DE19618032A1 - Prepared Maldi sample carriers that can be stored - Google Patents
Prepared Maldi sample carriers that can be storedInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft vorpräparierte Probenträger für die matrixunterstützte ionisierende La serdesorption großer Analytmoleküle (MALDI) zur Erzeugung von Ionen der Analytsubstanz für deren massenspektrometrische Untersuchung, und Verfahren für die Präparation der Pro benträger.The invention relates to prepared sample carriers for the matrix-supported ionizing La serdesorption of large analyte molecules (MALDI) to generate ions of the analyte substance for their mass spectrometric examination, and methods for the preparation of the Pro bearer.
Das Verfahren der massenspektrometrischen Untersuchungen von großmolekularen Analyt substanzen mit Ionisierung durch laserinduzierte Desorption besteht darin, den Probenträger mit oberflächlich aufgebrachter Analytsubstanz einem Lichtpuls aus einem Laser auszusetzen, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird. Dieser Lichtpuls erzeugt Ionen der Analytmole küle, die dann mit ionenoptischen Mitteln der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden. Es finden dabei insbesondere Flugzeitmassenspektrometer, aber auch ionenspeichern de Massenspektrometer, wie Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen (häufig einfach "Ionen fallen" genannt) oder Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer ("ICR-Spektrometer"), Anwendung.The method of mass spectrometric analysis of large molecular analyte Substances with ionization through laser-induced desorption consists of the sample carrier to expose a light pulse from a laser with superficially applied analyte substance, which is focused on the sample surface. This light pulse generates ions of the analyte mole cooler, which is then fed to the mass spectrometric analysis using ion-optical means will. In particular, there are time-of-flight mass spectrometers, but also ion storage devices de mass spectrometers, such as high-frequency quadrupole ion traps (often simply "ions fall ") or ion cyclotron resonance mass spectrometer (" ICR spectrometer "), Application.
Für den besonderen Fall der Flugzeitmassenspektrometrie wird der Probenträger konstant auf eine Hochspannung zwischen 6 und 30 Kilovolt gelegt, dem in einer Entfernung von 10 bis 20 Millimetern eine Grundelektrode auf Erdpotential gegenüberliegt. Ein Laserpuls von typi scherweise etwa 4 Nanosekunden Dauer übernimmt die Ionisierung. Die Ionen werden durch das elektrische Feld zur Grundelektrode hin beschleunigt und erhalten dabei alle die gleiche kinetische Energie. Jenseits der Grundelektrode befindet sich die feldfreie Flugstrecke des Flugzeitmassenspektrometers. Am Ende der Flugstrecke werden die ankommenden Ionen de tektiert, aus ihrer Flugzeit läßt sich - bei gleicher kinetischer Energie - ihre Masse bestimmen. Bei Verwendung von ionenspeichernden Massenspektrometern wie Quadrupol-Ionenfallen oder ICR-Spektrometern werden die desorptiv erzeugten Ionen mit ionenoptischen Mitteln in die Speicherzellen der Massenspektrometer überführt und dort massenspektrometrisch unter sucht.For the special case of time-of-flight mass spectrometry, the sample carrier is constantly opened high voltage between 6 and 30 kilovolts, which is at a distance of 10 to 20 Millimeters a ground electrode is opposite to earth potential. A laser pulse from typi ionization takes about 4 nanoseconds. The ions are through the electric field accelerates towards the base electrode and all get the same kinetic energy. The field-free flight path of the Time of flight mass spectrometer. At the end of the flight route, the incoming ions are de tect, their mass can be determined from their flight time - with the same kinetic energy. When using ion-storing mass spectrometers such as quadrupole ion traps or ICR spectrometers, the desorptively generated ions with ion-optical means in the memory cells of the mass spectrometer transferred and there under mass spectrometry is looking for.
Für die Ionisierung von großen Analytmolekülen durch die weithin bekannte matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = matrix assisted taser desorption and ionization), die in den vergan genen Jahren eine große Verbreitung gefunden hat, werden die großen Moleküle der Analyt substanz auf dem Probenträger in eine Schicht winziger Kristalle einer niedermolekularen Ma trixsubstanz eingelagert. Der Laserlichtpuls verdampft praktisch momentan eine geringe Men ge der Matrixsubstanz. Die Dampfwolke nimmt zunächst praktisch den gleichen Raum ein wie die Festsubstanz, steht also unter hohem Druck. Auch die großen Analytmoleküle werden in die zunächst winzige Dampfwolke überführt. Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein gerin ger Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der großen Analytmoleküle, ionisiert. Anschließend dehnt sich die Dampfwolke in einem adiabatischen und isentropischen Prozeß ähnlich einer Explosion in das umgebende Vakuum aus. Solange während der Ausdeh nung der Dampfwolke noch Kontakt der Moleküle untereinander besteht, findet durch Ionen- Molekül-Reaktionen eine fortgesetzte Ionisierung der großen Analytmoleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt.For the ionization of large analyte molecules by the well-known matrix-assisted Laser desorption (MALDI = matrix assisted taser desorption and ionization) used in the past years ago, the large molecules became the analyte substance on the sample carrier in a layer of tiny crystals of a low molecular mass trix substance stored. The laser light pulse practically evaporates a small amount at the moment ge of the matrix substance. The steam cloud initially occupies practically the same space as the solid substance, is therefore under high pressure. The large analyte molecules are also in the initially tiny vapor cloud transferred. When the vapor cloud is formed, a clot becomes large part of the molecules, both the matrix and the large analyte molecules, ionized. Then the steam cloud expands in an adiabatic and isentropic Process similar to an explosion in the surrounding vacuum. As long as the expansion of the vapor cloud, there is still contact between the molecules. Molecule reactions involve continued ionization of the large analyte molecules at the expense of smaller matrix ions instead.
Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Analytsubstanz. Die dabei auftretende Streuung der Anfangsge schwindigkeiten bei laserinduzierter Ionisierung beeinträchtigt und begrenzt die Massenauflö sung der Flugzeitmassenspektrometer. Es gibt jedoch eine Methode, die Ionen wieder zeitlich zu fokussieren und damit das Auflösungsvermögen zu verbessern.The vapor cloud expanding into a vacuum accelerates due to its adiabatic expansion not only the molecules and ions of the matrix substance, but also by viscous entrainment the molecules and ions of the analyte. The resulting scatter of the initial ge Velocity with laser-induced ionization affects and limits the mass resolution solution of the time-of-flight mass spectrometer. However, there is a method to time the ions back to focus and thus improve the resolving power.
Für die anderen genannten Arten der Massenspektrometrie ist die Streuung der Anfangsener gien ebenfalls schädlich, da sie den Einfangprozeß der Ionen in den Speicherzellen erschwert Hier ist noch keine Methode zur Verbesserung des Einfangs bekannt.For the other types of mass spectrometry mentioned, the scatter is the beginning gien also harmful because it complicates the process of capturing the ions in the memory cells No method of improving capture is known yet.
