DE19717085C2 - Verfahren und Geräte für extrem schnelle DNA-Vervielfachung durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Geräte zur schnellen, selektiven Vervielfältigung von Desoxy-Ribo-Nukleinsäure (desoxy-ribo nucleic acid, DNA) aus Biomaterial durch die bekann­ te, in einzelnen Verdopplungszyklen arbeitende Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR).

Die Erfindung besteht darin, extrem kurze Zykluszeiten von nur wenigen Sekunden für die PCR dadurch zu erzeugen, daß einerseits die Reaktionsgefäße für die Aufnahme der Reaktions­ lösung aus einem Muster feiner Kapillaren in enger Nachbarschaft zu Heiz- und Kühlelementen aufgebaut sind, um in der Reaktionslösung die Temperatureinstellung für die drei Temperatur­ phasen der Verdopplungszyklen der PCR optimal zu beschleunigen, und daß andererseits die Strömungsgeschwindigkeit in den Kapillaren während der Amplifikationsphase gering gehalten wird, um die Polymerase-Reaktion nicht zu stören. Das Kapillarmuster läßt sich in einfacher Weise mikrosystemtechnisch herstellen.

Stand der Technik

Für die medizinische Versorgung von Patienten wird es immer wichtiger, sehr schnell arbeiten­ de gentechnische Analysenverfahren bereitzustellen. Ein Beispiel dafür ist die Identifizierung infektiöser Mikroorganismen, die heute noch Tage in Anspruch nimmt, aber eigentlich eine Behandlung in möglichst frühem Stadium, möglichst in den ersten Stunden, erfordert. Noch schärfer wird die Forderung nach schneller Analyse bei Untersuchungen an möglicherweise krebs- oder andersartig befallenem Gewebe während der Operation am offenen Patienten durch onkogenetische, virologische oder bakteriologische Analysen. Hier wird eine maximale Analy­ sedauer von etwa zehn Minuten gefordert.

Die Massenspektrometrie liefert heute sehr schnelle, hochempfindliche Analysenverfahren für amplifizierte DNA. Fortschritte der matrixunterstützten Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) lassen es möglich werden, eine Analyse von etwa 20 Proben einschließlich der MALDI-Präparation, der Einschleusung der DNA-Proben in das Massenspektrometer, der MALDI-Analyse und der Datenauswertung bis zur Darstellung auf dem Bildschirm in weniger als drei Minuten durchzuführen. Lysieren der Gewebszellen und Extraktion der DNA läßt sich in weniger als zwei Minuten durchführen.

Diesen maximal fünf Minuten insgesamt für Probenvorbereitung und massenspektrometrischer Analyse stehen Zeiten von drei Stunden für die klassische PCR-Vervielfältigung gegenüber. Starke Verkürzungen dieser Zeiten sind allerdings in Sicht. In einem inzwischen kommerziell erhältlichen Gerät konnte diese Zeit bereits auf etwa 20 Minuten reduziert werden. In einer neueren Veröffentlichung (A. T. Woolley et al., "Functional Integration of PCR Amplification and Capillary Electrophoresis in a Microfabricated DNA Analysis Device", Anal. Chem. 68, 4081, Dezember 1996) wurden 20 Mikroliter der Reaktionslösung mit DNA in nur 15 Minuten in einem Miniaturgefäß aus Polypropylen in 30 Zyklen amplifiziert. In der Arbeit "High Speed Polymerase Chain Reaction in Constant Flow" (H. Nakano et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58 (2), 349, 1194) wurde die Reaktion unter ständigem Durchfluß in einer Teflon-Kapillare durchgeführt, wobei, allerdings unter starkem Ausbeuteverlust, 12 bis 18 Minuten Gesamtzeit erreicht wurden. Für eine gute Ausbeute wurden dagegen noch 40 Minuten gebraucht. Je eine unverzweigte Kapillare als Reaktionsgefäß für die PCR jeweils einer Substanz ist auch in EP 0 636 413 A2 vorgeschlagen. In einer neuesten Arbeit "Fully Automated DNA Reaction and Analysis in a Fluidic Capillary Instrument" (H. Swerdlow et al., Anal. Chem: 69, 848, März 1997) wird die PCR ebenfalls in einer Teflon-Kapillare, jedoch unter ruhenden Bedingungen, sogar in nur acht Minuten durchgeführt.

Selbst diese Zeit ist jedoch für eine Schnellanalyse im obigen Sinn zu lang. Es muß das Ziel sein, die PCR-Amplifikation in nur zwei bis drei Minuten durchführen zu können.

Die DNA besteht bekanntlich aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechselnden Nukleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilde. Die Nukleotide bestehen jeweils aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe und einer Base. Je zwei Basen sind zueinander komplementär. Zucker und Phosphorsäure bilden die fortlaufende Kette der DNA (oder das sogenannte Rückgrat), die vier charakteristischen Basen sind jeweils seitliche Ab­ zweigungen, sie sind an der Phosphorsäuregruppe befestigt. Die beiden komplementären Ket­ ten oder Einzelstränge der DNA sind in Form einer Doppelhelix umeinandergewendelt, wobei jeweils zwei komplementäre Nukleotide über Wasserstoffbrücken zwischen den Basen mitein­ ander verbunden sind und so einen sogenannten Doppelstrang bilden.

Grundlage vieler gentechnischer Analyseverfahren ist die selektiv arbeitende PCR ("polymerase chain reaction"), eine einfache Vervielfältigungsmethode für gezielt aussuchbare DNA-Stücke im Reagenzglas, die erst 1983 von K. B. Mullis (dafür Nobelpreis 1993) entwickelt wurde und nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen einen beispiellosen Siegeszug durch die gentechnischen Laboratorien angetreten hat.

