DE19615161A1 - Optische Abtastvorrichtung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine optische Ab­ tastvorrichtung, und insbesondere auf eine Vorrichtung zur Verwendung beim Abtasten eines Mikroarray von Probenregi­ onen, wie z. B. einem Array einer fluoreszierenden Probenre­ gion auf einem Substrat.

Es gibt einen wachsenden Schwerpunkt auf den Gebieten der Arzneimitteltrennung, der Nukleinsäure-Sequenzierung und -Analyse und der Proteinentwicklung, beim Vorbereiten und "Ablesen" hochdichter Arrays von chemischen oder biolo­ gischen Spezies. Derartige Arrays können nun effizient durch massive Parallelschemata vorbereitet werden, wie z. B. die selektiven Photomaskentechniken, die im US-Patent Nr. 5.143.854 offenbart werden. Mikroarrays dieses Typs werden typischerweise in einem ebenen Bereich zwischen etwa 4-100 mm² gebildet, wobei sie Dichten von bis zu mehreren hundert­ tausend oder mehr verschiedenen Arraygliedern/cm² aufweisen können.

Bei der üblichen Anwendung bilden die Glieder der Mikro­ arrays Bibliotheken von oligonukleotiden oder Polypeptiden unterschiedlicher Sequenz oder Kleinmolekül-Bibliotheken mit unterschiedlichen R-Gruppenpermutationen, wobei jede Array­ sequenz oder Permutation positionsmäßig adressierbar ist, d. h., daß jede Arrayposition mit einer bekannten Sequenz oder Permutation übereinstimmt.

Im Gebrauch reagiert eine Arrayoberfläche mit einem oder mehreren Analyten, wie z. B. Polynukleotidanalyten, Rezeptor­ proteinen oder Anti-Ligandmolekülen, unter Bedingungen, die eine spezifische Bindung mit hoher Affinität der Analytmole­ küle an ein oder mehrere der Arrayglieder unterstützt. Es ist das Ziel ein oder mehrere positionsmäßig adressierbare Glieder des Bibliothekarrays, die sich an das Analyt binden, als ein Sieb-Verfahren für Arrayverbindungen, die sich an das Analyt binden oder im Fall des Oligonukleotidarrays, als ein Erfassungsverfahren für Arrayglieder, die sich mit dem (den) Analytmolekül(en) kreuzen können, zu identifizieren.

Typischerweise wird das Analyt mit einem erfaßbaren Repor­ termittel markiert, wie z. B. einer fluoreszierenden Kennung, die tatsächlich eine oder mehrere Arrayregionen fluoreszie­ rend markieren kann, an denen eine Analytbindung zum Array auftritt. Bei relativ hochentwickelten Schemata werden zwei oder mehrere Analyte mit unterschiedlich fluoreszierenden Kennungen markiert, wobei das Ausmaß einer Analytbindung an die Arrayglieder gemäß dem Pegel einer Fluoreszenz an Array­ bindungspositionen quantifiziert (quantitated) werden kann.

Es wurde eine Vielzahl von optischen Abtastgeräten zum Ab­ lesen von Mikroarrays diesen Typs vorgeschlagen. Das US- Patent Nr. 5.324.633 beschreibt z. B. ein konfokales Fluores­ zenz-Mikroskopgerät, bei dem ein Laserlichtstrahl durch ein Linsensystem auf eine kleine Region eines Substrats fokus­ siert wird (ein Lichtpunkt, der kleiner ist als der Bereich jeder Arraygliedregion). Das gleiche Linsensystem wird ver­ wendet, um die Fluoreszenzemission von der beleuchteten Re­ gion auf einen Photodetektor durch einen dichroitischen Spiegel abzubilden. Eine in X-Y-Richtung bewegliche Stufe ist wirksam, um jede Arrayregion in dem Substrat nacheinan­ der in dem Beleuchtungsbereich des Laserstrahls zu positio­ nieren.

Konfokale Abtastmikroskope, die entworfen sind, um die far­ bige Aberration zu korrigieren, die wegen den unterschied­ lichen Wellenlängen des Beleuchtungsstrahls eines Fluores­ zenzsignals von der Probe auftritt, wurden ebenfalls vorge­ schlagen, z. B. die US-Patente Nr. 5.296.700 und 5.260.578. Sogar mit relativ aufwendigen Linsensystemen weisen konfo­ kale Abtastmikroskope jedoch eine Anzahl von inhärenten Merkmalen auf, die die Probenauflösung und das erreichbare Signal/Rauschverhältnis begrenzen.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung optische Ab­ tastvorrichtungen zu schaffen, die eine erhöhte Probenauf­ lösung und ein verbessertes Signal/Rauschverhältnis aufwei­ sen. Diese Aufgabe wird durch optische Abtastvorrichtungen gemäß den Ansprüchen 1 und 12 gelöst.