Die Matrixsubstanz muß gegenwärtig verschiedenartige Aufgaben gleichzeitig erfüllen, wobei stets nur ein gewisser Kompromiß erreicht werden kann: Sie muß die Analytmoleküle in ihre Kristalle aufnehmen und über das Aufwachsen der Kristalle auf dem Probenträger festhalten. Sie muß das Licht der Laserstrahlung effektiv absorbieren und so in kürzester Zeit genügend Energie für die momentane Verdampfung aufnehmen. Während der Verdampfung muß sie eine solch hohe Plasmatemperatur erreichen, daß ein nicht zu kleiner Bruchteil der Moleküle ioni siert vorliegt, andererseits darf die Matrixsubstanz nicht - etwa durch Zersetzung - ihre zur Ionisierung befähigenden Eigenschaften verlieren. Sie muß dann im anschließenden Ionisie rungsprozeß die großen Analytmoleküle durch Protonierung ionisieren.The matrix substance must currently perform various tasks simultaneously, whereby Only a certain compromise can always be reached: it must insert the analyte molecules into their Pick up the crystals and hold them on the sample holder as the crystals grow. It has to absorb the light of the laser radiation effectively and thus sufficiently in the shortest possible time Take up energy for the current evaporation. During evaporation, it must be one reach such a high plasma temperature that a not too small fraction of the molecules ioni is present, on the other hand, the matrix substance must not - for example by decomposition - its Lose ionizing properties. You must then in the subsequent ionization ionizing the large analyte molecules by protonation.
Dieses Aufgabenspektrum ist sehr schwierig zu erfüllen; die Matrixsubstanzen sind daher recht komplexer Natur.This range of tasks is very difficult to accomplish; the matrix substances are therefore right complex nature.
Bisherige Präparationsmethoden verlangen eine frische Präparation, wobei Analyt und Matrix zu gleicher Zeit in einer Lösung auf den Probenträger gebracht und dort getrocknet werden. Dieses Verfahren verfolgt das Ziel, die Analytmoleküle in die Mikrokristalle der Matrixsub stanz einzuschließen, die sich beim Trocknen des aufgebrachten Tröpfchens bilden. Es sind nur einige wenige Verfahren bekannt geworden, erst die Matrixsubstanz und später die Analytsub stanz auf den Probenträger aufzubringen, und diese Verfahren verlangen zumeist ein zumindest teilweises Anlösen der vorher aufgebrachten Matrixkristalle (siehe beispielsweise GB 2 236 185).Previous preparation methods require fresh preparation, with analyte and matrix at the same time placed in a solution on the sample carrier and dried there. This method aims to insert the analyte molecules into the microcrystals of the matrix sub to include punch that form when the applied droplet dries. It is only a few methods have become known, first the matrix substance and later the analyte substance to be stamped onto the sample carrier, and these methods usually require at least one partial dissolving of the previously applied matrix crystals (see for example GB 2 236 185).
Selbst bei einer Vorpräparation der Matrixschicht und späterem Aufbringen der Analytsubstanz muß die Matrixschicht relativ frisch aufgebracht werden. Der Grund dafür ist, daß die bisher bekannt gewordenen Matrixsubstanzen ganz überwiegend empfindlich gegenüber Oxidation, Hydrolyse und anderen verändernden Prozessen durch Luftbestandteile sind und sich daher leicht zersetzen. Sie sind - besonders in der feinen Verteilung auf der Oberfläche einer Träger platte - spätestens nach einigen Tagen für den vorliegenden Zweck der Ionisation unbrauchbar. Selbst die längere Lagerung der Matrixsubstanzen in angebrochenen Flaschen ist kritisch und nicht zu empfehlen.Even if the matrix layer is preprepared and the analyte substance is applied later the matrix layer must be applied relatively fresh. The reason for this is that so far known matrix substances are mostly sensitive to oxidation, Hydrolysis and other changing processes caused by air components are and therefore decompose easily. They are - especially in the fine distribution on the surface of a carrier plate - usable for the present purpose of ionization after a few days at the latest. Even the longer storage of the matrix substances in opened bottles is critical not recommendable.
Diese Verfahren sind also nicht geeignet, große Anzahlen von MALDI-Trägerplatten vorzu präparieren und dann zu verbrauchen. Insbesondere sind sie nicht für eine industrielle Vorprä paration verkaufbarer Probenträger geeignet.These methods are therefore not suitable for prefabricating large numbers of MALDI carrier plates prepare and then consume. In particular, they are not for an industrial prep suitable for sellable sample carriers.
Darüberhinaus sind Verfahren bekannt geworden, die Analytmoleküle beim Aufbringen auf den Probenträger in situ zu verändern, um die Aussagefähigkeit der massenspektrometrischen Un tersuchungsmethode zu vergrößern. Beispielsweise können Proteine durch einen tryptischen oder andersartigen enzymatischen Verdau in charakteristischer Weise so in Bruchstücke zer legt werden, daß über eine Messung der Molekulargewichte dieser Bruchstücke eine sofortige Identifizierung des aufgebrachten Proteins anhand von Protein-Datenbanken möglich wird. Krankhafte Veränderungen eines bekannten Proteins können ebenfalls durch einen solchen Verdau mit anschließender Messung der Molekulargewichte der Bruchstücke festgestellt wer den, wobei es sogar möglich ist, das veränderte Teilstück der Proteinkette zu erkennen.In addition, methods have become known which apply analyte molecules to the To change the sample carrier in situ to ensure that the mass spectrometric Un to enlarge the research method. For example, proteins can be replaced by a tryptic or other kind of enzymatic digestion in a characteristic way into fragments be that an immediate measurement of the molecular weights of these fragments Identification of the applied protein is possible using protein databases. Pathological changes in a known protein can also be caused by such Digestion followed by measurement of the molecular weights of the fragments that, and it is even possible to recognize the altered part of the protein chain.
Die dazu notwendigen Enzyme sind relativ stabil. Sie könnten einer vorpräparierten Matrix schicht beigegeben werden, wenn diese haltbar vorpräpariert werden könnte, und wenn die Enzyme nicht in direkter Berührung zu den meist sauren Ionisiersubstanzen der Matrix aufge bracht werden könnten. Da es jedoch keine lagerfähige Matrixpräparation gibt, verlangt auch diese Methode jeweils frischen Ansatz. Sie ist damit sehr aufwendig.The enzymes required for this are relatively stable. You could use a prepared matrix be added if this could be prepared in advance and if the Enzymes are not in direct contact with the mostly acidic ionizing substances of the matrix could be brought. However, since there is no storable matrix preparation, so too this method fresh approach each. It is therefore very complex.
Es ist die vordringliche Aufgabe der Erfindung, das Verfahren zur Präparation von MALDI- Schichten und das MALDI-Verfahren der Ionisierung von Analytmolekülen selbst so abzu wandeln, daß eine Vorpräparierung der Probenträger erfolgen kann, und zwar so, daß die Pro benträger über längere Zeit ohne Funktionsverlust gelagert werden können. Die vorpräparier ten Probenträger sollen es ermöglichen, die Analytmoleküle in einfacher Weise aufzubringen, beispielsweise in der Form automatisch aufpipettierter Tröpfchen. Die Analytsubstanzen sollen von der vorpräparierten Schicht so festgehalten werden, daß sie waschbar werden, um Reste an Puffersubstanzen oder Salzen zu entfernen. Es ist also das Ziel, die verwendeten Matrixkom ponenten für die Ionisierung der Analytsubstanzen vor Zersetzung während des Transportes oder der Lagerung zu schützen, und das Aufbringen der Analytmoleküle zu erleichtern. Es soll insbesondere möglich sein, vorpräparierte Probenträger industriell herstellbar und vertreibbar zu machen.It is the primary object of the invention to provide the method for the preparation of MALDI Layers and the MALDI method of ionizing analyte molecules themselves convert that a prepreparation of the sample carrier can be done so that the Pro can be stored for long periods without loss of function. The preprepared Sample carriers should make it possible to apply the analyte molecules in a simple manner, for example in the form of automatically pipetted droplets. The analyte substances should of the prepared layer so that they are washable to remove residues Remove buffer substances or salts. So it is the goal, the Matrixkom used Components for the ionization of the analyte substances before decomposition during transport or to protect the storage and facilitate the application of the analyte molecules. It should In particular, it may be possible to prepare and distribute prepared sample carriers industrially close.