PCR ist die gezielte Vervielfältigung eines präzise aus dem Genom ausgesuchten relativ kurzen Segments der zweisträngigen DNA in einfachen Temperaturzyklen. Die Auswahl des DNA- Segments erfolgt durch ein sogenanntes Paar von Primern, zweier DNA-Stücke mit je etwa 20 Basen Länge, die (etwas verkürzt und vereinfacht beschrieben) die beiderseitigen Enden des ausgesuchten DNA-Segments codieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch ein Enzym namens Polymerase, das eine chemische Fabrik in einem Molekül darstellt. Die PCR-Reaktion läuft in wäßriger Lösung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs-DNA und genügende Mengen an Polymerase, Primern, Triphosphaten der vier Nukleinsäuren (sogenannte "Substrate"), Aktiva­ toren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem Temperaturzyklus wird zunächst die Dop­ pelhelix der DNA bei etwa 95°C "aufgeschmolzen", wobei die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Bei etwa 45°C werden dann die Primer an eine genau passend komplementä­ re Nukleotidfolge der DNA-Einzelstränge angelagert ("Hybridisierung"). Bei 72°C wird die Doppelhelix durch den Anbau der komplementären Nukleotide an ein Wachstumsende der Primer durch eine besonders temperaturfeste Polymerase (taq-Polymerase) wieder zu einer neuen Doppelhelix vervollständigt. Dadurch wird das ausgewählte DNA-Segment zwischen den Primern im Prinzip verdoppelt. In 30 Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang der DNA als Ausgangsmaterial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt, deren beide Enden mit den Primern identisch sind. (In strenger Beschreibung hybridisieren die beiden Primer auf den beiden verschiedenen Strängen der DNA und die Verkürzung auf das DNA-Segment zwi­ schen den Primern tritt erst statistisch bei weiterem Vervielfachen auf).

Die Zeitdauer für einen Temperaturzyklus hängt praktisch nur von der Aufheiz- und Abkühl­ geschwindigkeit ab, die wiederum vom Flüssigkeitvolumen, von den Gefäßdimesionen und von der Wärmeleitfähigkeit der Gefäßwände und der Reaktionslösung abhängt. Auf jeder Tempera­ turstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden vonnöten, teilweise sogar weniger.

In der oben zitierten Arbeit von Woolley et al., in der die PCR-Amplifikation für 30 Zyklen nur 15 Minuten dauerte, wurden beispielsweise folgende Zeiten für die Arbeit in den drei Tempera­ turstufen benötigt: 2 Sekunden bei 96°C für das Schmelzen, 5 Sekunden bei 55°C für die Pri­ meranlagerung und 2 Sekunden bei 72°C für den Wiederaufbau. Die restliche Zeit von 21 Se­ kunden pro Zyklus wurde für die Temperaturübergänge gebraucht.

Das Schmelzen der DNA erfolgt bei einer Temperatur, die um einige Grade oberhalb der "Schmelztemperatur" liegt, praktisch momentan. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine hal­ be Sekunde Erhitzung auf diese Temperatur für eine vollständige Trennung aller Doppelhelix- Strukturen genügt. Die genaue Einhaltung der Temperatur ist hierfür nicht einmal besonders kritisch, solange man nur oberhalb der Schmelztemperatur, aber unterhalb einer Gerinnungs­ temperatur bleibt.

Die Hybridisierung braucht ebenfalls nicht lange, wenn die Primer in genügender Konzentrati­ on vorhanden sind. Bei optimaler Konzentration sind etwa ein bis zwei Sekunden ausreichend. Für die Hybridisierung ist die Temperatur noch weniger kritisch, sie sollte nur unter 50°C lie­ gen, um genügend rasch abzulaufen. Optimale Bedingungen liegen bei etwa 45°C vor.

Die Vervollständigung der angelagerten Primer zu einem komplementären DNA-Molekül durch die Polymerase, im folgenden "Wiederaufbau" genannt, hat eine hohe Geschwindigkeit. Pro Sekunde können unter optimalen Temperatur- und Konzentrationsbedingungen 500 bis 1000 Basen durch die Polymerase angebaut werden. Da im allgemeinen nur DNA-Segmente von maximal 400 Basen Länge für die Analysen benötigt werden, reichen zwei Sekunden gut für diese Wiederaufbauphase aus. Für diesen Vorgang des Wiederaufbaus einer neuen Doppel­ helix ist die gute Einhaltung der optimalen Temperatur erforderlich, um die hohe Geschwin­ digkeit des Wiederaufbaus zu erzielen.

Theoretisch könnte somit ein Zyklus der PCR-Reaktion in weniger als fünf Sekunden abge­ schlossen sein, unter der Voraussetzung, die Wärme bis zu jeweils ausreichenden Tempera­ turgleichgewichten in jeweils etwa ¼ Sekunde zu- oder abzuführen zu können. Ein solch idea­ ler Temperaturverlauf für einen PCR-Zyklus ist in Fig. 1 gezeigt. Die Wärme-Zu- und Abfuhr sind dabei die kritisch zeitbestimmenden Größen.

Durch die Zugabe nur eines Primerpaares lassen sich uniforme DNA-Segmente vervielfachen. Werden jedoch gleichzeitig mehrere verschiedenartige Primerpaare zugegeben, so werden auch gleichzeitig mehrere DNA-Segmente vervielfältigt ("multiplexed PCR").

Diese Art der Multiplex-PCR wird häufig angewandt und hat oft besondere Vorteile. Für das sogenannte "Fingerprinting" zur Identifizierung von Individuen durch DNA-Segmente varia­ bler Länge (Methoden der "VNTR = Variable Number of Tandem Repeats" oder "AMP-FLP = Amplified Fragment Length Polymorphism") macht es die Analysen schneller. Dabei kann durch die Wahl der Primer, die das mittlere Molekulargewicht der DNA-Segmente bestimmen, erreicht werden, daß die Variationen der Molekulargewichte der durch die verschiedenen Pri­ merpaare gebildeten DNA-Segmente sich nicht oder nur selten überlappen. Diese Art der Mul­ tiplex-PCR bedingt einen Analysator, der zur gleichzeitigen Messung eines großen Bereichs der Molekulargewichte fähig ist. Besondere Vorteile hat das Verfahren zur Identifizierung von infektiösen Lebewesen, da beispielsweise gleichzeitig 20 Bakteriensorten (oder Viren, Hefen, Pilze) mit einer einzigen PCR-Vervielfältigung nachgewiesen werden können.

