DE19830478A1 - Assay for alkaline phosphatase based on measuring absorption or luminescence of azo dye especially in immunoassays - Google Patents

Assay for alkaline phosphatase based on measuring absorption or luminescence of azo dye especially in immunoassays

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DE19830478A1
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Karl-Juergen Halbhuber
Reimar Krieg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase

Abstract

Assay for alkaline phosphatase (AP) in a sample comprises contacting the sample with an aromatic phosphate, diazotizing the resulting phenol in situ to form an azo dye, adding an additive that increases the degree of dispersion (precipitation fineness) of the dye, and measuring the absorption or luminescence of the dye.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von alkalischer Phosphatase und Phosphatasekonjugaten. Der Nachweis von Substanzen (Analyt) mit Reagenzien ist im wesentlichen an drei Voraussetzungen gebunden, wenn eine untere Nachweisgrenze im nano- bis femtomolaren Bereich erzielt und strukturell ähnliche Stoffe nicht mit gemessen werden sollen: (1) eine hohe Affinität des Reagenzes zum Analyten, (2) eine hochspezifische und stabile Analyt-Reagenz Bindung und (3) ein hochempfindlicher Nachweis des Reaktionsproduktes.The invention relates to a method for the detection of alkaline Phosphatase and phosphatase conjugates. The detection of substances (Analyte) with reagents has three main requirements bound if a lower detection limit in the nano- to femtomolar Area achieved and structurally similar substances are not measured should: (1) a high affinity of the reagent for the analyte, (2) a highly specific and stable analyte-reagent binding and (3) highly sensitive detection of the reaction product.

Die Forderungen an die Affinität und Spezifität werden sehr gut von Antikörpern mit Affinitätskonstanten zwischen 1010 und 1012 L/mol erfüllt. Diese sind in der Lage, feinste Strukturunterschiede auf molekularer Ebene zu erkennen.The requirements for affinity and specificity are met very well by antibodies with affinity constants between 10 10 and 10 12 L / mol. These are able to recognize the finest structural differences at the molecular level.

Moderne Detektionsverfahren der gebildeten Analyt-Antikörper-Komplexe führten neben Radioimmunoassays (RIA; H. G. Eckert, Angew. Chem. 1976, 88, 565) zunehmend zur Verwendung von Enzymimmunoassays (EJA; Nonisotopic Jmmunoassay [Herausg. T. T. Ngo], Plenum, New York; 1988; Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules [Herausg. C. Kessler], Springer, Berlin. 1992). Dabei katalysiert jedes Enzymmolekül eine Vielzahl von speziellen chemischen detektierbaren Spezies, was gegenüber der direkten Antikörper-Signalgeber-Kopplung einen zusätzlichen Signalverstärkungsmechanismus bewirkt.Modern detection methods of the analyte-antibody complexes formed performed radioimmunoassays (RIA; H. G. Eckert, Angew. Chem. 1976, 88, 565) increasingly for the use of enzyme immunoassays (EJA; Nonisotopic Jmmunoassay [Ed. T. T. Ngo], Plenum, New York; 1988; Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules [Ed. C. Kessler], Springer, Berlin. 1992). Every enzyme molecule catalyzes a variety of special chemical detectable species what an additional one compared to the direct antibody-signal generator coupling Signal amplification mechanism causes.

Die für die Detektion entscheidende signalgebende Komponente kann wiederum in einer nachgeschalteten Reaktion gebildet werden. Durch derartige Kupplungsreaktionen lassen sich in Analogie zur Enzymkatalyse nochmals beträchtliche Empfindlichkeitssteigerungen erzielen.The signaling component that is decisive for the detection can  again be formed in a downstream reaction. By Coupling reactions of this type can be carried out in analogy to enzyme catalysis again achieve considerable increases in sensitivity.

Die drei wichtigsten zur Detektion herangezogenen Markerenzyme sind die Meerrettichperoxidase (HRP), die alkalische Phosphatase (AP) und die β-D- Galactosidase (GAL). Die HRP hat das kleinste Molekulargewicht und sorgt demzufolge für die geringsten sterischen Probleme, ist aber empfindlich gegenüber häufig eingesetzten antimikrobiellen Agentien Enzymsubstraten (A. Mayer, S. Neuenhofer; Angew. Chem. 1994, 106, 1097-1126). Demgegenüber vereint die alkalische Phosphatase die Vorzüge hoher chemischer Stabilität und der größten katalytischen Aktivität. Sie hat deswegen heute als Marker-Enzym überragende praktische Bedeutung.The three most important marker enzymes used for detection are Horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP) and β-D- Galactosidase (GAL). The HRP has the smallest molecular weight and provides consequently for the slightest steric problems, but is sensitive against commonly used antimicrobial agents enzyme substrates (A. Mayer, S. Neuenhofer; Angew. Chem. 1994, 106, 1097-1126). In contrast, the alkaline phosphatase combines the advantages of higher chemical stability and the greatest catalytic activity. she has therefore today of outstanding practical importance as a marker enzyme.

Die empfindlichsten Enzym-Detektionsmethoden arbeiten heute mit chromogenen oder besser luminogenen Enzymsubstraten (Übersicht: A. Mayer, S. Neuenhofer; Angew. Chem. 1994, 106, 1097-1126) und somit mit Photonen als finalen Informationsträger, da hier inzwischen empfindliche Detektoren zur Verfügung stehen. Die Detektion des Analyten wird dabei auf Lichtmessungen in Form von Absorption (chromogene Methoden) bzw. Emission (luminogene Methoden) zurückgeführt. Bei den luminogenen Methoden unterscheidet man zwischen Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemie- und Biolumineszenz sowie Elektrolumineszenz, wobei heute die fluoreszenzspektroskopischen Methoden dominieren und hierbei wiederum zunehmend Methoden mit Laseranregung an Bedeutung erlangen.The most sensitive enzyme detection methods work today chromogenic or better luminogenic enzyme substrates (overview: A. Mayer, S. Neuenhofer; Appl. Chem. 1994, 106, 1097-1126) and thus with photons as the final information carrier, since they are now sensitive Detectors are available. The detection of the analyte is based on Light measurements in the form of absorption (chromogenic methods) or Emission (luminogenic methods) attributed. With the luminogenic Methods differentiate between fluorescence, phosphorescence, Chemical and bioluminescence as well as electroluminescence, whereby today fluorescence spectroscopic methods dominate and here again Methods with laser excitation are becoming increasingly important.

Die Leistungsfähigkeit einer Analytbestimmung ergibt sich somit aus der Summe des gesamten Eigenschaftsspektrums oben aufgezeigter Reaktions­ kette. Soll der betreffende Analyt nicht nur hochspezifisch und hochempfindlich, sondern auch ortsgetreu lokalisiert werden, schränkt sich die Vielzahl der prinzipiell bekannten Reagenzien und Methoden stark ein, da zusätzliche Anforderungen an die physikalisch-chemischen Eigenschaften der intermediären und finalen Produkte hinzu kommen: Die eingesetzten Edukte sollten möglichst gut wasserlöslich sein, während die Produkte der enzymatischen Endreaktion möglichst absolut unlöslich und diffusionsstabil sein müssen. Die zu detektierenden Luminochrome müssen intrinsisch ein möglichst feinamorphes Präzipitationsverhalten besitzen, so daß die ursprüngliche Analyt-Verteilung auch ortsgetreu widergespiegelt wird. Dies ist vor allem in Zellen und Geweben entscheidend und, wie unten näher erläutert, bislang nicht oder nur sehr eingeschränkt für einige Fluorochrome gegeben. Die meisten anderen Lumineszenz-Methoden scheiden für histochemische Anwendungen wegen prinzipieller Gründe aus, so vor allem auch wegen des sehr begrenzten Detektionszeitraumes.The performance of an analyte determination therefore results from the Sum of the entire property spectrum of the reaction shown above Chain. Should the analyte in question not only be highly specific and highly sensitive, but also localized, is limited the large number of reagents and methods known in principle strongly because  additional requirements for the physico-chemical properties of the there are also intermediate and final products: the educts used should be as water soluble as possible, while the products of enzymatic final reaction as absolutely insoluble and diffusion stable as possible have to be. The luminochromes to be detected must be intrinsic have as fine an amorphous precipitation behavior so that the original analyte distribution is also reflected in the correct location. This is especially critical in cells and tissues and, as detailed below explained, so far not or only very limited for some fluorochromes given. Most other luminescence methods are in favor histochemical applications because of basic reasons, especially also because of the very limited detection period.

Die Eignung eines Farbstoffes als Fluoreszenzmarker ist an wichtige weitere Voraussetzungen geknüpft: Nur sehr wenige Farbstoffe besitzen gleichzeitig eine große Differenz zwischen Anregungs- und Emissionswellenlänge (Stokes-shift) bei gleichzeitig hoher Fluoreszenzquantenausbeute (z. B. R. P. Haugland, in: Optical Microscopy for Biology; Herausg. B. Hermann, K. Jacobson, Wiley-Liss, 143-157, 1990).The suitability of a dye as a fluorescent marker is important Preconditions linked: Very few dyes have at the same time a big difference between excitation and emission wavelength (Stokes shift) with a high fluorescence quantum yield (e.g. R. P. Haugland, in: Optical Microscopy for Biology; Ed. B. Hermann, K. Jacobson, Wiley-Liss, 143-157, 1990).

Da heute gebräuchliche Scanner, konfokale Laser-Mikroskope oder Flow- Cytometer häufig mit Argon- und Helium/Neon-Lasern arbeiten, bleibt die Anregung von grünen, gelben, orangen oder rot fluoreszierenden Farbstoffen vor allem auf die 488 nm, 514 nm und 543 nm Spektrallinien beschränkt (R. P. Haugland; Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; 6th ed., 1996, Molecular Probes Inc., Eugene).As scanners, confocal laser microscopes or flow Cytometers often work with argon and helium / neon lasers Excitation of green, yellow, orange or red fluorescent dyes mainly limited to the 488 nm, 514 nm and 543 nm spectral lines (R.P. Haugland; Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; 6th ed., 1996, Molecular Probes Inc., Eugene).

