DE19629281A1

DE19629281A1 - Biochemical preparation of bio-material samples

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Publication number: DE19629281A1
Application number: DE19629281A
Authority: DE
Original assignee: Bruken Franzen Analytik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 1998-01-29

Abstract

Process for biochemical preparation of biomaterial samples for mass-spectrometric analysis to detect certain genetic markers is new. The presence of a target genetic marker results in the generation of analyte molecules with characteristic molecular weights. Enough of these analyte molecules are generated to permit mass-spectrometric analysis.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Probenvorbereitung von Biomaterial für die massenspektrometrische Analyse zur Feststellung der Anwesenheit bestimmter geneti scher Merkmale im Biomaterial.The invention relates to a method for biochemical sample preparation of biomaterial for mass spectrometric analysis to determine the presence of certain geneti characteristics in biomaterial.

Die Erfindung besteht in der Umwandlung der Information des genetischen Merkmals, das in einem genau definierbaren Teilstück der DNA verschlüsselt ist, in Analytmoleküle mit einem Molekulargewicht, das für das Merkmal charakteristisch ist, und in der Bereitstellung genü gend solcher Analytmoleküle für eine massenspektrometrische Molekulargewichtsbestimmung. Letztere gibt dann Auskunft über die Anwesenheit des gesuchten Merkmals. Die Analytmole küle können beispielsweise selbst je eine Kopie des Teilstücks der DNA - verändert oder un verändert - enthalten, wobei die Vervielfältigung der DNA in bekannter Weise durch das PCR-Verfahren vorgenommen werden kann. Die Probenvorbereitung kann massiv-parallel in Reak torsystemen mit sehr großen Anzahlen von Einzelreaktoren vorgenommen werden. Die Mole kulargewichtsbestimmung kann beispielsweise in Flugzeit-Massenspektrometern mit Hilfe der MALDI-Ionisierung vorgenommen werden. Für komplexe, aber häufig vorkommende konkre te Fragestellungen nach vielen Merkmalen gleichzeitig (beispielsweise für ein Mutationsscree ning) können benutzungsfertige Reaktorsysteme mit vielen biochemisch vorpräparierten Ein zelreaktorgefäßen verwendet werden. The invention consists in converting the information of the genetic trait, which in a precisely definable part of the DNA is encoded, into analyte molecules with one Molecular weight that is characteristic of the characteristic and sufficient in the provision Such analyte molecules for a mass spectrometric molecular weight determination. The latter then provides information about the presence of the feature sought. The analyte mole For example, coolers can copy their own part of the DNA - modified or un modified - included, the duplication of the DNA in a known manner by the PCR procedures can be done. The sample preparation can be massively parallel in reak gate systems with very large numbers of individual reactors. The mole Specular weight can be determined, for example, in time-of-flight mass spectrometers with the aid of MALDI ionization can be made. For complex but frequently occurring concre te questions about many features at the same time (for example for a mutation screen ready-to-use reactor systems with many biochemically prepared ones cell reactor vessels are used.

State of the art

In Biochemie und molekularer Genetik tritt in zunehmender Weise die Frage nach dem Vor handensein bestimmter genetischer Merkmale in einem gegebenen Biomaterial auf. Diese Merkmale sind in der DNA des Biomaterials verschlüsselt Fragen dieser Art (und die zugehö rigen analytischen Feststellungen) bilden die Grundlage der Genotypisierung, also der Bestim mung des Zusammenhangs zwischen phänotypischen Merkmalen und genetischen Merkmalen. Aber auch die Mutationsforschung, und mehr noch das Mutationsscreening, läuft auf Analysen dieser Art hinaus. Im weiteren Sinne sind Feststellungen dieser Art auch für die Identifizierung und Charakterisierung von Biomaterial wichtig. So kann man auf diese Weise krebsbefallenes Gewebe von nicht befallenem Gewebe eines Patienten unterscheiden. Oder man kann die An wesenheit von Viren oder Bakterien bestimmter Arten anhand von charakteristischen Teilstüc ken ihrer DNA in beliebigem Biomaterial feststellen. Schließlich kann durch die Bestimmung einer genügenden Anzahl dieser Merkmale auch die Zugehörigkeit von Biomaterial zu einem bestimmten Individuum festgestellt werden ("genetischer Fingerabdruck"). Auch künstlich ge netisch verändertes Material und seine Vererbung kann festgestellt werden.In biochemistry and molecular genetics, the question of what comes before is increasing presence of certain genetic traits in a given biomaterial. This Characteristics are encoded in the DNA of the biomaterial Questions of this kind (and the associated other analytical findings) form the basis of genotyping, i.e. the determinant the relationship between phenotypic traits and genetic traits. But mutation research, and even more so mutation screening, is based on analysis of this kind. In a broader sense, statements of this kind are also for identification and characterization of biomaterial important. In this way you can get cancer Distinguish tissue from a patient's unaffected tissue. Or you can the An Presence of viruses or bacteria of certain types based on characteristic parts determine their DNA in any biomaterial. Finally, by determination a sufficient number of these characteristics also means that biomaterial belongs to one certain individual can be determined ("genetic fingerprint"). Also artificially ge Netically modified material and its inheritance can be determined.