Die hohe Empfindlichkeit moderner Meßmethoden für die Analyse der DNA, beispielsweise die Empfindlichkeit der oben erwähnten massenspektrometrischen Messungen, läßt es zu, das Volumen der Reaktionslösung unter Beibehaltung der optimalen Konzentration zu verkleinern. Da dann einerseits bei gleicher Ausgangsmenge an DNA eine Erschöpfung der Reaktionslö­ sung nach weniger Zyklen eintritt, andererseits aber auch nicht so viel amplifiziertes DNA- Material für die Analyse gebraucht wird, kann die Zahl der Zyklen von normalerweise 30 auf etwa 24 bis 28 verringert werden. Die Zeitersparnis ist dadurch jedoch gering. Die mögliche Verkleinerung der Volumina legt eine mikrosystemtechnische Lösung für ein neues PCR- Amplifizierungsverfahren nahe, wie es auch schon in der obig zitierten Arbeit von Woolley et al. angewandt wurde.

Auch in dem Review-Artikel "Microfabrication Technologies for Integrated Nucleic Acid Analysis", D. T. Burke, M. A. Burns und C. Mastrangelo, Genome Research 7, 189 (1997), werden mikrosystemtechnisch hergestellte Kammern für die PCR-Amplifikation vorgestellt, ohne jedoch Angaben über die erreichbaren Geschwindigkeiten zu machen. Solche Kammern, hier 1000 × 1000 × 250 Mikrometer groß und aus einem Niedertemperaturpolymer gefertigt, haben jedoch den Nachteil, daß sie sich nur durch längeres Spülen mit einer Waschflüssigkeit leeren lassen und so beim Entleeren eine Verdünnung der amplifizierten DNA erzwingen.

Ein ebenfalls naheliegender Gedanke ist es, die Reaktionslösung konstant durch eine feine Kapillare laufen zu lassen, die für jeden Zyklus in einfacher Weise drei stationär auf entspre­ chenden Temperaturen gehaltene Zonen auf einem Mikrosystemchip durchquert, wobei also die übliche Zeitvariation der Temperatur durch eine einfache Ortsvariation der Temperatur ersetzt wird. Ein Ausschnitt einer solchen Anordnung ist in Fig. 3 gezeigt. Eine geringe Di­ mension der Kapillare soll dabei eine schnelle Temperaturänderung bis zum Temperaturgleich­ gewicht ermöglichen.

Leider behindert der Fluß in einer Kapillare die Arbeit der Polymerase in der Wiederaufbau­ phase. In einer zylindrischen Kapillare herrscht im wesentlichen eine laminare Strömung mit einem parabolischen Geschwindigkeitsprofil, wobei in der Mittelachse der Kapillare die doppel­ te mittlere Geschwindigkeit, am Rande der Kapillare die Geschwindig Null herrscht. In einer Kapillare mit quadratischem oder rechteckigem Querschnitt herrschen etwas andere Verhält­ nisse, jedoch sind die Unterschiede hier nicht entscheidend. Die fließende Reaktionslösung ist also in Gleitschichten unterschiedlicher Geschwindigkeit aufgeteilt, benachbarte Moleküle in verschiedenen Gleitschichten bewegen sich aneinander vorbei. Die einzelnen Moleküle unter­ liegen Scherkräften. Längliche Moleküle werden parallel zur Flußrichtung ausgerichtet.

Bei einer realitätsnahen mittleren Geschwindigkeit von zwei Milimetern pro Sekunde in einer Kapillare von 100 Mikrometer Durchmesser bewegen sich zwei etwa kugelförmige Moleküle, die sich einander berührend auf beiden Seiten einer gedachten Gleitebene befinden, in einer Millisekunde im Mittel um etwa 8% ihres Durchmessers aneinander vorbei. Eine Millisekunde entspricht der minimalen Zeit für den Anbau einer Base. Moleküle in der Mitte des Flusses sehen keine solche Verschiebung, Moleküle nahe an der Wand der Kapillare sehen eine größe­ re Verschiebung. Damit ist aber die Arbeit der Polymerase, die ein ruhiges Nebeneinanderlie­ gen der Moleküle im Maßstab einer Millisekunde erfordert, stark behindert. Es kommt zu ver­ stärkten Fehlleistungen, bei stärkerer Verschiebebewegung sogar zu einem Ende der Polymera­ searbeit.

Die Verschiebebewegung benachbarter Moleküle nimmt bei gleichem Fluß proportional zur dritten Potenz des reziproken Durchmessers der Kapillare zu. Für die Durchfluß-PCR herrscht also ein Dilemma: dünnere Kapillaren verbessern die Temperatureinstellung, verlängern jedoch den Weg, zwingen daher zu einer höheren Durchflußgeschwindigkeit und hindern dabei die Amplifikation.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Zykluszeit für die PCR-Amplifikation von DNA auf ex­ trem kurze Zeiten von etwa vier bis sechs Sekunden, also die gesamte PCR-Amplifikation auf die Dauer von zwei bis drei Minuten zu verkürzen.

