DE19926457A1

DE19926457A1 - Method for the electrochemical detection of nucleic acid-oligomer hybridization events

Info

Publication number: DE19926457A1
Application number: DE19926457A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich
Original assignee: Gerhard Hartwich
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GMBH, 80639 MUENCHEN, DE
Priority date: 1999-01-18
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2000-07-27
Also published as: DE19901761A1; KR20010101477A; ZA200105097B

Abstract

The invention relates to a method for electrochemically detecting sequence-specific nucleic acid-oligomer hybridisation events. DNA/RNA/PNA oligomer single strands which are bound to a conductive surface at one end and linked to a redoxactive unit at the other, free end, serve as a hybridisation matrix (probe). A proportion of the single strand oligonucleotides are hybridised by treatment with the oligonucleotide solution (target) being tested, with the result that the electrical communication between the conductive surface and the redoxactive unit, which is initially non- or barely existent, is increased. This enables a hybridisation event to be detected using electrochemical methods such as voltammetry, amperometry or conductance measurement.

Description

Technical field

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer, sowie ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen.The present invention relates to a modified nucleic acid oligomer and a Method for the electrochemical detection of sequence-specific nucleic acid Oligomer hybridization events.

State of the art

Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA, z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor, werden im allgemeinen gel elektrophoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion verwendet.For sequence analysis of DNA and RNA, e.g. B. in disease diagnosis toxicological test procedures, in genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sector, are generally gel electrophoretic processes with autoradiographic or optical detection used.

Beim wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahren mit optischer Detektion, dem Sanger-Verfahren wird eine DNA enthaltende Lösung in vier Ansätze aufgeteilt. Zur Unterscheidung der vier Ansätze ist der Primer (komplementäre Startsequenz zur Replikation) jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener Wellenlänge emitierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Ausgehend vom Primer wird jeder Ansatz durch DNA-Polymerase I enzymatisch repliziert. Neben den dazu nötigen Desoxyribonucleosid-Triphosphaten der Basen A (Adenin), T (Thymin), C (Cytosin), und G (Guanin) enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend 2', 3'- Didesoxyanalogon eines dieser Nukleosidtriphosphate als Stopbase (je eine der 4 möglichen Stopbasen pro Ansatz), um die Replikation an allen möglichen Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze entstehen replizierte DNA-Fragmente aller Längen mit stopbasenspezifischer Fluoreszenz, die gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert werden können.The most important gel electrophoretic method with optical detection, the Sanger's method involves dividing a DNA-containing solution into four batches. For Differentiation of the four approaches is the primer (complementary start sequence to Replication) of each approach with one at different wavelengths emitting fluorescent dye covalently modified. Starting from the primer each approach enzymatically replicated by DNA polymerase I. In addition to that necessary deoxyribonucleoside triphosphates of bases A (adenine), T (thymine), C (Cytosine), and G (guanine) each reaction mixture still contains sufficient 2 ', 3'- Dideoxy analogue of one of these nucleoside triphosphates as stop base (one of the 4 possible stop bases per approach) to replicate at all possible To stop binding sites. After combining the four approaches arise replicated DNA fragments of all lengths with stop base-specific fluorescence that Gel electrophoretically sorted by length and by fluorescence spectroscopy can be characterized.

Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert auf der Anlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Im Vergleich zur freien Lösung des Farbstoffs ändert sich die Fluoreszenz solcher Farbstoffe bei Assoziation mit doppelsträngiger DNA oder RNA drastisch und kann deshalb zum Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet werden. Another optical detection method is based on the addition of Fluorescent dyes such. B. Ethidium bromide on oligonucleotides. Compared the fluorescence of such dyes changes to free the dye Association with double-stranded DNA or RNA drastically and can therefore become Detection of hybridized DNA or RNA can be used.

Bei der radioaktiven Markierung wird ³²P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide eingebaut, wobei ³²P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so daß pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im Reaktionsgemisch für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der ³²P-Markierung bis zur Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der Base erhält man entsprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier Fragmentgemische werden anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird vom Gel ein Autoradiogramm angefertigt, an dem die Sequenz unmittelbar abgelesen werden kann.In the case of radioactive labeling, ³² P is incorporated into the phosphate skeleton of the oligonucleotides, ³² P usually being added at the 5'-hydroxyl end by polynucleotide kinase. The labeled DNA is then preferably cleaved at one of the four nucleotide types, under defined conditions, so that an average cleavage occurs per chain. This means that there are chains in the reaction mixture for a certain base type, which extend from the ³² P mark to the position of this base (if the base occurs more than once, chains of different lengths are obtained). The four fragment mixtures are then separated by gel electrophoresis on four lanes. An autoradiogram is then made from the gel, from which the sequence can be read immediately.

Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer) Detektion beruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die Sequenzierung durch Oligomer-Hybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Nukleinsäure-Oligomere (Sonden-Oligonukleotide), z. B. alle 65536 möglichen Kombinationen der Basen A, T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein Trägermaterial gebunden. Die Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus 65536 Test-Sites, wobei jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid- Kombination ein Test-Site definieren und die Position jeder einzelnen Test-Site (Oligonukleotid-Kombination) bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix, dem Oligomer-Chip, wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will (das Target), mit Fluoreszenzfarbstoff (oder ³²P) markiert und unter Bedingungen, die nur eine spezifische Doppelstrangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet das Target DNA-Fragment nur an die Nukleinsäure-Oligomere (im Beispiel an die Oktamere), deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (einem Oktamer) seiner eigenen Sequenz entspricht. Durch optische (oder autoradiographische) Detektion der Bindungsposition des hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im Fragment vorhandenen Nukleinsäure-Oligomersequenzen (Oktamersequenzen) bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Nukleinsäure- Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die Vorteile dieses Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der Sequenzierung und damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem Arbeitsgang erfaßt wird. Daneben kann auf Primer und auf das gel-elektrophoretische Auftrennen der DNA- Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 1 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment gezeigt. A few years ago, a further method for DNA sequencing based on optical (or autoradiographic) detection was developed, namely sequencing by oligomer hybridization (cf. e.g. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 or Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), pp. 303-307). In this method, a complete set of short oligonucleotides or nucleic acid oligomers (probe oligonucleotides), e.g. B. all 65536 possible combinations of bases A, T, C and G of an oligonucleotide octamer are bound to a support material. The connection is made in an ordered grid of 65536 test sites, a larger amount of an oligonucleotide combination defining a test site and the position of each individual test site (oligonucleotide combination) being known. On such a hybridization matrix, the oligomer chip, a DNA fragment, the sequence of which is to be determined (the target), is labeled with fluorescent dye (or ³² P) and hybridized under conditions which only permit specific double-strand formation. As a result, the target DNA fragment only binds to the nucleic acid oligomers (in the example to the octamers) whose complementary sequence corresponds exactly to a part (an octamer) of its own sequence. By optical (or autoradiographic) detection of the binding position of the hybridized DNA fragment, all nucleic acid oligomer sequences (octamer sequences) present in the fragment are thus determined. Due to the overlap of adjacent nucleic acid oligomer sequences, the continuous sequence of the DNA fragment can be determined using suitable mathematical algorithms. The advantages of this method include the miniaturization of the sequencing and thus the enormous amount of data that is recorded simultaneously in one operation. In addition, primers and gel-electrophoretic separation of the DNA fragments can be dispensed with. This principle is shown by way of example in FIG. 1 for a 13 base long DNA fragment.

Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auflösungsvermögen (maximal 1 mm²) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard- und Software erhöht und die Detektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheblichen zusätzlichen Kosten verbunden.The use of radioactive labels in DNA / RNA sequencing has several disadvantages, such as e.g. B. complex, legally prescribed safety precautions when handling radioactive materials, the radiation exposure, the limited spatial resolution (maximum 1 mm ² ) and a sensitivity that is only high if the radiation of the radioactive fragments for a correspondingly long (hours to days) an x-ray film. Although the spatial resolution can be increased by additional hardware and software and the detection time can be shortened by using β scanners, both are associated with considerable additional costs.

Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die Anwendung der Autoradiographie; entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei verschiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomer-Chip ist die Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungssystem, zur 2- dimensionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras (Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.The fluorescent dyes that are commonly used to label DNA are partly mutagenic (e.g. ethidium bromide) and require, just like the Application of autoradiography; appropriate safety precautions. Almost In all cases, the use of optical detection requires the use of one or several laser systems and thus trained personnel and corresponding Safety precautions. The actual detection of fluorescence requires additional hardware, such as B. optical components for amplification and different excitation and interrogation wavelengths as in the Sanger method Control system. Depending on the required excitation wavelengths and the Desired detection performance can thus result in significant investment costs arise. When sequencing by hybridization is on the oligomer chip detection is even more (costly) because, in addition to the excitation system, dimensional detection of fluorescent spots high resolution CCD cameras (Charge Coupled Device Cameras) are required.

Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA- Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als transportable Systeme verfügbar.So although there are quantitative and extremely sensitive methods for DNA / RNA Sequencing out there, these methods are time consuming, involve time consuming Sample preparation and expensive equipment and are generally not considered portable systems available.

Presentation of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen. The object of the present invention is therefore a device and a To provide methods for the detection of nucleic acid-oligomer hybrids which do not have the disadvantages of the prior art.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer gemäß unabhängigem Patentanspruch 1, durch das Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers gemäß unabhängigem Anspruch 21, durch die modifizierte leitfähige Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch 29, das Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch 43 und ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen gemäß unabhängigen Patentanspruch 48 gelöst.According to the invention, this object is achieved by the modified nucleic acid oligomer according to independent claim 1, by the method for producing a modified nucleic acid oligomers according to independent claim 21, by which modified conductive surface according to independent claim 29, the Process for producing a modified conductive surface according to independent claim 43 and a method for electrochemical Detection of nucleic acid oligomer hybridization events according to independent claim 48 solved.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:Within the scope of the present invention the following abbreviations and Terms used:

genetics

DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH₂ DNA: deoxyribonucleic acid
RNA: ribonucleic acid
PNA: peptide nucleic acid (synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid. When the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH ₂

)₂ ) ₂

- N(COCH₂ - N (COCH ₂

-Base)-CH₂ -Base) -CH ₂

CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
U: Uracil
Base: A, G, T, C oder U
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem, Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatzpunkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss: single strand (Einzelstrang)
ds: double strand (Doppelstrang)CO unit hybridizes PNA with DNA.)
A: Adenine
G: Guanine
C: cytosine
T: thymine
U: uracil
Base: A, G, T, C or U
Bp: base pair
Nucleic acid: at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine). The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone). An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA in a sequence-specific manner.
Nucleic acid oligomer: nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another).
Oligomer: Equivalent to nucleic acid oligomer.
Oligonucleotide: Equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
Oligo: Abbreviation for oligonucleotide.
Primer: start complementary fragment of an oligonucleotide, the base length of the primer being only about 4-8 bases. Serves as a starting point for the enzymatic replication of the oligonucleotide.
Mismatch: To form the Watson Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in RNA, T is replaced by uracil ). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch".
ss: single strand
ds: double strand (double strand)

Photo-inducible and chemically inducible redox-active units

redoxaktive Einheit: photoinduzierbar redoxaktive Einheit oder chemisch induzierbar redoxaktive Einheit
Elektron-Donor: Der Begriff Elektron-Donor bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. einer chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit. Bei einem Elektron-Donor handelt es sich um ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron an einen Elektron- Akzeptor transferieren kann. Ein solcher äußerer Umstand ist z. B. die Lichtabsorption durch den Elektron-Donor oder -Akzeptor einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor "D" an den/einen Elektron-Akzeptor "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺ redox-active unit: photo-inducible redox-active unit or chemically inducible redox-active unit
Electron donor: In the context of the present invention, the term electron donor denotes a component of a photo-inducible redox-active unit or a chemically inducible redox-active unit. An electron donor is a molecule that can transfer an electron to an electron acceptor immediately or after exposure to certain external circumstances. Such an external circumstance is e.g. B. the light absorption by the electron donor or acceptor of a photo-inducible redox-active unit. By irradiating light of a certain or any wavelength, the electron donor "D" releases an electron to the electron acceptor "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ^{+ is formed}

A^- A ^-

aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Ein weiterer solcher äußerer Umstand kann z. B. die Oxidation oder Reduktion des Elektron-Donors oder -Akzeptors der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit durch ein externes Oxidations- oder Reduktionsmittel sein, also z. B. die Übertragung eines Elektrons auf den Elektron-Donor durch ein Reduktionsmittel bzw. die Abgabe eines Elektrons durch den Elektron-Akzeptor an ein Oxidationsmittel sein. Diese Oxidations- bzw. Reduktionsmittel können sowohl externe redoxaktive Substanzen sein, d. h. sie sind nicht kovalent mit der redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure-Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbunden, stehen aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt oder sie sind kovalent mit dem Nukleinsäure- Oligomer verbunden, wobei das Oxidations- bzw. Reduktionsmittel an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers kovalent angebunden ist, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der redoxaktiven Einheit entfernt ist, bevorzugt an dem der Modifikation mit redoxaktiver Einheit entgegengesetzten Ende des Oligonukleotids in der Nähe der leitfähigen Oberfläche. Die Fähigkeit als Elektron-Donor oder -Akzeptor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül als Elektron-Donor wirkt, kann gegenüber diesem Molekül unter abweichenden experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül unter gleichen oder abweichenden experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Akzeptor wirken.
Elekron-Akzeptor: Der Begriff Elektron-Akzeptor bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. einer chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit. Bei einem Elektron-Akzeptor handelt es sich um ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron von einem Elektron- Donor aufnehmen kann. Ein solcher äußerer Umstand ist z. B. die Lichtabsorption durch den Elektron-Donor oder -Akzeptor einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenfänge gibt der Efektron-Donor "D" an den/einen der Elektron-Akzeptor "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺ made of oxidized donor and reduced acceptor. Another such external circumstance can e.g. B. the oxidation or reduction of the electron donor or acceptor of the chemically inducible redox-active unit by an external oxidizing or reducing agent, so z. B. the transfer of an electron to the electron donor by a reducing agent or the release of an electron by the electron acceptor to an oxidizing agent. These oxidizing or reducing agents can both be external redox-active substances, ie they are not covalently linked to the redox-active unit, the nucleic acid oligomer or the conductive surface, but are associated with these, e.g. B. on the modified conductive surface added solution, in contact or they are covalently linked to the nucleic acid oligomer, the oxidizing or reducing agent being covalently linked at one point in the nucleic acid oligomer, the at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases are removed from the covalent attachment site of the redox-active unit, preferably at the end of the oligonucleotide opposite the modification with the redox-active unit in the vicinity of the conductive surface. The ability to act as an electron donor or acceptor is relative, ie a molecule which acts as an electron donor immediately or after the action of certain external circumstances can act against this molecule under different experimental conditions or against a third molecule same or different experimental conditions also act as an electron acceptor.
Electron acceptor: In the context of the present invention, the term electron acceptor denotes a component of a photo-inducible redox-active unit or a chemically inducible redox-active unit. An electron acceptor is a molecule that can accept an electron from an electron donor immediately or after exposure to certain external circumstances. Such an external circumstance is e.g. B. the light absorption by the electron donor or acceptor of a photo-inducible redox-active unit. By irradiating light of certain or any wavelengths, the efonron donor "D" releases an electron to the one or the electron acceptor "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ^{+ is formed}

A^- A ^-

aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Ein weiterer solcher äußerer Umstand kann z. B. die Oxidation oder Reduktion des Elektron-Donors oder -Akzeptors der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit durch ein externes Oxidations- oder Reduktionsmittel sein, also z. B. die Übertragung eines Elektrons auf den Elektron-Donor durch ein Reduktionsmittel bzw. die Abgabe eines Elektrons durch den Elektron-Akzeptor an ein Oxidationsmittel sein. Diese Oxidations- bzw. Reduktionsmittel können sowohl externe redoxaktive Substanzen sein, d. h. sie sind nicht kovalent mit der redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäüre-Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbunden, stehen aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt oder sie sind kovalent mit dem Nukleinsäure- Oligomer verbunden, wobei das Oxidations- bzw. Reduktionsmittel an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers kovalent angebunden ist, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der, photoinduzierbar redoxaktiven Einheit entfernt ist, bevorzugt an dem der Modifikation mit redoxaktiver Einheit entgegengesetzten Ende des Oligonukleotids in der Nähe der leitfähigen Oberfläche. Die Fähigkeit als Elektron- Akzeptor oder -Donor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül, das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül als Elektron-Akzeptor wirkt, kann gegenüber diesem Molekül unter abweichenden experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül unter gleichen oder abweichenden experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Donor wirken.
Elektron-Donor-Molekül: entspricht einem Elektron-Donor.
Elekron-Akzeptor-Molekül: entspricht einem Elektron-Akzeptor.
Oxidationsmittel: chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron- Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) oxidiert. Ein Oxidationsmittel sich analog zu einem Elektron-Akzeptor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Akzeptor verwendet. Nicht unmittelbar bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das Oxidationsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder daß das Oxidationsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der (photoinduzierbar) redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Oxidationsmittel darstellen.
Reduktionsmittel: chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemischen Substanz, Elektron- Donor, Elektron-Akzeptor) reduziert. Ein Reduktionsmittel verhält sich analog zu einem Elektron-Donor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. zur chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron- Donor verwendet. Nicht unmittelbar bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das Reduktionsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure- Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder daß das Reduktionsmittel kovalent an das Nukleinsäure- Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der edoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Reduktionsmittel darstellen.
photoinduzierbar: photoinduzierbar bedeutet, daß eine gewisse Eigenschaft erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. So entfaltet z. B. eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, unter bestimmten äußeren Umständen innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit eine Ladungstrennung durchzuführen, also z. B. den Zustand D⁺ made of oxidized donor and reduced acceptor. Another such external circumstance can e.g. B. the oxidation or reduction of the electron donor or acceptor of the chemically inducible redox-active unit by an external oxidizing or reducing agent, so z. B. the transfer of an electron to the electron donor by a reducing agent or the release of an electron by the electron acceptor to an oxidizing agent. These oxidizing or reducing agents can be both external redox-active substances, ie they are not covalently linked to the redox-active unit, the nucleic acid oligomer or the conductive surface, but are associated with these, e.g. B. on the modified conductive surface added solution, in contact or they are covalently linked to the nucleic acid oligomer, the oxidizing or reducing agent being covalently linked at one point in the nucleic acid oligomer, the at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases are removed from the covalent attachment point of the photoinducible redox-active unit, preferably at the end of the oligonucleotide opposite the modification with the redox-active unit in the vicinity of the conductive surface. The ability to act as an electron acceptor or donor is relative, ie a molecule which acts as an electron acceptor immediately after or after the action of certain external circumstances can act against this molecule under different experimental conditions or against a third molecule same or different experimental conditions also act as an electron donor.
Electron donor molecule: corresponds to an electron donor.
Electron acceptor molecule: corresponds to an electron acceptor.
Oxidizing agent: chemical compound (chemical substance) that, by taking up electrons from another chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor), oxidizes this other chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor). An oxidizing agent is analogous to an electron acceptor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron acceptor that does not directly belong to the photoinducible redox-active unit or chemically inducible redox-active unit. In this context, not directly means that the oxidizing agent is either a free redox-active substance that is not bound to the nucleic acid oligomer but is in contact with it, or that the oxidizing agent is covalently bound to the nucleic acid oligomer, but at one point of the nucleic acid oligomer, which is at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases from the covalent attachment point of the (photo-inducible) redox-active unit. In particular, the electrode can be the oxidizing agent.
Reducing agent: chemical compound (chemical substance) that, by donating electrons to another chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor), reduces this other chemical compound (chemical substance, electron donor, electron acceptor). A reducing agent behaves analogously to an electron donor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron donor that does not directly belong to the photoinducible redox-active unit or to the chemically inducible redox-active unit. In this context, not directly means that the reducing agent is either a free redox-active substance that is not bound to the nucleic acid oligomer but is in contact with it, or that the reducing agent is covalently linked to the nucleic acid oligomer, but at one point of the nucleic acid oligomer which is at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases from the covalent attachment site of the edox-active unit. In particular, the electrode can represent the reducing agent.
Photo-inducible: Photo-inducible means that a certain property is only developed by irradiation with light of a certain or any wavelength. So unfolds z. B. a photo-inducible redox-active unit its redox activity, that is, its property to carry out a charge separation under certain external circumstances within the photo-inducible redox-active unit, B. the state D ⁺

