DE19521753B4

DE19521753B4 - Monomere Insulinanalogonformulierungen

Info

Publication number: DE19521753B4
Application number: DE19521753A
Authority: DE
Inventors: Michael Rosario de Indianapolis Felippis
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: SE9502168L; HU218943B; BE1009409A5; LU88627A1; PL309100A1; NL1004643C2; CH689934A5; US5650486A; NO320808B1; DE19521753A1; US5747642A; ES2091728A1; GB9512105D0; MY116831A; FI118208B; KR100386038B1; GR1002494B; ITMI951277A0; IL114153A0; UA34468C2

Abstract

Kristalliner Insulinanalogonprotaminkomplex, der enthält: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Protamin, Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol.

Description

Die Erfindung betrifft monomere Humaninsulinanaloga. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung verschiedene parenterale Formulierungen, die ein Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Zink, Protamin und Phenol und bzw. oder m-Kresol umfassen. Die Formulierungen liefern eine verlängerte Wirkdauer. Ein Verfahren zur Herstellung von Insulinanalogon-Protaminformulierungen wird ebenfalls beschrieben.
Seit der Einführung von Insulin wurden laufend Fortschritte erzielt, um die Behandlung von Diabetes mellitus zu verbessern. Die hauptsächlichen Fortschritte wurden in der Insulinreinheit und Verfügbarkeit durch die Entwicklung der rekombinanten DNA Technologie erzielt. Verschiedene Formulierungen mit unterschiedlichen Wirkzeiten wurden ebenfalls entwickelt. Derzeit gibt es im allgemeinen sieben im Handel erhältliche Insulinformulierungen: Reguläres Insulin, semilentes Insulin, Globininsulin, Isophaninsulin, Insulin-Zink-Suspension, Protamin-Zink-Insulin und ultralentes Insulin.
Trotz dieses Spektrums an verfügbaren Formulierungen kann die subkutane Injektionstherapie dem Patienten immer noch keine bequeme Regulierung und normalisierte glykämische Kontrolle bieten. Häufige Abweichungen von den normalen glykämischen Spiegeln während des Lebens des Patienten führen zu Hyper- oder Hypoglykämie und Langzeitkomplikationen, die Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie und Mikro- und Makroangiopathie beinhalten.
Um zur Vermeidung von extremen glykämischen Spiegeln beizutragen, praktizieren Diabetiker oft eine Mehrfachinjektionstherapie, wobei Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird. Jedoch wurde diese Therapie bis jetzt nicht optimiert. Das am schnellsten wirksame, im Handel erhältliche Insulin hat seine maximale Wirkung zu spät nach der Injektion und hält zu lange vor, um den Glukosespiegel optimal zu kontrollieren. Daher wurde ein beträchtlicher Aufwand unternommen, um Insulinformulierungen und Insulinanalogonformulierungen zu entwickeln, die die Kinetik des subkutanen Absorptionsprozesses verändern.
Da alle im Handel erhältlichen pharmazeutischen Insulinformulierungen Insulin im selbstassoziierten Zustand und vorwiegend in der Hexamerform enthalten, durfte der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt für die Absorption des Insulins aus dem subkutanen Injektionsdepot in den Blutstrom die Dissoziation des selbstaggregierten Insulinhexamers sein. Kürzlich wurden monomere Insulinanaloga entwickelt, die weniger zur Assoziation zu hochmolekularen Formen neigen als Humaninsulin. Diese fehlende Selbstassoziation beruht auf Modifikationen in der Aminosäuresequenz von Humaninsulin, die die Assoziation primär durch die Zerstörung der Dimerbildung verringern. Brems et al. Protein Engeneering, 5: 6 527–533 (1992) und Brange et al., Nature 333: 679–682 (1988). Demnach besitzen monomere Insulinanaloga ein vergleichsweise schnelles Einsetzen der Aktivität, während sie die biologische Aktivität von nativem Humaninsulin behalten. Diese Insulinanaloga stellen eine schnelle Absorption bereit, um die Injektionszeit und die maximale Wirkung von Insulin näher zur postprandialen Glukoseabweichung zu bringen, die mit der Reaktion auf die Mahlzeit zusammenhängt.