Beschreibung der Erfindung

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, einerseits ein Muster sehr feiner Kapillaren in enger Nachbarschaft zu Heiz- und Kühlmitteln als Gefäßsystem für die Reaktionslösung zu verwen­ den, um die Aufheiz- und Abkühlzeiten der Reaktionslösung äußerst gering zu halten, anderer­ seits aber die Fließgeschwindigkeit der Reaktionslösung in den Kapillaren während der Phase des Wiederaufbaus des DNA-Doppelstrangs durch die Polymerase so gering wie möglich zu halten. Die Fließgeschwindigkeit während der Phase des Wiederaufbaus sollte das zehnfache des dort herrschenden maximalen Kapillarendurchmessers pro Sekunde auf keinen Fall über­ schreiten, günstiger ist eine mittlere Fließgeschwindigkeit, die pro Sekunde weniger als fünf maximale Kapillarendurchmesser zurücklegt. Die Fehlerrate für den Wiederaufbau nähert sich erst unterhalb einer mittleren Fließgeschwindigkeit, die kleiner als der zweifache Durchmesser pro Sekunde ist, ihrem Minimum. Der maximale Kapillarendurchmesser entspricht bei runden Kapillaren dem normalen Durchmesser, bei rechteckigen Querschnitten der Diagonale.

Eine günstige, sehr feine Kapillarstruktur mit eng benachbarten Heizelementen läßt sich günstig mit mikrosystemtechnischen Mitteln herstellen. Die geringe Fließgeschwindigkeit kann einer­ seits (besonders bei konstantem Fluß der Reaktionslösung durch die Kapillarstruktur) durch eine besondere Ausbildung des Kapillarnetzes vorgegeben werden, andererseits kann die gerin­ ge Fließgeschwindigkeit aber auch durch besondere Betriebsweisen mit zeitlich veränderlichen Flüssen der Reaktionslösung erzwungen werden.

Der Vorteil der feinen Kapillarstruktur liegt auf der Hand: es lassen sich die Zeitdauern der thermischen Übergänge in der Reaktionslösung sehr kurz halten. Diesem Vorteil liegen aber schwerwiegende Nachteile gegenüber: Die außerordentlich große Oberfläche des Gefäßsy­ stems stört die biochemischen Abläufe, wenn die Oberfläche auch nur in geringster Weise stö­ rend auf die beteiligten Moleküle einwirkt. So tötet beispielsweise eine nackte Siliziumoberflä­ che sofort die Aktivität der Polymerase ab. Auch viele Kunststoffe haben sich als ungeeignet für die PCR erwiesen. Selbst gleiche Kunststoffe verschiedener Hersteller, beispielsweise die an sich günstigen Kunststoffe Polyethylen oder Polypropylen, haben sich von verschiedener Qualität in bezug auf ihre Auswirkungen auf die PCR erwiesen. Es muß also die Oberfläche sehr sorgfältig völlig inert gemacht werden.

Die Aktivität einer Oberfläche kann durch eine sorgfältige Beschichtung fast vollkommen be­ seitigt werden. So sind aus der Chromatographie, besonders aus der Gaschromatographie, Be­ schichtungsmethoden bekannt, die auch geringste Reste aktiver Oberflächen beseitigen. Insbe­ sondere die Beschichtungen mit fadenförmigen Molekülen, die chemisch einseitig an die Ober­ fläche gebunden sind ("chemically bonded phases"), haben thermisch stabile und außerordent­ lich inerte Oberflächenbeschichtungen erzeugt. Dabei lassen sich auf Wunsch hydrophobe oder hydrophile, polare oder unpolare, fett- oder wasseraufnehmende Oberflächenschichten erzeu­ gen, die in der Tiefe der Schicht wiederum andere Eigenschaften haben können. Es ist daher eine weitere Idee der Erfindung, die an sich bekannten chromatographischen Beschichtungen für die Inaktivierung der Oberflächen zu verwenden. Besonders zur Beschichtung von Quarz­ glas- und Glasoberflächen an der Innenseite dünner Kapillaren stehen ausführliche und umfang­ reiche Rezepturen mit Beschreibungen der notwendigen Schritte zur Verfügung. Siliziumo­ berflächen lassen sich durch Oxidation in Quarzoberflächen verwandeln.

Insbesondere für metallische Implantate werden stabile Beschichtungen entwickelt, die kör­ pereigenen Proteinen und Glycoproteinen entsprechen, wie sie in Zellmembranen vorkommen. Solche Beschichtungen können im vorliegenden Fall die Aktivitäten der Oberflächen auf die Polymerasereaktionen mindern, selbst wenn sie als Implantatbeschichtungen noch nicht erfolg­ reich sind.

Die mikrosystemtechnischen Herstellungsmethoden umfassen aber auch die Abformung von Kunststoffen in mikrosystemtechnisch hergestellten Siliziumformen. Auch hiermit lassen sich Kapillarsysteme entwickeln, die als Reaktionsgefäße benutzt werden können. Es ist also eine weitere Idee der Erfindung, günstige Polymere wie Niederdruckpolyethylen oder Polypropylen für die Herstellung der Kapillarsysteme zu verwenden. Da die Polymere normalerweise schlechte Wärmeleiteigenschaften besitzen, können diese auch mit thermisch gut leitenden Nanopulvern gefüllt werden, beispielsweise mit Silberpulver. Diese Pulver lassen sich mit Par­ tikeldurchmessern von etwa 10 bis 1000 Nanometern herstellen, sie sind hervorragend geeig­ net, die Wärmeleitfähigkeit von Kunststoffen zu erhöhen. Die Pulver können so eingelagert werden, daß sie nicht direkt an der Oberfläche liegen.

Die erfindungsgemäß notwendig geringe Fließgeschwindigkeit kann in einem konstant durch­ flossenem Kapillarsystem, wobei Zonen verschiedener Temperatur durchflossen werden, da­ durch erreicht werden, daß in der Zone der Wiederaufbautemperatur der Fluß der Reaktionslö­ sung in eine Vielzahl von parallelen Kapillaren verzweigt, womit die Fließgeschwindigkeit in jeder dieser parallelen Kapillaren herabgesetzt wird, wie in Fig. 4 gezeigt.