Die DNA besteht bekanntermaßen aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechseln den Nucleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilden. Die Nucleotide bestehen jeweils aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe, und einer Base. Zucker und Phosphorsäure bilden das Rückgrat der Kette, die vier charakteristischen Basen sind jeweils seitlich an der Phosphorsäuregruppe befestigt. Die beiden Ketten sind in Form einer Doppelhe lix verbunden, wobei jeweils komplementäre Nucleotide (sogenannte Basenpaare) über Was serstoffbrücken miteinander verbunden sind.The DNA is known to consist of two complementary chains of four alternating the nucleotides, the order of which makes up the genetic code. The nucleotides exist each from a sugar (ribose), a phosphoric acid group, and a base. Sugar and Phosphoric acid form the backbone of the chain, the four characteristic bases are each attached to the side of the phosphoric acid group. The two chains are in the form of a double marriage lix connected, each with complementary nucleotides (so-called base pairs) via What hydrogen bridges are interconnected.

Unter einem "genetischen Merkmal" wird hier die Ausformung eines genau festgelegten Teil stücks eines Einzelteilstrangs der DNA des betrachteten Biomaterials, also eines genau defi nierten Teilstücks des Genoms, verstanden. Dieses Teilstück ist in der Regel nicht sehr lang und soll im hier verstandenen Sinne nur etwa 20 bis 100 Nucleotide umfassen. Das Genom einer Spezies ist durch die Reihenfolge der Nucleotide an sich prinzipiell festgelegt, wobei aber neben Teilstücken ohne jede Variabilität auch eine Anzahl einzelner Teilstücke mit mäßiger Variabilität, also mit veränderten Reihenfolgen der Nucleotide, vorkommen. Diese "Mutanten" bilden die individuelle Ausformung des Genoms, wie sie ein Individuum einer Spezies von den Vorfahren über Vater und Mutter ererbt, wie sie aber auch gelegentlich durch spontane Ände rungen in einem Individuum neu auftreten oder sogar künstlich erzeugt werden können. Die hier definierten Teilstücke mit genetischen Merkmalen sind nicht mit den normalerweise sehr viel größeren Genen identisch, sie können Teilstücke von Genen sein, aber auch Teilstücke von sogenannter "nichtkodierender DNA" ("introns"), die nicht zu Genen gehören, aber durchaus Informationen über Spezies oder Individuum tragen können. Ein Gen kann durchaus mehrere Stellen mit genetischen Individualmerkmalen im hier gebrauchten Sinn enthalten. Bereits heute sind etwa 50 Mutanten bekannt, deren Vorhandensein beim Menschen das Entstehen bestimm ter Krankheiten begünstigt, die Zahl nimmt zur Zeit wöchentlich um die Entdeckung einer sol chen Mutante zu. Es steht zu erwarten, daß wir in fünf Jahren alle Gene kennen, in zehn Jahren alle Mutationen.A "genetic trait" here means the formation of a precisely defined part piece of a single part strand of the DNA of the biomaterial under consideration, i.e. one exactly defi nured section of the genome, understood. This section is usually not very long and in the sense understood here should only comprise about 20 to 100 nucleotides. The genome a species is in principle determined by the order of the nucleotides per se, but in addition to sections without any variability, a number of individual sections with moderate Variability, i.e. with changed nucleotide orders. These "mutants" form the individual form of the genome as it is an individual of a species of the Ancestors inherited from father and mother, but also occasionally through spontaneous changes new occurrences in an individual or can even be created artificially. The Sections with genetic traits defined here are not usually very similar to those much larger genes identical, they can be parts of genes, but also parts of So-called "non-coding DNA" ("introns"), which do not belong to genes, but definitely Can carry information about species or individual. One gene can do several Contain positions with genetic individual traits in the sense used here. Already today About 50 mutants are known, the presence of which determines the origin in humans diseases, the number is currently increasing every week to discover a sol Chen mutant. We can expect to know all the genes in five years, in ten years all mutations.

Die genaue Festlegung des DNA-Teilstücks als Träger des interessierenden genetischen Merk mals kann über die Festlegung von genügend langen DNA-Sequenzen an beiden Rändern des Teilstücks erfolgen. Diese charakteristischen Randsequenzen sollten sinnvollerweise in Gebie ten ohne Variabilität liegen. Die Sicherheit der Festlegung hängt von der Länge des definierten Randgebiets ab. Wählt man beispielsweise für die Festlegung der Randsequenz eine Länge von 20 Nucleotiden, so kommt diese Sequenz nur noch unter DNA-Strängen der Länge von 4²⁰ ≈ 1 Billion Basenpaaren statistisch einmal vor; selbst in menschlicher DNA mit etwa 3,5 Milliar den Basenpaaren ist daher eine Verwechslung praktisch ausgeschlossen.The exact definition of the DNA section as the carrier of the genetic trait of interest can be determined by defining sufficiently long DNA sequences on both edges of the Partial take place. These characteristic marginal sequences should usefully be in the area without variability. The certainty of the definition depends on the length of the defined Outskirts. For example, if you choose a length of for defining the edge sequence 20 nucleotides, this sequence only comes under DNA strands with a length of 4²⁰ ≈ 1 billion base pairs statistically once; even in human DNA with about 3.5 billion the base pairs are therefore practically impossible to mix up.

