DE1962267C3 - Photometrisches Analysengerät. Aiun: The United States Atomic Energy Commission, Germantown, Md. (V.St.A.) - Google Patents

Description

fen, mit welchem die Analyse einer großen Zahl von getrennten Proben kontinuierlich und gleichzeitig durchgeführt werden kann und in welchem die Schritte der volumetrischen Messung, der Flüssigkeitsübertragung, der Lösungsmischung, der Reakttion, der photometrischen Messung und der Datenreduzierung mit einem einzigen System ausgeführt werden können.

Diese Aufgabe wird mit einem eingangs angegebenen photometrischen Analysengerät gelöst durch einen motorgetriebenen Rotor, der eine Mehrzahl von kreisförmig angeordneten Probenanalysekammern aufweist, wobei die genannten Probenanalysekammern zwischen einer Lichtquelle und den lichtuntersuchenden Einrichtungen während der Umdrehung des Rotors durchlaufen, eine Mehrzahl von kreisförmig in axialer Ausrichtung mit den Probenanalysekammern angeordneten Ladekammern, die radial zwischen den Probenanalysekammern und dem Rotationsmittelpunkt des Rotors angeordnet sind und einen sich radial erstreckenden Durchgang, der den radial äußersten Teil jeder Ladekammer mit der entsprechenden Probenanalyseküvette verbindet, wobei die Proben und Reagenzien von den genannten Ladekammern die genannten Durchgänge zu den genannten Probenanalyseküvetten bei Drehung des Rotors infolge der Zentrifugalkraft durchqueren, sowie durch Einrichtungen zur Aufnahme des Ausgangssignals von den genannten Lichtuntersuchungseinrichtungen zur kontinuierlichen und gleichzeitigen Anzeige des Vorhandenseins einer gemeinsamen Substanz in jeder Probenanalysekammer.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann der Rotor den Probenanalysekammern benachbart transparente Wände aufweisen.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

An Haud der Zeichnungen soll unter Bezugnahme auf die nachfolgende Beschreibung ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert werden. In den Zeichnungen zeigt

F i g. I eine schematische Darstellung eines photometrischen Systems gemäß der vorliegenden Erfindung;

F i g. 2 eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht eines Schnittes des Rotors, der in einem System gemäß Fi g. 1 verwendet wird;

F i g. 3 ein Oszillogramm, welches mit dem System gemäß F i g. 1 erhalten wurde, wobei ein 660 πΐμ Filter und destilliertes Wasser in allen Küvetten verwendet wurde;

F i g. 4 ein Oszillogramm, welches mi! dem System gemäß Fig. 1 erhalten wurde, wobei ein 660 πΐμ Filter und eine einheitliche Lösung verwendet wurden, welche Wasser, Ochseneiweißserum und Bromphenolblau enthielt, welches in die Küvetten der Nr. 2 bis 15 während der Umdrehung eingeführt wurde;

Fig. 5 ein Oszillogramm, welches mit dem System gemäß F i g. 1 erhalten wurde, wobei ein 550 πΐμ Filter und eine Reihe von gesteigerten Eichmaßen in den Küvetten mit der Nr. 3 bis 12 verwendet wurde;

Fig. 6 eine Auswertung der in Fig. 5 enthaltenen Daten;

Fig. 7 eine Auswertung der Aufnahmen gegenüber der Proteinkonzentration, die bei der Verwendung des Systems von Fig. 1 erhalten wurden, bei der Durchführung des im Beispiel II beschriebenen Experimentes.

