoren, Aktuatoren und Elektroniken enthalten. Alle diese Komponenten können mit bekannten Mikrofabrikationstechniken auf einem üblichen Chip hergestellt werden, einschließlich eines siliziumbasierten oder äquivalenten Substrats (z. B. Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1: 401–425, 1999). Die Sensorkomponenten von MEMS können verwendet werden, um mechanische, thermische, biologische, chemische, optische und/oder magnetische Phänomene zu messen. Die Elektronik kann die Informationen von den Sensoren verarbeiten und Aktuatorkomponenten wie Pumpen, Ventile, Heizelemente, Kühlelemente, Filter etc. steuern, wodurch die Funktion des MEMS gesteuert wird.
Die Elektronikkomponenten des MEMS können mithilfe integrierter Schaltkreis(IC)-Prozesse (z. B. CMOS-, Bipolar- oder BICMOS-Prozesse) gefertigt werden. Sie können mittels Photolithografie- und Ätzverfahren strukturiert werden, die für die Herstellung von Rechnerchips bekannt sind. Die mikromechanischen Komponenten können mithilfe kompatibler „Mikrobearbeitungs”-Prozesse gefertigt werden, die Teile des Silizium-Wafers selektiv wegätzen oder neue Strukturschichten hinzufügen, um die mechanischen und/oder elektromechanischen Komponenten zu bilden.
Basistechniken der MEMS-Fertigung umfassen das Aufbringen dünner Materialfilme auf einem Substrat, Auftragen einer gemusterten Maske auf die Filme durch photolithografisches Imaging oder andere bekannte lithografische Verfahren und selektives Ätzen der Filme. Ein dünner Film kann eine Dicke im Bereich einiger weniger Nanometer bis 100 Mikrometer aufweisen. Geeignete Aufbringungstechniken können chemische Verfahren wie chemische Dampfphasenabscheidung (CVD), Elektroabscheidung, Epitaxie und thermische Oxidation und physikalische Verfahren wie physikalische Dampfphasenabscheidung (PVD) und Gießen (casting) umfassen.
In manchen Ausführungsformen der Erfindung umfassen MEMS-Vorrichtungen 300 verschiedene flüssigkeitsgefüllte Kammern (compartments) 305, wie beispielsweise Mikrofluidikkanäle, Nanokanäle und/oder Mikrokanäle. In einer Ausführungsform können Systeme 5 und 105 als MEMS-Vorrichtung konstruiert werden, wie in 8 gezeigt ist. Diese und andere Komponenten der Vorrichtung können als eine Einheit ausgebildet sein, beispielsweise in Form eines Chips, wie in Halbleiterchips und/oder Mikrokapillar- oder Mikrofluidikchips bekannt. Alternativ kann ein Immobilisierungssubstrat, wie beispielsweise ein metallbeschichtetes poröses Siliziumsubstrat, von einem Siliziumwafer entfernt und auf anderen Komponenten einer Vorrichtung angebracht werden. In der beschriebenen Vorrichtung können alle Materialien, die bekanntermaßen für die Anwendung in solchen Chips geeignet sind, verwendet werden, einschließlich Silizium, Siliziumdioxid, Siliziumnitrid, Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Kunststoff, Glas, Quarz.
Techniken zur Mengenfertigung von Chips sind auf den Gebieten der Rechnerchipherstellung und/oder Mikrokapillarchipherstellung gut bekannt. Solche Chips können durch jedes aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Photolithographie und Ätzen, Laserablation, Spritzgießen, Gießen, Molekularstrahlepitaxie, Dip-Pen-Nanolithografie, Fertigung durch chemische Dampfphasenabscheidung (CVD), Elektronenstrahl- oder fokussierte Ionenstrahltechnologie oder Prägungstechniken. Nicht einschränkende Beispiele umfassen herkömmliches Formen mit einem fließbaren, optisch klaren Material wie beispielsweise Kunststoff oder Glas, Photolithografie und Trockenätzen von Siliziumdioxid, Elektronenstrahllithografie unter Verwendung eines Polymethylmethacrylatlacks, um eine Aluminiummaske auf ein Siliziumdioxidsubstrat zu übertragen, gefolgt von einem RIE-Prozess (Reactive Ion Etching). Bekannte Verfahren zur Herstellung nanoelektromechanischer Systeme können für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden (siehe z. B. Craighead, Science 290: 1532–36, 2000). Verschiedene Formen mikrogefertigter Chips sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA, USA) und ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA, USA).