Die physikalischen Eigenschaften und Charakteristiken von monomeren Analoga sind nicht zu Insulin analog. Beispielsweise beschreiben Brems et al., dass verschiedene monomere Analoga eine geringe oder keine Zink-induzierte Assoziation aufweisen. Die beobachtete Assoziation führt zu einer Vielzahl an Formen mit hohem Molekulargewicht. Dies unterscheidet sich drastisch vom Insulin, das in Gegenwart von Zink fast ausschließlich in einer geordneten, hexameren Konformation vorliegt. Brange et al. Diabetes Care 13: 923–954 (1990). Das Fehlen der Assoziation führt zu den schnell wirkenden Eigenschaften der Analoga. Da die Analoga eine geringere Assoziationstendenz haben, ist es ziemlich überraschend, dass ein monomeres Insulinanalogon formuliert werden kann, um eine mittlere Wirkdauer aufzuweisen.
Die Erfindung liefert eine monomere Insulinanalogonformulierung, die bei Verwendung eine mittlere Wirkdauer ergibt. Die Erfindung liefert ferner einen neuen Protaminkristall, der Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD genannt wird. Die Erfindung liefert auch ein Gemisch aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD und löslichem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin. Dieses Gemisch liefert ein rasches Einsetzen der Wirkung und eine mittlere Wirkdauer. Demnach besitzt das Gemisch Vorteile sowohl gegenüber Insulin als auch dem monomeren Analogon. Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung von einheitlichen Kristallen aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD.
Die Erfindung liefert eine Insulinanalogon-Protamin-Formulierung, die umfasst: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Protamin, Zink und ein Phenol und bzw. oder m-Kresol.
Die Erfindung liefert ferner einen kristallinen Insulinanalogon-Protaminkomplex. Dieser Komplex wurde als Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD definiert. Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD umfasst: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E Lys^B28Pro^B29-Insulin, 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol.
Die Erfindung liefert zusätzlich ein Verfahren zur Herstellung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD, das umfasst:
Die Kombination einer wässrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von 8°C bis 22°C,
wobei diese wässrige Lösung 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Phenol und bzw. oder m-Kresol bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 enthält,
und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 enthält, so dass die Protaminendkonzentration 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinanalogon beträgt.
Die Erfindung liefert auch Formulierungen, die sowohl schnell als auch etwas länger wirken. Die Formulierungen sind Gemische aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und kristallinem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten 1-99:99-1 beträgt.
Die 1 ist eine graphische Darstellung des Wirkprofils von Lys^B28Pro^B29-hl-NPD und Humaninsulin-NP. Die Kurve ist μE/ml gegen die Infusionszeit. Die Figur zeigt die Vorteile der Erfindung. Die 2 zeigt ein Bild von erfindungsgemäßen Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protamin-Kristallen. Das Bild wurde bei einer 1000fachen Vergrößerung mit Differentialphasenkontrast aufgenommen.
Wie oben erwähnt, liefert die Erfindung verschiedene Formulierungen von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin. Der Ausdruck "monomeres Insulinanalogon" oder "Insulinanalogon", wie er hierin verwendet wird, ist ein schnell wirkendes Insulinanalogon, das weniger zur Dimerisierung oder Selbstassoziation neigt. Lys^B28Pro^B29-Human insulin ist Humaninsulin, worin Pro an der Position B28 durch Lys ersetzt ist und Lys an der Position B29 Prolin ist. Monomere Insulinanaloga sind in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben.
Alle Aminosäureabkürzungen, die in der Beschreibung verwendet werden, sind die, die vom United States Patent & Trademark Office akzeptiert werden, wie dies in 37 C.F.R § 1.822(b) (2) beschrieben ist.
Der Ausdruck Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD ist eine Suspension eines kristallinen Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins und Protamin in einer Formulierung. NPD ist nach DeFelippis eine neutrale Protaminformulierung. Die Zusammensetzung wird gemäß dem hierin beschriebenen und beanspruchten Verfahren hergestellt. Der ähnliche Ausdruck oder Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protamin-Kristalle bezieht sich auf die Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protaminkristalle in der NPD-Formulierung.