A^- A ^-

auszubilden, und an ein anderes geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem anderen geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge. Ein weiteres Beispiel ist die photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine Gruppe, die erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv wird.
redoxaktiv: redoxaktiv bezeichnet die Eigenschaft einer redoxaktiven Einheit unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen bzw. die Eigenschaft einer redoxaktiven Substanz unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen.
freie, redoxaktive Substanz: freies, nicht kovalent mit der redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure-Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbundes, aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt stehendes Oxidations- oder Reduktionsmittel, wobei die freie redoxaktive Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den oxidierten Donor (bzw. den reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktive Einheit re-reduzieren. (bzw. re-oxidieren) kann bzw. daß die freie, redoxaktive Substanz den Donor (bzw. den Akzeptor) der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit reduzieren (bzw. oxidieren) kann.
photoinduzierbar redoxaktive Einheit: Oberbegriff für eine Einheit, die ein oder mehrere Elektron- Donor-Moleküle und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor- Moleküle enthält, wobei dieses (diese) Elektron-Donor- Molekül(e) und/oder dieses (diese) Elektron-Akzeptor- Molekül(e) in ein oder mehrere Makromoleküle eingebettet sein können. Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) können untereinander durch eine oder mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff-Brücken- Bindungen, van-der-Waals-Brücken, durch π-π- Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander verbunden sein, wobei kovalente Verbindungen direkte oder indirekte (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure-Oligomer) Verbindungen sein können. Daneben können die Elektron-Donor(en) und/oder Elektron- Akzeptor(en), falls sie in ein oder mehrere Makromolekül(e) eingebettet sind, mit dem (den) Makromolekül(en) durch kovalente Anbindung an das (die) Makromolekül(e), durch Einkapseln in passende molekulare Kavitäten (Bindungstaschen) des Makromoleküls (der Makromoleküle), durch ionische Bindungen, Wasserstoff-Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation zwischen dem(n) Makromolekül(en) und dem(n) Elektron-Donor-Molekül(en) und/oder dem(n) Elektron- Akzeptor-Molekül(en) verbunden sein. Sind mehrere Makromoleküle Bestandteil der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit kann die Bindung der Makromoleküle untereinander ebenfalls kovalent, ionisch, durch Wasserstoff-Brücken- Bindungen, van-der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation erfolgen. Wesentliche Merkmale der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit sind neben der Zusammensetzung aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) und Makromo)ekül(en): (i) die Einheit ist in den erfindungsrelevanten Erscheinungsformen (Elektron- Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) im ursprünglichen bzw. oxidierten oder reduzierten Zustand) stabil und dissozüert nicht in ihre Bestandteile, (ii) die Einheit enthält keine Nukleinsäure, (iii) die Zusammensetzung der Einheit aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) und Makromolekül(en) kann - unabhängig von der Bindung zwischen den Bestandteilen - vom Fachmann erkannt werden, da sie prinzipiell auch als Einzelmoleküle vorkommen können und (iv) Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wirken unter gleichen oder ähnlichen äußeren Umständen in Form von Einzelmolekülen in Lösung als Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en), d. h. auch bei freien gelösten Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) kann unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände, entsprechend den Umständen die innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit zu einem Elektrontransfer führen, ein Elektron vom (von den) gelösten Elektron-Donor(en) auf den (die) gelösten Elektron-Akzeptor(en) übertragen werden. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym oder jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elekton-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplex sein. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der/ein Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺ form, and to give electrons to another suitable oxidizing agent or to take up electrons from another suitable reducing agent, only by irradiating light of a certain or any wavelength. Another example is the photo-inducible reactive group, ie a group that only becomes reactive when light of a certain or any wavelength is irradiated.
redoxaktiv: redoxaktiv describes the property of a redoxactive unit under certain external circumstances to donate electrons to a suitable oxidizing agent or to take up electrons from a suitable reducing agent or the property of a redoxactive substance to release electrons under certain external circumstances to a suitable electron acceptor or from a suitable electron -Donor to take up electrons.
free, redox-active substance: free, not covalently bonded to the redox-active unit, the nucleic acid oligomer or the conductive surface, but with these, e.g. B. on the modified conductive surface added solution, contacting oxidizing or reducing agent, the free redox active substance z. B. can be an uncharged molecule, any salt or a redox-active protein or enzyme (Oxydoreductase). The free redox-active substance is characterized in that it re-reduces the oxidized donor (or the reduced acceptor) of the photo-inducible redox-active unit. (or re-oxidize) or that the free, redox-active substance can reduce (or oxidize) the donor (or acceptor) of the chemically inducible redox-active unit.
photo-inducible redox-active unit: generic term for a unit that contains one or more electron-donor molecules and one or more electron-acceptor molecules, this electron donor molecule (s) and / or this electron -Acceptor- Molecule (s) can be embedded in one or more macromolecules. Electron donor (s) and electron acceptor (s) can be linked to one another by one or more covalent or ionic bonds, by hydrogen bonds, by van der Waals bridges, by π-π interaction or by coordination by means of an electron pair -Donation and -Acceptation can be connected to one another, where covalent compounds can be direct or indirect (eg via a spacer, but not via a nucleic acid oligomer) compounds. In addition, if the electron donor (s) and / or electron acceptor (s) are embedded in one or more macromolecule (s), they can be linked to the macromolecule (s) by covalent attachment to the macromolecule (s) (e), by encapsulation in suitable molecular cavities (binding pockets) of the macromolecule (the macromolecules), by ionic bonds, hydrogen bridge bonds, van der Waals bridges, π-π interaction or by coordination by means of electron pair donation and acceptance between the macromolecule (s) and the electron donor molecule (s) and / or the electron acceptor molecule (s). If several macromolecules are part of the photo-inducible redox-active unit, the macromolecules can also be bound to one another covalently, ionically, by hydrogen bonds, van der Waals bridges, π-π interaction or by coordination by means of electron pair donation and acceptance . In addition to the composition of electron donor (s) and electron acceptor (s) or of electron donor (s) and electron acceptor (s) and macromo) ekül (s), essential features of the photo-inducible redox-active unit are: (i) the unit is stable in the aspects relevant to the invention (electron donor (s) and electron acceptor (s) in the original or oxidized or reduced state) and does not dissociate into its components, (ii) the unit contains no nucleic acid, (iii) the composition of the unit from electron donor (s) and electron acceptor (s) or from electron donor (s) and electron acceptor (s) and macromolecule (s) can - regardless of the bond between the components - by a person skilled in the art are recognized, since in principle they can also exist as single molecules and (iv) electron donor (s) and electron acceptor (s) of the photoinducible redox-active unit act in the form of single molecules in the same or similar external circumstances Solution as electron donor (s) and electron acceptor (s), ie even with free dissolved electron donor (s) and electron acceptor (s) can take place immediately or after exposure to certain external circumstances, depending on the circumstances within the photoinducible redox-active unit lead to an electron transfer, an electron is transferred from the dissolved electron donor (s) to the dissolved electron acceptor (s). The photo-inducible redox-active unit can e.g. B. any photo-inducible redox-active protein / enzyme or any photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex. By irradiating light of a certain or any wavelength, the electron donor emits an electron to one of the electron acceptors and, at least temporarily, a charge-separated state D ^{+ is formed}

A^- A ^-

aus einem oxidierten Donor und einem reduzierten Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, an einen geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst im ladungsgetrennten Zustand, da das Reduktionsmittel (bzw. Oxidationsmittel) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen überträgt (bzw. aufnimmt), z. B. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺ from an oxidized donor and a reduced acceptor. This process within the photo-inducible redox-active unit is called photo-induced charge separation. If the external circumstances are selected accordingly, the photoinducible redox-active unit only develops its redox activity, i.e. its property of donating electrons to a suitable oxidizing agent or taking up electrons from a suitable reducing agent, only in the charge-separated state, since the reducing agent (or oxidizing agent) only acts on the oxidized donor ( or from the reduced acceptor) of the photo-inducible redox-active unit transmits (or receives) electrons, e.g. B. in the presence of a reducing agent, the D ⁺

, jedoch nicht D, reduzieren kann (bzw. in Gegenwart eines Oxidationsmittels das A^- , but not D, can reduce (or in the presence of an oxidizing agent the A ^-

, jedoch nicht A, oxidieren kann). Insbesondere kann dieses Oxidations- bzw. Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^- , but not A, can oxidize). In particular, this oxidizing or reducing agent can also be an electrode, the photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up) an electron from an electrode only after the photo-induced charge separation, for. B. if the electrode is set to a potential at which A ^-

, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺ , but not A, oxidized (or D ⁺

, jedoch nicht D, reduziert) wird.
chemisch induzierbar redoxaktive Einheit: entspricht in Zusammensetzung und Funktionsweise einer photoinduzierbar redoxaktive Einheit, wobei aber im Unterschied zur Funktionsweise einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Photoaktivierung als äußerer Umstand zur Entfaltung der Redoxaktivität der redoxaktive Einheit ausgeschlossen ist. Die redoxaktive Einheit kann also z. B. jedes beliebige redoxaktive Protein/Enzym oder jeder beliebige redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elektron-Donor-/Elektron- Akzeptor-Komplex sein. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, z. B. an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Reduktionsmittel auf den/einen Elektron-Donor "D", der nur im reduzierten Zustand "D^- , but not D, is reduced).
Chemically inducible redox-active unit: corresponds in composition and mode of operation to a photo-inducible redox-active unit, but in contrast to the mode of operation of a photo-inducible redox-active unit, photo-activation is excluded as an external factor for the development of the redox activity of the redox-active unit. The redox-active unit can, for. B. any redox-active protein / enzyme or any redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex. If the external circumstances are chosen accordingly, the redox-active unit develops its redox activity, that is, its property, e.g. B. to donate electrons to a suitable oxidizing agent only after transfer of an electron from a reducing agent to an electron donor "D", which is only in the reduced state "D ^-

"ein Elektron auf den Akzeptor "A" übertragen kann und das Oxidationsmittel nur von diesem reduzierten Akzeptor "A^- "can transfer an electron to acceptor" A "and the oxidizing agent can only transfer from this reduced acceptor" A ^-

" der redoxaktiven Einheit Elektronen aufnimmt, also in Gegenwart eines Oxidationsmittels, das A^- Receives "the redox-active moiety electron, ie in the presence of an oxidizing agent, the A ^-

, jedoch nicht A, oxidieren kann (sukzessive Ladungsübertragung). Insbesondere kann dieses Oxidationsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^- , but not A, can oxidize (successive charge transfer). In particular, this oxidizing agent can also be an electrode, e.g. B. if the electrode is set to a potential at which A ^-

, jedoch nicht A, oxidiert wird. Umgekehrt kann bei abweichend gewählten äußeren Umständen die redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also z. B. ihre Eigenschaft von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Elektron-Akzeptor "A" auf ein Oxidationsmittel entfalten, wenn nur der oxidierte Akzeptor "A⁺ , but not A, is oxidized. Conversely, if the external circumstances are chosen differently, the redox-active unit can display its redox activity, e.g. B. their property of accepting electrons from a suitable reducing agent only unfold after transfer of an electron from an electron acceptor "A" to an oxidizing agent, if only the oxidized acceptor "A ⁺

" ein Elektron vom Donor D aufnehmen kann und das Reduktionsmittel nur auf den oxidierten Donor "D⁺ "can accept an electron from donor D and the reducing agent only to the oxidized donor" D ⁺

" der redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen kann, z. B. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺ "the redox-active unit can transfer electrons, for example in the presence of a reducing agent, the D ⁺

, jedoch nicht D, reduziert kann (sukzessive Ladungsübertragung). Insbesondere kann dieses Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem D⁺ , but not D, can be reduced (successive charge transfer). In particular, this reducing agent can also be an electrode, e.g. B. when the electrode is set to a potential at which D ⁺

, jedoch nicht D, reduziert wird.
photoinduzierbar redoxaktives Protein/Enzym: besteht in der Regel aus sogenanntem Apoprotein, dem (den) bevorzugten Makromolekül(en) der vorliegenden Erfindung, und Cofaktoren, den Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die photoinduzierte Ladungstrennung innerhalb des photoaktivierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms wird durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. So sind zum Beispiel im photosynthetischen Reaktionszentrum (reaction center, RC) als Cofaktoren ein primärer Elektron- Donor P und mehrere verschiedene Elektron-Akzeptoren A, darunter auch Quinon-Cofaktor(en) Q, in eine Proteinmatrix eingebettet und bilden so eine "polymolekulare" Einheit (vgl. Struktur 1). Die Einbettung erfolgt in diesem Fall durch Einkapselung der Cofaktoren in passende Kavitäten, sogenannte Bindungstaschen der Proteinmatrix aus mehreren Protein-Untereinheiten. Sowohl die Protein-Untereinheiten als auch die Einkapselung der Cofaktoren in die Proteinmatrix ist im Fall einiger natürlich vorkommender RC durch nicht kovalente Bindungen realisiert. Bei Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge gibt der primäre Donor ein Elektron an einen der Elektron-Akzeptoren ab und es bildet sich, zumindest temporär, aus den anfänglich neutralen Cofaktoren ein ladungsgetrennter RC-Zustand P⁺ , but not D, is reduced.
Photo-inducible redox-active protein / enzyme: usually consists of so-called apoprotein, the preferred macromolecule (s) of the present invention, and cofactors, the electron donor (s) and electron acceptor (s) in the sense of the present invention. The photo-induced charge separation within the photo-activatable redox-active protein / enzyme is triggered by light of certain or any wavelength. In the photosynthetic reaction center (RC), for example, a primary electron donor P and several different electron acceptors A, including quinone cofactor (s) Q, are embedded as cofactors in a protein matrix and thus form a "polymolecular" Unity (see Structure 1). In this case, the embedding takes place by encapsulating the cofactors in suitable cavities, so-called binding pockets of the protein matrix from several protein subunits. In the case of some naturally occurring RCs, both the protein subunits and the encapsulation of the cofactors in the protein matrix are realized by non-covalent bonds. When the light is of a suitable wavelength, the primary donor releases an electron to one of the electron acceptors and, at least temporarily, a charge-separated RC state P ⁺ is formed from the initially neutral cofactors

A^- A ^-

, insbesondere auch der Zustand P⁺ , especially the state P ⁺

Q^- Q ^-

.
chemisch induzierbar redoxaktives Protein/Enzym:
entspricht in Zusammensetzung und Funktionsweise einem photoinduzierbar redoxaktiven Protein/Enzym, wobei aber im Unterschied zur Funktionsweise einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Photoaktivierung als äußerer Umstand zur Entfaltung der Redoxaktivität der redoxaktive Einheit ausgeschlossen ist; das chemisch induzierbar redoxaktive Protein/Enzym besteht in der Regel aus sogenanntem Apoprotein, dem (den) bevorzugten Makromolekül(en) der vorliegenden Erfindung, und Cofäktoren, den Elektron- Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die Eigenschaft des redoxaktiven Proteins/Enzyms zur sukzessiven Ladungsübertragung wird durch eine freie redoxaktive Substanz (Substrat) ausgelöst.
photoinduzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elekton-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex:
Verbindung aus einem oder mehreren Elektron-Donor Molekülen D1, D2, D3 etc. und mindestens einem oder mehreren geeigneten Elektron-Akzeptor Molekülen A1, A2, A3 etc., wobei die Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) untereinander durch eine oder mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff- Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken, durch π-π- Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander verbunden sind. Kovalente Verbindungen in diesem Sinne können direkte oder indirekte (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure-Oligomer) Verbindungen sein. Wesentliche Merkmale des photoinduzierbar redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor- /Elektron-Akzeptor-Komplexes sind neben der Zusammensetzung aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en): (i) der Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplex ist in den erfindungsrelevanten Erscheinungsformen (Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) im ursprünglichen bzw. oxidierten oder reduzierten Zustand) stabil und dissozüert nicht in seine Bestandteile, (ii) die Einheit enthält keine Nukleinsäure, (iii) die Zusammensetzung des wenigstens bimolekularen Elektron-Donor-/Elektron- Akzeptor-Komplexes aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) kann - unabhängig von der Bindung zwischen den Bestandteilen - vom Fachmann erkannt werden und (iv) Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) des photoinduzierbar redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex wirken unter gleichen oder ähnlichen äußeren Umständen auch in Form von Einzelmolekülen in Lösung als Elektron- Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en), d. h. auch bei freien gelösten Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) kann unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände, entsprechend den Umständen die innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit zu einem Elektrontransfer führen, ein Elektron vom (von den) gelösten Elektron-Donor(en) auf den (die) gelösten Elektron-Akzeptor(en) übertragen werden. Der photoinduzierbar redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex entspricht in seiner erfindungsrelevanten Funktionsweise einem photoinduzierbar redoxaktiven Protein/Enzym, d. h. auch hier kommt es durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge zur photoinduzierten Ladungstrennung und es wird, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺ .
chemically inducible redox-active protein / enzyme:
corresponds in composition and mode of operation to a photo-inducible redox-active protein / enzyme, but in contrast to the mode of operation of a photo-inducible redox-active unit, photo-activation is excluded as an external factor for the development of the redox activity of the redox-active unit; the chemically inducible redox-active protein / enzyme usually consists of so-called apoprotein, the preferred macromolecule (s) of the present invention, and cofactors, the electron donor (s) and electron acceptor (s) in the sense of the present invention . The property of the redox-active protein / enzyme for successive charge transfer is triggered by a free redox-active substance (substrate).
photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex:
Compound of one or more electron donor molecules D1, D2, D3 etc. and at least one or more suitable electron acceptor molecules A1, A2, A3 etc., the electron donor (s) and electron acceptor (s) among one another are connected to one another by one or more covalent or ionic bonds, by hydrogen bonds, van der Waals bridges, by π-π interaction or by coordination by means of electron pair donation and acceptance. In this sense, covalent compounds can be direct or indirect (eg via a spacer, but not via a nucleic acid oligomer) compounds. In addition to the composition of electron donor (s) and electron acceptor (s), essential features of the photo-inducible, redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex are: (i) the electron donor / electron The acceptor complex is stable in the manifestations relevant to the invention (electron donor (s) and electron acceptor (s) in the original or oxidized or reduced state) and does not dissociate into its components, (ii) the unit contains no nucleic acid, (iii ) the composition of the at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex of electron donor (s) and electron acceptor (s) can be recognized by the person skilled in the art, regardless of the bond between the constituents, and (iv) electron Donor (s) and electron acceptor (s) of the photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex act under the same or similar external circumstances also in the form of single molecules in solution as electron donor (s) and electron acceptor (s), ie even with free dissolved electron donor (s) and electron acceptor (s) can be used immediately or after exposure to certain external circumstances Under the circumstances that lead to an electron transfer within the photoinducible redox-active unit, an electron is transferred from the dissolved electron donor (s) to the dissolved electron acceptor (s). The photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex corresponds in its mode of operation relevant to the invention to a photo-inducible redox-active protein / enzyme, i.e. here, too, photo-induced charge separation occurs due to light radiation of a suitable wavelength and it occurs, at least temporarily charge separated state D ⁺

A^- A ^-

gebildet (wobei D für ein beliebiges D1, D2, D3 etc. und A für ein beliebiges A1, A2, A3 etc. steht). Im Ausdruck "photoinduzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex" steht der Begriff "wenigstens bimolekular" dafür, daß der Komplex aus wenigstens einem Elektron-Donor und wenigstens einem Elektron-Akzeptor aufgebaut ist, auch wenn der Donor mit dem Akzeptor direkt (oder indirekt über einen Spacer) kovalent verbunden ist.
chemisch induzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex:
entspricht in Zusammensetzung und Funktionsweise einem photoinduzierbar redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex, wobei aber im Unterschied zur Funktionsweise eines photoinduzierbar redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes Photoaktivierung als äußerer Umstand zur Entfaltung der Redoxaktivität der redoxaktiven Einheit ausgeschlossen ist. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, z. B. an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Reduktionsmittel auf den/einen Elektron-Donor "D", der nur im reduzierten Zustand "D" ein Elektron auf den Akzeptor "A" übertragen kann und das Oxidationsmittel nur von diesem reduzierten Akzeptor "A^- formed (where D stands for any D1, D2, D3 etc. and A stands for any A1, A2, A3 etc.). In the expression “photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex”, the term “at least bimolecular” means that the complex is composed of at least one electron donor and at least one electron acceptor, even if the donor is covalently linked to the acceptor directly (or indirectly via a spacer).
chemically inducible, redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex:
corresponds in composition and mode of operation to a photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex, but in contrast to the mode of operation of a photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex, photoactivation as the outside Circumstances to develop the redox activity of the redox-active unit is excluded. If the external circumstances are chosen accordingly, the redox-active unit develops its redox activity, that is, its property, e.g. B. to release electrons to a suitable oxidizing agent only after transfer of an electron from a reducing agent to the / an electron donor "D", which can only transfer an electron to the acceptor "A" in the reduced state "D" and only the oxidizing agent from this reduced acceptor "A ^-

" der redoxaktiven Einheit Elektronen aufnimmt, also in Gegenwart eines Oxidationsmittels das A^- "of the redox-active unit takes up electrons, i.e. in the presence of an oxidizing agent the A ^-

, jedoch nicht A, oxidiert wird. Umgekehrt kann bei abweichend gewählten äußeren Umständen die redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also z. B. ihre Eigenschaft von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Elektron- Akzeptor "A" auf ein Oxidationsmittel entfalten, wenn nur der oxidierte Akzeptor "A⁺ , but not A, is oxidized. Conversely, if the external circumstances are chosen differently, the redox-active unit can display its redox activity, e.g. B. their property of accepting electrons from a suitable reducing agent only unfold after transfer of an electron from an electron acceptor "A" to an oxidizing agent, if only the oxidized acceptor "A ⁺

, jedoch nicht D, reduzieren kann (sukzessive Ladungsübertragung). Insbesondere kann dieses Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem D⁺ , but not D, can reduce (successive charge transfer). In particular, this reducing agent can also be an electrode, e.g. B. when the electrode is set to a potential at which D ⁺

, jedoch nicht D, reduziert wird. Im Ausdruck "redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex" steht der Begriff "wenigstens bimolekular" dafür, daß der Komplex aus wenigstens einem Elektron-Donor und wenigstens einem Elektron-Akzeptor aufgebaut ist, auch wenn der Donor mit dem Akzeptor direkt (oder indirekt über einen Spacer) kovalent verbunden ist.
RC: Reaktionszentrum. Beispiel eines photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms. Bei dem Protein/Enzym handelt es sich um einen sogenannten Pigment/Protein- Komplex der aus Apoprotein mit mehreren Proteinuntereinheiten und mehreren Cofaktoren (im Beispiel RC sogenannte Pigmente) handelt. In solchen Pigment/Protein-Komplexen spielen sich die ersten Schritte der lichtgetriebenen Ladungstrennung der bakteriellen oder pflanzlichen Photosynthese ab. Das RC der Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides z. B. (vgl. Struktur 1) besteht aus drei Protein- Untereinheiten und acht Cofaktoren (Pigmenten). Die Cofaktoren, ein Bakteriochlorophyll-Dimer P, zwei Bakteriochlorophyll-Monomere B_A , but not D, is reduced. In the expression "redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex", the term "at least bimolecular" means that the complex is composed of at least one electron donor and at least one electron acceptor, even if the Donor is covalently connected to the acceptor directly (or indirectly via a spacer).
RC: reaction center. Example of a photo-inducible redox-active protein / enzyme. The protein / enzyme is a so-called pigment / protein complex which consists of apoprotein with several protein subunits and several cofactors (in the example RC so-called pigments). The first steps of light-driven charge separation in bacterial or plant photosynthesis take place in such pigment / protein complexes. The RC of photosynthetic bacteria of the strain Rhodobacter sphaeroides z. B. (see Structure 1) consists of three protein subunits and eight cofactors (pigments). The cofactors, a bacteriochlorophyll dimer P, two bacteriochlorophyll monomers B _A

und B_B and B _B

, zwei Bakteriopheophytin-Monomere H_A , two bacteriopheophytin monomers H _A

und H_B and H _B

und zwei Ubichinon-50 (UQ) Moleküle Q_A and two ubiquinone-50 (UQ) molecules Q _A

und Q_B and Q _B

, sind in den jeweiligen Protein-Bindungstaschen (also der P-, B_A , are in the respective protein binding pockets (i.e. the P, B _A

- etc. Bindungstasche) lokalisiert.
QA-Protein-Bindungstasche: Proteinbindungstasche bzw. Proteinumgebung, in der sich der Chinon-Cofaktor Q_A - etc. binding pocket) localized.
QA protein binding pocket: protein binding pocket or protein environment in which the quinone cofactor Q _A

befindet. In RC von z. B. Rhodobacter sphaeroides ist der Chinon-Cofaktor Q_A located. In RC from z. B. Rhodobacter sphaeroides is the quinone cofactor Q _A

ein Ubichinon-50 (vgl. Struktur 1).
Q_A an ubiquinone-50 (see structure 1).
Q _A

-Bindungstasche: Q_A -Binding pocket: Q _A

-Protein-Bindungstasche-Protein binding pocket

Chemical substances / group n

ZnBChl: Zn-Bakteriochlorophyll (Formel 11 mit M = Zn)
Q: allgemein für Chinon (engl. Quinone), im Beispiel 3 und den sich darauf beziehenden Textpassagen ist Q ein modifiziertes Anthrachinon oder Pyrrollochinolinochinon (PQQ).
UQ: Ubichinon-50, RC-Cofaktor und temporärer Elektron-Akzeptor z. B. im RC der Photosynthese betreibenden Bakterien aus z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodopseudomonas viridis.
(cyt c₂ ZnBChl: Zn bacteriochlorophyll (Formula 11 with M = Zn)
Q: general for quinone, in Example 3 and the related text passages, Q is a modified anthraquinone or pyrrolequinoline quinone (PQQ).
UQ: Ubiquinon-50, RC cofactor and temporary electron acceptor e.g. B. in the RC of photosynthetic bacteria from z. B. Rhodobacter sphaeroides or Rhodopseudomonas viridis.
(cyt c ₂

