DE1770204B1

DE1770204B1 - Adriamycin und dessen Salze mit pharmakologisch vertraeglichen anorganischen und organischen Saeuren sowie diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE1770204B1
Application number: DE19681770204
Authority: DE
Inventors: Federico Arcamone; Giuseppe Cassinelli; Marcello Gaetani; Aurelio Di Marco
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1967-04-18
Filing date: 1968-04-13
Publication date: 1971-12-23
Also published as: US3590028A; YU33730B; FR1583289A; AT276630B; DK118652B; NO124883B; GB1161278A; ES352842A1; SE333126B; IL29813A0; FR7406M; NL6804925A; IL29813A; CH496091A; SU378026A3; BE713773A; YU71568A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Adriamycin und dessen Salze mit pharmakologisch verträglichen anorganischen und organischen Säuren sowie auf diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen. Sie sind neue antibiotische Substanzen, die in der Therapie insbesondere als Antitumorprodukte von Nutzen sind. Adriamycin wird auch als Antibiotikum »B-106 F.I.« bezeichnet.

Adriamycin wird unter Anwendung eines neuen Mikroorganismus, der durch Mutation aus dem bekannten Stamm Streptomyces peucetius, der in der britischen Patentschrift 1 003 383 und in Giorn. Microbiol., Bd. 11, 1963, S. 109 bis 118, beschrieben worden ist, biosynthetisch hergestellt. Der neue Stamm ist unter der Bezeichnung F.I. 106 in der mikrobiologischen Sammlung von Farmitalia hinterlegt. Er wird Streptomyces peucetius var. caesius genannt. Er ist ferner bei dem Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surry (England) mit der Indexnummer I.M.I. 131 502 und bei dem Institute of Microbiology of the Rutger University (U.S.A.) mit der Indexnummer I. M. R. U. 3920 hinterlegt.

Der neue Mikroorganismus hat folgende mikroskopische, makroskopische und biochemische Eigenschaften:

Mikroskopische Eigenschaften

Das vegetative Mycel auf den üblichen Kulturmedien zeigt dünne Hyphen (0,5 bis 0,9 μ dick), die mehr oder weniger lang und verzweigt sind. Die Verzweigungen bilden dickere Hyphen (1,1 bis 1,6 μ dick), die Conidiophoren sind oft in büschelförmigen Formen, die in Haken enden, gesammelt. Die Conidien sind sphärisch mit einem Durchmesser zwischen 1,8 und 3,3 μ, zuerst in kleinen Ketten angeordnet, dann frei.

Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Conidien nahezu sphärisch, mit unregelmäßigen Rändern und warziger Oberfläche.

Makroskopische Eigenschaften

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften festgehalten, die an den angezeigten Medien festgestellt wurden, in denen der Mikroorganismus bei 28° C gezogen wurde, wobei die Beobachtungen am 3., 8., 15., 21. und 30. Tag nach der Beimpfung vorgenomir η wurden.

Biochemische Eigenschaften Gelatine: langsame und teilweise Hydrolyse. Nitrate: keine Reduktion zu Nitriten. Produktion von Schwefelwasserstoff: positiv. Milch: keine Peptonisierung; keine Koagulation. f Stärke: sehr langsame und schwache Hydrolyse.

Maltose, Xylose, Mannose, Mannit, Glycerin, Glucose, Saccharose, Trehalose, Raffmose, Fructose werden als Nährmedium angewandt.

Lactose, Adonitol, Ramnose, Sorbit, Arabinose, Esculin und Mesoinosit werden als Nährmedium nicht verwendet.

Antibiotika: Er erzeugt Substanzen mit antiobiotischer und antitumoraler Aktivität.

Klassifizierung des Mutanten »F.I. 106«

Der Mutant F.I. 106 hat die folgenden taxonome Stellung: Im Klassifizierungssystem von Pridham u. a. (Appl. Microbiol., Bd. 6, 1958, S. 52) gehört der Mikroorganismus zur Gruppe Retinaculum apertum, Reihe RED. Im Klassifizierungssystem von B a 1 d a c c i (Giorn. Microbiol., Bd. 6, 1958, S. 10) gehört der Mikroorganismus zur Reihe Albosporeus und schließlich im System von W a k s m a η (The Actinomycetes, Bd. Π, 1961, S. 129) zur Reihe Ruber.

Ein Vergleich zwischen den Merkmalen des Mikroorganismus und denen der Arten, die zu den zitierten systematischen Gruppen (Taxa) gehören, zeigt, daß keine derselben Eigenschaften aufweist, die denen des zur Prüfung stehenden Mikroorganismus entsprechen.

In Tabelle II sind diese Vergleichsdaten angegeben. In der Tabelle wurden S. cinereoruber, S. cinereoruber var. fructo-fermentans, S. caespitosus und S. antibioticus hinzugefügt, auch wenn sie nicht Teil der oben angegebenen Gruppen sind. Ebenso sind die Unterschiede zu den Arten angeführt, von der Art des Adriamycins die keine Substanzen erzeugen.

Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus unterscheidet sich von der Art S. albosporeus (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 171), weil diese keine löslichen Pigmente erzeugt, Nitrate reduziert und kein H₂S erzeugt; von S. cinnamomensis (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 195) und von S. fradiae (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 211) in der Farbe des vegetativen Mycels und Luftmycels; von der Art S. ruber (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 271), weil letzterer die Milch koaguliert, keine löslichen Pigmente und kein H₂S erzeugt. Er unterscheidet sich von S. rubescens (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 271) in der Farbe des Luftmycels und weil S. rubescens keine löslichen Pigmente bildet

" und keinen Schwefelwasserstoff erzeugt; von S. oidiosporus (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 251), weil letzterer Nitrate nicht reduziert und Milch nicht peptonisiert. überdies erzeugt

S. oidiosporus keine löslichen Pigmente.

Daraus folgt, daß der Mutant »F.I. 106« von S. peucetius sich von allen Arten unterscheidet, die ähnliche Substanzen erzeugen und allgemeiner sich von allen Arten unterscheidet, die den systematischen subgenerischen Gruppen angehören, denen der Stamm selbst angehört. Insbesondere.unterscheidet sich der Stamm »F.I. 106« vom Mutterstamm S. peucetius, der Daunomycin erzeugt (britische Patentschrift 1 003 383), da er ein vegetatives Mycel, das intensiver rot gefärbt ist, und ein Luftmycel, das manchmal eine blaugrüntürkise Tönung annimmt, bildet und schließlich das Antibiotikum Adriamycin erzeugt, das eine andere Struktur als Daunomycin besitzt.