Das PCR-Verfahren (PCR = polymerase chain reaction) ist eine Methode, solche durch Rand gebiete definierten Teilstücke der DNA als Träger von genetischen Merkmalen aus einem ge samten Genom selektiv zu vervielfältigen. Die Ränder der Teilstücke werden dabei über syn thetisch hergestellte Nucleotid-Sequenzen definiert. Diese Sequenzen heißen "Primer", sie la gern sich an der ausgewählten Stelle einer einzelsträngigen DNA durch Hybridisierung an und bilden dann den Startpunkt einer enzymatischen Komplettierung des helixförmigen Doppel stranges der DNA aus einzelnen Nucleinsäuren durch ein beigegebenes Enzym (DNA-Polyme rase). In einem Folgeschritt wird dann der Doppelstrang durch Hitzedenaturierung wieder in zwei Einzelstränge zerlegt. Die zyklisch häufig wiederholten PCR-Schritte enden mit einer großen Anzahl von genauen Kopien des DNA-Teilstücks, das zwischen den beiden durch die Primer definierten Randsequenzen liegt. In 30 solcher Zyklen werden aus einem einzigen sol chen DNA-Teilstück durch jeweilige Verdoppelung der Anzahl 2³⁰ ≈ 1 Milliarde≈ 1,6 Femto mol solcher Kopien.The PCR method (PCR = polymerase chain reaction) is a method by Rand areas defined sections of DNA as carriers of genetic features from a ge to selectively reproduce the entire genome. The edges of the sections are over syn defined nucleotide sequences. These sequences are called "primers", they la like to hybridize at the selected site of a single-stranded DNA to and then form the starting point of an enzymatic completion of the helical double strands of DNA from individual nucleic acids by an added enzyme (DNA polymer rase). In a subsequent step, the double strand is then reinserted by heat denaturation disassembled two single strands. The cyclically repeated PCR steps end with one large number of exact copies of the DNA section that is between the two by the Primer defined edge sequences lies. In 30 such cycles, a single sol Chen DNA section by doubling the number 2³⁰ ≈ 1 billion≈ 1.6 femto moles of such copies.

Nach dem Stand der Technik können die so hergestellten DNA-Kopien ("PCR-Transscripte") einerseits durch Gelelektrophorese direkt auf ihr Molekulargewicht hin untersucht werden. Dieser Vorgang ist zeitraubend, nicht sehr genau, wenig empfindlich und nicht besonders für eine massiv-parallele Verarbeitung geeignet. Andererseits können die Basensequenzen durch Sangersequenzierung mit Gelelektrophorese als Bestimmungsmethode ermittelt werden, diese Methode liefert mehr Information, ist aber noch aufwendiger. Die Laufzeit der elektrophoreti schen Trennung ist bei beiden Verfahren der zeitbestimmende Faktor, der die Analysenge schwindigkeit limitiert. Die Elektrophoresegeschwindigkeit ist aus physikalischen Gründen begrenzt.According to the prior art, the DNA copies produced in this way (“PCR transcripts”) on the one hand, directly examined for their molecular weight by gel electrophoresis. This process is time consuming, not very precise, not very sensitive and not particularly for massive parallel processing is suitable. On the other hand, the base sequences can by Sanger sequencing can be determined using gel electrophoresis as a method of determination, this Method provides more information, but is even more complex. The duration of the electrophoresis separation is the time-determining factor that determines the limited speed. The electrophoresis rate is for physical reasons limited.

Es ist aber zu erwarten, daß massenspektrometrische Messungen des Molekulargewichts mit weit höherer Empfindlichkeit und weit höheren Geschwindigkeiten möglich sein werden. Der gegenwärtig rasche Fortschritt in der MALDI-Technik führt zu hohem Automatisierungsgrad der Probenionisierung und zu kurzzeitigen Analysen. Es werden damit Molekulargewichtsbe stimmungen auch sehr großer Analytmoleküle in Mengen von einigen hundert Attomol in Meßdauern von wenigen Sekunden möglich. Auf einem Probenträger können viele Tausende von Proben untergebracht werden. Die Automatisierung und die hohe Dichte an Proben eröff nen die Möglichkeit zu einer massiv-parallelen Verarbeitung von einigen zehntausend Proben pro Tag auch in der massenspektrometrischen Analyse.However, it is to be expected that mass spectrometric measurements of the molecular weight with far higher sensitivity and far higher speeds will be possible. Of the Rapid progress in MALDI technology leads to a high degree of automation sample ionization and short-term analyzes. So that it becomes molecular weight very large analyte molecules in amounts of a few hundred attomoles in Measuring times of a few seconds possible. Many thousands can be stored on a sample carrier of samples. The automation and the high density of samples opened open the possibility of massive parallel processing of tens of thousands of samples per day also in mass spectrometric analysis.

Massenspektrometer mit MALDI- oder ESI-Technik (ESI = Elektrosprüh-Ionisierung) werden bereits für die Sequenzierung der DNA nach dem Sanger-Schema unter Benutzung von PCR-Verfahren eingesetzt, siehe dazu PCT/US94/00193.Mass spectrometer with MALDI or ESI technology (ESI = electrospray ionization) already for the sequencing of the DNA according to the Sanger scheme using PCR method used, see PCT / US94 / 00193.

In der Biochemie und der Molekulargenetik haben sich für die parallele (synchrone) Verarbei tung vieler Proben sogenannte Mikrotiterplatten durchgesetzt. Es gibt bereits heute kommer ziell erhältliche Probenvorbereitungssysteme, die mit Mikrotiterplatten arbeiten. Diese enthiel ten ursprünglich auf einer nutzbaren Fläche von 72 mal 108 Millimeter 96 kleine Reaktionsge fäße in einem 9-mm-Raster. Heute haben sich Platten der gleichen Größe mit 384 fest im Kunststoff eingelassenen Reaktionsgefäßen im 4,5-mm-Raster durchgesetzt. Platten mit 864 Reaktionsgefäßen im 3-mm-Raster sind im Kommen, und noch viel höhere Dichten sind in Diskussion.Biochemistry and molecular genetics have favored parallel (synchronous) processing So-called microtiter plates are used in many samples. There are already today currently available sample preparation systems that work with microtiter plates. This contained originally had 96 small reaction vessels on a usable area of 72 by 108 millimeters barrels in a 9 mm grid. Today, panels of the same size are firmly in place at 384 Plastic inserted reaction vessels in a 4.5 mm grid. Plates with 864 3 mm pitch tubes are on the rise, and much higher densities are in Discussion.