)²⁺ ) ²⁺

: reduzierte Form des Cytochrom c₂ : reduced form of the cytochrome c ₂

, ein frei bewegliches Häm-Protein, das in der bakteriellen Photosynthese in Rhodobacter sphaeroides den oxidierten primären Donor P⁺ , a free-moving heme protein that uses the oxidized primary donor P ⁺ in bacterial photosynthesis in Rhodobacter sphaeroides

zu P reduziert; Beispiel einer redoxaktiven Substanz.
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, entspricht: 4,5-Dihydro-4,5-dioxo- 1H-pyrrolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, 2,5-Dimethylhexyl oder Isopropyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH₂ reduced to P; Example of a redox active substance.
PQQ: pyrrolo-quinolino-quinone, corresponds to: 4,5-dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo- [2,3-f] -quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid)
EDTA: ethylenediamine tetraacetate (sodium salt)
sulfo-NHS: N-hydroxysulfosuccinimide
EDC: (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
HEPES: N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid]
Tris: tris (hydroxymethyl) aminomethane
Alkyl: The term "alkyl" denotes a saturated hydrocarbon group that is straight-chain or branched (e.g. ethyl, 2,5-dimethylhexyl or isopropyl etc.). When "alkyl" is used to refer to a linker or spacer, the term refers to a group with two available valences for covalent linkage (e.g. -CH ₂

CH₂ CH ₂

-, -CH₂ -, -CH ₂

C(CH₃ C (CH ₃

)₂ ) ₂

CH₂ CH ₂

C(CH₃ C (CH ₃

)₂ ) ₂

CH₂ CH ₂

- oder -CH₂ - or -CH ₂

CH₂ CH ₂

- etc.). Bevorzugte Alkylgruppen als Substituenten oder Seitenketten R sind solche der Kettenlänge 1-30 (längste durchgehende Kette von kovalent aneinander gebundenen Atomen). Bevorzugte Alkylgruppen als Linker oder Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den durch den Linker oder Spacer verbundenen Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Alkenyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N; C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C∼C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero- Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
(n × HS-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n × R-S-S-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum kann an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter n ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo: zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure- Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure- Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.- Etc.). Preferred alkyl groups as substituents or side chains R are those of chain length 1-30 (longest continuous chain of atoms covalently bonded to one another). Preferred alkyl groups as linkers or spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures connected by the linker or spacer, that is to say between the two molecules or between a surface atom, Surface molecule or a surface molecule group and another molecule.
Alkenyl: alkyl groups in which one or more of the CC single bonds are replaced by C = C double bonds.
Alkynyl: alkyl or alkenyl groups in which one or more of the CC single or C = C double bonds are replaced by C∼C triple bonds.
Heteroalkyl: alkyl groups in which one or more of the CH bonds or CC single bonds are formed by CN, C = N; CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds are replaced.
Hetero-alkenyl: alkenyl groups in which one or more CH bonds, CC single or C = C double bonds are replaced by CN, C = N, CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds.
Hetero-alkynyl: alkynyl groups in which one or more of the CH bonds, CC single, C = C double or C∼C triple bond by CN, C = N, CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds are replaced.
Linker: molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule. As a rule, linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partners. The reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength. Preferred linkers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, that is to say between the two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule , represents.
Spacer: Linker that is covalently linked via the reactive groups to one or both of the structures to be connected (see linker). Preferred spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
(n × HS spacer) oligo: nucleic acid oligomer to which n thiol functions are each connected via a spacer, the spacers each having a different chain length (shortest continuous connection between thiol function and nucleic acid oligomer), in particular any one Chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to it by modification and “n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
(n × RSS spacer) oligo: nucleic acid oligomer to which n disulfide functions are each connected via a spacer, any residue R saturating the disulfide function. The spacer for connecting the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between the disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be connected to various naturally on the nucleic acid Oligomeric reactive groups attached or attached to this by modification. The placeholder n is any integer, in particular a number between 1 and 20.
oligo-spacer-SS-spacer-oligo: two identical or different nucleic acid oligomers which are connected to one another via a disulfide bridge, the disulfide bridge being linked to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers having a different chain length ( have the shortest continuous connection between the disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14, and these spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to them by modification.

Modified surfaces / electrodes

Mica: Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH₂ Mica: muscovite platelets, carrier material for applying thin layers.
Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ss-oligo-Spacer-UQ(RC): Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem 12Bp Einzelstrang DNA Oligonukleotid (Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO- (CH₂ -ss-oligo-Spacer-UQ (RC): Gold film on mica with covalently applied monolayer of derivatized 12 bp single-strand DNA oligonucleotide (sequence: TAGTCGGAAGCA). The terminal phosphate group of the oligonucleotide is at the 3 'end with (HO- (CH ₂

)₂ ) ₂

-S)₂ -S) ₂

zum P-O-(CH₂ to PO- (CH ₂

)₂ ) ₂

-S-S-(CH₂ -SS- (CH ₂

)₂ ) ₂

-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Die endständige Base Thymin am 5'- Ende des Oligonukleotids ist am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH- CH₂ -OH esterified, the SS bond being cleaved homolytically and each causing an Au-SR bond. The terminal base thymine at the 5 'end of the oligonucleotide is at the C-5 carbon with -CH = CH-CO-NH-CH ₂

-CH₂ -CH ₂

-NH₂ -NH _2nd

modifiziert, wobei dieser Rest wiederum über seine freie Aminogruppe durch Amidbildung mit der Carbonsäuregruppe des modifizierten Ubichinon-50 verbunden ist. Anschließend wird das UQ mit dem restlichen RC rekonstituiert.
Au-S-(CH₂ modified, this residue is in turn connected via its free amino group by amide formation with the carboxylic acid group of the modified ubiquinone-50. The UQ is then reconstituted with the rest of the RC.
Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ds-oligo-Spacer UQ(RC): Au-S-(CH₂ -ds-oligo spacer UQ (RC): Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) hybridisiert mit dem zu ss- oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid.
Au-S-(CH₂ -ss-oligo-spacer-UQ (RC) hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss- oligo (sequence: TAGTCGGAAGCA).
Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ss-oligo-Spacer Q-ZnBChl: identisch zu Au-S-(CH₂ -ss-oligo-spacer Q-ZnBChl: identical to Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) mit der Ausnahme, daß, statt des über UQ angebundenen RCs, Q- ZnBChl als photoinduzierbar redoxaktive Einheit angebunden ist.
Au-S-(CH2)2-ds-oligo-Spacer-Q-ZnBChl: Au-S-(CH₂ -ss-oligo-Spacer-UQ (RC) with the exception that, instead of the RCs linked via UQ, Q-ZnBChl is linked as a photo-inducible redox-active unit.
Au-S- (CH2) 2-ds-oligo-spacer-Q-ZnBChl: Au-S- (CH ₂

)₂ ) ₂

-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl hybridisiert mit dem zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid.-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl hybridizes with the ss-oligo (sequence: TAGTCGGAAGCA) complementary Oligonucleotide.

Electrochemistry

E: Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
E_ox E: Electrode potential that is applied to the working electrode.
E _ox

: Potential beim Strom-Maximum der Oxidation einer reversiblen Elektrooxidation oder -reduktion.
i: Stromdichte (Strom pro cm² : Potential at the current maximum of the oxidation of a reversible electro-oxidation or reduction.
i: current density (current per cm ²

Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strorn/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsotierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder - reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.Electrode surface)
Cyclic voltametry: recording a current / voltage curve. The potential of a stationary working electrode is changed linearly as a function of time, starting from a potential at which no electrooxidation or reduction takes place up to a potential at which a dissolved or adsorbed species is oxidized or reduced (i.e. current flows). After passing through the oxidation or reduction process, which generates an initially increasing current in the current / voltage curve and a gradually decreasing current after reaching a maximum, the direction of the potential feed is reversed. The behavior of the products of electrooxidation or reduction is then recorded in the return.
Amperometry: recording a current / time curve. Here, the potential of a stationary working electrode z. B. is set by a potential jump to a potential at which the electro-oxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the flowing current is recorded as a function of time.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische Bindung einer redoxaktiven Einheit modifiziert ist. Die redoxaktive Einheit ist entweder eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit oder eine chemisch induzierbar redoxaktive Einheit. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann nach photoinduzierter Abgabe eines Elektrons an ein externes Oxidationsmittels, z. B. einer Elektrode, oder Aufnahme eines Elektrons von einem externen Reduktionsmittel, z. B. einer Elektrode, durch eine freie redoxaktive Substanz re reduziert bzw. reoxidiert, also in seinen ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden. Die chemisch induziert redoxaktive Einheit kann nach Abgabe eines Elektrons an ein externes Oxidationsmittels von einem externen Reduktionsmittel; z. B. einer Elektrode, reduziert oder nach Aufnahme eines Elektrons von einem externen Reduktionsmittel durch ein externes Oxidationsmittel, z. B. einer Elektrode, oxidiert werden.The present invention relates to a nucleic acid oligomer by chemical Binding of a redox-active unit is modified. The redox active unit is either a photo-inducible redox-active unit or a chemically inducible one redox-active unit. The photo-inducible redox-active unit can be photo-induced delivery of an electron to an external oxidant, e.g. B. an electrode, or picking up an electron from an external Reducing agents, e.g. B. an electrode, through a free redox-active substance reduced or reoxidized, i.e. returned to its original state become. The chemically induced redox-active unit can be released after a Electrons to an external oxidant from an external reductant; e.g. B. an electrode, reduced or after picking up an electron from one external reducing agent by an external oxidizing agent, e.g. B. an electrode, be oxidized.

Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich 'der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat- Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-) Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet. A nucleic acid oligomer is used in the context of the present invention Connection from at least two covalently linked nucleotides or from at least two covalently linked pyrimidine (e.g., cytosine, thymine or Uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine), preferably a DNA, RNA or PNA fragment used. In the present invention, the ' Term nucleic acid on any "backbone" of the covalently linked Pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analog backbone Structures such as B. a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a Phosphoramide backbone. Essential characteristic of a nucleic acid in the sense of The present invention is that they are naturally occurring cDNA or RNA can bind sequence-specifically. Alternative to the term "nucleic acid oligomer" the terms "(probe) oligonucleotide", "nucleic acid" or "oligomer" used.

Der Begriff "Elektron-Akzeptor" bzw. "Elektron-Akzeptor-Molekül" und der Begriff "Elektron-Donor" bzw. "Elektron-Donor-Molekül° bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Bestandteil einer redoxaktiven Einheit.The term "electron acceptor" or "electron acceptor molecule" and the term "Electron donor" or "electron donor molecule" referred to in the context of present invention a component of a redox-active unit.

Unter einer "redoxaktiven Einheit" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Einheit verstanden, die einen oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle und einen oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle enthält. Die Elektron-Donor-Molekül(e) und Elektron-Akzeptor-Molekül(e) dieser redoxaktiven Einheit können untereinander durch eine oder mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff- Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken, durch π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander verbunden sein, wobei kovalente Bindungen direkte oder indirekte (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure-Oligomer) Bindungen sein können. Außerdem können die Elektron-Donor-Molekül(e) und/oder Elektron-Akzeptor- Molekül(e) in ein oder mehrere Makromolekül(e) eingebunden sein, wobei diese Einbindung durch Einkapseln in passende molekulare Kavitäten (Bindungstaschen) des Makromoleküls (der Makromoleküle), durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation zwischen dem(n) Makromolekül(en) und dem(n) Elektron-Donor-Molekül(en) und/oder dem(n) Elektron-Akzeptor-Molekül(en) erfolgt. In diesem Fall bilden also die Makromolekül(e) und die Elektron-Donor- Molekül(e) und die Elektron-Akzeptor-Molekül(e) die redoxaktive Einheit. Sind mehrere Makromoleküle Bestandteil der redoxaktiven Einheit kann die Bindung der Makromoleküle untereinander ebenfalls kovalent, ionisch, durch Wasserstoff- Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken, π-π-Wechselwirkung oder durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation erfolgen.In the context of the present invention, a “redox-active unit” means each Unit understood that one or more electron donor molecules and one or contains several electron acceptor molecules. The electron donor molecule (s) and Electron acceptor molecule (s) of this redox-active unit can interact with one another through one or more covalent or ionic bonds, through hydrogen Bridge bonds, van der Waals bridges, by π-π interaction or by Coordination by means of electron pair donation and acceptance with each other be connected, covalent bonds being direct or indirect (e.g. via a Spacer, but not via a nucleic acid oligomer) bonds. In addition, the electron donor molecule (s) and / or electron acceptor Molecule (s) can be integrated into one or more macromolecule (s), these Integration by encapsulation in suitable molecular cavities (binding pockets) of the macromolecule (the macromolecules), through hydrogen bonds, van der Waals bridges, π-π interaction or by means of coordination Electron pair donation and acceptance between the macromolecule (s) and the electron donor molecule (s) and / or the electron acceptor molecule (s) he follows. In this case, the macromolecule (s) and the electron donor Molecule (s) and the electron acceptor molecule (s) the redox-active unit. are Several macromolecules can form part of the redox-active unit Macromolecules also covalently, ionically, by hydrogen Bridge bonds, van der Waals bridges, π-π interaction or through Coordination by means of electron pair donation and acceptance.

Die angesprochenen Donor- und Akzeptor-Moleküle bilden erfindungsgemäß Bestandteile einer redoxaktive Einheit, d. h. sie sind direkt oder über weitere Molekülteile aneinander gebunden. Einzige erfindungsgemäße Einschränkung der die Bestandteile der redoxaktiven Einheit verbindenden Moleküle oder Molekülteile ist der Ausschluß von Nukleinsäure-Oligomeren. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die redoxaktive Einheit als eine komplette Einheit an das Sonden-Oligonukleotid gebunden, wobei natürlich mehrere chemische Bindungen zwischen Oligonukleotid und der redoxaktiven Einheit ausgebildet werden können. Durch den Ausschluß von Nukleinsäure-Oligomeren als die die Bestandteile der redoxaktiven Einheit verbindenden, Moleküle oder Molekülteile soll verdeutlicht werden, daß nicht einzelne Teile der redoxaktiven Einheit an verschiedenen Stellen des Sonden- Oligonukleotids angebunden sind. Das Sonden-Oligonukleotid stellt also explizit nicht die Verbindung zwischen den Elektron-Donor-Molekül(en) oder -Molekülteil(en) und den Elektron-Akzeptor-Molekül(en) oder -Molekülteil(en) der redoxaktiven Einheit dar.The mentioned donor and acceptor molecules form according to the invention Components of a redox-active unit, d. H. they are direct or through others Molecular parts bound together. The only limitation of the invention the components of the redox-active unit connecting molecules or parts of molecules is the exclusion of nucleic acid oligomers. According to the present invention is the redox active unit as a complete unit to the probe oligonucleotide bound, with of course several chemical bonds between oligonucleotide and the redox-active unit can be trained. By excluding Nucleic acid oligomers as the components of the redox-active unit connecting molecules or parts of molecules should be made clear that not individual parts of the redox-active unit at different points on the probe Oligonucleotide are attached. The probe oligonucleotide is therefore explicit not the connection between the electron donor molecule (s) or molecular part (s) and the electron acceptor molecule (s) or part (s) of the redox-active Unity.

Die redoxaktive Einheit ist entweder eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit oder eine chemisch induzierbar redoxaktive Einheit.The redox-active unit is either a photo-inducible redox-active unit or a chemically inducible redox-active unit.

"Photoinduzierbar" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung; daß die Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor "D" an einen der Elektron-Akzeptoren "A" ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität erst im ladungsgetrennten Zustand, da das Reduktionsmittel (bzw. das Oxidationsmittel) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen kann (bzw. aufnehmen kann), z. B. in Gegenwart eines Oxidationsmittels, das A^-, jedoch nicht A, oxidieren kann (bzw. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduzieren kann)."Photoinducible" means in the context of the present invention; that the redox activity of the photo-inducible redox-active unit, that is to say its property, under certain external circumstances, to release electrons to a suitable oxidizing agent or to take up electrons from a suitable reducing agent, is only developed by irradiating light of a certain or any wavelength. By irradiating light of a certain or arbitrary wavelength, the electron donor "D" releases an electron to one of the electron acceptors "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- consisting of oxidized donor and reduced acceptor ^{- is} formed. This process within the photo-inducible redox-active unit is called photo-induced charge separation. If the external circumstances are selected accordingly, the photo-inducible redox-active unit only develops its redox activity in the charge-separated state, since the reducing agent (or the oxidizing agent) can only transfer electrons to the oxidized donor (or from the reduced acceptor) of the photo-inducible redox-active unit ), e.g. B. in the presence of an oxidizing agent that can oxidize A ^- but not A (or in the presence of a reducing agent that can reduce D ⁺ but not D).

Insbesondere kann das angesprochene Oxidations- bzw. Reduktionsmittel eine Elektrode sein, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an die Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^-, jedoch nicht A; oxidiert (bzw. D⁺ jedoch nicht D, reduziert) wird. Daneben kann das Oxidations- bzw. Reduktionsmittel eine freie, redoxaktive Substanz sein, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an die freie, redoxaktive Substanz abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die freie redoxaktive Substanz A^-, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert).In particular, the oxidizing or reducing agent mentioned can be an electrode, the photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up) an electron from the electrode only after the photo-induced charge separation, for. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- but not A; is oxidized (or D ⁺ but not D, reduced). In addition, the oxidizing or reducing agent can be a free, redox-active substance, wherein the photo-inducible redox-active unit can only release (or take up from) an electron to the free, redox-active substance after the photoinduced charge separation, for. B. if the free redox-active substance A ^- , but not A, oxidizes (or D ⁺ , but not D, reduces).

"Chemisch induzierbar" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die Redoxaktivität der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben (bzw. von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen), erst nach Reduktion (bzw. nach Oxidation) durch ein externes Reduktionsmittel (bzw. Oxidationsmittel) entfaltet wird. Die chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit entspricht in Zusammensetzung und Funktionsweise einer photoinduzierbar redoxaktive Einheit, wobei aber im Unterschied zur Funktionsweise einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Photoaktivierung als äußerer Umstand zur Entfaltung der Redoxaktivität der redoxaktive Einheit ausgeschlossen ist. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die chemisch induzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, z. B. an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Reduktionsmittel auf den/einen Elektron- Donor "D": Nur im reduzierten Zustand "D^-" kann der Elektron-Donor ein Elektron auf den Akzeptor. "A" übertragen und das Oxidationsmittel kann nur von diesem reduzierten Akzeptor "A^-" der redoxaktiven Einheit Elektronen aufnehmen, z. B. in Gegenwart eines Oxidationsmittels das A^-, jedoch nicht A, oxidieren kann (sukzessive Ladungsübertragung). Insbesondere kann das besagte Oxidationsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^-, jedoch nicht A, oxidiert wird. Umgekehrt kann - bei abweichend gewählten äußeren Umständen - die chemisch induzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also z. B. ihre Eigenschaft von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Elektron-Akzeptor "A" auf ein Oxidationsmittel entfalten: Nur im oxidierten Zustand "A⁺" kann der Elektron-Akzeptor ein Elektron vom Donor D aufnehmen und das Reduktionsmittel kann nur auf den oxidierten Donor "D⁺" der redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen, z. B. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduzieren kann (sukzessive Ladungsübertragung). Insbesondere kann das besagte Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem D⁺, jedoch nicht D, reduziert wird.In the context of the present invention, “chemically inducible” means that the redox activity of the chemically inducible redox-active unit, ie its property of releasing electrons to a suitable oxidizing agent under certain external circumstances (or taking up electrons from a suitable reducing agent), only after reduction (or after oxidation) is developed by an external reducing agent (or oxidizing agent). The composition and mode of operation of the chemically inducible redox-active unit corresponds to that of a photo-inducible redox-active unit, but in contrast to the mode of operation of a photo-inducible redox-active unit, photo-activation is excluded as an external factor for the development of the redox activity of the redox-active unit. If the external circumstances are chosen accordingly, the chemically inducible redox-active unit develops its redox activity, ie its property, e.g. B. to give electrons to a suitable oxidizing agent, only after transfer of an electron from a reducing agent to / an electron donor "D": Only in the reduced state "D ^- " can the electron donor transfer an electron to the acceptor. "A" transferred and the oxidizing agent can only accept electrons from this reduced acceptor "A ^- " of the redox-active unit, e.g. B. in the presence of an oxidizing agent that can oxidize A ^- but not A (successive charge transfer). In particular, said oxidizing agent can also be an electrode, e.g. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- , but not A, is oxidized. Conversely, if the external circumstances are chosen differently, the chemically inducible redox-active unit can have its redox activity, ie. B. their property of accepting electrons from a suitable reducing agent only develop after transfer of an electron from an electron acceptor "A" to an oxidizing agent: only in the oxidized state "A ⁺ " can the electron acceptor accept an electron from donor D and that Reducing agent can only transfer electrons to the oxidized donor "D ⁺ " of the redox-active unit, e.g. B. in the presence of a reducing agent that D ⁺ , but not D, can reduce (successive charge transfer). In particular, said reducing agent can also be an electrode, e.g. B. when the electrode is set to a potential at which D ⁺ , but not D, is reduced.

Wesentliche Merkmale der photoinduzierbar oder chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit sind neben der Zusammensetzung aus Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) und Makromolekül(en): (i) die Einheit ist in den erfindungsrelevanten Erscheinungsformen (Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) im ursprünglichen bzw. oxidierten oder reduzierten Zustand) stabil und dissoziiert nicht in ihre Bestandteile, (ii) die Einheit enthält keine Nukleinsäure, (iii) die Zusammensetzung der Einheit aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) oder aus Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) und Makromolekül(en) kann - unabhängig von der Bindung zwischen den Bestandteilen - vom Fachmann erkannt werden, da Elektron-Donor(en) und Akzeptor(en) prinzipiell auch als Einzelmoleküle vorkommen können und (iv) Elektron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) der redoxaktiven Einheit wirken unter gleichen oder ähnlichen äußeren Umständen wie in ihrer erfindungsrelevanten Erscheinung als Bestandteile der redoxaktiven Einheit auch in Form der Einzelmoleküle in Lösung als Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en), d. h. auch bei freien gelösten Elektron-Donor(en) und Elektron- Akzeptor(en) kann unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände, entsprechend den Umständen die innerhalb der redoxaktiven Einheit zu einem Elektrontransfer führen, ein Elektron vom (von den) gelösten Elektron-Donor(en) auf den (die) gelösten Elektron-Akzeptor(en) übertragen werden. Wie für die Elekron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit kann ein solcher äußerer Umstand für die freien, gelösten Elekron-Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) die Lichtabsorption durch den (die) freien, gelösten Elektron-Donor(en) oder - Akzeptor(en) sein, wobei der (ein) Elektron-Donor "D" an den (einen) Elektron- Akzeptor "A" ein Elektron abgibt und, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus einem freien, gelösten oxidierten Donor und einem freien gelösten, reduzierten Akzeptor gebildet wird. Ein weiterer solcher äußerer Umstand kann - wie für die Elekron-Donor(en) und Elektron Akzeptor(en) der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit - die Übertragung eines Elektrons auf den freien, gelösten Elektron-Donor durch ein Reduktionsmittel bzw. die Abgabe eines Elektrons durch den freien, gelösten Elektron-Akzeptor an ein Oxidationsmittel sein.In addition to the composition of electron donor (s) and electron acceptor (s) or of electron donor (s) and electron acceptor (s) and macromolecule (s), essential features of the photo-inducible or chemically inducible redox-active unit are: (i ) the unit is stable in the aspects relevant to the invention (electron donor (s) and electron acceptor (s) in the original or oxidized or reduced state) and does not dissociate into its components, (ii) the unit contains no nucleic acid, (iii ) the composition of the unit from electron donor (s) and electron acceptor (s) or from electron donor (s) and electron acceptor (s) and macromolecule (s) can - regardless of the bond between the components - from Those skilled in the art will be recognized, since electron donor (s) and acceptor (s) can in principle also occur as single molecules and (iv) electron donor (s) and electron acceptor (s) of the redox-active unit act under the same or similar external circumstances Changes as in their appearance relevant to the invention as components of the redox-active unit also in the form of the individual molecules in solution as electron donor (s) and electron acceptor (s), ie also with free dissolved electron donor (s) and electron acceptor (s) ) can transfer an electron from the dissolved electron donor (s) to the dissolved electron acceptor (s) immediately or after the action of certain external circumstances, depending on the circumstances that lead to an electron transfer within the redox-active unit become. As for the electron donor (s) and electron acceptor (s) of the photoinducible redox-active unit, such an external circumstance for the free, dissolved electron donor (s) and electron acceptor (s) can reduce the light absorption by the free, dissolved electron donor (s) or acceptor (s), the (one) electron donor "D" giving an electron to the (one) electron acceptor "A" and, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^{- is formed} from a free, dissolved oxidized donor and a free dissolved, reduced acceptor. Another such external circumstance can - as for the electron donor (s) and electron acceptor (s) of the chemically inducible redox-active unit - the transfer of an electron to the free, dissolved electron donor by a reducing agent or the release of an electron the free, dissolved electron acceptor to an oxidizing agent.

Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym oder jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex sein. Im Ausdruck "photoinduzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex" steht der Begriff "wenigstens bimolekular" dafür, daß der Komplex aus wenigstens einem Elektron- Donor und wenigstens einem Elektron-Akzeptor aufgebaut ist, auch wenn dieser Donor und dieser Akzeptor direkt (oder indirekt über einen Spacer) kovalent verbunden sind. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der/ein Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A^- aus einem oxidierten Donor und einem reduzierten Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, an einen geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten, Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen, erst im ladungsgetrennten Zustand, da das Reduktionsmittel (bzw. Oxidationsmittel) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen überträgt (bzw. aufnimmt), z. B. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺ jedoch nicht D, reduziert kann (bzw. in Gegenwart eines Oxidationsmittels das A^-, jedoch nicht A, oxidieren kann). Insbesondere kann dieses Oxidations- bzw. Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen) kann, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^-, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird.The photo-inducible redox-active unit can e.g. B. Any photo-inducible redox-active protein / enzyme or any photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex. In the expression “photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex”, the term “at least bimolecular” means that the complex is composed of at least one electron donor and at least one electron acceptor, even if this donor and this acceptor are directly (or indirectly via a spacer) covalently linked. By irradiation with light of a specific or any given wavelength is the / an electron donor to one of the electron acceptors an electron, and it is formed, at least temporarily, a charge-separated state D ⁺ A ^- of an oxidized donor and a reduced acceptor. This process within the photo-inducible redox-active unit is called photo-induced charge separation. If the external circumstances are selected accordingly, the photo-inducible redox-active unit only develops its redox activity, i.e. its property of donating electrons to a suitable oxidizing agent or taking up electrons from a suitable reducing agent, only in the charge-separated state, since the reducing agent (or oxidizing agent) only acts on the oxidized donor (or from the reduced acceptor) the photoinducible redox-active unit transfers (or receives) electrons, e.g. B. in the presence of a reducing agent which D ⁺ but not D, can be reduced (or in the presence of an oxidizing agent which can oxidize A ^- but not A). In particular, this oxidizing or reducing agent can also be an electrode, the photo-inducible redox-active unit being able to release (or take up) an electron from an electrode only after the photo-induced charge separation, for. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- , but not A, is oxidized (or D ⁺ , but not D, reduced).

Die chemisch induzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige chemisch induzierbar redoxaktive Protein/Enzym oder jeder beliebige chemisch induzierbar redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplex sein. Im Ausdruck "chemisch induzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex" steht der Begriff "wenigstens bimolekular" dafür, daß der Komplex aus wenigstens einem Elektron-Donor und wenigstens einem Elektron-Akzeptor aufgebaut ist, auch wenn dieser Donor und dieser Akzeptor direkt (oder indirekt über einen Spacer) kovalent verbunden sind. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die chemisch induzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben (bzw. von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen), erst nach Reduktion (bzw. nach Oxidation) durch ein externes Reduktionsmittel (bzw. Oxidationsmittel). Erst nach Übertragung eines Elektrons von einem Reduktionsmittel auf den/einen Elektron-Donor "D" kann der dann reduzierte Donor "D^-" ein Elektron auf den Akzeptor "A" übertragen und das Oxidationsmittel kann nur von diesem reduzierten Akzeptor "A^-" der redoxaktiven Einheit Elektronen aufnehmen. Insbesondere kann das angesprochene Oxidationsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A^-, jedoch nicht A, oxidiert wird. Umgekehrt kann - bei abweichend gewählten äußeren Umständen - der Elektron-Akzeptor der chemisch induzierbar redoxaktive Einheit erst nach Übertragung eines Elektrons vom Akzeptor "A" auf ein externes Oxidationsmittel in seinem dann oxidierten Zustand "A⁺" ein Elektron vom Donor D aufnehmen und das Reduktionsmittel nur auf den oxidierten Donor "D⁺" der redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen. Insbesondere kann das angesprochene Reduktionsmittel auch eine Elektrode sein, z. B. wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem D⁺, jedoch nicht D, reduziert wird. The chemically inducible redox-active unit can e.g. B. any chemically inducible redox-active protein / enzyme or any chemically inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex. In the expression "chemically inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex", the term "at least bimolecular" also means that the complex is composed of at least one electron donor and at least one electron acceptor if this donor and this acceptor are directly (or indirectly via a spacer) covalently linked. If the external circumstances are selected accordingly, the chemically inducible redox-active unit develops its redox activity, i.e. its property, under certain external circumstances, to release electrons (or to take up electrons from a suitable reducing agent) only after reduction (or after oxidation) by an external one Reducing agents (or oxidizing agents). Only after transfer of an electron from a reducing agent to the electron donor "D" can the then reduced donor "D ^- " transfer an electron to the acceptor "A" and the oxidizing agent can only transfer from this reduced acceptor "A ^- " redox-active unit take up electrons. In particular, the oxidant mentioned can also be an electrode, e.g. B. if the electrode is set to a potential at which A ^- , but not A, is oxidized. Conversely, if the external circumstances are different, the electron acceptor of the chemically inducible redox-active unit can only take up an electron from donor D and the reducing agent after transfer of an electron from acceptor "A" to an external oxidizing agent in its then oxidized state "A ⁺ " only transfer electrons to the oxidized donor "D ⁺ " of the redox-active unit. In particular, the mentioned reducing agent can also be an electrode, e.g. B. when the electrode is set to a potential at which D ⁺ , but not D, is reduced.

Mit dem Begriff "Oxidationsmittel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine chemische Verbindung (chemische Substanz) bezeichnet, die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemische Substanz, Elektron- Donor, Elektron-Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemischen Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) oxidiert. Das Oxidationsmittel verhält sich analog zu einem Elektron-Akzeptor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht zur redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Akzeptor verwendet. "Nicht unmittelbar" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das Oxidationsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt steht oder daß das Oxidationsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Oxidationsmittel darstellen.The term "oxidizing agent" is used in the context of the present invention chemical compound (chemical substance) called by absorption of Electrons from another chemical compound (chemical substance, electron Donor, electron acceptor) this other chemical compound (chemical substance, Electron donor, electron acceptor) oxidized. The oxidizing agent behaves analogously to an electron acceptor, but is used in the context of the present invention as a term for an external electron acceptor that does not belong to the redox-active unit used. In this context, "not immediately" means that the Oxidizer is either a free redox active substance that does not adhere to that Nucleic acid oligomer is bound, but is in contact with it or that the Oxidizing agent is covalently attached to the nucleic acid oligomer, however a site of the nucleic acid oligomer that connects at least two covalently Nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases is removed from the covalent attachment point of the redox-active unit. In particular the electrode can be the oxidizing agent.

Mit dem Begriff "Reduktionsmittel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine chemische Verbindung (chemische Substanz) bezeichnet, die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron- Donor, Elektron-Akzeptor) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz, Elektron-Donor, Elektron-Akzeptor) reduziert. Das Reduktionsmittel verhält sich analog zu einem Elektron-Donor, wird aber im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Begriff für einen externen, nicht unmittelbar zur redoxaktiven Einheit gehörigen Elektron-Donor verwendet. "Nicht unmittelbar" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das Reduktionsmittel entweder eine freie redoxaktive Substanz ist, die nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, aber mit diesem in Kontakt, steht oder daß das Reduktionsmittel kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebunden ist, jedoch an einer Stelle des Nukleinsäure-Oligomers, die mindestens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- oder Purin-Basen von der kovalenten Anbindungstelle der redoxaktiven Einheit entfernt ist. Insbesondere kann die Elektrode das Reduktionsmittel darstellen.The term "reducing agent" is used in the context of the present invention chemical compound (chemical substance) referred to by the release of Electrons to another chemical compound (chemical substance, electron Donor, electron acceptor) this other chemical compound (chemical substance, Electron donor, electron acceptor) reduced. The reducing agent behaves analogously to an electron donor, but is a term in the context of the present invention for an external electron donor that does not directly belong to the redox-active unit used. In this context, "not immediately" means that the Reductant is either a free redox active substance that does not adhere to that Nucleic acid oligomer is bound, but is in contact with it, or that the Reducing agent is covalently attached to the nucleic acid oligomer, however a site of the nucleic acid oligomer that connects at least two covalently Nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine or purine bases is removed from the covalent attachment point of the redox-active unit. In particular the electrode can represent the reducing agent.

Mit dem Begriff "freie redoxaktive Substanz" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein freies, nicht kovalent mit der redoxaktiven Einheit, dem Nukleinsäure- Oligomer oder der leitfähigen Oberfläche verbundenes, aber mit diesen, z. B. über die der modifizierten leitfähigen Oberfläche zugefügte Lösung, in Kontakt stehendes Oxidations- oder Reduktionsmittel bezeichnet, wobei die freie redoxaktive Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, ein beliebiges Salz oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den oxidierten Donor (bzw. den reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktive Einheit re-reduzieren (bzw. re-oxidieren) kann bzw. daß die freie, redoxaktive Substanz den Donor (bzw. den Akzeptor) der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit reduzieren (bzw. oxidieren) kann. Desweiteren ist die freie redoxaktive Substanz dadurch gekennzeichnet, daß sie bei einem Potential ϕ oxidierbar und reduzierbar ist, wobei ϕ der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧ - 2,0 V genügt. Das Potential bezieht sich hierbei auf das freie redoxaktive Molekül in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ - 1.7 V bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ - 1,2 V besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ - 0,7 V, in dem die redoxaktiven Substanzen der Anwendungsbeispiele oxidiert (bzw. reduziert) werden, ganz besonders bevorzugt ist.The term "free redox-active substance" is used in the context of the present Invention a free, non-covalent with the redox-active unit, the nucleic acid Oligomer or the conductive surface connected, but with these, e.g. B. about the solution added to the modified conductive surface, in contact Oxidizing or reducing agents referred to, the free redox active substance z. B. an uncharged molecule, any salt or a redox-active protein or Enzyme (Oxydoreductase) can be. The free redox-active substance is thereby characterized in that they are the oxidized donor (or the reduced acceptor) of the photo-inducible redox-active unit can be re-reduced (or re-oxidized) or that the free, redox-active substance is the donor (or the acceptor) of the chemically can reduce (or oxidize) an inducible redox-active unit. Furthermore is the free redox-active substance is characterized in that it is at a potential ϕ is oxidizable and reducible, where ϕ meets the condition 2.0 V ≧ ϕ ≧ - 2.0 V. The potential here relates to the free redox-active molecule in a suitable one Solvent, measured against normal hydrogen electrode. As part of the In the present invention, the potential range 1.7 V ≧ ϕ ≧ - 1.7 V is preferred, the Range 1.4 V ≧ ϕ ≧ - 1.2 V is particularly preferred and the range 0.9 V ≧ ϕ ≧ - 0.7 V, in which the redox-active substances of the application examples oxidize (or reduce) are particularly preferred.

Das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer ist direkt oder indirekt (über einen Spacer) an eine leitfähige Oberfläche gebunden. Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jede elektrisch leitfähige Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere metallische Oberflächen, Oberflächen aus Metallegierungen oder dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen, wobei sämtliche Halbleiter als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden können. Die leitfähige Oberfläche kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung alleine oder auf einem beliebigen Trägermaterial, wie z. B. Glas, aufgebracht vorliegen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Elektrode" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.The modified nucleic acid oligomer is direct or indirect (via a spacer) bound to a conductive surface. Under the term "conductive surface" any electrically conductive surface of any thickness is understood, in particular metallic surfaces, surfaces of metal alloys or doped or not doped semiconductor surfaces, all semiconductors as pure substances or can be used as mixtures. The conductive surface can Framework of the present invention alone or on any Backing material, such as. B. glass, applied. As part of the present Invention, the term "electrode" is used as an alternative to "conductive surface".

Unter dem Begriff "modifizierte leitfähige Oberfläche" wird eine leitfähige Oberfläche verstanden, die durch Anbindung eines mit einer redoxaktiven Einheit modifizierten Nukleinsäure-Oligomers modifiziert ist.The term "modified conductive surface" is a conductive surface understood that by connecting a modified with a redox-active unit Nucleic acid oligomers is modified.

Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die elektrochemische Detektion molekularer Strukturen, insbesondere die elektrochemische Detektion von DNA-/RNA-/PNA-Fragmenten in einer Probenlösung durch sequenzspezifische Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierung ermöglicht. Die Detektion der Hybridisierungsereignisse durch elektrische Signale ist eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer batteriebetriebenen Variante den Einsatz vor Ort.In another aspect, the present invention relates to a method that the electrochemical detection of molecular structures, in particular the electrochemical detection of DNA / RNA / PNA fragments in one Sample solution by sequence-specific nucleic acid-oligomer hybridization enables. The detection of hybridization events by electrical signals is a simple and inexpensive method and enables in one battery-operated variant use on site.

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein photoadressierbares Ausleseverfahren zur Detektion molekularer Strukturen zur Verfügung, unter anderem zur Detektion von Hybridisierungsereignissen auf einem Oligomer-Chip durch z. B. elektrische Signale. Erfindungsgemäß wird unter photoadressierbarem (Oligomer-Chip-) Ausleseverfahren ein Verfahren verstanden, bei dem die Detektion molekularer Strukturen auf ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site- Gruppe innerhalb des Gesamtsystems (des kompletten Oligomer-Chips) begrenzt wird, indem Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge zur Induktion der Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit räumlich auf diese Test- Site(-Gruppe) fokussiert (begrenzt) wird.In addition, the present invention provides a photo addressable Readout methods for the detection of molecular structures are available at other for the detection of hybridization events on an oligomer chip through z. B. electrical signals. According to the invention under photo-addressable (Oligomer chip) readout process understood a process in which the detection molecular structures on a particular test site or site Group within the overall system (the complete oligomer chip) limited is used by induction of light of any or any wavelength to induce the Redox activity of the photo-inducible redox-active unit spatially on this test Site (group) is focused (limited).

Binding of a redox-active unit to a nucleic acid oligomer

Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. einer chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer.The prerequisite for the method according to the invention is the binding of a photo-inducible redox-active unit or a chemically inducible redox-active Unit to a nucleic acid oligomer.

Als Beispiele einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit seien genannt:
Examples of a photo-inducible redox-active unit are:

a) the photosynthetic bacterial reaction center (RC), such as. B. the RC of Rhodobacter sphaeroides with the schematic structure 1, the RC of others photosynthetic bacteria, such as B. the reaction center of Rhodopseudomonas viridis or from Rhodobacter capsulatus, or a Reaction center of photosynthetic plants, such as. B that Photosystem 1 or Photosystem 2, as examples of a photo-inducible redox-active protein / enzyme.
b) Cyclophanes, i.e. bridged porphyrin-quinone systems, of the general Structure 2 as an example of a photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complex. The two Spacer-bridged, covalent compounds ("- Spacer -" in structure 2) between the electron acceptor (1,4-benzoquinone in structure 2) and the Electron donor (metallo-porphyrin in structure 2) can be placed anywhere of the electron donor and / or electron acceptor. In addition to the in Electron acceptors shown in structure 2 can also use flavins of the general type Formula 1, nicotinamide of general formula 2 or other quinones, e.g. B. those of the general formulas 3-8 or organic or inorganic electron Acceptors and besides the (metallo-) porphyrins of the general Formula 9 other electron donors, such as. B. (Metallo-) chlorophylls of the general Formula 10 or (metallo) bacteriochlorophylls of the general formula 11 or other organic or inorganic electron donors can be used. In addition, simply covalently (spacer) bridged electron Donor / electron acceptor complexes such. B. covalent compounds Substance according to formula 9 and one of the substances according to one of the formulas 1-8, covalent compounds of a substance according to formula 10 and one of the Substances according to one of the formulas 1-8 or covalent compounds one Substance according to formula 11 and one of the substances according to one of the formulas 1-8 as photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron Donor / electron acceptor complexes can be used.
c) photo-inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor complexes in which (one) the electron donor (s) and / or (one) the electron acceptor (s) is a charge transfer complex or Is transition metal complex. Examples of transition metal complexes are [Ru (bipy) 2 (py) (im)] 2+ , any other [Ru (II) (L1) (L2) (L3) (L4) (L5) (L6)] complexes , Cr (III), Fe (II), Os (II), or Co (II) complexes, where "bipy" for a bispyridyl ligand, "py" for a pyridyl ligand, "im" for represents an immidazole ligand and L1 to L3 represents any ligand and can also coordinate more or less than 6 ligands to a transition metal.

Beispiele einer chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit sind der Cytochrom-bc Komplex oder der Cytochrom c₂ Komplex der Photosynthese betreibenden Bakterien (Komplex aus Proteinmatrix und vier eingebetteten Fe-Porphyrin Cofaktoren als Elektron-Donoren und/oder Elektron-Akzeptoren) als Beispiele für ein chemisch induzierbar redoxaktives Protein/Enzym oder, wie unter (ii) und (iii) aufgelistet, geeignet zusammengesetzte Cyclophane bzw. analoge Verbindungen als Beispiele für einen chemisch induzierbar redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex.
Examples of a chemically inducible redox-active unit are the cytochrome-bc complex or the cytochrome c ₂ complex of the photosynthetic bacteria (complex of protein matrix and four embedded Fe-porphyrin cofactors as electron donors and / or electron acceptors) as examples of a chemically inducible one redox-active protein / enzyme or, as listed under (ii) and (iii), suitably composed cyclophanes or analogous compounds as examples of a chemically inducible redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex.

Struktur 1: Reaktionszentrum bestehend aus den Cofaktoren P (primärer. Donor, ein Bakteriochlorophyll Dimer), B_A und B_B (Bakteriochlorophyll Monomere), H_A und H_B (Bakteriopheophytine), Q_A und Q_B (Ubichinon-50) und den Proteinuntereinheiten L, M, und H (nicht gezeigt), die die Cofaktoren einhüllen.
Structure 1: reaction center consisting of the cofactors P (primary. Donor, a bacteriochlorophyll dimer), B _A and B _B (bacteriochlorophyll monomers), H _A and H _B (bacteriopheophytins), Q _A and Q _B (ubiquinone-50) and the Protein subunits L, M, and H (not shown) that envelop the cofactors.

Struktur 2: ein Cyclophan; M = z. B. 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R₁ bis R₈, oder Spacer sind unabhängig voneinander beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.
Structure 2: a cyclophane; M = z. B. 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc .; R ₁ to R ₈ , or spacers are, independently of one another, any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

R₁ bis R₈ sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.
R ₁ to R ₈ are independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R₁ bis R₁₂ sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten. M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc .; R ₁ to R ₁₂ are independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

Daneben zeichnet sich die redoxaktive Einheit erfindungsgemäß dadurch aus, daß besagte Einheit an ein ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenes Oxidationsmittel Elektronen abgibt bzw. von einen anderen ebenfalls kovalent an das Oligonukleotid angebundenen Reduktionsmittel Elektronen aufnimmt, wobei dieses Oxidations- oder Reduktionsmittel insbesondere eine elektrisch leitfähige Oberfläche (Elektrode) sein kann und die redoxaktive Einheit durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser Elektrode im elektrochemisch zugänglichen Potentialbereich der Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden kann.In addition, the redox-active unit is characterized according to the invention in that said unit to a likewise covalently to the nucleic acid oligomer attached oxidant releases electrons or from another Reducing agent electrons covalently attached to the oligonucleotide records, this oxidizing or reducing agent in particular a can be electrically conductive surface (electrode) and the redox-active unit by applying an external voltage to this electrode in the electrochemical accessible potential range of the electrode can be electrooxidized / reduced.