Die Erfindung umfaßt bei einem Ausführungsbeispiel eine op­ tische Abtastvorrichtung zum Abtasten eines Arrays von Pro­ benregionen, das auf der Oberfläche eines Substrats gehalten ist. Die Vorrichtung weist einen Strahlgenerator zum Erzeu­ gen eines Lichtstrahls auf, der wirksam ist, um erfaßbares Licht, z. B. eine Fluoreszenzemission, von den Probenregionen zu erzeugen, und eine Struktur zum Abtasten des Strahls in einer Richtung entsprechend einem linearen Array der Proben­ regionen. Ein optisches System ist bei der Vorrichtung ent­ worfen, um das Licht von dem linearen Array von Probenregi­ onen als Reaktion auf eine Bestrahlung mit einem Strahl ent­ lang von optischen Achsen, die winkelmäßig von den ent­ sprechenden optischen Achsen des Abtaststrahls versetzt sind, abzubilden. Das abgebildete Licht wird durch eine op­ tische Erfassungseinheit erfaßt.

Der Strahl kann eine Strahlweite von weniger als etwa 5 µm im Fokus aufweisen, wobei die Abtaststruktur wirksam sein kann, um den Strahl insgesamt mindestens etwa 2-10 mm ent­ lang dem Probenarray zu bewegen.

Die Linsenanordnung weist vorzugsweise eine numerische Aper­ tur von mindestens etwa 0,25 und eine Abtastlinse mit einer numerischen Apertur von mindestens 0,1 auf.

Bei einem allgemeinen Ausführungsbeispiel umfaßt die Erfas­ sungseinheit eine Detektoroberfläche und einen Spalt, der zwischen dem optischen Abbildungssystem und der Detektor­ oberfläche angeordnet ist. Das Abbildungssystem ist wirksam, um die Lichtemission von dem Probenarray durch den Spalt ab­ zubilden, während der Strahl entlang der einen Richtung ab­ getastet wird. Wenn das Abbildungssystem eine feste optische Achse aufweist, liefert ein von dem Probenarray emittiertes Licht, das aus der Achse ist, ein astigmatisches Bild. Der Spalt wird vorzugsweise nach einem der astigmatischen Bilder ausgerichtet.

Der Detektor kann einen räumlich nicht auflösenden Photode­ tektor aufweisen, oder einen Photodetektor, wie z. B. ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD; CCD = Charge-Coupled Device), das ein ein- oder zweidimensionales Array von pho­ toempfindlichen Elementen aufweist. Wenn der Detektor räum­ lich auflöst, kann das emittierte Licht direkt auf dieses Array abgebildet werden, d. h. ohne durch einen Spalt geführt zu werden.

Zum Abtasten eines zweidimensionalen Arrays von Probenre­ gionen umfaßt die Vorrichtung eine Struktur zum Verschieben der Probe in einer Richtung senkrecht zu der Richtung der Strahlabtastung. Die Vorrichtung kann ferner eine Steuerein­ heit zum (i) Steuern der Abtaststruktur, (ii) Aufzeichnen der momentanen Position des Strahls und (ii) Korrelieren der momentanen Positionen des Strahls mit Signalen umfassen, die von dem Detektor empfangen werden, zum Aufbauen eines Dia­ gramms von Substratlichtemissionspegeln, als eine Funktion einer Substratposition.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend bezugnehmend auf die beiliegenden Zeich­ nungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer optischen Ab­ tastvorrichtung, die gemäß der Erfindung aufgebaut ist;

Fig. 2 eine schematische Darstellung von Komponenten bei der Vorrichtung zum Abtasten eines Beleuchtungs­ strahls in einem linearen Array in der Probe;

Fig. 3 eine schematische Darstellung von Komponenten bei der Vorrichtung zum Erfassen eines emittierten Lichts von einer Probe, während der Beleuchtungs­ strahl über einem linearen Array in der Probe abge­ tastet wird;

Fig. 4 Probenregionen einer Lichtstrahlanregung und einer Lichtemissionserfassung bei der Vorrichtung;

Fig. 5 eine Draufsicht eines Teils einer Probe, die ein Array von unterschiedlichen Probenregionen dar­ stellt, wobei eine Bewegung des Anregungsstrahls durch eine Probenregion in einer Abtastrichtung ge­ zeigt ist;

Fig. 6 ein Diagramm, das die gemessene Lichtemission von einer Probe zeigt, während ein Anregungsstrahl über einem linearen Array von Regionen in der Probe ab­ getastet wird; und

Fig. 7 einen Teil eines Probenarraydiagramms, das von Pro­ benemissionsmustern aufgebaut wird, gemäß der Er­ findung.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht einer optischen Abtast- Vorrichtung oder eines -Mikroskops 10, das gemäß der Erfin­ dung aufgebaut ist. Das Mikroskop umfaßt eine Lichtquelle 12 zum Erzeugen eines Probenbeleuchtungsstrahls 14 und ein Lin­ sensystem, das durch die Linse 16 angedeutet ist, zum Fokus­ sieren des Beleuchtungslichtstrahls auf einen Beleuchtungs­ bereich gewünschter Größe auf einem Probensubstrat 18.