Die häufig "massiv-parallel" genannte Verarbeitung von Proben, beispielsweise in der moleku laren Genetik, besteht nun einerseits darin, nicht nur mit einer einzigen solchen Mikrotiterplatte zu arbeiten, sondern mit einer großen Anzahl solcher Platten parallel. Beispielsweise können bei gleichzeitiger Behandlung von 120 solcher Platten in einer einzigen PCR-Apparatur mehr als 46 000 DNA-Proben gleichzeitig in einer Zeit von etwa 3 Stunden jeweils milliardenfach vervielfältigt werden. Andererseits ist zu erwarten, daß sich die PCR-Zeit für eine Vermilliar denfachung mit miniaturisierten Reaktionssystemen in naher Zukunft auf weniger als 10 Minu ten reduzieren wird, wobei sich durch die Verkleinerung der Reaktionssysteme auf wenige Mikroliter Inhalt mehr als Tausend solcher Reaktionssysteme auf der Fläche einer heutigen Mi krotiterplatte unterbringen lassen. Beispielsweise ergeben sich auf der Fläche heutiger Mikroti terplatten 1944 Probengefäße im 2-mm-Raster oder 3456 Gefäße im 1,5-mm-Raster. Die Ein führung der Mikrosystemtechnik kann zu weiterer Verkleinerung führen. Die synchrone Über tragung aller Proben aus diesen Mikroreaktoren auf MALDI-Trägerplatten wird folgen.The processing of samples, often called "massively parallel", for example in the moleku laren genetics, now consists on the one hand, not only with a single such microtiter plate to work, but with a large number of such plates in parallel. For example with simultaneous treatment of 120 such plates in a single PCR apparatus more than 46,000 DNA samples at a time in billions of times over a period of about 3 hours be reproduced. On the other hand, it can be expected that the PCR time for a vermillion with miniaturized reaction systems in the near future to less than 10 minutes ten will reduce, with the reduction of the reaction systems to a few Microliter content more than a thousand such reaction systems in the area of today's Mi Have the titer plate placed. For example, there are microti on today's surface 1944 sample plates in 2 mm increments or 3456 tubes in 1.5 mm increments. The one Management of microsystem technology can lead to further downsizing. The synchronous about All samples from these microreactors will be carried on MALDI carrier plates.

Object of the invention

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, mit dem sich die Anwesenheit von bekannten Ausformungen genetischer Merkmale in Biomaterial schnell massenspektrometrisch feststellen läßt. Das Verfahren soll einer massiv-parallelen Verarbeitung mit einer schnellen Feststellung von vielen genetischen Merkmalen im selben Biomaterial zugänglich sein. Schließ lich soll es möglich sein, für komplexe, aber häufig vorkommende konkrete Fragestellungen nach vielen Merkmalen gleichzeitig (beispielsweise für ein Mutationsscreening) ein benutzungs fertiges Reaktorsystem mit vielen einzeln biochemisch so vorpräparierten Reaktorgefäßen zu verwenden, daß alle Gefäße nur noch mit gleichen Proben- und Reaktionsmaterialien zu be schicken sind.It is the object of the invention to find a method by which the presence of known forms of genetic characteristics in biomaterial quickly mass spectrometrically can be determined. The process is intended to be massively parallel with fast processing Finding many genetic traits in the same biomaterial will be accessible. Close It should be possible for complex, but frequently occurring, concrete questions according to many features at the same time (for example for mutation screening) one use finished reactor system with many individually prepared biochemically prepared reactor vessels use that all tubes only with the same sample and reaction materials to be are send.

Description of the invention

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, den DNA-Strang mit dem genetischen Merkmal durch eine biochemische Verarbeitung des Biomaterials im Rahmen der Probenvorbereitung für die Erzeugung einer Vielzahl von Molekülen zu verwenden, die massenspektrometrisch gut detek tierbar sind, und die bekannte Ausformung des Merkmals, dessen Anwesenheit festgestellt werden soll, zur Ausbildung eines charakteristischen Molekulargewichts dieser Moleküle zu benutzen, so daß die massenspektrometrische Messung des Molekulargewichts die Information über die Anwesenheit dieser bestimmten Ausformung des genetischen Merkmals im untersuch ten Biomaterial ergibt. Dabei können andere Ausformungen des Merkmals zu anderen Moleku largewichten führen, so daß die massenspektrometrische Messung auch Auskunft über die Anwesenheit anderer Ausformungen des genetischen Merkmals geben kann.It is the basic idea of the invention to pass through the DNA strand with the genetic trait a biochemical processing of the biomaterial as part of the sample preparation for the Generation of a large number of molecules to be used which detec mass spectrometry well are animal, and the known shape of the feature, the presence of which is established should be used to form a characteristic molecular weight of these molecules use so that the mass spectrometric measurement of the molecular weight the information about the presence of this particular form of the genetic trait in the study results in biomaterial. In this case, other forms of the feature can form other molecules lead weights, so that the mass spectrometric measurement also provides information about the Presence of other forms of the genetic trait.

Einfacher ausgedrückt soll ein gesuchtes genetisches Merkmal auf biochemischem Wege in eine Vielzahl massenspektrometrisch detektierbarer Analytmoleküle eines bestimmten Moleku largewichts transformiert werden und die massenspektrometrische Analyse soll Auskunft über die Anwesenheit des Merkmals geben.To put it simply, a sought-after genetic trait is to be found in biochemically a large number of analyte molecules of a particular molecule that can be detected by mass spectrometry Lar weight are transformed and the mass spectrometric analysis should provide information about give the presence of the feature.

