DE19906757B4

DE19906757B4 - microscope

Info

Publication number: DE19906757B4
Application number: DE1999106757
Authority: DE
Inventors: Johann Dr. Engelhardt; Heinrich Dr. Ulrich; Joachim Dr. Bradl
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2019-02-18
Also published as: DE19906757A1

Abstract

Mikroskop mit einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle (2), mit einer spektral selektiven Einrichtung zum Einkoppeln des Anregungslichts (3) in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt (10) gestreuten und/oder reflektierten Anregungslichts (9) aus dem Detektionsstrahlengang (12), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der spektral selektiven Einrichtung um ein einzelnes, passives Bauteil handelt, dass das Anregungslicht (3) unterschiedliche Wellenlängen umfasst, die aus unterschiedlichen Richtungen auf das Bauteil einfallen und von diesem koaxial zu einem Anregungslichtstrahl vereinigbar sind, und dass das Anregungslicht (3) durch das Bauteil aus dem Detektionsstrahlengang (9) ausblendbar ist.Microscope with a light source (2) suitable for fluorescence excitation, with a spectrally selective device for coupling the excitation light (3) into the microscope and for hiding the excitation light (9) scattered and / or reflected on the object (10) from the detection beam path (12) , characterized in that the spectrally selective device is a single, passive component, that the excitation light (3) comprises different wavelengths which are incident on the component from different directions and can be coaxially combined by the latter to form an excitation light beam, and that the excitation light (3) can be masked out by the component from the detection beam path (9).

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, mit einer spektral selektiven Einrichtung zum Einkoppeln des Anregungslichts in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und/oder reflektierten Anregungslichts aus dem Detektionsstrahlengang.The invention relates to a microscope with a light source suitable for fluorescence excitation, with a spectrally selective device for coupling the excitation light into the microscope and to hide the scattered on the object and / or reflected excitation light from the detection beam path.

Sowohl bei der konventionellen wie auch bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie werden in den Strahlengang einer für Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle Farbstrahlteiler mit einer ganz besonderen Transmissions- und Reflexionscharakteristik verwendet. Dabei handelt es sich ganz überwiegend um dichroitische Strahlteiler. Mit einem solchen Element wird die Fluoreszenzanregungswellenlänge λill1 (bzw. λill2 , λill3 ..., λilln bei der Verwendung von mehreren Lasern) in den Beleuchtungsstrahlengang reflektiert, um die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen und dann zusammen mit dem am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslicht den Strahlengang bis hin zum Farbstrahlteiler zu durchlaufen. Das Anregungslicht mit den Wellenlängen λill1 , λill2 , λill3 ,...., λilln wird am Farbstrahlteiler zurück in den Laser reflektiert, nämlich aus dem Detektionsstrahlengang heraus. Das Fluoreszenzlicht mit den Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 , λfluo3 ,..., λfluon passiert den Farbstrahlteiler und wird – gegebenenfalls nach weiterer spektraler Aufteilung – detektiert.Both conventional and Confocal laser scanning microscopy is also used in the Beam path one for Fluorescence excitation suitable light source with color beam splitter a very special transmission and reflection characteristic used. Most of them are dichroic Beam splitter. With such an element, the fluorescence excitation wavelength λill1 (or λill2, λill3 ..., λilln at the use of several lasers) reflected in the illumination beam path, to stimulate the fluorescence distribution in the object and then together the beam path with the excitation light scattered and reflected on the object to go through to the color beam splitter. The excitation light with the wavelengths λill1, λill2, λill3, ...., λilln back on the color beam splitter reflected in the laser, namely out of the detection beam path. The fluorescent light with the Wavelengths λfluo1, λfluo2, λfluo3, ..., λfluon happens the color beam splitter and will - if necessary after further spectral division - detected.

Farbstrahlteiler sind üblicherweise durch ein Interferenzfilter realisiert und werden je nach den verwendeten Wellenlängen für die Anregung bzw. für die Detektion gezielt bedampft. An dieser Stelle sei angemerkt, dass gemäß voranstehender Beschreibung des Standes der Technik unter einem Dichroit ein Wellenlängen-separierbares Element verstanden wird, welches das Licht unterschiedlicher Wellenlänge aufgrund der Wellenlänge und nicht aufgrund der Polarisation trennt.Color beam splitters are common realized by an interference filter and are depending on the used wavelength for the Suggestion or for specifically fumes the detection. At this point it should be noted that according to the preceding Description of the Prior Art Under a dichroic a wavelength separable Element is understood which is due to the light of different wavelengths the wavelength and does not separate due to polarization.

In der Praxis ist die Verwendung von Farbstrahlteilern zunächst einmal insoweit nachteilig, als es sich hierbei um in der Herstellung aufwendige und daher teure optische Bausteine handelt. Des Weiteren ist nachteilig, dass Farbstrahlteiler eine feste Wellenlängencharakteristik aufweisen und daher nicht mit beliebiger Flexibilität hinsichtlich der Wellenlänge des Anregungslichts verwendet werden können. Bei einem Wechsel der Wellenlänge des Anregungslichts müssen auch die Farbstrahlteiler ausgewechselt werden, so beispielsweise bei einer Anordnung mehrerer Farbstrahlteiler in einem Filterrad. Dies ist abermals aufwendig und daher teuer und erfordert im Übrigen eine ganz besondere Justage der einzelnen Farbstrahlteiler.In practice, the use of color beam splitters first disadvantageous in so far as it concerns the manufacture complex and therefore expensive optical modules. Furthermore is disadvantageous that color beam splitter has a fixed wavelength characteristic have and therefore not with any flexibility regarding the wavelength of the excitation light can be used. When changing the wavelength of the excitation light the color beam splitters are also replaced, for example with an arrangement of several color beam splitters in a filter wheel. This is again complex and therefore expensive and, moreover, requires one very special adjustment of the individual color beam splitters.

Die Verwendung eines Farbstrahlteilers bringt den weiteren Nachteil mit sich, dass durch Reflexion bedingte Lichtverluste auftreten, insbesondere Lichtverluste von Fluoreszenzlicht, welches gerade detektiert werden soll. Der spektrale Transmissions-/Reflexionsbereich ist bei Farbstrahlteilern recht breit (λill ± 20 nm) und keineswegs ideal „steil". Folglich lässt sich das Fluoreszenzlicht aus diesem spektralen Bereich nicht ideal detektieren.The use of a color beam splitter brings the further disadvantage with it that light losses caused by reflection occur, in particular light loss from fluorescent light, which is currently to be detected. The spectral transmission / reflection range is very wide with color beam splitters (λill ± 20 nm) and is by no means ideally "steep" do not ideally detect the fluorescent light from this spectral range.

Bei Verwendung von Farbstrahlteilern ist die Anzahl der gleichzeitig einkoppelbaren Laser begrenzt, nämlich beispielsweise auf die Anzahl der in einem Filterrad angeordneten und kombinierbaren Farbstrahlteiler. Üblicherweise werden maximal drei Laser in den Strahlengang eingekoppelt. Wie bereits zuvor ausgeführt, müssen sämtliche Farbstrahlteiler, also auch die in einem Filterrad angeordneten Farbstrahlteiler, exakt justiert werden, was einen ganz erheblichen Aufwand in der Handhabung mit sich bringt. Alternativ können geeignete Neutralstrahlteiler eingesetzt werden, die das Fluoreszenzlicht gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten/reflektierten Anregungslicht effizient zum Detektor leiten. Die Verluste bei der Lasereinkopplung sind dabei jedoch erheblich.When using color beam splitters the number of lasers that can be coupled in simultaneously is limited, namely, for example on the number of color beam splitters arranged and combinable in a filter wheel. Usually a maximum of three lasers are coupled into the beam path. How already executed before have to all Color beam splitter, including those arranged in a filter wheel Color beam splitter, can be adjusted exactly, which is a very considerable Involves effort in handling. Alternatively, suitable ones Neutral beam splitters are used, which contain the fluorescent light together with the excitation light scattered / reflected on the object route efficiently to the detector. The losses in laser coupling are significant.