Die Lichtquelle besteht bei der Vorrichtung vorzugsweise aus einem Laser zum Erzeugen eines kohärenten Lichtstrahls mit einer ausgewählten Wellenlänge, typischerweise eine ultra­ violette oder eine Wellenlänge im unteren sichtbaren Be­ reich, entsprechend der Fluoreszenzanregungswellenlänge eines gegebenen fluoreszierenden Probenreportermittels. Eine exemplarische Lichtquelle ist ein Argonlaser. Die Lichtquel­ le und Fokussierungslinsen werden hierin zusammengefaßt auch als ein Strahlgenerator bezeichnet. Der Strahlgenerator kann ferner einen Strahlaufweiter aufweisen, der wirksam ist, um den Strahldurchmesser des Lasers an einen, für die Abtast­ linsen geeigneteren Durchmesser anzupassen.

Bezugnehmend auf die Fig. 1 und 2 wird das Licht von Quelle 12 durch einen Spiegel 19 auf die Probe reflektiert. Der Spiegel ist für eine Winkelbewegung um eine Achse 20 unter der Steuerung eines Motors 22 drehbar befestigt, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Ein geeigneter Motor, wie z. B. ein Galvo-Ab­ tastvorrichtungsmotor, zum Steuern der Spiegelbewegung ist, wie ein Abtastspiegel, auch handelsüblich erhältlich.

Die Drehbewegung des Spiegels ist ausgelegt, um den Strahl in eine Richtung (orthogonal zur Zeichenebene in Fig. 1 und in einer Richtung von links nach rechts in Fig. 2) über ein lineares Array von Probenregionen auf einer Probe 18 abzu­ tasten, falls der Motor 22 geeignet aktiviert ist. In Fig. 2 liegt das lineare Probenarray auf der Probenoberfläche zwi­ schen Punkten a und c, entsprechend einem typischen Abtast­ abstand von mindestens 2-10 mm. Eine Spiegelbewegung zwi­ schen den Positionen, die durch die gestrichelten und durch­ gezogenen Linien in der Figur angezeigt sind, tastet den fo­ kussierten Beleuchtungsstrahl zwischen den Punkten "a" und "c" auf dem Substrat ab.

Wieder bezugnehmend auf Fig. 1 bewegt sich der abgetastete Strahl in einer Ebene 23, die das lineare Probenarray schneidet und senkrecht auf der Ebene von Fig. 1 steht. Bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Abtastebene senk­ recht zu der Oberfläche der Probe, obwohl auch schiefe Ein­ fallswinkel in Erwägung gezogen werden. Ein Motor 22 befin­ det sich unter der Steuerung einer Steuervorrichtungs-/Ana­ lysator-Einheit 24, deren Betrieb im folgenden beschrieben wird.

Der Spiegel 19 und sein antreibender Motor 22 werden hierbei auch zusammen als Abtasteinrichtung zum Abtasten des Licht­ strahles von der Quelle 12 in einer Richtung entsprechend einem linearen Array von Probenregionen bezeichnet. Das Lin­ sensystem, das durch ein Linsenelement 16 dargestellt ist, ist ein Abtastlinsensystem, wie z. B. bei Smith, W.J., Modern Lens Design, McGraw Hill, 1992, S. 413, beschrieben ist. Das Linsensystem weist vorzugsweise eine numerische Apertur von mindestens etwa 0,1 auf, wobei es ein Feld-abflachendes Lin­ senelement umfassen kann.