F i g. 1 zeigt eine flachförmige Rotoranordnung, die in der auseinandeigezo^enen Ansicht von F i g. 2 in vergrößertem Detail dargestellt ist. Sie besteht aus einem Stahlrotorkörper 2 mit angeflanschten Bolzen, Glasringen 3 und 4, einem mit Schlitzen versehenen Küvettenring aus Polysetrafluoräthylen, Halteringen 6 und 7 aus Polytetrafluioräthylen und einem Flanschring 8. Die Ringe 3, 41, 5, 6 und 7 werden zwischen dem Rotorkörper 2 und dem Flanschring 8 zusammengepreßt, um eine Mehrzahl von radial ausgerichteten Küvetten 9 in dem mit Schlitzen versehenen Küvettenring 5 zu bilden. Im Abstand voneinander angeordnete Bohrungen 10, die axial mit den Küvetten 9 ausgerichtet sind, sind im Rotorkörper 2, den Halteringen 6 und 7 und dem Flanschring 8 vorgesehen, um axial sich erstreckende Durchgänge zu bilden, die erlaube.i, daß der Lichtstrahl durch die Küvetten hindurchdringt. Eine zentral angeordnete entfernbare Übertragungsscheibe 11 ist mit kleinen so radialen Vorsprüngen 112 versehen, welche im Abstand voneinander auf dem Umfang angeordnet sind, um in die Küvetten inn Ring 5 einzugreifen. Es ist ferner ein Handgriff 3 vorgesehen, um das Entfernen der Übertragungsscheibe 11 aus der Rotoranordnung Ϊ5 zu erleichtern. Die Übertragungsscheibe 11 ist mit einer Reihe von Kammern 14 entsprechend jeder Küvette 9 zur Aufnahme von Probeflüssigkeiten und Reagenzien bei Stillstand des Motors versehen. Die Kammern 14 besteheni aus einer Mehrzahl von geneigten zylindrischen Bohrungen, welche an ihren oberen Enden miteinander verbunden und an ihren unteren Enden durch Scheidewände 15 voneinander getrennt sind. Die Scheidewände 15 verhindern die Mischung der Probe und der Reagenzflüssigkeiten, wenn der Rotor still sieht, während die Flüssigkeiten in die Küvetten 9 einfließen können, wenn der Rotor umläuft. Ein Durchgang 16 erstreckt sich von der radial äußersten Bohrung jeder Kammer 14. zum Rand des entsprechenden Vorsprunges 12, um einen Durchtritt der Flüssigkeit von jeder Kammer zu der entsprechenden Küvette zu ermöglichen, wenn der Rotor sich in Umdrehung befindet. Ein Antriebsmotor 17 trägt die Rotoranordnung und versetzt sie in Umdrehung.

Es sind eine Lichtquelle und Projektionseiinrichtungen vorgesehen, um einen Lichtstrahl von konstanter Intensität, die Rotoranordnung 1 kreuzend, auf einen Punkt zu werfen, der den radialen Stellungen der Küvetten 9 und der mit Zwischenraum angeordneten Bohrungen 10 entspricht. Der Lichtstrahl wird so ausgerichtet, daß er durch jede Bohrung 10 hindurchdringt und jede Küvette 9 von dem Strahl durchquert wird. Die photometrische Lichtquelle besteht aus einer Glühlampe 18 mit einem reflektierenden Spiegel 19, der unterhalb der Rotoranordnung 1 angeordnet und ausgerichtet ist, um den Lichtstrahl nach oben im wesentlichen senkrecht auf die Rotationsebene zu reflektieren.

Es ist eine elektronische Lichtdetektoreinrichtung 20 über der Rotoranordnung 1 vorgesehen und ausgerichtet, um das durch die Küvetten hindurchdringende Licht während der Rotation aufzunehmen. Die Lichtdetektoreinrichtung 20 liefert elektronisch einen Ausgang, welcher proportional der Intensität des von der Lichtquelle 18 durch die Küvetten hindurchtretenden Lichtes ist. Der Lichtdetektor 20 besteht aus einer Photomultiplierröhre, welche unmittelbar über dem Küvettenkreis angeordnet ist, um das gesamte

nach oben durch die axial ausgerichteten öffnungen austretende Licht zu empfangen.

