DE19913864A1

DE19913864A1 - Verwendung lokal applizierter DNA-Fragmente

Info

Publication number: DE19913864A1
Application number: DE19913864A
Authority: DE
Inventors: Barbara A Gilchrest; Mina Yaar; Mark Eller
Original assignee: Boston University
Current assignee: Boston University
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 1999-09-30
Also published as: FR2776522A1; ITTO990233A1; GB2336157B; IT1307027B1; US6147056A; GB2336157A; GB9906758D0

Abstract

Verfahren zur Behandlung oder Verhütung hyperproliferativer Erkrankungen oder präkanzeröser Zustände, die epitheliale Zellen betreffen, wie z. B. Psoriasis, Vitiligo, atopische Dermatitis oder hyperproliferative oder UV-responsive Dermatosen, hyperproliferative oder allergisch vermittelte Erkrankungen anderer Epithelien und Verfahren zur Verringerung des Photoalterns oder zur Prophylaxe vor Hautkrebs oder Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Hautkrebs werden beschrieben.

Description

Menschliche Haut besteht aus zwei Schichten, der Dermis und der Epidermis. Die Epidermis, die die obere der beiden Hautschichten ist, enthält viele verschiedene Zelltypen einschließlich Melanozyten und Keratinozyten. Melanozyten sind spezialisierte Zellen in der Basalschicht der Epider mis, die Melanin synthetisieren; das Melanin wird dann in Melanosomen verpackt und dann in Keratinozyten transpor tiert.

Das Aussetzen von Haut gegenüber der Sonne führt zur Vit amin-D-Synthese, zu Sonnenbrand (Erythema) und zur Bräu nung, der Hauptform endogenen Schutzes der Haut gegen nachfolgende Hautschädigung durch ultraviolette (UV)- Strahlung. Verschiedene morphologische und enzymatische Veränderungen finden auf zellulärer Ebene in epidermalen Melanozyten als Antwort auf eine UV-Bestrahlung statt. Me lanin, das in "gebräunter" Haut erhöht ist, dient als Fil ter mit einer Absorption im UV-Bereich und führt zu einer Photoprotektion des Individuums.

Das Gipfel-Wirkungsspektrum für Erythema liegt im UV-B- Bereich, 290 bis 305 nm. UV-B-Strahlen werden durch Pro teine und Nukleinsäuren der Epidermis absorbiert, wodurch die Produktion von Thymindimeren verursacht wird, von de nen bekannt ist, daß sie durch UV-Bestrahlung nukleärer DNA gebildet werden, und durch die Wirkung hochspezifi scher Enzyme einschließlich Endonukleasen aus dem DNA- Strang herausgeschnitten werden. Wenn diese Dimere nicht entfernt werden, können sie die DNA-Replikationsgabeln zum Anhalten bringen, was zur Bildung von Bereich einzelsträn giger DNA führt. Das Fehlschlagen der Entfernung von Thy mindimeren und anderen Formen von DNA-Schäden im Genom kann zu somatischen Mutationen führen, die zur Karzinoge nese führen.

Bei Bakterien ist bekannt, daß einzelsträngige DNA, die während des Verlauf der DNA-Reparatur als Fragmente frei gesetzt wird, oder die an angehaltenen Replikationsgabeln exponiert ist, mit nukleären Proteinen, die dann die Ex pression spezifischer Gene in der DNA als Teil der SOS- Antwort des Organismus auf UV-Schäden regulieren, intera gieren kann. Vernünftigerweise könnte die Bräunungsantwort der Haut als Teil der analogen SOS-Antwort in Säugetier haut betrachtet werden. Der präzise Stimulus für die UV- induzierte Bräunung bleibt jedoch unbekannt.

Die UV-Bestrahlung wird bei der Phototherapie und Photo chemotherapie für bestimmte dermatologische Erkrankungen erfolgreich angewendet. So ist z. B. die Psoriasis eine häufige dermatologische Erkrankung, die 1 bis 2 Prozent der Bevölkerung betrifft. Die Psoriasis kann durch UV-B- Bestrahlung entweder alleine oder zusammen mit Mitteln, wie z. B. Kohlenteer oder Anthralin, oder durch UV-A- Bestrahlung in Verbindung mit Psoralenen (PUVA-Therapie) behandelt werden. Andere Erkrankungen, die auf UV- Bestrahlung reagieren, schließen atopische Dermatitis und Vitiligo ein. Trotz der Vorteile der Phototherapie und der Photochemotherapie tragen diese Behandlungen die gleichen Risiken, wie chronische Sonnenbestrahlung einschließlich Runzel-/Faltenbildung, "Photoaltern" ("photoaging") und Hautkrebs.

Die Erfindung betrifft die vollständige oder teilweise Re paratur jeglichen Typs an DNA-Schaden durch Induktion von DNA-Reparaturmechanismen, wie z. B. die Nukleotid-Heraus schneide-Reparatur (nucleotide excision repair). Die DNA- Schädigung kann durch ultraviolette Strahlung oder durch Chemikalien, die eine DNA-Schädigung induzieren oder durch Karzinogene, wie z. B. Benzo(a)pyren (BP), verursacht sein.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von hyperproliferativen Erkrankungen oder präkanzeröse Zustände, die die epithelialen Zellen betreffen, wie z. B. Psoriasis oder andere Hauterkrankungen einschließlich Kontaktdermatitis und anderer hyperprolife rativer, präkanzeröser oder auf UV antwortende Dermatosen in einem Säugetier. Die Erfindung umfaßt weiterhin Verfah ren zur Prophylaxe gegen Hautkrebs oder zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Hautkrebs, wie auch die Verringerung der Schwere des Photoalterns, das aus einer Sonnenbestrahlung resultiert, in einem Säugetier einschließlich des Menschen. Die Verfahren umfassen das Inkontaktbringen von Zellen (oder das Einführen in die Zellen) eines Säugetiers mit einzelsträngigen DNA- Fragmenten (z. B. Oligonukleotiden oder Polynukleotiden), Desoxynukleotiden, Dinukleotiden, Dinukleotiddimeren oder einem Gemisch davon, so daß die DNA-Fragmente, Desoxynu kleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere für die Zel len verfügbar sind. Alternativ werden die Zellen mit einem Mittel in Kontakt gebracht, das die Aktivität des p53- Proteins erhöht und dadurch die Nukleotid-Exzisions- Reparatur stimuliert. Die Fragmente, Desoxynukleotide oder Dinukleotide oder Mittel, die die p53-Aktivität steigern, was zu einer Steigerung der Nukleotid-Exzisions-Reparatur führt, können topisch, oral, durch Aerosol oder durch ir gendein anderes geeignetes Mittel, wie z. B. durch Einträu felung/Einflößung, eingeführt werden. Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide oder Dinukleotide können ultraviolett be strahlt sein.

Die Erfindung schließt außerdem Zusammensetzungen ein, die für die oben beschriebenen Verfahren brauchbar sind, um fassend DNA-Fragmente, Desoxynukleotide Dinukleotide und Dinukleotiddimere oder ein Mittel, das die p53-Aktivität erhöht und durch die die Nukleotid-Exzisions-Reparatur ge steigert wird, in einem geeigneten Verabreichungsvehikel, wie z. B. Liposomen.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate humaner squamöser Karzinomazellen, die mit Wasser (Verdünnungsmittel), 100 µM pTpT (T₂) oder 100 µM pdApdA (A₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor dem Verabreichen der Dosis; die Tage 1, 3, 4 und 5 sind Tage nach der Ver abreichung der Dosis.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate normaler menschlicher Fibroblasten, die mit Wasser (Verdünnungsmittel) oder 100 µm pTpT (T₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor der Verabreichung der Dosis; die Tage 1, 3, 4 und 5 sind Tage nach der Verabreichung der Dosis. Die Werte stellen Durchschnitte ± Standardabweichungen von Doppelkulturen dar.

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate von humanen Zervix-Karzinomazellen, die entweder mit Wasser (Verdünnungsmittel) oder 100 µM pTpT (T₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor der Verabreichung der Dosis; die Tage 1, 4 und 6 sind Tage nach der Verabreichung der Do sis.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Zellausbeute humaner Melanomzellinien, die mit entweder dem Verdün nungsmittel oder mit 100 µM pTpT (T₂) behandelt wurden.

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate von normalen menschlichen Keratinozyten, die mit Was ser (Verdünnungsmittel) oder mit 100 µM pTpT (T₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor der Verabreichung der Dosis, 8, 24, 48 und 72 sind Stunden nach der Verabreichung der Do sis. Die Werte stellen die Durchschnitte ± Standardabwei chungen von Doppelkulturen dar.

Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der durchschnitt lichen Zellzahl humaner neonataler Fibroblasten, die mit entweder Wasser, T₂ oder A₂ behandelt wurden.

Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der durchschnitt lichen Zellzahl normaler neonataler Fibroblasten, die mit entweder Wasser, T₂ oder A₂ behandelt wurden.

Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate normaler humaner Fibroblasten, die mit Wasser (Verdünnungsmittel) oder 100 µM pTpT (T₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor der Verabreichung der Dosis. Die Werte stellen Durchschnitte ± Standardabweichungen von Doppel kulturen dar.

Fig. 9 ist eine graphische Darstellung der Zellwachstums rate von p53-null-H1299-Lungenkarzinomazellen, die mit Wasser (Verdünnungsmittel) oder 100 µM pTpT (T₂) behandelt wurden. Der Tag 0 ist vor der Verabreichung der Dosis, 1, 2, 3 und 4 sind Tage nach der Verabreichung der Dosis. Die Werte stellen die Durchschnitte ± Standardabweichungen von Doppelkulturen dar.

Fig. 10 ist eine graphische Darstellung der Steigerung der DNA-Reparatur eines Reporterplasmids in humanen Kera tinozyten, die mit pTpT behandelt wurden. Offene Balken, kontrollbestrahlte Kontrollplasmide, schwarze Balken, UV- bestrahlte Plasmide.

