DE19717085A1 - Verfahren und Geräte für extrem schnelle DNA-Vervielfachung durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) - Google Patents
Verfahren und Geräte für extrem schnelle DNA-Vervielfachung durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)Info
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Description
Die Erfindung betrifft Verfahren und Geräte zur schnellen, selektiven Vervielfältigung von
Desoxy-Ribo-Nukleinsäure (desoxy-ribo nucleic acid, DNA) aus Biomaterial durch die bekann
te, in einzelnen Verdopplungszyklen arbeitende Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain
reaction, PCR).
Die Erfindung besteht darin, extrem kurze Zykluszeiten von nur wenigen Sekunden für die
PCR dadurch zu erzeugen, daß einerseits die Reaktionsgefäße für die Aufnahme der Reaktions
lösung aus einem Muster feiner Kapillaren in enger Nachbarschaft zu Heiz- und Kühlelementen
aufgebaut sind, um in der Reaktionslösung die Temperatureinstellung für die drei Temperatur
phasen der Verdopplungszyklen der PCR optimal zu beschleunigen, und daß andererseits die
Strömungsgeschwindigkeit in den Kapillaren während der Amplifikationsphase gering gehalten
wird, um die Polymerase-Reaktion nicht zu stören. Das Kapillarmuster läßt sich in einfacher
Weise mikrosystemtechnisch herstellen.
Für die medizinische Versorgung von Patienten wird es immer wichtiger, sehr schnell arbeiten
de gentechnische Analysenverfahren bereitzustellen. Ein Beispiel dafür ist die Identifizierung
infektiöser Mikroorganismen, die heute noch Tage in Anspruch nimmt, aber eigentlich eine
Behandlung in möglichst frühem Stadium, möglichst in den ersten Stunden, erfordert. Noch
schärfer wird die Forderung nach schneller Analyse bei Untersuchungen an möglicherweise
krebs- oder andersartig befallenem Gewebe während der Operation am offenen Patienten durch
onkogenetische, virologische oder bakteriologische Analysen. Hier wird eine maximale Analy
sedauer von etwa zehn Minuten gefordert.
Die Massenspektrometrie liefert heute sehr schnelle, hochempfindliche Analysenverfahren für
amplifizierte DNA. Fortschritte der matrixunterstützten Laserdesorption und Ionisierung
(MALDI) lassen es möglich werden, eine Analyse von etwa 20 Proben einschließlich der
MALDI-Präparation, der Einschleusung der DNA-Proben in das Massenspektrometer, der
MALDI-Analyse und der Datenauswertung bis zur Darstellung auf dem Bildschirm in weniger
als drei Minuten durchzuführen. Lysieren der Gewebszellen und Extraktion der DNA läßt sich
in weniger als zwei Minuten durchführen.
Diesen maximal fünf Minuten insgesamt für Probenvorbereitung und massenspektrometrischer
Analyse stehen Zeiten von drei Stunden für die klassische PCR-Vervielfältigung gegenüber.
Starke Verkürzungen dieser Zeiten sind allerdings in Sicht. In einem inzwischen kommerziell
erhältlichen Gerät konnte diese Zeit bereits auf etwa 20 Minuten reduziert werden. In einer
neuesten Veröffentlichung (A. T. Woolley et al., "Functional Integration of PCR Amplification
and Capillary Electrophoresis in a Microfabricated DNA Analysis Device", Anal. Chem. 68,
4081, Dezember 1996) wurden 20 Mikroliter der Reaktionslösung mit DNA in nur 15 Minuten
in einem Miniaturgefäß aus Polypropylen in 30 Zyklen amplifiziert. Selbst diese Zeit ist jedoch
für eine Schnellanalyse im obigen Sinn zu lang. Es muß das Ziel sein, die PCR-Amplifikation in
nur zwei bis drei Minuten durchführen zu können.
Die DNA besteht bekanntlich aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechselnden
Nukleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilden. Die Nukleotide bestehen jeweils
aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe und einer Base. Je zwei Basen sind
zueinander komplementär. Zucker und Phosphorsäure bilden die fortlaufende Kette der DNA
(oder das sogenannte Rückgrat), die vier charakteristischen Basen sind jeweils seitliche Ab
zweigungen, sie sind an der Phosphorsäuregruppe befestigt. Die beiden komplementären Ket
ten oder Einzelstränge der DNA sind in Form einer Doppelhelix umeinandergewendelt, wobei
jeweils zwei komplementäre Nukleotide über Wasserstoffbrücken zwischen den Basen mitein
ander verbunden sind und so einen sogenannten Doppelstrang bilden.
Grundlage vieler gentechnischer Analyseverfahren ist die selektiv arbeitende PCR ("polymerase
chain reaction"), eine einfache Vervielfältigungsmethode für gezielt aussuchbare DNA-Stücke
im Reagenzglas, die erst 1983 von K. B. Mullis (dafür Nobelpreis 1993) entwickelt wurde und
nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen einen beispiellosen Siegeszug durch die
gentechnischen Laboratorien angetreten hat.