Die einfachste Verwirklichung dieser Grundidee besteht darin, ein solches Teilstück der DNA-Kette mit dem genetischen Merkmal durch das an sich bekannte PCR-Verfahren aus der DNA-Kette heraus selektiv zu vervielfältigen und selbst als charakteristisches Analytmolekül zu ver wenden. Die PCR-Kopien dieses Teilstücks sollen also die Analytmoleküle bilden, deren Mo lekulargewicht bestimmt werden soll.The simplest realization of this basic idea is such a section of the DNA chain with the genetic characteristic by the PCR method known per se from the To selectively reproduce the DNA chain and to reproduce it as a characteristic analyte molecule turn. The PCR copies of this section should therefore form the analyte molecules whose mo molecular weight should be determined.

Mutationen eines genetischen Merkmals können Veränderungen eines einzigen Nucleotids an einer Stelle in der DNA-Kette sein, in der Regel ein Ersatz des Nucleotids durch ein anderes. Man spricht dann von Punktmutationen. Es findet dabei bereits eine Änderung des Molekular gewichts dieser DNA-Kette statt, die allerdings nur wenige atomare Masseneinheiten beträgt, und bei großen Absolutmassen schwer zu messen ist.Mutations in a genetic trait can indicate changes in a single nucleotide one place in the DNA chain, usually a replacement of the nucleotide with another. One then speaks of point mutations. There is already a change in the molecular weight of this DNA chain, which is only a few atomic mass units, and is difficult to measure with large absolute masses.

Anscheinend häufiger sind aber Mutationen, die durch Einfügen oder Weglassen einiger Nucleotide zustandekommen. Diese Mutationen zeichnen sich durch weit kräftigere Änderun gen des Molekulargewichts der DNA-Kette aus. Wird aus einer DNA-Kette ein Teilstück der Länge von 100 Nucleotiden herausgeschnitten und vervielfacht, so ändert das Einfügen je eines Nucleotids das Molekulargewicht des Teilstücks bereits um etwa ein Prozent. Änderungen dieser Größenordnung sind leicht massenspektrometrisch zu messen.Apparently more common are mutations caused by the insertion or omission of some Nucleotides. These mutations are characterized by far stronger changes against the molecular weight of the DNA chain. If a section of the DNA chain becomes Cut out the length of 100 nucleotides and multiplied, so the insertion changes one Nucleotide the molecular weight of the section by about one percent. Changes this size can easily be measured by mass spectrometry.

Die schwerer direkt meßbaren Punktmutationen lassen sich durch biochemische Mittel, bei spielsweise durch Hybridisierung mit anschließendem enzymatischen Zerschneiden gezielt in zwei DNA-Teilstücke zerlegen, und damit wieder in Analytmoleküle umwandeln, deren cha rakteristisches Molekulargewicht leicht zu messen ist. The more difficult directly measurable point mutations can be solved by biochemical means for example by hybridization with subsequent enzymatic cutting into disassemble two pieces of DNA, thereby converting them back into analyte molecules whose cha characteristic molecular weight is easy to measure.

Es ist nun eine weitere Ausformung der Erfindung, das bekannte Verfahren der matrixunter stützten Laserdesorption (MALDI) für die Ionisierung der Analytmoleküle zu verwenden und in einem geeigneten Massenspektrometer einzusetzen. Besonders vorteilhaft können hier Flug zeit-Massenspektrometer verwendet werden. Dieses Verfahren ist aber auch für alle Arten von speichernden Massenspektrometern, wie Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen oder Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometer geeignet.It is now a further embodiment of the invention, the known method of matrix sub supported laser desorption (MALDI) for the ionization of the analyte molecules and use in a suitable mass spectrometer. Flight can be particularly advantageous here time mass spectrometer can be used. This method is also for all types of storing mass spectrometers, such as high-frequency quadrupole ion traps or Ion cyclotron resonance spectrometer suitable.

Nun ist aber bekannt, daß sich die DNA-Teilstücke selbst für das MALDI-Verfahren sehr schlecht eignen. Die DNA ist in der sauren Umgebung der normalerweise angewandten Ma trixsubstanzen nicht stabil. Sie läßt sich wegen seiner großen Anzahl an negativen Ladungen sehr schlecht positiv laden, aber auch MALDI mit Nachweis der negativ geladenen Ionen bringt keine guten Resultate.However, it is now known that the DNA sections are very suitable for the MALDI process badly suited. The DNA is in the acidic environment of the normally used Ma trix substances not stable. You can because of its large number of negative charges very bad positive charge, but also MALDI with detection of the negatively charged ions does not bring good results.

Es ist daher eine weitere Verfeinerung der Erfindung, durch ein an sich für die Verbesserung des MALDI-Verfahrens bereits bekanntes Verfahren die DNA-Teilstücke durch die Einführung von Thio-Gruppen an der Phosphorsäure des Rückgrats und durch Alkylierung so zu stabilisie ren, daß ein positiv ladendes MALDI möglich wird. Eine weitere Verbesserung kann durch das ebenfalls bereits bekannte Verfahren des Anhängens einer Gruppe mit einer positiven Ladung, beispielsweise durch eine quaternäre Ammonium-Gruppe, erreicht werden. Wenn diese Reak tionen nahezu mit 100% Ausbeute durchgeführt werden, geht die Information über die Mutan te des genetischen Merkmals bei diesen Umwandlungen nicht verloren.It is therefore a further refinement of the invention, by itself for the improvement of the MALDI method already known method by introducing the DNA sections stabilization of thio groups on the phosphoric acid of the backbone and by alkylation ren that a positively charging MALDI is possible. A further improvement can be made through the also known methods of attaching a group with a positive charge, for example by a quaternary ammonium group. If this reak ions are carried out with almost 100% yield, the information about the mutan te of the genetic trait is not lost in these conversions.