Fig. 11 ist eine graphische Darstellung der Steigerung der DNA-Reparatur eines Reporterplasmids in humanen Fi broblasten, die mit pTpT behandelt wurden. Offene Balken, scheinbestrahlte Kontrollplasmide; schwarze Balken, UV- bestrahlte Plasmide.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis der Anmelderin, daß die Behandlung von Zellen mit DNA-Fragmenten zu einer protektiven Antwort in Bezug auf ein nachfolgendes Ausge setztsein mit UV-Strahlung oder Chemikalien führt. Es ist wahrscheinlich, daß pTpT und andere kleine Nukleinsäuren, die Produkte einer DNA-Schädigung oder prozessierter DNA- Schädigungs-Intermediate vortäuschen. Es wurde zuvor ge zeigt, daß diese Verbindungen eine melanogene (bräunende) Antwort in der Haut hervorrufen (U.S. Patent 5 643 556, dessen Lehre hiermit vollständig aufgenommen wird), wo durch die melanogene Schutzantwort gegenüber UV-Strahlung rekapituliert wird, und in der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, daß dies zur Induktion des p53-Weges führt, ein schließlich des Heraufregulierens p53-induzierbarer Gene, die bei der DNA-Reparatur eine Rolle spielen, wie z. B. p21, das nukleäre Antigen proliferierender Zellen (proliferating cell nuclear antigen (PCNA)) und Xerodoma pigmentosum-Gruppe A-Protein (XPA). Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente täuschen ein DNA-Schädigungssignal vor, was zur Induktion des Nukleotid-Exzisions-Reparaturweges und zum transienten Anhalten des Zellwachstums führt, was zu eine ausführlicheren DNA-Reparatur vor der Zellteilung führt. Ein genotoxischer Stress liegt dabei nicht vor. Ei ne solche "Vortäuschung" ist bei der Chemoprotektion von Karzinogenese von Nutzen. Insbesondere betrifft die Erfin dung die Verwendung von DNA-Fragmenten, Desoxynukleotiden, Dinukleotiden oder Dinukleotiddimeren, wie sie in der fol genden Beschreibung definiert sind, oder eines Mittels, das die Aktivität des p53-Proteins erhöht, zur Vorbeugung oder zur Behandlung bestimmter hyperproliferativer Erkran kungen oder präkanzeröser Zustände, die Zellen, wie z. B. epitheliale Zellen, Keratinozyten oder Fibroblasten, be treffen einschließlich Hauterkrankungen, wie z. B. Psoria sis, und hyperproliferative, präkanzeröse oder UV- induzierte Dermatosen, wie z. B. Kontaktdermatitis, in Säu getieren und insbesondere in Menschen. Die Erfindung be trifft weiterhin die Verwendung von DNA-Fragmenten, Des oxynukleotiden, Dinukleotiden oder Dinukleotiddimeren oder Mittel, die die Aktivität des p53-Proteins erhöhen, zur Reduktion des Photoalterns (ein Verfahren, das teilweise auf sich anhäufende DNA-Schäden zurückzuführen ist) oder zur Prophylaxe vor der Entwicklung von Hautkrebs oder zur Reduktion der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Haut krebs in einem Säugetier. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen, umfassend die genannten DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder Mittel, die die Aktivität des p53-Proteins erhöhen.

Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden DNA- Fragmente einer Länge von etwa 2 bis 200 Basen, Desoxynu kleotide (einzelne Basen), Dinukleotide oder Dinukleotid dimere dem Säugetier in einem geeigneten Vehikel verab reicht. In der hier verwendeten Bedeutung bezieht sich der Begriff "DNA-Fragmente" auf einzelsträngige DNA-Fragmente, doppelsträngige DNA-Fragmente oder ein Gemisch sowohl ein zel- als auch doppelsträngiger DNA-Fragmente.

"Desoxynukleotide" bezieht sich auf entweder einen einzel nen Typ an Desoxynukleotid oder auf ein Gemisch verschie dener Desoxynukleotide. Der Begriff "Dinukleotide" kann einen einzelnen Typ an Nukleotid oder verschiedenen Nu kleotidtypen umfassen und kann ein Gemisch verschiedener Typen von Dinukleotiden umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleotide der Dinukleotide De soxynukleotide. Repräsentative Dinukleotide schließen d(pT)₂, d(pC)₂, d(pA)₂, d(pCpT), d(pTpc), d(CpT), d(TpC) und d(TpT) ein, wobei T Thymin, C Cytosin, d Desoxy und p Phosphat bedeuten (siehe Niggli, Photochem. Photobiol. 38(3); 353-356 (1988)). Eine Kombination wenigstens zweier oder mehrerer DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleoti de und/oder Dinukleotiddimere kann ebenfalls verwendet werden. Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide oder Dinukleo tide können UV-bestrahlt sein. Eine derartige UV- Bestrahlung führt zur Photodimerisierung zwischen zwei be nachbarten Pyrimidinresten (d. h. Thymin (T) und Cytosin (C)), die in den DNA-Fragmenten oder Dinukleotiden vorhan den sind.

Wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt, erniedrigt ein Thymidindinukleotid die Zellwachstumsrate mehrerer humaner Zelltypen einschließlich squamöses Zellkarzinom, Zervix karzinom, Melanom, neonatale Keratinozyten und normale ne onatale Fibroblasten (Beispiele 1 bis 5). pTpT reduziert ebenso die epidermale Umsatzrate in einem Meerschweinchen modell (Beispiel 6). Weiterhin führt die pTpT-Behandlung von Zellen zur nukleären Lokalisation von p53 (Beispiel 7) und zur Induktion p53-regulierter Gene (Beispiel 8), wie z. B. Gene, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur spielen (Beispiele 1 und 7).

Die Vorbehandlung von Zellen mit pTpT erhöht ihre Fähig keit, eine DNA-Schädigung durch UV-Bestrahlung und durch das chemische Karzinogen Benzo(a)pyren zu reparieren (Bei spiele 8 und 9), wenigstens teilweise durch die Aktivie rung von p53 und durch die Hochregulierung von Genen, die durch p53 transkriptionell aktiviert werden, wie z. B. das p21/Waf/Cip-1-Gen. Die Vorbehandlung von Haut mit pTpT führt ebenfalls zu einem erniedrigten Grad UV-induzierter Mutation in vivo (Beispiel 12).

DNA-Fragmente täuschen ebenfalls in effektiver Weise UV vor. Z.B. war ein Neun-Nukleotid-Oligomer, GAGTATGAG (SEQ ID No: 1) in der Lage, die Melanogenese in humanen Melano zyten zu stimulieren und die Expression von p21/Waf/Cip-1 in einer squamösen Zellkarzinomzellinie zu induzieren. Weiterhin waren eine durcheinandergewürfelte Version des 9-mer, TAGGAGGAT (SEQ ID No: 2) und trunkierte Versionen des original 9-mer, AGTATGA (SEQ ID No: 3) und GTATG (SEQ ID No: 4) ebenfalls in der Lage, die Melanogenese in huma nen Melanozyten zu stimulieren (Beispiel 11). Längere Fragmente und Fragmente, denen das 5'-Phosphat fehlte, wa ren in Bezug auf die Stimulierung der Melanogenese weniger wirksam (Beispiel 13). Somit war die UV-vortäuschende Ak ivität von pTpT durch Oligonukleotide (z. B. im 2-200- Nukleotidbereich, typischerweise im 5-20-Nukleotidbereich und am typischsten im 5-10-Nukleotidbereich) in ziemlich dramatischer Weise verdoppelt. Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind deshalb in Verfahren zur Ver hinderung von Krebs und Photoalterung durch Erhöhung der DNA-Reparatur und durch Erhöhung der Pigmentierung durch erhöhte Melaninbildung von Nutzen. Es ist bekannt, daß Me lanin Photonen im UV-Bereich absorbiert, und deshalb redu ziert das Vorhandensein von Melanin das Krebsrisiko und das Photoalterungsrisiko.

Thymidindinukleotid, pTpT, täuscht einige Effekte des UV- Lichts vor, einschließlich der Induktion der Melanogenese und der Stimulation der Keratinozytenproduktion von TNFα (Beispiel 4). TNFα wird ebenfalls durch pTpT in einem Maus-Kontakttyp-Hypersensitivitätsmodell induziert (Bei spiel 10). Das Dinukleotid pdApdA ist nicht in der Lage, diese Antworten zu induzieren.

Die UVB-Bestrahlung ist ein starker Inhibitor der indukti ven Phase der Kontakthypersensitivität (CH), und TNFα ist ein Mediator dieses suppressiven Effekts. Thymidindinu kleotide (pTpT), das Substrat der UV-induzierten Thymindi merbildung, stimuliert mehrere UVB-Effekte einschließlich der erhöhten Tyrosinaseexpression und des Melaningehaltes in kultivierten Melanozyten und Hautbräunung in Meer schweinchen. Adenindinukleotide (pApA), die weniger häufig durch UV dimerisiert werden, sind weniger wirksam.

Wie in Beispiel 9 gezeigt, täuschen diese DNA-Fragmente ebenso den suppressiven Effekt von UVB auf die Kontakthy persensitivität in einem Mausmodell vor. Wie durch die vorliegende Erfindung demonstriert wird, kann die intraku tane Injektion von pTpT die Induktion der Kontakthypersen sitivität inhibieren und kann das TNFα-Gen in vivo akti vieren. Diese Ergebnisse erweitern das Spektrum der UVB- Effekte, die durch pTpT vorgetäuscht werden, und demon strieren, daß die DNA-Photoprodukte und/oder ihre Repara tur die biologischen Folgen der UVB-Strahlung vermitteln.

Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere können von jeglichen geeigneten Quellen erhalten werden, oder sie können synthetische DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere sein. Z.B. kann Lachssperma-DNA in Wasser gelöst werden, und das Gemisch kann dann autoklaviert werden, um die DNA zu fragmentieren.