Zur Dokumentation des Standes der Technik wird lediglich beispielhaft auf die DE 196 27 568 A1 verwiesen, die eine optische Anordnung zur konfokalen Mikroskopie zeigt. Dabei handelt es sich im Konkreten um eine Anordnung zur zeitgleichen konfokalen Beleuchtung einer Objektebene mit einer Vielzahl geeignet divergierender Leuchtpunkte sowie zugehörigen Abbildungsgliedern und einer Vielzahl von Pinholes zur konfokalen kontrastreichen Abbildung in einem Beobachtungsgerät, wobei es sich dabei um ein Mikroskop handeln kann. Die Einkopplung mehrerer Lichtquellen erfolgt dort über ein diffraktives Element. Mehrere optische Teilerelemente bzw. Farbstrahlteiler sind im Detektionsstrahlengang angeordnet, wodurch sich ein ganz erheblicher apparativer Aufwand ergibt.For documentation of the state of the art, reference is only made to the DE 196 27 568 A1 referenced, which shows an optical arrangement for confocal microscopy. Specifically, this is an arrangement for simultaneous confocal illumination of an object plane with a large number of suitably divergent luminous dots and associated imaging elements and a large number of pinholes for confocal high-contrast imaging in an observation device, which can be a microscope. Several light sources are coupled in via a diffractive element. Several optical splitter elements or color beam splitters are arranged in the detection beam path, which results in a very considerable outlay on equipment.

Hinsichtlich der Verwendung aktiver optischer Elemente im Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops wird ergänzend auf die US 4,827,125 und die US 5,410,371 verwiesen, wobei diese Druckschriften die grundsätzliche Verwendung eines AOD (Acousto-Optical-Deflector) und eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) zeigen, und zwar stets mit dem Zweck, einen Strahl abzulenken oder abzuschwächen.With regard to the use of active optical elements in the beam path of a laser scanning microscope, the US 4,827,125 and the US 5,410,371 referenced, these documents show the basic use of an AOD (Acousto-Optical-Deflector) and an AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter), always with the purpose of deflecting or attenuating a beam.

Aus der DE 195 10 102 C1 ist ein gattungsbildendes Mikroskop bekannt, bei dem im Beleuchtungsstrahlengang zwei identische Prismenspektrometer, zwei Streifenblenden sowie eine Selektionsblende angeordnet sind. Hierbei ist der monochromatischen Lichtquelle ein erste Streifenblende und ein erstes Prismenspektrometer nachgeordnet, wobei das erste Prismenspektrometer das aus der ersten Streifenblende austretende Anregungslicht spektral auffächert und in eine Zwischenbildebene fokussiert, in der die Selektionsblende angeordnet ist. Die Selektionsblende ist in der Zwischenbildebene beweglich angeordnet und kann einzelne Lichtkomponenten des spektral aufgefächerten Lichts passieren lassen oder reflektieren. Das zur Objektbeleucht dienende Licht kann sodann das zweiten Prismenspektro– meter passieren, das aufgefächerte Anregungslicht spektral zusammenführt und auf die zweite Streifenblende fokussiert. Die zweite Streifenblende wirkt sowohl als Anregungslicht- als auch als Detektionsstreifenblende für das konfokale Fluoreszenzmikroskop. Das Anregungslicht, das die zweite Streifenblende passieren kann, wird über einen Scanspiegel zum Objekt geleitet, das hierdurch zur Fluoreszenz angeregt werden kann.From the DE 195 10 102 C1 A generic microscope is known in which two identical prism spectrometers, two strip diaphragms and a selection diaphragm are arranged in the illumination beam path. Here, the monochromatic light source is followed by a first stripe diaphragm and a first prism spectrometer, the first prism spectrometer spectrally fanning out the excitation light emerging from the first stripe diaphragm and focussing into an intermediate image plane in which the selection diaphragm is arranged. The selection screen is moved in the intermediate image plane Lich arranged and can pass or reflect individual light components of the spectrally fanned light. The light used to illuminate the object can then pass through the second prism spectrometer, which spectrally merges the fanned excitation light and focuses on the second strip diaphragm. The second strip diaphragm acts both as an excitation light and as a detection strip diaphragm for the confocal fluorescence microscope. The excitation light, which can pass through the second strip diaphragm, is guided to the object via a scanning mirror, which can thereby be excited to fluoresce.

Das zu detektierende Fluoreszenzlicht durchläuft den optischen Strahlengang in umgekehrter Richtung, bis es die zweite Streifenblende erreicht. Lediglich Licht aus der Fokalebene des Mikroskopobjektivs kann die zweite Streifenblende passieren. Das zweite Prismenspektrometer fächert das Fluoreszenzlicht spektral auf und fokussiert das aufgefächerte Fluoreszenzlicht auf die in der Zwischenbildebene angeordnete Selektionsblende. Das am Objekt gestreute bzw. reflektierte Licht wird in gleicher Weise wie das Anregungslicht von dem zweiten Prismenspektrometer spektral aufgefächert und ebenfalls auf die Selektionsblende fokussiert. Aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtwegs wird das am Objekt reflektierte bzw. gestreute Anregungslicht von der Selektionsblende in Richtung der Lichtquelle geleitet. Das Fluoreszenzlicht hingegen wird in Richtung des Detektors geleitet. Das spektral aufgefächerte Fluoreszenzlicht wird von einem dritten, der Selektionsblende nachgeordneten Prismenspektrometer zusammengeführt und auf den Detektor fokussiert.The fluorescent light to be detected passes through the optical beam path in the opposite direction until it is the second Strip aperture reached. Only light from the focal plane of the Microscope objective can pass through the second strip aperture. The second prism spectrometer the fluorescent light spectrally and focuses the fanned fluorescent light on the selection screen arranged in the intermediate image level. The Light scattered or reflected on the object is used in the same way like the excitation light from the second prism spectrometer spectral fanned and also focused on the selection aperture. Due to the Reversibility of the light path is reflected or reflected on the object scattered excitation light from the selection diaphragm in the direction of the Led light source. The fluorescent light, however, is in the direction of the detector. The spectrally fanned fluorescent light is from a third prism spectrometer downstream of the selection aperture together and focused on the detector.

Durch die Verschiebung der Selektionsblende kann Fluoreszenzlicht einer gewünschten Fluoreszenzwellenlänge dem Detektor zugeleitet werden, wodurch in vorteilhafter Weise mit ein und denselben Komponenten dieses optischen Strahlengangs Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche detektiert werden kann. Zur Fluoreszenzanregung des Objekts können auch mehrere monochromatische Lichtquellen dienen, so dass das aus dieser Entgegenhaltung bekannte konfokale Fluoreszenzmikroskop. mit Anregungslicht mehrerer Anregungswellenlängen betrieben werden kann.By moving the selection screen can create a desired fluorescent light Fluorescence wavelength be fed to the detector, thereby advantageously with one and the same components of this optical beam light different Wavelength ranges can be detected. For fluorescence excitation of the object, too multiple monochromatic light sources are used, so that's from this Citation known confocal fluorescence microscope. with excitation light several excitation wavelengths can be operated.