Eine weitergehende Aufgabe der Erfindung soll es sein, auch Vorpräparierungen unter Ein schluß anderer Reaktionspartner zu ermöglichen, beispielsweise mit Enzymen zum charakteri stischen Verdau von Proteinen, aber auch mit anderen Chemikalien zur gezielten Veränderung der Analytsubstanzen.A further object of the invention should also be prepreparations under one to allow the conclusion of other reactants, for example with enzymes to characterize digestion of proteins, but also with other chemicals for targeted change of the analyte substances.
Die Erfindung soll ein MALDI-Verfahren mit hoher Ionenausbeute und hoher Empfindlichkeit liefern, um mit eingesetzten Probenmengen von nur wenigen Femtomol arbeiten zu können. Sie soll darüberhinaus durch eine gleichmäßige Schicht automatisch ablaufende MALDI-Prozesse ermöglichen.The invention is intended to be a MALDI process with high ion yield and high sensitivity deliver in order to be able to work with sample quantities of only a few femtomoles. she MALDI processes should also run automatically thanks to an even layer enable.
Es ist der Grundgedanke der Erfindung, das Aufgabenspektrum, das die Matrixsubstanz zu erfüllen hat, auf zwei oder mehr Substanzkomponenten aufzuteilen, und dabei einer Substanz komponente die zusätzliche Aufgabe des Schutzes der anderen Substanzkomponenten zuzu weisen. Dabei liegt der Erfindung die experimentell gewonnene Erkenntnis zugrunde, daß für einen erfolgreichen MALDI-Prozess die Analytmoleküle und die Moleküle der ionisierenden Substanzkomponente nicht schon im festen Zustand in Berührung sein müssen. Diese Berüh rung im festen Zustand, im idealen Fall der Einbau der Analytmoleküle in die Mikrokristalle der Matrixsubstanz, war bisher das Ziel aller Präparationsverfahren.It is the basic idea of the invention, the range of tasks that the matrix substance too has to be divided into two or more substance components and one substance component the additional task of protecting the other substance components point. The invention is based on the experimentally gained knowledge that for a successful MALDI process the analyte molecules and the molecules of the ionizing Substance components do not have to be in contact in the solid state. This famous solid state, ideally the incorporation of the analyte molecules into the microcrystals of the Matrix substance was previously the target of all preparation processes.
Eine Aufteilung des Aufgabenkatalogs auf zwei Substanzen kann nach diesem Grundgedanken der Erfindung etwa so aussehen:A division of the task catalog into two substances can be based on this basic idea of the invention look something like this:
- (a) eine erste Matrixsubstanz (ein "Binder") übernimmt die adsorptive Bindung der Analytmo leküle an einer vorzugsweise glatten Oberfläche, sie übernimmt die Bindung an die Unter lage, sie kann vorzugsweise die Energieabsorption übernehmen, sie übernimmt insbeson dere die Bildung der Plasmawolke und sie übernimmt zusätzlich nach dem Grundgedan ken dieser Erfindung den Schutz der ionisierenden Matrixkomponente; (a) a first matrix substance (a "binder") takes over the adsorptive binding of the analyte mo read on a preferably smooth surface, it takes over the binding to the bottom location, it can preferably take over the energy absorption, in particular it takes over the formation of the plasma cloud and it also takes over according to the basic idea ken this invention the protection of the ionizing matrix component;
- (b) mindestens eine weitere Matrixsubstanz (ein "Ionisierer"), die vorzugsweise molekular in der ersten Substanz gelöst ist, übernimmt die Ionisierung der Analytmoleküle in der Plas mawolke; sie kann aushilfsweise auch die Energieabsorption übernehmen, wenn diese nicht von der ersten oder von weiteren Matrixsubstanzen übernommen wird.(b) at least one further matrix substance (an "ionizer"), which is preferably molecular in the first substance is dissolved, takes over the ionization of the analyte molecules in the plas maw cloud; in the alternative it can also take over the energy absorption if this is not taken over by the first or by further matrix substances.
Der Schutz der ionisierenden Matrixkomponente kann am besten verwirklicht werden, wenn der (oder die) Ionisierer ganz in einer luft- und wasserdichten Masse des Binders eingeschlos sen werden kann. Es ist daher ein weitergehender Gedanke der Erfindung, einen lackartig ver arbeitbaren Binder zu verwenden, der den Ionisierer in molekularer Lösung in die Lackmasse aufnehmen kann.The protection of the ionizing matrix component can best be achieved if the ionizer (s) completely enclosed in an airtight and watertight mass of the binder can be sen. It is therefore a further idea of the invention, a ver ver workable binder to use the ionizer in molecular solution in the paint can record.
Es ist nun für den MALDI-Prozeß notwendig, daß der Binder die Moleküle des Ionisierers bei der Desorption freigibt. Das kann beispielsweise durch vollständige Verdampfung geschehen. Da aber lackartige Schichten in der Regel aus polymeren Molekülen aufgebaut sind, ist eine solche vollständige Verdampfung nicht ohne weiteres möglich. Es ist daher ein weiterer Erfin dungsgedanke, daß der Binder die Freigabe der Moleküle des Ionisierers am besten erfüllen kann, wenn er sich bei Laserlichtbeschuß in kleine Moleküle zersetzt. Als besonders vorteilhaft bieten sich hier polymere Sprengstoffe an, die sich bei Erhitzung durch den Laserstrahl exo therm in die kleinen Moleküle Wasser, Kohlenmonoxid, Kohlendioxid, Stickstoff und Wasser stoff zersetzen. Es muß aber nicht unbedingt ein solch starker exothermer Zersetzungsvorgang wie bei Sprengstoffen sein, auch schwach exotherme oder sogar leicht endotherme Zerset zungsvorgänge, deren Energiezufuhr aus dem Laserlicht stammt, können hier eingesetzt wer den.It is now necessary for the MALDI process that the binder adds the molecules of the ionizer the desorption releases. This can be done, for example, by complete evaporation. However, since lacquer-like layers are usually made up of polymeric molecules, one is such complete evaporation is not readily possible. It is therefore another invention idea that the binder best fulfills the release of the molecules of the ionizer can if it decomposes into small molecules when laser light is bombarded. To be particularly advantageous Polymer explosives are available here, which are exo when heated by the laser beam therm into the small molecules of water, carbon monoxide, carbon dioxide, nitrogen and water decompose fabric. But it does not necessarily have to be such a strong exothermic decomposition process as with explosives, also weakly exothermic or even slightly endothermic decomposition Any process whose energy comes from laser light can be used here the.
Der Binder muß aber auch die Aufgabe der adsorptiven Bindung der Analytmoleküle über nehmen können, da die umschlossenen Moleküle des Ionisierers diese Aufgabe nicht überneh men können. Es ist nun ein weiterer Erfindungsgedanke, hier hochadsorptive Polymerstruktu ren zu benutzen, wie sie etwa aus Adsorptionssäulen zur Reinigung von hochmolekularen or ganischen Stoffen oder von Blotmembranen zum Blotten 2D-elektrophoretischer Trennung bekannt sind.However, the binder must also perform the task of adsorptively binding the analyte molecules can take, since the enclosed molecules of the ionizer do not take over this task can. It is now another inventive concept, here highly adsorptive polymer structure ren to use, such as from adsorption columns for the purification of high molecular weight or ganic substances or blot membranes for blotting 2D electrophoretic separation are known.