PCR ist die gezielte Vervielfältigung eines präzise aus dem Genom ausgesuchten relativ kurzen
Segments der zweisträngigen DNA in einfachen Temperaturzyklen. Die Auswahl des DNA-
Segments erfolgt durch ein sogenanntes Paar von Primern, zweier DNA-Stücke mit je etwa 20
Basen Länge, die (etwas verkürzt und vereinfacht beschrieben) die beiderseitigen Enden des
ausgesuchten DNA-Segments codieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch ein Enzym namens
Polymerase, das eine chemische Fabrik in einem Molekül darstellt. Die PCR-Reaktion läuft in
wäßriger Lösung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs-DNA und genügende Mengen an
Polymerase, Primern, Triphosphaten der vier Nukleinsäuren (sogenannte "Substrate"), Aktiva
toren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem Temperaturzyklus wird zunächst die Dop
pelhelix der DNA bei etwa 95°C "aufgeschmolzen", wobei die beiden Stränge voneinander
getrennt werden. Bei etwa 45°C werden dann die Primer an eine genau passend komplementä
re Nukleotidfolge der DNA-Einzelstränge angelagert ("Hybridisierung"). Bei 72°C wird die
Doppelhelix durch den Anbau der komplementären Nukleotide an ein Wachstumsende der
Primer durch eine besonders temperaturfeste Polymerase (taq-Polymerase) wieder zu einer
neuen Doppelhelix vervollständigt. Dadurch wird das ausgewählte DNA-Segment zwischen
den Primern im Prinzip verdoppelt. In 30 Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang
der DNA als Ausgangsmaterial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt, deren beide Enden
mit den Primern identisch sind. (In strenger Beschreibung hybridisieren die beiden Primer auf
den beiden verschiedenen Strängen der DNA und die Verkürzung auf das DNA-Segment zwi
schen den Primern tritt erst statistisch bei weiterem Vervielfachen auf).
Die Zeitdauer für einen Temperaturzyklus hängt praktisch nur von der Aufheiz- und Abkühl
geschwindigkeit ab, die wiederum vom Flüssigkeitsvolumen, von den Gefäßdimesionen und von
der Wärmeleitfähigkeit der Gefäßwände und der Reaktionslösung abhängt. Auf jeder Tempera
turstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden vonnöten, teilweise sogar weniger.
In der oben zitierten Arbeit von Woolley et al., in der die PCR-Amplifikation für 30 Zyklen nur
15 Minuten dauerte, wurden beispielsweise folgende Zeiten für die Arbeit in den drei Tempera
turstufen benötigt: 2 Sekunden bei 96°C für das Schmelzen, 5 Sekunden bei 55°C für die Pri
merarlagerung und 2 Sekunden bei 72°C für den Wiederaufbau. Die restliche Zeit von 21 Se
kunden pro Zyklus wurde für die Temperaturübergänge gebraucht.
Das Schmelzen der DNA erfolgt bei einer Temperatur, die um einige Grade oberhalb der
"Schmelztemperatur" liegt, praktisch momentan. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine hal
be Sekunde Erhitzung auf diese Temperatur für eine vollständige Trennung aller Doppelhelix-
Strukturen genügt. Die genaue Einhaltung der Temperatur ist hierfür nicht einmal besonders
kritisch, solange man nur oberhalb der Schmelztemperatur, aber unterhalb einer Gerinnungs
temperatur bleibt.
Die Hybridisierung braucht ebenfalls nicht lange, wenn die Primer in genügender Konzentrati
on vorhanden sind. Bei optimaler Konzentration sind etwa ein bis zwei Sekunden ausreichend.
Für die Hybridisierung ist die Temperatur noch weniger kritisch, sie sollte nur unter 50°C lie
gen, um genügend rasch abzulaufen. Optimale Bedingungen liegen bei etwa 45°C vor.
Die Vervollständigung der angelagerten Primer zu einem komplementären DNA-Molekül
durch die Polymerase, im folgenden "Wiederaufbau" genannt, hat eine hohe Geschwindigkeit.
Pro Sekunde können unter optimalen Temperatur- und Konzentrationsbedingungen 500 bis
1000 Basen durch die Polymerase angebaut werden. Da im allgemeinen nur DNA-Segmente
von maximal 400 Basen Länge für die Analysen benötigt werden, reichen zwei Sekunden gut
für diese Wiederaufbauphase aus. Für diesen Vorgang des Wiederaufbaus einer neuen Doppel
helix ist die gute Einhaltung der optimalen Temperatur erforderlich, um die hohe Geschwin
digkeit des Wiederaufbaus zu erzielen.
Theoretisch könnte somit ein Zyklus der PCR-Reaktion in weniger als fünf Sekunden abge
schlossen sein, unter der Voraussetzung, die Wärme bis zu jeweils ausreichenden Tempera
turgleichgewichten in jeweils etwa ¼ Sekunde zu- oder abzuführen zu können. Ein solch idea
ler Temperaturverlauf für einen PCR-Zyklus ist in Fig. 1 gezeigt. Die Wärme-Zu- und Abfuhr
sind dabei die kritisch zeitbestimmenden Größen.
Durch die Zugabe nur eines Primerpaares lassen sich uniforme DNA-Segmente vervielfachen.
Werden jedoch gleichzeitig mehrere verschiedenartige Primerpaare zugegeben, so werden auch
gleichzeitig mehrere DNA-Segmente vervielfaltigt ("multiplexed PCR").
Diese Art der Multiplex-PCR wird häufig angewandt und hat oft besondere Vorteile. Für das
sogenannte "Fingerprinting" zur Identifizierung von Individuen durch DNA-Segmente variabler
Länge (Methoden der "VNTR = Variable Number of Tandem Repeats" oder "AMP-FLP
= Amplified Fragment Length Polymorphism") macht es die Analysen schneller. Dabei kann
durch die Wahl der Primer, die das mittlere Molekulargewicht der DNA-Segmente bestimmen,
erreicht werden, daß die Variationen der Molekulargewichte der durch die verschiedenen Pri
merpaare gebildeten DNA-Segmente sich nicht oder nur selten überlappen. Diese Art der Mul
tiplex-PCR bedingt einen Analysator, der zur gleichzeitigen Messung eines großen Bereichs
der Molekulargewichte fähig ist. Besondere Vorteile hat das Verfahren zur Identifizierung von
infektiösen Lebewesen, da beispielsweise gleichzeitig 20 Bakteriensorten (oder Viren, Hefen,
Pilze) mit einer einzigen PCR-Vervielfältigung nachgewiesen werden können.
Die hohe Empfindlichkeit moderner Meßmethoden für die Analyse der DNA, beispielsweise
die Empfindlichkeit der oben erwähnten massenspektrometrischen Messungen, läßt es zu, das
Volumen der Reaktionslösung unter Beibehaltung der optimalen Konzentration zu verkleinern.