In der hier verwendeten Bedeutung ist ein "Mittel, das die Aktivität des p53-Proteins erhöht" ein Mittel (z. B. ein Arzneimittel, ein Molekül, ein Nukleinsäurefragment oder ein Nukleotid), das die Aktivität des p53-Proteins erhöht und deshalb zu einer Steigerung des DNA- Reparaturmechanismus, wie z. B. der Nukleotid-Exzisions- Reparatur, durch Induktion von Proteinen, die bei der DNA- Reparatur eine Rolle spielen, wie z. B. PCNA oder XPA, führt. Die Aktivität des p53-Proteins kann durch direkte Stimulation der Transkription oder der Translation von p53-DNA oder -RNA gesteigert werden; oder aber durch Stei gerung der Expression oder Produktion von p53-Protein, durch Erhöhung der Stabilität des p53-Proteins, durch Steigerung der Resistenz der p53-mRNA oder des -Proteins gegenüber Degradation, dadurch, daß man das Akkumulieren von p53 im Nukleus einer Zelle hervorruft, durch Erhöhung der vorhandenen Menge an p53 oder durch andere Steigerung der Aktivität von p53. Das p53-Protein selbst ist auch ein Mittel, das die Aktivität des p53-Proteins erhöht. Eine Kombination eines oder mehrerer Mittel, das/die die Akti vität von p53 erhöht/erhöhen, kann verwendet werden. Al ternativ oder zusätzlich kann das Mittel, das die Aktivi tät von p53 erhöht, in Kombination mit DNA-Fragmenten, De soxynukleotiden oder Dinukleotiden, wie oben beschrieben, verwendet werden.

Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder Mittel, die die Aktivität von p53- Protein erhöhen, können alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie z. B. Duftstoffen oder Farbstof fen, verwendet werden. Sie können in einem Träger, wie z. B. Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, oder in einem anderen geeigneten Verabreichungsvehikel verabreicht wer den. Das Verabreichungsvehikel kann jegliches geeignete Vehikel sein, das die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die Aktivität des p53-Proteins erhöht, überträgt. Bei ei ner Ausführungsform wird Propylenglykol als Verabrei chungsvehikel verwendet. Bei einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird ein Gemisch von Propylengly kol : Ethanol : Isopropylmyristat (1 : 2, 7 : 1), enthaltend 3% Benzylsulfonsäure und 5% Oleylalkohol, verwendet. Bei ei ner anderen Ausführungsform wird eine Liposomenpräparation verwendet. Die Liposomenpräparation kann jegliche Liposo men enthalten, die durch das Stratum corneum penetrieren und mit der Zellmembran fusionieren, was zum Einbringen des Inhalts des Liposomen in die Zelle führt. Z.B. können die Liposomen verwendet werden, wie in dem U.S. Patent Nr. 5 077 211 von Yarosh, dem U.S. Patent Nr. 4 621 023 von Redziniak et al. oder dem U.S. Patent Nr. 4 508 703 von Redziniak et al. beschrieben.

Das Verabreichungsvehikel kann Duftstoffe, Farbstoffe, Stabilisierungsmittel, Sonnenfilter oder andere Wirkstoffe enthalten.

Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, werden den Zellen von Interesse auf geeignete Wei se verabreicht (in die Zellen eingeführt oder in Kontakt mit den Zellen gebracht). Die Zellen "von Interesse" in der hier verwendeten Bedeutung sind die Zellen, die von der hyperproliferativen Erkrankung oder dem präkanzerösen Zustand betroffen werden können oder betroffen sind, oder Zellen, die durch DNA-schädigende Bedingungen, wie z. B. UV-Bestrahlung oder Ausgesetztsein gegenüber DNA-schädi genden Chemikalien, wie z. B. Benzo(a)pyren, betroffen sind. Insbesondere sind von der Erfindung epitheliale Zel len einschließlich Melanozyten und Keratinozyten, wie auch orale, respiratorische Blasen- und Zervix-epitheliale Zel len mit umfaßt. Wie hier beschrieben, inhibieren die Ver fahren und Zusammensetzungen der Erfindung das Wachstum epithelialer Zellen aus verschiedenen Quellen.

Bei einer Ausführungsform werden die DNA-Fragmente, De soxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, topisch auf die Hautoberfläche aufgetragen. Bei anderen Ausführungsformen werden die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53- Aktivität erhöht, zu anderen Epithelien gebracht, von de nen bekannt ist, daß sie im Vergleich zur Haut gegenüber dem Eintritt derartiger Substanzen eine geringere Barriere haben, wie z. B. oral für das orale oder intestinale Epit hel, durch Aerosol zum respiratorischen Epithel, durch Einträufeln/Einflößen zum Blasenepithel oder durch andere Mittel für andere Zellen oder Gewebe im Körper. Die DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, werden zu einem geeigneten Zeitpunkt in einer wirksamen Menge verabreicht. Der "geeignete Zeitpunkt" wird in Ab hängigkeit des Typs und des Molekulargewichts der DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder dem verwendeten Mittel, der zu behandelnden oder zu verhütenden Erkrankung, der erstrebten Ergebnisse und des individuellen Patienten variieren. Eine "wirksame Menge" in der hier verwendeten Bedeutung ist eine Menge oder eine Konzentration, die ausreichend ist, um das ge wünschte Ergebnis zu erzielen. Die wirksame Menge wird in Abhängigkeit des Typs und des Molekulargewichts der DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder des verwendeten Mittels, der zu behandeln den oder zu verhütenden Erkrankung, des angestrebten Er gebnisses und des individuellen Patienten variieren. Z.B. ist bei der Behandlung oder der Prävention der Psoriasis oder der hyperproliferativen, präkanzerösen oder UV- induzierten Dermatosen die effektive Menge die Menge, die notwendig ist, um die Symptome der Erkrankung zu erleich tern, die Fläche der von der Krankheit betroffenen Haut zu verkleinern oder die Bildung betroffener Flächen zu ver hindern. Die Konzentration wird im allgemeinen etwa 2 bis 300 µm sein und wird in Abhängigkeit des Tys und des Mole kulargewichts der DNA-Fragmente, der Desoxynukleotide, der Dinukleotide oder der Dinukleotiddimere oder des verwende ten Mittels, der zu behandelnden oder zu verhütenden Er krankung, dem gewünschten Ergebnis und dem individuellen Patienten variieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 50 bis 200 µm, bei einer mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 75 bis 150 µm.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden DNA- Fragmente, wie z. B. einzelsträngige DNA-Fragmente, De soxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder ein Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder ohne ein Vehikel oder in einem geeigneten Verabreichungsvehikel den Zellen von Interesse in dem Säugetier verabreicht, um eine hyperproliferative Erkrankung, die epitheliale Zellen betrifft, zu behandeln oder zu verhüten. Die DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, kann lediglich auf die betroffenen Bereiche aufgetragen werden oder es kann prophylaktisch auf Bereiche aufgetra gen werden, die häufig von der hyperproliferativen Erkran kung betroffen sind.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die DNA-Fragmente, Dsoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder ohne ein Vehikel oder in einem geeigneten Verabreichungsvehikel der Epidermis zur Behandlung oder zur Vorbeugung von Psoriasis verabreicht. Die DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, können lediglich auf die betroffenen Bereiche aufgetragen werden oder sie können auf häufig betroffene Bereiche der Epidermis prophylaktisch aufgetragen werden.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin dung werden die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleo tide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53- Aktivität erhöht, entweder ohne ein Vehikel oder in einem geeigneten Verabreichungvehikel der Epidermis zur Behand lung oder zur Vorbeugung atopischer Dermatitis, Kontakt dermatitis oder allergisch vermittelter Entzündung oder anderer Epithelien, wie z. B. allergischer Rhinitis oder allergischer Konjunktivitis (Heuschnupfen) in einem Säuge tier verabreicht. Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, können lediglich auf die betrof fenen Bereiche aufgetragen werden oder sie können prophy laktisch den Bereichen der Epidermis, die häufig betroffen sind, verabreicht werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder alleine oder in einem geeigneten Verabreichungsvehikel der Epider mis zur Behandlung oder zur Prävention von Vitiligo verab reicht. Die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53- Aktivität erhöht, können lediglich den betroffenen Berei chen verabreicht werden oder sie können prophylaktisch auf die Bereiche der Epidermis, die häufig betroffen sind, aufgebracht werden.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform können DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder alleine oder in einem geeigneten Verabreichungs vehikel der Epidermis zur Behandlung oder Prävention ande rer hyperproliferativer, präkanzeröser oder UV-reagieren der Dermatosen verabreicht werden.

Bei einer zweiten Ausführungsform werden DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder ein Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder alleine oder in einem geeigneten Verabreichungsvehikel der Epider mis zur Verminderung des Photoalterns oder zur Prophylaxe des Hautkrebs es oder zur Verringerung der Wahrscheinlich keit der Entwicklung von Hautkrebs verabreicht. Die DNA- Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleo tiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, werden zu einem geeigneten Zeitpunkt (d. h. zeitlich aus reichend nahe zur UV-Bestrahlung der Haut) angewendet: die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinu kleotiddimere können vor, während oder nach der UV- Bestrahlung angewendet werden. Sie können täglich oder ein regelmäßigen Intervallen oder mit Unterbrechungen angewen det werden. Zu einer bevorzugten Ausführungsform können die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, auf einer täglichen Basis auf der Haut angewendet werden, die im Laufe des Tages dem Sonnenlicht ausgesetzt sein kann.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimere oder das Mittel, das die p53-Aktivität erhöht, entweder ohne ein Vehikel oder in einem geeigneten Verabreichungsvehikel Zellen eines Patienten (z. B. epithe lialen Zellen) zur Behandlung oder zur Vorbeugung hyper proliferativer, präkanzeröser Bedingungen oder zur Repara tur oder Verhinderung von DNA-Schäden, die durch DNA- Schäden erzeugende Chemikalien, wie z. B. Benzo(a)pyren, hervorgerufen werden, verabreicht.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele dargestellt.