Die restlichen elektronischen Bauteile, die in Fig. 1 schematisch dargestellt sind, bestehen aus einem Proportionaltachometer 21, der ein Spannungssignal proportional der Rotorgeschwindigkeit an einen Auflaufsignalgenerator 22 liefert, der ein Signal einem Impulsabtaster 23 zuführt. Ein Umdrehungsdetektor 24 synchronisiert die Auflaufsignalfrequenz mit der Rotorgeschwindigkeit. Die Impulsabtasteinrichtung 23, welche durch die Frequenz des Auflaufsignals vom Generator 22 synchronisierbar ist, spricht proportional auf die in der Photodetektoreinrichtung 20 entstehenden Impulse an und sortiert daraus die Impulse so wie sie entstanden sind. Eine Impulsspitzenanzeigeeinrichtung 25 zeigt kontinuierlich und gleichzeitig den Lichtdurchgang durch die flüssigen Inhalte in jeder Küvette an.

!n Betrieb werden die Proben und Reagenzien zunächst in die Kammern 14 bei Stillstand des Rotors 1 eingeführt und danach zentrifugal bei Umdrehung des Rotors in die entsprechenden Küvetten 9 bewegt. Da die Übertragung in die Küvetten 9 beim Beschleunigen des Motors während einer relativ kurzen Zeitdauer geschieht, beginnen alle Reaktionen in den Küvetten im wesentlichen gleichzeitig und können kontinuierlich an einem Oszilleskop oder anderen Ableseeinrichtungen 25 beobachtet werden. Bei der Versehung von drei Höhlungen in jeder Kammer 14 in der Übertragungsscheibe 11 können bei Stillstand des Rotors eine Probe und zwei Reagenzien ohne Mischung untergebracht werden und bei Umdrehung des Rotors werden diese infolge der Zentrifugalkraft in die entsprechende Küvette abfließen und gemischt. Die Verbindungen zu den Küvetten erfolgen durch kleine Durchgänge durch die Vorsprünge 12, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist. Die Übertragungsscheibe 11 nimmt Übertragungsröhren oder kleine, kommerziell verfügbare Mikroliter-Pipetten auf. Derartige Vorrichtungen erlauben eine einzige Reaktion oder eine mehrfache Addition von Reaktionen oder Reaktionen, bei weichen die Reaktionszeit zwischen zwei Hinzufügungen abläuft. Bei Reaktionen, bei welchen Niederschläge erzeugt werden, können «ich die suspendierten Feststoffe durch die Zentrifugalkraft aus dem optischen Weg bewegen, wodurch die absorbierenden Mittel klar gemessen werden können.

Bei dem beschriebenen Rotor bewirkt die radiale Ausrichtung der Küvetten eine Differenz in der Tangentialgeschwindigkeit, die zwischen dem radialinnersten und dem radialäußersten Ende bei jeder Küvette vorhanden ist. Eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung des Rotors während der Übertragung der Flüssigkeit in die Küvetten bewirkt einen kreisförmigen Fluß der Flüssigkeit und steigert die Mischung. Eine derartige Mischung ist sehr wünschenswert, da sie die Reaktion zwischen der Probe und dem Reagenz steigert und einheitlichere Ergebnisse liefert. In der Praxis wird der Rotor schnell beschleunigt, um die Flüssigkeit in die Küvetten zu übertragen, schnell verzögert, um die Mischung zu erleichtern und dann wieder auf die gewünschte Geschwindigkeit für die Prüfung beschleunigt.