Viele Fluorochrome besitzen eine relativ geringe Fotostabilität ("fading"). Diese kann durch spezielle Zusätze (anti-fading agents), wie vor allem 4-Phenylendiamin (PPD), n-Propylgallat (NPG) oder auch 1,4-Diaza­ bicyclo[2,2,2]octan (DABCO), in einigen Fällen bedingt verbessert werden (vergleichende Übersichten für unterschiedliche Medien: A. Longin, C. Souchier, M. French, P.-A. Bryon; J: Histochem. Cytochem., 1993, 41, 1833-1840; und: K. D. Krenik, G. M. Kephart, K. P. Offord, S. L. Dunette, G. J. Gleich; J. Immunol. Methods, 1989, 117, 91-97).Many fluorochromes have a relatively low photo stability ("fading"). This can be done by special additives (anti-fading agents), especially 4-phenylenediamine (PPD), n-propyl gallate (NPG) or 1,4-diaza bicyclo [2,2,2] octane (DABCO), in some cases can be improved conditionally  (Comparative overviews for different media: A. Longin, C. Souchier, M. French, P.-A. Bryon; J: Histochem. Cytochem., 1993, 41, 1833-1840; and: K. D. Krenik, G. M. Kephart, K. P. Offord, S. L. Dunette, G. J. Gleich; J. Immunol. Methods, 1989, 117, 91-97).

Ein weiteres Problem ist das Auftreten von unspezifischer "Hintergrund­ fluoreszenz", welche die Nachweisempfindlichkeit und Spezifität u. U. stark beeinträchtigt. Unspezifische Fluoreszenz kann je nach Art der Generierung des Fluorochroms im signalgebenden Schrift unterschiedliche Ursachen haben:
Another problem is the occurrence of non-specific "background fluorescence", which affects detection sensitivity and specificity. U. severely impaired. Non-specific fluorescence can have different causes depending on how the fluorochrome is generated in the signaling font:

  • 1. Das Fluorochrom entsteht unmittelbar durch die in der vom Enzymmarker Phosphatase katalysierte Reaktion durch Spaltung der (Substrat-O)- PO3H2-Bindung unter Freisetzung von Substrat-OH (Fluorochrom) und H3PO4. Für eine effiziente und artefaktfreie Präzipitation müssen Substratphosphat und freies Substrat-OH signifikante Löslichkeits­ unterschiede aufweisen, was nur selten gegeben ist (siehe Beispiele unten). Gleichzeitig muß das Substrat(phoshat) unter den jeweilen Anwendungsbedingungen ausreichend löslich, hydrolytisch stabil und ein potentes Phosphatasesubstrat mit ausreichend reaktiver (Substrat-O)- PO3H2-Bindung sein.1. The fluorochrome is formed directly by the reaction catalyzed by the enzyme marker phosphatase by cleaving the (substrate-O) - PO 3 H 2 bond with the release of substrate-OH (fluorochrome) and H 3 PO 4 . For an efficient and artifact-free precipitation, substrate phosphate and free substrate-OH must show significant solubility differences, which is rarely the case (see examples below). At the same time, the substrate (phosphate) must be sufficiently soluble, hydrolytically stable and a potent phosphatase substrate with a sufficiently reactive (substrate-O) - PO 3 H 2 bond under the respective application conditions.
  • 2. Die signalgebende Komponente wird erst in einer nachgeschalteten Kupplungsreaktion nach Spaltung der (Substrat-O)-PO3H2-Bindung aus Substrat-OH generiert. Dies führt dann entweder2. The signal-generating component is only generated in a downstream coupling reaction after cleavage of the (substrate-O) -PO 3 H 2 bond from substrate-OH. This either leads
  • a) direkt zum detektierbaren Fluorochrom (siehe Beispiele unten) oder ersta) directly to the detectable fluorochrome (see examples below) or first
  • b) indirekt im Zuge weiterer amplifizierender oder katalytischer Reaktionszyklen (siehe Übersicht in: A. Mayer, S. Neuenhofer; Angew. Chem., 1994, 106, 1097-1126). Die Freisetzung bzw. Aktivierung eines lumineszenten Markers schließt sich dann nach den oben genannten Prinzipien an.
    Im Gegensatz zur direkten Methode (Punkt 1) sind hier die Anforderungen an die Unterschiede der physikalischen Eigenschaften von Substrat(phos­ phat) und freiem Substrat-OH nicht so hoch - vorausgesetzt, die anschließende Kupplungsreaktion verläuft ausreichend effizient. Dies setzt wiederum einen ausgeprägten Wechsel der chemischen Reaktivität von Substrat(phosphat) und freiem Substrat gegenüber dem angreifenden Kopplungs-Agenz voraus und ist häufig mit guten Erfolg realisierbar. Entsteht dabei das Fluorochrom erst durch Ausbildung der Substrat-Agenz- Bindung, läßt sich unspezifische Fluoreszenz prinzipiell weitgehend zurückdrängen. Unspezifische Fluoreszenz ist dann auf analoge Nebenreaktionen zurückzuführen, z. B. mit zellulären Bestandteilen. Durch gezielte Wahl der kuppelnden Agenzien und ihrer Anwendungs­ bedingungen sollte dieser Effekt aber prinzipiell variabel und effektiv beeinflußbar sein oder sich gar unterdrücken lassen.    b) indirectly in the course of further amplifying or catalytic reaction cycles (see overview in: A. Mayer, S. Neuenhofer; Angew. Chem., 1994, 106, 1097-1126). The release or activation of a luminescent marker then follows the principles mentioned above.
    In contrast to the direct method (point 1), the requirements for the differences in the physical properties of substrate (phosphate) and free substrate OH are not so high - provided the subsequent coupling reaction is sufficiently efficient. This in turn requires a pronounced change in the chemical reactivity of the substrate (phosphate) and the free substrate with respect to the attacking coupling agent and can often be achieved with good success. If the fluorochrome arises only through the formation of the substrate-agent bond, unspecific fluorescence can in principle be largely suppressed. Nonspecific fluorescence is then due to analog side reactions, e.g. B. with cellular components. Through targeted selection of the coupling agents and their conditions of use, this effect should, in principle, be variable and effectively influenced or even suppressed.

Bislang sind beide Methoden mit verschieden Fluorochromen und mit unterschiedlichem Erfolg zur Lokalisation von Phosphataseaktivität eingesetzt worden (Übersichten zu Fluorochromen in der biochemischen Analytik: A. P. de Silva, H. Q. N. Gunaratne, T. Gunlaugsson, A. J. M. Huxley, C. P. McCoy, J. T. Rademacher, T. E. Rice, Chem. Rev. 1997, 97, 1515-1586; B. M. Krasovitskii, B. M. Bolot, Organic Luminescent Materials, VCH Weinheim, 1988; in Immunochemie: R. S. Davidson, M. M. Hilchenbach, J. Photochem. Photobiol. 1990, 52, 431-438; in lebender Zelle: R. P. Haugland, I. D. Johnson, J: ofFluorescence, 1993, 3, 119-127):So far, both methods are with different fluorochromes and with different success used to localize phosphatase activity (overviews of fluorochromes in biochemical analysis: A. P. de Silva, H. Q. N. Gunaratne, T. Gunlaugsson, A. J. M. Huxley, C. P. McCoy, J. T. Rademacher, T. E. Rice, Chem. Rev. 1997, 97, 1515-1586; B. M. Krasovitskii, B. M. Bolot, Organic Luminescent Materials, VCH Weinheim, 1988; in immunochemistry: R. S. Davidson, M. M. Hilchenbach, J. Photochem. Photobiol. 1990, 52, 431-438; in living cell: R.P. Haugland, I.D. Johnson, J: ofFluorescence, 1993, 3, 119-127):