Der Ausdruck "behandeln" beschreibt, wie er hierin verwendet wird, die Handhabung und die Pflege eines Patienten zur Bekämpfung der Krankheit, des Zustands oder der Störung und beinhaltet die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu beheben.
Der später verwendete Ausdruck isotonisches Mittel betrifft ein Agens, das physiologisch toleriert wird und der Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluss des Wassers durch die Zellmembran zu verhindern. Verbindungen, wie Glycerin, werden gewöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet. Die Konzentration des isotonischen Mittels liegt in dem Bereich, der in der Technik für Insulinformulierungen bekannt ist.
Der später verwendete Ausdruck "auf der Grundlage der freien Base" deutet die Menge an Protamin in der Formulierung an. Die Grundlage der freien Base wird um den Gehalt an Wasser und Salz der Protaminsalze korrigiert, die im Handel erhältlich sind und gewöhnlich in parenteralen Formulierungen verwendet werden. Das bevorzugte Protamin, Protaminsulfat, enthält etwa 80% Protamin.
Der Ausdruck "IE" oder "E" ist eine internationale Einheit.
Der später verwendete Ausdruck "Isophanverhältnis" ist die Gleichgewichtsmenge an Protamin, die zur Komplexbildung mit dem Analogon erforderlich ist, wie dies von Kragenbühl und Rosenberg, Steno Memorial Hospital Report (Kopenhagen), 1:60 (1946) beschrieben wurde. Das Isophanverhältnis wird durch Titration auf eine Weise bestimmt, wie sie in der Technik gut bekannt ist und in Kragenbühl et al. beschrieben ist.
Die Erfindung liefert eine Insulinanalogon-Protamin-Formulierung, die umfasst: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Protamin, Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol. Die Protaminkonzentration beträgt vorzugsweise 0,2 bis 1,5 mg Protamin auf 100 E Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin auf der Grundlage der freien Base. Noch bevorzugter beträgt die Protaminmenge 0,27 mg/100 E bis 0,35 mg/100 E. Die Konzentration an Zink beträgt 0,35 bis 0,9% auf Gewichtsbasis. Vorzugsweise beträgt die Zinkkonzentration etwa 0,7%.
Vorzugsweise werden m-Kresol und Phenol verwendet. Die Konzentration des Phenols und bzw. oder m-Kresols ist einem Fachmann bekannt. Die Konzentrationen müssen ausreichen, um eine Konservierungswirkung aufrechtzuerhalten, das heißt mikrobielles Wachstum zu verzögern. Im allgemeinen liegt die Konzentration von Phenol und bzw. oder m-Kresol im Bereich von 1,0 mg/ml bis 6,0 mg/ml, vorzugsweise bei mehr als etwa 2,5 mg/ml. Die am meisten bevorzugte Konzentration liegt bei etwa 3 mg/ml. Das Vorkommen von Phenol und bzw. oder m-Kresol ist entscheidend, da es die Komplexierung des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins, Protamins und des Zinks bewirkt und zusätzlich als Konservierungsmittel dient. Jedoch dürfte nur ein Molekül Phenol und bzw. oder m-Kresol pro Molekül Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin an die Kristallstruktur gebunden sein.
Vorzugsweise wird ein isotonisches Mittel zur Formulierung gegeben. Das bevorzugte isotonische Mittel ist Glycerin. Die Konzentration des isotonischen Mittels beträgt beispielsweise 14 mg/ml bis 18 mg/ml, vorzugsweise etwa 16 mg/ml.
Der pH-Wert der Formulierung kann mit einem physiologisch tolerierten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, wie dibasischem Natriumphosphat, gepuffert werden. Andere physiologisch tolerierte Puffer sind unter anderem IRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat. Die Auswahl und die Konzentration des Puffers sind in der Technik bekannt. Im allgemeinen beträgt die Konzentration beispielsweise 1,5 mg/ml bis 5,0 mg/ml, vorzugsweise 3,8 mg/ml.
Die Erfindung liefert ferner bestimmte Bedingungen, unter denen das Insulinanalogon-Protamin als stabiler Kristall existiert. Formulierungen dieser Kristalle werden als Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD definiert. Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD ist eine formulierte Suspension aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD-Kristallen und ergibt bei Verwendung eine mittlere Wirkdauer. Das Wirkprofil des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD ist in Anbetracht der fehlenden Selbstassoziierung des monomeren Analogons ziemlich überraschend.