Beispiel 1

Um festzustellen, ob reproduzierbare Kurven mit Eichlösungen bei Verwendung des zuvor beschriebenen Gerätes erhalten werden konnten, wurde eine Lösung, welche 1,5 g von kristallinem Ochseneiweißserum (BSA) und 15 mgm Bromphenolblau (BPB) in 100 ml Wasser mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine Reihe von Lösungen, welche 10% Zuwachs pro Stammlösung enthielt, zu erhalten. Fig. 3 stellt ein 5 Oszillogramm dar, welches ein typisches Beispiel zeigt, das unter Verwendung eines 660 m|i Filters und destilliertem Wasser in allen Küvetten beobachtet wurde. Das Oszillogramm wurde von einem Oszilloskop erhalten, welches mit einer Impulsspilzenableseeinrichtung 25, die in bezug auf Fig. 1 beschrieben wurde, versehen war. Das Oszillogramm von F i g. 4 wurde durch Einführung einer Lösung, welche Wasser und BSA-BPB-Lösung im Volumenverhältnis 1:1 enthielt, in die Küvetten Nr. 2 bis 15 während der Rotation erhalten. Die Unterschiede in den Spitzenhöhen, obgleich geringfügig, stimmten mit den durch direkte Messungen beobachteten überein. Das Oszillogramm von F i g. 5 wurde erhalten durch eine vollständige Reihe von gesteigerten Eichmaßen in den Küvetten Nr. 3 bis 12, mit einer Verdopplung der Lösung, die in der Küvette 12 und auch in der Küvette 14 verwendet wurde. Die vier verbleibenden Küvetten enthielten nur destilliertes Wasser. Die Messungen wurden aus photographischen Vergrößerungen

»5 der im Oszilloskop beobachteten Abbildungen gewonnen und alle Spitzen wurden in 1/%T durch Division der ersten Leeren durch jede folgende Ablesung umgewandelt. Der Logarithmus von l/T ist die Extinktion, welche nach der Subtraktion der Leeren mit dem Küvettenfaktor multipliziert wurde, um die absorbierenden Substanzen für einen Zentimeter Weglänge zu erhalten. Die auf diese Weise von dem Oszillogramm gemäß Fig. 5 erhaltenen Daten wurden in F i g. 6 ausgewertet.

Beispiel 2

Ein weiteres Experiment wurde ausgeführt, um darzustellen, daß das System für folgende in den Küvetten ablaufende Reaktionen verwendet werden kann. Die Biuret-Rcaktion für Protein iM eine einzige Ein-Reagenz-Analysc. welche von allgemeinem Tnteresse und geeignet ist, den Wirkungsgrad der Übertragungsscheibe, der Mischung und der Leistungsfähigkeit des Systems, die absorbierenden Substanzen frühzeitig beim Ablauf der Reaktionen zu messen, zu berechnen. Das Weichselbaum-Biuret-Reagen7 kann mit Protein-Lösungen im Bereich der verschiedenen Verhältnisse von 0 bis 50% des Reagenzes in der endgültigen Mischung durchgeführt werden, wobei identische Lösungen verwendet werden, um eine Eichkurvc zu erhalten.

Ein Experiment wurde durchgeführt mit 200 Mikroliter eines Reagenzes und doppelten Proteinlösungen von 200 Mikroliter, wobei die Lösungen 0.2, 0,4, 0,6, 0.8 und 1 % Protein enthielten. Diese Lösungen wurden in die geeigneten Kammern in der mittleren Scheibe gebracht und beim Anlaufen des Rotors in die Küvetten übertragen. Dreißig Sekunden später wurde ein Oszillogramm in der gleichen Weise wie beim Experiment von Beispiel 1 erhalten und die Ergebnisse wurden in Fig. 7 ausgewertet, wobei Wasser als Bezugsmaß verwendet wurde.

Die experimentelle Ausfühningsform des Gerätes, welches in den oben beschriebenen Beispielen verwendet wurde, gestattet es, 15 Reaktionen gleichzeitig durchzuführen und die Substanzen der Proben innerhalb von sehr kurzen Zeitdauern, nachdem die Reaktionen begonnen haben, zu beobachten und zu messen. Eine größere Anzahl von Reaktionen kann durch

Verwendung eines größeren Rotors mit einer entsprechend größeren Zahl von Küvetten und eine kleinere Zahl durch einfaches Verwenden nur eines Teils der verfügbaren Küvetten durchgeführt werden.