Das aus der DE 195 10 102 C1 bekannte konfokale Fluoreszenzmikroskop ist jedoch in der Praxis problematisch. So müssen die beiden Streifenblenden sowie die Selektionsblende exakt aufeinander justiert sein. Auch die drei Prismenspektrometer nebst dazugehöriger Anpassungsoptik müssen exakt zueinander positioniert und kalibriert sein. Schließlich erfordert ein stabiler Langzeitbetrieb aufgrund der Vielzahl der rotwendigen optischen Komponenten einen ganz erheblichen apperativen Aufwand.That from the DE 195 10 102 C1 Known confocal fluorescence microscope is problematic in practice. For example, the two strip diaphragms and the selection diaphragm must be exactly aligned. The three prism spectrometers and the associated adjustment optics must also be positioned and calibrated exactly to one another. After all, due to the large number of red-faced optical components, stable long-term operation requires a great deal of apperative effort.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein gattungsbildendes Mikroskop derart auszugestalten und weiterzubilden, dass die bislang auftretenden Justierprobleme vermindert sind.The present invention lies Now the task is based on a generic microscope to design and further develop that so far occurring Adjustment problems are reduced.

Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe sowohl durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 als auch durch die Merkmale des Patentanspruchs 2. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop gemäß Patentanspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der spektral selektiven Einrichtung um ein einzelnes, passives Bauteil handelt, dass das Anregungslicht unterschiedliche Wellenlängen umfasst, die aus unterschiedlichen Richtungen auf das Bauteil einfallen und von diesem koaxial zu einem Anregungslichtstrahl vereinigbar sind, und dass das Anregungslicht durch das Bauteil aus dem Detektionsstrahlengang ausblendbar ist.The microscope according to the invention solves the above Task both by the features of claim 1 and by the features of claim 2. Then is the generic Microscope according to claim 1 characterized in that it is spectrally selective Facility is a single, passive component that the Excitation light includes different wavelengths from different directions incident on the component and from it coaxial to an excitation light beam can be combined, and that the excitation light from the component the detection beam path can be masked out.

Gemäß Patentanspruch 2 ist das erfindungsgemäße Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der spektral selektiven Einrichtung um ein einzelnes, aktives Bauteil handelt, welches auf die aus dem Detektionsstrahlengang auszublen dende Anregungswellenlänge einstellbar ist.According to claim 2 that is microscope according to the invention characterized in that it is spectrally selective Facility is a single, active component that is based on the excitation wavelength to be masked out from the detection beam path is adjustable is.

Das Wesen der Erfindung liegt in der Ausbildung der spektral selektiven Einrichtung als einzelnes Bauteil, das in seiner Ausbildung als passives Bauteil Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen koaxial vereinigt und das Anregungslicht aus dem Detektionsstrahlengang das in seiner Ausbildung als aktives Bauteil zwecks aus dem Detektionsstrahlengang auszublendenen (monochromatischen) Anregungslichts auf die Anregungswellenlänge einstellbar ist.The essence of the invention lies in the formation of the spectrally selective device as a single Component that excites in its training as a passive component different wavelengths coaxially combines and the excitation light from the detection beam path that in its training as an active component for the purpose of the detection beam path (monochromatic) excitation light to be suppressed adjustable to the excitation wavelength is.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass man im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, insbesondere im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, den dort bislang verwendeten Farbstrahlteiler durch ein ganz besonderes spektral selektives Element ersetzen kann, nämlich durch ein spektral selektives Element, welches geeignet ist, Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen auszublenden oder einzublenden bzw. einzukoppeln. Dieses spektral selektive Element dient einerseits zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und andererseits zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der entsprechenden Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht. Insoweit kommt dem spektral selektiven Element eine Doppelfunktion zu, wobei beide Funktionen quasi zwangsgekoppelt sind.According to the invention, it has been recognized that in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation, especially in the beam path of a confocal laser scanning microscope, the color beam splitter used there so far by a very special one can replace spectrally selective element, namely by a spectrally selective Element that is suitable, excitation light different wavelength hide or unhide or couple. This spectral The selective element serves on the one hand to couple the excitation light at least one light source in the microscope and on the other hand Hiding the excitation light scattered and reflected on the object or the corresponding excitation wavelength from the over the Detection beam path from the light coming from the object. So far the spectrally selective element has a double function, both of which Functions are quasi-coupled.

Alternativ zu der Fähigkeit des spektral selektiven Elements, Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen ausblenden zu können, ist das spektral selektive Element auf die jeweils einzublendende oder auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar ist. Auch insoweit ist aufgrund der voranstehend geschilderten Doppelfunktion eine Zwangskopplung auf einfache Weise gewährleistet, nämlich dadurch, dass mit Hilfe des spektral selektiven Elements das Anregungslicht in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelbar und dass exakt die Wellenlänge des Anregungslichts, nämlich die Anregungswellenlänge, aufgrund der hier vorgesehenen Einstellbarkeit aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht ausblendbar ist, so dass zur Detektion das vom Objekt kommende Detektionslicht (=Fluoreszenzlicht) verbleibt.As an alternative to the ability of the spectrally selective element to be able to block excitation light of different wavelengths, the spectrally selective element is on the one to be faded in or excitation wavelength to be suppressed is adjustable. In this respect, too, due to the double function described above, forced coupling is ensured in a simple manner, namely in that the excitation light can be coupled into the illuminating beam path with the aid of the spectrally selective element and that the wavelength of the excitation light, namely the excitation wavelength, can be exactly determined from the setting provided here Light coming from the object can be suppressed via the detection beam path, so that the detection light coming from the object (= fluorescent light) remains for detection.

So kann es sich bei dem spektral selektiven Element – zur Begünstigung der vo ranstehend erörterten Doppelfunktion – um ein passives Element bzw. Bauteil handeln. Dazu könnte das spektral selektive Element als transparentes optisches Gitter oder als holographisches Element ausgeführt sein. Ebenso ist es denkbar, das spektral selektive Element als passiven AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder als passiven AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) auszuführen.So it can be with the spectral selective element - for favoring of those discussed above Dual function - um act a passive element or component. That could be spectrally selective element as a transparent optical grating or be designed as a holographic element. It is also conceivable the spectrally selective element as a passive AOD (Acousto-Optical Deflector) or to be implemented as a passive AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter).

Insbesondere zur Realisierung der Einstellbarkeit des spektral selektiven Elements auf die auszublendende Anregungswellenlänge kann es sich bei dem spektral selektiven Element um ein aktives Bauteil handeln, so bspw. um ein akustooptisch und/oder elektrooptisch arbeitendes Element. Im Konkreten kommt hier als spektral selektives Element ein AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) in Frage.In particular to implement the Adjustability of the spectrally selective element to the one to be hidden Excitation wavelength the spectrally selective element can be an active one Act component, for example an acousto-optical and / or electro-optical working element. In concrete terms, here comes as spectrally selective Element an AOD (Acousto-Optical-Deflector) or an AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) in question.