Die Probenvorbereitung, die nach diesem Verfahren für die Feststellung verschiedener geneti scher Merkmale in einem Material notwendig ist, ist bis auf die Zugabe der speziellen Primer zur Definition des genetischen Merkmals für alle Proben des Materials völlig identisch. Sie läßt sich daher in geeigneten Systemen zur massiv-parallelen Vorbereitung von vielen Proben eines Biomaterials einsetzen. Es ist daher eine weitere Idee der Erfindung, eine solche massiv parallele Verarbeitung einzusetzen.The sample preparation, which is carried out according to this procedure for the determination of various geneti features in a material is necessary except for the addition of special primers completely identical for the definition of the genetic trait for all samples of the material. She leaves therefore in suitable systems for the massive parallel preparation of many samples one Use biomaterials. It is therefore another idea of the invention, such a massive one use parallel processing.

In der Praxis kommen immer wieder gleiche Fragestellungen nach einem festgelegten Bündel von genetischen Merkmalen vor. Das kann beispielsweise die Frage nach dem Vorkommen von einer Reihe von Viren oder Bakterien in einem Biomaterial betreffen, oder auch die Frage nach einer Reihe von krankheitsbegünstigenden Merkmalsfaktoren in menschlichem Blut. Es ist da her eine weitere Idee der Erfindung, ein System von Reaktoren zu benutzen, in dem die einzel nen Reaktoren bereits mit den für die Feststellung der Einzelmerkmale speziell gebrauchten Biochemikalien versehen sind. Im einfachsten Fall können das die Primer sein. Aber es ist auch möglich, die Polymerase und die zur Vervielfältigung notwendigen Nucleotide vorpräpariert in den Gefäßen zu haben. Es brauchen dann nur kleine Probenmengen des Biomaterials zugege ben werden. Alle Reaktoren werden dann synchron und parallel den Schritten der Probenvor bereitung unterworfen. Diese Schritte können zweckmäßigerweise in Automaten ablaufen.In practice, the same questions come up again and again according to a set bundle of genetic traits. For example, the question of the occurrence of a range of viruses or bacteria in a biomaterial, or even the question of a number of disease-promoting characteristic factors in human blood. It is there forth another idea of the invention to use a system of reactors in which the individual already reactors with those specially used for the determination of the individual features Biochemicals are provided. In the simplest case, these can be the primers. But it is also possible to prepare the polymerase and the nucleotides necessary for duplication in to have the vessels. Then only small sample amounts of the biomaterial are needed be. All reactors are then synchronized and parallel to the steps of the samples preparation subjected. These steps can expediently take place in automatic machines.

Particularly favorable embodiments

Zur Schilderung einer günstigsten Ausführung werde angenommen, daß zur Feststellung der Anlage eines Patienten in bezug auf bestimmte Krankheiten die Anwesenheit von 380 festge legter, krankheitsfördernden Mutanten in menschlichem Blut abzufragen seien. Die Erfindung soll allerdings nicht auf diesen Fall beschränkt sein, der Fachmann kann diese Fragestellung leicht auf andere komplexe Fragestellungen übertragen.To describe a most favorable version, it is assumed that to determine the Plant a patient with respect to certain diseases the presence of 380 fixed legter, disease-promoting mutants in human blood. The invention However, should not be limited to this case, the expert can answer this question easily transferred to other complex questions.

Die zugehörigen 380 Paare von Primern für diese Fragestellung sind bereits in 380 von den insgesamt 384 Einzelgefäßen von normalen, vorpräparierten Mikrotiterplatten enthalten. Die mit geeigneter Wandadsorptivität hergestellten Mikrotiterplatten wurden in Automaten mit geringen Lösungsmengen dieser Primer befüllt und die Lösungsmengen wurden in einer Vaku umkammer durch Evakuieren eingetrocknet. Die Primer werden dabei von den Wänden der Einzelgefäße adsorbiert, sie sind in diesem getrockneten Zustand über lange Zeit haltbar. In die restlichen vier Einzelgefäßen, zweckmäßigerweise in den vier Ecken der Mikrotiterplatte, kön nen später geeignete Kalibriersubstanzen für die massenspektrometrische Messung der genauen Probenpositionen auf der Probenträgerplatte eingebracht werden. Diese Kalibriersubstanzen können aber auch Kontrollproben für das PCR- und Probenvorbereitungsverfahren anhand bekannter DNA-Teilstücke sein, in diesem Fall sind auch hier schon die Primer vorhanden.The associated 380 pairs of primers for this question are already in 380 of the contains a total of 384 individual tubes from normal, prepared microtiter plates. The Microtiter plates produced with a suitable wall adsorptivity were used in automata small amounts of solution of these primers were filled and the amounts of solution were in a vacuum chamber dried by evacuation. The primers are thereby from the walls of the Individual vessels are adsorbed; they can be stored for a long time in this dried state. In the remaining four individual vessels, conveniently in the four corners of the microtiter plate, can later suitable calibration substances for the mass spectrometric measurement of the exact Sample positions are introduced on the sample carrier plate. These calibration substances can also use control samples for the PCR and sample preparation procedure known DNA sections, in this case the primers are already present.