Es kann die Reaktionslösung auch durch Druckpulse diskontinuierlich weiterbewegt werden. Jeweils nach Füllung des Kapillarsystems für den Wiederaufbau des DNA-Doppelstranges, das sich auf entsprechender Temperatur befindet, bleibt der Fluß der Reaktionslösung stehen, die Aufbaureaktionen laufen ab, und erst dann (nach etwa 2 Sekunden) wird die Reaktionslösung weitergepumpt. Dazu ist es vorteilhaft, die Volumina der Gefäßsysteme für Schmelzen, Anla­ gerung, Wiederaufbau jeweils gleich groß zu halten, so daß die Reaktionslösung immer um genau diese Volumengröße weitergepreßt wird. Es entsteht ein getakteter Ablauf, der aller­ dings gleiche Aufenthaltszeiten der Reaktionslösung in den drei Temperaturzonen erzwingt.

Es ist jedoch insbesondere auch möglich, das System der Kapillaren so groß zu wählen, daß die gesamte Menge der zu verarbeitenden Reaktionslösung darin aufgenommen werden kann, und dann mit ruhender Lösung die Temperaturphasen durch schnelle Heiz- und Kühlelemente sehr schnell zeitlich nacheinander zu durchfahren.

Dabei kann das Kapillarsystem, wie in Fig. 2a und 2b gezeigt, leicht in einer Ebene ange­ ordnet werden. Diese ebene Fläche mit den Kapillaren ist in eine dünne Membran eingeschlos­ sen, an deren Oberfläche sich die Heizelemente befinden, ebenfalls in einer flächigen Struktur. So lassen sich beispielsweise 200 Nanoliter Reaktionslösung in 16 parallelen Kapillaren mit Querschnitten von 60 × 100 Mikrometern und Längen von zwei Millimetern auf einer Fläche von etwa 2 × 1,6 Millimetern unterbringen. Diese Kapillaren befinden sich in einer Silizium­ membran von maximal 300 Mikrometer Dicke. Durch die dünne Membran und durch die Stege zwischen den Kapillaren kann die Wärme besonders gut zu- oder abgeführt werden.

Auf der Ober- und Unterseite der Membran befinden sich flächig eindotierte oder sonst aufge­ brachte Widerstandsgitter, die die Heizleistung übernehmen. Mit weniger als zwei Watt Heiz­ leistung kann man die Temperatur einer solch dünnen Siliziummembran mit einer Fläche von 3 × 3 mm² in einer Sekunde um etwa 100°C erhöhen, die Erhöhung von 45°C auf etwa 72°C läßt sich somit in 0,3 Sekunden erreichen. Die Temperatur läßt sich in bekannter Weise über den Wärmekoeffizienten aus dem Widerstand des Heizelementes selbst bestimmen. Eine Rege­ lung der Heizleistung mit leichtem Überschießen führt zur schnellen Einstellung des Gleichge­ wichts in der Reaktionslösung.

Die Membran kann über Kühlmittel, die sich in flächigen Kontakt mit der Membran bringen lassen, sehr schnell gekühlt werden. Eine Anordnung mit beweglichen Kühlgliedern ist in Fig. 2b dargestellt. Diese können sich im einfachsten Fall auf Raumtemperatur befinden, zur Be­ schleunigung auch auf tieferer Temperatur. Da die Temperatur für die Primeranlagerung nicht genau eingestellt zu werden braucht, reicht eine einfache Zeitsteuerung für die Kontaktzeit aus. In kritischeren Fällen kann die Widerstandsänderung der Heizelemente für eine Steuerung der Kontaktdauer ausgenutzt werden. Die beispielsweise elektromechanisch oder pneumatisch bewegten Kühlglieder können Teil der mikrosystemtechnischen Anordnung sein, sie können aber auch durch externe Bewegungseinrichtungen an die Membran herangeführt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt einen Zyklus eines optimalen, bisher ohne diese Erfindung nicht erreichten Tem­ peraturprofils für die schnelle DNA-Amplifikation durch PCR. Die drei Temperaturstufen der Zyklen werden in nur 5 Sekunden durchlaufen. Eine DNA-Amplifikation mit 30 Temperatur­ zyklen dauert daher nur 2½ Minuten.

Fig. 2 stellt eine mikrosystemtechnische Membran für die DNA-Amplifikation mit ruhender Reaktionslösung dar. Fig. 2a zeigt die Kapillarstruktur mit Einlaßkanal (1), Flußverteiler (2) zum gleichmäßigen Befüllen der Parallelkapillaren, Parallelkapillaren (3), Flußsammler (4) und Auslaßkanal (5). Fig. 2b zeigt einen Querschnitt durch die Membran (6) mit den Parallelkapil­ laren, den Heizelementen (7, 8), und den beweglichen Kühlelementen (9, 10).

Fig. 3 zeigt das Prinzip einer (ungünstigen) kapillaren Anordnung, bei dem die Reaktionslö­ sung in der Kapillare in je einem Zyklus drei Orte unterschiedlicher Temperatur durchfließt. Die Oberkante (15) dieser Struktur befindet sich in Kontakt mit einem Heizer, der die Kante auf etwa 100°C hält, während die Unterkante (16) durch Kühlung auf etwa 40°C gehalten wird. Nach einem Durchfließen eines Schmelzgebiets (11) mit etwa 95°C fließt die Reaktions­ lösung zur gegenüberliegenden Kante und wird im Primeranlagerungsgebiet (12) auf etwa 45°C gekühlt. Danach fließt sie zum Wiederaufbaugebiet (13), indem sie auf etwa 72°C erhitzt wird. Dieses Gebiet hat eine etwas längere Durchflußstrecke, um eine etwas längere Zeitdauer für die Wiederaufbauphase zu erhalten. Von da aus fließt die Reaktionslösung in das nächste Schmelzgebiet (14), das zum nächsten Temperaturzyklus gehört. Es handelt sich in Fig. 3 um eine ungünstige Ausführung dieser Kapillarstruktur, da die Fließgeschwindigkeit auf allen Temperaturstufen gleich ist.