3 4

Tabelle I

Kultureigenschaften des Mutanten »F. I. 106« von S. peucetius

Medien	Wachstum	Luftmycel	Vegetatives Mycel	Lösliche Pigmente
Agar Malzhefe extrakt (gemäß Hesseltine u.a.*) 1954)	kleine zusammen fließende Kolo nien mit runze ligen Falten, hart, abgehoben reichlich	sehr spärlich, glatt, blaßrosa gefärbt, keine Spiralen und Wirbel	reichlich, gelblich, dann gelbrötlich	intensiv, zuerst Gelbrot, dann Braunrot
Bennet-Agar	spärlich, einzelne gelbliche kleine Kolonien	keines	spärlich, zuerst gelblich, dann Orange	keine
Emerson-Agar	mäßig, kleine zusammen fließende Kolonien	keines	mäßig, zuerst Blaß rosa, dann rötlich	Rötlich-klar Braun
Kartoffel-Agar (gemäß Hesseltine u. a.*) 1954)	reichlich in glatter regelmäßiger Patina	reichlich, zuerst Rosa, dann schwach Blau grüntürkis. Hyphen mit hakenförmigen Enden und dann kugelförmigen Enden	reichlich, fleisch farben. Harte glatte Patina	intensiv, zuerst gelbrötlich, dann von stark Orange bis Hellrot
Agar Pepton + KNO₃	reichlich, in zu sammenfließen den kleinen Kolonien	keines	reichlich, farblos	keine
Agar Czapeck	reichlich, in zu sammenfließen den kleinen Kolonien	spärlich, zuerst Schmutzigweiß, dann schwach Blaugrüntürkis, schwach wattig, Hyphen mit hakenförmigen Enden oder kugelförmigen Enden	reichlich, schwach rosa gefärbt	keine
Asparagin-Glucose- Agar	spärlich, in iso lierten kleinen Kolonien	spärlich, weißlich- rosa. Sehr ge brochenes Mycel, kurz ohne apikale Haken	spärlich, farblos	keine
Glycerin-Glycin- Agar	reichlich, in glatter harter Patina	keines	reichlich, von Gelb bis Orange	keine
Stärke-Agar	spärlich, in einzelnen kleinen Kolonien	keines	spärlich, farblos dann gelblichrosa	keine
Gelatine	mäßig, an der Oberfläche	keines	mäßig, farblos bis gelblich	reichlich, Braun bis bis Tiefschwarz
Milch	spärlich	keines	spärlich, ring förmige Ober fläche, lachsrosa gefärbt	spärlich, Rosa

·) Hesseltine u. a., Ann. N. Y. Acad. Sei., Bd. 60, S. 136 bis 151 (1954).

5

Tabelle II

Vergleich zwischen dem Mutanten »F. I. 106« von S. peucetius und Arten, die Substanzen ähnlich dem

Antibiotikum Adriamycin erzeugen

	Mutant »F. I. 106«	S. purpurescens	S. bobiliae	+	S. cienereoruber	S. ceruleorubidus
Sporophoren	gerade oder	spiralenförmig	spiralenförmig		gerade oder	doppelt ge
	hakenförmig			+	hakenförmig	quirlt,
				+		spiralen
				+		förmig
Sporen	fast rund,	oval, stachelig,	—	+	oval, glatt.	oval, stachelig,
	warzig 1,8	0,8 bis 1 μ		+	0,7 bis 1 μ	0,6 bis 0,9
	zu 3,3 μ	zu 0,4 bis		+	zu 0,9 bis	zu 0,8 bis
		0,5 μ		+	2 μ	1,2
Vegetatives	Gelbrot bis	Rot	Korallenrot	+	Gelbrotbraun	Gelbrotbraun
Mycel	Intensivrot			—
Luftmycel	Weißrosa,	Weißrosa	Weiß	—	Aschgrau	Blautürkis
	manchmal
	schwach			Cynerubin
	Blaugrün
	türkis
Reduktion von
Nitraten	_	/	/	/
Milch (Pep.
Koag.)	—	—	+	/
L-Xylose	+	+	+	+
L-Arabinose ..	—	+	+	+
L-Ramnose...	—	+	—	+
Fructose	+	+	—	+
Saccharose ...	+	+	—	+
Lactose	—	+	+	+
Raffinose ....	—	+	—	+
D-Mannit	+	+	—	+
D-Sorbit	—	—	—	+
Erzeugte
Antibiotika	Adriamycin	Rhodomycin	Rhodomycin	Rubidomycin

+ = positive Reaktion. — = negative Reaktion. / = keine Daten.

(Fortsetzung)

	S.cinereoruber var. fructofermentans	S. caespitosus	S. niveoruber	S. galilaeus	S. nogalater var. nogalater
Sporophoren	gerade oder hakenförmig	quirlförmig	spiralenförmig	spiralenförmig	gerade oder hakenförmig
Sporen	oval, glatt, 0,7 bis 1 μ zu 0,9 bis 2 μ	oval, glatt, 0,5 bis 1,5 μ zu 0,3 bis 0,5 μ	glatt	glatt	mehr oder weniger sphärisch, glatt
Vegetatives Mycel	Gelbrotbraun	cremefarbig bis Braun bis Gelb rötlich	Karminrot	Karminrot	Orangerot
Luftmycel	Aschgrau	Weiß Gelblichgrau	Weißlich	Weiß bis Aschgrau	Grau

Fortsetzung

	S. cinereoruber var. fructofermentans	S. caespitosus	S. niveoruber	S. galilaeus	S. nogalater var. nogalater
Reduktion von
Nitraten	/	4.	/	/
Milch
(Pep. Koag.)	+	+	—	+	+
L-Xylose	+	—	/	/	+
L-Arabinose ..	+	—	/	/	+
L-Ramnose...	+	—	/	/	+
Fructose	+	-f	/	/
Saccharose ...	+	+	/	/	—
Lactose	+	/	/	/	4-
Raffinose ....	_	—	/	/	4-
D-Mannit ....	+	—	/	/	4-
D-Sorbit	+	+	/	/	4-
Erzeugte
Antibiotika...	Cynerubin	Mithomycin	Cynerubin	Cynerubin	Nogalamycin

+ = positive Reaktion.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.