BEISPIEL 1 Anwendung für humane squamöse Karzinomzellen

Zellen der humanen squamösen Karzinomzellinie SCC12F wur den in primärem Keratinozytenmedium (300 ml DME, 100 ml F- 12-Nährstoffergänzung, 50 ml 10x Adenin, 50 ml fötales Rinderserum, 5 ml Penicillin/Streptomycin-Stocklösung und 0,5 ml 10 µg/ml epidermaler Wachstumsfaktor und Hydrocor tison zu einer Endkonzentration von 1,4 µg/ml) gehalten und entweder mit Wasser (Verdünnungsmittel), 100 µM pTpT (T₂, Midland Certified Reagent Company, Midland, TX) oder 100 µM pdApdA (A₂) versetzt. Die Zellen wurden vor der Zu gabe der Dosis (Tag 0) und 1, 3, 4 und 5 Tage nach Zugabe der Dosis geerntet, und sie wurden in einem Coulter Coun ter gezählt. Nach dem Ernten wurden die Zellen zur Gesamt- RNA-Isolierung weiterverarbeitet, und sie wurden durch Northern Blot analysiert. Die Zugabe von pTpT (T₂) zu huma nen squamösen Karzinomzellen führte zu einer auffälligen Erniedrigung der Wachstumsrate, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Zugabe von Kontroll-Desoxyadenindinukleotid (pdApdA oder A₂), eine Verbindung, die dem pTpT sehr ähnlich ist, die jedoch durch UV-Strahlung nicht leicht dimerisiert wird und deshalb nicht während dem Ablauf der UV- induzierten DNA-Reparatur herausgeschnitten wird, zeigt keinen Effekt (A).

In einem zweiten Experiment wurden SCC12F-Zellen wie oben beschrieben kultiviert. Zwei oder drei Tage nach dem Aus säen wurde den präkonfluenten Kulturen frisches Medium ge geben, das entweder mit 100 µM T₂ oder mit Verdünnungsmit tel als Kontrolle supplementiert war. Die Zellen wurden durch tägliches Trypsinieren gesammelt und durch Coulter Counting gezählt. Die Zellausbeute in Kulturen, die mit T₂ behandelt wurden, war um 75% im Vergleich zu denen gepaar ter Kontrollkulturen nach fünf Tagen (Fig. 2) verringert. Dies entspricht 2,3 Populationsverdoppelungen in diesem Zeitraum für die Kontrollzellen, verglichen mit 1 Verdop pelung für die T₂-behandelten Zellen. Diese Ergebnisse zei gen weiterhin, daß die Anwendung der DNA-Fragmente die Zellvermehrung einschließlich die Vermehrung kanzeröser Zellen inhibiert.

In einem dritten Experiment wurde gezeigt, daß die Zugabe von Thymidindinukleotiden (T₂) zu humanen squamösen Karzi nomzellen während 24 bis 72 Stunden zu einem Heraufregu lieren wenigstens dreier Gene führt: Wachstumsarrest und DNA-Schädigung (GADD 45), Seneszenz-abgeleiterer Inhibitor (Sdi I) und Exzisions-Reparatur-Kreuzkomplementierung (ERCC-3) (Daten nicht gezeigt). Gepaarte SCC12F-Zellen wurden in einem auf Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)-basierenden Keratino zyten-Wachstumsmedium, das mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone Labs, Logan, UT) und epidermalem Wachstumsfaktor, wie beschrieben (Hollander, M.C. et al., J. Biol. Chem. 268 : 328-336 (1992)), supplementiert war, gehalten. Präkon fluent-Kulturen wurde frisches Medium gegeben, das entwe der mit 100 µM pTpT oder einem gleichen Volumen Verdün nungsmittel supplementiert war. Die Zellen wurden täglich nach Zugaben gesammelt und für Gesamt-RNA-Isolierung unter Verwendung des Tri-Reagens-Extraktionsverfahrens (Molecu lar Research Center, Cincinnati, OH) nach dem Protokoll des Herstellers weiter verarbeitet. Zehn Mikrogramm RNA von jeder Probe wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf einen Nylonfilter transferiert und wie zuvor beschrie ben mit einer Sonde getestet (Nada, A. et al., Exp. Cell Res. 211 : 90-98 (1994)). Die cDNA für GADD 45 wurde durch PCR unter Verwendung von Primern erzeugt, die auf der hu manen GADD 45-Gensequenz basierten (Mitsudomi, T. et al., Oncogene 7:171-180 (1992)). Die cDNA für ERCC 3 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) geliefert. Die SDI-1-cDNA war ein Geschenk von Dr. J. Smith und wurde zuvor beschrieben (Walworth, N.C. und Ber nards, R., Science 271 : 353-356 (1996)).

Verglichen mit der Verdünnungskontrolle waren die mRNAs für GADD 45, ERCC 3 und SDI-1 in pTpT-behandelten Zellen bereits nach 24 Stunden heraufreguliert und verblieben während mehrerer Tage erhöht. Die Zugabe des Kontroll- Desoxyadenindinukleotids (A₂) war weniger wirksam oder un wirksam in Bezug auf die Induktion dieser Gene (Daten nicht gezeigt). Vergleichbare Daten wurden in vorläufigen Experimenten mit S91-Melanomzellen und normalen humanen Fibroblasten erhalten (Daten nicht gezeigt).

Der Zeitverlauf der Induktion ist ähnlich dem, der nach der UV-Bestrahlung für die beiden Gene, für die es unter sucht worden war, beobachtet wurde (GADD 45 und Sdi I) (Fornace, A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8800- 8804 (1988); Hollander, M.C. et al., J. Biol. Chem. 268 : 24385-24393 (1993); Zhan, Q. et al., Mol. Cell Biol. 14 : 2361-2371 (1994); El-Deiry, W.S. et al., Cancer Res. 54 : 1l69-1174 (1994); und El-Deiry, W.S. et al., Cell 75 : 817-825 (1993)) und ist auch dem Zeitverlauf der Induk tion des Tyrosinasegens durch T₂ in Melanozyten und Me lanomzellen ähnlich (Maltzman, W. und L. Czyzyk, Mol. Cell Biol. 4 : 1689-1694 (1984) und Lu, X. und D.P. Lan, Cell 75:765-778 (1993)). Sdi I ist bekanntermaßen bei der Zellzyklusregulation beteiligt und insbesondere beim Blok kieren der Zellteilung. GADD 45 und ERCC-3, ein humanes DNA-Reparaturenzym, sind bekanntermaßen bei der Reparatur der UV-induzierten DNA-Schädigung beteiligt. Die Antwort auf pTpT ist mit der identisch, die nach der UV- Bestrahlung dieser Zellinien beobachtet wurde, und ist auch der Antwort verschiedener Antimetaboliten, wie z. B. Methotrexat, ähnlich, die klinisch bei der Behandlung von hyperproliferativen Hauterkrankungen wirksam sind.

BEISPIEL 2 Anwendung auf humane Zervix-Karzinomzellen

Humane Zervix-Karzinomzellen (HeLa-Zellen) wurden in DME + 10% Kälberserum gehalten und mit entweder Wasser (Verdünnungsmittel) oder 100 µM pTpT (T₂) versetzt. Die Zellen wurden 1, 4 und 6 Tage nach der Verabreichung der Dosis gesammelt und mit Coulter Counter gezählt.

Die Zugabe von pTpT (T₂) zu den humanen Zervix- Karzinomzellen führte zu einer bemerkenswerten Erniedri gung der Zellwachstumsrate, wie in Fig. 3 gezeigt.

BEISPIEL 3 Anwendung auf humane Melanomzellen

Die humanen Melanomzellinien CRL 1424, Malma, Sk Mel 2, und Sk Mel 28 wurden von der American Type Culture Col lection (ATCC) erhalten. Die Zellinien wurden in DME + 2% Kälberserum gehalten und mit entweder Wasser (Verdünnungs mittel) mit DME oder 100 µM pTpT (T₂) in DME versetzt. Eine Woche nach der Verabreichung der Dosis wurden die Zellen gesammelt und mit Coulter Counter gezählt.

Die Zugabe von pTpT (T₂) zu irgendeiner der vier verschie denen humanen Melanomzellinien führte zu einer bemerkens werten Abnahme der Zellausbeuten, wie in Fig. 4 gezeigt.

BEISPIEL 4 Anwendung auf humane Keratinozyten

Normale humane neonatale Keratinozytenzellen wurden wie oben in Beispiel 1 für SCCI2F-Zellen beschrieben kulti viert und entweder mit 100 µM T₂ oder mit Verdünnungsmittel als Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden zur Zellzählung geerntet. Die Zellausbeute in Kulturen, die mit T₂ behan delt wurden, war im Vergleich zu der von gepaarten Kon trollkulturen nach drei Tagen um 63% verringert (Fig. 5). Dies entspricht einer Populationsverdoppelung in dieser Zeit für Kontrollzellen, wohingegen die Zahl der T₂ behandelten Zellen die gleiche blieb. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Anwendung der DNA-Fragmente die Zellmulti plikation inhibiert.

Northern-Blot-Analyse normaler humaner Keratinozyten, die mit pTpT während 24 bis 72 Stunden behandelt wurden, zeigt eine Induktion des Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha-Gens (Daten nicht gezeigt). Dieses immunmodulatorische Cytokin, von dem bekannt ist, daß es durch UV-Bestrahlung induziert wird, kann somit durch pTpT induziert werden. Die Verwen dung lokal angewandter DNA-Fragmente, Desoxynukleotide, Dinukleotide oder Dinukleotiddimerer kann deshalb bei der Immunmodulation von kutanen Reaktionen und bei der Behand lung oder Prävention von Erkrankungen oder Zuständen, die Immunmediatoren involvieren, von Nutzen sein.