Methode 1Method 1

  • - Klassische Methoden nutzten die enzymatische Spaltung Naphthol­ phosphaten zu den schwerer löslichen fluoreszenzaktiven Naphtholen (M.S. Burstone, J: Natl. Cancer Inst. 1960, 24, 1199; M. S. Burstone, in: Enzyme histochemistry and its application in the study of neoplasms, Academic Press, New York, 1962). Die so erzielten Resultate sind aber durch grobe Präzipitation und Diffüsionsartefakte stark beeinträchtigt (Z. Huang, W. You, R. Rosaria, P. Haugland, V. B. Paragas, N. A. Olson, R. P. Haugland, J. of Histochem. Cytochem. 1993, 41, 313-317).
    In Weiterentwicklung dieser Methodik wurden auch Derivate des Anthracens, Cumarins und Perylens hinsichtlich ihrer Sensitivität, Substantivität sowie relativen Fluoreszenzintensität untersucht (S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, N. Kagiyama, S. H. Hori, T. Toru; Anal. Chem. 1994, 66, 1347-1353). Nachteile der einzelnen Reagenzien wie Diffusionsartefakte, ungünstige Fluoreszenzeigenschaften oder Inertheit der Substrat-Phosphat-Bindung führten im Ergebnis dieser Unter­ suchungen zur Favorisierung des Phosphats von N-(4-Biphenylyl)-naphth- 3-ol-2-carbonsäureamid mit den geringsten Nachteilen, aber nur bedingt praxistauglicher Substantivität (N. Kagiyama, S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, M. Nishiyauch, S. H. Hori, Acta Histochem. Cytochem. 1995, 28, 581-589).
    Patentliteratur zur Phosphatasebestimmung mittels präzipitierender fluoreszenter Naphtolphosphate: DE 41 42 076, DE 40 41 880, US 4 889 798, DE 41 25 904, EP 0 401 813, US 5 532 125. Weit darüber hinausgehende zahlreiche Substituentenmuster sowie analoge Anthracene, Pyrene, Stilbene und Herteroaromaten wurden beschrieben in: US 5 484 700, JP 2 413 201, US 5 470 710; Anthracene: US 5 385 823.    - Classic methods used the enzymatic cleavage of naphthol phosphates to the less soluble fluorescent-active naphthols (MS Burstone, J: Natl. Cancer Inst. 1960, 24, 1199; MS Burstone, in: Enzyme histochemistry and its application in the study of neoplasms, Academic Press , New York, 1962). However, the results obtained in this way are severely impaired by coarse precipitation and diffusion artifacts (Z. Huang, W. You, R. Rosaria, P. Haugland, VB Paragas, NA Olson, RP Haugland, J. of Histochem. Cytochem. 1993, 41, 313-317).
    In further development of this methodology, derivatives of anthracene, coumarin and perylene were also examined with regard to their sensitivity, substantivity and relative fluorescence intensity (S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, N. Kagiyama, SH Hori, T. Toru; Anal. Chem. 1994, 66, 1347-1353). Disadvantages of the individual reagents such as diffusion artifacts, unfavorable fluorescence properties or inertness of the substrate-phosphate bond resulted in the results of these studies in favor of the phosphate of N- (4-biphenylyl) -naphth-3-ol-2-carboxamide with the least disadvantages, but only limited practicality (N. Kagiyama, S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, M. Nishiyauch, SH Hori, Acta Histochem. Cytochem. 1995, 28, 581-589).
    Patent literature for the determination of phosphatase by means of precipitating fluorescent naphthalene phosphates: DE 41 42 076, DE 40 41 880, US 4 889 798, DE 41 25 904, EP 0 401 813, US 5 532 125. Numerous substituent patterns as well as analogous anthracenes, pyrenes, stilbenes go far beyond this and herteroaromatics have been described in: US 5,484,700, JP 2,413,201, US 5,470,710; Anthracenes: US 5,385,823.
  • - Molecular Probes Inc. (Eugene, USA) entwickelte und patentierte präzipitierende Phosphatase-Substrate auf Basis von 4-(3H)- Chinazolinonen, Benzimidazolen, Benzothiazolen, Benzoxazolen, Chinolinen und Phenanthridinen (US 5 316 906 und US 5 443 986, EP 0 641 351).
    Das gelbgrün fluoreszierende Chinazolin-Derivat Elf-97 [2-(5'-Chloro-2'- hydroxyphenyl)-6-chloro-4-(3H)-chinazolinon-2-phosphat] ist derzeit das einzige kommerziell vertriebene präzipierende fluorogene Phosphatase- Substrat. Hinsichtlich seiner Fluoreszenz-Eigenschaften nimmt es derzeit eine Spitzenstellung ein: Der Stokes-shift ist mit über 100 nm außer­ ordentlich groß und wird nur von wenigen anderen Fluorochromen wie (leichter löslichen) Lanthanoid-Derivaten noch deutlich übertroffen. Die Photostabilität ist um Größenordnungen besser als die von etablierten klassischen Fluorochromen wie z. B. Fluoreszein (J. Histochem. Cytochem. 1995, 43, 77).
    Leider führt das Präzipitationsverhalten der Elf-97-Produkte nur zu feingranulär-kristallinen Produkten, welche Orte von Enzymaktivität licht- oder lasermikroskopisch nur unbefriedigend und undifferenziert widerspiegeln. Eine Verbesserung durch präzipitationsbeeinflussende Zusätze ist nach unseren Erfahrungen auf Grund der ausgeprägten intrinsischen Kristallisationsneigung praktisch nicht möglich. Außerdem ist das Reagenz (als Phosphat) nur mäßig wasserlöslich. Anwendungen zur immunhistochemischen Lokalisation von alkalischer Phosphataseaktivität wurden inzwischen beschrieben, ihre Vor- und Nachteile diskutiert (Z. Huang, W. You, R. Rosaria, P. Haugland, V. B. Paragas, N. A. Olson, R.P.Haugland, J. of Histochem. Cytochem. 1993, 41, 313-317; V. B. Paragas, Y.-Z. Zhang, R. P. Haugland, V. L. Singer; ebenda, 1997, 45, 345-357) und dabei auch ein vergleichsweise langsames Reaktionsverhalten festgestellt (C. Avivi, O. Rosen, R. S. Goldstein, J. of Histochem. Cytochem. 1994, 42, 551-554).    - Molecular Probes Inc. (Eugene, USA) developed and patented precipitating phosphatase substrates based on 4- (3H) - quinazolinones, benzimidazoles, benzothiazoles, benzoxazoles, quinolines and phenanthridines (US 5 316 906 and US 5 443 986, EP 0 641 351).
    The yellow-green fluorescent quinazoline derivative Elf-97 [2- (5'-chloro-2'-hydroxyphenyl) -6-chloro-4- (3H) -quinazolinone-2-phosphate] is currently the only commercially available precipitating fluorogenic phosphatase- Substrate. With regard to its fluorescence properties, it currently occupies a top position: the Stokes shift is extraordinarily large at over 100 nm and is only significantly exceeded by a few other fluorochromes such as (more soluble) lanthanoid derivatives. The photostability is orders of magnitude better than that of established classic fluorochromes such as. B. Fluorescein (J. Histochem. Cytochem. 1995, 43, 77).
    Unfortunately, the precipitation behavior of the Elf-97 products only leads to fine-granular-crystalline products, which reflect sites of enzyme activity only unsatisfactorily and undifferentiated under light or laser microscopy. In our experience, an improvement due to additives influencing precipitation is practically not possible due to the pronounced tendency to crystallize intrinsically. In addition, the reagent (as phosphate) is only moderately water-soluble. Applications for the immunohistochemical localization of alkaline phosphatase activity have been described, their advantages and disadvantages have been discussed (Z. Huang, W. You, R. Rosaria, P. Haugland, VB Paragas, NA Olson, RPHaugland, J. of Histochem. Cytochem. 1993 , 41, 313-317; VB Paragas, Y.-Z. Zhang, RP Haugland, VL Singer; ibid., 1997, 45, 345-357) and also found a comparatively slow reaction behavior (C. Avivi, O. Rosen, RS Goldstein, J. of Histochem. Cytochem. 1994, 42, 551-554).
  • - Gut lösliche Fluorochrome wurden mit hydrophoben Substituenten im Sinne der hier diskutierten Zielstellung modifiziert, so z. B. 5-Amino­ fluoreszein als 5-(4-biphenylcarboxamido)- oder besser 3-Aralkylkoxy-5- (4-biphenylcarboxamido)- und 3-Aralkylkoxy-5-(N-3,5-dimethylphenyl) thioureido-fluoreszein-phosphat (Acta Histochem. Cytochem. 1997, 30, 165-172).- Easily soluble fluorochromes were mixed with hydrophobic substituents in the Modified sense of the objective discussed here, such. B. 5-amino fluorescein as 5- (4-biphenylcarboxamido) - or better 3-aralkylkoxy-5- (4-biphenylcarboxamido) - and 3-aralkylkoxy-5- (N-3,5-dimethylphenyl)  thioureido fluorescein phosphate (Acta Histochem. Cytochem. 1997, 30, 165-172).
  • - 5,10,15,20-Tetrakis(phosphonooxyphenyl)porphin wurde beschrieben (T. Kawakami, S. Igarashi, Analyst, 1995, 120, 539-542) und als AP- Substrat eingesetzt. Einer Anwendung in der Histochemie dürften die zu geringen Löslichkeitsunterschiede von Edukt und Produkt sowie für photometrische Zwecke der trotz Abspaltung von maximal vier Phosphat­ gruppen je Molekül nur kleine Stokes- shift (ca. 10-15 nm) entgegen stehen.- 5,10,15,20-tetrakis (phosphonooxyphenyl) porphin has been described (T. Kawakami, S. Igarashi, Analyst, 1995, 120, 539-542) and as AP- Substrate used. They are likely to be used in histochemistry low solubility differences between the starting material and the product as well as for photometric purposes despite the elimination of a maximum of four phosphate groups only small Stokes shift (approx. 10-15 nm) per molecule stand.
  • - Andere potentiell schwerlösliche oder pigmentbildende und langwellig anregbare Fluorochrome haben trotz z. T. sehr großer Stokes-shift's aus unterschiedlichen Gründen keine praktische Bedeutung erlangt. Als Beispiele mit direktem fluoreszenzdiagnostischen Hintergrund, zumeist in anderem Zusammenhang, seien genannt: Squaraine (H. Meier, U. Dullweger, J. Org. Chem. 1997, 62, 4821-4826; M. L. Cano, F. L. Cozens, M. A. Esteves, F. Marquez, H. Garzia; ebenda 7121-7127; K.-Y. Law, J. S. Facci, F. C. Balley, J. F. Yanus, J. of Imaging Science, 1990, 34, 31-38; E. Terpetsching, H. Szmacinski, J. R. Lakowicz; Anal. Chim. Acta 1993, 282, 633-641), Oxazone (T. A. Brugel, B. W. Williams, J. of Fluorescence 1993, 3, 69-76), Benzofurane (K. Imai, S. Uzu, S. Kanda, Analytica Chim. Acta 1994, 290, 3-20), Perylen-Derivate (DE 30 16 764; DE 39 35 257 ; H. Kaiser, J. Lindner, H. Langhals, Chem. Ber. 1991, 124, 529-534; C. Aubert, J. Fünfschilling, I. Zschokke- Gränacher, H. Langhals; Fresenius Z. Anal. Chem. 1985, 320, 361-364; M. C. Carre, T. Reis, E. Sousa, F. Baros, M. L. Viriot, J. C. Andre, J: of Fluorescence 1997, 7, 83-86; J. Dapprich, N. G. Walter, F. Salingue, H. Staerk, ebenda 87-89), heteroanaloge Indigofarbstoffe, wie z. B. Oxindigo (H. Langhals, B. Wagner, Angew. Chem. 1996, 108, 1090-1093).- Other potentially sparingly soluble or pigment-forming and long-wave stimulable fluorochromes have z. T. very large Stokes shift's not gaining practical importance for various reasons. As Examples with a direct fluorescence diagnostic background, mostly in other context, may be mentioned: Squaraine (H. Meier, U. Dullweger, J. Org. Chem. 1997, 62, 4821-4826; M. L. Cano, F.L. Cozens, M.A. Esteves, F. Marquez, H. Garzia; ibid. 7121-7127; K.-Y. Law, J.S. Facci, F.C. Balley, J.F. Yanus, J. of Imaging Science, 1990, 34, 31-38; E. Terpetsching, H. Szmacinski, J.R. Lakowicz; Anal. Chim. Acta 1993, 282, 633-641), Oxazone (T. A. Brugel, B. W. Williams, J. of Fluorescence 1993, 3, 69-76), Benzofurane (K. Imai, S. Uzu, S. Kanda, Analytica Chim. Acta 1994, 290, 3-20), perylene derivatives (DE 30 16 764; DE 39 35 257; H. Kaiser, J. Lindner, H. Langhals, Chem. Ber. 1991, 124, 529-534; C. Aubert, J. Fünfschilling, I. Zschokke- Gränacher, H. Langhals; Fresenius Z. Anal. Chem. 1985, 320, 361-364; M.C. Carre, T. Reis, E. Sousa, F. Baros, M.L. Viriot, J.C. Andre, J: of Fluorescence 1997, 7, 83-86; J. Dapprich, N.G. Walter, F. Salingue, H. Staerk, ibid. 87-89), heteroanalogous indigo dyes, e.g. B. Oxindigo (H. Langhals, B. Wagner, Angew. Chem. 1996, 108, 1090-1093).
Methode 2Method 2