Ein hervorragende Kombination einer hochadsorptiven, zur Lackherstellung geeigneten poly mer strukturierten Substanz mit erwünschtem Sprengstoff-Charakter ist die Nitrozellulose (korrekter: Zellulosenitrat, Kurzzeichen nach DIN: CN), deren Explosivität sich darüber hinaus durch den Grad der Nitrierung einstellen läßt. Man spricht bei Stickstoffgehalten zwischen 10,5 und 12,5% von Zellulosedinitrat (Collodiumwolle), bei solchen zwischen 12,5 und 14,14% von Zellulosetrinitraten (Schießbaumwolle). Beide Sorten verpuffen bei Erhitzung, die Verpuf fungsheftigkeit nimmt mit höherer Nitrierung zu. Zellulosenitrate bestehen aus etwa 100 bis 3500 teil- bis vollnitrierten Glukose-Einheiten.An excellent combination of a highly adsorptive poly suitable for paint production A more structured substance with the desired explosive character is nitrocellulose (Correct: cellulose nitrate, abbreviation according to DIN: CN), the explosiveness of which is also can be adjusted by the degree of nitration. One speaks at nitrogen contents between 10.5 and 12.5% of cellulose dinitrate (collodion wool), for those between 12.5 and 14.14% of cellulose trinitrates (gun cotton). Both types fizzle when heated, the fizzle The level of performance increases with higher nitriding. Cellulose nitrates consist of about 100 to 3500 partially to fully nitrated glucose units.
Der Binder kann, muß aber nicht notwendig die Aufgabe der Lichtabsorption übernehmen. Diese Aufgabe kann durch eine Derivatisierung des Zellulosenitrats gelöst werden, wobei ab sorptive Molekülgruppen in das Zellulosegerüst eingebaut werden. Durch Wahl der Molekül gruppen kann man sich an die Wellenlänge des verwendeten Lasers anpassen. - Es ist aber auch möglich, diese Aufgabe einer dritten Matrixsubstanz zu übertragen. Zellulosenitrat ist hervor ragend färbbar, und kann somit für beliebige Wellenlängen undurchsichtig gemacht werden.The binder can, but does not necessarily have to take on the task of light absorption. This object can be achieved by derivatizing the cellulose nitrate, with ab sorptive groups of molecules are built into the cellulose structure. By choosing the molecule groups can be adapted to the wavelength of the laser used. - It is also possible to transfer this task to a third matrix substance. Cellulose nitrate is prominent outstandingly dyeable, and can thus be made opaque for any wavelength.
Das Zellulosenitrat kann sehr einfach in Azeton gelöst als Lackschicht auf den Probenträger aufgebracht werden, sowohl durch Sprühen, Streichen oder Drucken. Es wird eine gleichmäßi ge und glatte Schicht erzeugt, die wiederum auch eine Grundvoraussetzung sowohl für die Automatisierbarkeit der Probenvorbereitung und wie auch für die Automatisierbarkeit der MALDI-Ionisierung ist. Eine gleichmäßige Schichtdicke ist auch für die Genauigkeit der Mas senbestimmung notwendig. Aus Zellulosenitrat werden technisch die sogenannten Nitrolacke hergestellt. Nitrolacke verwenden meist das weniger nitrierte Zellulosedinitrat als Grundstoff. Erst die Nitrierung der Zellulose ermöglicht die Lösung des entstehenden Produkts in organi schen Lösemitteln.The cellulose nitrate can be easily dissolved in acetone as a lacquer layer on the sample holder can be applied by spraying, brushing or printing. It will be an even one ge and smooth layer, which in turn is a basic requirement for both Automation of sample preparation and the automation of the MALDI ionization is. A uniform layer thickness is also essential for the accuracy of the mas determination necessary. Technically, cellulose nitrate becomes the so-called nitro lacquers produced. Nitro lacquers mostly use the less nitrated cellulose dinitrate as the base material. Only the nitration of the cellulose enables the resulting product to be dissolved in organi solvents.
Die Zellulosegrundstruktur ist besonders günstig für die oberflächliche Bindung der Analytmo leküle wegen ihrer besonders starken Adsorptivität. Da Nitrozellulose nicht in Wasser lösbar ist, kann man Proteine, wasserlösliche Polymere und andere großmolekulare Analytsubstanzen sehr einfach aus wässeriger Lösung auf die Lackschicht aufbringen. Nitrozellulose wird häufig für Blotmembranen verwendet; sie hat gegenüber anderen, meist teuereren Blotmembranen den Nachteil, daß die Analytmoleküle sehr fest, für viele Untersuchungsmethoden zu fest, an der Oberfläche haften. Dieser Nachteil ist im vorliegenden Fall ein Vorteil. Die wässerige Lösung von hochmolekularen Analytsubstanzen wie Proteinen enthält neben den Analytmolekülen häufig noch stabilisierende Puffersalze und andere für den Ionisierungsprozeß schädliche Be standteile. Die feste Haftung der Analytmoleküle und die Wasserunlöslichkeit der Nitrozellulo se ermöglicht ein leichtes und verlustarmes Waschen der aufgebrachten großmolekularen Ana lytsubstanz.The cellulose basic structure is particularly favorable for the superficial binding of the analyte read because of their particularly strong adsorptivity. Because nitrocellulose is not soluble in water is, proteins, water-soluble polymers and other large molecular analyte substances very easy to apply to the paint layer from an aqueous solution. Nitrocellulose becomes common used for blot membranes; compared to other, usually more expensive blot membranes Disadvantage that the analyte molecules are very tight, too tight for many methods of investigation Stick to the surface. This disadvantage is an advantage in the present case. The aqueous solution of high molecular weight analyte substances such as proteins in addition to the analyte molecules frequently still stabilizing buffer salts and other Be harmful for the ionization process components. The firm adhesion of the analyte molecules and the water insolubility of the nitrocellulose This enables the applied large molecular Ana to be washed easily and with little loss lytic substance.
Sprengstoffe mit ihrer exothermen Zersetzung führen auch gleichzeitig zu einer sehr konstan ten Wolkenbildung, dadurch ergeben sich für die Flugzeit-Massenspektrometrie günstige Vor aussetzungen für eine hohe Massengenauigkeit. Kleinere Energieunterschiede im Laserlicht strahl spielen eine untergeordnete Rolle. Der Sprengstoff wird dabei so dünn aufgetragen (teilweise nur Bruchteile eines Mikrometers), daß ein selbständiges Nachbrennen in Nachbar bereiche unterbleibt, da der Probenträger stark kühlt und die Verbrennung löscht im Gegen satz zu normalem MALDI, bei dem man Laserlichtfokusdurchmesser von 100 bis 200 Mikro meter bevorzugt, um großflächig eine dünne Schicht der Matrixoberfläche abzutragen, kann man bei Sprengstoff-MALDI mit Fokusdurchmessern von 5 bis 20 Mikrometern arbeiten. Es wird dabei innerhalb dieses Durchmessers die gesamte Schicht bis auf den Probenträger darun ter abgetragen.Explosives with their exothermic decomposition also lead to a very constant cloud formation, which results in favorable conditions for time-of-flight mass spectrometry conditions for high mass accuracy. Smaller energy differences in laser light beam play a subordinate role. The explosives are applied so thinly (sometimes only fractions of a micrometer) that an independent afterburn in neighboring areas is omitted because the sample holder cools down strongly and the combustion extinguishes in the opposite set to normal MALDI, in which one has laser light focus diameters from 100 to 200 micro meters preferred to remove a thin layer of the matrix surface over a large area to work with explosives MALDI with focus diameters from 5 to 20 micrometers. It the entire layer except for the sample carrier will be within this diameter ter removed.