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die Vorrichtung teilweise oder ganz transparent für Terahertz- und/oder Gigahertzstrahlung ausgewählt werden, beispielsweise Glas, Silizium, Quarz oder ein beliebiges anderes optisch klares Material. Für flüssigkeitsgefüllte Kammern, die verschiedenen Biomolekülen ausgesetzt sein können, wie beispielsweise Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Nukleotiden und dergleichen, können die solchen Molekülen ausgesetzten Flächen durch Beschichtung modifiziert werden, beispielsweise, um eine Fläche von einer hydrophoben in eine hydrophile Fläche zu verwandeln und/oder um die Adsorption von Molekülen an eine Fläche zu verringern. Eine Flächenmodifizierung gängiger Chipmaterialien, wie beispielsweise Glas, Silizium, Quarz und/oder PDMS, ist aus dem Stand der Technik bekannt (z. B. US-Patent Nr. 6,263,286 ). Solche Modifikationen können eine Beschichtung mit kommerziell erhältlichen Kapillarbeschichtungen (Supelco, Bellafonte, PA, USA), Silane mit verschiedenen funktionellen Gruppen wie beispielsweise Polyethylenoxid oder Acrylamid oder jede andere beliebige aus dem Stand der Technik bekannte Beschichtung umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Erfindung ist zwar unter Bezugnahme auf die obigen Beispiele beschrieben, aber es versteht sich, dass Modifikationen und Variationen in der Idee und dem Umfang der Erfindung enthalten sind. Entsprechend ist die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.

Claims

Verfahren zum Detektieren einer biomolekularen Wechselwirkung, umfassend: – Inberührungbringen eines ersten Moleküls mit einem zweiten Molekül, wobei das erste Molekül ein Biomolekül ist, von dem vermutet wird, dass es an das zweite Molekül bindet; – Bestrahlen des ersten Moleküls mit Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung; und – Detektieren einer Ausgangsstrahlung, wobei eine Verschiebung in der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung im Intensitätsniveau der Ausgangsstrahlung gegenüber der von einem nicht an das zweite Molekül gebundenen ersten Molekül detektierten Ausgangsstrahlung eine biomolekulare Wechselwirkung anzeigt, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Molekül auf einem Substrat immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung durch das Substrat auf das erste Molekül trifft.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem ersten Molekül und/oder dem zweiten Molekül um eine menschliche Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem ersten Molekül und/oder dem zweiten Molekül um eine bakterielle Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem ersten Molekül und/oder dem zweiten Molekül um eine virale Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten Molekül um einen Rezeptor und bei dem zweiten Molekül um einen Liganden handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Protein und bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein verringertes Intensitätsniveau festgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Gigahertz- oder Terahertz-Strahlung einen Wellenlängenzielbereich umfasst, von dem bekannt ist, dass er von dem ersten Molekül absorbiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Eingangsstrahlung durch einen Wellenleiter geleitet wird, der nahe dem ersten Molekül positioniert ist, indem die Eingangsstrahlung von einer Innenwand des Wellenleiters reflektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Eingangsstrahlung eine Bandbreite zwischen 0,1 und 10 Terahertz hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verschiebung der Schwingungsfrequenz durch Detektieren mittels Raman-Spektroskopie detektiert wird.
Verfahren zum Detektieren eines Biomoleküls, umfassend: a) Bestrahlen des Biomoleküls mit einer Gigahertz- oder Terahertz Eingangsstrahlung und b) Detektieren einer Ausgangsstrahlung, wobei eine Verschiebung in der Schwingungsfrequenz der Ausgangsstrahlung gegenüber der Eingangsstrahlung oder eine Veränderung im Intensitätsniveau der Ausgangsstrahlung gegenüber von einer das Molekül nicht umfassenden Kontrollprobe detektierten Ausgangsstrahlung das Vorhandensein des Moleküls anzeigt, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch A, wobei zur Detektion der Ausgangsstrahlung Raman-Spektroskopie verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biomolekül ein Molekulargewicht von mindestens 1 Kilodalton aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biomolekül ein Molekulargewicht von mindestens 10 Kilodalton aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Biomolekül um ein Nukleinsäuremolekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Biomolekül um ein Protein handelt.