Um die Nachteile obigen Verfahrens (möglichst gute Löslichkeit der AP- Substrate versus hohe Substantivität der gebildeten Fluorochrome, Problem Präzipitationsverhalten) zu umgehen, wurden unterschiedliche Kupplungs­ techniken erprobt, da diese prinzipiell eine leichtere Adaptierbarkeit der geforderten physiko-chemischen Eigenschaften an Reaktivität und Fluoreszenzeigenschaften ermöglichen:
In order to avoid the disadvantages of the above process (the best possible solubility of the AP substrates versus high substantivity of the fluorochromes formed, problem of precipitation behavior), different coupling techniques were tested, since in principle these enable the required physico-chemical properties to be more easily adapted to reactivity and fluorescence properties:

  • - Calcium bindende Fluorochrome, wie Calcein (2',7'-Bis-[N,N-bis (carboxymethyl)-aminomethyl]fluoreszein), Calceinblau (7-Hydroxy-4- methyl-8-cumarinylmethylimino-diessigsäure) oder Xylenolorange (o- Kresolsulfonphthalein-3',3''-bis-methylimino-diessigsäure) mit blauer, grüner und roter Fluoreszenz wurden ebenfalls in der Phosphatase- Histochemie eingesetzt (G. I. Murray, S. W. B. Ewen, J: Histochem. Cytochem. 1992, 40, 1971-1974). Dabei wird während der enzymatischen Reaktion (Substrat: 2-Glyzerolphosphat-Na-salz) in Gegenwart von Calciumsalzen gebildetes schwerlösliches Calciumphosphat simultan mit dem fluoreszenten Ca-Ionophor nachgewiesen.- Calcium-binding fluorochromes, such as calcein (2 ', 7'-bis- [N, N-bis (carboxymethyl) aminomethyl] fluorescein), calcein blue (7-hydroxy-4- methyl-8-coumarinylmethylimino-diacetic acid) or xylenol orange (o- Cresolsulfonphthalein-3 ', 3' '- bis-methylimino-diacetic acid) with blue, green and red fluorescence were also found in the phosphatase Histochemistry used (G.I. Murray, S.W.B. Ewen, J: Histochem. Cytochem. 1992, 40, 1971-1974). This is done during the enzymatic Reaction (substrate: 2-glycerol phosphate sodium salt) in the presence of Calcium salts formed sparingly soluble calcium phosphate simultaneously with the fluorescent Ca ionophore detected.
  • - 5-Fluorsalicylsäure, aus 5-Fluorsalicylsäurephospat enzymatisch generiert, vermag in Gegenwart von EDTA mit Terbiumsalzen hochfluoreszente, allerdings relativ gut lösliche Terbiumchelate zu bilden, welche auch in Immunoassays eingesetzt wurden (T. K. Christopoulos, E. P. Diamandis, Anal. Chem. 1992, 64, 342-346). In diesem Zusammenhang wurde auch eine analoge Methode basierend auf 4-Methyl-umbelliferylphosphat (US 5 312 922).5-fluorosalicylic acid, generated enzymatically from 5-fluorosalicylic acid phosphate, is capable of highly fluorescent in the presence of EDTA with terbium salts, However, to form relatively well soluble terbium chelates, which also in Immunoassays were used (T.K. Christopoulos, E.P. Diamandis, Anal. Chem. 1992, 64, 342-346). In this context, too an analogous method based on 4-methyl-umbelliferyl phosphate (US 5,312,922).
  • - Eine Reihe von Diazoniumsalzen wurde zur Kupplung mit N-(4- Biphenylyl)-naphth-3-ol-2-carbonsäureamid herangezogen und lediglich der mit Fast Red TR salt (Sigma, 4-Chlor-2-methyl-phenyldiazonium­ hemizinkchlorid bzw. -hemi-1,5-naphtha-lindisulfonat) erhaltene orange fluoreszierende Azofarbstoff als geeignet gefunden (N. Kagiyama, S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, M. Nishiyauch, S. H. Hori, Acta Histochem. Cytochem. 1995, 28, 581-589).
    Die Diazotierung von primär gebildeten Naphthol AS-Derivaten mit Fast Red TR-Salzen findet in letzter Zeit zunehmendes Interesse (kritische Übersicht siehe: E. Claassen, J: of Immunol. Methods 1991, 139, 149-150). Die Fotostabilität der gebildeten fluoreszierenden Azofarbstoffe übertrifft dabei überraschend z. T. die gut etablierter Standards (z. B. die von Fluoreszein-Derivaten: siehe N. Kagiyama et al. in oben zit. Lit.). Trans- Azoverbindungen wurden früher im Gegensatz zu den cis-Isomeren generell als nicht fluoreszent angesehen (H. Dürr, B. Ruge: Triplet States from Azo Compounds, in: Topics in Current Chemistry, S. 57, Springer Verlag, 1975/1976).
    In der Patentliteratur wurden die Azo-Kupplung von N-substituierten Naphtholcarbonsäureamiden und 7-Bromnaphtholcarbonsäureamiden mit einer Reihe an diazotierten aromatischen Monoaminen beschrieben (EP 0 599 270, US 5 480 791, US 5 480 791). Eine kombinierte Immuno­ gold-Silber/Azokupplungstechnik für die Dunkelfeldmikroskopie ("dark­ field double staining") unter Einsatz von Naphthol AS MX phoshat und Fast Red TR oder Neu Fuchsin in Gegenwart von 9% Polyvinylalkohol wurde ebenfalls beschrieben (EP 0 670 496).    - A number of diazonium salts were used for coupling with N- (4-biphenylyl) -naphth-3-ol-2-carboxamide and only the one with Fast Red TR salt (Sigma, 4-chloro-2-methyl-phenyldiazonium hemizinc chloride or -hemi-1,5-naphtha-lindisulfonate) orange fluorescent azo dye found to be suitable (N. Kagiyama, S. Fujita, M. Momiyama, Y. Kondoh, M. Nishiyauch, SH Hori, Acta Histochem. Cytochem. 1995, 28 , 581-589).
    The diazotization of primarily formed naphthol AS derivatives with Fast Red TR salts has been of increasing interest recently (for a critical overview, see: E. Claassen, J: of Immunol. Methods 1991, 139, 149-150). The photo stability of the fluorescent azo dyes formed surprisingly exceeds z. T. the well-established standards (e.g. those of fluorescein derivatives: see N. Kagiyama et al. In the above-cited reference). In contrast to the cis isomers, trans azo compounds were previously generally regarded as non-fluorescent (H. Dürr, B. Ruge: Triplet States from Azo Compounds, in: Topics in Current Chemistry, p. 57, Springer Verlag, 1975/1976) .
    The patent literature describes the azo coupling of N-substituted naphtholcarboxamides and 7-bromonaphtholcarboxamides with a number of diazotized aromatic monoamines (EP 0 599 270, US 5 480 791, US 5 480 791). A combined immuno gold-silver / azo coupling technique for dark field microscopy ("dark field double staining") using naphthol AS MX phoshat and Fast Red TR or Neu Fuchsin in the presence of 9% polyvinyl alcohol has also been described (EP 0 670 496).