Ein zweites oder Abbildungs-Linsensystem bei der Vorrichtung umfaßt ein Kollimations-Linsenelement 26 und ein Fokus­ sierungslinsenelement 28. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, werden Lichtstrahlen von einem gegebenen Objektpunkt zwischen den Linsen 26 und 28 parallel gerichtet. Das Abbildungslinsen­ system ist ausgelegt, um das Licht, das von der Probe als Reaktion auf die Beleuchtung durch den Strahl 14 emittiert wird, in einer Abbildungsebene, die bei 32 angezeigt ist, abzubilden. Genauer gesagt wird diese Ebene, die senkrecht auf der Ebene von Fig. 1 steht, durch eine Reihe von Licht­ emissionsachsen definiert, wobei jede die Achse des Lichts darstellt, die von einer beleuchteten Region der Probe emit­ tiert wird und durch das Abbildungs-Linsensystem geführt wird, während der Beleuchtungsstrahl innerhalb einer Abta­ stungs-Ebene 23 abgetastet wird. Gemäß einem wichtigen Merk­ mal der Erfindung werden die Achsen, die die Ebene 32 defi­ nieren, winkelmäßig von den entsprechenden Beleuchtungs­ strahlachsen um einen Winkel α versetzt, wobei getrennte Optiken für Beleuchtungs- und Abbildungslichtstrahlen möglich sind.

Das Abbildungssystem kann auch ein Filter 34, wie z. B. ein Bandpaßfilter, zum selektiven Sperren des Beleuchtungs­ strahllichts, das von der Probenoberfläche reflektiert wird, aufweisen. Die Elemente in dem System, einschließlich der Linsenelemente 26, 28 und des Filters 34, werden hierin auch als Abbildungseinrichtung bezeichnet. Natürlich kann das Filter auch eines aus einem Satz von verschiedenen Filtern sein, ein derartiges Filter in einem Filterrad, wobei unter­ schiedliche Filter in dem Satz zum Abtasten von unterschied­ lichen Farbstoffen optimiert sind.

Wie in Fig. 1 und 3 gezeigt ist, wird Licht von dem Abbil­ dungssystem auf einen Detektor 36 zum Messen eines emit­ tierten Lichtes von einer Probenoberfläche fokussiert. Bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel besteht der Detektor aus einer handelsüblichen Photozelle mit einer räumlich nicht auflösenden Lichterfassungsoberfläche 38 zum Erfassen und räumlichen Integrieren des gesamten, auf die Erfassungsober­ fläche einfallenden Lichts. Ein geeigneter Detektor dieses Typs ist eine konventionelle Photovervielfacherröhre. Alter­ nativ kann der Detektor ein ein- oder zweidimensionales Array von Lichtelementen umfassen, wie sie z. B. in einem ladungsgekoppelten Standardelement (CCD) vorgesehen sind.

Eine Platte 40 mit einem verlängerten Spalt 42 ist zwischen dem Abbildungssystem und der Detektoroberfläche unmittelbar an die Detektoroberfläche angrenzend angeordnet, deren Funk­ tion es ist, die Tiefenunterscheidung durchzuführen. Die Spaltbreite beträgt vorzugsweise zwischen etwa 10 und 200 mm und die Spaltlänge zwischen 2 und 20 mm. Eine geeignete Spaltplatte diesen Typs ist handelsüblich erhältlich und kann entsprechend modifiziert werden. Wie in den Fig. 1 und 3 zu sehen ist, ist der Spalt 42 positioniert und dimensio­ niert, um das fokussierte, abgebildete Licht von dem Ab­ bildungssystem auf die Detektoroberfläche durchzulassen, während der Beleuchtungsstrahl über ein Substratarray abge­ tastet wird. Insbesondere wird Licht, das von den Endregi­ onen "a" und "c" und der Mittelregion "b" eines linearen Arrays auf dem Substrat emittiert wird, durch den Spalt zu den Punkten "a′", "c′", bzw. "b′" auf die Detektoroberfläche geleitet. Der Abstand zwischen den Endregionen "a′" und "c′" in dem Spalt entspricht ungefähr dem Abstand zwischen den Punkten "a" und "c" auf dem Substrat, d. h. in dem Bereich von 2-20 mm.

Falls durch ein Substrat in einem schiefen Winkel (Winkel α in dem gezeigten Ausführungsbeispiel) abgebildet wird, tre­ ten Aberrationen sogar für eine perfekte Linse auf. Diese führen zu einem astigmatischen Verhalten, bei dem das Strah­ lenbündel zuerst zu einem Punkt, der eine minimale Ausdeh­ nung in einer Dimension aufweist, konvergiert, dann zu einem Kreis von geringster Verwaschung mit etwas größerer, iden­ tischer Abmessung in den beiden Dimensionen orthogonal zu der Ausbreitungsrichtung und dann zu einem Punkt mit minima­ ler Ausdehnung in die andere der beiden Dimensionen. Es ist vorteilhaft, die Abbildungsoptik derart zu fokussieren, daß sich der Spalt in der Ebene befindet, für die die längeren Ausdehnungen eines Punktes und der Spalt zueinander und zu der Abtastrichtung parallel sind.