Da dann einerseits bei gleicher Ausgangsmenge an DNA eine Erschöpfung der Reaktionslö
sung nach weniger Zyklen eintritt, andererseits aber auch nicht so viel amplifiziertes DNA-
Material für die Analyse gebraucht wird, kann die Zahl der Zyklen von normalerweise 30 auf
etwa 24 bis 28 verringert werden. Die Zeitersparnis ist dadurch jedoch gering. Die mögliche
Verkleinerung der Volumina legt eine mikrosystemtechnische Lösung für ein neues PCR-
Amplifizierungsverfahren nahe, wie es auch schon in der obig zitierten Arbeit von Woolley et
al. angewandt wurde.
Auch in dem Review-Artikel "Microfabrication Technologies for Integrated Nucleic Acid
Analysis", D. T. Burke, M. A. Burns und C. Mastrangelo, Genome Research 7, 189 (1997),
werden mikrosystemtechnisch hergestellte Kammern für die PCR-Amplifikation vorgestellt,
ohne jedoch Angaben über die erreichbaren Geschwindigkeiten zu machen. Solche Kammern,
hier 1000 × 1000 × 250 Mikrometer groß und aus einem Niedertemperaturpolymer gefertigt,
haben jedoch den Nachteil, daß sie sich nur durch längeres Spülen mit einer Waschflüssigkeit
leeren lassen und so beim Entleeren eine Verdünnung der amplifizierten DNA erzwingen.
Ein ebenfalls naheliegender Gedanke ist es, die Reaktionslösung konstant durch eine feine
Kapillare laufen zu lassen, die für jeden Zyklus in einfacher Weise drei stationär auf entspre
chenden Temperaturen gehaltene Zonen auf einem Mikrosystemchip durchquert, wobei also
die übliche Zeitvariation der Temperatur durch eine einfache Ortsvariation der Temperatur
ersetzt wird. Ein Ausschnitt einer solchen Anordnung ist in Fig. 3 gezeigt. Eine geringe Di
mension der Kapillare soll dabei eine schnelle Temperaturänderung bis zum Temperaturgleich
gewicht ermöglichen.
Leider behindert der Fluß in einer Kapillare die Arbeit der Polymerase in der Wiederaufbau
phase. In einer zylindrischen Kapillare herrscht im wesentlichen eine laminare Strömung mit
einem parabolischen Geschwindigkeitsprofil, wobei in der Mittelachse der Kapillare die doppel
te mittlere Geschwindigkeit, am Rande der Kapillare die Geschwindigkeit Null herrscht. In einer
Kapillare mit quadratischem oder rechteckigem Querschnitt herrschen etwas andere Verhält
nisse, jedoch sind die Unterschiede hier nicht entscheidend. Die fließende Reaktionslösung ist
also in Gleitschichten unterschiedlicher Geschwindigkeit aufgeteilt, benachbarte Moleküle in
verschiedenen Gleitschichten bewegen sich aneinander vorbei. Die einzelnen Moleküle unter
liegen Scherkräften. Längliche Moleküle werden parallel zur Flußrichtung ausgerichtet.
Bei einer realitätsnahen mittleren Geschwindigkeit von zwei Millimetern pro Sekunde in einer
Kapillare von 100 Mikrometer Durchmesser bewegen sich zwei etwa kugelförmige Moleküle,
die sich einander berührend auf beiden Seiten einer gedachten Gleitebene befinden, in einer
Millisekunde im Mittel um etwa 8% ihres Durchmessers aneinander vorbei. Eine Millisekunde
entspricht der minimalen Zeit für den Anbau einer Base. Moleküle in der Mitte der Flusses
sehen keine solche Verschiebung, Moleküle nahe an der Wand der Kapillare sehen eine größe
re Verschiebung. Damit ist aber die Arbeit der Polymerase, die ein ruhiges Nebeneinanderlie
gen der Moleküle im Maßstab einer Millisekunde erfordert, stark behindert. Es kommt zu ver
stärkten Fehlleistungen, bei stärkerer Verschiebebewegung sogar zu einem Ende der Polymera
searbeit.
Die Verschiebebewegung benachbarter Moleküle nimmt bei gleichem Fluß proportional zur
dritten Potenz des reziproken Durchmessers der Kapillare zu. Für die Durchfluß-PCR herrscht
also ein Dilemma: dünnere Kapillaren verbessern die Temperatureinstellung, verlängern jedoch
den Weg, zwingen daher zu einer höheren Durchflußgeschwindigkeit und hindern dabei die
Amplifikation.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Zykluszeit für die PCR-Amplifikation von DNA auf ex
trem kurze Zeiten von etwa vier bis sechs Sekunden, also die gesamte PCR-Amplifikation auf
die Dauer von zwei bis drei Minuten zu verkürzen. Wegen der außerordentlich hohen Emp
findlichkeit moderner Analysenmethoden für DNA (beispielsweise massenspektrometrischer
Messungen des Molekulargewichts der amplifizierten DNA-Segmente) kann das Volumen für
die Reaktionslösung auf ein Mikroliter oder sogar weit weniger beschränkt werden. Es liegt
nahe, für diese Verfahren mikrosystemtechnische Verfahren und Geräte zu verwenden.