Anders als bei den Folgeanalysegeräten wurde kein Hinüberziehen zwischen den Proben und der Oszilloskopspur beobachtet, welche zwischen jeder Probenablesung auf 0% zurückging. Bei der Vorsehung von einem oder mehreren reinen Wasserproben in jeder Reihe wurden bei Ablesungen der Proben 0 und 100% Übertragung während jeder Umdrehung festgestellt. Bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 1200 rpm erfolgen 20 Umdrehungen pro see, wodurch 20 Meßreihen ausgeführt werden können. Wenn eine Aussetzungszeit von einer Sekunde gewählt wird, können im Ergebnis durchschnittlich 20 Ablesungen erhalten werden. Die Zeit zwischen den Spitzen genügt, um bei der Computer-Mittelwertsbildung die Digitalisierung der Spitzenhöhen vorzunehmen.

Wenn kleine Flüssigkeitsvolumina dem Rotor zu Beginn zugeführt werden, wird der Rotor vollständig angehalten und die Proben-Reagenzienscheibe wird wieder eingesetzt. Auf diese Weise können Reaktionen ausgeführt werden, die abhängig sind von zeitlich aufeinander folgenden Hinzufügungen. Die Zentrifugaleigenschaften des Rotors können, wenn gewünscht, auch dazu verwendet werden, besondere Stoffe abzusetzen und zu gewährleisten, daß die

ίο Lösungen, während die Substanzen gemessen werden, nicht trübe sind.

Die Rotoranordnung 1 kann mit mehr oder weniger Küvetten als gezeigt oder aus verschiedenen Materialien, wie z. B. transparenten Kunststoffen, hergestellt werden. Die zentral angeordnete Übertragungsscheibe kann ebenso mit mehr oder weniger Kammern zur Aufnahme der Proben und der Reagenzflüssigkeiten versehen werden, wobei die genannten Kammern von der besonderen dargestellten Form abweichen können.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Photometrisches Analysengerät zur Bestimmung der in einer Probe vorhandenen Substanz, bei welcher ein Lichtstrahl die Probe durchdringt und durch lichtuntersuchende Einrichtungen gemessen wird, welche ein Ausgangssignal abgeben, das proportional der Intensität des untersuchten Lichtes ist, und mit welchen das Vorhandensein einer gemeinsamen Substanz in einer Mehrzahl von Proben gleichzeitig und kontinuierlich bestimmt werden kann, gekennzeichnet durch einen motorgetriebenen Rotor, der eine Mehrzahl von kreisförmig angeordneten Probenanalysekammem aufweist, die zwischen einer Lichtquelle und den lichtuntersuchenden Einrichtungen während der Umdrehung des Rotors durchlaufen, eine Mehrzahl von kreisförmig in axialer Ausrichtung mit den Probenanalysekammern angeordneten Ladekammern, die radial zwischen den Probenanalysekammern und dem Rotationsmittelpunkt des Rotors angeordnet sind, und einen sich radial erstreckenden Durchgang, der den radial äußersten Teil jeder Ladekammer mit der entsprechenden Probenanalyseküvette verbindet, wobei die Proben und Reagenzien von den genannten Ladekammern die genannten Durchgänge zu den genannten Probenanalyseküvetten bei Drehung des Rotors infolge der Zentrifugalkraft durchqueren, sowie durch Einrichtungen zur Aufnahme des Ausgangssignals von den genannten Lichtuntersuchungseinrichtungen zur kontinuierlichen und gleichzeitigen Anzeige des Vorhandenseins einer gemeinsamen Substanz in jeder Probenanalysekammer.

2. Photometrisches Analysengerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Probenanalysekammern aus einer Mehrzahl von radialorientierten, längserstreckten Bohrungen oder Höhlungen bestehen, welche in kreisförmiger Reihung über dem Rotationsmittelpunkt der genannten Rotoranordnung vorgesehen sind.

3. Photometrisches Analysengerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenanalysekammern durch Zwischenlegen eines geschlitzten Ringes zwischen zwei Schichten aus transparentem Material hergestellt sind.

4. Photometrisches Analysengerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der geschlitzte Ring aus Polytetrafluoräthylen und die genannten Schichten aus einem transparenten Material aus Glas hergestellt sind.

5. Photometrisches Analysengerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Rotor, benachbart den Probenanalysekammern, durchsichtige Wände aufweist.