Wieder bezugnehmend auf Fig. 1, umfaßt die Vorrichtung gemäß der Erfindung ferner eine Stufe 44, auf der ein Substrat ge­ halten ist. Die Stufe ist in die Richtung eines Pfeils 46 entlang einer Achse entsprechend der Ebene von Fig. 1, senk­ recht zu der Abtastrichtung des Beleuchtungsstrahls, beweg­ lich. Die Stufe ist unter der Steuerung der Einheit 24 in inkrementalen Schritten, die angrenzenden linearen Arrays in einem zweidimensionalen Arraymuster auf einem Substrat ent­ sprechen, und typischerweise in inkrementalen Schritten in dem Bereich von 1-20 µm beweglich. Mikroskopstufen und Stellglieder für eine inkrementale Stufenbewegung in einer einzelnen Richtung sind handelsüblich erhältlich.

Um die Beschreibung der Vorrichtung zu vervollständigen, ist anzugeben, daß die Einheit 24 eine Mikroprozessorvorrichtung ist, die, wie gezeigt ist, mit (i) einem Motor 22, zur Steu­ erung der Position und der Bewegung des Abtastspiegels 19, mit (ii) einer Stufe 44, zur Steuerung der Position und Be­ wegung von Stufe 44, und mit (iii) einem Photodetektor 36, zum Empfangen digitalisierter oder analoger Detektorsignale, die auf einen Lichtemissionspegel, der durch den Photodetek­ tor gemessen wird, und den Beleuchtungsstrahl und auf die Stufenposition bezogen sind, wirksam verbunden ist. Der funktionelle Entwurf der Einheit ist konventionell und wird durch den Betrieb des Geräts, der nun beschrieben wird, of­ fensichtlich.

Wie im vorhergehenden gezeigt ist, ist das Mikroskop dazu bestimmt, ein planares Mikroarray von Probenregionen auf ei­ ner Oberfläche eines Substrats abzutasten, um erfaßbare Re­ portermittelgruppen, die in einer oder mehreren der Arrayre­ gionen positioniert sind, zu erfassen und optional zu quan­ tifizieren. Bei den im folgenden diskutierten Beispielen bestehen die Reportermittelgruppen aus fluoreszierenden Re­ portermitteln, obwohl andere Reportermittel, die geeignet sind, ein erfaßbares Lichtsignal als Reaktion auf eine Strahlbeleuchtung zu erzeugen, in Erwägung gezogen werden.

Als ein Beispiel kann das Substrat-Mikroarray aus einem hochdichten, zweidimensionalen Array von oligonukleotiden unterschiedlicher Sequenz bestehen, dessen Sequenzen zur Verwendung bei der Sequenzierung durch eine Hybridisierung oder durch die Erfassung von veränderlichen Formen einer analytischen Nukleinsäure geeignet sind. Eine Lösung eines fluoreszierend markierten Nukleinsäureanalyts wird auf dem Mikroarray unter Bedingungen einer ausgewählten Strenge pla­ ziert, was zur Hybridisierung des Analyts mit Komplementär- Sequenz Oligonukleotiden in dem Array und einer fluores­ zierenden Markierung in den Arrayregionen, in denen eine derartige Bindung auftritt, führt. Das Substrat wird dann gespült, um ungebundene und nicht-spezifisch gebundene Analyte zu entfernen.

Als weiteres Beispiel kann das Mikroarray vorbereitet wer­ den, um ein hochdichtes Array von Polypeptiden unterschied­ licher Sequenz zu umfassen, die zusammen eine kombinato­ rische Peptid-Bibliothek bilden. Diesem Array wird ein fluoreszierend markierter Rezeptor oder Anti-Ligandanalyt hinzugefügt, der sich mit hoher Affinität an ein oder mehrere der Bibliotheksglieder binden kann. Nachdem die Arrayoberfläche dem markierten Ziel ausgesetzt wurde, wird die Oberfläche gespült, um ein ungebundenes oder schwach ge­ bundenes Ziel zu entfernen, wobei nur eine fluoreszierende Markierung von Regionen mit hoher Affinität des Mikroarrays zurückbleibt.

Es sind auch andere Typen von ein- oder zweidimensionalen Mikroarrays, wie z. B. Kleinmolekül-Bibliotheksarrays, Arrays einzelner Klon-Zellen, und dergleichen geeignet.