Das Aufbringen der Analytmoleküle auf die Oberfläche der Lackschicht hat den weiteren Vor teil, daß die so gebildeten Ionen der Analytmoleküle nach Ausdehnung der Wolke eine weit geringere Streuung ihrer Anfangsgeschwindigkeiten zeigen. Die Ionen lassen sich daher viel besser in Speicherzellen von ionenspeichernden Massenspektrometern einfangen, und sie erhö hen die Genauigkeit der Massenbestimmung in Flugzeit-Massenspektrometern.The application of the analyte molecules to the surface of the lacquer layer has the further purpose partly that the ions of the analyte molecules formed in this way extend far after the cloud has expanded show less dispersion of their initial speeds. The ions can therefore be much capture better in memory cells of ion-storing mass spectrometers, and increase them hen the accuracy of mass determination in time-of-flight mass spectrometers.
Um die aufgebrachte Schicht auch gegen nicht-wäßrige Lösungsmittel unlöslich zu machen, ist es besonders vorteilhaft, die meist fadenförmigen Moleküle der Lackschicht nach Aufbringen auf den Probenträger zumindest an der Oberfläche zu vernetzen. Das kann durch Zugabe eines Brückenbildners geschehen, aber auch durch ionisierende Bestrahlung, zum Beispiel mit UV- Licht. Für die oberflächliche Vernetzung von Zellulosenitrat hat sich Diisocyanat als Brüc kenbildner bewahrt, das restliche OH-Gruppen benachbarter Molekülstränge miteinander ver bindet. Diese Vernetzung unterbindet die Lösbarkeit in organischen Lösemitteln. Die Vernet zung unterbindet nicht die Zersetzlichkeit des Zellulosenitrats unter Einwirkung der Laserstrah lung.In order to make the applied layer insoluble even against non-aqueous solvents it is particularly advantageous to apply the usually thread-like molecules of the lacquer layer after application to network on the sample carrier at least on the surface. This can be done by adding a Bridging, but also by ionizing radiation, for example with UV Light. For the superficial cross-linking of cellulose nitrate, diisocyanate has been used as a bridging agent preserves that the remaining OH groups of neighboring molecular strands ver binds. This crosslinking prevents solubility in organic solvents. The network Tongue does not prevent the cellulose nitrate from degrading when exposed to the laser beam lung.
Es hat sich experimentell erwiesen, daß die Konzentration des Ionisierers nicht hoch zu sein braucht. Unsere Versuche haben sich allerdings auf Alpha-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (kurz "Alpha-Cyano") beschränkt. Mit etwa 10% Alpha-Cyano in 90% Nitrozellulose erhält man einen nahezu klaren Lack, der sich sehr dünn aufbringen läßt. Er bildet eine gute Grundlage für die Ionisierung von praktisch allen Arten von Proteinen, die leicht aus wäßriger Lösung auf die Oberfläche des wasserunlöslichen Lacks aufgebracht werden können.It has been found experimentally that the concentration of the ionizer is not high needs. However, our experiments have focused on alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (short "Alpha-Cyano") limited. With about 10% alpha-cyano in 90% nitrocellulose you get an almost clear lacquer that can be applied very thinly. It forms a good basis for the ionization of practically all types of proteins that easily arise from aqueous solution the surface of the water-insoluble lacquer can be applied.
Es ist jedoch zu erwarten, daß die Suche nach besseren Ionisierern bald Ergebnisse liefern wird, die die Ausbeute an Analytionen, die jetzt etwa bei 1/10000 Ionen pro Analytmolekül liegt, ganz wesentlich erhöhen werden.However, the search for better ionizers is expected to deliver results soon which is the yield of analyte ions, which is now around 1/10000 ions per analyte molecule lies, will increase significantly.
Es können in der Lackschicht auch mehrere ionisierende Substanzen gleichzeitig untergebracht werden. Sie können sowohl als eine einzige Lösung mit mehreren Komponenten auf den Pro benträger aufgebracht sein, aber auch als schichtartiger Aufbau mit mehreren Lacklösungen übereinander, die jeweils nur eine einzige ionisierende Komponente enthalten. Die Lackschich ten - sowohl als Einzelkomponenten-Schicht, als Mehrkomponenten-Schicht wie auch als Mehrschichten-Aufbau - können durch eine schützende Deckschicht wasser- und luftdicht ab gedeckt sein. Die Deckschicht enthält zweckmäßigerweise keinen Ionisierer. Die Vernetzung kann sich auf die Deckschicht oder sogar nur auf die Oberfläche der Deckschicht beschränken.Several ionizing substances can also be accommodated in the lacquer layer at the same time will. You can use the Pro both as a single solution with multiple components be applied carrier, but also as a layered structure with several paint solutions one above the other, each containing only a single ionizing component. The lacquer layer ten - both as a single-component layer, as a multi-component layer and as Multi-layer construction - can be waterproof and airtight thanks to a protective cover layer be covered. The top layer expediently contains no ionizer. The networking can be limited to the top layer or even only to the surface of the top layer.
Für den MALDI-Prozeß ist es erforderlich, daß die Dampfwolke in einem Gebiet definierten elektrischen Potentials entsteht. Da die Lackschicht nichtleitend ist, hat es sich als günstig er wiesen, einen leitenden Probenträger zu verwenden. Im Falle einer Verwendung von nichtlei tenden Probenträgern ist eine oberflächliche Metallisierung angebracht. Diese kann sehr dünn, sogar fast durchsichtig sein, um einen Laserbeschuß von der Rückseite her durch den Proben träger hindurch zu ermöglichen. The MALDI process requires that the vapor cloud be defined in an area electrical potential arises. Since the lacquer layer is non-conductive, it has proven to be cheap indicated to use a conductive sample holder. In case of non-use Surface metallization is attached to the sample carriers. This can be very thin, even be almost transparent to laser bombardment from the back through the samples to enable carriers through.
Um Aufladungen der Lackschicht zu vermeiden, oder um die Lackschicht selbst leitend zu ma chen, kann dem Lack auch ein Leiter in disperser Form zugesetzt werden. Dazu kann beispiels weise Kohlenstoff in feinster, disperser Form verwendet werden.To avoid charging the paint layer or to measure the paint layer itself Chen, a conductor in disperse form can also be added to the paint. For example wise carbon can be used in the finest, disperse form.
Durch solcherart leitfähig gemachte Schichten ist es möglich, Probenträgerplatten herzustellen, die direkt als Blotmembran zum Blotten zweidimensional durch Gel-Elektrophorese getrennter Eiweiße benutzt werden können. Die 2-dimensionale Abtastung durch MALDI ergibt eine Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber üblichen Färbungsmethoden, die bei mehreren Zeh nerpotenzen liegt und darüberhinaus zuverlässige Information über das Molekulargewicht bie tet.Layers made conductive in this way make it possible to produce sample carrier plates the directly as a blot membrane for blotting two-dimensionally separated by gel electrophoresis Proteins can be used. The 2-dimensional scanning by MALDI results in one Increase in sensitivity to conventional staining methods, which apply to several toes potency lies and also reliable information about the molecular weight bie tet.