Systematische Versuche zur Verbesserung des Präzipitationsverhaltens derart in situ generierter Azofarbstoffe sind bisher nicht bekannt. Vielmehr wird Polyvinylalkohol als Enzymstabilisator eingesetzt (E. J. M. Speel, B. Schutte, J. Wiegant, F. C. S. Ramaekers, A. H. N. Hopman, J. of Histochem. Cytochem. 1992, 40, 1299-1308). Auch in neueren Arbeiten wird das noch offene Problem dieser Azokupplungstechnik - die unzulängliche Strukturtreue der Präzipitate - offensichtlich (J. Espada, R. W. Horobin, J. C. Stocker, Histochem. Cell. Biol. 1997, 108, 481-487). Außerdem sind so hergestellte histologische Präparate auf Grund der guten Löslichkeit der Azofarbstoffe in organischen Solventien nur wässrigen Medien eindeckbar.Systematic attempts to improve precipitation behavior in this way azo dyes generated in situ are not yet known. Rather it will Polyvinyl alcohol used as an enzyme stabilizer (E. J. M. Speel, B. Schutte, J. Wiegant, F.C.S. Ramaekers, A.H. N. Hopman, J. of Histochem. Cytochem. 1992, 40, 1299-1308). This will also be the case in more recent works open problem of this azo coupling technique - the inadequate structural fidelity  the precipitates - obviously (J. Espada, R. W. Horobin, J. C. Stocker, Histochem. Cell. Biol. 1997, 108, 481-487). They are also manufactured histological preparations due to the good solubility of the azo dyes in organic solvents can only be covered with aqueous media.

Die spektroskopischen Eigenschaften dieser Azofarbstoffmethoden lassen nach dem aktuellen Stand der Technik keine differenziert quantitativen oder semiquantitativen Aussagen zur lokalisierten Enzymaktivität zu.The spectroscopic properties of these azo dye methods leave according to the current state of the art no differentiated quantitative or semi-quantitative statements on localized enzyme activity.

Außerdem führen Kupplungsreaktionen der Diazonium-Komponente mit reaktiven Spezies der biologischen Matrix stets anteilig zu unspezifischer Hintergrundfluoreszenz mit bislang ähnlichen spektroskopischen Eigen­ schaften wie die der spezifischen Reaktion. Eine gezielte Einflußnahme auf beide Effekte und deren Differenzierung ist weder durch chemische Modifizierung der beteiligten Reagenzien noch durch Additive gelungen.Coupling reactions of the diazonium component are also involved reactive species of the biological matrix always proportionate to non-specific Background fluorescence with similar spectroscopic properties like the specific reaction. A targeted influence on both effects and their differentiation is neither chemical Modification of the reagents involved was still successful with additives.

Cyclodextrine zeichnen sich durch ihre Eigenschaft aus, kleinere Moleküle in ihrem Hohlraum durch hydrophobe oder polare Wechselwirkungen zu Wirt- Gast-Verbindungen zu komplexieren (siehe Übersicht: M. L. Bender, M. Komiyama, in: Cyclodextrin Chemistry, Springer Verlag 1978, Berlin, Heidelberg, New York).Cyclodextrins are characterized by their property, smaller molecules in their cavity through hydrophobic or polar interactions to host To complex guest connections (see overview: M. L. Bender, M. Komiyama, in: Cyclodextrin Chemistry, Springer Verlag 1978, Berlin, Heidelberg, New York).

Es können eingeschlossene Gastmoleküle in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften wirksam modifiziert, labile Verbindungen stabilisiert oder neue Reaktivitätsmuster und katalytische Effekte erzielt werden. Die so erhaltenen supramolekularen Molekülaggregate zeigen häufig qualitativ neue Eigenschaften (J. L. Atwoode, J. E. D. Davis, D. D. MacNicol; Inclusion Compounds, vol. 3; Academic Press, 1984; London, Orlando). So wird zum Beispiel die photochemische Isomerisierung von Stilbenen und Zimsäureestern anders als in freier Lösung (< 85% cis nach Photo­ isomerisierung) durch β-Cyclodextrin-Komplexierung zugunsten der trans- Verbindungen gelenkt (M. S. Syamala, S. Devanathan, V. Ramamurthy; J. of Photochemistry 1986, 34, 219-229) und damit die Fluoreszenz­ eigenschaften verändert (G. L. Duveneck, E. V. Sitzmann, K. B. Eisenthal, N. J. Turro, J. Phys. Chem. 1989, 93, 7166-7170).There can be trapped guest molecules in their physico-chemical Properties modified effectively, unstable connections stabilized or new ones Reactivity patterns and catalytic effects can be achieved. The so obtained Supramolecular molecular aggregates often show qualitatively new ones Properties (J.L. Atwoode, J.E.D. Davis, D.D. MacNicol; Inclusion Compounds, vol. 3; Academic Press, 1984; London, Orlando). So becomes Example is the photochemical isomerization of stilbenes and Cinnamic acid esters differently than in free solution (<85% cis according to photo isomerization) by β-cyclodextrin complexation in favor of the trans Connections directed (M. S. Syamala, S. Devanathan, V. Ramamurthy;  J. of Photochemistry 1986, 34, 219-229) and thus fluorescence properties changed (G. L. Duveneck, E. V. Sitzmann, K. B. Eisenthal, N. J. Turro, J. Phys. Chem. 1989, 93, 7166-7170).

Kürzlich wurden auch erstmalig langgestreckte, wasserlösliche und in Cyclodextrine eingekapselte Azofarbstoffe durch Azokupplung in Gegenwart von Cyclocextrinen synthetisiert und die so erhaltenen Farbstoff-Rotaxane NMR-spektroskopisch charakterisiert (S. Anderson, T. D. W. Claridge, H. L. Anderson; Angew. Chem. 1997, 109, 1367-1370).Recently, elongated, water-soluble and in Cyclodextrins encapsulated azo dyes by azo coupling in the presence synthesized by cyclocextrins and the dye rotaxanes thus obtained Characterized by NMR spectroscopy (S. Anderson, T. D. W. Claridge, H.L. Anderson; Appl. Chem. 1997, 109, 1367-1370).

Detaillierte Untersuchungen zur Beeinflussung der Fluoreszenzeigenschaften von Azofarbstoffen durch Cyclodextrin-Komplexierung liegen derzeit nicht vor. In Analogie zu oben zitierten Stilbenderivaten sind aber stabilisierende Effekte auf die N=N-cis/trans-Photoisomerisierung und andere photo­ chemische Sekundärprozesse zu erwarten. Dies wurde für die photochemische trans/cis-Isomerisierung (P. Bortolus, S. Monti J: Phys. Chem. 1987, 91, 5046-5050) und neuerdings auch für die thermische cis/trans-Isomerisierung von Donor-substituierten Azobenzolderivaten gezeigt (A. M. Sanchez, R. H. de Rossi, J. Org. Chem. 1996, 61, 3446-3451).Detailed investigations to influence the fluorescence properties of azo dyes by cyclodextrin complexation currently do not exist in front. In analogy to the stilbene derivatives cited above, they are stabilizing Effects on N = N-cis / trans photoisomerization and other photo chemical secondary processes to be expected. This was for the photochemical trans / cis isomerization (P. Bortolus, S. Monti J: Phys. Chem. 1987, 91, 5046-5050) and more recently for thermal cis / trans isomerization of donor-substituted azobenzene derivatives (A. M. Sanchez, R.H. de Rossi, J. Org. Chem. 1996, 61, 3446-3451).

In Analogie dazu sind auch Wirt-Gast-Komplexe von Kronenethern mit Diazoniumsalzen oder Azofarbstoffen hergestellt und untersucht worden (Übersicht: H. Zollinger, in: Diazo Chemistry I, Aromatic and Heteroaromatic Compounds, VCH Weinheim, 1994), allerdings ebenfalls ohne Anwendung in der Enzym-Fluoreszenzdiagnostik.In analogy to this, host-guest complexes of crown ethers are also included Diazonium salts or azo dyes have been prepared and investigated (Overview: H. Zollinger, in: Diazo Chemistry I, Aromatic and Heteroaromatic Compounds, VCH Weinheim, 1994), however also without application in enzyme fluorescence diagnostics.

Zusammenfassend muß festgestellt werden, daß trotz intensiver Bemühungen um hochempfindliche und lokalisationsgetreue Nachweisverfahren die bisher erreichten Ergebnisse, insbesondere hinsichtlich Auflösungsvermögen und quantitativer Aussagefähigkeit, nicht zufriedenstellend sind.In summary, it must be stated that despite intensive efforts to highly sensitive and localized detection methods the previous achieved results, particularly with regard to resolution and quantitative information, are not satisfactory.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein möglichst aufwandgeringes, hochempfindliches und zuverlässiges Nachweisverfahren mit extrem hoher Lokalisationstreue unter gleichzeitiger exakter Widerspiegelung morpho­ logischer Feinstrukturen für den histochemischen und immunhistochemischen Nachweis von alkalischer Phosphataseaktivität zu schaffen.The invention is based on the object of minimizing highly sensitive and reliable detection method with extremely high  Localization fidelity with exact morpho reflection logical fine structures for histochemical and immunohistochemical To provide detection of alkaline phosphatase activity.

Das Verfahren soll insbesondere auch quantitative Aussagen zur lokalisierten Enzymaktivität unter Anwendung an sich bekannter gerätetechnischer Nachweismittel und Auswerteverfahren ermöglichen. Ferner ist aus Aufwandsgründen der Einsatz kostengünstiger handelsüblicher Reagenzien wünschenswert.In particular, the method should also provide quantitative statements on the localized Enzyme activity using equipment known per se Enable means of detection and evaluation procedures. Furthermore is off The use of inexpensive commercially available reagents is a matter of effort desirable.