Nach einer fluoreszierenden Markierung wird das Substrat zum Abtasten und zur Abbildung der Fluoreszenzposition auf der Mikroskopstufe plaziert. Bei der Anordnung, die in Fig. 4 gezeigt ist, besteht das Probensubstrat aus einem licht­ durchlässigen Glasträger 50 mit einem Mikroarray, das auf dessen unterer Oberfläche 52 gebildet ist, und setzt sich aus einem zweidimensionalen Array von Regionen zusammen, wie z. B. von Regionen 54, 56 in der Fig. 4. Jede gezeigte Region ist ein Glied eines linearen Arrays, wie z. B. ein Array 58, das die Region 56 enthält, das sich in einer Richtung senk­ recht zur Zeichenebene erstreckt.

Die Strahldiagramme in Fig. 4 stellen unterschiedliche Merk­ male der Erfindung dar. Als erstes kann der Beleuchtungs­ strahl durch eine Linse 16 fokussiert werden, um eine hohe Auflösung zu erreichen, was bedeutet, daß der Beleuchtungs­ punkt auf der Ebene des Mikroarrays wesentlich kleiner ist als die Abmessungen einer Arrayregion. Eine hohe Strahlauf­ lösung kann bei der vorliegenden Erfindung mit einer relativ preiswerten monochromatischen Optik erreicht werden, die eine numerische Apertur von etwa 0,1 oder mehr aufweist.

Die Fähigkeit eines kleinen Strahlpunktes, die Auflösung und Quantifizierung (quantitation) einer Lichtemission von einer Arrayregion zu verbessern, ist in Fig. 5 dargestellt, die eine Bewegung eines fokussierten Beleuchtungsstrahls 60 in und durch eine Region 54 entlang eines linearen Arrays 58 zeigt. Typische Abmessungen für den Strahlpunkt sind 5 µm oder weniger und Abmessungen für jede Arrayregion sind 10 - 20 µm. Wie zu sehen ist, wird der Strahl durch mehrere Posi­ tionen laufen, in denen er völlig in der Region positioniert ist, sowie durch eine Überlappungsposition mit angrenzenden Positionen. Als ein Ergebnis kann ein emittiertes Lichtpro­ fil mit einer im wesentlichen rechteckigen Form, wie z. B. in Fig. 6 gezeigt ist, erhalten werden. Der Betrag einer gebun­ denen, fluoreszierenden Markierung in jeder markierten Regi­ on kann durch Integrieren des Bereichs unter jeder Spitze quantifiziert werden. Das räumliche Integrieren kann, in dem Fall eines räumlich nicht auflösenden Lichtdetektors, durch den Detektor oder durch die Einheit 24 durchgeführt werden, wobei digitalisierte Lichtinformationen von dem Detektor empfangen werden. Bei dem in Fig. 6 gezeigten Beispiel ist das Lichtintensitätsverhältnis der zwei Spitzen in dem abge­ tasteten linearen Array etwa 3 : 1.

Wieder bezugnehmend auf Fig. 4 ist ersichtlich, daß, da die Abbildungsoptik unabhängig von der Beleuchtungsstrahloptik ist, die Abbildungsoptik unabhängig entworfen und fokussiert werden kann, um die Lichtsammlung von den beleuchteten Sub­ stratregionen zu optimieren. Insbesondere kann der Auflö­ sungsbereich der Abbildungsoptik an der Mikroarrayoberfläche den gesamten Beleuchtungsstrahlpunkt ohne Auflösungsverlust umfassen. Gleichzeitig kann die Abbildungsoptik eine relativ große numerische Apertur aufweisen, z. B. größer als 0,25, um eine emittierte Lichtintensität an dem Detektor zu erhöhen. Zusätzlich besteht kein Bedarf nach speziellen Linsenkom­ ponenten, um eine chromatische Aberration zu reduzieren, da das Abbildungssystem ausgelegt ist, um nur das abgebildete monochromatische Licht zu fokussieren. Ferner kann, da nur geringe Beträge von mittels Streuungen gestreutem Beleuch­ tungsstrahllicht das Abbildungssystem erreichen, dieses Licht durch Lichtfilterung ohne bedeutenden Verlust von emittiertem Licht entfernt werden.

Bei einem typischen Abtastbetrieb wird die Stufe bewegt, um die Abtastebene zu positionieren, um einem der linearen Arrays, wie z. B. Array 58, zu entsprechen. Der Beleuchtungs­ strahl wird nun über das lineare Array in der Abtastebene 23 abgetastet, wobei eine Fluoreszenzlichtemission in jeder Re­ gion in dem Array, in der ein markierter Analyt gebunden ist, angeregt wird. Das emittierte Licht wird durch den Spalt 42 auf den Photodetektor abgebildet und die Intensität der Lichtemission wird gemessen. Die gemessene Intensität, die jeder Spiegelposition oder alternativ jedem Fühler in einem vielzelligen Photodetektor zugeordnet ist, wird mit der zugeordneten Region in der Abtastebene in der Einheit 24 aufgezeichnet und gespeichert.