BEISPIEL 5 Inhibition des Zellwachstums normaler neonata ler Fibroblasten durch DNA-Fragmente

Normale humane neonatale Fibroblasten wurden in Falcon- P35-Kulturschalen in einer Dichte von 9×10⁴ Zellen/Schale ausplattiert. Das Kulturmedium war DME + 10% Kälberserum, 2 ml pro Platte. Ein Tag nach dem Ausplattieren wurden die Kulturen entweder mit 100 µl 2 mM T₂ in DME oder 100 µl 2 mM A₂ in DME oder Wasser (Kontrolle) supplementiert. Zwei Platten wurden gesammelt und vor den Zugaben gezählt, um einen Start oder "Tag 0"-Lesewert zu ergeben. Duplikat platten einer jeden Bedingung wurden während 5 Tagen nach Zugabe der Supplementierungsstoffe geerntet, und die Zellzahl wurde bestimmt. Alle Zellzählungen wurden mit Coulter Counter durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 6 und 7 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Anwendung der DNA-Fragmente die Zellmultiplikation inhi biert.

In einem zweiten Experiment wurden normale humane neonata le Fibroblasten ausplattiert und kultiviert, wie oben in Beispiel 1 für SCC12F-Zellen beschrieben. Die Kulturen wurden entweder mit 100 µl 2 µM T₂ oder Wasser (Kontrolle) supplementiert, und die Zellen wurden zur Zellzählung ge erntet. Die Zellausbeute in Fibroblastenkulturen, die mit T₂ behandelt wurden, war im Vergleich zu derjenigen von ge paarten Kontrollkulturen nach 3 Tagen um 40% verringert (Fig. 8). Dies entspricht 4 Populationsverdoppelungen in dieser Zeit für Kontrollzellen, verglichen mit 3,6 Verdop pelungen für T₂-behandelte Zellen. Diese Ergebnisse zeigen weiterhin, daß die Anwendung der DNA-Fragmente die Zellmo difikation inhibiert.

BEISPIEL 6 Effekt von pTpT-Anwendungen auf den epiderma len Markierungsindex

Meerschweinchen erhielten einmal oder zweimal täglich to pische Anwendungen von 100 µM pTpT oder Vehikel allein als Kontrolle während 3 Tagen. Am vierten Tag wurden Stanz biopsien erhalten und während 7 oder 8 Stunden in primärem Keratinozytenmedium gehalten, das mit 10 µCi/ml ³H-Thymidin (spezifische Aktivität: 9,0 Ci/mmol, NEN) supplementiert war. Die Gewebe wurden dann mit kaltem Medium gespült und in 10% phosphatgepuffertem Formalin fixiert. Nach einer Reihe von Dehydratisierungsstufen wurden die Gewebe in Pa raffin eingebettet, und 6 µm-Schnitte wurden ausgeschnit ten und auf Glasträger aufgebracht, in NTB-2-Nuclear- Track-Emulsion eingetaucht und in der Dunkelheit während 7 Tagen bei 4°C gehalten. Die Schnitte wurden in Kodak-D-19- Entwickler entwickelt und mit Hämatoxylin und Cosin ge färbt. Der Markierungsindex wurde durch Berechnung des Prozentsatzes markierter Kerne unter 100 Basal- Keratinozyten gemessen.

Ergebnisse

Markierungsindex@	2 tägliche Anwendungen@	Vehikelkontrolle	pTpT
4 ± 1,4	1,5 ± 0,7
1 tägliche Anwendung@	Vehikelkontrolle	pTpT
4,5 ± 2,1	2 ± 0

Ergebnisse ± SD sind gezeigt

Der Markierungsindex (ein Maß der epidermalen Turn-over- Rate) ist in pTpT-behandelter Haut niedriger als in Vehi kel-behandelter Haut (<0,03 gepaarter-T-Test), und zwar in beiden Experimenten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die DNA- Fragmente die epidermale Turnover-Rate induzieren.

BEISPIEL 7 Rolle von p53 bei der DNA-Reparatur

Sowohl die GADD-45 als auch SDi-1-Gene sind bekanntermaßen transkriptionell durch das Tumor-Suppressorprotein p53 re guliert (Kastan, M.B. et al., Cell 71 : 587-597 (1992), El- Deiry, W.S. et al., Cell 75 : 817-825 (1993)). Nach UV- und 7-Bestrahlung, wie auch nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden chemischen Agentien gibt es eine schnelle Stabilisierung und eine nukleäre Akkumulierung von p53 (Fritsche, M. et al, Oncogene 8 : 307-318 (1993); Nelson, W.G. und Kastan, M.B., Mol. Cell. Biol. 14 : 1815-1823 (1994); Lu, X. und Lane, D.P., Cell 75:765-778 (1993)), nach der dieses Protein an spezifische Promotor-Konsensus- Sequenzen bindet und die Transkription regulierter Gene moduliert (Lu, X. und Lane. D.P., Cell 75 : 765-778 (1993)). Jüngste Daten legen es nahe, daß p53 auch durch die Bin dung kleiner einzelsträngiger DNAs, wie auch bestimmter Peptide und Antikörper, an eine carboxyterminale Domäne dieses Proteins aktiviert werden kann (Jayaraman, L. und Prives, C., Cell 81 : 1021-1029 (1995); Hupp, T.R. et al., Cell 83 : 237-245 (1995)). Um zu bestimmen, ob der inhibito rische Effekt des Dinukleotids pTpT auf die Zellprolifera tion durch p53 vermittelt wird, wurde die Wachstumsantwort einer p53-Null-Zellinie, H1299-Lungenkarzinomzellen, un tersucht. Die p53-Null-H1299-Zellen (Sanchez, Y. et al., Science 271 : 357-360 (1996)) wurden in DMEM mit 10% Kälber serum gehalten. Präkonfluente Kulturen wurden frisches Me dium gegeben, das entweder mit 100 µM pTpT oder mit Ver dünnungsmittel supplementiert war. Die Zellen wurden an aufeinanderfolgenden Tagen durch Trypsinierung gesammelt und mit Coulter Counter gezählt. Wie in Fig. 9 gezeigt, gab es keine Inhibition der Proliferation von pTpT- behandelten H1299-Zellen, verglichen mit Verdünnungsmit tel-behandelten Kontrollen.

Die Wirkung von pTpT auf die Menge und die intrazelluläre Verteilung von p53 in normalen neonatalen Fibroblasten wurde durch Immunperoxidasefärbung unter Verwendung eines p53-spezifischen monoclonalen Antikörpers untersucht (mAb 421, Oncogene, Cambridge, MA). Präkonfluente Kulturen wur den entweder mit 100 µM pTpT oder mit Verdünnungsmittel während 24 Stunden vor der Zellfärbung behandelt. Die Zel len wurden zuerst während einer Minute in Histochoice- Fixativ (Amresco, Solon, OH) fixiert, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung in PBS. p53 wurde unter Verwendung des Vectastain-Elite-ABC-Kits (Vector Laboratories, Bur lingame, CA) und des p53-spezifischen monoclonalen Anti körpers mAb 421 nachgewiesen. Innerhalb von 24 Stunden wurde eine Erhöhung des intranukleären p53 in pTpT- behandelten Zellen im Vergleich zu Verdünnungsmittel behandelten Zellen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), so wie es nach der UV-Bestrahlung berichtet worden war (Fritsche, M. et al., Oncogene 8 : 307-318 (1993); Nelson, W.G. und Kastan, M.B., Mol. Cell. Biol. 14 : 1815-1823 (1994); Lu, X. und Lane, D.P., Cell 75 : 765-778 (1993)). Diese Ergebnisse sind mit der Induktion der p53- regulierten Gene GADD-34 und SDI 1 in Fibroblasten (Daten nicht gezeigt), wie auch in SCC12F-Zellen durch pTpT kon sistent.

In einem anderen Experiment wurde gefunden, daß pTpT die Expression von SDI-1-mRNA in p53-abhängiger Weise indu ziert. Präkonfluente Kulturen von H1299-Zellen wurden mit einem Expressionsvektore transfiziert, der die Wildtyp humane p53-cDNA unter Kontrolle des humanen Cytomegalovi rus-Promotors/Enhancers enthält (Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Oncology Center). Kontrolltransfektionen wurden unter Verwendung des Vektors durchgeführt, aus dem die p53-cDNA entfernt wurde. Die Transfektionen wurden un ter Verwendung des Lipofectin-Reagens-Kits (GIBCO/BRL) durchgeführt. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen zur Western-Blot-Analyse unter Verwendung von 20 µg Gesamtprotein, wie beschrieben, geerntet (Yaar, M. et al., J. Clin. Invest. 94 : 1550-1562 (1994)). p53 wurde unter Verwendung von mAb 421, Anti-Maus-Ig, das an Meerrettisch peroxidase gebunden ist (Amersham, Arlington Heights, IL) und eines ECL-Kits (Amersham) nach den Angaben des Her stellers nachgewiesen. Zum Zeitpunkt des Proteinsammelns erhielten Duplikatkulturen von H1299-Zellen, die mit dem p53-Expressionsvektor (mit "p53" bezeichnet) oder mit dem Kontrollvektor ("Ctrl") transfiziert worden waren, entwe der Verdünnungsmittel (DMEM) oder 100 µM pTpT. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gesammelt, zur RNA-Isolierung und zur Northern-Blot-Analyse mit einer SDI-1-cDNA-Sonde aufgearbeitet. Die Autoradiographie wurde unter Verwendung eines MacIntosh-IIsi-Computers und eines MacIntosh-One- Scanners gescannt, und die Helligkeit und der Kontrast wurden eingestellt, um maximale Unterschiede der autora diographischen Signale darzustellen. Diese Ergebnisse zeigten, daß p53-null-H1299-Zellen einen sehr niedrigen Spiegel des SDI-1-Transkripts exprimieren und daß dieser Spiegel durch die Zugabe von pTpT nicht beeinflußt wird (Daten nicht gezeigt). Die Transfektion dieser Zellen mit einem Wildtyp-p53-Expressionsvektor erhöhte den Spiegel von SDI 1 und führte dazu, daß dieses Transkript durch Zu gabe von pTpT induzierbar wurde (Daten nicht gezeigt). Die Western-Analyse bestätigte, daß H1299-Zellen üblicherweise kein p53 exprimieren und daß transfizierte H1299-Zellen hohe Spiegel an p53 exprimieren (Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen in starkem Maße nahe, daß pTpT die transkriptionelle Aktivität von p53 erhöht.