Die Fähigkeit zur Bildung einer Formulierung mit mittlerer Wirkdauer mit einem monomeren Analogon ist in 1 gezeigt. Die 1 zeigt ein Wirkprofil für Lys^B28Pro^B29-hl-NPD und Humaninsulin-NPH. Das NPD Profil ist dem von Insulin-NPH ähnlich. Die Wirkdauer für die NPD-Formulierung und die Insulin-NPH Formulierung sind etwa gleich. Jedoch ist am signifikantesten, dass die vorliegende Formulierung schneller ansteigt und für einen längeren Zeitraum stabil bleibt als Insulin-NPH. Dieser Unterschied ist in Anbetracht des schnellwirkenden Profils des monomeren Analogons unerwartet.
Eine besonders bevorzugte Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protamin-Formulierung umfasst: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol. Die Protaminkonzentration beträgt vorzugsweise 0,3 mg/100 E auf der Grundlage der freien Base.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protaminkristallen, das umfasst: Die Kombination einer wässrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von 8°C bis 22°C,
wobei diese wässrige Lösung 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Phenol und bzw. oder m-Kresol bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 enthält,
und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH von 7,1 bis 7,6 enthält, so dass die Protaminendkonzentration 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin beträgt.
Zur Zeit der Erfindung war bekannt, dass monomere Insulinanaloga eine geringere Tendenz zur Assoziation und Hexamerbildung aufweisen. Die Bedingungen, die notwendig sind, um die monomeren Insulinanaloga zur Assoziation mit Protamin unter Bildung von Kristallen zu veranlassen, waren vorher in der Technik unbekannt. Frühere Untersuchungen betreffen Insulin. Die Beschreibungen, die die Herstellung von Insulin-NPH (neutrale Protaminformulierung gemäß Hagedorn) oder Isophaninsulinformulierungen von Kragenbühl und Rosenberg, Steno Memorial Hospital Report (Kopenhagen), 1:60 (1946) in Betracht ziehen, sind nicht in Anbetracht der distinkten Eigenschaften der monomeren Insulinanaloga relevant. Tatsächlich stellt das kommerzielle Verfahren zur Herstellung von Humulin-N^R (Insulin-NPH), ein sauer-neutrales Verfahren, kein kristallines Insulinanalogon-NPD her.
Am signifikantesten ist die Feststellung, dass die Parameter im vorliegenden Verfahren, nämlich die Temperatur der Kristallisation und die Bildung eines Hexamerkomplexes des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins, des Zinks und des Phenols und bzw. oder m-Kresols, entscheidende Beschränkungen für die Bildung von stabilen Lys^B28Pro^B29-hl-NPD Kristallen sind.
Die Kristallisationstemperatur muss 8°C bis 22°C, vorzugsweise 13°C bis 17°C betragen. Falls die Temperatur außerhalb dieses Bereichs liegt, resultieren daraus hauptsächlich amorphe Insulinanalogon-Protamin-Formulierungen.
Es ist ebenfalls entscheidend, dass das Insulinanalogon vor der Kristallisation in einen hexameren Zustand umgewandelt wird. Die Kristallisation führt zu einem amorphen Produkt, wenn das Verfahren mit einem monomeren Assoziationszustand durchgeführt wird. Die Kristalle bilden sich ohne Schütteln in fünf bis sechsunddreißig Stunden. Kristalle mit guter Qualität bilden sich im allgemeinen innerhalb von 24 Stunden.
Das lösliche monomere Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin wird zu einem Hexamerassoziationszustand komplexiert, indem man das feste monomere Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem Verdünnungsmittel suspendiert, das das Phenol und bzw. oder m-Kresol enthält, und Zink zugibt, bis die Konzentration 0,35% bis 0,9% auf Gewichtsbasis beträgt. Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen beinhalten Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann erkennt, dass viele andere Zinksalze existieren, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden könnten. Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet.
Das Lösen des Insulinanalogons im Verdünnungsmittel kann mit einer Maßnahme erleichtert werden, die gewöhnlich als Säurelösung bekannt ist. Bei einer Säurelösung wird der pH-Wert auf 3,0 bis 3,5 mit einer physiologisch tolerierten Säure erniedrigt, vorzugsweise HCl, um die Löslichkeit des Analogons zu erhöhen. Andere physiologisch tolerierte Säuren sind unter anderem Essigsäure, Citronensäure und Phosphorsäure. Der pH-Wert wird dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf 7,1 bis 7,6 zur Kristallisation eingestellt. Andere physiologisch tolerierte Basen sind Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid.