Fortsetzung

	S. antibioticus	/	S.A. 1165	/	S. A. 220	S. DOA 1205	/
			(A s h e s h ο ν u. a..		(A sh e s h ο ν u. a..	(Brockmann,
	gerade	4-	Antib. and Chemother.,	/	Antib. and Chemother.,	Chem. Ber.,	+
		/	Bd. 4, 1954, S. 380)	/	Bd. 4, 1954, S. 380)	Bd. 92, 1959, S. 1880)	/
Sporophoren	glatt, sphärisch	/	nicht beschrieben	/	nicht beschrieben	in Spiralenform her	/
	Gelbcremefarbig	/		/		gestellt	/
Sporen	Weiß bis Maus	/	nicht beschrieben	/	nicht beschrieben	nicht beschrieben	/
Vegetatives Mycel	grau	/	nicht beschrieben	/	nicht beschrieben	Ziegelrot, Weinrot	/
Luftmycel		/	nicht beschrieben	/	nicht beschrieben	Rotgrau	/
	/		/			/
Reduktion von	/	,.				/
Nitraten	/	- /	/	/
Milch	Cynerubin	Aklavin		Pyrromycin
(Pep. Koag.)	/
L-Xylose	/
L-Arabinose ....	/
L-Ramnose	/
Fructose	/
Saccharose	/
Lactose	/
Raffinose	/
D-Mannit	/
D-Sorbit	/
Erzeugte Antibiotika	Rutilantin

+ = positive Reaktion.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.

Der Mutant »F.I. 106« kann durch Lyophilisierung unter Verwendung von Milch oder Milchserum als Suspendiermittel oder durch Sammeln der Sporen und Aufbewahren derselben in einem sterilen Substrat gelagert werden. Außerdem kann er auch durch aufeinanderfolgende Kultivierungen auf einem festen Medium, das Glucose oder einen anderen geeigneten Zucker und komplexe stickstoffhaltige Substanzen (Hefeextrakt, Pepton, hydrolisiertes Kasein) gelagert werden. Das Medium kann außerdem einige Salze

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ίο

enthalten, wobei Magnesiumsulfat und Kaliumphosphat besonders wichtig sind.

Die Herstellung des Antibiotikums Adriamycin erfolgt auf übliche Art und besteht darin, daß der Mutant »F. I. 106« in einem flüssigen Kulturmedium, das vorher sterilisiert wurde, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 37° C (vorzugsweise bei 28° C) während eines Zeitraumes von 3 bis 7 Tagen, vorzugsweise 5 Tagen, bei einem

zweimal extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. In einer Probe des Rückstandes wird der Gehalt an Adriamycin mittels des oben angegebenen Verfahrens bestimmt.

Um Adriamycin zu isolieren, kann das Antibiotikum mit geeigneten Lösungsmitteln entweder aus der Kulturbrühe ohne Filtrieren der Mycelmasse oder aus dem Mycel und der Kulturflüssigkeit, die vorher

pH-Wert von anfangs 6,5 bis 7,0 und am Ende des io durch Filtrieren getrennt wurden, extrahiert werden.

Fermentationsverfahrens von 7,5 bis 8,0 kultiviert wird. Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle und Mineralsalzen. Die .Kohlenstoffquelle kann aus Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreidequellflüssigkeit, Trebern, Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl bestehen. Die Stickstoffquelle kann außer den obenerwähnten stickstoffhaltigen komplexen Substanzen aus trockener Hefe, Fleischpepton und Kasein

Wenn die Extraktion getrennt durchgeführt wird, wird folgende Verfahrensweise vorgezogen. Am Ende der Fermentation wird ein Kieselsäureadsorptionsmittel der Kulturbrühe zugesetzt; die Mischung wird filtriert, und sowohl der Filterkuchen als auch das Filtrat werden getrennt behandelt. Der Hauptanteil an Antibiotikum wird im Filterkuchen gefunden, der aus dem Mycel in Mischung mit den Kieselsäureadsorptionsmaterialien besteht. Dieser Kuchen wird

bestehen. Gute Resultate werden auch bei Verwendung 20 breiig gemacht und in einem Alkohol, wie Methanol,

Äthanol, Butanol; einem Keton, wie Aceton, Methyläthylketon; einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, Methylenchlorid oder in wässerigen Lösungen von organischen oder anorganischen Säulichen Mineralsalze können je nach dem verwendeten 25 ren, wie Essigsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, gerührt.

von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitraten, Ammoniumsulfaten und Diammoniumphosphaten, erhalten.
Die für die Herstellung des Antibiotikums nütz-

Vorteilhafterweise können Mischungen der genannten organischen Lösungsmittel, wie Alkohole und mit Wasser mischbare Ketone, und wässerige Lösungen von anorganischen Säuren verwendet werden.

Im allgemeinen wird eine Mischung von Aceton und O,ln-Schwefelsäure in einem Verhältnis von 7:1 bis 3:1, vorzugsweise 4:1, verwendet.

Aus der vorher auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 alkalisch gemachten filtrierten Brühe kann das Anti

Medium variieren. In einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände, enthält, hat sich der Zusatz von Kalziumcarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als nützlich erwiesen. In Medien, die Glucose, Hefe oder Ammoniumsalze enthalten, sind viel höhere Zusätze an Mineralsalzen, wie Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Mangan- und Kupfersalzen, erforderlich.

Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder

in Laboratoriums- oder Industriefermentationsappa- 35 biotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren raturen verschiedener Kapazität durchgeführt werden. Alkohol, Keton oder halogenierten niedrigen alipha-

Die Menge des in den Brühen vorhandenen Adri- tischen Kohlenwasserstoff, wie Amylalkohol, Butylamycins wird durch folgende Methode berechnet: alkohol, Methylisobutylketon, Methylenchlorid, Die Kulturlösung wird mit Hilfe von 2%igem Kiesel- Chloroform oder Mischungen davon, extrahiert gur filtriert. Die filtrierte Brühe wird mit einer 1 n-Na- 40 werden.

triumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,6 Ein anderes Verfahren zum Extrahieren der fil-

eingestellt und dann zweimal mit einer Mischung von trierten Brühe besteht darin, daß die Brühe selbst Chloroform und Methanol (9:1) extrahiert. Der durch eine chromatographische Säule geleitet wird, Extrakt wird mit Wasser gewaschen und dann im die kationisches carboxylgruppenhaltiges Austausch-Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand 45 harz (»Amberlite IRC 50«) in saurer Form enthält, wird mit Methylalkohol aufgenommen und danach aus dem das Produkt mit einer wässerigen methaüber Whatman-MM-Nr. 3-Papier, das mit einem nolischen Lösung von Natriumchlorid eluiert werden m/15-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,4 kann.