BEISPIEL 8 Verstärkung der DNA-Reparatur

Die Expression eines UV-geschädigten Reporterplasmids, das das bakterielle Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen unter Kontrolle von SV40-Promotor und Enhancersequenzen enthält, von der/dem zuvor gezeigt wurde, daß es die er niedrigte DNA-Reparaturfähigkeit in menschlichen Lympho zyten, die mit dem Altern und der Frühentwicklung von Hautkrebs assoziiert ist, nachweist (Wei, Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.I USA 90 : 1614-1618 (1993)) wurde verwen det, um die DNA-Reparaturfähigkeit von Fibroblasten, die von normaler neonataler menschlicher Haut abgeleitet sind, und von Keratinozyten zu messen.

Neugeborenen Keratinozyten wurden wie beschrieben eta bliert (Stanulis-Praeger, B.M. und Gilchrest, B.A., J. Cell. Physiol. 139 : 116-124 (1989)), wobei eine Modifikati on des Verfahrens von Rheinwald und Green (Gilchrest, B.A. et al., J. Invest. Dermatol. 101 : 666-672 (1993)) verwendet wurde. Keratinozyten der ersten Passage wurden in einem nichtdifferenzierenden Niedrig-Ca²⁺-Medium (K-Stim, Colla borative Biomedical Products, Bedford, MA) gehalten. Die Fibroblasten wurden aus dermalen Explantaten, wie be schrieben etabliert (Rheinwald, J. G. und Green, J. Cell 6 : 331-343 (1975)) und in DMEM, supplementiert mit 10% Rin derserum, gehalten. Die Zellen wurden entweder mit 100 µM pTpT oder einem gleichen Volumen Verdünnungsmittel (DHER) während 5 Tagen vor der Transfektion gehalten. Duplikat kulturen jeder Bedingung wurden unter Verwendung des Li pofectin-Reagens-Kits (GIBCO/BRL) und 5 µg Reporter-DNA, nämlich pCAT-Kontrollvektor (Promega, Madison, WI) trans fiziert. Vor der Transfektion wurde die Vektor-DNA entwe der scheinbestrahlt oder einer 100 mJ/cm² UVB-Strahlung von einem 1 KW Xenon-Bogen-Sonnenlichtsimulator (XMN 1000-21, Optical Radiation, Azuza, CA), der auf 285 ± 5 nm unter Verwendung eines Forschungsradiometers (Modell IL l700A, International Light, Newburyport, MA) eingestellt wurde, wie beschrieben (Yaar, M. et al., J. Invest. Dermatol. 85 : 70-74 (1985)) ausgesetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion in einem Lysis-Puffer, der in dem CAT-Enzym-Assay-System (Promega, Madison, WI) enthalten war, unter Verwendung eines Protokolls, das von dem Her steller bereitgestellt wurde, gesammelt. Die CAT- Enzymaktivität wurde unter Verwendung des Flüssigszintil lationszählungsprotokolls und Bestandteilen des Assaysy stemkits bestimmt. Markiertes Chloramphenicol [50-60 mCi (1,85-2,22 GBq) mmol] wurde von New England Nuclear (Boston, MA) bezogen. Die Proteinkonzentration in den Zellextrakten wurde unter Verwendung des Verfahrens von Bradford bestimmt (Anal. Biochem. 72 : 248 (1986)). Die CAT- Aktivität wurde als cpm/100 µg Protein ausgedrückt und ist als Prozent Aktivität von Zellen transfiziert mit schein bestrahltem Plasmid dargestellt.

In vorläufigen Experimenten wurde nachgewiesen, daß ein Aussetzen des Plasmids gegenüber einer Dosis sonnenlicht simulierter Bestrahlung (100 mJ/cm², gemessen bei 285 nm) vor der Transfektion im Vergleich zu scheinbestrahltem Plasmid, das in gepaarte Kulturen transfiziert wurde, zu einer etwa 75%igen Reduktion der CAT-Aktivität, gemessen in Zell-Lysaten 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion, führte. Jedoch zeigten Keratinozyten (Fig. 10) und Fi broblasten (Fig. 11), die mit 100 µM pTpT während fünf Tagen vor der Transfektion vorbehandelt worden waren, eine CAT-Aktivität, die mehr als 50% derjenigen von scheinbe strahlten transfizierten Kontrollen betrug. Da das Repor terplasmid nichtreplizierend war, reflektiert die Stärke der CAT-Aktivität direkt das Ausmaß der biologische Akti vität-wiederherstellenden DNA-Reparatur des UV- geschädigten CAT-Gens. Diese Daten zeigen somit, daß die pTpT-Behandlung normaler humaner Fibroblasten und Kera tinozyten die Fähigkeit der Zellen, UV- induzierte DNA- Schäden während eines 24 Stunden Zeitraums zu reparieren, mehr als verdoppelt. Es wurde gezeigt, daß kultivierte hu mane Zellen innerhalb 24 Stunden nach der Bestrahlung mehr als 70% der UV-induzierten Photoprodukte reparieren (Mitchell, D.L. et al., Environmental UV Photobiology (Young, A.R. et al., Hrsg.), 345-377 (Plenum Press, New York und London, (1993)). Die verstärkte Expression des UV-bestrahlten Plasmids in pTpT-behandelten Zellen rührte nicht von einer allgemeinen Erhöhung der Plasmidtranskrip tion in diesen Zellen her, da die Expression des scheinbe strahlten Plasmids nicht höher war als die nicht-pTpT- behandelter Zellen.

BEISPIEL 9 Aktivierung von p53 und Reparatur von BP-DNA- Addukten Zellkultur

Humane Neugeborenen Keratinozyten wurden unter Verwendung einer Modifikation (Stanislus et al., J. Invest. Dermatol. 90 : 749-754 (1998)) des Verfahrens von Rheinwald und Green (Cell 6 : 331-343 (1975)) etabliert. Keratinozyten der er sten Passage wurden in einem nichtdifferenzierenden Medi um, das eine geringe Konzentration von Calciumionen ent hält, gehalten (K-Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA).

Die p53-null-H1299-Lungenkarzinomzellinie (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) wurde in Dulbec co's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), das mit 10% Rinderserum (Hyclone Labs, Logan, UT) supplementiert war, gehalten.

Transfektion von H1299-Zellen mit einem p53- Expressionsvektor

Präkonfluente Kulturen von H1299-Zellen wurden mit einem Expressionvektor transfiziert, der die Wildtyp-humane-p53- cDNA unter Kontrolle des humanen Cytomegaloviruspromo tors/Enhancers enthielt (Dr. Bert. Vogelstein, Johns Hop kins Oncology Center). Es wurden Kontrolltransfektionen unter Verwendung des gleichen Vektors durchgeführt, dem die p53-cDNA fehlt. Die Transfektionen wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen für Western Blots unter Verwendung von 20 µg Gesamtprotein, wie beschrieben, gesammelt. p53 wurde unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers Do-1 (Ab-6), von dem bekannt ist, daß er sowohl die aktiven als auch die inaktiven Formen des Proteins erkennt (Oncogene, Cam bridge, MA), Anti-Maus-Ig, das an Meerrettichperoxidase gebunden ist (Amersham, Arlington Heights, IL) und eines ECL-Kits (Amersham) nach den Angaben des Herstellers, nachgewiesen.

p53-Assay unter Verwendung eines hGH-Reporterplasmids

Normale humane Keratinozyten wurden mit dem humanen Wachs tumshormon (hGH) -Reporterplasmid (pPG-GH) unter Verwendung des Lipofectamin-Reagenskits (GIBCO/BRL), wie von dem Her steller vorgeschlagen, und 0,5 µg pPG-GH, zugegeben zu je der p53-Kulturschale, transfiziert. pPG-GH enthält die hGH-codierende Region unter Kontrolle des Thymidinkina se(TK)-Promotors und der p53-Konsensussequenz, und die hGH-Proteinbildung ist bekanntermaßen proportional zur p53-Aktivität (Kern et al., 1992).

Die Transfektion wurde in Gegenwart von 100 µM pTpT (Midland Certified Reagent Company, Midland, TX) oder ei nem gleichen Volumen Verdünnungsmittel durchgeführt. Gleichzeitig wurde der PS-β-Galactosidase-Kontrollvektor (Promega, Madison, WI) cotransfiziert, um die Transfekti onseffizienz zu bestimmen (Norton und Coffin, 1985). Vier Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und durch K-Stim-Medium mit oder ohne 100 µM pTpT ersetzt. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion und der pTpT- Behandlung wurden 400 ul des Mediums von jeder 35mm- Kulturschale geerntet, und es wurden 100 µl ¹²⁵I-hGH- Antikörperlösung (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA) zugegeben, um sekretiertes hGH nachzuwei sen. Die Zellen wurden in einem Reporter-Lysepuffer (Promega) unter Verwendung eines Protokolls, das vom Her steller bereitgestellt wurde, geerntet, und es wurden 150 µl dieses Lysats für den β-Galactosidaseassay unter Ver wendung eines β-Galactosidaseassaykits verwendet (Promega). Proben von jeder der Dreifachkulturschälchen wurden im Hinblick auf die hGH- und β-Galactosidase- Synthese ausgewertet.

H1299-Zellen wurden in ähnlicher Weise mit dem p53- Expressionsvektor oder Kontrollvektor transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden diese Zellen mit pPG-GH und PSV-β-Galactosidase-Kontrollvektor cotransfiziert und mit 100 µM pTpT behandelt. Vierundzwanzig Stunden später wurden 250 ul des Mediums und das Zell-Lysats geerntet und wie oben beschrieben weiterbehandelt.