Am signifikantesten ist, dass das Verfahren zur Herstellung des Lys^B28Pro^B29-hl-NPD-Komplexes gegenüber der NaCl Konzentration empfindlich ist. Falls die Konzentration etwa 4 mg/ml übersteigt, werden die Insulinanalogon-NPD-Kristalle mit einem amorphen Produkt gemischt. Demnach ist es bevorzugt, dass das mo nomere Analogon bei neutralem pH gelöst wird, um die Bildung von Salzionen zu vermeiden. Alternativ dazu kann das Analogon im Diluenten bei einem sauren pH vor der Zugabe des Puffers gelöst werden. Dies reduziert die Konzentration an Salzen, welche aufgrund der pH-Einstellung erzeugt werden. Jedoch ist die Reihenfolge, in der die Bestandteile zugegeben werden, für die Bildung des Hexamers oder der amorphen Formulierung nicht entscheidend.
Wie vorher beschrieben, kann ein isotonisches Mittel zu den erfindungsgemäßen Formulierungen gegeben werden. Die Zugabe des isotonischen Mittels kann zur Lösung des Analogons, zur Protaminlösung oder zur schließlichen Insulinanalogon-NPD-Formulierung erfolgen. Ähnlich kann die Zugabe des physiologisch tolerierten Puffers zur Lösung des Analogons, zur Protaminlösung oder zur schließlichen Insulinanalogon-NPD-Formulierung erfolgen. Jedoch ist es bevorzugt, das sowohl die Lösung des Analogons als auch die Protaminlösung das isotonische Mittel und den Puffer vor der Kombination der wässrigen Lösung mit dem Protamin enthalten. Aufgrund der NaCl-Wirkungen auf das Verfahren zur Herstellung des kristallinen Insulinanalogon-NPD ist Glycerin das bevorzugte isotonische Mittel.
Die Erfindung liefert auch Insulinanalogonformulierungen, die Gemische aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD als kristallinen Feststoff und löslichem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin umfassen. Diese Gemische werden in einem Bereich von 1:99 bis 99:1, bezogen auf das Volumen des suspendierten Insulinanalogon-NPD, zu löslichem Insulinanalogon hergestellt. Das lösliche Insulinanalogon ist ein monomeres Insulinanalogon, das in einem wässrigen Verdünnungsmittel gelöst wird, das umfasst: Zink, Phenol und bzw. oder m-Kresol, ein isotonisches Mittel und Puffer. Die im Verdünnungsmittel beschriebenen Konzentrationen sind dieselben, wie sie vorher beschrieben wurden. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD zu löslichem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin 25:75 bis 75:25 und vor allem 50:50. Diese Gemische werden leicht durch Mischen der einzelnen Bestandteile hergestellt.
Die gemischten Formulierungen der Erfindung sind aufgrund der Kombination aus schnellem Einsetzen der Wirkung und verlängerter Wirkdauer speziell zur Behandlung von Diabetes mellitus geeignet. Diese Gemische erlauben eine "feine Kontrolle" durch die Variation der Menge jedes einzelnen Bestandteils auf der Grundlage der Bedürfnisse, der Nahrung und der physischen Aktivität des Patienten. Das Gemisch an suspendiertem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD und löslichem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin ist ebenfalls vorteilhaft, da es homogen ist, das heißt jede Gleichgewichtsveränderung zwischen den suspendierten Kristallen und dem löslichen Insulinanalogon ersichtlich ist.
Das erfindungsgemäße Insulinanalogon kann auf eine Vielzahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich klassischer Verfahren (Verfahren in Lösung), Festphasenverfahren, halbsynthetischer Verfahren und neuerdings auch rekombinanter DNA Verfahren. Beispielsweise beschreiben Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 die Herstellung von verschiedenen Monomeranaloga.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur weiteren Erläuterung der Herstellung des Insulinanalogons und der Erfindung bereitgestellt. Der Schutzumfang der Erfindung besteht nicht nur aus den folgenden Beispielen.
Beispiel 1
Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hl-NPD