gepuffert wurde, chromatographiert, wobei als Eluier- Die organischen Extrakte der Brühe und des Mycels

mittel eine Mischung aus Propanol, Äthylacetat und 50 werden gesammelt, neutralisiert, es wird Wasser zuWasser (7:1:2) verwendet wird. Der rotgefärbte gesetzt und die erhaltene Lösung dann unter vermin-Teil, der dem R_f-Wert von Adriamycin entspricht, dertem Druck eingeengt. Das wässerige Konzentrat wird mit einer Mischung von Methanol und Wasser wird mit ln-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 ein-(9:1) eluiert, und die Menge des in der filtrierten gestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Der Brühe vorhandenen Adriamycins wird durch spektro- 55 verschiedene Verunreinigungen enthaltende Extrakt photometrische Prüfung einer Probe des Eluats bei wird entfernt, während die wässerige Schicht auf einen der Wellenlänge von 495 ηΐμ berechnet und mit einer
Probe von Adriamycin, dessen Titer bekannt ist,
verglichen.

Die Menge des im Mycel vorhandenen Adriamyeins wird auf'folgende Weise berechnet: Das Mycel wird mit einer Mischung von Aceton und 0,1 n-Schwefelsäure (4:1) extrahiert; der Extrakt wird neutralisiert und unter vermindertem Druck bis auf Vs des

ursprünglichen Volumens konzentriert, das Konzen- 65 nente Adriamycin enthält, in Form der freien Base trat wird mit 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen erhalten. Um das Adriamycin von verschiedenen pH-Wert von 8,6 eingestellt und dann mit einer wasser- und fettlöslichen Pigmenten zu reinigen, kann Mischung von Chloroform und Methanol (9:1) Gegenstromverteilung oder Säulenchromatographie

pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und mit einer Mischung von Chloroform und Methanol (9:1) extrahiert wird.

Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft. Aus dem Konzentrat wird bei Zusatz von Äthyläther ein rohes Produkt, das als Hauptkompo-

angewendet werden. Im ersten Falle kann die Mischung Chloroform—Methanol—m/15- Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,4 (2:2:1) verwendet werden; bessere Resultate werden erhalten, wenn über einer Säule von Zellulose, die mit Phosphaten auf einen pH-Wert von 5,4 gepuffert ist, Chromatographien und als Eluiermittel die Mischung Propanol—Äthylacetat—Wasser (7:1:2) verwendet wird.

Die Adriamycin enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und nach Zusetzen von Wasser eingedampft.

Das wässerige Konzentrat wird mit ln-Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingedampft. Durch Zusetzen von salzsäurehaltigem, wasserfreiem Methanol wird Adriamycinhydrochlorid in Form von dünnen, orangerotgefärbten Nadeln erhalten, das beim Umkristallisieren aus wasserfreiem Äthylalkohol orangerote Nadeln ergibt, Fp. 204 bis 205⁰C (Zersetzung). Es ist optisch.aktiv, [,{\T= +248 ± 2° (c = 0,1 in Methanol). Die Elementaranalyse einer gereinigten Adriamycinhydrochloridprobe ergibt die folgenden Werte: C = 54,36%, H = 5,43%, N = 2,37%, Cl = 6,42%. Die empirische Formel entspricht C₂₇H₂₉NO₁₁ · HCl, Molekulargewicht = 579,98.

Adriamycin besitzt folgende Strukturformel

CH₂OH

Das Adriamycinhydrochlorid ist in Wasser, Methanol und wässerigen Alkoholen löslich, aber unlöslich in Aceton, Benzol, Chloroform, Äthyläther und Petroläther. Die alkoholischen Lösungen des Antibiotikums ergeben mit Metallsalzen charakteristische Färbungen : scharlachrot mit Magnesiumsalzen, scharlachrot mit Calciumsalzen, dunkelrot mit Bleisalzen.

Bei einem alkalischen pH-Wert wird ein Umschlagen zur violetten Farbe und Ausfällung der pigmentierten Substanzen beobachtet. Die wässerigen Lösungen von Adriamycinhydrochlorid bei saurem pH-Wert sind gelborange gefärbt, bei einem neutralen pH-Wert Rotorange und bei einem pH-Wert von höher als 9 Violettblau. Das UV-Absorptionsspektrum und das Spektrum in den sichtbaren Bereichen in Methanol ist durch die folgenden Maxima charakterisiert:

bei 233 ήΐμ (Ε}* = 673)
bei 252 πΐμ (Ε}* = 450)
bei 288 πΐμ (Ε} S. = 159)
bei 479 πΐμ (EJS. = 219)
bei 496 πΐμ (Ε}* = 217)
bei 529 πΐμ (EJ* = 118)

Im IR-Absorptionsspektrum werden Banden der folgenden Wellenlängen festgestellt (in μ): 3,00, 3,44, 5,80, 6,17, 6,31, 6,55, 7,05, 7,78, 8,11, 8,24, 9,00, 9,35, 10,10, 10,98, 11,50, 12,68, 13,12, 14,60.

NH, OH H

Das Antibiotikum ist eine Base, die mit anorganischen und organischen Säuren Salze bilden kann. Der beobachtete Farbwechsel von Rot zu Blauviolett bei einem pH-Wert ~ 9 tritt zufolge Salzbildung der phenolischen Hydroxylgruppen auf. Durch 1 stündiges Erhitzen auf 10O⁰C in 0,5n-Mineralsäuren ergibt Adriamycin ein rotgefärbtes Aglycon, das in Wasser unlöslich ist (Adriamycinon), und eine wasserlösliche, basische, reduzierend wirkende Fraktion (Daunosamin).

Die wasserlösliche Fraktion besteht aus einem bekannten reduzierenden Aminozucker Daunosamin der folgenden Strukturformel

—— CHOH

CH₂

H-C-NH₂ H—C—OH

C-H

CH₃

(III)

60

65 C-CH,

Daunosaminhydrochlorid schmilzt bei 168° C (Zersetzung); [o]_D = —54,5° (in Wasser); N-Benzoylderivat schmilzt bei 154 bis 156° C. Durch diese Spaltstücke ist die Struktur des Adriamycins weitgehend gesichert.

Wie das bekannte Daunomycin (J. Am. Chem. Soc., Bd. 86, 1964, S. 5334 bis 5336) kann Adriamycin chromatographisch gereinigt werden. Dabei zeigt es jedoch ein unterschiedliches Verhalten.