Anstelle des im Stand der Technik üblichen Farbstrahlteilers wird hier ein aktives spektral selektives Element verwendet, so beispielsweise ein AOD oder ein AOTF. Die Aufgabe dieser aktiven Bauteile besteht darin, das Anregungslicht der Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser λill1 , λill2 , λill3 ,...., λilln in den Beleuchtsstrahlengang und somit in das Mikroskop einzukoppeln, um danach per Beam-Scanning die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen. Bei der Detektion kann das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht nahezu ungestört das aktive spektral selektive Element passieren. Dabei wird das vom Objekt gestreute oder reflektierte Licht mit den Anregungswellenlängen der Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser aus dem Detektionsstrahlengang weitgehend herausreflektiert.Instead of the color beam splitter common in the prior art if an active spectrally selective element is used here, so for example an AOD or an AOTF. The task of this active Components consists in the excitation light of the light source or of the laser or the laser λill1 , λill2 , λill3 , ...., λilln to couple into the light beam path and thus into the microscope, to then use beam scanning to stimulate the fluorescence distribution in the object. During detection, the fluorescent light coming from the object can almost undisturbed pass the active spectrally selective element. It will light scattered or reflected by the object with the excitation wavelengths of the Light source or the laser or the laser from the detection beam path largely reflected out.

Zur Einkopplung einer Lichtquelle bzw. eines Lasers oder mehrerer Laser mit verschiedenen Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln kann ein AOD mit entsprechenden Frequenzen ν1 , ν2 ,..., νn vorzugsweise simultan beschaltet werden, so dass die verschiedenen Laserstrahlen nach dem Durchgang durch den AOD koaxial mit der optischen Achse verlaufen. Hinsichtlich der Verwendung des AOD ist wesentlich, dass dort eine Frequenz νn eine Wellenlänge λilln, selektiert, die aus dem eigentlichen Strahlengang abgelenkt wird. Der Ablenkungswinkel ϕ ist dabei durch die Formel ϕ = λilln νn/2f definiert, wobei f die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Schallwelle im AOD ist. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon zusammen mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln durchläuft nun den AOD in umgekehrter Richtung. Jedoch wird gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs das Anregungslicht mit den Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln wegen der spezifischen Einstellung des AOD aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung des Lasers abgelenkt (1. Ordnung). Somit kann das „spektral verbleibende" Fluoreszenzlicht um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon – verglichen mit einem herkömmlichen Farbstrahlteiler – auf verbesserte Weise detektiert werden (0. Ordnung). Dadurch lässt sich jedenfalls die Justage der Einkopplung unterschiedlicher Laser einfacher als im Stand der Technik (dort unter Anwendung herkömmlicher Farbstrahlteiler in einem Filterrad) vornehmen.To couple a light source or a laser or several lasers with different wavelengths λill1, λill2, ..., λilln, an AOD with corresponding frequencies ν1, ν2, ..., νn can preferably be connected simultaneously, so that the different laser beams after Passage through the AOD is coaxial with the optical axis. With regard to the use of the AOD, it is essential that a frequency νn a wavelength λilln is selected there, which is deflected from the actual beam path. The deflection angle ϕ is given by the formula ϕ = λilln νn / 2f defined, where f is the velocity of propagation of the sound wave in the AOD. The fluorescent light to be detected with a spectral distribution around the wavelengths λfluo1, λfluo2, ..., λfluon together with the excitation light scattered or reflected at the object with the wavelengths λill1, λill2, ..., λilln now passes through the AOD in the opposite direction. However, according to the reversibility of the light path, the excitation light with the wavelengths λill1, λill2, ..., λilln is deflected from the detection beam path in the direction of the laser because of the specific setting of the AOD (1st order). Thus, the "spectrally remaining" fluorescent light around the wavelengths λfluo1, λfluo2, ..., λfluon can be detected in an improved manner (0th order) compared to a conventional color beam splitter. In any case, this makes it easier to adjust the coupling of different lasers than in the state of the art (using conventional color beam splitters in a filter wheel).

In weiter vorteilhafter Weise könnte ein Nachschalten weiterer AOTF die einzelnen Wellenlängen in ihrer Leistung nach der Strahlzusammenführung selektiv regeln.A further switching could be advantageous further AOTF the individual wavelengths in their performance the beam merging regulate selectively.

Zur Einkopplung einer Laserlichtquelle mit verschiedenen Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln kann ein AOTF mit entsprechenden Frequenzen ν1 , ν2 ,..., νn simultan geschaltet sein, so dass die verschiedenen Wellenlängen in ihrer Anregungsleistung variieren und auf die Anwendung hin optimierbar sind. Die Zuführung des Laserlichts kann mittels Lichtleitfaser erfolgen.For coupling a laser light source with different wavelengths λfill1, λfill2, ..., λfilln an AOTF with corresponding frequencies ν1, ν2, ..., νn can be switched simultaneously, so that the different wavelengths vary in their excitation power and can be optimized for the application. The feeding of the Laser light can be made using optical fiber.

Jedenfalls wird die Lichtquelle bzw. der Laser koaxial aus der Richtung der 1. Ordnung des Kristalls eingekoppelt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln durchlaufen nun den AOTF in umgekehrte Richtung. Gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs wird das Anregungslicht mit den Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln wegen der spezifischen Einstellung des AOTF aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung der Lichtquelle bzw. des Lasers abgelenkt. Somit kann auch hierbei das „spektral verbleibende" Fluoreszenzlicht um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon in einer – verglichen zum herkömmlichen Farbstrahlteiler – verbesserten Weise detektiert werden (0. Ordnung).In any case, the light source or the laser is coupled coaxially from the direction of the 1st order of the crystal. The fluorescent light to be detected with a spectral distribution around the wavelengths λfluo1, λfluo2, ..., λfluon together with the excitation light scattered or reflected on the object with the Wavelengths λfill1, λfill2, ..., λfilln now pass through the AOTF in the opposite direction. According to the reversibility of the light path the excitation light with the wavelengths λfill1, λfill2, ..., λfilln because of the specific Adjustment of the AOTF from the detection beam path in the direction the light source or the laser. The “spectral remaining "fluorescent light around the wavelengths λfluo1, λfluo2, ..., λfluon in one - compared to the conventional Color beam splitter - improved Be detected (0th order).

Sowohl unter Verwendung eines AOD oder AOTF als auch unter Verwendung eines transparenten Gitters wird sich das Fluoreszenzlicht nach dem Duchgang durch das jeweilige aktive Element aufgrund der auftretenden Dispersion spektral auffächern. Insoweit ist es von Vorteil, ein oder mehrere entsprechende „inverse" Elemente nachzuschalten, so dass die ungewünschte spektrale Auffächerung wieder rückgängig gemacht wird. Auch ist es denkbar, weitere optische Elemente zur Fokussierung oder zum Ausblenden unerwünschter Strahlanteile dem jeweiligen Element (AOD, AOTF oder transparentes Gitter) vor- bzw. nachzuschalten. Der dadurch wiedervereinigte Detektionsstrahl kann dann in herkömmlicher Weise durch nachgeschaltete Farbstrahlteiler spektral zerlegt und auf die verschiedenen Detektoren abgebildet werden.Both when using an AOD or AOTF and when using a transparent grating, the fluorescent light will spectrally fan out after passing through the respective active element due to the dispersion that occurs. In this respect, it is advantageous to add one or more corresponding “inverse” elements, so that the undesired spectral fanning is canceled again. It is also possible bar, upstream or downstream of further optical elements for focusing or for masking out undesired beam components of the respective element (AOD, AOTF or transparent grating). The detection beam thus reunited can then be spectrally broken down in a conventional manner by downstream color beam splitters and imaged on the various detectors.