6. Photometrisches Analysegerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Einrichtungen zur Untersuchung des Lichts aus einer Photomultiplierröhre bestehen.

7. Photometrisches Analysegerät nacli Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Einrichtungen zur kontinuierlichen i-.nd simultanen Anzeige des Vorhandenseins eiaer gemeinsamen Substanz in jeder Probenanalysekammer aus einem Osiilloskop bestehen.

Die Erfindung betrifft ein photometrisches Analysengerät zur Bestimmung der in einer Probe vorhandenen Substanz, bei welcher ein Lichtstrahl die Probe durchdringt und durch lichtuntersuchende Einrichtungen gemessen wird, weiche ein Ausgangssignal abgeben, das proportional der Intensität des untersuchten Lichtes ist, und mit welchen das Vorhandensein einer gemeinsamen Substanz in einei Mehrzahl von Proben gleichzeitig und kontinuierlich bestimmt

ίο weiden kann.

Die nachfolgend verwendete Bezeichnung »photometrisch« soll nicht in eingeschränktem Sinne aufgefaßt werden, sondern sie soll allgemein für die Ausdrücke »kolorimetrisch«, »fluorimetrisch« und »spektrometrisch« gelten. Folgerichtig damit soll auch die Bezeichnung »Photometer« in einem weiten Sinne für Vorrichtungen verwendet werden, die manchmal als »Kolorimeter«, »Fluorometer« und »Spektrometer« bekannt wurden. Die weiterhin verwendete Bezeichnung »Licht« umfaßt Strahlungsenergie im sichtbaren und unsichtbaren Spektrum ebenso wie Strahlungsenergie, die auf spezielle Wellenlängen beschränkt ist. Somit soll die Erfindung Systeme umfassen, welche verschiedene Arten von

as Strahlung verwenden, um die gewünschte Messung auszuführen.

Das Bedürfnis nach einem photometrischen System, welches geeignet ist, eine große Zahl von getrennten Proben gleichzeitig durchzuführen, existierte

in den klinischen und analytischen Laboratorien schon seit langem. Qualitative und quantitative Messungen von Stoffwechselprodukten, Hormonen, Vitaminen, Enzymen, Mineralien, Körperabfallprodukten, Gallenbestandteilen und Mageninhalten werden täglieh in großer Anzahl in derartigen Laboratorien bei Krankheitsdiagnosen wie auch zu Forschungszwecken durchgeführt. Ein System, welches Messungen dieser Art schnell, genau und billig ausführen könnte, würde auch eine große Arbeitskräfte- und Kostenersparnis, verbunden mit verbesserten Ergebnissen, bewirken. Die meisten vorbekannten Instrumente dieser Art waren eher geeignet, Analysen der Reihenfolge nach als gleichzeitig durchzuführen. Die aufeinander folgenden Analysen beschränken nicht nur die Zahl der Analysen, sondern im Falle der Analyse von sehr kleinen Proben werden die Resultate gewöhnlich unzuverlässig.

Ein anderer Nachteil der vorbekannten Analysegeräte für getrennte Proben ist das Erfordernis, daß die Proben in viel Zeit erforderlichen Schritten und in getrennten Apparaten vorbereitet werden mußten. Derartige Anordnungen begrenzen ebenfalls die Zahl der Analysen, da sie noch mehr Zeit verbrauchen und kostspielig sind.

Eine andere Unzulänglichkeit der vorbekannten photometrischen Instrumente ist die Tatsache, daß Mengen von Proben, Enzymen oder anderen teuren Reagenzien, größer als wünschenswert, erforderlich sind. Dieser Nachteil wirkt sich in einigen Fällen bei kontinuierlich arbeitenden Durchflußüberwachungssystemen dahin aus, daß sie unbrauchbar werden, wenn eine kleine Anzahl von Proben analysiert werden soll. Ein weiterer Nachteil ist die Unerwünschtheit der einzelnen Behandlung von vielen kleinen, getrennten Volumen von Proben und Reagenzien und die Mischung derselben in Zeitabständen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein photometrisches System zu schaf-