Verfahren zum Detektieren eines Analyten in einer biologischen Probe, umfassend: a) Inberührungbringen der biologischen Probe mit einem ersten Molekül, das auf einem Substrat immobilisiert ist, wobei von dem ersten Molekül vermutet wird, dass es den Analyten bindet; b) Bestrahlen des ersten Moleküls mit Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung; und c) Detektieren eines Schwingungsspektrums des ersten Moleküls, wobei eine Verschiebung im Schwingungsspektrum oder eine Verringerung in einem Intensitätsniveau des Schwingungsspektrums gegenüber dem Schwingungsspektrum eines ersten Moleküls, das nicht mit dem Analyten assoziiert ist, das Vorhandensein des Analyten in der Probe anzeigt, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die biologische Probe aus Blut, Urin, Speichel, Gewebe, Ejakulat, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Sputum, Stuhl oder einer Biopsieprobe stammt.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das eine biomolekulare Bindung beeinflusst, umfassend: a) Inberührungbringen eines ersten Moleküls, eines zweiten Moleküls und des Agens, wobei das erste Molekül an das zweite Molekül bindet; b) Bestrahlen des ersten Moleküls mit einer Gigahertz- oder Terahertz-Lichtquelle; und c) Detektieren eines Schwingungsspektrums des ersten Moleküls, wobei eine Verschiebung im Schwingungsspektrum oder eine Veränderung des Intensitätsniveaus des Schwingungsspektrums gegenüber einem Schwingungsspektrum eines ersten Moleküls, das in Abwesenheit des Agens an das zweite Molekül gebunden ist, das Agens identifiziert, welches die Molekülbindung beeinflusst, und wobei die Strahlung von einer Breitbaud-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Nukleinsäuremolekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Protein um einen Antikörper handelt.
Verfahren zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses, wobei das Verfahren umfasst: a) Präparieren einer Probe, umfassend ein erstes Molekül und ein zweites Molekül; b) Richten einer Gigahertz- oder Terahertz-Eingangsstrahlung auf die Probe, wodurch die Eingangsstrahlung die Probe anregt, ohne Fluoreszenz zu verursachen; und c) Detektieren einer Ausgangsstrahlung, die von der Probe ausgeht, wobei eine Verschiebung in der Schwingungsfrequenz oder eine Veränderung im Intensitätsniveau der Ausgangsstrahlung im Vergleich zu der für ein nicht an das zweite Molekül gebundenes erstes Molekül detektierten Ausgangsstrahlung eine biomolekulare Wechselwirkung anzeigt, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
System zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses, wobei das System umfasst: a) eine Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfasst, wobei von dem ersten Molekül vermutet wird, dass es an das zweite Molekül bindet; b) eine Terahertz- oder Gigahertz-Strahlungsquelle, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung auf die Probe zu richten, und c) einen Detektor zum Empfangen einer von der Probe reflektierten Ausgangsstrahlung.
System nach Anspruch 30, wobei das System des Weiteren ein Substrat aufweist, das für die Terahertz-Strahlung transparent ist, wobei das erste Molekül auf dem Substrat immobilisiert ist.
System nach Anspruch 31, des Weiteren umfassend eine Reaktionskammer nahe dem Substrat.
System nach Anspruch 32, wobei eine Lösung in dem Aufnahmebehälter das zweite Molekül umfasst.
System nach Anspruch 33, wobei die Lösung Wasser umfasst.
System nach Anspruch 31, wobei das Substrat eine Oberfläche eines Wellenleiters ist.