Grundsätzlich ist eine Anordnung im Sinne eines „Multibanddetektor" denkbar. Hierzu wird auf die Patentanmeldung DE 43 30 347.1 A1 verwiesen, deren Inhalt hier ausdrücklich hinzugezogen und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Zwischen der Scan-Einheit und dem AOD bzw. dem transparenten Gitter (bei mehreren Lichtquellen bzw. Lasern mehrerer Wellenlängen) bzw. dem AOTF (bei einer Lichtquelle bzw. einem Laser mit verschiedenen Wellenlängen) ist das Anregungs-Pinhole angeordnet, wobei dieses identisch mit dem Detektions-Pinhole ist. In vorteilhafter Weise wird dabei die Eigenschaft des Kristalls, den Lichtstrahl der 0. Ordnung durch den Prismeneffekt spektral aufzufächern, zur Detektion genutzt. Das dispersive Element des Multibanddetektors ist dabei mit dem Farbstrahlteiler zu einem Bauteil vereinigt, wodurch alle weiteren, dem herkömmlichen Detektionsstrahlengang nachgeordneten und mit weiteren Verlusten in der Fluoreszenzintensität behafteten Farbstrahlteiler entfallen.In principle, an arrangement in the sense of a “multiband detector” is conceivable. For this, refer to the patent application DE 43 30 347.1 A1 referenced, the content of which is expressly included here and which is assumed to be known. The excitation pinhole is arranged between the scan unit and the AOD or the transparent grating (in the case of several light sources or lasers of several wavelengths) or the AOTF (in the case of a light source or laser with different wavelengths), this being identical to the detection pinhole. The property of the crystal of spectrally fanning the light beam of the 0 th order through the prism effect is advantageously used for detection. The dispersive element of the multiband detector is combined with the color beam splitter to form a component, as a result of which all further color beam splitters downstream of the conventional detection beam path and with further losses in the fluorescence intensity are eliminated.

In ganz besonders vorteilhafter Weise kann die voranstehend erörterte Technik in Kombination mit einer in der Wellenlänge variabel durchstimmbaren Laserlichtquelle – z.B. Farbstofflaser, OPO (optisch parametrisierter Oszillator), Elektronenstrahlkollisionslichtquelle – äußerst flexible Fluoreszenzmikroskopie-Anwendungen ermöglichen. Die Einstellung bzw. Kontrolle der Anregungswellenlänge kann direkt mit der Ansteuereinheit eines der zuvor beschriebenen spektral selektiven Elemente gekoppelt sein, so dass nur diese Anregungswellenlänge koaxial in den Anregungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt und wiederum nur diese Wellenlänge aus dem Detektionsstrahlengang. ausgeblendet wird. Die Kopplung bzw.In a particularly advantageous way can be the one discussed above Technology in combination with a variable tunable wavelength Laser light source - e.g. Dye laser, OPO (optically parameterized oscillator), electron beam collision light source - extremely flexible Enable fluorescence microscopy applications. The setting or Control of the excitation wavelength can directly with the control unit one of the previously described spectrally selective elements can be coupled, so that only this excitation wavelength coaxial coupled into the excitation beam path of the microscope and again only this wavelength the detection beam path. is hidden. The coupling or

Zwangskopplung der Lichtquelle mit dem strahlteilenden Element kann entweder manuell oder automatisch oder gar nach einer vorgebbaren Vorschrift erfolgen, wobei diese Möglichkeit dem jeweiligen Anforderungsprofil anzupassen ist. Beispielsweise kann nach jeder gescannten Bildebene die Anregungswellenlänge sowie der Strahlteiler in geeigneter Weise verändert werden. Somit lassen sich Mehrfarbenfluoreszenzobjekte detektieren. Eine zeilenweise Umschaltung ist ebenso denkbar.Forced coupling of the light source with The beam splitting element can either be manual or automatic or even according to a prescribable regulation, this possibility is to be adapted to the respective requirement profile. For example the excitation wavelength as well as after each scanned image plane the beam splitter can be changed in a suitable manner. So leave multicolor fluorescence objects are detected. One line at a time Switching is also conceivable.

Zusammenfassend lassen sich die Vorteile der erfindungsgemäßen Lehre nebst vorteilhafter Ausgestaltung wie folgt zusammenfassen:
Die spektral selektiven Elemente sind für alle Wellenlängen außer für die selektierten Anregungswellenlängen λill1 , λill2 ,... λilln „transparent". Der „spektrale Verlust" ist minimal, da vom spektral selektiven Element nur der selektierte spektrale Bereich von typischerweise λilln ± 2 nm abgelenkt wird. Dadurch wird der spektrale Bereich für die Detektion vergrößert. Somit können nahezu beliebig viele unterschiedliche Wellenlängenbereiche simultan eingekoppelt und genutzt werden. Die spektral „verlorene Fluoreszenzintensität", die durch die spektral selektiven Elemente bedingt ist, ist geringer als bei herkömmlichen Farbstrahlteilern. Mit anderen Worten liegen hier reduzierte Intensitätsverluste im interessierenden Bereich vor. Die aktiven spektral selektiven Elemente sind flexibel einstellbar, so dass prinzipiell beliebig viele Lichtquellen bzw. Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen auch simultan in das Mikroskop einkoppelbar sind. Dies ermöglicht die verbesserte Anwendung bei Multi-Color FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung). Folglich ist dann nur noch eine Limitierung der spektralen Aufspaltung des Fluoreszenzlichts, bspw. durch „Cross-Talk", gegeben. Herkömmliche Sperrfilter können komplett entfallen, so dass weitere Verluste von Fluoreszenzlicht in der Detektion vermieden sind.In summary, the advantages of the teaching according to the invention, together with an advantageous embodiment, can be summarized as follows:
The spectrally selective elements are "transparent" for all wavelengths except for the selected excitation wavelengths λill1, λill2, ... λilln. The "spectral loss" is minimal, since only the selected spectral range of typically λilln ± 2 nm is deflected by the spectrally selective element becomes. This increases the spectral range for the detection. This means that almost any number of different wavelength ranges can be simultaneously coupled in and used. The spectrally "lost fluorescence intensity", which is caused by the spectrally selective elements, is lower than in conventional color beam splitters. In other words, there are reduced intensity losses in the region of interest. The active spectrally selective elements can be flexibly adjusted, so that in principle any number of light sources or lasers with different wavelengths can also be coupled simultaneously into the microscope, which enables improved use in multi-color FISH (fluorescence in-situ hybridization). As a result, the spectral splitting of the fluorescent light is only limited, for example, by "Cross-talk" given. Conventional blocking filters can be dispensed with completely, so that further losses of fluorescent light in the detection are avoided.

Schließlich ist es auch denkbar, dass ein anderes aktives holographisches Element dem spektral selektiven Element nachgeschaltet ist und dabei die Aufgabe des Strahlscanners ausübt. Beide Elemente können zu einem einzigen Bauteil zusammengefasst sein.Finally, it is also conceivable that another active holographic element is the spectrally selective Element is downstream and the task of the beam scanner exercises. Both elements can be combined into a single component.