Im Analysenlaboratorium werden nun die 380 (oder 384) Einzelgefäße der vorpräparierten Mikrotiterplatte in einem Pipettierautomaten mit gleichen Suspensionsmengen des Bluts ge füllt, wobei die Blutzellen in bekannter Weise so lysiert worden sind, daß die DNA frei gelöst ist. Die Suspension ist so verdünnt, daß sich die Substanzen aus etwa 10 bis hundert Blutzellen in jedem Einzelgefäß befinden. Zugegeben wird auch zu allen Reaktionsgefäßen eine gleiche Lösung mit freien Nucleotiden und einer geeigneten Polymerase für den PCR-Prozess. Es wurden aus Bakterien, die in vulkanischen Quellen leben, besondere taq-Polymerasen gewon nen, die bei hohen Temperaturen optimal arbeiten. Diese, besonders aber auch genetisch ver besserte, Polymerasen sind kommerziell erhältlich.In the analysis laboratory, the 380 (or 384) individual tubes of the pre-prepared are now Microtiter plate in an automatic pipetting machine with equal amounts of blood fills, the blood cells have been lysed in a known manner so that the DNA is freely dissolved is. The suspension is diluted so that the substances are made up of about 10 to 100 blood cells in each individual container. The same is also added to all reaction vessels Solution with free nucleotides and a suitable polymerase for the PCR process. It special taq polymerases were obtained from bacteria living in volcanic sources that work optimally at high temperatures. These, but especially genetically ver better, polymerases are commercially available.

Durch Erhitzung auf 94°C wird dann die DNA dissoziiert, nach Abkühlung auf 40°C mit einem Primer des Primerpaares hybridisiert, und bei 73°C durch die Polymerase vom Primer ausge hend unter Benutzung der freien Nucleotide wieder zu einem Doppelstrang zusammengebaut Der Primer bestimmt dabei auch die Richtung, in der polymerisiert wird. Der Primer ist so kon struiert, daß nur in Richtung des genetischen Merkmals polymerisiert wird. Die DNA in der anderen Richtung wird nicht dupliziert. Durch zyklisches Durchfahren dieses Temperaturpro gramms, bei dem in statistisch zufälliger Folge jeweils einer der beiden Primer benutzt wird, wird durch fortgesetzte Duplizierung erreicht, daß nur noch der DNA-Strang zwischen den beiden Primern dupliziert wird, da jeweils diejenigen Teile der DNA, die außerhalb des Teil stücks mit dem genetischen Merkmal liegen, abgeschnitten werden.The DNA is then dissociated by heating to 94 ° C, after cooling to 40 ° C with a Primer of the primer pair hybridized, and at 73 ° C by the polymerase from the primer reassembled into a double strand using the free nucleotides The primer also determines the direction in which the polymerisation takes place. The primer is so con strukt that polymerized only in the direction of the genetic trait. The DNA in the other direction is not duplicated. By cycling through this temperature pro gramms, in which one of the two primers is used in randomly random order, is achieved by continued duplication that only the DNA strand between the Both primers are duplicated, since those parts of the DNA that are outside the part pieces with the genetic trait are cut off.

Der Temperaturzyklus kann mit gegenwärtig benutzten, speziell dazu hergestellten Mikrotiter platten in etwa 6 Minuten durchfahren werden. Nach drei Stunden sind etwa 30 Zyklen absol viert, mit einer Vermilliardenfachung der Kopien. Da sich in den einzelnen Gefäßen der Mi krotiterplatte jeweils 10 bis hundert Blutzellen befanden, sind jetzt etwa 16 bis 160 Femtomol an Kopien vorhanden.The temperature cycle can be with currently used, specially made microtiter plates can be driven through in about 6 minutes. After three hours, about 30 cycles are absolute fourth, with a billionfold increase in copies. Since the individual vessels of the Mi 10 to 100 blood cells were now around 16 to 160 femtomoles copies available.

Diese DNA-Kopien enthalten alle einseitig einen der beiden Primer. Durch geeignete Modifi kation, beispielsweise mit Biotin, lassen sich die DNA-Kopien über das Biotin mit Affinitätsli ganden wie Avidin an den Wänden der Reaktorgefäße fixieren. Die DNA-Kopien können dann sehr einfach von allen anderen Substanzen, die sich im Reaktorgefäß befinden, durch Waschen mit leicht saurem Wasser (bespielsweise durch Zugabe von 3% Trifluoressigsäure angesäuert) befreit werden. Die DNA-Kopien können dann (in manchen Fällen auch besser vor dem Wa schen) stabilisiert werden. Das kann in an sich bekannter Weise durch gezielten Ersatz einer OH-Gruppe an der Phosphorsäure durch eine Thio-Gruppe, und durch Alkylierung der basen ständigen OH-Gruppen geschehen. Nach weiteren Reinigungsvorgängen wird die Fixierung an der Gefäßwand aufgetrennt, und ein Ende des stabilisierten DNA-Strangs wird in an sich be kannter Weise mit einer Gruppe versehen, die eine positive Ladung trägt, beispielsweise durch Anhängen einer quaternären Ammoniumgruppe.These DNA copies all contain one side of one of the two primers. Through suitable modifi cation, for example with biotin, the DNA copies can be made via the biotin with affinity li like avidin on the walls of the reactor vessels. The DNA copies can then very simply by washing all other substances in the reactor vessel with slightly acidic water (acidified, for example, by adding 3% trifluoroacetic acid) be freed. The DNA copies can then (in some cases even better before the wa be stabilized. This can be done in a manner known per se by targeted replacement of a OH group on the phosphoric acid by a thio group, and by alkylation of the bases permanent OH groups happen. After further cleaning processes, the fixation is on the vessel wall is separated, and one end of the stabilized DNA strand is in itself be known with a group carrying a positive charge, for example by Attach a quaternary ammonium group.