Es ist der Grundgedanke der Erfindung, einerseits ein Muster sehr feiner Kapillaren in enger
Nachbarschaft zu Heiz- und Kühlelementen als Gefäßsystem für die Reaktionslösung zu ver
wenden, um die Aufheiz- und Abkühlzeiten der Reaktionslösung äußerst gering zu halten, an
dererseits aber die Fließgeschwindigkeit der Reaktionslösung in den Kapillaren während der
Phase des Wiederaufbaus des DNA-Doppelstrangs durch die Polymerase so gering wie mög
lich zu halten. Die Fließgeschwindigkeit während der Phase des Wiederaufbaus sollte das
zehnfache des dort herrschenden maximalen Kapillarendurchmessers pro Sekunde auf keinen
Fall überschreiten, günstiger ist eine mittlere Fließgeschwindigkeit, die pro Sekunde weniger
als fünf maximale Kapillarendurchmesser zurücklegt. Die Fehlerrate für den Wiederaufbau nä
hert sich erst unterhalb einer mittleren Fließgeschwindigkeit, die kleiner als der zweifache
Durchmesser pro Sekunde ist, ihrem Minimum. Der maximale Kapillarendurchmesser ent
spricht bei runden Kapillaren dem normalen Durchmesser, bei rechteckigen Querschnitten der
Diagonale.
Eine günstige, sehr feine Kapillarstruktur mit eng benachbarten Heizelementen läßt sich günstig
mit mikrosystemtechnischen Mitteln herstellen. Die geringe Fließgeschwindigkeit kann einer
seits (besonders bei konstantem Fluß der Reaktionslösung durch die Kapillarstruktur) durch
eine besondere Ausbildung des Kapillarnetzes vorgegeben werden, andererseits kann die gerin
ge Fließgeschwindigkeit aber auch durch besondere Betriebsweisen mit zeitlich veränderlichen
Flüssen der Reaktionslösung erzwungen werden.
Der Vorteil der feinen Kapillarstruktur liegt auf der Hand: es lassen sich die Zeitdauern der
thermischen Übergänge in der Reaktionslösung sehr kurz halten. Diesem Vorteil liegen aber
schwerwiegende Nachteile gegenüber: Die außerordentlich große Oberfläche des Gefäßsy
stems stört die biochemischen Abläufe, wenn die Oberfläche auch nur in geringster Weise stö
rend auf die beteiligten Moleküle einwirkt. So tötet beispielsweise eine nackte Siliziumoberflä
che sofort die Aktivität der Polymerase ab. Auch viele Kunststoffe haben sich als ungeeignet
für die PCR erwiesen. Selbst gleiche Kunststoffe verschiedener Hersteller, beispielsweise die
an sich günstigen Kunststoffe Polyethylen oder Polypropylen, haben sich von verschiedener
Qualität in bezug auf ihre Auswirkungen auf die PCR erwiesen. Es muß also die Oberfläche
sehr sorgfältig völlig inert gemacht werden.
Die Aktivität einer Oberfläche kann durch eine sorgfältige Beschichtung fast vollkommen be
seitigt werden. So sind aus der Chromatographie, besonders aus der Gaschromatographie, Be
schichtungsmethoden bekannt, die auch geringste Reste aktiver Oberflächen beseitigen. Insbe
sondere die Beschichtungen mit fadenförmigen Molekülen, die chemisch einseitig an die Ober
fläche gebunden sind ("chemically bonded phases"), haben thermisch stabile und außerordent
lich inerte Oberflächenbeschichtungen erzeugt. Dabei lassen sich auf Wunsch hydrophobe oder
hydrophile, polare oder unpolare, fett- oder wasseraufnehmende Oberflächenschichten erzeu
gen, die in der Tiefe der Schicht wiederum andere Eigenschaften haben können. Es ist daher
eine weitere Idee der Erfindung, die an sich bekannten chromatographischen Beschichtungen
für die Inaktivierung der Oberflächen zu verwenden. Besonders zur Beschichtung von Quarz
glas- und Glasoberflächen an der Innenseite dünner Kapillaren stehen ausführliche und umfang
reiche Rezepturen mit Beschreibungen der notwendigen Schritte zur Verfügung. Siliziumo
berflächen lassen sich durch Oxidation in Quarzoberflächen verwandeln.
Insbesondere für metallische Implantate werden stabile Beschichtungen entwickelt, die kör
pereigenen Proteinen und Glycoproteinen entsprechen, wie sie in Zellmembranen vorkommen.
Solche Beschichtungen können im vorliegenden Fall die Aktivitäten der Oberflächen auf die
Polymerasereaktionen mindern, selbst wenn sie als Implantatbeschichtungen noch nicht erfolg
reich sind.
Die mikrosystemtechnischen Herstellungsmethoden umfassen aber auch die Abformung von
Kunststoffen in mikrosystemtechnisch hergestellten Siliziumformen. Auch hiermit lassen sich
Kapillarsysteme entwickeln, die als Reaktionsgefäße benutzt werden können. Es ist also eine
weitere Idee der Erfindung, günstige Polymere wie Niederdruckpolyethylen oder Polypropylen
für die Herstellung der Kapillarsysteme zu verwenden. Da die Polymere normalerweise
schlechte Wärmeleiteigenschaften besitzen, können diese auch mit thermisch gut leitenden
Nanopulvern gefüllt werden, beispielsweise mit Silberpulver. Diese Pulver lassen sich mit Par
tikeldurchmessern von etwa 10 bis 1000 Nanometern herstellen, sie sind hervorragend geeig
net, die Wärmeleitfähigkeit von Kunststoffen zu erhöhen. Die Pulver können so eingelagert
werden, daß sie nicht direkt an der Oberfläche liegen.
Die erfindungsgemäß notwendig geringe Fließgeschwindigkeit kann in einem konstant durch
flossenem Kapillarsystem, wobei Zonen verschiedener Temperatur durchflossen werden, da
durch erreicht werden, daß in der Zone der Wiederaufbautemperatur der Fluß der Reaktionslö
sung in eine Vielzahl von parallelen Kapillaren verzweigt, womit die Fließgeschwindigkeit in
jeder dieser parallelen Kapillaren herabgesetzt wird, wie in Fig. 4 gezeigt.
Es kann die Reaktionslösung auch durch Druckpulse diskontinuierlich weiterbewegt werden.