Grundsätzlich lassen sich unterschiedliche Lichtquellen verwenden, solange sie zur Fluoreszenzanregung geeignet sind. So kommt bspw. eine Weißlichtquelle, eine Lichtquelle zur Verwendung eines optisch parametrisierten Oszillators, eine Elektro nenstrahlkollisionslichtquelle oder eine Laserlichtquelle in Frage, wobei die Laserlichtquelle in der Wellenlänge variabel durchstimmbar sein kann. Laserlichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen oder eine mehrere Laser umfassende Lichtquelle ist bzw. sind verwendbar.Basically, different light sources can be use as long as they are suitable for fluorescence excitation. So comes, for example, a white light source, a light source for using an optically parameterized oscillator, an electron beam collision light source or a laser light source in question, the laser light source variable in wavelength can be tuned. Laser light sources with different wavelengths or one Light source comprising several lasers can be used.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzwbilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 2 nachgeordneten Patentansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigenNow there are different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and educate. For this purpose, on the one hand to the claims 1 and 2 subordinate claims, on the other hand to the following explanation of preferred exemplary embodiments to refer to the invention with reference to the drawing. Combined with the explanation of the preferred embodiments the invention with reference to the drawing are also generally preferred Refinements and developments of teaching explained. In show the drawing

1 in einer schematischen Darstellung eine gattungsbildende optische Anorndung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops zur Dokumentation des der Erfindung zugrunde liegenden Standes der Technik, 1 a schematic representation of a generic optical arrangement in the beam path of a confocal laser scanning micros cops for documenting the state of the art on which the invention is based,

2 in einer schematischen Darstellung ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort ein Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkoppelbar ist, 2 a schematic representation of a first exemplary embodiment of an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, where a laser with different excitation wavelengths can be coupled in,

3 in einer schematischen Darstellung ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort drei Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkoppelbar sind, 3 a schematic representation of a second exemplary embodiment of an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, where three lasers with different excitation wavelengths can be coupled in,

4 in einer schematischen Darstellung ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, wobei dort die Einkopplung von drei Laserlichtquellen über ein transpa rentes Gitter erfolgt, 4 a schematic representation of a third embodiment of an optical arrangement according to the invention in the beam path of a confocal laser scanning microscope, where the coupling of three laser light sources takes place via a transparent grating,

5 in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dem aktiven spektral selektiven Element zur Strahlzusammenführung dienende Mittel nachgeschaltet sind, 5 a schematic representation, enlarged and partially, of the illuminating beam path and detection beam path, the active spectrally selective element for beam combining being connected downstream,

6 in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dort eine Dispersionskorrektur erfolgt, 6 in a schematic representation, enlarged and partially, the illuminating beam path and the detection beam path, a dispersion correction being carried out there,

7 in einer schematischen Darstellung die prinzipielle Funktionsweise eines AOD oder AOTF, 7 a schematic representation of the basic functioning of an AOD or AOTF,

8 in einer schematischen Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung, wobei dort eine zusätzliche spektrale Auffächerung vor einem Multibanddetektor stattfindet und 8th In a schematic representation, a further embodiment of an optical arrangement according to the invention, wherein there is an additional spectral fanning in front of a multiband detector

9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus 8, wobei dort im Detektionsstrahlengang vor dem Multibanddetektor ein variables Spaltfilter angeordnet ist. 9 in a schematic representation of the embodiment 8th , where a variable gap filter is arranged in the detection beam path in front of the multiband detector.

1 dokumentiert den Stand der Technik und zeigt dabei eine herkömmliche optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, wobei es sich hier um eine optische Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops handelt. Der Laserscanner 1 ist dabei lediglich symbolisch dargestellt. Bei der den Stand der Technik betreffenden Darstellung sind als Lichtquellen insgesamt drei Laser 2 vorgesehen, die mit ihrem Anregungslicht 3 über spektral selektive Elemente 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln. Bei den spektral selektiven Elementen 4 handelt es sich im Konkreten um einen Spiegel 6 sowie um Farbstrahlteiler 7. Jedenfalls wird das Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 eingekoppelt und gelangt über einen weiteren Spiegel 8 als Anregungslicht 9 zum Laserscanner 1. 1 documents the state of the art and shows a conventional optical arrangement in the beam path of a light source suitable for fluorescence excitation, which is an optical arrangement in the beam path of a confocal laser scanning microscope. The laser scanner 1 is only shown symbolically. In the illustration relating to the prior art, a total of three lasers are used as light sources 2 provided that with their excitation light 3 about spectrally selective elements 4 in the illumination beam path 5 of the microscope. With the spectrally selective elements 4 in concrete terms it is a mirror 6 as well as color beam splitters 7 , In any case, the excitation light 3 in the illumination beam path 5 coupled in and passes through another mirror 8th as an excitation light 9 to the laser scanner 1 ,

Das von dem ebenfalls lediglich symbolisch dargestellten Objekt 10 zurückkommende Licht – hier handelt es sich um das am Objekt gestreute und reflektierte Anregungslicht 9 einerseits und um das vom Objekt 10 ausgesandte Fluoreszenzlicht 11 – gelangt über den Spiegel 8 zu dem spektral selektiven Element 4, wobei es sich hier um den Farbstrahlteiler 7 handelt. Von dort aus wird das Anregungslicht 9 bzw. die Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang 12 vom Objekt 10 kommenden Licht 13 ausgeblendet und gelangt als zurückkommendes Anregungslicht 9 zurück zu den Lasern 2. Das durch den Farbstrahlteiler 7 nicht abgelenkte Detektionslicht 14 gelangt unmittelbar zu dem Detektor 15.The object that is also only symbolically represented 10 return light - this is the excitation light scattered and reflected on the object 9 on the one hand and around that of the object 10 emitted fluorescent light 11 - gets over the mirror 8th to the spectrally selective element 4 , which is the color beam splitter 7 is. From there the excitation light comes on 9 or the excitation wavelength from that via the detection beam path 12 from the object 10 coming light 13 fades out and comes as a returning excitation light 9 back to the lasers 2 , That through the color beam splitter 7 undeflected detection light 14 goes directly to the detector 15 ,

Erfindungsgemäß ist durch das spektral selektive Element 4 zurückkommendes Anregungslicht 3 unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar. Dies ist insbesondere in 4 dargestellt.According to the invention is the spectrally selective element 4 returning excitation light 3 different wavelengths can be suppressed. This is particularly true in 4 shown.

Alternativ – in ebenfalls erfindungsgemäßer Weise – ist das spektral selektive Element 4 auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar. Dies lässt sich den Ausführungsbeispielen aus den 2, 3 und 8, 9 besonders gut entnehmen.Alternatively - in a manner also according to the invention - is the spectrally selective element 4 adjustable to the excitation wavelength to be hidden. This can be seen from the exemplary embodiments in FIGS 2 . 3 and 8th . 9 remove particularly well.

Bei dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel ist lediglich ein Laser 2 vorgesehen, dessen Anregungslicht 3 unterschiedliche Wellenlängen aufweisen kann. Jedenfalls gelangt das Anregungslicht 3 über einen Spiegel 6 und über ein zusätzliches optisches Element, nämlich über eine Linse 16 zu einem AOTF 17, der als spektral selektives Element arbeitet. Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 wiederum über ein zusätzliches optisches Element – im hier gewählten Ausführungsbeispiel eine Linse 18 – und über einen Spiegel 8 zum Laserscanner 1. Vom Objekt 10 reflektiert, gelangt das zurückkommende Licht – reflektiertes Anregungslicht 9 und Detektionslicht 11 – über den Spiegel 8 und die Linse 18 zurück in den AOTF 17 und wird dort entsprechend der Beschattung des AOTF 17 teilweise ausgeblendet. Im Konkreten wird nämlich das Detektionslicht bzw. Fluoreszenzlicht 11 über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15 geführt (0. Ordnung). Das zurückkommende Anregungslicht 9 wird dagegen über die Linse 16 und den Spiegel 6 zurück zum Laser 2 geführt und ist somit aus dem Detektionsstrahlengang 12 ausgeblendet. Ähnlich verhält es sich bei dem in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel, wobei dort gleichzeitig drei Laser 2 über zusätzliche optische Elemente, hier Linsen 16, ihr Anregungslicht 3 über ein AOD 19, eine weitere nachgeschaltete Linse 18 und einen Spiegel 8 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 einkoppeln. Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 zum Laserscanner 1 und zum Objekt 10.At the in 2 The embodiment shown is only a laser 2 provided its excitation light 3 can have different wavelengths. In any case, the excitation light arrives 3 through a mirror 6 and an additional optical element, namely a lens 16 to an AOTF 17 that works as a spectrally selective element. The excitation light comes from there 3 again via an additional optical element - a lens in the exemplary embodiment chosen here 18 - and a mirror 8th to the laser scanner 1 , From the object 10 reflected, the returning light arrives - reflected excitation light 9 and detection light 11 - over the mirror 8th and the lens 18 back to the AOTF 17 and is there according to the shading of the AOTF 17 partially hidden. Specifically, namely the detection light or fluorescent light 11 via the detection beam path 12 to the detector 15 managed (0th order). The returning excitation light 9 is against the lens 16 and the mirror 6 back to the laser 2 guided and is thus out of the detection beam path 12 hidden. It is similar with the in 3 shown embodiment, where there are three lasers simultaneously 2 about additional optical elements, here lenses 16 , your excitation light 3 about an AOD 19 , another downstream lens 18 and a mirror 8th in the illumination beam path 5 inject. The excitation light comes from there 3 to the laser scanner 1 and to the object 10 ,