In den vier Eckgefäßen der Mikrotiterplatte werden jetzt Lösungen mit der Kalibriersubstanz zugegeben, falls nicht schon als PCR-Kontrollsubstanz vorhanden.Solutions with the calibration substance are now in the four corner vessels of the microtiter plate added if not already present as a PCR control substance.

Die so in den einzelnen Reaktionsgefäßen gelösten stabilisierten und veränderten DNA-Kopien bilden nun die Analytmoleküle. Teilmengen der Analytmoleküle können nun, einschließlich der vier Kalibriersubstanzen, mit einer Vielfachpipette aus der Mikrotiterplatte entnommen und auf einen vorpräparierten MALDI-Probenträger aufgebracht werden. Dabei können die Analytmo leküle durch einen elektrophoretischen Prozeß zur Pipettenspitze hin angereichert werden. Der MALDI-Probenträger kann auch schon durch seine Vorpräparation eine Substanz enthalten, deren Molekulargewicht genau bekannt ist. Diese Substanz kann als Referenz für die Bestim mung des genauen Molekulargewichts diesen.The stabilized and modified DNA copies dissolved in the individual reaction vessels now form the analyte molecules. Subsets of the analyte molecules can now, including the Four calibration substances, removed from the microtiter plate with a multiple pipette and put on a prepared MALDI sample carrier can be applied. The Analytmo leküle be enriched by an electrophoretic process to the pipette tip. Of the MALDI sample carriers can already contain a substance through their preparation, whose molecular weight is known exactly. This substance can be used as a reference for the determination the exact molecular weight of these.

Die MALDI-Probenträger werden dann in an sich bekannter Weise der Ionenquelle des Mas senspektrometers zugeführt, und die einzelnen Probenaufträge werden dort in ebenfalls be kannter Weise automatisch auf die Molekulargewichte der Analytsubstanzen hin untersucht
Dieses Verfahren kann dabei in verschiedener Weise modifiziert werden. So ist es möglich, die Phosphorsäure-Modofizierung mit einer Thiogruppe in einem frühen Schritt vor der massen weisen Vervielfältigung vorzunehmen, und eine Polymerase zu benutzen, die die veränderte DNA vervielfältigt. Es können auch bereits alkylierte Nucleotide verwendet werden.The MALDI sample carriers are then fed to the ion source of the mass spectrometer in a manner known per se, and the individual sample orders are automatically examined there in a known manner for the molecular weights of the analyte substances
This method can be modified in various ways. It is thus possible to carry out the phosphoric acid modification with a thio group in an early step before the mass-wise reproduction, and to use a polymerase which reproduces the modified DNA. Already alkylated nucleotides can also be used.

Es ist aber auch möglich, die DNA-Kopien gar nicht selbst in die Analytmoleküle einzubauen, sondern sie nur dazu zu benutzen, andere Moleküle charakteristischen Molekulargewichts zu bilden, beispielsweise durch Hybridisierung mit Abspaltung des charakteristischen Analytmole küls.However, it is also possible not to insert the DNA copies into the analyte molecules at all, but only to use it to add other molecules of characteristic molecular weight form, for example by hybridization with elimination of the characteristic analyte mole cool.

Claims

1. A method for the biochemical preparation of biomaterial samples for mass spectrometric analysis to determine the presence of certain genetic features, characterized in that the presence of a sought genetic feature in the biomaterial by the bio-chemical sample preparation leads to the generation of analyte molecules characterizing molecular weight and that a sufficient number of these analyte molecules for mass spectrometric analysis.

2. The method according to claim 1, characterized in that the sample preparation includes selective enzymatic amplification of a portion of DNA that contains the genetic Feature contains.

3. The method according to claim 2, characterized in that the enzymatically produced Copies of the DNA section itself in unchanged or modified form Form a realistic analyte molecule to identify the genetic trait.

4. The method according to claim 3, characterized in that the enzymatically produced Copies of the DNA sections by stabilizing their backbone, by stabilizing the Bases, and / or by adding a specific chemical group the.

5. The method according to claim 4, characterized in that the attached specific chemical group carries an electrical charge and thus to a simpler ionization tion of the analyte molecule contributes.

6. The method according to claim 4, characterized in that the specific chemical Group fixation of the analyte molecule on a prepared solid surface enables, the fixation can be used especially for cleaning the analyte molecules.

7. The method according to claim 4, characterized in that the specific chemical Group enables a split, which among other things can also dissolve a fixation.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the Sample preparation for many biomaterial samples simultaneously in one device with one Variety of reaction vessels is made.

9. The method according to claim 8, characterized in that the device with the lot Number of reaction vessels already for the task of analysis for predetermined sentences of features is prepared and at least that for selective reproduction the DNA sections required selective biochemicals ("primers") in the reaction area barrels are present.

10. The method according to any one of claims 8 or 9, characterized in that the Vorrich device with the large number of reaction vessels is a microtiter plate.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the mass spectrometric analysis of the molecular weight of the analyte molecules using the Ionization is carried out by matrix-assisted laser desorption.

12. The method according to claim 11, characterized in that the mass spectrometric Analysis is done in a time of flight mass spectrometer.

13. The method according to any one of claims 8 to 12, characterized in that the analyte Transfer molecules from the reaction vessels to a sample support plate at the same time will.

14. The method according to claim 13, characterized in that the transmission with a Multiple pipette done automatically.