Fig. 4 zeigt eine günstigere Ausführungsform einer kapillaren Anordnung für einen konstan­ ten Fluß. Im Wiederaufbaugebiet (23) verzweigt die Kapillare in eine Vielzahl paralleler Kapil­ laren gleichen Querschnitts, wodurch die Fließgeschwindigkeit hier erheblich herabgesetzt ist. Sonst gleicht diese Anordnung in allen Stücken der Anordnung in Fig. 3.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen

Es liegt nahe, mikrosystemtechnisch eine Kapillarstruktur in einem Siliziumchip mit stationärer Temperaturverteilung zu erzeugen, wie sie in Fig. 3 gezeigt und beschrieben ist, und sie von der Reaktionslösung mit konstantem Fluß durchfließen zu lassen. Es stellt sich jedoch heraus, daß die PCR-Reaktion bei Kapillardurchmessern unterhalb von etwa 400 Mikrometern durch die erforderlich hohe Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare erheblich gestört wird. Dieser Kapillardurchmesser ist aber für die hier erwünschten Aufheizraten noch viel zu groß. Um an­ dererseits die Polymerasearbeit mit der üblichen, niedrigen Fehlerrate von 10^-4 beizubehalten, ist eine so niedrige Flußgeschwindigkeit erforderlich, daß keine wesentliche Verminderung der Gesamtzeit erzielt wird.

Eine durch den Erfindungsgedanken stark verbesserte Ausführungsform ist daher durch die Kapillarstruktur gegeben, wie sie in Fig. 4 gezeigt ist. Hier verzweigt sich die Kapillare ohne Verengungen im Wiederaufbaugebiet, daher ist hier die Fließgeschwindigkeit deutlich abge­ senkt. Es kann damit eine Verkürzung der Zeitdauer für die PCR-Amplifizierung erreicht wer­ den. Es ist ein Vorteil dieser Anordnung, daß in dieser Struktur wegen des kontinuierlichen Betriebes wechselnde Mengen an Reaktionslösung einer PCR-Amplifizierung unterworfen werden können, wobei allerdings der Zeitvorteil schwindet.

Diese Struktur hat jedoch auch Nachteile. Sie ist relativ lang und schmal (etwa 4 × 60 Millime­ ter), ungewöhnlich für ein Mikrosystem und sehr fragil, dazu starken, thermisch erzeugten Spannungen ausgesetzt. Diese Nachteile können zum Teil durch eine kreis- oder schleifenför­ mige Anordnung mit zentraler Heizung ausgeglichen werden, oder durch eine gefaltete Anord­ nung mit übereinanderliegenden Kapillarebenen, die zu einer Verkürzung der Gesamtstruktur führt. Ein weiterer Nachteil ist die strenge Festlegung der Anzahl von PCR-Zyklen, die durch die Anzahl der Strukturwiederholungen im Mikrosystemchip fest vorgegeben ist. Ein Nachteil ist auch die relativ lange Dauer des Gesamtprozesses einschließlich Entleerung, nachdem für die Front der durchlaufenden Reaktionslösung die Arbeit bereits beendet ist.

Es ist daher von Vorteil, ein größervolumiges Muster mit sehr feinen Kapillaren nur einmal zu füllen, die PCR-Reaktionen in der ruhenden Reaktionslösung durch zeitliche Temperaturzyklen ablaufen zu lassen, und die Struktur dann wieder einmalig zu entleeren.

Im Prinzip kann diese Art des Betriebes in einer einzigen, vielfach gefalteten, durchlaufenden Kapillare durchgeführt werden, dann ist aber der Vorgang des Füllens und Entleerens relativ lang. Füll- und Entleerungszeit sind nicht unbeträchtlich. So ist eine Kapillare mit einem Quer­ schnitt von 100 × 60 Mikrometern, die etwa 250 Nanoliter aufnehmen soll, bereits über 40 Millimeter lang, und benötigt, bei einer Füll- und Entleerungsgeschwindigkeit von 2 Millime­ tern pro Sekunde, bereits 40 Sekunden für diese Vorgänge. Schließen sich noch weitere Ver­ arbeitungsschritte an, so werden die Füll- und Entleerungszeiten prohibitiv groß.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist daher in Fig. 2a und 2b gezeigt. Es handelt sich um eine Vielzahl paralleler Kapillaren (3), die in der Mittelebene einer dünnen, mikrosy­ stemtechnischen Membran (6) liegen. Für eine streng gleichphasige Füllung sorgen zwei Ver­ teilersysteme (2, 4) zu Beginn und Ende der Parallelkapillaren, die für alle Zu- und Abführun­ gen der Parallelkapillaren die gleichen Fließwiderstände garantieren. Diese Kapillarstruktur wird zu Beginn der PCR-Amplifizierung gefüllt, danach befindet sich die Reaktionslösung in Ruhe. Die Heizelemente (7, 8) auf der Oberfläche der Membran können die Membran und mit ihr die Reaktionslösung in sehr kurzer Zeit aufheizen. So reichen etwa 2 Watt Heizleistung aus, um einen Temperaturanstieg um mehr als 100°C pro Sekunde zu erzeugen. Die Anstiege von der Primeranlagerungstemperatur (45°C) zur Wiederaufbautemperatur (72°C) und dann zur Schmelztemperatur (95°C) können in jeweils etwa ¼ Sekunde durchlaufen werden. Werden die Heizer beispielsweise durch einen hochfrequenten Wechselstrom betrieben, so können die Temperaturkoeffizienten in bekannter Weise zur Messung der Temperatur im Heizer selbst und somit zur Regelung des Heizvorganges benutzt werden.