Die redoxaktive Substanz zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß sie die photoinduzierbar redoxaktive Einheit, nach deren Elektron-Abgabe an ein anderes, von der redoxaktiven Substanz verschiedenes, kovalent an das Oligonukleotid angebundenes Oxidationsmittel re-reduzieren kann (bzw. nach deren Elektron- Aufnahme von einem anderen, von der redoxaktiven Substanz verschiedenen, kovalent an das Oligonukleotid angebundenen Reduktionsmittel re-oxidieren kann). bzw. daß die freie, redoxaktive Substanz den Donor (bzw. den Akzeptor) der chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit reduzieren (bzw. oxidieren) kann. Erfindungsgemäß kann dazu jede redoxaktive Substanz verwendet werden, solange sie bei einem Potential ϕ, das der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧ - 2,0 V genügt, oxidierbar und reduzierbar ist und das Potential geeignet ist, besagte photoinduzierbar redoxaktive Einheit nach deren Elektron-Abgabe an ein anderes, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenes Oxidationsmittel zu re-reduzieren (bzw. nach deren Aufnahme eines Elektrons von einen anderen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäüre-Oligomer angebundenen Reduktionsmittel zu re-oxidieren) oder besagte chemisch induzierbar redoxaktive Einheit zu reduzieren bzw. zu oxidieren. Das Potential bezieht sich hierbei auf die freie, unmodifizierte, redoxaktive Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ - 1,7 V bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ - 1,2 V besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ - 0,7 V, in dem die redoxaktiven Substanzen des Anwendungsbeispiels oxidiert (und rereduziert) werden, ganz besonders bevorzugt ist. Geeignet sind, neben den üblichen organischen und anorganischen redoxaktiven Molekülen wie z. B. Hexacyanoferraten, Ferrocenen, Cobaltocenen und Chinonen, vor allem die Ascorbinsäure (oder das Na⁺ Salz davon), [Ru(NH₃)₆]²⁺, oder Cytochrom c₂ (cyt c₂)²⁺, ein frei bewegliches eisenhaltiges Protein, das den oxidierten primären Donor P⁺ in RC von Rhodobacter sphaeroides zu P reduziert und dabei selbst zu (cyt c₂)³⁺ oxidiert wird. The redox-active substance is characterized according to the invention in that it can re-reduce the photo-inducible redox-active unit, after its electron has been released to another oxidizing agent which is different from the redox-active substance and is covalently bound to the oligonucleotide (or after its electron uptake by another, different from the redox-active substance, covalently bound to the oligonucleotide re-oxidizing agent). or that the free, redox-active substance can reduce (or oxidize) the donor (or the acceptor) of the chemically inducible redox-active unit. According to the invention, any redox-active substance can be used for this as long as it is oxidizable and reducible at a potential ϕ which meets the condition 2.0 V ≧ ϕ ≧ - 2.0 V and the potential is suitable, said photo-inducible redox-active unit after its electron -Delivery to another, likewise covalently bound to the nucleic acid oligomer, to re-reduce (or, after picking up an electron from another, also covalently to the nucleic acid oligomer, re-oxidize) or said chemically inducible redox-active Reduce or oxidize unit. The potential here relates to the free, unmodified, redox-active substance in a suitable solvent, measured against a normal hydrogen electrode. In the context of the present invention, the potential range 1.7 V ≧ ϕ ≧ - 1.7 V is preferred, the range 1.4 V ≧ ϕ ≧ - 1.2 V being particularly preferred and the range 0.9 V ≧ ϕ ≧ 0.7 V, in which the redox-active substances of the application example are oxidized (and reduced), is very particularly preferred. Are suitable, in addition to the usual organic and inorganic redox-active molecules such. B. hexacyanoferrates, ferrocenes, cobaltocenes and quinones, especially ascorbic acid (or the Na ⁺ salt thereof), [Ru (NH ₃ ) ₆ ] ²⁺ , or cytochrome c ₂ (cyt c ₂ ) ²⁺ , a freely mobile ferrous Protein that reduces the oxidized primary donor P ⁺ in RC of Rhodobacter sphaeroides to P and is itself oxidized to (cyt c ₂ ) ³⁺ .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der photo- oder chemisch induzierbar redoxaktive, verknüpfte, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex dergestalt in ein oder mehrere Makromoleküle eingebettet, daß das Makromolekül als elektrisch isolierende Einhüllende des redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron- Donor/Elektron-Akzeptor-Komplexes wirkt, indem er die direkte Elektrooxidation/- reduktion des redoxaktiven, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron- Donor/Elektron-Akzeptor-Komplexes an der Elektrode, z. B. bei direktem Kontakt zwischen Elektrode und redoxaktivem, verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex, verhindert, die indirekte, über doppelsträngiges Nukleinsäure-Oligomer vermittelte Elektrooxidation/-reduktion des Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplexes aber erlaubt. Ein solchen Makromolekül kann z. B. ein maßgeschneidertes Cyclodextrin sein, das durch seine Form eines abgeschnittenen, innen hohlen Kegels ein Cyclophan oder ähnliche Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex ummantelt.In a preferred embodiment of the present invention, the photo- or chemically inducible redox-active, linked, at least bimolecular Electron-donor / electron-acceptor complex in one or more Macromolecules embedded that the macromolecule as an electrically insulating Envelope of the redox-active, linked, at least bimolecular electron Donor / electron acceptor complex works by direct electrooxidation / - Reduction of the redox-active, linked, at least bimolecular electron Donor / electron acceptor complex on the electrode, e.g. B. with direct contact between electrode and redox-active, linked, at least bimolecular Electron-donor / electron-acceptor complex, prevents indirect, via double-stranded nucleic acid oligomer mediated electrooxidation / reduction of Electron donor / electron acceptor complex, however, allowed. Such one Macromolecule can e.g. B. be a bespoke cyclodextrin by its Form of a truncated, internally hollow cone a cyclophane or similar Enclosed electron donor / electron acceptor complex.

Erfindungsgemäß wird eine redoxaktive Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäure-Oligomers mit der redoxaktiven Einheit oder Teilen davon (siehe auch Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung") gebunden. Diese Bindung kann auf vier verschiedene Arten durchgeführt werden:
According to the invention, a redox-active unit is covalently bound to a nucleic acid oligomer by the reaction of the nucleic acid oligomer with the redox-active unit or parts thereof (see also section “Ways of carrying out the invention”). This binding can be done in four different ways:

a) A reactive group for binding formation on the nucleic acid oligomer is a free phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group of the oligonucleotide backbone, in particular a group at one of the two ends of the oligonucleotide backbone, used. The free, terminal phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easily typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino groups or with acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or with acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary). Thio alcohols or with acid groups or the condensation of amine and aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. The coupling group (acid, amine, alcohol, thioalcohol or aldehyde function) required for the covalent attachment of the redox-active unit is either naturally present on the redox-active unit or is obtained by chemical modification of the redox-active unit. The redox-active unit can be connected completely or in parts of the unit with subsequent completion of the redox-active unit (see below).
b) The nucleic acid oligomer is modified via a covalently linked part of the molecule (spacer) of any composition and chain length (longest continuous chain of bonded atoms), in particular chain length 1 to 14, on the oligonucleotide backbone or on a base with a reactive group . The modification is preferably carried out at one of the ends of the oligonucleotide backbone or at a terminal base. As a spacer z. B. an alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent can be used. Possible simple reactions for the formation of the covalent bond between the redox-active unit and the nucleic acid oligomer modified in this way are as described under a), the amide formation from the acid and amino group, the ester formation from the acid and alcohol group, the thioester formation from the acid and thio alcohol group or the condensation of aldehyde and amine with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. The 63012 00070 552 001000280000000200012000285916290100040 0002019926457 00004 62893d connection of the redox-active unit can be done completely or in parts of the redox-active unit with subsequent completion of the unit (see below).
c) In the synthesis of the nucleic acid oligomer, a terminal base is replaced by the redox-active unit replaced. This connection of the redox-active unit can be complete or in parts of the unit with subsequent completion of the redox active Unit (see below).
d) When using a linked (at least bimolecular) electronic Donor / electron acceptor complex as a redox-active unit is the electron Acceptor (or donor) in a first covalent modification, as under b) or c) described in this section, at or instead of a terminal base at the Nucleic acid oligomer bound and then in a second covalent Modification of the electron donor (or acceptor) as under a) in this section described at the same end of the nucleic acid oligomer backbone to one reactive group of the backbone or to a reactive group of the acceptor (or of the donor). When using a covalently linked, tri or Higher molecular weight electron donor / electron acceptor complex can instead of Electron acceptor (or donor), also any part of the electron donor / Electron-acceptor complex used in the first covalent modification and be completed in a second or further covalent modification (s).

Erfindungsgemäß kann die Bindung der redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure- Oligomer ganz oder in Teilen vor oder nach der Bindung des Nukleinsäure- Oligomers an die leitfähige Oberfläche erfolgen. So. kann im Falle eines redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und Cofaktor(en) statt der kompletten redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein, das Apoprotein und ein Teil der Cofaktoren oder ein oder mehrere Cofaktoren angebunden sein und die redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden Teilen komplettiert. Bei der Verwendung eines verknüpften (wenigstens bimolekularen) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes als redoxaktiver Einheit wird der Elektron-Akzeptor (oder -Donor) in einer ersten kovalenten Modifikation, wie unter b) oder c) in diesem Abschnitt beschrieben, an oder statt einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden und anschließend in einer zweiten kovalenten Modifikation der Elektron-Donor (oder -Akzeptor), wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, am selben Ende des Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats an eine reaktive Gruppe des Rückgrats gebunden. Bei Verwendung eines kovalent verknüpften, tri- oder höhermolekularen Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplexes kann, statt des Elektron-Akzeptors (oder -Donors), auch ein beliebiger Teil des Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes in der ersten kovalenten Modifikation verwendet und in der zweiten kovalenten Modifikation komplettiert werden. Diese Modifikationen können vor oder nach der Bindung des Nukleinsäure- Oligomers an die leitfähige Oberfläche erfolgen.According to the invention, the binding of the redox-active unit to the nucleic acid Oligomer in whole or in part before or after the binding of the nucleic acid Oligomers are made to the conductive surface. So. in the case of a redox-active protein / enzyme from apoprotein and cofactor (s) instead of the complete one redox-active unit also only the apoprotein, the apoprotein and part of the Cofactors or one or more cofactors can be linked and the redox active Unity becomes by subsequent reconstitution with the missing parts completed. When using a linked (at least bimolecular) The electron-donor / electron-acceptor complex as the redox-active unit is the Electron acceptor (or donor) in a first covalent modification, as under b) or c) described in this section, on or instead of a terminal base on the Nucleic acid oligomer bound and then in a second covalent Modification of the electron donor (or acceptor) as under a) in this section described at the same end of the nucleic acid oligomer backbone to one reactive group of the backbone bound. When using a covalent linked, tri- or higher molecular weight electron donor / electron acceptor Complex can, instead of the electron acceptor (or donor), any one Part of the electron donor / electron acceptor complex in the first covalent Modification used and completed in the second covalent modification become. These modifications can be made before or after the binding of the nucleic acid Oligomers are made to the conductive surface.

Bei mehreren verschiedenen Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen (Test-Sites) auf einer gemeinsamen Oberfläche ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der redoxaktiven Einheit an die Nukleinsäure-Oligomere durch geeignete Wahl der reaktiven Gruppe an den freien Nukleinsäure-Oligomerenden der verschiedenen Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen, wenn die redoxaktive Einheit nach Immobilisierung des Nukleinsäure-Oligomers an der Oberfläche angebunden werden soll.With several different nucleic acid-oligomer combinations (test sites) a common surface, it is advantageous to connect the (covalent) redox-active unit to the nucleic acid oligomers by suitable choice of reactive group on the free nucleic acid oligomer ends of the different Unify test sites for the entire surface when the redox active Unit after immobilization of the nucleic acid oligomer on the surface to be connected.

Bei Verwendung von redoxaktiven Proteinen/Enzymen als redoxaktiver Einheit kann die kovalente Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe des Proteins erfolgen oder - in dem Falle, daß das redoxaktive Protein/Enzym aus Apoprotein und Cofaktor(en) besteht - an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte; reaktive Gruppe eines (beliebigen) Cofaktors. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die kovalente Anbindung an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe eines (beliebigen) Cofaktors des Proteins bevorzugt. Ohne an mechanistische Details gebunden sein zu wollen, ist bei mehreren Cofaktoren derjenige besonders bevorzugt, der Elektronen an ein externes, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenes Oxidationsmittel abgeben oder von einem externen, ebenfalls, kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Reduktionsmittel aufnehmen kann (siehe auch Abschnitt "Verfahren zur amperometrischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden").When using redox-active proteins / enzymes as a redox-active unit the covalent attachment of the nucleic acid oligomer to any reactive group naturally present or modified by modification of the protein or - in the event that the redox-active protein / enzyme Apoprotein and cofactor (s) exist - at any, naturally existing or modified ones; reactive group one (any) cofactor. In the context of the present invention, the is covalent Connection to any, naturally existing or through modification attached, reactive group of (any) cofactor of the protein preferred. Without wanting to be bound to mechanistic details, there are several Cofactors are particularly preferred for those that transfer electrons to an external also covalently bound to the nucleic acid oligomer give off or from an external, also, covalently to the nucleic acid oligomer tied up reducing agent (see also section "Process for amperometric detection of nucleic acid-oligomer hybrids ").

The conductive surface

Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird erfindungsgemäß jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan.According to the invention, the term “conductive surface” includes each carrier understood an electrically conductive surface of any thickness, in particular Surfaces made of platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, Carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum and manganese.

Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.In addition, any doped or undoped semiconductor surfaces can also be used any thickness can be used. All semiconductors can be used as Find pure substances or as mixtures. As not being restrictive Examples here are carbon, silicon, germanium, α-tin, Cu (I) and Ag (I) halides of any crystal structure called. Are suitable likewise all binary compounds of any composition and any structure from the elements of groups 14 and 16, the elements of Groups 13 and 15, as well as the elements of groups 15 and 16. In addition, ternary compounds of any composition and structure from the Elements of groups 11, 13 and 16 or elements of groups 12, 13 and 16 can be used. The names of the groups in the periodic table of the Elements refer to the 1985 IUPAC recommendation.

Binding of a nucleic acid oligomer to the conductive surface

Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:
According to the invention, a nucleic acid oligomer is linked directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a conductive surface of the type described above. This binding can be done in three different ways:

a) The surface is modified so that a reactive group of molecules is accessible. This can be done by direct derivatization of the surface molecules, e.g. B. done by wet chemical or electrochemical oxidation / reduction. So z. B. the surface of graphite electrodes can be provided by wet chemical oxidation with aldehyde or carboxylic acid groups. Electrochemically z. B. the possibility by reduction in the presence of aryl diazonium salts the corresponding (functionalized, that is provided with a reactive group) aryl radical or by oxidation in the presence of R'CO 2 H the (functionalized) R 'radical on the graphite Coupling the electrode surface. An example of the direct modification of semiconductor surfaces is the derivatization of silicon surfaces to reactive silanols, ie silicon substrates with Si-OR "groups on the surface, where R" and R 'represent any functionalized organic residue (e.g. Alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent). Alternatively, the entire surface can be modified by the covalent attachment of a reactive group of a bifunctional linker, so that a monomolecular layer of any molecule is formed on the surface which preferably contains a reactive group at the end. The term “bifunctional linker” is understood to mean any molecule of any chain length, in particular chain lengths 2-14, with two identical (homo-bifunctional) or two different (hetero-bifunctional) reactive molecule groups.
If several different test sites are to be formed on the surface by using the methodology of photolithography, then at least one of the reactive groups of the homo- or hetero-bifunctional linker is a photo-inducible reactive group, that is to say a group that becomes reactive only through light irradiation of a certain or any wavelength . This linker is applied in such a way that the photoactivatable reactive group is available on the surface after the covalent attachment of the linker. The nucleic acid oligomers are covalently attached to the surface modified in this way, whereby they themselves are modified with a reactive group via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14, preferably in the vicinity of one end of the nucleic acid oligomer. The reactive group of the oligonucleotide is a group which reacts directly (or indirectly) with the modified surface to form a covalent bond. In addition, a further reactive group can be bound to the nucleic acid oligomers in the vicinity of their second end, this reactive group, in turn, as described above, being attached directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14. Furthermore, as an alternative to this further reactive group, the redox-active unit (complete or components thereof) can be attached to this second end of the nucleic acid oligomer.
b) The nucleic acid oligomer that is applied to the conductive surface is, is via a covalently attached spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14, with one or more modified reactive groups, the reactive groups preferably in the Is located near one end of the nucleic acid oligomer. With the reactive groups are groups that react directly with the unmodified surface can. Examples include: (i) thiol (HS) or disulfide (S-S) derivatized Nucleic acid oligomers of the general formula (n × HS spacer) oligo, (n × R-S-S- Spacer) -oligo or oligo-spacer-S-S-spacer-oligo, with a gold surface react to form gold-sulfur bonds or (ii) amines that are attach to platinum or silicon surfaces by chemical or physical sorption. In addition, the nucleic acid oligomers can be close to their second end another reactive group may be bound, this reactive group again, as described above, directly or via a spacer Composition and chain length, in particular chain length 1-14, is connected. Furthermore, the photo-inducible redox-active unit (complete or components thereof) as an alternative to this further reactive group, on this be attached to the second end of the oligonucleotide. In particular nucleic acid Oligomers with multiple spacer-bridged thiol or disulfide bridges modified ((n × HS spacer) oligo or (n × R-S-S spacer) oligo) have the Advantage that such nucleic acid oligomers at a certain angle of attack against the conductive surface (angle between the surface normal and the Helix axis of a double-stranded helical nucleic acid oligomer or between the surface normal and the axis perpendicular to the base pairs of one double-stranded non-helical nucleic acid oligomers) are applied can, if the thiol or disulfide functions on the nucleic acid oligomer connecting spacer, viewed from one end of the nucleic acid, one have increasing or decreasing chain length.
c) The reactive group on the probe nucleic acid oligomer is the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups of the oligonucleotide backbone, in particular terminal groups. The phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easy to carry out typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino or acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary) thio alcohols or acid groups or the condensation of amine and Aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. In this case, the coupling group required for covalent attachment to the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group is part of the surface derivatization with a (monomolecular) layer of any molecular length, as under a) in described in this section, or the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group can react directly with the unmodified surface, as described under b) in this section. In addition, a further reactive group can be bound to the oligonucleotides in the vicinity of their second end, this reactive group, in turn, as described above, being attached directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14. Furthermore, the redox-active unit (complete or parts thereof); alternatively to this further reactive group, be attached to this second end of the nucleic acid oligomer.

Die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche kann vor oder nach der Anbindung der redoxaktive Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer erfolgen. Im Falle eines redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und Cofaktor(en) kann statt der kompletten redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein, das Apoprotein mit einem Teil der Cofaktoren oder ein oder mehrere der Cofaktor angebunden sein und die redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden Teilen komplettiert. Bei der Verwendung eines verknüpften (wenigstens bimolekularen) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes als redoxaktive Einheit kann der Elektron-Akzeptor (bzw. -Donor), wie unter b) oder c) im Abschnitt "Bindung einer redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben, an eine oder statt einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden sein und der Elektron-Donor (bzw. -Akzeptor) durch anschließende kovalente Anbindung an eine reaktive Gruppe des Elektron-Akzeptors (oder -Donors) angebunden werden oder, wie unter a) im Abschnitt "Bindung einer redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben, durch anschließende Anbindung an eine terminale reaktive Gruppe des Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats am selben Ende (siehe auch den Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung"). Alternativ kann die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Einheit erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten Nukleinsäure- Oligomers an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer bzw. nach der Anbindung von Teilen der redoxaktiven Einheit oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Einheit, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) in diesem Abschnitt beschrieben.The nucleic acid oligomer can be bound to the conductive surface before or after connecting the redox-active unit to the nucleic acid oligomer. In the case of a redox-active protein / enzyme composed of apoprotein and cofactor (s) instead of the complete redox-active unit, only the apoprotein, the apoprotein be connected to part of the cofactors or one or more of the cofactors and the redox-active unit is then reconstituted with the still missing parts completed. When using a linked (at least bimolecular) electron donor / electron acceptor complex as redox-active unit can the electron acceptor (or donor), as under b) or c) in section "Binding of a redox-active unit to a nucleic acid oligomer" one or instead of a terminal base may be bound to the nucleic acid oligomer and the electron donor (or acceptor) by subsequent covalent attachment attached to a reactive group of the electron acceptor (or donor) or, as under a) in the section "binding a redox-active unit to a Nucleic acid oligomer "described by subsequent connection to a terminal reactive group of the nucleic acid oligomer backbone at the same end (See also the section "Ways to Implement the Invention"). Alternatively, you can the binding of the nucleic acid oligomer to the conductive surface before or after Attaching the spacer provided with a reactive group to bind the redox-active unit. The binding of the already modified nucleic acid Oligomers to the conductive surface, i.e. H. the bond to the surface after the Connection of the redox-active unit to the nucleic acid oligomer or after Connection of parts of the redox-active unit or after connecting the with a reactive group provided spacers for binding the redox-active unit also as described under a) to c) in this section.

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang- Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen den einzelnen Nukleinsäure-Oligomeren ein genügend großer Abstand verbleibt, um zum einen den für eine Hybridisierung mit dem Target-Nukleinsäure-Oligomer nötigen Freiraum und zum anderen den für die Anbindung der redoxaktiven Einheit nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich insbesondere drei verschiedene Vorgehensweisen (und Kombinationen daraus) an:
When producing the test sites, when connecting the single-stranded nucleic acid oligomers to the surface, care must be taken to ensure that there is a sufficiently large distance between the individual nucleic acid oligomers, on the one hand, for the hybridization with the target nucleic acid To provide the oligomer with the necessary space and, on the other hand, the space required for the connection of the redox-active unit. There are three different approaches (and combinations thereof) in particular:

1. Production of a modified surface by connecting a hybridized Nucleic acid oligomers, i.e. a surface derivatization with hybridized Probe nucleic acid oligomer instead of single stranded probe oligonucleotide. The the nucleic acid-oligomer strand used for hybridization is unmodified (the Surface connection is carried out as under a) -c) in this section described). The hybridized nucleic acid oligomer is then Double strand thermally dehybridized, whereby one with single strand nucleic acid Oligomer modified surface with a larger distance between the probe Nucleic acid oligomers is produced.
2. Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded nucleic acid oligomers, whereby during the surface A suitable monofunctional linker is added to the derivatization the single-stranded or double-stranded nucleic acid oligomer also to the Surface is bound (the surface connection is carried out as under a) -c) described in this section). According to the monofunctional Linker a chain length that the chain length of the spacer between the surface and is identical to the nucleic acid oligomer or by a maximum of four chain atoms deviates. When using double-stranded nucleic acid oligomer for The nucleic acid-oligomer double strand after the surface derivatization joint connection of the double-stranded nucleic acid oligomer and the Linkers thermally dehybridized to the surface. By the simultaneous Linking a linker to the surface is also the distance between the single or double-stranded nucleic acid oligomers bound to the surface enlarged. In case of using double stranded nucleic acid oligomer this effect is further reinforced by the subsequent thermal dehybridization.
3. 3. Production of a modified surface by connecting a single strand or double-stranded oligonucleotide to which the redox-active unit is already attached is attached, the redox-active unit having a diameter of greater than 30 Å having. When using double-stranded oligonucleotide, the Double stranded oligonucleotide after attachment of the double stranded oligonucleotide thermally dehybridized to the surface.

Im Bezug auf die einzelnen Schritte zur "Bindung einer redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" als auch zur "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" sei darauf verwiesen, daß im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung" die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte, die zum selben Endergebnis führen, an einem Beispiel demonstriert sind (Fig. 2).With regard to the individual steps for "binding a redox-active unit to a nucleic acid oligomer" and for "binding an oligonucleotide to the conductive surface", reference should be made to the fact that in the section "Ways of Carrying Out the Invention" the various possible combinations of the individual steps which lead to the same end result are demonstrated using an example ( FIG. 2).

Method for the electrochemical detection of nucleic acid oligomer Hybrids

Vorteilhafterweise werden gemäß dem Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden mehrere Sonden-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz, idealerweise alle nötigen Kombinationen des Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer(DNA)-Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA zu detektieren bzw. um Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer leitfähigen Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann aber der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden- Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden- Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 8 bis 25 verwendet. Erfindungsgemäß wird oder ist an die Sonden-Nukleinsäure-Oligomere, wie nachfolgend beschrieben, eine redoxaktive Einheit gebunden.Advantageously, according to the method for electrochemical detection of nucleic acid-oligomer hybrids several probe-nucleic acid oligomers different sequence, ideally all necessary combinations of Nucleic acid oligomers, applied on an oligomer (DNA) chip, to the Sequence of any target nucleic acid oligomer or one to detect (fragmented) target DNA or to detect mutations in the target to be tracked down and demonstrated in a sequence-specific manner. For this, be on a conductive surface the surface atoms or molecules of a defined Area (of a test site) with DNA / RNA / PNA nucleic acid oligomers of known, but linked to any sequence as described above. In a most general However, the DNA chip can also be embodied with a single probe Oligonucleotide can be derivatized. As probe nucleic acid oligomers Nucleic acid oligomers (e.g. DNA, RNA or PNA fragments) of base length 3 to 50, preferably the length 5 to 30, particularly preferably the length 8 to 25 used. According to the invention, the probe nucleic acid oligomers are or are a redox-active unit as described below.

Die Modifikation der Sonden-Nukleinsäure-Oligomere mit einer redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Bestandteilen der redoxaktiven Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Sonden-Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte (Reaktionssequenzen), sind mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel einer über ein Sonden- Oligonukleotid an eine Elektrode gebundenen redoxaktiven Einheit im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung" demonstriert.The modification of the probe nucleic acid oligomers with a redox-active unit can take place completely or in parts of the redox-active unit either before or after the binding of the probe oligonucleotide to the conductive surface. The various possible combinations of the individual steps (reaction sequences) are demonstrated with the aid of FIG. 2 using the example of a redox-active unit bound to an electrode via a probe oligonucleotide in the section “Ways of carrying out the invention”.