Das vom Objekt kommende Licht 13 umfasst bei dem voranstehend genannten Ausführungsbeispiel Fluoreszenzlicht 11 und zurückkommendes Anregungslicht 9, wobei dort der AOD 19 das zurückkommende Fluoreszenzlicht als Detektionslicht 14 zu dem Detektor 15 führt. Das zurückkommende Anregungslicht 9 wird ausgeblendet und gelangt über Linsen 16 zu den jeweiligen Lasern 2.The light coming from the object 13 includes fluorescent light in the above-mentioned embodiment 11 and returning excitation light 9 , where the AOD 19 the returning fluorescent light as detection light 14 to the detector 15 leads. The returning excitation light 9 is hidden and reaches Lin sen 16 to the respective lasers 2 ,

Das in 4 gezeigte Ausführungsbeispiel umfasst als spektral selektives Element 4 ein transparentes Gitter 20, wobei über das transparente Gitter 20 gleichzeitig drei Laser 2 ihr Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln. Wesentlich ist hier jedenfalls, dass das transparente Gitter 20 das vom Objekt 10 zurückkommende Anregungslicht 9 aus dem Detektionsstrahlengang ausblendet, so dass dieses Licht zurück zu den Lasern 2 gelangt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht 11 gelangt über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15.This in 4 The exemplary embodiment shown comprises as a spectrally selective element 4 a transparent grid 20 , being over the transparent grid 20 three lasers simultaneously 2 your excitation light 3 in the illumination beam path 5 of the microscope. In any case, it is essential that the transparent grid 20 that of the object 10 returning excitation light 9 fades out of the detection beam path so that this light returns to the lasers 2 arrives. The fluorescent light to be detected 11 reaches the detector via the detection beam path 12 15 ,

5 zeigt die Möglichkeit einer Dispersionskorrektur, wobei das vom Objekt zurückkomende Licht 13 in den AOTF 17 oder AOD 19 gelangt. Dort wird das zurückkommende Detektionslicht 14 – zwangsweise – spektral aufgefächert und über nachgeschaltete Elemente – AOD/AOTF – parallelisiert und schließlich konvergiert. Das spektral vereinigte Detektionslicht 14 gelangt von dort zu dem in 5 nicht gezeigten Detektor 15. 5 shows the possibility of a dispersion correction, whereby the light coming back from the object 13 in the AOTF 17 or AOD 19 arrives. The returning detection light is there 14 - compulsory - spectrally fanned out and parallelized via downstream elements - AOD / AOTF - and finally converged. The spectrally combined detection light 14 from there to the in 5 not shown detector 15 ,

Bei der in 6 gezeigten Dispersionskorrektur wird das vom Objekt kommende Licht 13 mittels AOD 17/AOTF 19 aufgefächert, wobei das aufgefächerte Detektionslicht 14 über ein weiteres passives spektral selektives Element 4 – AOTF 17 oder AOD 19 – über eine Linse 21 mit Feldkorrektur konvertiert und durch ein Detektionspinhole 22 oder durch einen Detektionsspalt zum Detektor 15 gelangt.At the in 6 Dispersion correction shown is the light coming from the object 13 using AOD 17 / AOTF 19 fanned out, the fanned detection light 14 via another passive spectrally selective element 4 - AOTF 17 or AOD 19 - via a lens 21 converted with field correction and through a detection pinhole 22 or through a detection slit to the detector 15 arrives.

Gemäß der Darstellung in 7 handelt es sich bei dem spektral selektiven Element 4 um ein AOTF 17 oder ein AOD 19, wobei diese Elemente einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier 0. Ordnung umfassen. Dieser Kristall bzw. dieses spektral selektive Element wird über ein Piezoelement 23 angeregt bzw. beaufschlagt. 7 zeigt besonders deutlich, dass das vom Objekt kommende Licht 13 in dem AOTF 17 bzw. AOD 19 aufgespalten wird, wobei das Detektionslicht 14 als dispersionsfreies Licht 0. Ordnung ungehindert durch den Kristall läuft. Das vom Objekt zurückkommende Anregungslicht 9 wird dagegen als Licht 1. Ordnung abgelenkt und zurück zu den hier nicht gezeigten Lasern geführt.As shown in 7 is the spectrally selective element 4 an AOTF 17 or an AOD 19 , where these elements comprise a special crystal with zero-order zero dispersion. This crystal or this spectrally selective element is via a piezo element 23 excited or acted upon. 7 shows particularly clearly that the light coming from the object 13 in the AOTF 17 or AOD 19 is split, the detection light 14 runs through the crystal unhindered as zero-order light. The excitation light coming back from the object 9 is contrasted as light 1 , Order distracted and led back to the lasers not shown here.

8 zeigt eine spezielle Detektion unter Ausnutzung der spektralen Auffächerung des spektral selektiven Elements 4, wobei hier im Konkreten ein AOTF 17 verwendet ist. Das vom Objekt 10 kommende Licht 13 wird im AOTF 17 spektral aufgespalten, wobei das Detektionslicht 14 über eine Linse 16 und einen Spiegel 6 zu einem Multibanddetektor 24 bzw. Spektrometer gelangt. Der Spiegel 6 führt zu einer Verlängerung der Strecke, so dass eine Auffächerung des zurückkomenden Detektionslichts 14 bis hin zum Multibanddetektor 24 begünstigt wird. 8th shows a special detection using the spectral spread of the spectrally selective element 4 , with an AOTF 17 is used. That of the object 10 coming light 13 is in the AOTF 17 spectrally split, the detection light 14 through a lens 16 and a mirror 6 to a multiband detector 24 or spectrometer. The mirror 6 leads to an extension of the route, so that the returning detection light is fanned out 14 up to the multiband detector 24 is favored.