CAT-Assay

Der pCAT-Vektor (Promega) wurde mit Benzo(a)pyren-7,8- diol-9,10-epoxid (BPDE) wie beschrieben (Athas et al., Cancer Res. 1991) behandelt, um weniger geschädigte und stärker geschädigte Plasmide zu erhalten, wobei zuvor ge zeigt wurde, daß diese in Untersuchungen instruktiv sind, bei denen die unterschiedlichen Reparaturkapazitäten in menschlichen Zellen untersucht werden. Basierend auf der Inkorporation von ³H-BPDE in die DNA enthielt das weniger geschädigte Plasmid 25 Addukte je 5kb-Plasmid, und das ge schädigte Plasmid enthielt 50 Addukte. Dieser nichtrepli zierende Vektor enthält das Chloramphenicolacetyltransfe rase-Gen unter Kontrolle von SV40-Promotor- und Enhancer sequenzen. Humane Keratinozyten und p53-transfizierte H1299-Zellen wurden entweder mit 100 µM pTpT oder einem gleichen Volumen von Verdünnungsmittel (DMEM) allein wäh rend 48 Stunden vorbehandelt, dann mit entweder BP- modifiziertem pCAT-Kontrollvektor (0,5 µg/ml) oder mit nicht modifiziertem Vektor (0,5 µg/ml) zusammen mit dem PSV-β-Galactosidase-Kontrollvektor (0,5 µg/ml) transfi ziert. Die Zellen wurden in einem Reporter-Lysepuffer (Promega) 24 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Die CAT-Enzymakaktivität wurde unter Verwendung des Flüssigs zintillationszählungsprotokolls und Bestandteilen des As saysystemkits (Promega) bestimmt. ¹⁴C-markiertes Chloram phenicol [50-60 mCi (1,85-2,22 GB q) mmol] wurde von New England Nuclear (Boston, MA) bezogen. Die CAT-Aktivität wurde mit β-Galactosidaseaktivität normalisiert.

Western-Blot-Analyse

Zellen wurden mit 100 µM pTpT oder einem gleichen Volumen Verdünnungsmittel alleine während 48 Stunden behandelt. Gesamtzellproteine wurden in einem Puffer, bestehend aus 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,375 M NaCl, 2,5% Natriumdes oxycholat, 1% Triton X-100, 25 mM MgCl₂, 1 mM Phenylmethyl sulfonylfluorid und 0,1 mg/ml Aprotinin gesammelt. Die Proteine (100 µg je Probe) wurden durch 7,5-15% SDS-PAGE getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) übertragen. Nach dem Transfer wurde das Gel mit Coomassieblau gefärbt, um gleiche Beladung nachzuweisen, die durch restliche Proteine hohen Moleku largewichts visualisiert wurde. Die Membranen wurden in 0,05% Tween-20/PBS mit 5% Milch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) blockiert. Antikörperreaktionen wurden mit den folgenden Antikörpern durchgeführt: anti-p53 (AB-6), anti-PCNA (Ab-2) (Oncogene Science) und anti-XPA (FL-273) (Santa Cruz Biotechnology). Schaf-Anti-Maus-Ig, gebunden an Meerrettichperoxidase (Amersham, Arlington Heights, IL) (für p53 und PCNA) und Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Bio-Rad) (für XPA) wurden als Sekundärantikörper verwendet. Die Bindung wurde durch den ECL-Nachweiskit (Amersham) nachge wiesen.

Um die Reparatur von BP-DNA-Addukten zu messen, wurde das nichtreplizierende BP-geschädigte Reporterplasmidsystem, enthaltend das bakterielle Chloramphenicolacetyltransfera se(CAT)-Gen, wie in Beispiel 8 beschrieben, verwendet. Mit humanen Keratinozyten erster Passage betrug die Transfek tionseffizienz, die durch den cotransfizierten β-Galacto sidase-Expressionsvektor gemessen wurde, 40 bis 70%. Im Vergleich zu Verdünnungsmittel-behandelten Zellen zeigten pTpT-behandelte humane Keratinozyten etwa eine Verdoppe lung der CAT-Expression in Relation zu gepaarten Kulturen, die mit nichtgeschädigtem Kontroll-CAT-Vektor transfiziert wurden, und zwar wenn diese entweder mit dem weniger BP- geschädigten (etwa 25 Addukte/Plasmid) oder dem mehr BP- geschädigten (etwa 50 Addukte/Plasmid) Vektor transfiziert wurden.

Um die Aktivierung von p53 durch pTpT in einem zweiten As say zu bestätigen, wurde ein Reporterplasmid verwendet, das das humane Wachstumshormon(hGH)-Gen unter dem Einfluß eines p53-induzierbaren Promotors enthält. Die Aktivierung von p53 erhöht seine Bindung an die Konsensussequenz im Plasmid, was zur Transkription der hGH-codieren-den Se quenz und letztlich zur Sekretion von hGH in das Medium führt.

pTpT-behandelte humane Keratinozyten zeigten eine 45% ± 25% Erhöhung der hGH-Sekretion, verglichen mit Verdün nungsmittel-behandelten Zellen. Diese Daten zeigen, daß pTpT p53 in normalen humanen Keratinozyten, wie auch in p53-transfizierten H1299-Zellen aktiviert.

Um zu bestätigen, daß pTpT die Reparatur von BP-DNA- Addukten durch die p53-Aktivierung repariert, wurden p53- null-H1299-Zellen mit dem p53-Expressionsvektor transfi ziert, und die p53-Proteinexpression wurde dann durch We stern-Blot-Analyse 48 Stunden nach der Transfektion bestä tigt. In Parallelkulturen 48 Stunden nach der Transfektion mit dem p53-Expressions- oder Kontrollvektor dann Weiter bearbeitung wie oben beschrieben. In p53- + H1299-Zellen war die Reparatur der vergleichbar, die bei normalen Kera tinozyten beobachtet wurde, und das Plasmid, das ein nied riges Ausmaß an BP-Schädigung enthielt, wurde 80% ± 50% effizienter in pTpT-vorbehandelten Zellen repariert als in Zellen, die mit Verdünnungsmittel vorbehandelt wurden, und das Plasmid, das ein hohes Ausmaß an BP-Schädigung ent hielt, wurde mehr als dreimal effizienter repariert. In p53-H1299-Zellen war jedoch die Reparaturkapazität in bei den Behandlungsgruppen gleich. Diese Daten zeigen, daß ei ne verstärkte Reparatur von BP-DNA-Addukten durch pTpT p53 benötigt.

Die pTpT-Aktivierung von p53 in H1299-Zellen, die transi ent mit dem p53-responsiven hGH+H1299 transfiziert wurden, führte zu einer 40%igen Steigerung der hGH-Sekretion im Vergleich zu Verdünnungsmittel-behandelten Zellen. Diese Daten zeigen weiter, daß pTpT die p53-transkriptionelle Aktivität durch eine verstärkte Bindung an seine DNA- Konsensussequenz verstärkt.

Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um diesen Effekt der pTpT-Behandlung auf die Expression ausgewählter Gene, von denen bekannt war, daß sie in der DNA-Reparatur eine Rolle spielen, zu untersuchen. Normale humane Keratino zyten wurden vor dem Ernten des Zellproteins zwei Tage mit pTpT behandelt. pTpT regulierte die Spiegel von p53, PCNA und dem XPA-Protein 2- bis 3fach innerhalb von 2 Tagen Be handlung hoch.

BEISPIEL 10 Inhibition der Kontakthypersensitivität in einem murinen Modell

C57/B16-Mäuse wurden der folgenden Behandlung vor der Sen sibilisierung mit dem Allergen DNFB durch die abdominale Haut unterzogen; keine Vorbehandlung, UVB-Bestrahlung (200 J/m²/d×4d), pTpT, pApA, oder Vehikel alleine (30 µl, 100 µM BID×5d). Mäuse, die mit UVB- oder pTpT vorbehandelt wurden, zeigten bemerkenswert unterdrückte Ohrschwellungs antworten auf eine DNFB-Herausforderung (0,6 ± 0,2 und 0,9 ± 0,3), verglichen zu nichtbehandelten oder Vehikel behandelten Tieren (4,3 ± 0,6 und 3,3 ± 0,2), wohingegen pApA-behandelte Mäuse mittlere Antworten zeigten (2,5 ± 0,6). Die TNFa-Genaktivierung wurde durch Verwendung von Mäusen gemessen, die ein CAT-Reportertransgen trugen, das den ganzen TNFα-Promotor und die 3'-nichtranslatierte Re gion trug. Transgene Mäuse wurden der folgenden Behandlung vor dem Hautassay zur CAT-Expression unterzogen: UVB- Bestrahlung (200-700 J/m²), intrakutane Injektion von pTpT (100 µM); Lipopolysaccharid (LPS 1 µg/ml) als Positivkon trolle oder Vehikel alleine. Die CAT-Aktivität wurde in Haut bestimmt, die mit UVB, LPS oder pTpT (jedoch nicht mit Vehikel alleine) behandelt wurde.

BEISPIEL 11 Oligonukleotid-abhängige UV-vortäuschende Ak tivität

Die Induktion der Melanogenese in Cloudman-S91-Maus- Melanomzellen mit einem Fünf-Nukleotidoligomer, CATAC (SDQ ID NO: 5) und einem Neun-Nukleotidoligomer, GAGTATGAG (SEQ ID NO: 1) wurde untersucht. Duplikate von Cloudman-S91- murinen-Melanomzellen wurden mit entweder 100 µM Oligo oder einem gleichen Volumen Verdünnungsmittel (H₂O) während 5 Tagen inkubiert. Die Zellen wurden dann gesammelt, ge zählt und zur Melaninanalyse sedimentiert. In drei Experi menten stieg der Pigmentgehalt nach Inkubation mit dem 9-mer, 5-mer und pTpT auf 418% ± 267%, 61% ± 60% bzw. 155% ± 60%, bezogen auf die Kontrollspiegel. Das 9-mer, jedoch nicht das 5-mer stimulierte ebenfalls die Melanogenese in humanen Melanozyten und führte zu einer 51 bis 62% Steige rung nach einer Woche in Kultur. Wie mit pTpT induzierte das 9-mer Oligonukleotid, nicht jedoch das 5-mer auch die Expression des p21/Waf 1/Cip1-Gens innerhalb von 48 Stun den in einer squamösen Zellkarzinomlinie, bei einer Stei gerung der Menge dieser mRNA auf 200 bis 300%, verglichen mit einer 100 bis 150%igen Steigerung durch pTpT. Varia tionen dieses Oligonukleotids wurden ausgewertet: ein durchgewürfeltes 9-mer (TAGGAGGAT, SEQ ID NO: 2) und zwei trunkierte Versionen, ein 7-mer (AGTATGA, SEQ ID NO: 3) und ein 5-mer (GTATG SEQ ID NO: 4). Beide 9-mere waren in der gleichen Weise aktiv und führten zu einer 800%igen Steigerung des Melaningehalts. Die trunkierten Versionen (7-mer und 5-mer) waren ebenfalls aktiv und induzierten 640% bzw. 670% Steigerung. Zusammen zeigen diese Daten, daß die UV-vortäuschende Aktivität von pTpT dramatisch durch andere Oligonukleotide verstärkt oder vervielfältigt werden kann.