Jeweils nach Füllung des Kapillarsystems für den Wiederaufbau des DNA-Doppelstranges, das
sich auf entsprechender Temperatur befindet, bleibt der Fluß der Reaktionslösung stehen, die
Aufbaureaktionen laufen ab, und erst dann (nach etwa 2 Sekunden) wird die Reaktionslösung
weitergepumpt. Dazu ist es vorteilhaft, die Volumina der Gefäßsysteme für Schmelzen, Anla
gerung, Wiederaufbau jeweils gleich groß zu halten, so daß die Reaktionslösung immer um
genau diese Volumengröße weitergepreßt wird. Es entsteht ein getakteter Ablauf, der aller
dings gleiche Aufenthaltszeiten der Reaktionslösung in den drei Temperaturzonen erzwingt.
Es ist jedoch insbesondere auch möglich, das System der Kapillaren so groß zu wählen, daß die
gesamte Menge der zu verarbeitenden Reaktionslösung darin aufgenommen werden kann, und
dann mit ruhender Lösung die Temperaturphasen durch schnelle Heiz- und Kühlelemente sehr
schnell zeitlich nacheinander zu durchfahren.
Dabei kann das Kapillarsystem, wie in Fig. 2a und 2b gezeigt, leicht in einer Ebene ange
ordnet werden. Diese ebene Fläche mit den Kapillaren ist in eine dünne Membran eingeschlos
sen, an deren Oberfläche sich die Heizelemente befinden, ebenfalls in einer flächigen Struktur.
So lassen sich beispielsweise 200 Nanoliter Reaktionslösung in 16 parallelen Kapillaren mit
Querschnitten von 60 × 100 Mikrometern und Längen von zwei Millimetern auf einer Fläche
von etwa 2 × 1,6 Millimetern unterbringen. Diese Kapillaren befinden sich in einer Silizium
membran von maximal 300 Mikrometer Dicke. Durch die dünne Membran und durch die Stege
zwischen den Kapillaren kann die Wärme besonders gut zu- oder abgeführt werden.
Auf der Ober- und Unterseite der Membran befinden sich flächig eindotierte oder sonst aufge
brachte Widerstandsgitter, die die Heizleistung übernehmen. Mit weniger als zwei Watt Heiz
leistung kann man die Temperatur einer solch dünnen Siliziummembran mit einer Fläche von
3 × 3 mm2 in einer Sekunde um etwa 100°C erhöhen, die Erhöhung von 45°C auf etwa 72°C
läßt sich somit in 0,3 Sekunden erreichen. Die Temperatur läßt sich in bekannter Weise über
den Wärmekoeffizienten aus dem Widerstand des Heizelementes selbst bestimmen. Eine Rege
lung der Heizleistung mit leichtem Überschießen führt zur schnellen Einstellung des Gleichge
wichts in der Reaktionslösung.
Die Membran kann über bewegliche Kühlglieder, die sich in flächigen Kontakt mit der Mem
bran bringen lassen, sehr schnell gekühlt werden. Diese Anordnung ist in Fig. 2b dargestellt.
Die Kühlglieder können sich im einfachsten Fall auf Raumtemperatur befinden, zur Beschleuni
gung auch auf tieferer Temperatur. Da die Temperatur für die Primeranlagerung nicht genau
eingestellt zu werden braucht, reicht eine einfache Zeitsteuerung für die Kontaktzeit aus. In
kritischeren Fällen kann die Widerstandsänderung der Heizelemente für eine Steuerung der
Kontaktdauer ausgenutzt werden. Die beispielsweise elektromechanisch oder pneumatisch
bewegten Kühlglieder können Teil der mikrosystemtechnischen Anordnung sein, sie können
aber auch durch externe Bewegungseinrichtungen an die Membran herangeführt werden.
Fig. 1 zeigt einen Zyklus eines optimalen, bisher ohne diese Erfindung nicht erreichten Tem
peraturprofils für die schnelle DNA-Amplifikation durch PCR. Die drei Temperaturstufen der
Zyklen werden in nur 5 Sekunden durchlaufen. Eine DNA-Amplifikation mit 30 Temperatur
zyklen dauert daher nur 2½ Minuten.
Fig. 2 stellt eine mikrosystemtechnische Membran für die DNA-Amplifikation mit ruhender
Reaktionslösung dar. Fig. 2a zeigt die Kapillarstruktur mit Einlaßkanal (1) Flußverteiler (2)
zum gleichmäßigen Befüllen der Parallelkapillaren, Parallelkapillaren (3), Flußsammler (4) und
Auslaßkanal (5). Fig. 2b zeigt einen Querschnitt durch die Membran (6) mit den Parallelkapil
laren, den Heizelementen (7, 8), und den beweglichen Kühlelementen (9, 10).
Fig. 3 zeigt das Prinzip einer (ungünstigen) kapillaren Anordnung, bei dem die Reaktionslösung
in der Kapillare in je einem Zyklus drei Orte unterschiedlicher Temperatur durchfließt.
Die Oberkante (15) dieser Struktur befindet sich in Kontakt mit einem Heizer, der die Kante
auf etwa 100°C hält, während die Unterkante (16) durch Kühlung auf etwa 40°C gehalten
wird. Nach einem Durchfließen eines Schmelzgebiets (11) mit etwa 95°C fließt die Reaktions
lösung zur gegenüberliegenden Kante und wird im Primeranlagerungsgebiet (12) auf etwa
45°C gekühlt. Danach fließt sie zum Wiederaufbaugebiet (13), in dem sie auf etwa 72°C erhitzt
wird. Dieses Gebiet hat eine etwas längere Durchflußstrecke, um eine etwas längere Zeitdauer
für die Wiederaufbauphase zu erhalten. Von da aus fließt die Reaktionslösung in das nächste
Schmelzgebiet (14), das zum nächsten Temperaturzyklus gehört. Es handelt sich in Fig. 3 um
eine ungünstige Ausführung dieser Kapillarstruktur, da die Fließgeschwindigkeit auf allen
Temperaturstufen gleich ist.