Das im AOTF 17 ausgeblendete Anregungslicht 9 gelangt über die Linse 16 und den Spiegel 8 zurück zum Laser 2.That in the AOTF 17 hidden excitation light 9 gets through the lens 16 and the mirror 8th back to the laser 2 ,

Schließlich zeigt 9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus 8, wobei dort – in Ergänzung – im Detektionsstrahlengang vor dem Multibanddetektor 24 ein variables Spaltfilter 25 angeordnet ist. Dieses Spaltfilter 25 ist im Detektionsstrahlengang 12 unmittelbar vor dem Detektor 15 angeordnet und im Detektionsstrahlengang positionierbar. Des Weiteren ist der Spalt 26 des Spaltfilters 25 variabel, so dass auch insoweit eine spektrale Selektion des Detektionslichts 14 möglich ist.Finally shows 9 in a schematic representation of the embodiment 8th , where - in addition - in the detection beam path in front of the multiband detector 24 a variable gap filter 25 is arranged. This gap filter 25 is in the detection beam path 12 immediately in front of the detector 15 arranged and positionable in the detection beam path. Furthermore, the gap 26 of the gap filter 25 variable, so that a spectral selection of the detection light 14 is possible.

Hinsichtlich weiterer Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lehre, die den Figuren nicht zu entnehmen sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung und die dort geschilderte Funktionsweise der Lehre und der vorteilhaften Ausgestaltungen verwiesen.With regard to further configurations the teaching according to the invention, that cannot be seen in the figures is used to avoid Repeats on the general part of the description and the there described mode of operation of the teaching and the advantageous Referenced configurations.

Claims

Microscope with a light source suitable for fluorescence excitation ( 2 ), with a spectrally selective device for coupling the excitation light ( 3 ) into the microscope and to hide the on the object ( 10 ) scattered and / or reflected excitation light ( 9 ) from the detection beam path ( 12 ), characterized in that the spectrally selective device is a single, passive component, that the excitation light ( 3 ) comprises different wavelengths which strike the component from different directions and can be coaxially combined by the latter to form an excitation light beam, and that the excitation light ( 3 ) through the component from the detection beam path ( 9 ) can be hidden.

Microscope, with a light source suitable for fluorescence excitation ( 2 ), with a spectrally selective device for coupling the excitation light ( 3 ) into the microscope and to hide the on the object ( 10 ) scattered and / or reflected excitation light ( 3 ) from the detection beam path ( 9 ), characterized in that the spectrally selective device is a single, active component which is based on the from the detection beam path ( 9 ) excitation wavelength to be suppressed is adjustable.

Microscope according to claim 1, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as a transparent optical grating ( 20 ) is executed.

Microscope according to claim 1, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is designed as a holographic element.

Microscope according to claim 1, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as passive AOD (Acousto-Optical-Deflector) ( 19 ) or passive AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) ( 17 ) is executed.

Microscope according to claim 2, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) works acoustically and / or electro-optically.

Microscope according to claim 6, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as AOD (Acousto-Optical-Deflector) ( 19 ) is executed.

Microscope according to claim 7, wherein a plurality of light sources with different wavelengths can be coupled, characterized in that the AOD ( 19 ) is connected to corresponding frequencies simultaneously, so that the different light beams after passing through the AOD ( 19 ) coaxial with the optical axis of the illumination beam path ( 5 ) are.

Microscope according to claim 6, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) as AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) ( 17 ) is executed.

Microscope according to claim 9, wherein a light source with different wavelengths can be coupled, characterized in that the AOTF ( 17 ) can be connected to the corresponding frequencies simultaneously.

Microscope according to one of claims 1 to 10, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) is constructed in such a way that a spectral fanning out of the detection light ( 11 ) is at least largely avoided.

Microscope according to one of claims 1 to 11, characterized in that for the power-specific control of individual wavelengths the spectrally selective element ( 4 ) at least one further active or spectrally selective element is connected downstream.

Microscope according to claim 12, characterized in that the further spectrally selective element is an AOD ( 19 ) acts.

Microscope according to claim 12, characterized in that the further spectrally selective element is an AOTF ( 17 ) acts.

Microscope according to one of claims 1 to 14, wherein the spectrally selective element ( 4 ) comprises a control unit, characterized in that the setting / control of the excitation wavelength is forcibly coupled to the control unit, so that only this excitation wavelength is preferably coaxial in the illumination beam path ( 5 ) of the microscope can be coupled and only this wavelength from the detection beam path ( 12 ) can be hidden.

Microscope according to one of claims 1 to 15, characterized in that the control of the light source ( 2 ) with the spectrally selective element ( 4 ) is done manually or automatically.

Microscope according to claim 16, characterized in that the control of the light source ( 2 ) with the spectrally selective element ( 4 ) according to a freely definable regulation.

Microscope according to one of claims 1 to 17, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) at least one further optical element is connected upstream and / or downstream.

Microscope according to claim 18, characterized in that in the illuminating beam path ( 5 ) the spectrally selective element ( 4 ) downstream active holographic element serves as a beam scanner.

Microscope according to claim 19, characterized in that the spectrally selective element ( 4 ) and the downstream holographic element are combined to form a functional building block.

Microscope according to claim 18, characterized in that the further optical element is a beam adjustment means or a means for compensation, which by the spectrally selective element ( 4 ) caused spectral spreading.

Microscope according to claim 21, characterized in that the beam adjustment means as a lens ( 16 ) is executed.

Microscope according to claim 21, characterized in that the beam adjustment means is designed as a prism.

Microscope according to claim 21, characterized in that the beam adjustment means as an aperture, preferably as a pinhole or slit diaphragm is.

Microscope according to claim 21, characterized in that the beam adjustment means as a filter, preferably as a blocking filter, accomplished is.

Microscope according to claim 25, characterized in that the filter immediately in front of the detector ( 15 ) is arranged.

Microscope according to claim 21, characterized in that the beam adjustment means is designed as a focusing means.

Microscope according to one of claims 18 to 27, characterized in that as a further opti cal element a color beam splitter is provided for further spectral decomposition.

Microscope according to one of claims 18 to 28, characterized in that as a further optical element at least one AOTF ( 17 ) is provided.

Microscope according to claim 29, characterized in that the AOTF ( 17 ) can be used as a passive element.

Microscope according to one of claims 18 to 30, characterized in that that combinations of further optical elements are provided.

Microscope according to one of claims 1 to 31, characterized in that in the detection beam path ( 12 ) Multiple reflection means are arranged which bring about an increase in the angle of the fanning out of the detection beam.

Microscope according to one of claims 1 to 32, characterized in that in the detection beam path ( 12 ), preferably immediately in front of the detector ( 15 ), a gap filter ( 25 ) is arranged.

Microscope according to claim 33, characterized in that the gap filter ( 25 ) in the detection beam path ( 12 ) can be positioned.

Microscope according to claim 33 or 34, characterized in that the gap ( 26 ) of the gap filter ( 25 ) is variable.

Microscope according to one of claims 1 to 35, characterized in that in the detection beam path ( 12 ) after the spectrally selective element ( 4 ) a spectrometer for detecting the spectral spread is arranged.

Microscope according to claim 36, characterized in that the spectrometer as a multi-band detector ( 24 ) is executed.

Microscope according to one of claims 1 to 37, characterized in that the masked excitation wavelengths in the direction of the light sources ( 2 ) from the detection beam path ( 12 ) to get distracted.

Microscope according to one of claims 1 to 38, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as a white light source.

Microscope according to one of claims 1 to 38, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as an optically parameterized oscillator (OPO).

Microscope according to one of claims 1 to 38, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as an electron beam collision light source.

Microscope according to one of claims 1 to 38, characterized in that the light source ( 2 ) is designed as a laser light source.

Microscope according to claim 42, characterized in that the laser light source is variably tunable in wavelength is.

Microscope according to claim 42 or 43, characterized in that that the laser light source comprises a laser with different wavelengths.

Microscope according to claim 42, characterized in that the light source a plurality of lasers ( 2 ) with different wavelengths.

Microscope according to one of claims 42 to 45, characterized in that the laser ( 2 ) is designed as a dye laser.