Die Kühlung der Membran erfolgt bei dieser Ausführungsform über zwei vergoldete oder versilberte Kühlelemente aus Kupfer (9, 10), die durch eine elektromechanisch oder pneuma­ tisch erzeugte Bewegung an die Membran angepreßt werden und einen großflächigen thermi­ schen Kontakt herstellen. Eine mechanische Zwangskopplung der gegenläufigen Bewegungen beider Kühlkörper kann die Membran vor Beschädigungen schützen. Die Kühlelemente sind mit Kühlrippen versehen, die mit Umgebungsluft gekühlt werden. Für stärkere Kühlung kann auch eine einfache Wasserkühlung in Betracht gezogen werden. Die Wärmeabfuhr aus der dün­ nen Membran erfolgt dann in weniger als einer halben Sekunde.

Nach Beendigung der PCR-Amplifikation wird die Kapillarstruktur durch nachgeschobene Waschflüssigkeit entleert. Die DNA wird der Analyse zugeführt. Die Kapillarstruktur wird ausreichend gut gewaschen und steht für die nächste PCR-Amplifikation wieder zur Verfü­ gung.

Diese Kapillarstruktur in einer mikrosystemtechnischen Membran erlaubt keine wechselnden Volumina der verarbeiteten Reaktionslösung. Da für die Art der Analyse jedoch meist unver­ ändert feststehende Mengen benötigt werden, ist dieses kein gravierender Nachteil. Demgegen­ über erlaubt diese Struktur wechselnde Anzahlen von Vervielfältigungszyklen. Damit kann die DNA-Amplifizierung in vorteilhafter Weise an die Menge an DNA im Ausgangsmaterial ange­ paßt werden. Steht die DNA aus nur wenigen Zellen zur Verfügung, so können beispielsweise 32 Zyklen durchfahren werden, stammt die DNA dagegen aus einigen tausend Zellen, so mö­ gen 24 Zyklen genügen. Es ist daher diese Art der zeitlichen Temperaturvariation flexibler als die oben geschilderten Arten des Durchflusses der Reaktionslösung durch Ortsgebiete ver­ schiedener Temperatur. Auch können die ersten Zyklen langsamer ablaufen, um die Hybridisie­ rung zu erleichtern, und bei Erzeugung von genügend vielen kurzen DNA-Segmenten kann die Geschwindigkeit erhöht werden.

Die Analyse der amplifizierten DNA-Segmente kann beispielsweise massenspektrometrisch durch Ionisierung mit matrixunterstützter Laserdesorption (MALDI) in einem Flugzeitmassen­ spektrometer (TOF) erfolgen. Die DNA wird dazu zusammen mit geeigneten Matrixsubstan­ zen auf einen Probenträger aufgebracht. Die MALDI-Probenträger werden dann in an sich bekannter Weise der Ionenquelle des Massenspektrometers zugeführt, und die einzelnen DNA- Probenaufträge werden dort in ebenfalls bekannter Weise automatisch auf die Molekularge­ wichte der DNA-Segmente hin vermessen.

Alle oben geschilderten Kapillarsysteme bedürfen einer Desaktivierung der inneren Kapillaro­ berflächen, um die Polymerasearbeit nicht zu stören. Experimente haben ergeben, daß nackte Siliziumoberflächen die Polymerase sofort inaktiviert.

Die inneren Kapillaroberflächen müssen also mit desaktivierenden Schichten belegt werden. Sehr gute Belegungsverfahren für die Desaktivierung sind aus der Kapillargaschromatographie bekannt. Die dort verwendeten Glas- oder Quarzglaskapillaren haben ebenfalls sehr aktive, in diesem Fall adsorptionsaktive Oberflächen. Die Aktivität geht im wesentlichen von freien OH- Gruppen aus. Solche freien OH-Gruppen werden auch für die Störung der Polymerase verant­ wortlich gemacht.

Für die Kapillargaschromatographie sind die verschiedensten Belegungssubstanzen entwickelt worden. Da diese Substanzen die flüssige Phase dieser Art von Verteilungschromatographie bilden (die daher auch of GLC statt nur GC genannt wird), werden die Belegungssubstanzen hier einfach "Phasen" genannt. Dabei gibt es polare und unpolare Phasen, hydrophile und hy­ drophobe. Seit gut 20 Jahren haben sich sogenannte "chemically bonded phases" durchgesetzt, bei denen lange, fadenförmige Moleküle dicht an dicht wie Seegras einseitig an der Oberfläche chemisch kovalent gebunden sind. Diese Phasen sind temperaturstabil und langzeitbeständig.

Durch die parallele Anordnung der Phasenmoleküle läßt sich dabei jede gewünschte Anord­ nung zurechtschneidern. So kann eine oberflächlich hydrophile Schicht im Inneren hydrophob ausgestaltet werden. Die Dicke kann den Erfordernissen angepaßt werden. Die überwiegend als Standardphasen in der Gaschromatographie benutzten Silicongummiphasen sind allerdings für die PCR-Reaktionen weniger günstig, besser dagegen sind wachsartige Phasen, beispiels­ weise Carbowax.

In Zukunft werden Belegungen mit Biomaterialien wie Proteine, Lipidproteine oder Glycopro­ teine eine größere Rolle als Belegungsmaterialien spielen. Es ist bereits gelungen, solche Mole­ küle kovalent an Oberflächen von Metallen zu binden. Es ist zu erwarten, daß diese Bioma­ terialbelegungen noch günstiger als die chromatographischen Phasen für die Desaktivierung der Oberflächen für die Polymerasearbeit sind.

Es ist jedoch auch möglich, das Kapillarsystem mit mikrosystemtechnischen Mitteln aus poly­ meren Kunststoffen zu erzeugen. Es existieren Mikroabdruckverfahren, die von einer Silizi­ umstruktur als Matrize ausgehen. Durch bekannte Mikroschweiß- oder Mikroklebetechniken ist auch die Herstellung von dünnen Membranen mit eingelagerten Kapillaren möglich. Die fertigen Membranen können mit einem Widerstandsnetzwerk, bedruckt werden; auch die Auf­ bringung vom Metallschichten mit anschließendem Ätzen kann solche Widerstandsnetzwerke erzeugen.