Bei dem Verfahren zum Nachweis von alkalischer Phosphatase und Phosphatasekonjugaten mit chromogenen und/oder luminogenen, insbesondere fluoreszenzspektroskopischen, Methoden kommen aromatische Phosphate als Phosphatasesubstrat und deren kupplungsfähige Folgeprodukte für die Nachweisreaktion zur Anwendung. Die infolge der enzymatischen Reaktion gebildeten Phenole werden in situ über eine Diazotierungsreaktion zu Azofarbstoffen abgefangen, die mit optischen Verfahren hinsichtlich ihrer Farbe bzw. Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz, ausgewertet werden. Erfindungsgemäß wird gemäß Patentanspruch 1 mindestens ein Zusatz zugegeben, der den Präzipitationsfeinheitsgrad des Produktes der Diazotierungsreaktion erhöht. Das Fällungsverhalten kann dabei durch die erfindungsgemäßen Zusätze auf chemischen Wege katalytisch oder auch nichtkatalytisch durch Beeinflussung der Produktzusammensetzung bzw. Konstitution der Einzelkomponenten sowie durch physikalisch-chemische Effekte verbessert werden. Beispiele (Kronenether, Übergangsmetalle, Amphinile, Cyclodextrine etc.) sind in den Unteransprüchen aufgeführt.In the method for the detection of alkaline phosphatase and Phosphatase conjugates with chromogenic and / or luminogenic, especially fluorescence spectroscopic, aromatic methods come Phosphates as a phosphatase substrate and their couplable secondary products for the detection reaction to use. The result of the enzymatic Reaction formed phenols are generated in situ via a diazotization reaction intercepted to azo dyes with optical processes with regard to their Color or luminescence, in particular fluorescence, can be evaluated. According to the invention at least one additive added, the degree of precipitation fineness of the product of Diazotization reaction increased. The precipitation behavior can be determined by the Additives according to the invention by chemical means or catalytically non-catalytically by influencing the product composition or Constitution of the individual components as well as physico-chemical Effects are improved. Examples (crown ethers, transition metals, Amphinils, cyclodextrins etc.) are listed in the subclaims.

Durch das so erzielte strukturgetreue Präzipitationsverhalten des Produktes der Diazotierungsreaktion ist mit an sich bekannten optischen Auswertungsverfahren (Einsatz üblicher Nachweismittel und -verfahren) ein extrem hochauflösender und ortsgenauer Enzymnachweis unter Wider­ spiegelung selbst feinster morphologischer Details möglich. Die Anwendung von Fluoreszenzanregungsverfahren ermöglicht zudem bei entsprechender visueller oder spektroskopischer Auswertung differenzierte quantitative Aussagen zur Enzymaktivität auch am einzelnen "Spot". Die untersuchten Substanzen zur Beeinflussung des Präzipitationsverhaltens sind kostengünstig und handelsüblich. Die Fluoreszenzanregung kann vorteilhaft mit Argon- Lasern (λex. = 488 nm) oder Helium/Neon-Lasern (λex. = 543 nm) erfolgen.The structure-accurate precipitation behavior of the product of the diazotization reaction achieved in this way makes it possible to use extremely well-known optical evaluation methods (use of conventional detection means and methods) to perform an extremely high-resolution and precise detection of the enzyme while reflecting even the finest morphological details. The use of fluorescence excitation methods also enables differentiated quantitative statements on enzyme activity, even at the individual "spot", with appropriate visual or spectroscopic evaluation. The substances examined to influence precipitation behavior are inexpensive and commercially available. The fluorescence excitation can advantageously be carried out using argon lasers (λ ex. = 488 nm) or helium / neon lasers (λ ex. = 543 nm).

Die Fluoreszenzeigenschaften können weiterhin gezielt durch basische Folge- bzw. Eindeckmedien, Puffer oder gleichzeitig die Fluoreszenz stabilisierende organische Basen, wie Piperidin oder Phosphazen-Basen, beeinflußt werden. Es resultiert eine intensive und differenzierte spezifische Rotfluoreszenz. Die Hintergrundfluoreszenz ist dabei hinsichtlich Farbton und Intensität durch genannte Additive beeinflußbar und im Falle basischer Medien komplementärfarbig grün bei ebenfalls äußerst präziser Widerspiegelung morphologischer Details. Dies ermöglicht eine gute Orientierung bei gleichzeitig hohem visuellem Kontrast. Die gebildeten Azofarbstoffe sind zur koordinativen und elektrovalenten Metallbindung über mehrfache jeweils zweizähnige Chelatbindungsstellen befähigt und machen somit das erfindungsgemäße Verfahren auch für elektronenmikroskopische Anwen­ dungen sowie für klassische Nachkontrastierungsverfahren interessant. Die orange-roten bis weinroten Präzipitate sind lichtmikroskopisch ebenfalls gut auswertbar. Das Hauptanwendungsgebiet liegt aber auf Grund der ausgezeichneten Photostabilität und spektralen Eigenschaften bei modernen Fluoreszenztechniken, wie Laseranregung, "Confocale Laser Scanning Microscopy" und langwelligen Multiphotonen-Laseranregungstechniken.The fluorescence properties can still be targeted by basic sequential or Mounting media, buffers or at the same time stabilizing the fluorescence organic bases, such as piperidine or phosphazene bases, are influenced. The result is an intense and differentiated specific red fluorescence. The Background fluorescence is through in terms of hue and intensity mentioned additives can be influenced and in the case of basic media complementary green with also extremely precise reflection morphological details. This enables a good orientation at the same time high visual contrast. The azo dyes formed are for coordinative and electrovalent metal bond over multiple each enabled bidentate chelate binding sites and thus do that Method according to the invention also for electron microscopic applications interesting as well as for classic post-contrast procedures. The Orange-red to wine-red precipitates are also good under light microscopy evaluable. The main area of application is due to excellent photostability and spectral properties in modern Fluorescence techniques such as laser excitation, "Confocal Laser Scanning Microscopy "and longwave multiphoton laser excitation techniques.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen zum histochemischen Nachweis von endogener und immunogebundener alkalischer Phosphataseaktivität näher erläutert werden.The invention is intended to be described below with the aid of exemplary embodiments histochemical detection of endogenous and immunobound  alkaline phosphatase activity will be explained in more detail.

Es zeigen:Show it:

Fig. 1 Fluoreszenzauswertung bei λext = 435 nm endogener alkalischer Phosphataseaktivität in der Milzkapillare einer Maus (Kryostat- Schnitt) mit Ni2+ als Metalladditiv, Fig. 1 fluorescence analysis at λ ext = 435 nm endogenous alkaline phosphatase activity in the Milzkapillare a mouse (cryostat section) with Ni 2+ as the metal additive,

Fig. 2 Fluoreszenzauswertung bei λext = 435 nm endogener alkalischer Phosphataseaktivität in der Dickdarmkapillare einer Maus mit Ni2+ als Metalladditiv in Gegenwart von 1% α-Cyclodextrin, Fig. 2 fluorescence analysis at λ ext = 435 nm endogenous alkaline phosphatase activity in the Dickdarmkapillare a mouse with Ni 2+ as the metal additive in the presence of 1% α-cyclodextrin,

Fig. 3 Fluoreszenzauswertung gemäß Fig. 1 unter Zusatz von cis- Dicyclohexano-18-crown-6, Fig. 3 fluorescence analysis of Fig. 1 with the addition of cis-dicyclohexano-18-crown-6,

Fig. 4 Fluoreszenzauswertung gemäß Fig. 3 unter zusätzlicher Beigabe von TWEEN 20 und Austausch von Ni2+ gegen Mn2+, Fig. 4 fluorescence analysis of Fig. 3 with additional addition of TWEEN 20 and exchange of Ni 2+ to Mn 2+,

Fig. 5 Fluoreszenzauswertung gemäß Fig. 4 unter Austausch von Mn2+ gegen Co2+, Fig. 5 fluorescence analysis of Fig. 4 with the replacement of Mn 2+ to Co 2+,

Fig. 6 laserkonfokalmikroskopische Auswertung bei λext = 543 nm (Falschfarbendarstellung) der endogenen enzymatischen Aktivität in den Kapillaren der quergestreiften Muskulatur einer Maus, Fig. 6 laserkonfokalmikroskopische analysis at λ ext = 543 nm (false color) of the endogenous enzymatic activity in the capillaries of the striated muscle of a mouse;

Fig. 7 laserkonfokalmikroskopische Auswertung gemäß Fig. 6 der immunhistochemisch dargestellten exprimierten Transglutaminase als Apoptoseprotein von Enterozyten und Stromazellen einer Maus, Fig. 7 laserkonfokalmikroskopische evaluation according to Fig. 6 of the illustrated immunohistochemically expressed transglutaminase as apoptosis protein of the enterocytes and stromal cells of a mouse;

Fig. 8 laserkonfokalmikroskopische Auswertung gemäß Fig. 6 von immunhistochemisch dargestelltem Calcitonin in Tumorzellen eines Schilddrüsenkarzinoms vom Menschen. FIG. 8 laser confocal microscopic evaluation according to FIG. 6 of calcitonin shown immunohistochemically in tumor cells of a thyroid carcinoma of humans.

Die Schwarzweiß-Darstellungen lassen allerdings im Gegensatz zu den vorliegenden Farbaufnahmen die Nachweiseffekte leider nur unvollständig bzw. lediglich andeutungsweise erkennen. The black and white representations, however, in contrast to the existing color photographs, the detection effects are unfortunately incomplete or only hinted at.  

Zunächst soll die histochemische Basismethode bereits unter Anwendung von Metallsalzzusätzen als allgemeine Arbeitsvorschrift beschrieben werden:First, the basic histochemical method should already be applied using Metal salt additives are described as a general working specification:

Fixation von nativen KryostatschnittenFixation of native cryostat sections 1. SchrittStep 1

Die Schnitte werden mit einer Lösung von 1% Glutardialdehyd oder 2% Paraformaldehyd in 0.1 M Cacodylat- oder 67 mM Phosphat- bzw. 0.1 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7.2-7.4 für 5 bis 10 min bei 1°C (Eisbad) inkubiert.The cuts are made with a solution of 1% glutardialdehyde or 2% Paraformaldehyde in 0.1 M cacodylate or 67 mM phosphate or 0.1 M Tris-HCl buffer at pH 7.2-7.4 incubated for 5 to 10 min at 1 ° C (ice bath).