Es wurde Whatman-Papier Nr. 1, gepuffert mit m/15-Phosphatpuffer (NaH₂PO₄ und K₂HPO₄; pH-Wert 5,4), absteigende 16stündige Entwicklung bei Raumtemperatur.

Lösungsmittel A:
Butanol, gesättigt
(pH-Wert 5,4);

Lösungsmittel B:

Propanol—Äthylacetat—Wasser (7:1:2).

Dünnschichtchromatographie

Kieselsäuregel-G-Schicht (Merck), gepuffert mit 1% Oxalsäure in Wasser. Das Chromatogramm wurde bei Raumtemperatur 10 cm weit laufen gelassen.

mit m/l 5 - Phosphatpuffer

1 77Q204

System C: Methylenchlorid—Methanol

(100:15);
System D: n-Butanol—Essigsäure—Wasser

(4:1:5) obere Phase;

System E: Benzol—Äthylacetat—Petroläther,
Kp. 80 bis 120⁰C (80:50:20);

System F: Benzol—Äthylformiat—Ameisensäure (50:50:1).

Verbindung

Papierchromatographie	B	Dünnschichtchromatographie	C	D	E
	0,25	System	0,17	0,33	0,00
A	0,50	0,35	0,40	0,00
0,10	0,85	0,95	0,85	0,15
0,20
0,75

Adriamycin Rf

Daunomycinhydrochlorid Rf
Daunomycinon Rf

Die Salze von Adriamycin werden durch übliches Umsetzen der Base mit pharmazeutisch verwendbaren organischen und anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, ölsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure, erhalten. Neutrale Salze werden durch Umsetzen der entsprechenden Säure mit der freien Base Adriamycin, die durch Extraktion einer wässerigen Lösung des Hydrochlorids bei einem pH-Wert von 8,6 mit organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie Butanol und Chloroform, erhalten wird, erzielt. Durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels wird das Antibiotikum Adriamycin in Form der freien Base erhalten. Die Salze können auch durch doppelte Umsetzung der Salze erhalten werden: beispielsweise wird aus Adriamycinsulfat mit Calciumpantothenat Adriamycinpantothenat erhajten.

Obwohl das Antibiotikum Adriamycin eine bemerkenswerte bakteriostatische Aktivität gegenüber verschiedenen Mikroorganismen (s. Tabelle III) besitzt, hat es sich insbesondere als antitumorales Mittel wirksam erwiesen.

Tabelle III

40

Antibiotische Aktivität von Adriamycinhydrochlorid 0,00
0,00
0,40

Das Antibiotikum zeigt einen deutlichen Hemmungseffekt auf das Tumorwachstum in ascitischer Form, in der ein unmittelbarer Kontakt des Antibiotikums mit den neoplastischen Zellen erreicht wird. Ein guter Hemmungseffekt wird auch bei festen Tumoren beobachtet, wo die Aktivität entsprechend der Verabreichungsweise und der Dosis verschieden ist. Die antitumorale Aktivität von Adriamycin ergibt bessere Resultate bezüglich Wirksamkeit und Dauer als es bei Daunomycin der Fall ist. Das Antibiotikum Adriamycin und seine pharmakologisch verträglichen Salze sowie deren Gemische, können als Heilmittel verwendet werden. Diese enthalten die Verbindungen in Mischung mit üblichen inerten pharmazeutischen Trägern, die für parenteral oder lokale Verabreichung geeignet sind. Zur parenteralen Verabreichung werden vorzugsweise Iyophylisierte Aufbereitungen verwendet, die zum Zeitpunkt der Verwendung gelöst werden sollen.

Die Untersuchung der antitumoralen Wirkung des Antibiotikums unter Verwendung des Stamms Adriamycin, das Streptomyces »F. I. 106« hergestellt wurde, wurde an einigen Mäuse- und Rattentumoren sowohl in fester als auch ascitischer Form vorgenom

men.

1. Ascitische Tumore

Stämme	Medium	DIM ag, ml
Staph. aureus cp. 209 P Bacillus subtilis Streptococcus faecalis Salmonella abortivo equina Escherichia coli B ... Shigella fiexneri Candida albicans....	Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Sabouraud	12,5 6,25 50 50 3 >50 >50

Aktivitätsversuche wurden an Mäusen vorgenommen, die ascitische Ehrlich-Karzinome aufwiesen und mit Lösungen des Antibiotikums in verschiedenen Konzentrationen fünf aufeinanderfolgende Tage, beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte, intraperitoneal behandelt wurden.

Die Tabelle IV, in der die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt sind, zeigt, daß das zu prüfende Antibiotikum, verabreicht in gleichen Dosen von 1,75 und 2,50 mg/kg/Tag, einen bemerkenswerten Hemmungseffekt auf das ascitische Tumorwachstum ausübt und die durchschnittliche Uberlebensrate der behandelten Tiere erheblich erhöht hat.

Tabelle IV Ascitische Ehrlich-Karzinome

Gruppen von 10 Tieren

Dosis

mg/kg/Tag

Körpergewichtsänderung in Gramm
(Tage nach der Implantation)

6 12

Mittlere
Uberlebenszeit (Tage)

Kontrollen .
Adriamycin
Adriamycin

1,75
2,50

+7,5
-0,5
-1,8

+ 13,9
+ 3,8
+0,9

14

33,8

34,6

Dieses Ergebnis wurde durch einen nachfolgenden Versuch bestätigt, in welchem das Antibiotikum in Dosen von 1,25 und 2,50 mg/kgTag (Tabelle V) verabreicht wurde.

Tabelle V Ascitische Ehrlich-Karzinome

Gruppen von 10 Tieren

Dosis

mg/kg/Tag

Körpergewichtsänderung in Gramm
(Tage nach der Implantation)

6 12

Mittlere
Überlebenszeit (Tage)

Kontrollen .

Adriamycin

1,25 2,50

+ 7,5
-0,6
-0,9

+ 13,2

+ 4.6

-4,3

17,8
31,8
51,2

Ein Vergleich der erhaltenen Ergebnisse unter den gleichen experimentellen Bedingungen an Mäusen, die ascitische Ehrlich-Karzinome aufwiesen, mit den Antibiotika Daunomycin und Adriamycin im Hinblick auf Kontrollmäuse erlaubt die Feststellung, daß letzteres ein aktiveres Produkt ist, wie aus Tabelle VI hervorgeht, aus der ersichtlich ist, daß die Verhältniswerte, die das Ansteigen der Uberlebenszeit bei den behandelten Mäusen im Vergleich mit den Kontrollmäusen anzeigen, bei gleichen Dosen mit Adriamycin höher sind.