System nach Anspruch 30, des Weiteren umfassend nicht mehr als ein Beugungsgitter, das zwischen der Probe und dem Detektor positioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem ersten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem ersten Molekül um einen Rezeptor und bei dem zweiten Molekül um einen Liganden handelt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Protein und bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Vorrichtung zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses in einer Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfasst, wobei vermutet wird, dass das erste Molekül das zweite Molekül bindet, umfassend: eine Terahertz-Strahlungsquelle, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung auf die Probe zu richten, und einen Detektor, der zum Empfangen einer von der Probe reflektierten Ausgangsstrahlung positioniert ist, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt ist und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 42, des Weiteren umfassend ein Datenverarbeitungs- und Steuersystem in Kommunikation mit dem Detektor.
Vorrichtung nach Anspruch 43, wobei das Datenverarbeitungs- und Steuersystem dazu eingerichtet ist, die von dem Detektor empfangenen Daten zu analysieren.
Vorrichtung nach Anspruch 42, des Weiteren umfassend eine Probenhalterung.
Vorrichtung nach Anspruch 45, wobei die Probenhalterung ein Substrat umfasst, das für die Terahertz-Strahlung transparent ist, wobei das erste Molekül auf dem Substrat immobilisiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 46, des Weiteren umfassend eine Reaktionskammer nahe dem Substrat, wobei eine Lösung in der Reaktionskammer das zweite Molekül enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 46, wobei das Substrat einen Wellenleiter mit einem Eingangsabschnitt und einem Ausgangsabschnitt umfasst, wobei das erste Molekül auf dem Wellenleiter immobilisiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 48, wobei die Terahertz-Strahlungsquelle positioniert ist, um die Eingangsstrahlung auf den Eingangsabschnitt des Wellenleiters zu richten, und der Detektor positioniert ist, um die Ausgangsstrahlung von dem Ausgangsabschnitt des Wellenleiters zu empfangen.
Vorrichtung nach Anspruch 42, des Weiteren umfassend einen Filter, um eine Strahlung mit einer vorbestimmten Bandbreite auszuwählen, die von der Terahertz-Strahlungsquelle abgegeben wird.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Terahertz-Strahlungsquelle eine Bandbreite zwischen 0,001 und 1000 THz aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem ersten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um eine Nukleinsäure handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem ersten Molekül um einen Rezeptor und bei dem zweiten Molekül um einen Liganden handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem ersten Molekül um ein Protein und bei dem zweiten Molekül um ein Protein handelt.
Mikroelektromechanisches System (MEMS) zum Detektieren eines biomolekularen Bindungsereignisses in einer Probe, welche ein erstes Molekül und ein zweites Molekül umfasst, wobei vermutet wird, dass das erste Molekül das zweite Molekül bindet, umfassend: eine oder mehrere Fluidkammern für die Probe; eine Gigahertz- oder Terahertz-Strahlungsquelle, die positioniert ist, um eine Eingangsstrahlung auf die Probe zu richten; und einen Detektor, der positioniert ist, um eine von der Probe reflektierte Ausgangsstrahlung zu empfangen, und wobei die Strahlung von einer Breitband-Lichtquelle zugeführt und mit einem Spektrum-Analysator analysiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 57, des Weiteren umfassend ein Datenverarbeitungs- und Steuersystem in Kommunikation mit dem Detektor.
Vorrichtung nach Anspruch 58, wobei die Fluidkammer ein Substrat umfasst, das für die Terahertz-Strahlung transparent ist, wobei das erste Molekül auf dem Substrat immobilisiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 59, wobei das Substrat einen Wellenleiter mit einem Eingangsabschnitt und einem Ausgangsabschnitt umfasst, wobei das erste Molekül auf dem Wellenleiter immobilisiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 60, wobei die Strahlungsquelle positioniert ist, um die Eingangsstrahlung auf den Eingangsabschnitt des Wellenleiters zu richten, und der Detektor positioniert ist, um die Ausgangsstrahlung von dem Ausgangsabschnitt des Wellenleiters zu empfangen.
Vorrichtung nach Anspruch 57, des Weiteren umfassend einen Filter, um eine Strahlung mit vorbestimmter Bandbreite auszuwählen, die von der Strahlungsquelle abgegeben wird.