2. Schritt2nd step

Es wird 5 min fließend gewässert und mit Aqua bidest. gespült.It is watered fluently for 5 min and bidistilled with Aqua. rinsed.

3. Schritt3rd step

Primäre Phosphatase-Nachweisreaktion und Azo-Kupplung (bis auf Variationen der Metallsalzkomponente geltend für alle Ausführungsbeispiele) Die primäre Phosphatase-Nachweisreaktion und die Azo-Kupplung erfolgen simultan durch Inkubation in folgendem Medium bei Raumtemperatur (Dauer: 30 min bei Kryostat- und Paraffinschnitten bzw. 60 min bei Semidünnschnitten): 20 ml 0.1 M Tris-Puffer (pH 8.5), welcher 5 mM bezüglich eines Metallsalzes (katalytischer Zusatz) wie vorzugsweise MnCl2, NiSO4 oder CoCl2 ist, und als Enzym-Substrat 1 mg Naphthol-AS-GR- Phosphat (0.11 mM) und 65 µl an frisch hergestelltem hexazotierten Neufüchsin als farbkuppelnde Komponente enthält.Primary phosphatase detection reaction and azo coupling (except for variations in the metal salt component apply to all exemplary embodiments) The primary phosphatase detection reaction and the azo coupling take place simultaneously by incubation in the following medium at room temperature (duration: 30 min for cryostat and paraffin sections or 60 min for semi-thin sections): 20 ml 0.1 M Tris buffer (pH 8.5), which is 5 mM with respect to a metal salt (catalytic additive) such as preferably MnCl 2 , NiSO 4 or CoCl 2 , and 1 mg naphthol-AS as enzyme substrate -GR- contains phosphate (0.11 mM) and 65 µl of freshly made hexazotized new fox as a color-coupling component.

Anstelle von Naphthol-AS-GR-Phosphat kann auch das analoge MX-Derivat eingesetzt werden. Die Absorptionsmaxima des entstehenden Azofarbstoffes sind dann hypsochrom (zu weinrot) verschoben und die Fluoreszenzemission ist bei gleicher Anregungswellenlänge (λext ca. 488 nm) von intensiv rot zu orange-rot verschoben. Instead of naphthol AS-GR phosphate, the analog MX derivative can also be used. The absorption maxima of the resulting azo dye are then shifted hypsochromically (to wine red) and the fluorescence emission is shifted from intensely red to orange-red with the same excitation wavelength (λ ext approx. 488 nm).

Das hexazotierte Neufuchsin wird aus zwei Stammlösungen A und B wie folgt generiert:
Stammlösung A: 400 mg Neufüchsin werden in 8 ml Aqua bidest. gelöst und mit 2 ml konzentrierter HCl (p.a.) versetzt.
Stammlösung B: 4%-ige Lösung von Natriumnitrit in Aqua bidest.The hexazoted Neufuchsin is generated from two stock solutions A and B as follows:
Stock solution A: 400 mg Neufüchsin in 8 ml Aqua bidest. dissolved and mixed with 2 ml of concentrated HCl (pa).
Stock solution B: 4% solution of sodium nitrite in aqua bidist.

Die Stammlösungen A und B sind im Kühlschrank (4°C) ca. 2 Wochen haltbar. Jeweils 65 µl der auf 0°C gekühlten Stammlösungen A und B werden gemischt und nach 3 bis 5 min Reaktionsdauer bei 4°C eingesetzt.Stock solutions A and B are in the refrigerator (4 ° C) for about 2 weeks durable. 65 µl each of stock solutions A and B cooled to 0 ° C are mixed and used after 3 to 5 min reaction time at 4 ° C.

Als erstes Ausführungsbeispiel zur Basismethode dient eine Fluoreszenz­ auswertung bei λext = 488 nm endogener Peroxidaseaktivität in der Milz­ kapillare einer Maus (Kryostat-Schnitt) mit Ni2+ als Metalladditiv (Fig. 1, Schwarz-weiß-Abbildung in 500facher Vergrößerung). Substrat: Naphthol- AS-GR-Phosphat.A fluorescence evaluation with λ ext = 488 nm endogenous peroxidase activity in the capillary spleen of a mouse (cryostat section) with Ni 2+ as metal additive serves as the first exemplary embodiment of the basic method ( FIG. 1, black and white illustration in 500 times magnification). Substrate: Naphthol-AS-GR phosphate.

Die spezifische Fluoreszenz ist je nach lokaler Enzymkonzentration intensiv orange bis tiefrot und bereits bei dieser Basismethode sehr hochauflösend (z. B. "ausgesparte" Zellkerne), während der Hintergrund sich in einem angenehm grün bis gelbgrünen Fluoreszenzkontrast darstellt.The specific fluorescence is intense depending on the local enzyme concentration orange to deep red and very high resolution even with this basic method (e.g. "recessed" cell nuclei), while the background is in a represents a pleasant green to yellow-green fluorescence contrast.

Eine gegenüber der vorbeschriebenen Basismethode signifikante Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften wird durch folgende Additive und deren Kombinationen erreicht:
A significant improvement in the fluorescence properties compared to the above-described basic method is achieved by the following additives and their combinations:

  • a) Cyclodextrine: 1% α-, β- oder γ-Cyclodextrin, insbesondere α-Cyclodextrin. In Fig. 2 wurden die Kapillaren des Dickdarmes einer Maus analog zu Fig. 1 dargestellt, wobei zusätzlich 1% α-Cyclodextrin zugegeben wurden. Es ist nochmals ein signifikanter Zuwachs der spezifischen Rot-Fluoreszenz zu verzeichnen. Morphologische Details werden sowohl von der spezifischen Fluoreszenz als auch von der grünen Hintergrundfluoreszenz sehr differenziert und hochaufgelöst widergespiegelt.a) Cyclodextrins: 1% α-, β- or γ-cyclodextrin, especially α-cyclodextrin. The capillaries of the large intestine of a mouse were shown in FIG. 2 analogously to FIG. 1, 1% α-cyclodextrin additionally being added. There is again a significant increase in the specific red fluorescence. Morphological details are very differentiated from the specific fluorescence as well as from the green background fluorescence and are reflected in high resolution.
  • b) Kronenether: Besonders geeignet ist 1% cis-Dicyclohexano-18-crown-6, aber auch 15-crown-5 oder 18-crown-6 (Fig. 3). Die übrigen Bedingungen entsprechen der Auswertung gemäß Fig. 1. Es zeigt sich wiederum eine deutliche Kontraststeigerung von spezifischer- zur Hintergrundfluoreszenz.b) Crown ether: 1% cis-dicyclohexano-18-crown-6 is particularly suitable, but also 15-crown-5 or 18-crown-6 ( FIG. 3). The other conditions correspond to the evaluation according to FIG. 1. Again, there is a clear increase in contrast from specific to background fluorescence.
  • c) Tenside: vorzugsweise 0,005%-0,05% Triton-X 100 oder 0,005%-0,05% TWEEN 20 bzw. TWEEN 80 oder 0,005%-0,05% CHAPS.
    Fig. 4 zeigt die Fluoreszenzauswertung gemäß Fig. 3, wobei unter Austausch von Ni2+ gegen Mn2+ zusätzlich zum Kronenether (1% cis- Dicyclohexano-18-crown-6) 0,005% TWEEN 20 zugegeben wurden. Damit konnten die spezifische Fluoreszenzintensität und der Kontrast zum Hintergrund nochmals verbessert werden.
    Fig. 5 zeigt in Analogie zu Fig. 4 die Fluoreszenzauswertung unter Zugabe von 0,005% TWEEN 20 zum Kronenether (1% cis- Dicyclohexano-18-crown-6), wobei Mn2+ durch Co2+ substituiert wurde, gezeigt am Beispiel der entsprechenden Metalldichloride. Auch hier ergeben sich sehr gute Fluoreszenz- und Kontrasteigenschaften.    c) Surfactants: preferably 0.005% -0.05% Triton-X 100 or 0.005% -0.05% TWEEN 20 or TWEEN 80 or 0.005% -0.05% CHAPS.
    FIG. 4 shows the fluorescence evaluation according to FIG. 3, with 0.005% TWEEN 20 being added in addition to the crown ether (1% cis-dicyclohexano-18-crown-6) while exchanging Ni 2+ for Mn 2+ . This allowed the specific fluorescence intensity and the contrast to the background to be further improved.
    Fig. 5 shows in analogy to Fig. 4, the fluorescence analysis with the addition of 0.005% TWEEN 20 for crown ether (1% cis-dicyclohexano-18-crown-6), Mn has been substituted by Co 2+ 2+, shown in the example of corresponding metal dichlorides. Here, too, there are very good fluorescence and contrast properties.

Nachfolgend sollen Ausführungsbeispiele für laserkonfokale Auswerte­ verfahren erläutert werden:Exemplary embodiments for laser confocal evaluations are given below procedures are explained:

Fig. 6 zeigt anhand einer Falschfarbendarstellung Orte endogener enzyma­ tischer Aktivität in den Kapillaren der quergestreiften Muskulatur einer Maus (Kryostatschnitt). Es wurde in Gegenwart von 5 mM NiSO4 und 0,005% TWEEN 20 inkubiert und Naphthol-AS-CR-Phosphat als Substrat eingesetzt. Die Fluoreszenzanregung erfolgte im Helium-Neon-Laserlicht bei 543 nm. Der gewählte Bildausschnitt zeigt die Orte von Phosphataseaktivität äußerst kontrastreich und sehr sauber lokalisiert. Fig. 6 shows a false color representation of locations of endogenous enzymatic activity in the capillaries of the striated muscles of a mouse (cryostat section). It was incubated in the presence of 5 mM NiSO 4 and 0.005% TWEEN 20 and naphthol AS-CR phosphate was used as the substrate. The fluorescence excitation was carried out in helium-neon laser light at 543 nm. The selected image section shows the locations of phosphatase activity in extremely high contrast and very cleanly localized.