Tabelle VI

Mittlere Uberlebenszeit von Mäusen mit ascitischen Ehrlich-Karzinomen (als Verhältniszahl zwischen der Uberlebenszeit der behandelten Tiere (Mäuse) und der Kontrolltiere; jeder Wert zeigt das Mittel der erhaltenen Ergebnisse bei Gruppen von 10 Tieren).

Dosis mg, kg, Tag	Daunomycin	Adriamycin
2,50	1,8	2,8

Der antimycotische Effekt des zu prüfenden Antibiotikums wurde bei Versuchen aufgedeckt, die an Mäusen durchgeführt wurden, welche ascitische Tumore im logarithmischen Wachstumsstadium (5. Tag) aufwiesen. Diese Tiere wurden intraperitoneal behandelt, wobei ihnen Adriamycin in einer Menge von 2 mg/kg lediglich einmal verabreicht wurde. Die Prüfung der Flecken des neoplastischen Exudats, die vorher und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung (2, 4, 8, 24, 32 und 48 Stunden) durchgeführt wurde, konnte aufzeigen, daß das Antibiotikum eine sehr schnelle und vollständige Beendigung der mehrfachen Wirksamkeit des Tumors bewirkt, die bis zur 32. Stunde dauert.

48 Stunden nach der Behandlung wurden zahlreiche Zellen im Mythose festgestellt, aber ihre Morphologie war konstant verändert.

2. Feste Tumore

Die Versuche bezüglich Wirksamkeit gegenüber festen Tumoren wurden mit Sarcom 180 bei Mäusen und mit Oberling-Guerin-Guerin-Myelomen bei Ratten durchgeführt.

a) Sarcom 180

Mäuse, denen ein Fragment eines neoplastischen Gewebes eingepflanzt worden war, wurden 8 Tage subkutan behandelt, beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte. Das Antibiotikum wurde als Lösung in verschiedenen Konzentrationen entsprechend den folgenden Dosen in mg/kg/Tag verabreicht: 7, 5, 3,5, 2,5 und 1,75.

Am 11. Tag des Versuches wurden alle Tiere getötet und deren Tumore entfernt und gewogen.

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen VII und VIII angegeben:

Tabelle VII

Gruppe und Dosis
(mg/kg/Tag)

Kontrollen

Adriamycin

7

3,50

1,75

Körpergewichtsänderung brutto netto

Tumorgewicht

Hemmung

Sterblichkeit

+4,78

-5,98 -2,31 + 3,09

+ 0,86

-6,22 -3,01 + 1,10

Tabelle VIII Sarcom 3,922

0,239
0,696
1,988

93,9

82,3
49,3

0/10

6/10
0/10
0/10

Gruppe und Dosis

(mg/kg/Tag)

Kontrollen

Adriamycin

5

2,50

Daunomycin

5

2,50

Körpergewichtsänderung brutto netto

Tumorgewicht
g

Hemmung %

Sterblichkeit

+ 5,65

-4,37 -1,60

+0,85 + 1,52

+ 3,19

+4,61 -2,26

-0,18 -0,23 2,461

0,239
0,656

1,029
1,745

90,3

73,4

58,2
29,1

0/10

0/10
0/10

109552/436

Aus den zwei Tabellen geht hervor, daß das Antibiotikum eine starke Hemmung des Tumorwachstums bei allen verwendeten Dosierungen verursacht hat. Eine merkliche Sterblichkeit der behandelten Tiere wurde nur mit höheren Dosierungen (7 mg/kg/Tag) erzielt.

Unter den gleichen experimentellen Bedingungen ergab sich klar, daß Adriamycin im Vergleich zu Daunomycin in bezug auf diese Tumorart überlegen wirksam ist. Dieses Ergebnis ist um so anschaulicher, wenn die Hemmungsdosen 50 (HD₅₀) in Betracht gezogen werden: Daunomycin etwa 3,3 mg/kg, Adriamycin etwa 1,5 mg/kg.

Versuche bezüglich der Toxizität, die an gesunden Mäusen 8 Tage unter subkutaner Verabreichung von Adriamycin in Dosen von 10 bis 1,25 mg/kg durchgeführt wurden, zeigten die folgenden Ergebnisse:

Tabelle IX Toxizität von Adriamycin bei Mäusen

Dosis	% Sterblichkeit	am
(mg/kg/Tag)	10. Tag	15. Tag
10	100	100
8 33	70	100
6,67	40	80
5	0	0
2,50	0	0
1,25	0	o ■

Aus obigen Daten ist ersichtlich, mittels einer graphischen Methode, daß die tödliche Dosis 10 (LD₁₀) bei 6,4 mg/kg liegt. Aus dem Diagramm kann man ersehen, daß die Hemmungsdosis 90(HD₉₀) von Adriamycin gleich 5 mg/kg ist. Mit diesen Daten ist es möglich, gemäß Skipper (Cancer Chemotherapy Report, Bd. 17,1962, S. 1) den therapeutischen Index von Adriamycin zu berechnen:

IO

T. I. =

LD

12. -

6,4

HD,

= 1,28.

'90

Es sei darauf hingewiesen, daß der therapeutische Index von Daunomycin unter den gleichen experimentellen Bedingungen 0,67 beträgt. Außerdem sei noch darauf hingewiesen, daß es gemäß der obenerwähnten Literaturstelle von S ki ρ ρ e r scheint, daß unter den gleichen experimentellen Bedingungen der therapeutische Index von anderen antitumoralen Antibiotika, die schon in Verwendung sind (Actinomycin, Mitomycin, Actinobolin, Actidion), niedriger als 1 ist.

b) Oberling-Guerin-Guerin-Myelome

Wistar-Ratten, denen ein Fragment eines Tumorgewebes eingepflanzt worden war, wurden intravenös 8 Tage, beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte, behandelt. Am 12. Tag des Versuches wurden die überlebenden Tiere getötet und die Tumore entfernt und gewogen.