Die Kunststoffe können zur Verbesserung der Wärmeleitfähigkeit mit metallischen Pulvern gefüllt werden, beispielsweise mit Nanopulver aus Silber.

Die beschriebenen Verfahren und Strukturen können natürlich vielfältig variiert werden. Es ist dem Fachmann ein leichtes, dem angegebenen Erfindungsgedanken folgend, weitere Kapillar­ strukturen und weitere Betriebsverfahren zu entwickeln.

So ist es beispielsweise möglich, RNA nach einem ersten Schritt einer Verdopplung mit "inver­ ser Transcriptase", die die RNA wieder in DNA komplementärer Sequenz zurückverwandelt, in der oben beschriebenen Weise als DNA zu vervielfältigen und anschließend zu analysieren. Auch dieser Prozess läßt sich in einer einheitlichen, mikrosystemtechnisch hergestellten Appa­ ratur durchführen. Auch weitergehende Veränderungen oder Derivatisierungen der DNA mit dem Ziel, besser analysierbare Ausgangsprodukte für die Analyse zu erhalten, kann in dazu speziell angepaßten, mikrosystemtechnisch hergestellten Geräten durchgeführt werden.

Claims (17)

1. Verfahren für die Vervielfältigung von DNA durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) in einem Reaktionsgefäß, in dem in bekannter Weise eine Reaktionslösung nacheinander zyklisch wiederholt die drei Temperaturen für Schmelzen, Primeranlagerung und Wieder­ aufbau annehmen muß, dadurch gekennzeichnet,
daß (a) das Reaktionsgefäß aus feinen Kapillaren besteht und zumindest partiell aus meh­ reren parallelen Kapillaren mit gemeinsamem Eingang und gemeinsamem Ausgang aufge­ baut ist, und
daß (b) die Reaktionslösung während des Wiederaufbaus der doppelsträngigen DNA in den Kapillaren ruht oder maximal mit einer Fließgeschwindigkeit fließt, die zehn Kapillar­ durchmesser pro Sekunde nicht überschreitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des Reaktionsge­ fäßes kleiner als ein Mikroliter ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kapillar aufgebaute Reaktionsgefäß mikrosystemtechnisch aus Siliziumwafern herausgear­ beitet und daß die Oberfläche der Kapillaren durch Beschichtung mit organischem, PCR­ freundlichen Material inert gemacht worden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle der Beschichtung an die Oberfläche des Siliziums chemisch gebunden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschichtung an sich be­ kannte chromatographische Phasen verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschichtung die besonders unpolare Phase Carbowax® benutzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Be­ schichtung der Kapillarenoberflächen die besonders PCR-freundlichen Proteine oder Gly­ co-Proteine der Zellmembranen verwendet werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das kapillare Reaktionsgefäß mit mikrosystemtechnischen Herstellungsmethoden aus polymeren Kunst­ stoffen hergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das kapillare Reaktionsgefäß aus Polyethylen oder Polypropylen gefertigt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die polyme­ ren Kunststoffe mit Partikeln eines thermisch gut leitenden Metalls gefüllt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Silberpulver zur Füllung be­ nutzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Innen­ oberflächen der Kapillaren durch Beschichtung desaktiviert werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) in einem System nacheinander durchlaufbarer Zonen eines kapillare Reaktionsgefäßes in einem mikrosystemtechnischen Substrat die einzelnen Zonen durch einen geregelten Wärmefluß durch das Substrat stationär auf den Temperaturen für die drei Phasen Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau gehalten werden, daß
• b) diese Zonen für Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau von der Reaktionslö­ sung nacheinander mit in etwa konstantem Fluß durchlaufen werden, und daß
• c) in der Zone für den Wiederaufbau die Strömungsgeschwindigkeit durch eine Mehrzahl parallel angelegter Kapillaren erniedrigt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) in einem System nacheinander durchlaufbarer Zonen eines kapillaren Reaktionsgefäßes in einem mikrosystemtechnischen Substrat die einzelnen Zonen durch einen geregelten Wärmefluß durch das Substrat stationär auf den Temperaturen für die drei Phasen Schmelzen, Primeranlagerung und Wiederaufbau gehalten werden, daß
• b) diese Zonen des kapillaren Systems etwa von gleichem Volumen sind, und daß
• c) sie von der Reaktionslösung nacheinander in getakteten Schüben so durchlaufen wer­ den, daß während des Wiederaufbaus keine oder nur sehr geringe Strömung herrscht.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) die PCR-Amplifikation in einem Reaktionsgefäß abläuft, das aus mehreren parallelen Kapillaren besteht, die durch ein kapillares Verteilersystem gleichmäßig und schnell befüllt und wieder geleert werden können und in denen die nach einmaliger Zufuhr ruhende Re­ aktionslösung nacheinander zyklisch wiederholt auf die drei Temperaturstufen gebracht wird, daß
• b) die parallelen Kapillaren des Reaktionsgefäßes innerhalb einer dünnen, mikrosystem­ technischen Membran angeordnet sind, daß
• c) die Membran und mit ihr die Reaktionslösung in jedem Zyklus durch oberflächlich auf­ gebrachte Heizelemente sehr schnell von der Primeranlagerungstemperatur auf die Tempe­ raturen des Wiederaufbaus der Doppelhelix und dann des Schmelzens gebracht wird, und daß
• d) die Membran und mit ihr die Reaktionslösung in jedem Zyklus nach dem Schmelzen durch bewegliche Kühlelemente, die in thermischen Kontakt mit der Membran gebracht werden, oder durch Wasserkühlung sehr schnell auf die Primeranlagerungstemperatur ab­ gekühlt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran dünner als ein Millimeter ist.

17. Mikrosystemtechnische Anordnung zur Durchführung eines der Verfahren nach den An­ sprüchen 1 bis 16, enthaltend eine feine Kapillarstruktur mit eng benachbarten Heizele­ menten, wobei die Kapillaren eine inerte Oberfläche aufweisen.