Eine Lösung des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins (Lys^B28Pro^B29-hl) mit einer Konzentration von 200 IE/ml (U200) wird durch Lösen von Zink enthaltenden Kristallen des Lys^B28Pro^B29-hl in einem Konservierungsmittel/Puffer-System hergestellt, das enthält: 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,73 mg/ml Phenol (äquivalent zu 0,65 mg/ml Phenol, das mit 89% verrechnet wird), 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml dibasischer Natriumphosphatpuffer. Die endogene Zinkmenge in den Kristallen wird durch Zugabe eines geeigneten Volumens einer sauren ZnO Lösung (10 mg/ml) zur Erlangung einer Endkonzentration von 0,025 mg/100 IE (0,7%) bereitgestellt. Das Lösen von Lys^B28Pro^B29-hl wird bei Umgebungstemperatur durch Erniedrigung des pH auf etwa 3 mit μl Volumina 5 M HCl erreicht. Nachdem sich die Lösung geklärt hat wird der pH mit μl Volumina 5 M NaOH wieder auf 7,5 eingestellt.
Es wird eine Protaminlösung durch Lösen von ausreichend festem Protaminsulfat in der Konservierungsstoff/Puffer-Lösung hergestellt, um eine Endkonzentration von 0,6 mg/100 IE berechnet auf der Grundlage der freien Base zu erreichen. Der pH dieser Lösung wird auf 7,5 eingestellt und auf 15°C äquilibriert.
Beide Lösungen werden auf eine Endkonzentration mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt und filtriert. 5 ml Aliquots des Lys^B28Pro^B29-hl Teils werden in getrennte saubere Gläschen gefüllt und die Proben werden in einem Wasserbad bei 15°C inkubiert. Nach einer ausreichenden Zeit zur Äquilibrierung (15 Minuten) wird die Fällung durch die schnelle Zugabe von 5 ml der Protaminlösung zu den Lys^B28Pro^B29-hl Proben induziert. Die Kristallisation kann für 24 Stunden bei 15°C weiterlaufen.
Beispiel 2
Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hl-NPD
Das Verfahren ist zu Beispiel 1 identisch, außer dass die Lösung des Lys^B28Pro^B29-hl bei neutralem pH erfolgt. Das Verfahren wird so ausgeführt, dass der schließliche pH 7,4 beträgt.
Beispiel 3
Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hl-NPD
Insulinanalogon-NPD wird auf eine zu Beispiel 1 analoge Weise hergestellt, aber die Säurelösung von Lys^B28Pro^B29-hl wird in Gegenwart aller Hilfsstoffe außer dem dibasischen Natriumphosphatpuffer durchgeführt. Festes dibasisches Natriumphosphat wird zugegeben, nachdem die Insulinanalogonlösung wieder pH 7,4 hat. Die Zugabe des dibasischen Natriumphosphats klärt die Lösung.
Beispiel 4
Herstellung von Insulinanalogon-NPD Mischformulierungen
Gemische von mittellang und schnell wirkenden Lys^B28Pro^B29-hl Formulierungen werden folgendermaßen hergestellt. Die Suspensionspräparation mit mittlerer Wirkdauer wird durch die in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt und dient als Anteil mit mittlerer Wirkdauer für das Gemisch. Es wird eine getrennte Lö sung des Lys^B28Pro^B29-hl (100 IE) durch Lösen von Zink-enthaltenden Lys^B28Pro^B29-hl Kristallen bei Umgebungstemperatur in dem in Beispiel 1 beschriebenen Verdünnungsmittel hergestellt. Die endogene Zinkmenge des Lys^B28Pro^B29-hl in dieser Lösung wird durch die Zugabe von saurer ZnO-Lösung bereitgestellt, um die Menge im Suspensionsteil anzupassen (das heißt 0,025 mg/100 IE (0,7%). Wasser für Injektionszwecke wird zur Verdünnung der Lösung auf eine Endkonzentration verwendet, nachdem der pH unter Verwendung von 10%igen HCl und/oder NaOH Lösungen auf 7,4 eingestellt wurde. Diese Lösung ist der schnell wirkende Teil der Gemische. Das schließliche Gemisch wird durch Kombination von geeigneten Volumina der mittellang und schnell wirkenden Anteile hergestellt, um das gewünschte Verhältnis zu erreichen. Ein 50/50 Gemisch wird durch Kombination von einem Volumenteil des Anteils mit mittlerer Wirkdauer mit einem Volumenteil des Anteils mit schneller Wirkung hergestellt.
Beispiel 5
Auswirkung der Ionenstärke auf die Lys^B28Pro^B29-hl-Protamin-Kristallisation
Die Auswirkungen der Ionenstärke auf die Kristallisation werden durch die Zugabe von NaCl zu dem Lys^B28Pro^B29-hl Anteil vor dem Mischen mit Protamin ausgetestet. NaCl wird so zugegeben, dass die Gesamtkonzentration 20, 30 und 40 mM (1,2, 1,8 und 2,3 mg/ml) beträgt. Die Volumenpartikelgröße zeigt ein multimodulares Verhalten (zusätzliche Peaks mit kleinen Partikelgrößen), wenn die NaCl Konzentration erhöht wird. Die mittlere Volumenpartikelgröße nimmt ab, wenn die NaCl Konzentration erhöht wird, was eine Zunahme an amorphem Material anzeigt. Die Ergebnisse der Partikelgröße in Abhängigkeit von der NaCl Konzentration sind folgende:

[NaCl] Mittlere Volumenpartikelgröße (μm]

13 mM 3,9

29 mM 3,5

30 mM 3,3

40 mM 3,2
Die Analyse mit dem Mikroskop zeigt, dass alle Proben ein Gemisch aus amorphem und kristallinem Material enthalten. Die 40 mM NaCl enthaltende Probe hat das meiste amorphe Material und sehr wenig Kristalle.
Beispiel 6
Dynamik von Lys^B28Pro^B29-hl-NPD und Humaninsulin-NPH im Vergleich
Diese Untersuchung wird an einem Hundemodell ohne Betäubung durchgeführt. Vor dem Beginn der Untersuchung werden drei Grundproben entnommen. Eine Infusion von Somatostatin (0,3 μg/kg-min) wird eingeleitet. Nach einem 10 Minutenintervall wird eine subkutane Injektion entweder von NPD oder NPH verabreicht. Ein häufiges Überwachen der Plasmaglucose wird veranlasst und eine variable Glucoseinfusion (20%) wird ver abreicht, um eine nahezu normale Glykämie aufrechtzuerhalten. Dabei werden Proben entnommen und auf immunreaktives Insulin (Linco-Antikörper) und Glucose untersucht. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Die gemäß den obigen Beispielen hergestellten Kristalle sind in 2 gezeigt.

Claims

Kristalliner Insulinanalogonprotaminkomplex, der enthält: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Protamin, Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol.
Komplex nach Anspruch 1, der besteht aus Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol.
Parenterale pharmazeutische Insulinanalogon-Protamin-Formulierung, die den Komplex nach Anspruch 1 enthält.
Parenterale pharmazeutische Insulinanalogon-Formulierung, die den Komplex nach Anspruch 2 enthält.
Formulierung nach Anspruch 3, die ferner 0,2 bis 1,5 mg Protamin/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol enthält.
Parenterale pharmazeutische Formulierung, die enthält: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,3 mg Protamin/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, 0,7 Gewichtsprozent Zink, 1,7 mg/ml m-Kresol, 0,7 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml dibasisches Natriumphosphat.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, die ferner lösliches Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin enthält.
Parenterale pharmazeutische Formulierung, die enthält: ein Gemisch aus einem kristallinen Insulinanalogonprotaminkomplex gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie einem löslichen Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol, wobei das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten 1:99 bis 99:1 Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin zu dem kristallinen Insulinanalogonprotaminkomplex beträgt.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 8, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten 75:25 bis 25:75 beträgt.
Verfahren zur Herstellung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protamin-Kristallen, das umfasst: Kombination einer wässrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von 8°C bis 22°C, wobei diese wässrige Lösung 0,35 bis 0,9 Gewichtsprozent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Phenol und bzw. oder m-Kresol bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 enthält, und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 enthält, so dass die Protaminendkonzentration 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Temperatur 15°C, die Zinkkonzentration 0,7% bis 0,9% und die Protaminkonzentration 0,3 mg/100 IE Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin beträgt.