Tabelle X Oberling-Guerin-Guerin-Myelome

Gruppe und Dosis
(mg/kg/Tag)

Körpergewichtsänderung (g)

brutto

netto Sterblichkeit

Tumorgevvicht

Hemmung %

Kontrollen .
Adriamycin

0,625

1,25

2,50

+ 15,7

+ 9,2

+25,2 - 1,3

+ 3,3

- 1,0

+ 14,6

- 5,6

0/10

3/10
0/10
1/10

12,447

10,253

10,649

4,295

17,7 14,5 65,5

Tabelle X zeigt, daß das Antibiotikum auch gegenüber dieser Tumorart wirksam ist. Unter diesen experimentellen Bedingungen beträgt die HD₅₀ des Adriamycins etwa 2 mg/kg.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben, die jeweils 60 ml des folgenden Kulturmediums für die vegetative Phase enthielten, wurden vorbereitet: Pepton 0,6%, trockene Hefe 0,3%, hydratisiertes Calciumnitrat 0,05%, Leitungswasser. Nach der Sterilisierung betrug der pH-Wert 7,2. Die Sterilisierung erfolgte durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen im Autoklav auf 120⁰C.

Jeder Kolben wurde mit einer Menge Mycel des Mutanten »F. I. 106« von Streptomyces peucetius entsprechend ¹Z₅ einer Suspension des Mycels in sterilem Wasser angeimpft; dieses Mycel stammt von einer 10 Tage alten Kultur, die in einer großen Proberöhre auf dem folgenden Medium gezogen wurde: Saccharose 2%, trockene Hefe 0,1%, Bikaliumphosphat 0,2%, Natriumnitrat 0,2%, Magnesiumsulfat 0,2%, Agar 2%, Leitungswasser. Die Kolben wurden 48 Stunden bei 28° C auf einem Drehschüttler mit einem Hub von 30 mm bei 220 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

2 ml eines so gezogenen vegetativen Mediums wurden dazu verwendet, um 300-ml-Erlenmeyerkolben mit 60 ml des folgenden Mediums für die Produktionsphase anzuimpfen: Glucose 6%, trockene Hefe 2,5%, Natriumchlorid 0,2%, Bikaliumphosphat 0,1%, Calciumcarbonat 0,2%, Magnesiumsulfat 0,01%, Ferrosulfat 0,001%, Zinksulfat 0,001%, Kupfersulfat 0,001%, Leitungswasser. Der sich ergebende pH-Wert beträgt 7. Das Medium wurde bei 120⁰C 20 Minuten sterilisiert; die Glucose wurde 20 Minuten bei 110⁰C separat sterilisiert. Sie wurde bei 28° C unter den gleichen Rührbedingungen, wie für die

vegetativen Medien beschrieben, bebrütet. Die Maximalkonzentration des Antibiotikums wurde am 6. Tag der Fermentation erreicht. Die Menge nach einer solchen Zeit hergestellten Adriamycins entspricht einer Konzentration von 15 μg/ml.

Beispiel 2

Der Versuch wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt mit dem Unterschied, daß die Impfkultur auf dem folgenden festen Medium gezogen wurde: 200 g geschälte Kartoffeln wurden 20 Minuten in 500 ml Wasser gekocht; das Volumen wurde auf seinen ursprünglichen Wert gebracht und durch Gase filtriert. 2% Glucose, 0,1% Difco-Hefeextrakt und 2% Agar wurden zugesetzt. Das Volumen wurde auf 1000 ml gebracht; es wurde 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert; pH-Wert 6,8 bis 7,0. Die maximale Konzentration des Adriamycins von 12 μg/ml wurde in der 140. Stunde erreicht.

Beispiel 3

Der Versuch wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt mit dem Unterschied, daß die vegetativen und produktiven Medien die folgenden Zusammensetzungen hatten:

Vegetatives Medium: Stärke 3%, Calciumcarbonat 0,4%, Treber 0,3%, Ammoniumsulfat 0,1%, Kasein 0,5%, Bikaliumphosphat 0,01%, in Leitungswasser. Der pH-Wert nach der Sterilisation im Autoklav bei 120⁰C während 20 Minuten betrug 7.

Produktives Medium: Stärke 5%, Calciumcarbonat 0,8%, Getreidequellflüssigkeit 0,6%, Kasein 0,5%, Ammoniumsulfat 0,1%, Bikaliumphosphat 0,01%. Der pH-Wert betrug nach der Sterilisation 7. Die Sterilisation wurde so, wie für die vegetative Phase beschrieben, durchgeführt. Die Maximalproduktion wurde am 7. Tag mit 6,5 μg/ml erreicht.

Beispiel 4

500 ml des flüssigen Mediums der vegetativen Phase, wie im Beispiel 1 beschrieben, die in einem 2000-ml-Pyrex-Glaskolben enthalten waren, wurden mit einer Kultur des Mutanten »F. I. 106« von Strept. peucetius auf einem festen Medium, wie im Beispiel 2 beschrieben, angeimpft. Es wurde 48 Stunden bei 28° C auf einem Drehschüttler mit einem Hub von 3,5 mm bei 120 Umdrehungen pro Minute bebrütet;

100 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurden danach in 3000 ml des gleichen flüssigen Mediums angeimpft, das in einem 51 neutralen Glasfermentiergefäß, das mit einem Propellerrührer, einem Einlaßrohr zum Einblasen von Luft, das unter dem Propellerrührer endigt, einer Wellenbrechereinrichtung, einem Rohr für das Animpfen, einem Luftauslaßrohr, einer Temperaturprüfeinrichtung und einer Einrichtung zum intermittierenden oder kontinuierlichen Zusetzen unter sterilen Bedingungen, versehen war, enthalten war. Das Wachsen erfolgte bei 28° C mit einer Durchlüftungsgeschwindigkeit von 3 1 pro Minute und unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400 Umdrehungen pro Minute (U. p. M.).

300 ml der so erzeugten Kulturbrühe dienten nach 24 Stunden zum Animpfen von 6 1-des im Beispiel 1 beschriebenen produktiven Mediums, das in einem

101 neutralen Glasfermentiergerät, das die oben beschriebenen Merkmale aufwies, enthalten war. Während der Fermentation, die bei einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute und mit einer Durchlüftungsgeschwmdigkeit von 5 1 pro Minute durchgeführt wurde, wurde das Schäumen durch Zusetzen von kleinen Mengen Silikon-Antischaummittel geprüft. Die in 150 Stunden der Fermentation erzielte Höchstproduktion entspricht einer Konzentration von 6 μΒ/ΐηΙ Adriamycin.