Wenn wir vom Blotten absehen, so werden die Analytmoleküle meist einfach durch Aufbringen eines winzigen Tröpfchens der Analytlösung auf die adsorptive Schicht aufgebracht. Die glatte Lackschicht erlaubt dabei ein automatisches Aufpipettieren kleiner Tröpfchen, in denen sich gelöste Analytmoleküle befinden. Die Tröpfchen behalten auf der Lackschicht eine etwa halb kugelige Form, aus der die Analytmoleküle in relativ kurzer Zeit durch Diffusion und feste Adsorption an der Lackoberfläche herausgezogen werden. Das Tröpfchen muß oft nicht einmal eintrocknen, nach Adsorption der Analytmoleküle kann der Rest einfach abgewaschen werden. Auch die Substanzen aus eingetrockneten Tröpfchen können gewaschen werden. Das ist be sonders vorteilhaft, da so auch störende Puffersubstanzen und Salze der Lösung entfernt wer den können.If we refrain from blotting, the analyte molecules are usually simply applied a tiny droplet of the analyte solution is applied to the adsorptive layer. The smooth one Lacquer layer allows automatic pipetting of small droplets in which there are dissolved analyte molecules are. The droplets stay on the lacquer layer for about half spherical form, from which the analyte molecules in a relatively short time by diffusion and solid Adsorption can be pulled out on the paint surface. The droplet often doesn't even have to dry, after adsorption of the analyte molecules, the rest can simply be washed off. The substances from dried droplets can also be washed. That is Particularly advantageous because it also removes annoying buffer substances and salts from the solution that can.
Die Oberfläche unter einem Tröpfchen mit etwa 10 Nanoliter Lösung hat etwa 250 Mikrome ter Durchmesser und kann dabei größenordnungsmäßig 10 Femtomol an Analytmolekülen auf nehmen, die eine monomolekulare Adsorptionsschicht bilden. Ist die Konzentration wesentlich geringer als ein Picomol pro Mikroliter, so kann die Lösung nach jeweiligem Trocknen des Tröpfchens - eventuell unter Einschluß mehrerer Waschvorgänge - mehrfach aufpipettiert wer den. Die Fläche des Tröpfchens kann während der Spektrenaufnahme durch mehrere Laser schüsse abgetastet werden und ergibt nach Addition der Meßwerte sehr gute Spektren der Analytsubstanz. Meist können von einem einzigen Fleck sogar mehrere Spektren gewonnen werden. Diese Spektren haben wegen der Gleichmäßigkeit der Auftragung alle die gleiche Qualität.The surface under a droplet containing approximately 10 nanoliters of solution is approximately 250 microns ter diameter and can be of the order of 10 femtomoles of analyte molecules take, which form a monomolecular adsorption layer. The concentration is essential less than one picomole per microliter, the solution can be dried after drying the Droplets - possibly including multiple washing processes - are pipetted on several times the. The area of the droplet can be measured by multiple lasers during spectra acquisition shots are scanned and after addition of the measured values gives very good spectra of the Analyte substance. In most cases, multiple spectra can be obtained from a single spot will. These spectra are all the same because of the uniformity of the plot Quality.
Für hochverdünnte Analytlösungen, bei denen ein aufgebrachter Tropfen nicht genügend Mo leküle für eine massenspektrometrische Untersuchung enthält, hat sich eine andere Art der Probenträger bewährt. Die adsorptive Matrixschicht nach dieser Erfindung wird auf die Ober fläche von winzigen magnetischen Kügelchen ("magnetic beads") aufgebracht, die in Durch messern von einem bis 100 Mikrometern erhältlich sind. Besonders vorteilhaft ist es hier, die Matrixschicht durch Vernetzung vollkommen unlöslich zu machen. Die Kügelchen werden dann in kleiner Anzahl der sehr verdünnten Analytlösung beigegeben. Durch langandauernden und bewegten Kontakt können so die Analytmoleküle praktisch quantitativ adsorptiv an die Oberfläche der Kügelchen gebunden werden. Wenn dabei keine restlose Adsorption erfolgen soll, wird die restliche Analytlösung nicht durch freiwerdende Substanzen der Matrix verun reinigt. Die Kügelchen lassen sich anschließend durch magnetische Spezialwerkzeuge aus der Lösung herausholen und auf eine flache Probenträgerunterlage bringen. Dort können sie durch magnetische Kräfte, durch übergelegte Feinstgitter oder aber einfach durch Ankleben befestigt werden. Sie werden, nach Überführung ins Vakuum, direkt vom Laser beschossen und liefern ein hervorragendes MALDI. Auch die Kügelchen lassen sich so vorpräparieren, daß sie ver sand- und lagerfähig werden.For highly diluted analyte solutions in which an applied drop does not have enough mo contains a type of mass spectrometric examination Proven sample carrier. The adsorptive matrix layer according to this invention is on top surface of tiny magnetic beads ("magnetic beads") applied in through knives from one to 100 micrometers are available. It is particularly advantageous here To make the matrix layer completely insoluble by crosslinking. The beads are then added in small numbers to the very dilute analyte solution. By long-lasting and moving contact, the analyte molecules can be practically quantitatively adsorptive to the Surface of the beads are bound. If there is no complete adsorption the rest of the analyte solution is not contaminated by the substances of the matrix that are released cleans. The beads can then be removed using special magnetic tools Take out the solution and place it on a flat sample support pad. There they can go through magnetic forces, fixed by superimposed fine mesh or simply by gluing will. After being transferred to a vacuum, they are shot and delivered directly by the laser an excellent MALDI. The beads can also be prepared so that they ver become sand and storable.
Die Kügelchen sind besonders effektiv einsetzbar, wenn nur geringste Mengen an Analytsub stanz vorliegen, weil sie die Analytmoleküle praktisch vollständig auch aus sehr verdünnten Lösungen oder aus kleinsten Volumina adsorbieren können. Dabei braucht die Lösung nicht pipettiert oder sonstwie transportiert werden, und es werden daher die Verluste durch Wand adsorptionen so gering wie möglich gehalten. Es lassen sich in dieser Weise sogar Analytsub stanzen aus einzelnen biologischen Zellen einer massenspektrometrischen Analyse zuführen. Die bisher verwendeten MALDI-Verfahren verlangten notwendigerweise eine Bestrahlung des Probenträgers von der Probenseite her, da jeweils nur eine sehr geringe Matrixmenge an der Oberfläche verdampft wurde, also jeweils nur ein Bruchteil der Schichtdicke abgetragen wur de. Auch die Verwendung von magnetischen Kügelchen verlangt einen Beschuß von der Pro benseite her, da die Kügelchen undurchsichtig sind.The beads can be used particularly effectively if only minimal amounts of analyte sub punch, because they are almost completely diluted with the analyte molecules Solutions or adsorb from the smallest volumes. The solution does not need pipetted or otherwise transported, and therefore there will be losses through wall adsorption kept as low as possible. You can even use Analytsub in this way punch from individual biological cells for mass spectrometric analysis. The MALDI methods previously used necessarily required irradiation of the Sample carrier from the sample side, since only a very small amount of matrix on the Surface was evaporated, so only a fraction of the layer thickness was removed de. The use of magnetic beads also requires the Pro to fire from the side since the balls are opaque.
Werden jedoch flache Probenträger benutzt, so kann ein anderes Verfahren verwendet werden, da die Verwendung einer dünnen Sprengstofflackschicht zu einer vollständigen Verdampfung eines kleinen Schichtbereiches führt, so daß eine nackte Stelle des Probenträgers übrigbleibt Es ist daher möglich, die Matrixschicht von der Rückseite eines für die Laserstrahlung durch sichtigen Probenträgers her zu bestrahlen und so zu verdampfen. Es ist also ein weiterer Ge danke der Erfindung, durchsichtige Probenträger zu verwenden, die jedoch zur Aufrechterhal tung stabiler elektrischer Potentiale oberflächlich leitend gemacht werden. Die Rückseite des Probenträgers ist für den Laserstrahl in der Ionenquelle viel leichter zugänglich als die Vorder seite, auf der die Beschleunigungs- und Fokussierungsblenden mit ihren hohen Spannungen einem senkrechten Aufschuß oder einem Aufschuß mit kurzer Brennweite im Wege stehen und sehr trickreiche Konstruktionen notwendig machen.However, if flat sample carriers are used, another method can be used, since the use of a thin layer of explosive varnish to complete evaporation leads to a small layer area so that a bare area of the sample carrier remains It is therefore possible to pass through the matrix layer from the back of one for the laser radiation irradiate visible sample carrier and thus evaporate. So it's another Ge thanks to the invention to use transparent sample carriers, but to maintain stable stable electrical potentials are made superficially conductive. The back of the The sample carrier is much more accessible to the laser beam in the ion source than the front one side on which the acceleration and focusing diaphragms with their high voltages stand in the way of a vertical or short focal length, and make very tricky constructions necessary.