Fig. 4 zeigt eine günstigere Ausführungsform einer kapillaren Anordnung für einen konstan
ten Fluß. Im Wiederaufbaugebiet (23) verzweigt die Kapillare in eine Vielzahl paralleler Kapil
laren gleichen Querschnitts, wodurch die Fließgeschwindigkeit hier erheblich herabgesetzt ist.
Sonst gleicht diese Anordnung in allen Stücken der Anordnung in Fig. 3.
Es liegt nahe, mikrosystemtechnisch eine Kapillarstruktur in einem Siliziumchip mit stationärer
Temperaturverteilung zu erzeugen, wie sie in Fig. 3 gezeigt und beschrieben ist, und sie von
der Reaktionslösung mit konstantem Fluß durchfließen zu lassen. Es stellt sich jedoch heraus,
daß die PCR-Reaktion bei Kapillardurchmessern unterhalb von etwa 400 Mikrometern durch
die erforderlich hohe Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare erheblich gestört wird. Dieser
Kapillardurchmesser ist aber für die hier erwünschten Aufheizraten noch viel zu groß. Um an
dererseits die Polymerasearbeit mit der üblichen, niedrigen Fehlerrate von 10-4 beizubehalten,
ist eine so niedrige Flußgeschwindigkeit erforderlich, daß keine wesentliche Verminderung der
Gesamtzeit erzielt wird.
Eine durch den Erfindungsgedanken stark verbesserte Ausführungsform ist daher durch die
Kapillarstruktur gegeben, wie sie in Fig. 4 gezeigt ist. Hier verzweigt sich die Kapillare ohne
Verengungen im Wiederaufbaugebiet, daher ist hier die Fließgeschwindigkeit deutlich abge
senkt. Es kann damit eine Verkürzung der Zeitdauer für die PCR-Amplifizierung erreicht wer
den. Es ist ein Vorteil dieser Anordnung, daß in dieser Struktur wegen des kontinuierlichen
Betriebes wechselnde Mengen an Reaktionslösung einer PCR-Amplifizierung unterworfen
werden können, wobei allerdings der Zeitvorteil schwindet.
Diese Struktur hat jedoch auch Nachteile. Sie ist relativ lang und schmal (etwa 4 × 60 Millime
ter), ungewöhnlich für ein Mikrosystem und sehr fragil, dazu starken thermisch erzeugten
Spannungen ausgesetzt. Diese Nachteile können zum Teil durch eine kreis- oder schleifenför
mige Anordnung mit zentraler Heizung ausgeglichen werden, oder durch eine gefaltete Anord
nung mit übereinanderliegenden Kapillarebenen, die zu einer Verkürzung der Gesamtstruktur
führt. Ein weiterer Nachteil ist die strenge Festlegung der Anzahl von PCR-Zyklen, die durch
die Anzahl der Strukturwiederholungen im Mikrosystemchip fest vorgegeben ist. Ein Nachteil
ist auch die relativ lange Dauer des Gesamtprozesses einschließlich Entleerung, nachdem für
die Front der durchlaufenden Reaktionslösung die Arbeit bereits beendet ist.
Es ist daher von Vorteil, ein größervolumiges Muster mit sehr feinen Kapillaren nur einmal
zu füllen, die PCR-Reaktionen in der ruhenden Reaktionslösung durch zeitliche Temperatur
zyklen ablaufen zu lassen, und die Struktur dann wieder einmalig zu entleeren.
Im Prinzip kann diese Art des Betriebes in einer einzigen, vielfach gefalteten, durchlaufenden
Kapillare durchgeführt werden, dann ist aber der Vorgang des Füllens und Entleerens relativ
lang. Füll- und Entleerungszeit sind nicht unbeträchtlich. So ist eine Kapillare mit einem Quer
schnitt von 100 × 60 Mikrometern, die etwa 250 Nanoliter aufnehmen soll, bereits über 40
Millimeter lang, und benötigt, bei einer Füll- und Entleerungsgeschwindigkeit von 2 Millime
tern pro Sekunde, bereits 40 Sekunden für diese Vorgänge. Schließen sich noch weitere Ver
arbeitungsschritte an, so werden die Füll- und Entleerungszeiten prohibitiv groß.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist daher in Fig. 2a und 2b gezeigt. Es handelt
sich um eine Vielzahl paralleler Kapillaren (3), die in der Mittelebene einer dünnen, mikrosy
stemtechnischen Membran (6) liegen. Für eine streng gleichphasige Füllung sorgen zwei Ver
teilersysteme (2, 4) zu Beginn und Ende der Parallelkapillaren, die für alle Zu- und Abführun
gen der Parallelkapillaren die gleichen Fließwiderstände garantieren. Diese Kapillarstruktur
wird zu Beginn der PCR-Amplifizierung gefüllt, danach befindet sich die Reaktionslösung in
Ruhe. Die Heizelemente (7, 8) auf der Oberfläche der Membran können die Membran und mit
ihr die Reaktionslösung in sehr kurzer Zeit aufheizen. So reichen etwa 2 Watt Heizleistung aus,
um einen Temperaturanstieg um mehr als 100°C pro Sekunde zu erzeugen. Die Anstiege von
der Primeranlagerungstemperatur (45°C) zur Wiederaufbautemperatur (72°C) und dann zur
Schmelztemperatur (95°C) können in jeweils etwa ¼ Sekunde durchlaufen werden. Werden die
Heizer beispielsweise durch einen hochfrequenten Wechselstrom betrieben, so können die
Temperaturkoeffizienten in bekannter Weise zur Messung der Temperatur im Heizer selbst und
somit zur Regelung des Heizvorganges benutzt werden.