Unabhängig von der jeweiligen Reaktionssequenz entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit, wobei "Einheit" repräsentativ für die photoinduzierbar redoxaktive Einheit bzw. chemisch induzierbar redoxaktive Einheit steht. Die Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer (Elek-ss-oligo-Spacer-Einheit bzw. Elek-Spacer-ss-oligo- Einheit) durchgeführt werden. Im Beispiel der Fig. 2 ist die Einheit eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit, nämlich das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides, ein photoinduzierbar redoxaktives Protein bestehend aus Apoprotein und Cofaktoren. Im Beispiel der Fig. 2, 3 und 4 ist das RC über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten Q_A-Protein-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem Nukleinsäure-Oligomer verbunden. Das RC bildet mit dem Cofaktor Ubichinon-50 in der Q_A-Bindungstasche einen 1 : 1 Komplex, wobei das Ubichinon-50 in der beschriebenen Weise kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist. Im Beispiel der Fig. 5 und 6 ist die Einheit ein photoinduzierbar redoxaktiver, verknüpfter, wenigstens bimolekularer Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex, nämlich ein kovalent verknüpfter Zn-Bakteriochlorophyll-Chinon-Komplex, der über das Chinon, dem Elektron-Akzeptor-Molekül des Komplexes, kovalent (über einen Spacer) mit dem Nukleinsäure-Oligomer verbunden ist.Regardless of the respective reaction sequence, a surface hybrid of the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is formed, "unit" being representative of the photo-inducible redox-active unit or chemically inducible redox-active unit. The bridges can of course also be carried out without a spacer or with only one spacer (Elek-ss-oligo-spacer unit or Elek-Spacer-ss-oligo-unit). In the example in FIG. 2, the unit is a photo-inducible redox-active unit, namely the reaction center (RC) of the photosynthetic bacteria of the strain Rhodobacter sphaeroides, a photo-inducible redox-active protein consisting of apoprotein and cofactors. In the example of FIGS. 2, 3 and 4, the RC is covalently linked to the nucleic acid oligomer via its cofactor ubiquinone-50 (UQ) in the so-called Q _A protein binding pocket of the RC. The RC forms a 1: 1 complex with the cofactor ubiquinone-50 in the Q _A binding pocket, the ubiquinone-50 being covalently bound to the nucleic acid oligomer in the manner described. In the example of FIGS. 5 and 6, the unit is a photoinducibly redox-active, linked, at least bimolecular electron-donor / electron-acceptor complex, namely a covalently-linked zinc-bacteriochlorophyll-quinone complex that on the quinone, the electron- Acceptor molecule of the complex, covalently (via a spacer) is connected to the nucleic acid oligomer.

Die elektrochemische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten redoxaktiven Einheit ("Einheit") in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden.The electrochemical communication between the (conductive) surface and the via a single strand oligonucleotide bridged redox active unit ("unit") in the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is weak or even unavailable.

In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden Nukleinsäure-Oligomer-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sondert-Nukleinsäure- Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Im Falle der Hybridisierung zwischen Sonden- und Target-Nukleinsäure-Oligomer kommt es zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der redoxaktiven Einheit, da diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang bestehende Nukleinsäure-Oligomer verbrückt ist. Fig. 3 zeigt dies schematisch am Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC). In Fig. 4 ist die Sequenz der Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) im Detail gezeigt, während Fig. 5 das Beispiel Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl schematisch zeigt und Fig. 6 die Sequenz der Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds- oligo-Spacer-Q-ZnBChl im Detail darstellt. In a next step, the test sites are brought into contact with the nucleic acid oligomer solution (target) to be examined. Hybridization occurs only in the case in which the solution contains nucleic acid oligomer strands which are complementary to, or at least in many areas complementary to, the special nucleic acid oligomers bound to the conductive surface. In the case of hybridization between probe and target nucleic acid oligomer, there is an increased conductivity between the surface and the redox-active unit, since this is now bridged by the double-stranded nucleic acid oligomer. Fig. 3 shows this schematically using the example of the Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ (RC). In FIG. 4, the sequence of the electron transfer steps in elec-spacer-shown ds-oligo-spacer-UQ (RC) in detail, while Fig. 5 shows the example elec-spacer-ss-oligo-spacer-Q- ZnBChl shows schematically and FIG. 6 shows the sequence of the electron transfer steps in electr-spacer-ds-oligo-spacer-Q-ZnBChl in detail.

Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.Because of the hybridization of probe nucleic acid oligomer and the related complementary nucleic acid oligomer strand (target) changes the electrical communication between the (conductive) surface and the photo-inducible redox-active unit. A sequence-specific Hybridization event by electrochemical processes such. B. Cyclic voltammetry, amperometry or conductivity measurements can be detected.

Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom, dann einen Maximalstrom (Peak) und schließlich einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.With cyclic voltammetry the potential of a stationary working electrode changed linearly depending on time. Starting from a potential with no Electrooxidation or reduction takes place, the potential is changed until the redox-active substance is oxidized or reduced (i.e. current flows). After going through of the oxidation or reduction process, the one in the current / voltage curve first increasing current, then a maximum current (peak) and finally one gradually decreasing current is generated, the direction of the potential feed vice versa. The behavior of the products of electrooxidation or -reduction recorded.

Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch ermöglicht, daß die redoxaktive Einheit durch Anlegen eines geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) werden kann, die Rereduktion (Reoxidation) der redoxaktiven Einheit in den ursprünglichen Zustand aber nicht wie in der Cyclovoltametrie durch Änderung des Elektrodenpotentials erfolgt, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), der "redoxaktiven Substanz", wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange solches Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange das verbrauchte Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.This creates an alternative electrical detection method, amperometry enables the redox-active unit by applying an appropriate, constant held electrode potential can be electro-oxidized (electro-reduced), the Reduction (reoxidation) of the redox-active unit to its original state, however not by changing the electrode potential as in cyclic voltammetry, but through a suitable reducing agent added to the target solution (Oxidizing agent), the "redox active substance", which causes the circuit of the Entire system is closed. As long as such reducing agent (oxidizing agent) is present or as long as the used reducing agent (oxidizing agent) on the If the counter electrode is reduced (reoxidized), current flows that detects amperometrically can be and which is proportional to the number of hybridization events.

Dieses Prinzip der amperometrischen Detektion soll stellvertretend für eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit bzw. für eine redoxaktive Einheit am Beispiel der Glucoseoxidase näher erläutert werden. Die Glucoseoxidase ist ein aus Apoprotein und einem Cofaktor (Flavin-Adenin-Dinukleotid) bestehendes redoxaktives Enzym. Das mit einem Ende kovalent an die Elektrode angebundene Sonden-Oligonukleotid kann am anderen, noch freien Ende mit der vollständigen enzymatischen Einheit der Glucoseoxidase funktionalisiert werden, indem z. B. der Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)-Cofaktor des Enzyms kovalent an das Sonden- Oligonukleotid angebunden wird und anschließend mit dem Glucoseoxidase- Apoprotein (GOx) rekonstituiert wird. Das entstandene Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-FAD(GOx) weist zwischen Elektrode und FAD keine oder nur geringe Leitfähigkeit auf. Im Falle der Hybridisierung mit dem zu "ss-oligo" komplementären Target-Oligonukleotid wird die Leitfähigkeit deutlich erhöht wird. Bei Zusatz des Substrats Glucose zur Target- Oligonukleotid-Lösung wird das FAD der Gukoseoxidase (FAD(GOx)) zu FADH₂ der Glucoseoxidase (FADH₂(GOx)) reduziert, wobei Glucose zur Gluconsäure oxidiert wird. Liegt nun an der Elektrode ein geeignetes äußeres Potential an, so daß über das hybridisierte Oligonukleotid Elektronen von FADH₂(GOx) an die Elektrode abgegeben werden und somit FADH₂(GOx) zu FAD(GOx) reoxidiert wird (aber weder Glucose noch Gluconsäure bei diesem Potential elektrooxidiert oder -reduziert werden kann), fließt im System Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-FAD(GOx) solange Strom wie FAD(GOx) durch freie Glucose reduziert wird, d. h. bis die gesamte Glucose verbraucht ist bzw. für den Fall, daß an der Gegenelektrode ein Potential anliegt, bei dem Gluconsäure zu Glucose reduziert werden kann, solange wie Gluconsäure an der Gegenelektrode reduziert wird. Dieser Strom kann amperometrisch detektiert werden und ist proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse.This principle of amperometric detection is to be explained in more detail on behalf of a photo-inducible redox-active unit or for a redox-active unit using the example of glucose oxidase. Glucose oxidase is a redox-active enzyme consisting of apoprotein and a cofactor (flavin adenine dinucleotide). The probe oligonucleotide covalently bound to the electrode at one end can be functionalized at the other, still free end with the complete enzymatic unit of glucose oxidase, for example by B. the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor of the enzyme is covalently bound to the probe oligonucleotide and then reconstituted with the glucose oxidase apoprotein (GOx). The resulting surface hybrid of the general structure Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-FAD (GOx) has little or no conductivity between the electrode and the FAD. In the case of hybridization with the target oligonucleotide complementary to "ss-oligo", the conductivity is increased significantly. When the substrate glucose is added to the target oligonucleotide solution, the FAD of gucose oxidase (FAD (GOx)) is reduced to FADH ₂ of glucose oxidase (FADH ₂ (GOx)), whereby glucose is oxidized to gluconic acid. If there is a suitable external potential at the electrode, so that electrons from FADH ₂ (GOx) are released to the electrode via the hybridized oligonucleotide and FADH ₂ (GOx) is reoxidized to FAD (GOx) (but neither glucose nor gluconic acid is added this potential can be electrooxidized or reduced) flows in the system Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-FAD (GOx) as long as current such as FAD (GOx) is reduced by free glucose, ie until all of the glucose has been consumed or for the case that there is a potential at the counter electrode at which gluconic acid can be reduced to glucose, as long as gluconic acid is reduced at the counter electrode. This current can be detected amperometrically and is proportional to the number of hybridization events.

Die für diese Erfindung relevanten photoinduzierbar redoxaktiven Einheiten bzw. chemisch induzierbar redoxaktiven Einheiten besitzen statt eines Elektron-Donors bzw. Elektron-Akzeptors jedoch mindestens einen Elektron-Donor und mindestens einen Elektron-Akzeptor.The photo-inducible redox-active units or have chemically inducible redox-active units instead of an electron donor or electron acceptor, however, at least one electron donor and at least one an electron acceptor.

Im Falle einer chemisch induzierbar redoxaktiven Einheit ist im Sinne der vorliegenden Erfindung mindestens ein Ladungstransferschritt zwischen Elektron- Donor(en) und Elektron-Akzeptor(en) zwischengeschaltet. Die freie redoxaktive Substanz, die D reduziert (bzw. A oxidiert) und somit einen Elektrontransfer von D^- zu A unter Bildung von A^- (bzw. den Elektrontransfer von D zu A⁺ unter Bildung von D⁺) initiiert, ermöglicht es, die Elektrode auf ein Potential zu setzten, bei dem A^- (bzw. D⁺), nicht jedoch A (bzw. D) oxidiert (bzw. reduziert) werden kann. Dies hat den Vorteil, daß die Elektrode ein Potential besitzt, bei dem die direkte Reaktion der freien, redoxaktiven Substanz mit der Elektrode deutlich unterdrückt werden kann und hauptsächlich Elektronenübertragungen zwischen redoxaktiver Einheit und Elektrode detektiert werden.In the case of a chemically inducible redox-active unit, at least one charge transfer step is interposed between electron donor (s) and electron acceptor (s) in the sense of the present invention. The free redox-active substance, which reduces D (or oxidizes A) and thus initiates an electron transfer from D ^- to A with formation of A ^- (or the electron transfer from D to A ⁺ with formation of D ⁺ ), enables the Set the electrode to a potential at which A ^- (or D ⁺ ), but not A (or D) can be oxidized (or reduced). This has the advantage that the electrode has a potential at which the direct reaction of the free, redox-active substance with the electrode can be significantly suppressed and mainly electron transfers between the redox-active unit and the electrode are detected.

Handelt es sich bei der redoxaktiven Einheit um eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit, so wird die Redoxaktivität der Einheit erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. Erfindungsgemäß wird diese Eigenschaft dadurch ausgenutzt, daß die elektrochemische Detektion erst durch Einstrahlen von Licht auf das Oberflächenhybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer- Einheit (Oberflächenhybrid mit hybridisiertem Target) ausgelöst wird und maximal solange aufrechterhalten wird wie die Lichteinstrahlung andauert. Insbesondere bei der amperometrischen Detektion fließt somit bei Verwendung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, unter bestimmten äußeren Umständen, erst dann (längeranhaltend) Strom, wenn Licht auf das Oberfächenhybrid eingestrahlt, wird. Solche äußere Umstände sind z. B. die Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels (bzw. Oxidationsmittels), um einen durch Photoinduktion gebildeten, oxidierten Donor D⁺ (bzw. reduzierten Akzeptor A^-) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit zu reduzieren (bzw. zu reduzieren) und das Anliegen eines Potentials an der Elektrode, bei dem zwar ein durch Photoinduktion gebildeter reduzierter Akzeptor A^- (bzw. oxidierter Donor D⁺) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, nicht jedoch der nicht reduzierte Akzeptor A (bzw. der nicht oxidierte Donor D) oxidiert (bzw. reduziert) werden kann. Im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung" wird dies anhand verschiedener Beispiele von Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer-Einheit mit photoinduzierbar redoxaktiver Einheit näher erläutert. Somit kann die Detektion bei Verwendung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit auf eine bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe des Oligomer-Chips räumlich beschränkt werden, indem das Licht auf dieses Test-Site oder auf diese Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Erfindungsgemäß können also verschiedene Test- Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer-Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden. Ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe kann einfach durch Anlegen eines geeigneten äußeren Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei Lichteinstrahlung auf genau dieses Test-Site oder diese Test-Site Gruppe adressiert und amperometrisch detektiert werden. Die verschiedenen Test-Sites müssen also nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-)Elektroden aufgebracht werden. Darüberhinaus kann bei der Verwendung von Oberflächenhybriden der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit mit photoinduzierbar redoxaktiver Einheit und amperometrischer Detektion der Ausleseprozess zur Detektion der einzelnen sequenzspezifischen Hybridisierungsereignisse auf dem Oligomer-Chip dadurch optimiert werden, daß die Test-Sites durch entsprechende Fokusierung des Lichts erst grobgerastert ausgelesen werden und dann in den Rastern mit Hybridisierungsereignissen des Auflösungsvermögen sukzessive erhöht wird, also z. B. bei einem Oktamer-Cliip mit 65.536 Test-Sites zuerst in z. B. 64 Gruppen von je 1024 Test-Sites ausgelesen wird, dann die Test-Site-Gruppen, die anhand der amperometrischen Messungen Hybridisierungsereignisse aufweisen, z. B. in 32 Gruppen von je 32 Test-Sites durchgetestet werden und anschließend in den erneut Hybridisierungsereignisse aufweisenden Test-Site-Gruppen die Test-Sites einzeln ausgetestet werden. Die einzelnen Hybridisierungsereignisse können dadurch mit geringem experimentellen Aufwand schnell bestimmten Sonden-Oligomeren zugeordnet werden.If the redox-active unit is a photo-inducible redox-active unit, the redox activity of the unit is only triggered by light of a certain or any wavelength. According to the invention, this property is exploited in that the electrochemical detection is triggered only by irradiation of light onto the surface hybrid of the general structure elek-spacer-ds-oligo-spacer unit (surface hybrid with hybridized target) and is maintained for a maximum of as long as the light irradiation lasts . In particular, in amperometric detection, when using a photo-inducible redox-active unit, under certain external circumstances, current (only persists) only flows when light is radiated onto the surface hybrid. Such external circumstances are e.g. B. the presence of a suitable reducing agent (or oxidizing agent) in order to reduce (or reduce) a photoinduced, oxidized donor D ⁺ (or reduced acceptor A ^- ) of the photoinducible redox-active unit and the presence of a potential at the Electrode in which a reduced acceptor A ^- (or oxidized donor D ⁺ ) of the photoinducible redox-active unit formed by photoinduction, but not the non-reduced acceptor A (or the non-oxidized donor D) can be oxidized (or reduced) . This is explained in more detail in the section "Ways of Carrying Out the Invention" using various examples of electr-spacer-ss-oligo-spacer units with a photo-inducible redox-active unit. Thus, when using a photo-inducible redox-active unit, the detection can be spatially restricted to a specific test site or a specific test site group of the oligomer chip by limiting the light to this test site or to this test site group . According to the invention, different test sites (nucleic acid-oligomer combinations) of an oligomer chip can therefore be applied to a common, continuous, electrically conductive surface. A specific test site or a specific test site group can be addressed and amperometrically detected simply by applying a suitable external potential to the (entire) surface when light is shining on precisely this test site or this test site group. The various test sites therefore do not have to be applied to individual (micro) electrodes which are electrically insulated from one another and can be individually controlled to apply a potential and read out the current. In addition, when using surface hybrids of the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit with photo-inducible redox-active unit and amperometric detection, the readout process for the detection of the individual sequence-specific hybridization events on the oligomer chip can be optimized in that the test sites can be read out by means of appropriate focusing of the light in a coarsely rasterized manner and then the resolution is gradually increased in the rasters with hybridization events. B. in an octameric clip with 65,536 test sites first in z. B. 64 groups of 1024 test sites each are read, then the test site groups that have hybridization events based on the amperometric measurements, for. B. be tested in 32 groups of 32 test sites each and then the test sites are individually tested in the test site groups again having hybridization events. The individual hybridization events can thus be quickly assigned to specific probe oligomers with little experimental effort.

Brief description of the drawings

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigenThe invention is intended to be described in the following using exemplary embodiments in Connection with the drawings will be explained in more detail. Show it

Fig. 1 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch Hybridisierung auf einem Chip; Fig. 1 Schematic representation of the oligonucleotide sequencing by hybridization on a chip;

Fig. 2 Verschiedene Reaktionssequenzen zur Herstellung des Oberflächenhybrids Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC). Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit in diesem Oberflächenhybrid ist das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien Rhodobacter sphaeroides. Dieses photoinduzierbar redoxaktive Protein besteht aus Apoprotein und Cofaktoren. Das RC ist über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten Q_A-Protein- Bindungstasche kovalent über einen Spacer mit dem Oligonukleotid verbunden; Fig. 2 Different reaction sequences for the production of the surface hybrid Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ (RC). The photoinducible redox-active unit in this surface hybrid is the reaction center (RC) of the photosynthetic bacteria Rhodobacter sphaeroides. This photo-inducible redox-active protein consists of apoprotein and cofactors. The RC is covalently linked to the oligonucleotide via a spacer via its cofactor ubiquinone-50 (UQ) in the so-called Q _A protein binding pocket;

Fig. 3 Schematische Darstellung, der photoinduzierten amperometrischen Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss- oligo-Spacer-UQ(RC) aus Fig. 2 (hv: Einstrahlung von Licht, P: primärer Donor des RC, UQ: Ubichinon-50 Elektron Akzeptor in der Q_A- Protein-Bindungstasche des RC, Red/Ox: reduzierte bzw. oxidierte Form der freien, der Targetlösung zugesetzten redoxaktiven Substanz, z. B. cyt c₂ ²⁺, Natriumascorbat oder Fe(CN)₆ ²⁺, die die oxidierte Form P⁺ in den ursprünglich neutralen Zustand P rereduzieren können, E_ox: Potential der Elektrode, bei dem UQ^- durch Elektronabgabe an die Elektode zu UQ oxidiert wird, "h an": Beginn der Lichteinstrahlung, "h aus": Ende der Lichteinstrahlung); Fig. 3 shows a schematic diagram of the photoinduced amperometric measurement method using the example of the surface hybrid elec-spacer-ss-oligo-spacer-UQ (RC) in Figure 2 (hv:. Irradiating light; P: primary donor of the RC, UQ: Ubiquinone-50 electron acceptor in the Q _A - protein binding pocket of RC, Red / Ox: reduced or oxidized form of the free redox-active substance added to the target solution, e.g. cyt c ₂ ²⁺ , sodium ascorbate or Fe (CN) ₆ ²⁺ , which can reduce the oxidized form P ⁺ to the originally neutral state P, E _ox : potential of the electrode at which UQ ^- is oxidized to UQ by electron donation to the electrode, "h on": start of light irradiation, " h off ": end of light irradiation);

Fig. 4 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au- S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) der Fig. 3 mit Gold als Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer (-S-CH₂CH₂- Spacer) zwischen Elektrode und Oligonukleotid und -CH₂CH=CH-CO-NH-CH₂- CH₂-NH- als Spacer zwischen dem Elektron-Akzeptor UQ und Oligonukleotid sowie die Darstellung der Sequenz der photoinduzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das Apoprotein des RCs ist nur als Hülle (durchgezogene Linie) angedeutet (vgl. Struktur 1). Das 12 Bp Sonden- Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand gezeigt; Fig. 4 Detailed schematic representation of the surface hybrid Au S (CH ₂₎ ₂ ds-oligo-spacer-UQ (RC) of Figure 3 having gold as a surface material, mercaptoethanol as the spacer (-S-CH ₂ CH ₂ - spacer). between the electrode and oligonucleotide and -CH ₂ CH = CH-CO-NH-CH ₂ - CH ₂ NH- as the spacer between the electron acceptor and UQ oligonucleotide as well as the representation of the sequence of the photoinduced electron transfer steps. The apoprotein of the RC is only indicated as a shell (solid line) (see structure 1). The 12 bp probe oligonucleotide of the exemplary sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'is shown as a detail in the hybridized state;

Fig. 5 Schematische Darstellung der photoinduzierten amperometrischen Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss- oligo-Spacer-Q-ZnBChl (h: Einstrahlung von Licht, ZnBChl: das Elektron-Donor-Molekül Zn-Bakteriochlorophyll, Q: das Elektron- Akzeptor-Molekül Chinon, z. B. modifiziertes Anthrachinon oder PQQ, Red/Ox: reduzierte bzw. oxidierte Form der freien, der Targetlösung zugesetzten redoxaktiven Substanz, z. B. Fe(CN)₆ ²⁺, das die oxidierte Form des Elektron-Donors ZnBChl+ in den ursprünglich neutralen Zustand ZnBChl rereduzieren kann, E_ox: Potential der Elektrode, bei dem Q^- durch Elektronabgabe an die Elektrode zu Q oxidiert wird, "h an": Beginn der Lichteinstrahlung, "h aus": Ende der Lichteinstrahlung); Fig. 5 Schematic representation of the photo-induced amperometric measurement method using the example of the surface hybrid Elek-Spacer-s-oligo-Spacer-Q-ZnBChl (h: radiation of light, ZnBChl: the electron donor molecule Zn-bacteriochlorophyll, Q: that Electron acceptor molecule quinone, e.g. modified anthraquinone or PQQ, Red / Ox: reduced or oxidized form of the free redox-active substance added to the target solution, e.g. Fe (CN) ₆ ²⁺ , which is the oxidized form of the electron donor ZnBChl + can be reduced to the originally neutral state ZnBChl, E _ox : potential of the electrode at which Q ^- is oxidized to Q by electron donation to the electrode, "h on": beginning of light irradiation, "h off": end exposure to light);

Fig. 6 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au- S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-Q-ZnBChl der Fig. 5 mit Gold als Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer (-S-CH₂CH₂- Spacer) zwischen Elektrode und Oligonukleotid und -CH₂-CH=CH-CO-NH-CH₂- CH₂-NH- als Spacer zwischen dem Elektron-Akzeptor PQQ und Oligonukleotid sowie die Darstellung der Sequenz der photoinduzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das 12 Bp Sonden-Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand gezeigt. Fig. 6 Detailed schematic representation of the surface hybrid Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-Q-ZnBChl of Fig. 5 with gold as a surface material, mercaptoethanol as a spacer (-S-CH ₂ CH ₂ - spacer) between electrode and oligonucleotide, and _-CH2 -CH = CH-CO-NH-CH ₂ - CH ₂ NH- as the spacer between the electron acceptor PQQ and the oligonucleotide, as well as representation of the sequence of the photoinduced electron transfer steps. The 12 bp probe oligonucleotide of the exemplary sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'is shown as a section in the hybridized state.