Nachdem die Regionen in einem linearen Array abgetastet wer­ den, wird die Stufe bewegt, um die Abtastebene zu plazieren, um dem nächsten linearen Array zu entsprechen, wobei dieses Array nun wie im vorhergehenden abgetastet und aufgezeichnet wird.

Wie im vorhergehenden gezeigt ist, befindet sich die Positi­ on der Stufe und die Position und die Bewegung des Abtast­ spiegels 19 unter der Steuerung von der Einheit 24, die die momentane Mikroarrayposition unter einer Beleuchtung auf­ zeichnet. Diese Position wird mit dem entsprechenden Licht­ intensitätswert, der jeder Mikroarrayposition zugeordnet ist, gespeichert, um eine Beleuchtungstabelle des Mikro­ arrays aufzubauen. Alternativ oder zusätzlich kann die Po­ sition des Abtaststrahls entlang des linearen Arrays von Re­ gionen, die abgetastet werden, aus der Position des Licht­ erfassungselements, das emittiertes Licht empfängt, wenn der Photodetektor ein Array von derartigen Elementen besitzt, bestimmt werden.

Nachdem ein Array abgetastet wurde, gibt die Einheit 24 ein Arraydiagramm, das die Lichtintensität, die jeder Region in dem Array zugeordnet ist, zeigt. Fig. 7 zeigt ein typisches Intensitätsdiagramm für einen Teil eines zweidimensionalen Arrays 62, bei dem der Schattierungspegel in Fluoreszenz­ regionen 64, 66 in dem Array auf die gesamte integrierte Lichtintensität bezogen ist, die an der zugeordneten Array­ region gemessen wird. Die Ausgabe kann auch die Identität der Molekularspezies, an der ein Fluoreszenzsignal beobach­ tet wurde, oder, im Fall der Sequenzierung durch eine Hybri­ disierung, analytische Sequenzinformationen umfassen.

Claims (15)

1. optische Abtastvorrichtung (10) zum Abtasten eines Arrays (58; 62) von Probenregionen (54, 56; 64, 66), das auf der Oberfläche eines Substrats (18) gehalten ist, die folgende Merkmale aufweist:
einen Strahlgenerator (12, 16) zum Erzeugen eines Licht­ strahls (14), der wirksam ist, um erfaßbares Licht von derartigen Probenregionen (54, 56; 64, 66) zu erzeugen,
eine Einrichtung (19, 22) zum Abtasten des Strahls (14) in einer Richtung, die einem linearen Array (58) der­ artiger Probenregionen entspricht,
eine Einrichtung (24, 28, 34) zum Abbilden von Licht, das Licht von einem derartigen linearen Array (58) von Probenregionen (54, 56) entspricht, als Reaktion auf eine Bestrahlung mit dem Strahl (14), wobei die op­ tischen Achsen (32) des abgebildeten Lichts winkelmäßig von den entsprechenden optischen Achsen (23) des abge­ tasteten Strahls versetzt sind, während der Strahl (14) in der einen Richtung abgetastet wird, und
eine Erfassungseinrichtung zum Erfassen des abgebildeten Lichts von der Abbildungseinrichtung (26, 28, 34).

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Erfassungsein­ richtung eine Detektoroberfläche (38) und einen Spalt (42), der zwischen der Abbildungseinrichtung (26, 28, 34) und der Detektoroberfläche (38) angeordnet ist, auf­ weist, und bei der die Abbildungseinrichtung (26, 28, 34) wirksam ist, um die Lichtemission von dem Proben­ array (58; 62) durch den Spalt (42) abzubilden, während der Strahl (14) in der einen Richtung abgetastet wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der die Abbildungsein­ richtung (26, 28, 34) ein astigmatisches Bild, das par­ allel zu dem Spalt (42) ausgerichtet ist, erzeugt, während der Strahl (14) in der einen Richtung über ein Proben­ array (58) abgetastet wird, wobei sich der Spalt (42) in einer Ebene (32) befindet, die mit dem astigmatischen Bild zusammenfällt.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 2 oder 3, bei der der Spalt 42 gerade ist.

5. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der Strahl (14) eine Strahlweite von weniger als etwa 5 µm im Fokus aufweist, und bei der die Abtasteinrichtung (19; 22) wirksam ist, um den Strahl (14) insgesamt min­ destens etwa 10 mm in der einen Richtung zu bewegen.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 4 oder 5, bei der die Abbil­ dungseinrichtung (26, 28, 34) eine Linsenanordnung (26, 28) mit einer numerischen Apertur von mindestens etwa 0,25 aufweist.

7. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Ver­ wendung bei einer Abtastung eines zweidimensionalen Arrays (62) von Probenregionen (64, 66), die ferner eine Einrichtung zur Verschiebung der Probe in einer Richtung (46) senkrecht zu der Richtung der Strahlabtastung um­ faßt.

8. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, zur Ver­ wendung mit einem lichtdurchlässigen Substrat (18), bei der der Strahl (14) angepaßt ist, um auf Probenregionen (54, 56; 64, 66) auf der Probenoberfläche durch das Sub­ strat (18) einzufallen, und bei der die Abbildungsein­ richtung (26, 28, 34) angepaßt ist, um das Licht, das durch das Substrat (18) empfangen wird, abzubilden.

9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der der Strahl (14) wirksam ist, um eine Probenfluoreszenz­ emission bei einer ausgewählten Wellenlänge anzuregen, und bei der der Detektor (36) wirksam ist, um eine Fluo­ reszenzemission bei einer größeren Wellenlänge zu erfas­ sen.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der Detektor (36) ein räumlich nicht auflösender Detektor ist.

11. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die fer­ ner eine Steuereinrichtung zum (i) Steuern der Abtast­ einrichtung (19, 22), (ii) Aufzeichnen der momentanen Position des Strahls (14) und (iii) Korrelieren der mo­ mentanen Positionen des Strahls (14) mit Signalen, die von dem Detektor (36) empfangen werden, aufweist, wo­ durch eine Tabelle von Substratlichtemissionspegeln als eine Funktion der Substratposition aufgebaut werden kann.

12. optische Abtastvorrichtung (10) zum Abtasten eines Array (58; 62) von fluoreszierenden Probenregionen (54, 56; 64, 66), die auf der Oberfläche eines Substrats (18) ge­ halten sind, die folgende Merkmale aufweist:
einen Strahlgenerator (12, 16) zum Erzeugen eines Licht­ strahls (14), der wirksam ist, um eine Fluoreszenzlicht­ emission von derartigen Probenregionen (54, 56; 64, 66) anzuregen, wobei der Strahl (14) eine Strahlweite von weniger als etwa 5 µm aufweist,
eine Einrichtung (19, 22) zum Abtasten des Strahls über eine Abtastentfernung von mindestens etwa 2-10 mm in einer Richtung entsprechend einem linearen Array (58) derartiger Probenregionen (54, 56),
eine Linsenanordnung (26, 28), mit einer numerischen Apertur von mindestens etwa 0,25 zum Abbilden einer Fluoreszenzlichtemission, die einer Lichtemission von einem derartigen linearen Array (58) von Probenregionen (54, 56) entspricht, als Reaktion auf eine Strahlanre­ gung, wobei die optischen Achsen (32) der abgebildeten Lichtemission winkelmäßig von den entsprechenden op­ tischen Achsen (23) des abgetasteten Strahls (14) ver­ setzt sind, während der Strahl (14) in der einen Rich­ tung abgetastet wird,
eine Erfassungseinrichtung (36) zum Erfassen eines ab­ gebildeten Lichts von der Linsenanordnung (26, 28),
eine Verschiebungseinrichtung (44) zum relativen Ver­ schieben der Probe (18) und des Lichtstrahls (14) in ei­ ner Richtung (46) senkrecht zu der Richtung der Strahl­ abtastung in der Ebene der Probe (18), und
eine Steuereinrichtung (24) zum (i) Steuern der Abtast­ einrichtung (19, 22), (ii) Aufnehmen der momentanen Po­ sition des Strahls (14) und (iii) Korrelieren der momen­ tanen Positionen des Strahls (14) mit Signalen, die von dem Detektor (36) empfangen werden, wodurch eine Tabelle von Substratlichtemissionspegeln als Funktion der Sub­ stratposition aufgebaut werden kann.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der die Linsenanord­ nung (26, 28) ein astigmatisches Bild erzeugt, das in der Richtung des Spaltes (42) ausgerichtet ist, während der Strahl (14) in der einen Richtung über ein Proben­ array (58, 62) abgetastet wird, und bei der sich der Spalt 42 in einer Ebene befindet, die mit dem astigmati­ schen Bild zusammenfällt.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 12 oder 13, zur Verwendung mit einem lichtdurchlässigen Substrat (18), wobei der Strahl (14) angepaßt ist, um durch das Substrat (18) auf Probenregionen (54, 56; 64, 66) auf der Probenoberfläche (52) einzufallen, und bei der die Linsenanordnung (26, 28) angepaßt ist, um das Licht, das durch das Substrat (18) empfangen wird, abzubilden.

15. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, bei der der Detektor (36) ein räumlich nicht-auflösender Detek­ tor ist.