Auf die Wellenlänge des Lasers, die bei bisherigen MALDI-Verfahren immer sehr wichtig war und die Auswahl der Matrixsubstanzen mit bestimmt hat, kommt es nur noch in zweiter Linie an, da es der einzige Zweck der Laserstrahlung ist, den Sprengstoff zu zünden und ein Plasma genügend hoher Temperatur zu erzeugen.The wavelength of the laser, which has always been very important in previous MALDI processes and the choice of the matrix substances helped determine, it only comes second because the only purpose of laser radiation is to ignite the explosive and a plasma to generate a sufficiently high temperature.
Fig. 1 zeigt eine Anordnung eines flachen, metallischen Probenträgers 1 mit einer Lackschicht 2 aus Zellulosenitrat mit eingelagerten Molekülen einer Substanz wie beispielsweise 10% Al pha-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, die beim MALDI-Vorgang zur Ionisierung der auf die Schicht aufgebrachten Analytmoleküle dient. Der Probenträger hat die für Mikrotiterplatten eingeführte Größe von 8×12 Zentimetern und ist mit Schwalbenschwanzführungen 3 verse hen, mit denen die Platte auf einem Führungsschlitten befestigt werden kann. Der Probenträger ist auf seiner Schichtseite poliert, um das eingestrahlte Laserlicht zu reflektieren und so eine gute Absorption des Lichts zu ermöglichen. Fig. 1 shows an arrangement of a flat, metallic sample carrier 1 with a lacquer layer 2 of cellulose nitrate with embedded molecules of a substance such as 10% Al pha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, which is applied to the layer in the MALDI process for ionizing Serves analyte molecules. The sample holder has the size of 8 × 12 centimeters introduced for microtiter plates and is provided with dovetail guides 3 with which the plate can be attached to a guide slide. The sample carrier is polished on its layer side in order to reflect the irradiated laser light and thus enable good absorption of the light.
Eine günstige Ausführungsform ist die in Fig. 1 gezeigte flache, metallische Trägerplatte in der für Mikrotiterplatten standardisierten Größe von 8×12 Zentimetern. Diese Größe paßt in alle gängigen Mikropipettieranlagen und stellt somit eine günstige Voraussetzung für die au tomatische Probenaufbringung dar. Die Schwalbenschwanzführungen lassen sich zur Befesti gung auf beweglichen Probentischen verwenden, auch im Vakuum des Massenspektrometers wird die Platte über diese Führungen einfach gehaltert. Für die Verwendung im Vakuum haben sich Führungen bewahrt, deren Oberfläche mit Tetrafluorethen ("Teflon") überzogen wurde.A favorable embodiment is the flat, metallic carrier plate shown in FIG. 1 in the size of 8 × 12 centimeters standardized for microtiter plates. This size fits into all common micropipetting systems and therefore represents a favorable prerequisite for automatic sample application. The dovetail guides can be used for fastening on movable sample tables, even in the vacuum of the mass spectrometer, the plate is simply held over these guides. Guides whose surface has been coated with tetrafluoroethene ("Teflon") have been preserved for use in a vacuum.
Diese Platte wird nun auf ihrer Probenseite erfindungsgemäß mit der Matrixschicht überzogen. Dabei wird von einem Lack ausgegangen, der aus in Azeton aufgelöstem Zellulosenitrat mit einem Nitrierungsgrad von etwa 12% und einer Kettenlänge ("Viskosität") von etwa 100 bis 200 Glukosegruppen und einem geringen Anteil an Alpha-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure besteht, die ebenfalls im Azeton gelöst ist. Die Schicht muß sehr dünn sein, sie beträgt nur wenige Mi krometer. Zum Auftragen haben sich besonders zwei Verfahren bewahrt: das bekannte elektri sche Sprühverfahren und das Aufbringen eines Tröpfchens auf die sich schnell drehende Trä gerplatte. Das Aufbringen erfolgt erst in einer Umgebung mit gesättigtem Azetondampf, wor auf plötzlich angewärmte reine Luft aufgeblasen wird. Die Trocknung erfolgt dann in wenigen Sekunden und erzeugt eine sehr gleichmäßige Schicht. Zellulosenitrat ohne Alpha-Cyano-4- Hydroxy-Zimtsäure oder andere ionisierende Substanzen hat keine ionisierende Wirkung wäh rend des MALDI-Prozesses.According to the invention, this plate is now coated with the matrix layer on its sample side. This is based on a varnish consisting of cellulose nitrate dissolved in acetone a degree of nitration of about 12% and a chain length ("viscosity") of about 100 to There are 200 glucose groups and a small amount of alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, which is also dissolved in acetone. The layer must be very thin, it is only a few Mi crometer. Two methods have proven particularly useful for application: the known electri spraying process and the application of a droplet to the rapidly rotating pipe plate. The application takes place only in an environment with saturated acetone vapor, wor is inflated to suddenly warmed clean air. The drying then takes place in a few Seconds and creates a very even layer. Cellulose nitrate without alpha-cyano-4- Hydroxy-cinnamic acid or other ionizing substances have no ionizing effect during the MALDI process.
Die etwa 10-prozentige Zugabe von Alpha-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure hat bisher alle von uns untersuchten als Analytmoleküle verwendeten Peptide und Proteine ionisieren können. Es ist jedoch zu erwarten, daß für andere Analytsubstanzen andere Ionisierer bessere Ergebnisse lie fern. Man kann dann leicht verschiedenartige Probenträgersorten verwenden. Es ist aber auch möglich, verschiedene Ionisierer in dem gleichen Matrixgemisch zu verwenden. Sollten sich die verschiedenen Ionisierer nicht in der gleichen Lösung vertragen, so kann man einen schichtwei sen Aufbau wählen mit Schichten, die verschiedene Ionisierer enthalten. Für den Benutzer ist es vorteilhaft, wenn eine einzige Trägerplattensorte für alle analytischen Aufgaben benutzt werden kann.The approximately 10 percent addition of alpha-cyano-4-hydroxy cinnamic acid has so far all of us investigated peptides and proteins used as analyte molecules can ionize. It is however, it would be expected that other ionizers would give better results for other analyte substances remote. You can then easily use different types of sample carriers. It is also possible to use different ionizers in the same matrix mixture. Should the different ionizers cannot be tolerated in the same solution Select your structure with layers that contain different ionizers. For the user it is advantageous if a single type of carrier plate is used for all analytical tasks can be.
Diese Trägerplatten sind auch für die schnelle Analyse sehr großer Zahlen an Proben geeignet (sogenannte "massiv-parallele Verarbeitung"). Es lassen sich bei einem Millimeter Abstand auf eine Trägerplatte 9600 Probenflecken aufbringen und analysieren. Bei einem halben Millimeter Abstand lassen sich 38 400 Proben aufbringen. Rechnet man 2 Sekunden Analysezeit pro Pro benfleck, so kann man diese 38 400 Proben in etwa 6 Stunden analysieren. Diese Zielsetzung liegt für medizinische Reihenuntersuchungen vor. Automaten für die schnelle Belegung von Trägern mit solchen Probenanzahlen sind zur Zeit in Entwicklung.These carrier plates are also suitable for the rapid analysis of very large numbers of samples (so-called "massive parallel processing"). It can be opened at a millimeter distance Apply and analyze a 9600 sample stain carrier plate. At half a millimeter A distance of 38,400 samples can be applied. If you calculate 2 seconds analysis time per pro benfleck, you can analyze these 38,400 samples in about 6 hours. This goal is available for medical screening. Vending machines for the quick occupancy of Carriers with such sample numbers are currently under development.