BEISPIEL 12 Der Effekt von DNA-Fragmenten auf die DNA- Reparatur in vivo

Transgene Mäuse, die multiple genomische Kopien eines LacZ-Reporterplasmids tragen, wurden verwendet. Einhundert µM pTpT in Polypropylenglykol wurde auf ein Ohr und das Vehikel alleine auf das andere Ohr täglich während vier Tagen aufgetragen. Am fünften Tag wurden beide Ohren 100 mJ/cm² UVB-Licht ausgesetzt. Diese Prozedur wurde wöchent lich während 3, 5 oder 7 Wochen wiederholt (3 Mäu se/Gruppe). Eine Woche nach der letzten Bestrahlung wurden LacZ-Plasmide von der Ohr-Epidermis geerntet. Unter Ver wendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, wurden die Plasmide aus genomischer DNA durch Re striktionsenzymspaltung und spezifische Bindung an das lac-LacI-Protein gewonnen. Mutante LacZ-Plasmide wurden positiv durch Transfektion in Bakterien und Wachstum auf Selektionsmedium selektiert, und die Mutationsfrequenz wurde bestimmt. Nach 3, 5, 7 Wochen zeigte pTpT-behandelte Haut eine 20 bis 30% niedrigere Mutationsfrequenz als die Verdünnungsmittel-behandelte Haut (200 gegenüber 293, 155 gegenüber 216 bzw. 261 gegenüber 322). Die Daten zeigten, daß pTpT-verstärkte DNA-Reparatur UV- induzierte Mutationen in vivo reduzierte, und die Daten legen nahe, daß eine to pische Anwendung diese Dinukleotids verwendet werden könn te, um die Mutationsrate in Karzinogen-ausgesetzter huma ner Haut zu erniedrigen.

BEISPIEL 13 Der Effekt der Oligonukleotidgröße und des 5'-Phosphats auf die Stimulation von UV-induzierten pro tektiven Phänotypen

Cloudman-S91-Melanomzellen wurden mit einem 20-mer Oligo nukleotid (GCATGCATGCATTACGTACG (SEQ ID NO: 6)) in einer Konzentration von 100 µM behandelt. Eine getrennte Zell probe wurde auf die gleiche Weise mit 100 µM pTpT behan delt. Die Ergebnisse zeigten, daß S91-Zellen, die mit dem 20-mer behandelt wurden, eine Erhöhung von 50% in Bezug auf das Pigment über die Verdünnungsmittel-behandelten Kontrollzellen zeigten. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit pTpT behandelt wurden, eine 400 bis 900%ige Stei gerung des Pigmentsgehalts. Obwohl also dieses 20-mer- Oligonukleotid etwas protektiven Phänotyp in Form einer gesteigerten Pigmentproduktion induziert, wurde gefunden, daß es ein viel weniger aktiver Stimulator des UV- induzierten protektiven Phänotyps ist als pTpT.

Der Effekt der 5'-phosphorylierten gegenüber der nicht phosphorylierten Form von pTpT und dem 9-mer Oligonukleo tid GAGTATGAG (SEQ ID NO: 1) wurde gemessen. In drei Expe rimenten wurden S91-Zellen entweder mit pTpT, TPT oder Verdünnungsmittel behandelt, oder die Zellen wurden mit der 5'-phosphorylierten gegenüber der nichtphosphorylier ten Form von SEQ ID NO: 1 behandelt. Die Stimulation der Mutagenese über die Kontrollen betrug für pTpT gegenüber TpT 385 gegenüber 12,5%, 50 gegenüber 0% bzw. 900 gegen über 360%. In einem getrennten Experiment erhöhte das 5'- phosphorylierte 9-mer den Pigmentgehalt 1000 bis 100% der Kontrollwerte, wohingegen die nichtphosphorylierte Form eine 600%ige Erhöhung stimulierte. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit publizierten Daten, die zeigen, daß die Aufnahme von DNA-Oligo durch das 5'-Phosphat erleich tert wird.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der p53-Aktivität in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einer wirksamen Menge von DNA-Fragmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, Desoxynukleotiden, Dinukleotiden, Dinukleotiddimeren und Kombinationen davon.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aktivierung von p53 zu einer Nukleotid-Exzisions-Reparatur in der Zelle führt.

3. Verfahren zur Verringerung der Empfindlichkeit gegen über einer UV-induzierten hyperproliferativen Erkrankung in einem Säugetier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epidermis eines Säugetieres einer wirksamen Menge von DNA-Fragmenten mit einer Länge von 2 bis 200 Basen, wobei die DNA-Fragmente aus der Gruppe bestehend aus ein zelsträngigen DNA-Fragmenten, doppelsträngigen DNA- Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente ausgewählt sind.

4. Verfahren zur Behandlung von Psoriasis in einem Säu getier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epi dermis des Säugetieres einer wirksamen Menge von DNA- Fragmenten, so daß die Verabreichung zu einer Inhibition der Proliferation der interessierenden Zellen oder einer Abnahme der epidermalen Dicke führt, und wobei die DNA- Fragmente etwa 2 bis 200 Basen lang sind und wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA- Fragmenten, doppelsträngigen DNA- Fragmenten und einem Gemisch von einzel- und doppelsträn gigen DNA-Fragmenten.

5. Verfahren zur Behandlung von Vitiligo in einem Säuge tier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epider mis des Säugetieres einer wirksamen Menge von DNA- Fragmenten, wobei die DNA-Fragmente etwa 2 bis 200 Basen lang sind und wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, doppelsträngigen DNA-Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

6. Verfahren zur Behandlung atopischer Dermatitis, Kon taktdermatitis oder allergisch vermittelter Entzündung an derer Epithelien, wie z. B. allergische Rhinitis oder allergische Konjunktivitis in einem Säugetier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epidermis des Säugetie res einer wirksamen Menge an DNA-Fragmenten, wobei die DNA-Fragmente etwa 2 bis 200 Basen lang sind und wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, doppelsträngigen DNA- Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

7. Verfahren zur Inhibierung UV-induzierter Dermatosen in einem Säugetier, umfassend die Verabreichung auf epi dermale epitheliale Zellen von Interesse in dem Säugetier einer wirksamen Menge von DNA-Fragmenten mit einer Länge von etwa 2 bis 200 Basen, wobei die DNA-Fragmente ausge wählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, doppelsträngigen DNA-Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

8. Verfahren zur Verringerung des Photoalterns in des Säugetier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epidermis eines Säugetiers einer wirksamen Menge an DNA- Fragmenten einer Länge von etwa 2 bis 200 Basen, wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, doppelsträngigen DNA- Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

9. Verfahren zur Verringerung der Empfindlichkeit gegen über Hautkrebs in einem Säugetier, umfassend die topische Verabreichung auf die Epidermis des Säugetiers einer wirk samen Menge an DNA-Fragmenten einer Länge von etwa 2 bis 200 Basen, wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA-Fragmenten, dop pelsträngigen DNA-Fragmenten und einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

10. Verfahren zur Verhütung oder Verringerung einer DNA- Schädigung in einer Zelle, wobei die DNA-Schädigung durch UV-Bestrahlung oder DNA-schädigende Chemikalien hervorge rufen wird, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einer wirksamen Menge an DNA-Fragmenten, die etwa 2 bis 200 Basen lang sind, wobei die DNA-Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngigen DNA- Fragmenten, doppelsträngigen DNA-Fragmenten und einem Ge misch einzel- und doppelsträngiger DNA-Fragmente.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das einzelsträngige DNA-Fragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Dinukleotide ausge wählt sind aus der Gruppe bestehend aus d(pT)₂, d(pC)₂, d(pA)₂, d(pCpT), d(pTpC), d(CpT), d(TpC) und d(TpT).

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelsträngigen DNA-Fragmente, Desoxynukleotide oder Dinukleotide ultra violett-bestrahlt sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Fragmente in einem Verabreichungvehikel verabreicht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verabreichungsvehi kel Liposomen umfaßt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verabreichungsvehi kel Propylenglykol enthält.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Fragmente durch ein Aerosol verabreicht werden.

18. Zusammensetzung, umfassend ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, und ein Verabreichungsvehikel.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekenn zeichnet, daß die Menge an DNA-Fragmenten ausrei chend ist, um die p53-Aktivität in einer Zelle zu erhöhen.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekenn zeichnet, daß die Menge an DNA-Fragmenten ausrei chend ist, um die Proliferation einer Zelle zu inhibieren.

21. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprü che 18 bis 20 zur Herstellung eines Medikaments für eine the rapeutische Anwendung, die ausgewählt ist aus: Erhöhung der p53-Aktivität in einer Zelle, Verringerung der Empfindlich keit gegenüber einer UV-induzierten hyperproliferativen Er krankung, Behandlung von Psoriasis, Behandlung von Vitiligo, Behandlung atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis oder allergisch vermittelter Entzündungen anderer Epithelien, wie z. B. allergische Rhinitis oder allergische Konjunktivitis, Inhibierung UV-induzierter Dermatosen, Verringerung des Pho toalterns, Verringerung der Empfindlichkeit gegenüber Haut krebs, Verhütung oder Verringerung einer DNA-Schädigung in einer Zelle.