Fig. 7 zeigt als Beispiel zu immunhistochemischen Techniken antikörper­ gebundene alkalische Phosphataseaktivität im Zytoplasma von Enterozyten und Stromazellen einer Maus. Die Reaktionsbedingungen und Zusätze entsprechen der Auswertung nach Fig. 6. Exprimierte Transglutaminase als Apoptoseprotein wird dabei lasermikroskopisch (λext = 543 nm, Falschfarben­ darstellung, Semidünnschnitt, Eponeinbettung) sehr scharf und ortsgetreu erfaßt und dabei gleichzeitig morphologische Details der Umgebung sehr differenziert widergespiegelt. Fig. 7 shows an example of immunohistochemical techniques to antibody bound alkaline phosphatase in the cytoplasm of enterocytes and stromal cells of a mouse. The reaction conditions and additives correspond to the evaluation according to FIG. 6. Expressed transglutaminase as an apoptosis protein is recorded very sharply and accurately according to the laser microscope (λ ext = 543 nm, false color representation, semi-thin section, epon embedding) and at the same time very differently reflected morphological details of the environment.

In Analogie zu Fig. 7 (gleiche Reaktionsbedingungen und Zusätze) zeigt Fig. 8 eine immunhistochemische Methode unter Laserauswertung (λext = 543 nm, Falschfarbendarstellung), bei der Calcitonin in Tumorzellen eines Schilddrüsenkarzinoms vom Menschen (Paraffinschnitt) lokalisiert wird.In analogy to FIG. 7 (same reaction conditions and additives), FIG. 8 shows an immunohistochemical method under laser evaluation (λ ext = 543 nm, false color representation), in which calcitonin is localized in tumor cells of a thyroid carcinoma of humans (paraffin section).

Bei allen Ausführungsbeispielen kam zur weiteren Beeinflussung der Hintergrundfluoreszenz (Farbveränderung von gelbgrün nach grün) eine alkalische Nachbehandlung zur Anwendung. Dazu werden nach erfolgter Inkubation die Objektträger zunächst in Tris/HCl-Puffer (pH 8,5) und anschließend dreimal in 0,1 N NaOH gespült. Anschließend wurden die Präparate alternativ wie folgt eingedeckt:
In all of the exemplary embodiments, an alkaline aftertreatment was used to further influence the background fluorescence (color change from yellow-green to green). After the incubation, the slides are first rinsed in Tris / HCl buffer (pH 8.5) and then three times in 0.1 N NaOH. The preparations were then covered alternatively as follows:

  • a) Nichtwässrige, "hydrophobe" Medien: Nach Entfernung des Flüssigkeits­ überschusses werden die Präparate direkt in dreimal gewechselten absoluten Alkohol überführt und von dort über Alkohol/Xylol (3 : 1) in DAB-Mount™ (Immunotech Marseille) eingedeckt.a) Non-aqueous, "hydrophobic" media: after removal of the liquid The preparations are made directly in absolute changes three times Alcohol transferred and from there via alcohol / xylene (3: 1) in DAB-Mount ™ (Immunotech Marseille) stocked.
  • b) Hydrophile Medien:
    Variante 1: Man deckt ohne Zwischenwässerung in einer 80%-igen Saccharose-Lösung in 0,5-1,0 M NaOH, welche 10% Glycerin enthält, ein.
    Variante 2: Es wird in einer Mischung aus 8 ml 80%-iger Saccharose, 1 ml Glycerin und 0,5 ml Piperidin oder 0,5 g einer Phosphacen-Base eingedeckt.    b) Hydrophilic media:
    Variant 1: One covers without soaking in an 80% sucrose solution in 0.5-1.0 M NaOH, which contains 10% glycerol.
    Variant 2: It is covered in a mixture of 8 ml of 80% sucrose, 1 ml of glycerol and 0.5 ml of piperidine or 0.5 g of a phosphacene base.

Die so eingedeckten Präparate besitzen eine ausgezeichnete Fluoreszenz­ stabilität und Lagerfähigkeit.The specimens covered in this way have excellent fluorescence stability and shelf life.

Nachträgliche selektive Beeinflussung der HintergrundfluoreszenzSubsequent selective influencing of the background fluorescence

Das spezifische Reaktionsendprodukt hat eine intensive orange-farbene bis tiefrote Fluoreszenz, die unspezifische Hintergrundfärbung ist grün. Diese kann bei Bedarf (weitere Kontraststeigerung) wahlweise nahezu selektiv zurückgedrängt werden. Dazu wird das Präparat nach Inkubation und Spülung in Aqua bidest. 30 min in einer 1%-igen OsO4-Lösung in 0,1 M Boratpuffer (pH 9,0) nachbehandelt. Danach wird mit Aqua bidest. gespült und, wie oben beschrieben, alkalisch gespült und eingedeckt.The specific reaction end product has an intense orange-colored to deep red fluorescence, the non-specific background color is green. If required (further increase in contrast), this can optionally be suppressed almost selectively. After incubation and rinsing, the preparation is bidistilled in aqua. Aftertreated for 30 min in a 1% OsO 4 solution in 0.1 M borate buffer (pH 9.0). Then bidistilled with Aqua. rinsed and, as described above, rinsed alkaline and covered.

Das Anregungsspektrum des spezifischen Produktes ist relativ breit. Für die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie kann eine Anregung von λext = 405 nm bis 680 nm vorgenommen werden. Im ultravioletten Bereich von λext = 365 nm ist ebenfalls eine deutliche, aber schwächere Fluoreszenz­ anregung möglich. Im konfokalen Lasermikroskop gelingt eine ausge­ zeichnete Anregung mit dem Argon-Ionen-Laser (λext = 488 nm) oder im Helium-Neon-Laser bei λext = 543 nm (Fig. 6-8). Das spezifische Endprodukt ist auch mit dem gepulsten Nahen Infrarotlaser (Optimum bei λext = 780 nm) gut detektierbar.The range of excitations for the specific product is relatively broad. For conventional fluorescence microscopy, excitation from λ ext = 405 nm to 680 nm can be carried out. A clear but weaker fluorescence excitation is also possible in the ultraviolet range of λ ext = 365 nm. Excellent excitation is achieved in the confocal laser microscope with the argon ion laser (λ ext = 488 nm) or in the helium-neon laser at λ ext = 543 nm ( Fig. 6-8). The specific end product can also be easily detected with the pulsed near infrared laser (optimum at λ ext = 780 nm).

Claims (6)

1. Verfahren zum Nachweis von alkalischer Phosphatase und Phosphatase­ konjugaten, basierend auf einer chromogenen und/oder luminogenen, insbesondere auf Fluoreszenzanregung und deren Auswertung beruhenden, Nachweisreaktion, wobei für die Nachweisreaktion kupplungsfähige aromatische Phosphate als Phosphatasesubstrat zur Anwendung kommen und die infolge der enzymatischen Reaktion gebildeten Phenole in situ über eine Diazotierungsreaktion zu Azofarbstoffen abgefangen werden, die optisch hinsichtlich ihrer Farbe bzw. Lumineszenz ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zweck eines extrem hochauflösenden und lokalisationsgetreuen Nachweises mindestens ein den Präzipitations­ feinheitsgrad des Produktes der Diazotierungsreaktion erhöhenden Zusatz zugegeben wird.1. A method for the detection of alkaline phosphatase and phosphatase conjugates, based on a chromogenic and / or luminogenic, in particular based on fluorescence excitation and its evaluation, detection reaction, whereby coupling-capable aromatic phosphates are used as phosphatase substrate and those formed as a result of the enzymatic reaction Phenols are captured in situ via a diazotization reaction to azo dyes, which are optically evaluated with regard to their color or luminescence, characterized in that for the purpose of extremely high-resolution and location-accurate detection, at least one additive which increases the degree of precipitation of the product of the diazotization reaction is added. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz aus Metallverbindungen, wie beispielsweise Ni2+- und Mn2+-Salzen, besteht.2. The method according to claim 1, characterized in that the addition of metal compounds, such as Ni 2+ - and Mn 2+ salts, consists. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz aus einschlußkomplexbildenden α-, β- oder χ-Cyclodextrinen oder Kronenethern besteht.3. The method according to claim 1, characterized in that the addition of inclusion complex-forming α-, β- or χ-cyclodextrins or crown ethers consists. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz aus grenzflächenaktiven Amphiphilen, wie beispielsweise Tween®, CHAPS® oder n-Alkylglucosiden, besteht.4. The method according to claim 1, characterized in that the addition of surface-active amphiphiles, such as Tween®, CHAPS® or n-alkyl glucosides. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zweck der Verbesserung des Farbkontrastes bei der Lumineszenzauswertung des Präzipitates an sich bekannte anorganische bzw. organische Basen und Puffersysteme, wie beispielsweise Glycin/NaOH-Puffer (pH < 10), Piperidin, 1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan (DABCO) oder Phosphazen-Base-P1-tert-butyl­ tetramethylen, zugegeben werden.5. The method according to claim 1, characterized in that for the purpose of Improvement of the color contrast in the luminescence evaluation of the  Precipitate known inorganic or organic bases and Buffer systems, such as glycine / NaOH buffer (pH <10), piperidine, 1,4-diazabicyclo [2,2,2] octane (DABCO) or phosphazene base-P1-tert-butyl tetramethylene. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß insbesondere zum Zweck einer selektiven Beeinflussung des Farbkontrastes bei der Lumineszenzauswertung des Präzipitates mit Osmiumtetroxid-Lösungen inkubiert wird.6. The method according to claim 1, characterized in that in particular for the purpose of selectively influencing the color contrast in the Luminescence evaluation of the precipitate with osmium tetroxide solutions is incubated.
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