Die Kühlung der Membran erfolgt bei dieser Ausführungsform über zwei vergoldete oder
versilberte Kühlelemente aus Kupfer (9, 10), die durch eine elektromechanisch oder pneuma
tisch erzeugte Bewegung an die Membran angepreßt werden und einen großflächigen thermi
schen Kontakt herstellen. Eine mechanische Zwangskopplung der gegenläufigen Bewegungen
beider Kühlkörper kann die Membran vor Beschädigungen schützen. Die Kühlelemente sind
mit Kühlrippen versehen, die mit Umgebungsluft gekühlt werden. Für stärkere Kühlung kann
auch eine einfache Wasserkühlung in Betracht gezogen werden. Die Wärmeabfuhr aus der dün
nen Membran erfolgt dann in weniger als einer halben Sekunde.
Nach Beendigung der PCR-Amplifikation wird die Kapillarstruktur durch nachgeschobene
Waschflüssigkeit entleert. Die DNA wird der Analyse zugeführt. Die Kapillarstruktur wird
ausreichend gut gewaschen und steht für die nächste PCR-Amplifikation wieder zur Verfü
gung.
Diese Kapillarstruktur in einer mikrosystemtechnischen Membran erlaubt keine wechselnden
Volumina der verarbeiteten Reaktionslösung. Da für die Art der Analyse jedoch meist unver
ändert feststehende Mengen benötigt werden, ist dieses kein gravierender Nachteil. Demgegen
über erlaubt diese Struktur wechselnde Anzahlen von Vervielfältigungszyklen. Damit kann die
DNA-Amplifizierung in vorteilhafter Weise an die Menge an DNA im Ausgangsmaterial ange
paßt werden. Steht die DNA aus nur wenigen Zellen zur Verfügung, so können beispielsweise
32 Zyklen durchfahren werden, stammt die DNA dagegen aus einigen tausend Zellen, so mö
gen 24 Zyklen genügen. Es ist daher diese Art der zeitlichen Temperaturvariation flexibler als
die oben geschilderten Arten des Durchflusses der Reaktionslösung durch Ortsgebiete ver
schiedener Temperatur. Auch können die ersten Zyklen langsamer ablaufen, um die Hybridisie
rung zu erleichtern, und bei Erzeugung von genügend vielen kurzen DNA-Segmenten kann die
Geschwindigkeit erhöht werden.
Die Analyse der amplifizierten DNA-Segmente kann beispielsweise massenspektrometrisch
durch Ionisierung mit matrixunterstützter Laserdesorption (MALDI) in einem Flugzeitmassen
spektrometer (TOF) erfolgen. Die DNA wird dazu zusammen mit geeigneten Matrixsubstan
zen auf einen Probenträger aufgebracht. Die MALDI-Probenträger werden dann in an sich
bekannter Weise der Ionenquelle des Massenspektrometers zugeführt, und die einzelnen DNA-
Probenaufträge werden dort in ebenfalls bekannter Weise automatisch auf die Molekularge
wichte der DNA-Segmente hin vermessen.
Alle oben geschilderten Kapillarsysteme bedürfen einer Desaktivierung der inneren Kapillaro
berflächen, um die Polymerasearbeit nicht zu stören. Experimente haben ergeben, daß nackte
Siliziumoberflächen die Polymerase sofort inaktiviert.
Die inneren Kapillaroberflächen müssen also mit desaktivierenden Schichten belegt werden.
Sehr gute Belegungsverfahren für die Desaktivierung sind aus der Kapillargaschromatographie
bekannt. Die dort verwendeten Glas- oder Quarzglaskapillaren haben ebenfalls sehr aktive, in
diesem Fall adsorptionsaktive Oberflächen. Die Aktivität geht im wesentlichen von freien OH-
Gruppen aus. Solche freien OH-Gruppen werden auch für die Störung der Polymerase verant
wortlich gemacht.
Für die Kapillargaschromatographie sind die verschiedensten Belegungssubstanzen entwickelt
worden. Da diese Substanzen die flüssige Phase dieser Art von Verteilungschromatographie
bilden (die daher auch of GLC statt nur GC genannt wird), werden die Belegungssubstanzen
hier einfach "Phasen" genannt. Dabei gibt es polare und unpolare Phasen, hydrophile und hy
drophobe. Seit gut 20 Jahren haben sich sogenannte "chemically bonded phases" durchgesetzt,
bei denen lange, fadenförmige Moleküle dicht an dicht wie Seegras einseitig an der Oberfläche
chemisch kovalent gebunden sind. Diese Phasen sind temperaturstabil und langzeitbeständig.
Durch die parallele Anordnung der Phasenmoleküle läßt sich dabei jede gewünschte Anord
nung zurechtschneidern. So kann eine oberflächlich hydrophile Schicht im Inneren hydrophob
ausgestaltet werden. Die Dicke kann den Erfordernissen angepaßt werden. Die überwiegend
als Standardphasen in der Gaschromatographie benutzten Silicongummiphasen sind allerdings
für die PCR-Reaktionen weniger günstig, besser dagegen sind wachsartige Phasen, beispiels
weise Carbowax.
In Zukunft werden Belegungen mit Biomaterialien wie Proteine, Lipidproteine oder Glycopro
teine eine größere Rolle als Belegungsmaterialien spielen. Es ist bereits gelungen, solche Mole
küle kovalent an Oberflächen von Metallen zu binden. Es ist zu erwarten, daß diese Bioma
terialbelegungen noch günstiger als die chromatographischen Phasen für die Desaktivierung
der Oberflächen für die Polymerasearbeit sind.
Es ist jedoch auch möglich, das Kapillarsystem mit mikrosystemtechnischen Mitteln aus poly
meren Kunststoffen zu erzeugen. Es existieren Mikroabdruckverfahren, die von einer Silizi
umstruktur als Matrize ausgehen. Durch bekannte Mikroschweiß- oder Mikroklebetechniken
ist auch die Herstellung von dünnen Membranen mit eingelagerten Kapillaren möglich. Die
fertigen Membranen können mit einem Widerstandsnetzwerk bedruckt werden; auch die Auf
bringung vom Metallschichten mit anschließendem Ätzen kann solche Widerstandsnetzwerke
erzeugen.