Beispiel 5

Mit einer Kultur, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurden 500 ml eines Mediums der nachstehenden Zusammensetzung in einem 2000 ml Kolben angeimpft: Pepton 0,6%, granulierte trockene Hefe 0,5%, Calciumnitrat in Wasser 0,05%. Das Medium wurde auf einem Drehschüttler 48 Stunden bei 28° C gerührt. Mittels der so erhaltenen Kultur wurde ein 80 1 Fermentiergerät mit 50 1 des oben angegebenen Mediums angeimpft. Dieses Medium wurde bei 230 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit einem Luftstrom von 0,71/1 Medium pro Minute bei einer Temperatur von 27° C belüftet. Nach 4 bis 5 Stunden wurde die Kulturbrühe dazu verwendet, um 500 ml des Kulturmediums in einem etwa 8001 Fermentiergefäß zu besetzen.

Das Fermentationsmedium hatte die nachfolgende Zusammensetzung: Glucose 7%, Kichererbsenmehl 6,65%, Calciumcarbonat 0,2%, Natriumchlorid 0,2%, Bikaliumphosphat 0,1%, Magnesiumsulfatheptahydrat 0,02%, Ferrosulfatheptahydrat 0,00068%, Mangansulfatheptahydrat 0,001%, Kupfersulfat 0,002% in Leitungswasser.

Das Medium wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, auf 27° C abgekühlt und nach dem Animpfen bei 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit einem Luftstrom von 0,41/1 Medium pro Minute belüftet. Nach 145 Stunden enthielt die Kulturbrühe 6,5 μg/ml Adriamycin.

Beispiel 6

60 1 Kulturflüssigkeit, die gemäß Beispiel 4 aus der Fermentation erhalten wurde, wurden vom Mycel mittels Kieselgur abfiltriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden. Der erhaltene Kuchen wurde in Aceton, das mit 0,1 n-wässeriger Schwefelsäure (4:1) verdünnt war, suspendiert und 2 Stunden gerührt. Die Flüssigkeit wurde filtriert und der Kuchen weitere zweimal gerührt. Die erhaltenen Extrakte wurden vereinigt, neutralisiert und das Aceton im Vakuum abgedampft. Das Konzentrat, das etwa 0,25 g Adriamycin enthielt, wurde mit 1 η-Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert und danach mit Chloroform extrahiert, wobei ein Teil der Verunreinigungen entfernt wurde. Die wässerige Phase wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und dann mit einer Mischung Chloroform— Methanol (9:1) extrahiert; der Vorgang wurde so lange wiederholt, bis die wässerige Phase farblos war. Die Methanol-Chloroform-Extrakte wurden mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen, danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf Adriamycin mittels Äthyläther in Form der freien Base ausgefällt wurde. Es wurden 1,50 g des rohen Produktes erhalten, die etwa 0,2 g Adriamycin enthielten.

Die filtrierte Brühe wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und danach mit einer Mischung Chloroform—Methanol (9:1)

extrahiert. Der Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die Methanol—Chloroform-Extrakte wurden mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen und dann mit 0,01 η-Salzsäure wiederextrahiert, bis die wässerige Phase eine rote Farbe annahm. Die Chloroformphase wurde entfernt. Die wässerige Phase wurde filtriert und mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt. Danach wurde sie mit der Mischung Chloroform—Methanol (9:1) extrahiert. Der Extrakt, der zu diesem Zeitpunkt neben verschiedenen Verunreinigungen 0,15 g Adriamycin enthielt, wurde mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert. Durch Zusetzen von 10 Volumteilen Äthyläther wurde ein Niederschlag von 1 g des rohen Produktes, das 0,12 g Adriamycin enthielt, erhalten.

Insgesamt wurden 0,320 g Adriamycin in Form der rohen Base erhalten.

Beispiel 7

0,5 g Rohprodukt, enthaltend etwa 15% Adriamycin, wurden in 10 ml eines m/l 5-Phosphatpuffers (pH-Wert von 5,4) gelöst. Die Lösung wurde an 10 g Zellulosepulver (Whatman-CF-11) adsorbiert, die Mischung über Nacht im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet, dann in eine Glassäule für Chromatographie (100 cm hoch und 4 cm Durchmesser), enthaltend 225 g Zellulosepulver (Whatman-CF-Il), das vorher mit m/l5-Phosphatpuffer (pH-Wert von 5,4) gepuffert worden war, eingebracht und im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet. Sie wurde mit einer Mischung Propanol— Äthylacetat—Wasser (7:1:2) eluiert, und 25-ml-Fraktionen wurden mit einem automatischen Sammler gesammelt. Die verschiedenen Fraktionen wurden durch Chromatographie über Whatman-Papier-Nr. 1, gepuffert bei einem pH-Wert von 5,4 geprüft, wobei als Eluiermittel die gleiche Mischung verwendet wurde, die zum Eluieren der Säule verwendet worden war. Die Fraktionen 40 bis 60 enthielten Adriamycin. Die Fraktionen 40 bis 60 wurden vereinigt und auf 50 ml eingeengt. Die ausgefällten Salze wurden filtriert und zum Filtrat wurden 200 ml Wasser zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt.

Sie wurde unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt, das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt, dann wurden die Chloroformextrakte vereinigt und mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 und dann mit gewöhnlichem Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf 5 ml eingeengt. Hierauf wurden 0,15 ml einer 1 η-Lösung von wasserfreier Salzsäure in Methanol zugesetzt, und das Gemisch wurde gekühlt. Nach einigen Minuten bildete sich ein kristalliner Niederschlag von Adriamycinhydrochlorid, der filtriert und mit kaltem Chloroform und wasserfreiem Äthyläther gewaschen wurde. Es wurden 50 mg des Produktes erhalten, das aus Äthanol umkristallisiert wurde.

Auf diese Weise wurden 35 mg des Reinproduktes mit einem Fp. von 204 bis 205° C erhalten. Aus den Mutterlaugen wurden weitere 15 mg eines amorphen Produktes von 90%iger Reinheit gewonnen.

Claims

Patentansprüche:
1. Adriamycin der Formel

O OH

CO-CH₂OH

OH

H
O OH O NH₂ OH

OCH₃ Ch-CH₂-CH-CH-CH-CH₃

-O-

und seine Salze mit pharmakologisch verträglichen organischen und anorganischen Säuren.
2. Therapeutische Zusammensetzungen zur Tumorbehandlung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Adriamycin bzw. dessen Salzen mit pharmakologisch verträglichen organischen oder anorganischen Säuren zusammen mit einem üblichen inerten Träger für parenterale oder lokale Verabreichung.