Ways of Carrying Out the Invention

Eine Bildungseinheit einer exemplarischen Test-Site mit hybridisiertem Target, Au- S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo- Spacer-Einheit ist in Fig. 4 dargestellt. Unter Bildungseinheit wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die kleinste sich wiederholende Einheit einer Test-Site verstanden. In dem Beispiel der Fig. 4 ist die Oberfläche eine Gold-Elektrode. Die Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Sonden-Oligonukleotid wurde mit dem Linker (HO-(CH₂)₂-S)₂ aufgebaut, der mit der endständigen Phosphatgruppe am 3' Ende zu P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche koadsorbiert wurde. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit im Beispiel der Fig. 4 ist das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien Rhodobacter sphaeroides, ein photoinduzierbar redoxaktives Protein bestehend aus Apoprotein und Cofaktoren. Im Anwendungsbeispiel ist das RC über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten QA-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden, wobei zuerst freies UQ mit einer reaktiven Carbonsäuregruppe versehen wurde (siehe Beispiel 1), dann freies UQ über diese Carbonsäure-Gruppe kovalent an das Sonden-Oligonukleotid angebunden wurde (Amidbildung unter Wasserabspaltung mit der terminalen Aminofunktion des an die C-5-Position des 5'-Thymins angebundenen -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Linkers) und schließlich das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer UQ) an UQ rekonstituiert wurde.A formation unit of an exemplary test site with hybridized target, Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-UQ (RC) of the general structure elek-spacer-ds-oligo-spacer unit is shown in FIG. 4 . In the context of the present invention, educational unit is understood to mean the smallest repeating unit of a test site. In the example of FIG. 4, the surface is a gold electrode. The connection between the gold electrode and probe oligonucleotide was established with the linker (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ , which with the terminal phosphate group at the 3 'end to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH was esterified and after homolytic cleavage of the SS bond on the gold surface each caused an Au-S bond, with which 2-hydroxy mercaptoethanol and mercaptoethanol-bridged oligonucleotide was adsorbed on the surface. The photo-inducible redox-active unit in the example in FIG. 4 is the reaction center (RC) of the photosynthetic bacteria Rhodobacter sphaeroides, a photo-inducible redox-active protein consisting of apoprotein and cofactors. In the application example, the RC is covalently linked to the oligonucleotide via its cofactor ubiquinone-50 (UQ) in the so-called QA binding pocket of the RC, free UQ first being provided with a reactive carboxylic acid group (see Example 1), then free UQ via this carboxylic acid Group was covalently attached to the probe oligonucleotide (amide formation with elimination of water with the terminal amino function of the -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ linker attached to the C-5 position of the 5'-thymine ) and finally the remaining RC (apoprotein with all cofactors except UQ) was reconstituted at UQ.

Wie weiter oben bereits erwähnt, kann die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide mit der kompletten oder mit einem Bestandteil der redoxaktiven Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Sonden-Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der einzelnen Schritte, die prinzipiell zur selben Bildungseinheit einer Test-Site führen, sollen im folgenden mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel des Oberflächenhybrids Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer- UQ(RC) bzw. in seiner allgemeineren Form als Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer- UQ(RC) dargestellt werden.As already mentioned above, the modification of the probe oligonucleotides with the complete or with a component of the redox-active unit can take place either before or after the binding of the probe oligonucleotide to the conductive surface. The various possible combinations of the individual steps, which in principle lead to the same formation unit of a test site, are described below with the aid of FIG. 2 using the example of the surface hybrid Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-UQ (RC). or in its more general form as Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ (RC).

Das Reaktionszentrum kann durch einfache Manipulation von den beiden Ubichinon- Cofaktoren in der Q_A- bzw. Q_B-Bindungstasche befreit werden (Gunner, M. R., Robertson, D. E., Dutton, P. L.,1986, Journal of Physical Chemistry, Vol. 90, S. 3783- 3795), so daß man Ubichinon getrennt vom restlichen RC (Apoprotein einschließlich aller Cofaktoren außer Ubichinon in der Q_A- bzw. Q_B-Bindungstasche) erhält. Das Sonden-Oligonukleotid ist in der Nähe .der beiden Enden jeweils über einen (beliebigen) Spacer mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppe versehen. In einer Reaktionssequenz "1" kann das so modifizierte Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers (entsprechend den Punkten a)-c) und 2.) im Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche") gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker kovalent an die Elektrode angebunden werden, wobei darauf geachtet wird, daß genügend monofunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird, um zwischen den einzelnen Sonden- Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target- Oligonukleotid und für die Anbindung der redoxaktiven Einheit zur Verfügung zu stellen. Danach wird an die freie, spacerverbrückte, reaktive Gruppe des Sonden- Oligonukleotids UQ, das vorher mit einer passenden reaktiven Kopplungsgruppe versehen wurde, angebunden. Die Anbindung erfolgt wie unter a) bzw. b) im Abschnitt "Bindung einer redoxaktiven. Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben. Im letzten Schritt dieser Reaktionssequenz "1" wird dann das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer UQ) an UQ rekonstituiert. In einer Variante dazu (Reaktionssequenz "2") kann das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifizierte Sonden-Oligonukleotid zuerst ohne freien, monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden werden, wobei es zu einer flachen Anlagerung des Oligonukleotids kommt. Danach wird der freie, monofunktionale Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden. Eine weitere Möglichkeit (Reaktionssequenz "3") besteht darin, das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifrzierte Sonden-Oligonukleotid zuerst mit UQ zu modifizieren, dann in Gegenwart von freiem, monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode anzubinden und anschließend mit dem restlichen RC zu rekonstituieren. Schließlich kann in einer Reaktionssequenz "4" das (mit Spacer und reaktiven Gruppen) modifizierte Sonden-Oligonukleotid zuerst mit UQ modifiziert werden, um es dann mit dem restlichen RC zu rekonstituieren und anschließend kovalent an die Elektrode zu binden. Falls, wie im Fall des RCs, die redoxaktive Einheit einen wesentlich größeren Durchmesser aufweist als das hybridisierte ds-Oligonukleotid (größer als 30 Å), kann auf die kovalente Anbindung eines geeigneten freien, monofunktionalen Linkers (Spacers) an die Elektrode verzichtet werden, anderenfalls geschieht die Anbindung der Struktur -Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) an die Elektrode in Gegenwart eines geeigneten, freien monofunktionalen Linkers.The reaction center can be freed from the two ubiquinone cofactors in the Q _A or Q _B binding pocket by simple manipulation (Gunner, MR, Robertson, DE, Dutton, PL, 1986, Journal of Physical Chemistry, Vol. 90, p 3783-3795), so that ubiquinone is obtained separately from the rest of the RC (apoprotein including all cofactors except ubiquinone in the Q _A or Q _B binding pocket). The probe oligonucleotide is provided with (identical or different) reactive groups near the two ends via an (arbitrary) spacer. In a reaction sequence "1", the probe oligonucleotide modified in this way can covalently bind together with the monofunctional linker in the presence of a monofunctional linker (corresponding to points a) -c) and 2.) in the section "Binding an oligonucleotide to the conductive surface") the electrode is connected, taking care that enough monofunctional linker of suitable chain length is added in order to provide sufficient space between the individual probe oligonucleotides for hybridization with the target oligonucleotide and for the connection of the redox-active unit. Then the free, spacer-bridged, reactive group of the probe oligonucleotide UQ, which was previously provided with a suitable reactive coupling group, is attached. The binding is carried out as described under a) or b) in the section “Binding a redox-active unit to a nucleic acid oligomer”. In the last step of this reaction sequence "1", the remaining RC (apoprotein with all cofactors except UQ) is then reconstituted at UQ. In a variant of this (reaction sequence "2"), the probe oligonucleotide (modified with spacers and reactive groups) can first be covalently bound to the electrode without a free, monofunctional linker (spacer), resulting in a flat attachment of the oligonucleotide. The free, monofunctional linker (spacer) is then covalently bound to the electrode. Another possibility (reaction sequence "3") is to first modify the probe oligonucleotide (with spacer and reactive groups) with UQ, then covalently bind it to the electrode in the presence of free, monofunctional linker (spacer) and then with the to reconstitute remaining RC. Finally, in a reaction sequence "4", the probe oligonucleotide (modified with spacers and reactive groups) can first be modified with UQ, in order to then reconstitute it with the rest of the RC and then covalently bind it to the electrode. If, as in the case of the RC, the redox-active unit has a much larger diameter than the hybridized ds-oligonucleotide (larger than 30 Å), the covalent attachment of a suitable free, monofunctional linker (spacer) to the electrode can be dispensed with, otherwise the structure-spacer-ss-oligo-spacer-UQ (RC) is connected to the electrode in the presence of a suitable, free monofunctional linker.

Im Beispiel der Fig. 2 ist das RC über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten Q_A-Protein-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden. Alternativ kann statt des UQ-Cofaktors in der QA-Bindungstasche auch ein anderer Cofaktor des RCs oder das Apoprotein kovalent an das Sonden- Oligonukleotid angebunden werden, es können beliebige Kombinationen der Reaktionssequenzen "1", "2", "3" oder "4" in Fig. 2 angewandt werden, solange sie zum gleichen Endprodukt führen (vgl. Fig. 2) und es kann in beliebigen Reaktionsschritten statt des Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotids das mit komplementären, unmodifizierten (Target-)Oligonukleotid hybridisierte Sonden- Oligonukleotid verwendefwerden. Das Sonden-Oligonukleotid kann auch direkt, also nicht über einen Spacer verbrückt, sowohl an die Elektrode als auch an die redoxaktive Einheit angebunden werden, wie unter c) im Abschnitt "Bindung eines Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche" bzw. a) im Abschnitt "Bindung einer redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben.In the example in FIG. 2, the RC is covalently linked to the oligonucleotide via its cofactor ubiquinone-50 (UQ) in the so-called Q _A protein binding pocket of the RC. Alternatively, instead of the UQ cofactor in the QA binding pocket, another cofactor of the RC or the apoprotein can be covalently linked to the probe oligonucleotide. Any combination of the reaction sequences "1", "2", "3" or "4 "can be used in FIG. 2 as long as they lead to the same end product (see FIG. 2) and the probe oligonucleotide hybridized with complementary, unmodified (target) oligonucleotide can be used instead of the single-stranded probe oligonucleotide in any reaction steps. The probe oligonucleotide can also be bound directly, that is not bridged via a spacer, both to the electrode and to the redox-active unit, as under c) in the section "Binding a nucleic acid oligomer to the conductive surface" or a) im Section "binding a redox-active unit to a nucleic acid oligomer" is described.

Die elektrische Kommunikation zwischen der leitfähigen Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten redoxaktiven Einheit in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid- Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target, zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der über ein Doppelstrang- Oligonukleotid verbrückten redoxaktiven Einheit. Für die Bildungseinheit der exemplarische Test-Site Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) (mit 12-Bp Sonden- Oligonukleotiden) ist dies schematisch in Fig. 3 anhand amperometrischer Messungen gezeigt.The electrical communication between the conductive surface and the redox-active unit bridged by a single-strand oligonucleotide in the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is weak or nonexistent. By treating the test site (s) with an oligonucleotide solution to be examined, in the case of hybridization between probe and target, there is an increased conductivity between the surface and the redox-active unit bridged by a double-stranded oligonucleotide. For the formation unit of the exemplary test site Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-UQ (RC) (with 12 bp probe oligonucleotides), this is shown schematically in FIG. 3 on the basis of amperometric measurements.

Durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge auf das RC wird der Cofaktor P, der sogenannte primäre Donor, elektronisch angeregt und es kommt innerhalb der Cofaktoren des RCs zur photoinduzierten Ladungstrennung, wobei ein Elektron vom angeregten primären Donor P* auf das UQ in der Q_A-Bindungstasche übertragen wird: Liegt an der Elektrode ein geeignetes Potential an, um vom reduzierten Ubichinon (UQ^-) ein Elektron auf die Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Sonden-Oligonukleotids trotzdem zu keinem Stromfluß, da die Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH₂)₂-ss- oligo-Spacer-UQ(RC) sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand (Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC)) jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, ein Elektron kann von UQ zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von UQ) und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven Substanz, die P⁺ zu P zu reduziert, wird der Stromkreis geschlossen und weitere Lichtabsorption durch das RC startet den Zyklus erneut. Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und photoinduzierbar redoxaktiver Einheit (Fig. 3). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden durch Amperometrie lichtinduziert zu detektieren. Die einzelnen Elektron Transfer Schritte, die im Oberflächenhybrid Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) durch Lichteinstrahlung und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven Substanz zur Reduktion von P⁺ zu P ausgelöst werden, sind in Fig. 4 dargestellt. Natürlich kann das Oberflächenhybrid Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) unter geeigneten äußeren Umständen und bei geeigneter Anbindung (z. B. Anbindung des RCs an das Sonden-Oligonukleotid in der Nähe des primären Donors), auch umgekehrt geschaltet werden, so daß nach Lichteinstrahlung P⁺ von der Elektrode reduziert und Q^- von einem geeigneten Oxidationsmittel oxidiert wird.The cofactor P, the so-called primary donor, is electronically excited by light irradiation of a suitable wavelength on the RC and photoinduced charge separation occurs within the cofactors of the RC, an electron being transferred from the excited primary donor P * to the UQ in the Q _A binding pocket If there is a suitable potential at the electrode to transfer an electron from the reduced ubiquinone (UQ ^- ) to the electrode, there is still no current flow in the case of the probe oligonucleotide that has not hybridized with the target oligonucleotide, since the conductivity of the ss-oligonucleotide in Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-UQ (RC) is very low or not at all. In the hybridized state (Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-UQ (RC)), however, the conductivity is high, an electron can be transferred from UQ to the electrode (with formation of UQ) and in the presence of a suitable one redox-active substance that reduces P ⁺ to P, the circuit is closed and further light absorption by the RC starts the cycle again. This is expressed amperometrically in a clear current flow between the electrode and the photo-inducible redox-active unit ( FIG. 3). This makes it possible to detect the sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides in a light-induced manner by amperometry. The individual electron transfer steps which are triggered in the surface hybrid Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-UQ (RC) by light irradiation and in the presence of a suitable redox-active substance for reducing P ⁺ to P are shown in Fig shown. 4,. Of course, the surface hybrid Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-UQ (RC) can be used under suitable external circumstances and with suitable connection (e.g. connection of the RC to the probe oligonucleotide in the vicinity of the primary donor ), can also be switched in reverse, so that after exposure to light P ⁺ is reduced by the electrode and Q ^{- is} oxidized by a suitable oxidizing agent.

Eine weiteres Test-Site, Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl, der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist in Fig. 5 dargestellt. Durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge auf ZnBChl wird ZnBChl elektronisch angeregt und es kommt zur photoinduzierten Ladungstrennung, wobei ein Elektron vom angeregten ZnBChl* auf das Chinon Q übertragen wird. Liegt an der Elektrode ein geeignetes Potential an, um vom so reduzierten Chinon (Q) ein Elektron auf die Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Sonden-Oligonukleotids trotzdem zu keinem Stromfluß, da die Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand Au-S(CH₂)₂-ds- oligo-Spacer-Q-ZnBChl jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, ein Elektron kann von Q^- zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von Q) und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven Substanz, die ZnBChl⁺ zu ZnBChl reduziert, wird der Stromkreis geschlossen und weitere Lichtabsorption durch ZnBChl startet den Zyklus erneut. Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und photoinduzierbar redoxaktiver Einheit (Fig. 5). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden- Oligonukleotiden durch Amperometrie lichtinduziert zu detektieren. Natürlich kann das Oberflächenhybrid Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer-Q-ZnBChl unter geeigneten äußeren Umständen und geeigneter Anbindung (z. B. Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-Spacer- ZnBChl-Q) auch umgekehrt geschaltet werden, so daß nach Lichteinstrahlung ZnBChl⁺ von der Elektrode reduziert und Q^- von einem geeigneten Oxidationsmittel oxidiert wird.Another test site, Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-Q-ZnBChl, of the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer unit is shown in FIG. 5. ZnBChl is excited electronically by light irradiation of a suitable wavelength and photoinduced charge separation occurs, whereby an electron is transferred from the excited ZnBChl * to the quinone Q. If there is a suitable potential at the electrode to transfer an electron from the reduced quinone (Q) to the electrode, there is still no current flow in the case of the probe oligonucleotide that has not hybridized with the target oligonucleotide, since the conductivity of the ss- Oligonucleotide in Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-Q-ZnBChl is very low or not at all. In the hybridized state Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-Q-ZnBChl, however, the conductivity is high, an electron can be transferred from Q ^- to the electrode (with the formation of Q) and in the presence of a suitable redox-active substance , which reduces ZnBChl ⁺ to ZnBChl, the circuit is closed and further light absorption by ZnBChl starts the cycle again. This is expressed amperometrically in a clear current flow between the electrode and the photo-inducible redox-active unit ( FIG. 5). This makes it possible to detect the sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides in a light-induced manner by amperometry. Of course, the surface hybrid Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-Q-ZnBChl can under suitable external circumstances and suitable connection (e.g. Au-S (CH ₂ ) ₂ -ds-oligo-spacer-ZnBChl -Q) can also be switched in reverse, so that ZnBChl ⁺ is reduced by the electrode after light irradiation and Q ^{- is} oxidized by a suitable oxidizing agent.

Da die Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit - auch bei passendem Elektrodenpotential - erst durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge ausgelöst und maximal solange aufrechterhalten wird, wie die Lichteinstrahlung andauert, kann dies erfindungsgemäß dadurch ausgenutzt werden, daß ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe eines Oligomer- Chips räumlich aufgelöst wird, indem das Licht auf dieses Test-Site oder auf diese Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Dies birgt den endungsgemäßen Vorteil, daß die die verschiedenen Test-Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer- Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden können und ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test- Site-Gruppen einfach durch Anlegen eines geeigneten äußeren Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei Lichteinstrahlung nur auf genau dieses Test-Site oder diese Test-Site Gruppe adressiert und amperometrisch detektiert werden kann. Die verschiedenen Test-Sites müssen also nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-) Elektroden aufgebracht werden.Since the redox activity of the photo-inducible redox-active unit - also at suitable electrode potential - only more suitable when exposed to light Wavelength triggered and maintained for as long as the If light radiation continues, this can be exploited according to the invention by that a particular test site or group of test sites of an oligomer Chips are spatially resolved by the light on this test site or on this Test site group is limited. This has the advantage according to the invention that the different test sites (nucleic acid-oligomer combinations) of an oligomer Chips on a common, continuous, electrically conductive surface can be applied and a specific test site or test Site groups simply by applying a suitable external potential to the (entire) surface when exposed to light only on exactly this test site or this test site group can be addressed and detected amperometrically. The Different test sites therefore do not have to be electrically isolated from each other isolated and for applying a potential and reading out the current individually controllable (micro) electrodes are applied.

Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden. Ein Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der Elektroreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronen-Transfer zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche und der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid-Target.In addition, incorrect base pairings (base pair mismatches) can be caused by a changed cyclic voltammetric characteristic can be recognized. A mismatch expresses in a larger potential distance between the current maxima Electroreduction and electroreoxidation (reversal of electroreduction at reverse potential feed direction) or the electrooxidation and Electrode reduction in a cyclic voltammetric reversible electron transfer between the electrically conductive surface and the photo-inducible redox-active Unit. This fact is particularly important in amperometric detection favorable because the current can be tested at a potential at which the perfectly hybridizing oligonucleotide target does not deliver significant current but the mispaired oligonucleotide target.

example 1

Modifikation des Ubichinon-50 mit einer Spacer-verbrückten reaktiven Carbonsäure-Gruppe. Die 2-Methoxy-Gruppe des Ubichinon-50 (UQ-50) wird durch Etherspaltung mit HBr, einer Standardmethode, zur 2-Hydroxygruppe modifiziert (alternativ kann 2-OH-UQ-50 nach dem Verfahren von Moore, H. W. and Folkers, K. Journal of the American Chemical Society, 1966, 88, 564-570 oder von Daves, G. et al., Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 5587-5593 hergestellt werden). Anschließend wird 2-OH-UQ-50 in einem Standardverfahren mit einer äquimolaren Menge an Cl-CH₂-CH₂-CO₂H zum 2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50 umgesetzt und chromatographisch aufgereinigt. Alternativ können 5-OH-6-alkyl-1,4- Benzochinon-Analoga des UQ-50 (Darstellung gemäß Catlin et al., Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 3572-3574) in einem Standardverfahren mit einer äquimolaren Menge an Cl-CH₂-CH₂-CO₂H zu 5-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50- Analoga modifiziert werden.
Modification of the ubiquinone-50 with a spacer-bridged reactive carboxylic acid group. The 2-methoxy group of ubiquinone-50 (UQ-50) is modified to the 2-hydroxy group by ether cleavage with HBr, a standard method (alternatively, 2-OH-UQ-50 can be modified by the method of Moore, HW and Folkers, K Journal of the American Chemical Society, 1966, 88, 564-570 or Daves, G. et al., Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 5587-5593). 2-OH-UQ-50 is then converted in a standard process with an equimolar amount of Cl-CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H to give 2- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ-50 and purified by chromatography . Alternatively, 5-OH-6-alkyl-1,4-benzoquinone analogs of UQ-50 (presentation according to Catlin et al., Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 3572-3574) can be used in a standard procedure with an equimolar Amount of Cl-CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H to 5- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ-50 analogues can be modified.

Example 2

Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH₂)₂-ss-oligo- SpacerUQ(RC). Die Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) gliedert sich in 4 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des modifizierten Ubichinon-50 (Redoxschritt) und der Rekonstitution des restlichen RCs (Rekonstitutionsschritt).Production of the oligonucleotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo- SpacerUQ (RC). The production of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-UQ (RC) is divided into 4 sections, namely the representation of the conductive surface, the derivatization of the surface with the probe oligonucleotide in the presence of a suitable monofunctional linker (Incubation step), the covalent attachment of the modified ubiquinone-50 (redox step) and the reconstitution of the remaining RCs (reconstitution step).

Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon- Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99,99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30% H₂O₂, / 70% H₂SO₄ von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher bereitete 1 × 10^-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten). The carrier material for the covalent attachment of the double-stranded oligonucleotides is formed by an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelet). For this purpose, freshly split mica was cleaned with an argon ion plasma in an electrical discharge chamber and gold (99.99%) was applied in a layer thickness of approximately 100 nm by electrical discharge. The gold film was then freed from surface impurities with 30% H ₂ O ₂ , / 70% H ₂ SO ₄ (oxidation of organic deposits) and immersed in ethanol for about 20 minutes in order to displace oxygen adsorbed on the surface. After rinsing the surface with bidistilled water, a previously prepared 1 × 10 ^-4 molar solution of the (modified) double-stranded oligonucleotide is applied to the horizontally stored surface, so that the entire gold surface is wetted (incubation step, see also below).

Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO- NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert. Zu einer 2 × 10^-4 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0,1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde ca. 10^-4 bis 10^-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol gegeben (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge) und die Gold-Oberfläche eines Test-Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit den Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (lnkubationsschritt).For the incubation, a double-modified 12 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base thymine of the oligonucleotide on the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ . About 10 ^-4 to 10 ^-1 molar 2-hydroxy- was added to a 2 × 10 ^-4 molar solution of this oligonucleotide in HEPES buffer (0.1 molar in water, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations). Mercaptoethanol given (or another thiol or disulfide linker of suitable chain length) and the gold surface of a test site completely wetted and incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxy mercaptoethanol. The free 2-hydroxy-mercaptoethanol which is simultaneously present in the incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).

Die so mit einer Monolayer aus ss-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10^-3 molarem Ghinon 2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ- 50, 10^-2 molarem EDC und 10^-2 molarem sulfo-NHS in HEPES-Puffer (0,1 molar (in Wasser, pH = 7.5), benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Spacer und das 2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50 eine kovalente Bindung aus (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C-2-Säurefunktion des 2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50, Redoxschritt).The gold electrode modified with a monolayer of ss-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 ^-3 molar Ghinon 2- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ - 50, 10 ^-2 molar EDC and 10 ^-2 molar sulfo-NHS in HEPES buffer (0.1 molar (in water, pH = 7.5)) wetted. After a reaction time of approx. 1-4 h the -CH form = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ spacer and the 2- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ-50 form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C- 2-acid function of 2- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ-50, redox step).

Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von ca. 5 × 10^-5 molarem Ubichinon-50-freien RCs in 10 mM Tris, pH = 8, mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB bei ca. 4°C für ca. 12 h inkubiert, um das restliche RC an das Oligonukleotid-gebundene UQ-50 zu rekonstituieren (Rekonstitutionsschritt).The gold electrode modified in this way was then washed with bidistilled water and with a solution of about 5 × 10 ^-5 molar ubiquinone-50-free RCs in 10 mM Tris, pH = 8, with 0.7 molar addition of TEATFB at about 4 ° C. incubated for approx. 12 h in order to reconstitute the remaining RC to the oligonucleotide-bound UQ-50 (reconstitution step).

Alternativ zur kovalenten Anbindung von 2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50 an das Sonden- Oligonukleotid kann, unter gleichen Bedingungen, auch ein 5-(CH₂-CH₂-CO₂-H)-UQ- 50-Analogon (Beispiel 1) oder ein anderes, mit einer reaktiven Carbonsäure versehenes Chinon der Formel 1-8 verwendet werden, da auch an diese Ubichinon-50-freies RC rekonstituiert werden kann. As an alternative to the covalent attachment of 2- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H) -UQ-50 to the probe oligonucleotide, a 5- (CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ -H) - UQ-50 analogue (Example 1) or another quinone of the formula 1-8 provided with a reactive carboxylic acid, since ubiquinone-50-free RC can also be reconstituted thereon.

Example 3

Herstellung der Oligonuk/eotid-Elektrode Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-Q- ZnBChl. Die Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl gliedert sich in 5 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem (mit Komplementärstrang hybridisierten) Sonden-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des Elektron-Akzeptors (Akzeptorschritt), der kovalenten Anbindung des Elektron-Donors (Donorschritt) und der thermischen Dehybridisierung des Doppelstrang-Oligonukleotids (Dehybridisierungsschritt).Preparation of the oligonucleotide / eotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-Q- ZnBChl. The production of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-spacer-Q-ZnBChl is divided into 5 sections, namely the representation of the conductive surface, the derivatization of the surface with the probe oligonucleotide (hybridized with a complementary strand) in the presence a suitable monofunctional linker (incubation step), the covalent attachment of the electron acceptor (acceptor step), the covalent attachment of the electron donor (donor step) and the thermal dehybridization of the double-stranded oligonucleotide (dehybridization step).

Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide, ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen), wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.The carrier material for the covalent attachment of the double-strand oligonucleotides, an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelet) was as in Example 1, prepared.

Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO- NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert. Eine 2 × 10^-4 molare Lösung dieses Oligonukleotids im Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5 mit 0,7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde mit einer 2 × 10^-4 molaren Lösung des (unmodifizierten) komplementären Strangs im Hybridisierungspuffer bei Raumtemperatur für ca. 2 h hybridisiert (Hybridisierungsschritt). Nach der Hybridisierung wurde der nun 1 × 10^-4 molaren Doppelstrang-Oligonukleotid-Lösung ca. 10^-4 bis 10^-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linkers geeigneter Kettenlänge) zugesetzt, die Gold-Oberfläche eines Test- Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit den Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ds-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).For the incubation, a double-modified 12 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base thymine of the oligonucleotide on the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ . A 2 × 10 ^-4 molar solution of this oligonucleotide in the hybridization buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations) was mixed with a 2 × 10 ^-4 molar solution of the (unmodified ) hybridized complementary strand in the hybridization buffer at room temperature for about 2 h (hybridization step). After the hybridization, the now 1 × 10 ^-4 molar double-strand oligonucleotide solution was added about 10 ^-4 to 10 ^-1 molar 2-hydroxy-mercaptoethanol (or another thiol or disulfide linker of suitable chain length), the gold Test site surface completely wetted and incubated for 2-24 hours. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ds-oligonucleotide and the split off 2-hydroxy-mercaptoethanol. The free 2-hydroxy-mercaptoethanol which is simultaneously present in the incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).

Die so mit einer Monolayer aus ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10^-3 molarem Chinon PQQ, 10^-2 molarem EDC und 10^-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Spacer und das PQQ eine kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C- 7-Carbonsäurefunktion des PQQ, Akzeptorschritt).The gold electrode modified with a monolayer of ds-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 ^-3 molar quinone PQQ, 10 ^-2 molar EDC and 10 ^-2 molar sulfo-NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1-4 h, the -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ spacer and the PQQ form a covalent bond (amide formation between the amino group of the spacer and the C-7-carboxylic acid function of the PQQ, acceptor step).

Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung aus 3 × 10^-3 molarem Donor ZnBChl (freie Säure), 1,5 × 10^-1 molarem EDC, 2,5 × 10^-3 molarem Hydrazin-Monohydrat (NH₂-NH₂xH₂O) und 1 × 10^-1 molarem Imidazol benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 16 h bei 23°C bindet die C-1-Carbonsäurefunktion des an das Oligonukleotid gebundenen PQQ über Hydrazin an die freie Carbonsäure-Gruppe des ZnBChl (Amidbildung zwischen den Aminogruppen des Hydrazins und der C-1-Carbonsäure- Gruppe des PQQ bzw. der freien Carbonsäure-Gruppe des ZnBChl, Donorschritt). Anschließend wurden die Doppelstränge bei Temperaturen von T < 40°C thermisch dehybridisiert und erneut mit bidestilliertem Wasser abgespült (Dehybridisierungsschritt). Das ZnBChl (freie Säure) wird aus Zn-BChl (Darstellung gemäß Hartwich et al., Journal of the American Chemical Society, 1998, 120, 3684- 3693) durch Inkubation mit Trifluoressigsäure hergestellt.
The gold electrode modified in this way was then washed with bidistilled water and with an aqueous solution of 3 × 10 ^-3 molar donor ZnBChl (free acid), 1.5 × 10 ^-1 molar EDC, 2.5 × 10 ^-3 molar hydrazine monohydrate (NH ₂ -NH ₂ xH ₂ O) and 1 × 10 ^-1 molar imidazole. After a reaction time of approx. 16 h at 23 ° C., the C-1 carboxylic acid function of the PQQ bound to the oligonucleotide binds via hydrazine to the free carboxylic acid group of the ZnBChl (amide formation between the amino groups of the hydrazine and the C-1 carboxylic acid Group of the PQQ or the free carboxylic acid group of the ZnBChl, donor step). The double strands were then thermally dehybridized at temperatures of T <40 ° C. and rinsed again with bidistilled water (dehybridization step). The ZnBChl (free acid) is prepared from Zn-BChl (presentation according to Hartwich et al., Journal of the American Chemical Society, 1998, 120, 3684-3693) by incubation with trifluoroacetic acid.

Alternativ kann z. B. ZnBChl (freie Säure) über Esterbildung nach Standardverfahren auch an die 3-OH-Gruppe des 5'-terminalen Zuckers des Sonden-Oligonukleotids gebunden werden oder der vorher kovalent verbundene Elektron-Donor/Elektron- Akzeptor-Komplex wird, wie im Donorschritt beschrieben, über eine freie Carbonsäure-Gruppe z. B. des Donors an das Sonden-Oligonukleotid angebunden. Statt PQQ kann unter den gleichen Reaktionsbedingungen auch Anthrachinon-2,6- Disulfonsäure Dinatriumsalz im Akzeptorschritt verwendet werden. Bei Verwendung von PNA-Oligonukleotid mit z.. B. -NH-(CH₂)₂-N(COCH₂-Base)-CH₂CO- als Oligonukleotid-Baustein besteht eine alternative Anbindungsmöglichkeit der ZnBChl PQQ-Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer (PNA-Oligonukleotid) entsprechend d) im Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an, ein Nukleinsäure-Oligomer". Dabei wird während der PNA-Oligonukleotid-Synthese statt der N-terminale Base in der Standard-PNA-Synthese-Reaktion PQQ über seinen Pyrrol-Stickstoff angebunden. Anschließend wird Zn-BChl, ähnlich wie im Donorschritt beschrieben, durch Inkubation des mit PQQ modifizierten PNA- Oligonukleotids mit 3 × 10^-3 molarem ZnBChl (freie Säure), 1,5 × 10^-1 molarem EDC 10^-2 und 2 × 10^-1 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer an das Amino-Ende des Peptid- Rückgrats gebunden (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Rückgrats und der Carbonsäure-Gruppe des Zn-BChl (freie Säure)).Alternatively, e.g. B. ZnBChl (free acid) via ester formation according to standard methods also to the 3-OH group of the 5'-terminal sugar of the probe oligonucleotide or the previously covalently linked electron donor / electron acceptor complex, as in the donor step described about a free carboxylic acid group z. B. the donor to the probe oligonucleotide. Instead of PQQ, anthraquinone-2,6-disulfonic acid disodium salt can also be used in the acceptor step under the same reaction conditions. When using PNA oligonucleotide with, for example, -NH- (CH ₂ ) ₂ -N (COCH ₂ base) -CH ₂ CO- as an oligonucleotide building block, there is an alternative possibility of connecting the ZnBChl PQQ unit to the nucleic acid. Oligomer (PNA oligonucleotide) corresponding to d) in the section "Binding a photo-inducible redox-active unit to a nucleic acid oligomer". During the PNA oligonucleotide synthesis, instead of the N-terminal base in the standard PNA synthesis reaction, PQQ is bound via its pyrrole nitrogen. Zn-BChl is then, similar to that described in the donor step, by incubating the PNA-modified PNA oligonucleotide with 3 × 10 ^-3 molar ZnBChl (free acid), 1.5 × 10 ^-1 molar EDC 10 ^-2 and 2 × 10 ^-1 molar sulfo-NHS in HEPES buffer bound to the amino end of the peptide backbone (amide formation between the amino group of the backbone and the carboxylic acid group of the Zn-BChl (free acid)).

Claims

1. Nucleic acid oligomer modified by covalent attachment of a redox-active unit, characterized in that the redox-active unit contains one or more electron-donor molecules and one or more electron-acceptor molecules.

2. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1, characterized characterized in that the redox-active unit has at least one redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor Contains complex, wherein at least two of the electron donor molecule (s) and / or electron acceptor molecule (s) of the redox-active unit through a or several bonds are connected to each other.

3. Modified nucleic acid oligomer according to claim 2, characterized characterized in that at least two of the electron donor molecule (s) and / or Electron acceptor molecule (s) of the redox-active unit by one or more covalent bonds are connected.

4. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1, characterized characterized in that the redox-active unit has at least one redox-active, linked, at least bimolecular electron donor / electron acceptor Contains complex, wherein at least two of the electron donor molecule (s) and / or electron acceptor molecule (s) by one or more branched or unbranched molecular parts of any composition and chain length are covalently linked.

5. Modified nucleic acid oligomer according to claim 4, wherein the branched or unbranched molecular parts with a chain length of 1-20 atoms, in particular 1-14 atoms.

6. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, characterized in that the one or more electron Donor molecules and one or more electron acceptor molecules containing redox-active unit additionally comprises one or more macromolecules.

7. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, wherein the redox-active unit is the native or modified Reaction center of photosynthetic organisms is especially the native or modified reaction center of Bacteria doing photosynthesis.

8. Modified nucleic acid oligomer according to one of claims 1 to 6, characterized in that one or more of the electron donor and / or electron acceptor molecule (s) are dyes, in particular flavins, (Metallo-) porphyrins, (metallo-) chlorophylls or (metallo-) Bacteriochlorophylls or derivatives thereof.

9. Modified nucleic acid oligomer according to one of claims 1 to 6, characterized in that one or more of the electron donor and / or electron acceptor molecule (s) are nicotinic acid amides or quinones, especially pyrrolo-quinoline quinones (PQQ), 1,2-benzoquinones, 1,4- Benzoquinones, 1,2-naphthoquinones, 1,4-naphthoquinones or 9,10- Anthraquinones or derivatives thereof.

10. Modified nucleic acid oligomer according to one of claims 1 to 6, characterized in that one or more of the electron donor and / or electron acceptor molecule (s) are charge transfer complexes.

11. Modified nucleic acid oligomer according to claim 10, wherein the batch Transfer complex is a transition metal complex, in particular a Ru (II) -, a Cr (III), an Fe (II), an Os (II) or a Co (II) complex.

12. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, wherein the modified nucleic acid oligomer is sequence specific Single-stranded DNA, RNA and / or PNA can bind.

13. A modified nucleic acid oligomer according to claim 12, wherein the modified Nucleic acid oligomer is a deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid Peptide nucleic acid oligomer or a nucleic acid oligomer with structural analog backbone.

14. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, wherein the redox-active unit alternatively covalently to one of the Phosphoric acid, carboxylic acid or amine groups or to a sugar, especially to a sugar hydroxy group, the nucleic acid oligomer Spine is bound.

15. Modified nucleic acid oligomer according to any one of claims 1-13, wherein the redox-active unit alternatively covalently to a thiol, hydroxy, Carboxylic acid or amine group of a modified base of the nucleic acid Oligomers is attached.

16. Modified nucleic acid oligomer according to claim 15, characterized characterized in that the reactive thiol, hydroxy, carboxylic acid or amine Group of the base covalently via a branched or unbranched Molecular part of any composition and chain length to the base is bound, the shortest continuous connection between the Thiol, hydroxy, carboxylic acid or amine group and the base branched or unbranched part of the molecule with a chain length of 1-20 Atoms, especially 1-14 atoms.

17. Modified nucleic acid oligomer according to any one of claims 14-16, wherein the redox-active unit at one end of the nucleic acid oligomer backbone or is attached to a terminal, modified base.

18. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, characterized in that the redox-active unit is photoinducible redox-active unit.

19. Modified nucleic acid oligomer according to one of claims 1-17, characterized in that the redox-active unit is a chemical inducible redox-active unit.

20. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, characterized in that several redox-active units the nucleic acid oligomer is attached.

21. A method for producing a modified nucleic acid oligomer as in one of the preceding claims, wherein a redox-active unit is covalently attached to a nucleic acid oligomer.

22. The method for producing a modified nucleic acid oligomer according to Claim 21, wherein the redox-active unit by covalent attachment of a or more electron donor molecule (s) to a nucleic acid oligomer is connected.

23. A method for producing a modified nucleic acid oligomer according to Claim 21, wherein the redox-active unit by covalent attachment of a or more electron acceptor molecule (s) to a nucleic acid oligomer is connected.

24. The method for producing a modified nucleic acid oligomer according to Claim 21, wherein the redox-active unit by covalent attachment of a or more macromolecules or by covalent attachment of one or several proteins is bound to a nucleic acid oligomer.

25. A method for producing a modified nucleic acid oligomer according to claims 22-24, wherein the redox-active unit by adding one or more electron acceptor molecules, one or more Electron donor molecule (s), one or more macromolecules and / or one or more proteins is completed.

26. A method for producing a modified nucleic acid oligomer according to any of claims 21-25, wherein the nucleic acid oligomer is alternative by one or more amide formations with amine or with acid groups redox-active unit, through one or more ester formations with alcohol or with acid groups of the redox-active unit, by thioester formation with Thio alcohol or with acid groups of the redox-active unit or through Condensation of one or more amine groups of the nucleic acid oligomer with aldehyde groups of the redox-active unit and subsequent reduction the resulting carbon-nitrogen double bond to the redox-active Unity is bound.

27. The method for producing a modified nucleic acid oligomer according to one of claims 21-26, wherein the redox-active unit is covalently or several branched or unbranched parts of molecules Composition and chain length is tied and the branched or unbranched molecular parts alternatively a reactive amine, hydroxy, thiol, Acid or aldehyde group for covalent attachment to a nucleic acid Own oligomer.

28. The method for producing a modified nucleic acid oligomer according to Claim 27, wherein the shortest continuous connection between the Nucleic acid oligomer and the redox-active unit is a branched or unbranched part of the molecule with a chain length of 1-20 atoms, especially from 1-14 atoms.

29. Modified conductive surface, characterized in that one or several types of modified nucleic acid oligomers according to one of the Claims 1 to 20 are connected to a conductive surface.

30. Modified conductive surface according to claim 29, wherein the surface of a metal or a metal alloy, in particular a metal selected from the group platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, Nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese and their mixtures.

31. Modified conductive surface according to claim 29, wherein the surface of a semiconductor, in particular a semiconductor selected from the Group carbon, silicon, germanium and α-tin.

32. Modified conductive surface according to claim 29, wherein the surface of a binary connection of the elements of groups 14 and 16, a binary Connection of the elements of groups 13 and 15, a binary connection the elements of groups 15 and 16, or a binary combination of the Elements of groups 11 and 17 consists, in particular, of a Cu (I) - Halide or an Ag (I) halide.

33. Modified conductive surface according to claim 29, wherein the surface of a ternary combination of the elements of groups 11, 13 and 16 or one ternary compound elements of groups 12, 13 and 16.

34. Modified conductive surface according to claims 29-33, wherein the Connection of the modified nucleic acid oligomers to the conductive Surface is covalent or by chemical or physical sorption.

35. Modified conductive surface according to any one of claims 29-34, wherein alternatively one of the phosphoric acid, carboxylic acid, amine or a sugar Group, in particular a sugar-hydroxy group, of the nucleic acid Oligomer backbone covalently or by chemi- or physisorption on the conductive surface is attached.

36. Modified conductive surface according to one of claims 29-34, characterized characterized in that alternatively a thiol, hydroxy, carboxylic acid or amine Group of a modified base of the nucleic acid oligomer covalently or is bound to the conductive surface by chemical or physical sorption.

37. Modified conductive surface according to claims 35 or 36, wherein the modified nucleic acid oligomer via a group at the end of the Nucleic acid oligomer backbone or via a group of a terminal, modified base is bound to the conductive surface.

38. Modified conductive surface according to claims 29-37, wherein to the conductive surface branched or unbranched molecular parts of any Composition and chain length covalently or by chemical or Physisorption are linked and the modified nucleic acid oligomers are covalently attached to these molecular parts.

39. Modified conductive surface according to claim 38, wherein the shortest continuous connection between the conductive surface and the Nucleic acid oligomer with a branched or unbranched part of the molecule a chain length of 1-20 atoms, in particular 1-12 atoms.

40. Modified conductive surface according to claims 38 or 39, wherein the branched or unbranched part of the molecule alternatively to a phosphoric acid, Carboxylic acid, an amine or a sugar group, especially one Sugar hydroxy group, the nucleic acid oligomer backbone or one Thiol, hydroxy, carboxylic acid or amine group of a modified base of Nucleic acid oligomers is attached.

41. Modified conductive surface according to claim 40, wherein the branched or unbranched part of the molecule to a phosphoric acid, sugar hydroxy, Carboxylic acid or amine group at the end of the nucleic acid oligomer Backbone or a thiol, hydroxy, carboxylic acid or amine group one terminal, modified base is bound.

42. Modified conductive surface according to one of claims 29-41, characterized characterized that predominantly one type of modified Nucleic acid oligomers in a spatially limited area of the conductive Surface is attached.

43. Modified conductive surface according to one of claims 29-41, characterized characterized that only one type of modified Nucleic acid oligomers in a spatially limited area of the conductive Surface is attached.

44. Process for producing a modified conductive surface as in the Claims 29-43 defined, characterized in that one or more Types of modified nucleic acid oligomers on a conductive surface be applied.

45. Process for producing a modified conductive surface as in the Claims 29-43 defined, characterized in that one or more Types of nucleic acid oligomers applied to a conductive surface and then a modification of the nucleic acid oligomers a method according to claims 21-28 is carried out.

46. Process for producing a modified conductive surface according to The claim 44 or 45, wherein the nucleic acid oligomers or the modified Nucleic acid oligomers with the complementary nucleic acid Oligomer strand are hybridized and in the form of the double strand hybrid the conductive surface can be applied.

47. Process for producing a modified conductive surface according to Claims 44 or 45, wherein the nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer in the presence of other chemical Connections that are also attached to the conductive surface is applied to the conductive surface.

48. Method for the electrochemical detection of oligomer Hybridization events, characterized in that one or more modified conductive surfaces as defined in claims 29-43 Nucleic acid oligomers are brought into contact and then one Detection of electrical communication between the redox-active unit and the respective conductive surface.

49. The method according to claim 48, wherein the detection is cyclovoltametric, done amperometrically or by conductivity measurement.

50. Method for electrochemical detection according to claims 48 or 49, characterized in that the electrochemical detection by photoinduced charge separation in the via a nucleic acid oligomer to the Conductive surface attached photo-inducible redox-active unit is started.

51. The method of claim 50, wherein the light irradiation for photoinduced Charge separation in the via a nucleic acid oligomer to the conductive Photoinducible redox-active unit attached to a surface Area of the conductive surface with one or more modified Nucleic acid oligomer types is limited.

52. The method according to any one of claims 50 or 51, wherein the after irradiation oxidized from light of any or any wavelength Electron donor molecule or the resulting reduced electron acceptor Molecule of the photoinducible redox-active unit through a suitable, free, not bound to the nucleic acid oligomer but with the nucleic acid Redox-active substance in contact with oligomer, reduced or right oxidized, i.e. in its original form before exposure to light existing state, is reset.

53. A method for electrochemical detection according to claims 48 or 49, characterized in that the electrochemical detection by a free redox-active substance through which a chemically induced charge transfer occurs the redox-active unit takes place.

54. The method of claim 52 or 53, wherein the free one is not on Nucleic acid oligomer bound, but with the nucleic acid oligomer in Contacting, redox-active substance at a potential ϕ selective is oxidizable and reducible, with ϕ the condition 2.0 V ≧ ϕ ≧ - 2.0 V, measured against normal hydrogen electrode, is sufficient.

55. The method according to any one of claims 52-54, wherein the free one is not on Nucleic acid oligomer bound, but with the nucleic acid oligomer in Contact, redox-active substance a free quinone, a free one Hexacyanoferrate (II) complex, a free sodium ascorbate, a free Ru (II) hexamine complex or a free redox-active protein, in particular a free cytochrome, is.