Die Kunststoffe können zur Verbesserung der Wärmeleitfähigkeit mit metallischen Pulvern
gefüllt werden, beispielsweise mit Nanopulver aus Silber.
Die beschriebenen Verfahren und Strukturen können natürlich vielfältig variiert werden. Es ist
dem Fachmann ein leichtes, dem angegeben Erfindungsgedanken folgend, weitere Kapillar
strukturen und weitere Betriebsverfahren zu entwickeln.
So ist es beispielsweise möglich, RNA nach einem ersten Schritt einer Verdopplung mit "inver
ser Transcriptase", die die RNA wieder in DNA komplementärer Sequenz zurückverwandelt,
in der oben beschriebenen Weise als DNA zu vervielfältigen und anschließend zu analysieren.
Auch dieser Prozeß läßt sich in einer einheitlichen, mikrosystemtechnisch hergestellten Appa
ratur durchführen. Auch weitergehende Veränderungen oder Derivatisierungen der DNA mit
dem Ziel, besser analysierbare Ausgangsprodukte für die Analyse zu erhalten, kann in dazu
speziell angepaßten, mikrosystemtechnisch hergestellten Geräten durchgeführt werden.
Claims (20)
1. Verfahren für die Vervielfältigung von DNA durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)
in Reaktionsgefäßen, in denen in bekannter Weise eine Reaktionslösung nacheinander
zyklisch wiederholt die drei Temperaturen für Schmelzen, Primeranlagerung und Wieder
aufbau annehmen muß,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Reaktionsgefäße aus einem Muster feiner Kapillaren bestehen, und daß die Fließ
geschwindigkeit der Reaktionslösung während des Wiederaufbaus der doppelsträngigen
DNA unter einem Wert gehalten wird, der zehn maximalen Kapillardurchmessern pro Se
kunde entspricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Reaktionsgefäß aus einer
Mehrzahl von Kapillaren aufgebaut ist, die sich parallel mit der Reaktionsflüssigkeit be
schicken lassen.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das
Volumen eines jeden Reaktionsgefäßes kleiner als ein Mikroliter ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
kapillar aufgebauten Reaktionsgefäße mikrosystemtechnisch aus Siliziumwafern herausge
arbeitet und daß die Oberfläche der Kapillaren durch Beschichtung mit organischem,
PCR-freundlichen Material inert gemacht worden sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle der Beschichtung
an die Oberfläche des Siliziums chemisch gebunden sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschichtung an sich be
kannte chromatographische Phasen verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschichtung die besonders
unpolare Phase Carbowax benutzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Be
schichtung der Kapillarenoberflächen die besonders PCR-freundlichen Glyco-Proteine der
Zellmembranen oder damit verwandte Substanzen verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die kapillaren
Reaktionsgefäße mit mikrosystemtechnischen Herstellungsmethoden aus polymeren
Kunststoffen hergestellt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die kapillaren Reaktionsgefäße
aus Polyethylen oder Polypropylen gefertigt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die polyme
ren Kunststoffe mit Partikeln eines thermisch gut leitenden Metalls gefüllt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Silberpulver zur Füllung be
nutzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Innen
oberflächen der Kapillaren durch Beschichtung desaktiviert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) in einem System nacheinander durchlaufbarer kapillarer Reaktionsgefäße in einem mi krosystemtechnischen Substrat die einzelnen Reaktionsgefäße durch einen geregelten Wärmefluß durch das Substrat stationär auf den Temperaturen für die drei Phasen Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau gehalten werden, daß
- (b) diese Reaktionsgefäße für Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau von der Reaktionslösung nacheinander mit in etwa konstantem Fluß durchlaufen werden, und daß
- (c) in den Reaktionsgefäßen für den Wiederaufbau die Strömungsgeschwindigkeit durch eine Mehrzahl parallel angelegter Kapillaren erniedrigt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) in einem System nacheinander durchlaufbarer kapillarer Reaktionsgefäße in einem mi krosystemtechnischen Substrat die einzelnen Reaktionsgefäße durch einen geregelten Wärmefluß durch das Substrat stationär auf den Temperaturen für die drei Phasen Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau gehalten werden, daß
- (b) diese kapillaren Reaktionsgefäße etwa von gleichem Volumen sind, und daß
- (c) sie von der Reaktionslösung nacheinander in getakteten Schüben so durchlaufen wer den, daß während des Wiederaufbaus keine oder nur sehr geringe Strömung herrscht.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) die PCR-Amplifikation in einem einzigen, kapillar ausgebildeten Reaktionsgefäß ab läuft, in dem die nach einmaliger Zufuhr ruhende Reaktionslösung nacheinander zyklisch wiederholt auf die drei Temperaturstufen gebracht wird, daß
- (b) die Kapillaren des Reaktionsgefäßes innerhalb einer dünnen, mikrosystemtechnischen Membran angeordnet sind, daß
- (c) die Membran und mit ihr die Reaktionslösung in jedem Zyklus durch oberflächlich auf gebrachte Heizelemente sehr schnell von der Primeranlagerungstemperatur auf die Tempe raturen des Wiederaufbaus der Doppelhelix und dann des Schmelzens gebracht wird, und daß
- (d) die Membran und mit ihr die Reaktionslösung in jedem Zyklus nach dem Schmelzen durch bewegliche Kühlelemente, die in thermischen Kontakt mit der Membran gebracht werden, sehr schnell auf die Primeranlagerungstemperatur abgekühlt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran dünner als ein
Millimeter ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reak
tionsgefäß aus einer einzigen, zickzack-gefalteten Kapillare besteht.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reak
tionsgefäß aus einer Mehrzahl parallel angeordneter Kapillaren besteht, die durch ein ka
pillares Verteilersystem gleichmäßig und schnell befüllt und wieder geleert werden kön
nen.
20. Mikrosystemtechnische Anordnung zur Durchführung eines der Verfahren nach den An
sprüchen 1 bis 19.
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