Diese Trägerplatten verlangen eine Konzentration des Analyten von etwa einem Picomol pro Mikroliter. Umgerechnet in Gewichtskonzentrationen entspricht das in etwa einem Gewichts anteil von einem Millionstel des Lösemittels (1 ppmw). Das ist eine geringe Konzentration, niedriger als sie normalerweise bei chromatographischen oder elektrophoretischen Trennvor gängen anfällt.These carrier plates require a concentration of the analyte of about one picomole per Microliters. Converted into weight concentrations, this corresponds approximately to one weight proportion of one millionth of the solvent (1 ppmw). This is a low concentration lower than that normally used in chromatographic or electrophoretic separations gears.
Sollte die verwendete Konzentration aber noch viel geringer sein, so kann man eine ganz ande re Art der Probenträger verwenden, die aus magnetisierbaren Kügelchen von etwa 10 Mikro metern Durchmesser bestehen. Diese werden ebenfalls mit einem lackartigen Überzug der Ma trix überzogen, und können wie die Trägerplatten über längere Zeiten gelagert werden. Eine geringe Anzahl der Kügelchen wird dann der sehr verdünnten Lösung für längere Zeit und un ter starker Bewegung beigegeben. Die adsorptive Oberfläche der Kügelchen nimmt dann die Analytsubstanz aus der Lösung auf und hält sie fest. Die Kügelchen können dann mit magneti sierbaren Spezialwerkzeugen aus der Lösung entnommen, gewaschen, und auf eine flache Un terlage aufgebracht werden. Sie werden dort befestigt und dem MALDI-Prozeß zugeführt. Die Kügelchen lassen sich sehr leicht mit einer dünnen Matrixschicht überziehen, indem man sie einzeln durch einen sehr feinen (elektrisch erzeugten) Lacksprühstrahl fallen läßt. Nach dem Verlassen des Lacksprühstrahls sind die Kügelchen nach Durchmessen einer Strecke von etwa 20 Zentimetern trocken und können daher einfach in einem Glas aufgefangen werden. Die Ein richtung einer heißen Wirbelschicht im Glas verhindert das Zusammenbacken der noch frischen Kügelchen. - Auch ein pneumatisches Versprühen der Kügelchen zusammen mit einer sehr verdünnten Lacklösung führt zu einer dünnen Lackschicht auf den Kügelchen.But if the concentration used is still much lower, you can choose a completely different one re type of sample holder use that consist of magnetizable beads of about 10 micro Meters diameter exist. These are also coated with a Ma trix coated, and like the carrier plates can be stored for longer periods. A Small number of beads will then be the very dilute solution for a long time and un added strong movement. The adsorptive surface of the beads then takes that Analyte substance from the solution and holds it. The beads can then be magneti Removable special tools from the solution, washed, and on a flat surface be applied. They are attached there and fed to the MALDI process. The beads can be very easily covered with a thin matrix layer by drops them individually through a very fine (electrically generated) paint spray. After this The spheres have left the paint spray jet after measuring a distance of approximately 20 centimeters dry and can therefore easily be caught in a glass. The one direction of a hot fluidized bed in the glass prevents the fresh ones from caking Globules. - Pneumatic spraying of the beads together with a very diluted paint solution results in a thin layer of paint on the beads.
Es ist nun eine häufig auftretende weitergehende analytische Aufgabe, aus einem Lösungsge misch, in dem sich nicht nur die interessierende Analytsubstanz befindet, die Analytsubstanz gezielt herauszuholen. Man möchte beispielsweise aus einem Proteingemisch ein interessieren des Protein herausholen und auf Mißbildungen untersuchen. Diese Aufgabe kann, wie bekannt, durch Antikörper geleistet werden. Diese Antikörper lassen sich nun relativ leicht auf die lack artige Matrixschicht aufbringen und dort kovalent binden, ohne die Binde-Eigenschaften der Antikörper zu zerstören. Solcherart vorgefertigte Probenträger sind dann ganz speziell auf die Analyse bestimmter Proteine eingerichtet. Besonders die als Kügelchen ausgebildeten Proben träger können so verwendet werden. In dieser Weise wird es beispielsweise möglich, aus einer einzigen Zelle ein ganz bestimmtes Eiweiß herauszuholen und zu untersuchen.It is now a frequently occurring further analytical task, from a solution ge mix, in which not only the analyte of interest is located, the analyte targeted to get out. For example, you might want to get one out of a protein mixture remove the protein and examine for malformations. As is well known, this task can are performed by antibodies. These antibodies can now be applied to the paint relatively easily apply like matrix layer and bind covalently there without the binding properties of Destroy antibodies. Such pre-fabricated sample carriers are then very specific to the Analysis of certain proteins set up. Especially the samples designed as beads carriers can be used in this way. In this way it becomes possible, for example, from a single cell to extract and examine a specific protein.
Aber auch die gezielte Veränderung der Analytmoleküle läßt sich so erreichen. So ist es bei spielsweise für die Identifizierung von Eiweißen günstig, das Eiweiß einer enzymatischen Ver dauung zuzuführen, die die Kette der Aminosäuren zwischen oder nach jeweils genau definier ten Aminosäurepaaren auftrennt. So trennt beispielsweise das Enzym Trypsin nach dem Ami nosäurepaar Lysin und Argenin. Die Molekulargewichte der Teilstücke aus dem tryptischen Verdau lassen sehr schnell über eine Protein-Datenbank eine Identifizierung zu. Dieser Verdau kann nun in situ auf dem Probenträger vorgenommen werden. Dazu ist es erforderlich, Trypsin (oder ein anderes Enzym) auf dem Probenträger adsorbiert oder sonstwie fest gebunden zu haben. Da die Enzyme relativ stabil sind, lassen sie sich auf den Probenträgern lange lagern. Sie müssen jedoch von den in der Regel sauren Ionisierern ferngehalten werden, was aber durch den lackförmigen Aufbau der Schicht gewährleistet ist. Für diese Art der Vorpräparierung mit veränderlichen Biochemikalien sind sowohl flache Trägerplatten wie auch magnetisierbare Kü gelchen geeignet.The targeted change of the analyte molecules can also be achieved in this way. So it is with for example for the identification of proteins favorable, the protein of an enzymatic ver duration that precisely defines the chain of amino acids between or after each separates ten amino acid pairs. For example, the enzyme trypsin separates after the ami pair of lysine and argenin. The molecular weights of the sections from the tryptic Digestion allows identification very quickly via a protein database. That digestion can now be carried out in situ on the sample holder. This requires trypsin (or another enzyme) adsorbed on the sample carrier or otherwise firmly bound to have. Since the enzymes are relatively stable, they can be stored on the sample carriers for a long time. she However, they must be kept away from the generally acidic ionizers, but what can be done by the varnished structure of the layer is guaranteed. For this type of preparation with Changeable biochemicals are both flat carrier plates and magnetizable ki gelchen suitable.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: BRUKER DALTONIK GMBH, 28359 BREMEN, DE |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| R084 | Declaration of willingness to licence | ||
| R071 | Expiry of right |