DE19937607A1 - Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported - Google Patents

Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported

Info

Publication number
DE19937607A1
DE19937607A1 DE19937607A DE19937607A DE19937607A1 DE 19937607 A1 DE19937607 A1 DE 19937607A1 DE 19937607 A DE19937607 A DE 19937607A DE 19937607 A DE19937607 A DE 19937607A DE 19937607 A1 DE19937607 A1 DE 19937607A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reagent
particles
nucleic acids
reagent kit
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19937607A
Other languages
German (de)
Inventor
Clemens Bergmann
Gerhard Bienhaus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BILATEC GES ZUR ENTWICKLUNG BI
Original Assignee
BILATEC GES ZUR ENTWICKLUNG BI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BILATEC GES ZUR ENTWICKLUNG BI filed Critical BILATEC GES ZUR ENTWICKLUNG BI
Priority to DE19937607A priority Critical patent/DE19937607A1/en
Priority to AU62812/00A priority patent/AU6281200A/en
Priority to EP00949475A priority patent/EP1203240A2/en
Priority to PCT/EP2000/007711 priority patent/WO2001010554A2/en
Publication of DE19937607A1 publication Critical patent/DE19937607A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Abstract

Laboratory robot having at least one robotic arm, movable within a predetermined working region, on which is a gripping device for grasping at least one functional unit (FU) to be moved by the arm, is new. The arm or gripper includes two opposing orientation devices, one optionally present on FU, and imposes on FU and the arm/gripper a predetermined, fixed orientation. Independent claims are also included for the following: (1) reagent kit for isolating nucleic acid (I) from a biological sample, comprising: (a) negatively charged particles (P) of polymer; (b) reagent (R1) comprising a charged or uncharged detergent (II) and an aliphatic alcohol and/or a reagent (R2) comprising an aqueous solution of at least one chaotropic salt (III) and optionally an aliphatic alcohol; and (c) a solution of protease (IV); (2) isolating (I) from a biological sample by treating the sample simultaneously with P and R1 or R2, then separating P from the supernatant, optionally washing and either (I) bound to P is used directly in other processes or it is released from P using an elution buffer; and (3) amplification and/or determination of (I) by polymerase chain reaction (PCR) in which (I) has been isolated by the method of (2).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Reagenzienkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe sowie ein Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels PCR.The present invention relates to a reagent kit for the isolation of Nucleic acids from a biological, nucleic acid-containing compartments containing sample, a method for the isolation of nucleic acids a biological, nucleic acid-containing compartments containing sample and a method for the amplification and / or determination of Nucleic acids by PCR.

Bei der in US-PS 4,683 195 beschriebenen Polymerasekettenreaktion (PCR) handelt es sich um ein einfaches Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Durch diese Vervielfältigung ist der Nachweis winzigster Mengen an Nukleinsäuren möglich geworden. Das Verfahren hat eine Nachweisempfindlichkeit, die bisher in der wissenschaftlichen Analytik beispiellos ist: Wo früher ein Nachweis erst ab ca. 106 Molekülen möglich war, können jetzt schon etwa 10 bis 100 Moleküle nachgewiesen werden. Eine aktuelle und spektakuläre Anwendung dieser Nachweisempfindlichkeit ist z. B. die Identifizierung von Tätern bei der Verbrechensaufklärung. Die PCR-Technologie ist ein zentraler Bestandteil der in der Öffentlichkeit diskutierten Erstellung einer "Gen-Kartei". Auch für den Nachweis von gentechnisch-veränderten Lebensmitteln oder die Untersuchung von Blutkonserven auf Viren wie HIV oder HCV ist die PCR unerlässlich.The polymerase chain reaction (PCR) described in US Pat. No. 4,683,195 is a simple method of amplifying nucleic acids. Through this duplication, the detection of tiny amounts of nucleic acids has become possible. The method has a detection sensitivity that has so far been unprecedented in scientific analysis. Previously, it was only possible to detect it from about 10 6 molecules, but now about 10 to 100 molecules can be detected. A current and spectacular application of this detection sensitivity is z. B. the identification of perpetrators in crime education. The PCR technology is a central component of the publicly discussed creation of a "gene index". Also for the detection of genetically modified food or the investigation of blood conserved on viruses such as HIV or HCV the PCR is essential.

In kürzester Zeit hat sich die PCR-Technologie im wissenschaftlichen Alltag etabliert und stellt damit einen Wachstumsmarkt dar. Voraussetzung für das PCR-Verfahren ist eine sogenannte "Probenvorbereitung", welche die Nukleinsäuren aus den verschiedensten Materialien wie Speichel, Blut, Liquor; Organismen wie z. B. Bakterien, Hefen, Pilzen aber auch Pflanzenmaterial, Fleisch und weiteren nukleinsäureenthaltenden Proben freisetzt und so vorbereitet, dass das PCR-Verfahren ohne Störungen durchgeführt werden kann. Diese Probenvorbereitung ist derzeit das Nadelöhr für die breite Anwendung, weil vor allem automatisierbare Verfahren fehlen.In a very short time, the PCR technology has become part of scientific everyday life established and thus represents a growth market. Prerequisite for the PCR procedure is a so-called "sample preparation", which the Nucleic acids from various materials such as saliva, blood, Liquor; Organisms such. As bacteria, yeasts, fungi but also Plant material, meat and other nucleic acid containing samples  releases and prepares so that the PCR procedure without interference can be carried out. This sample preparation is currently the Nadelöhr for the broad application, because above all automatable Procedure is missing.

Für die Automatisierung sind Partikel als Festphase von großer Bedeutung, die entweder verbunden mit Filtration oder Zentrifugation in der Probenvorbereitung eingesetzt werden, oder aber in Form von sogenannten Magnetpartikeln mit Hilfe von magnetischen Feldern abgetrennt werden können. Als zusammenfassende Literaturstelle wird US 4,554,088 genannt.Particles as a solid phase are of great importance for automation, either associated with filtration or centrifugation in the Sample preparation can be used, or in the form of so-called Magnetic particles are separated by means of magnetic fields can. As summary reference US 4,554,088 is called.

In der Literatur sind verschiedene Verfahren für die Probenvorbereitung zur PCR beschrieben, so z. B. unter Verwendung von anorganischen Silikatoberflächen als Adsorber für Nukleinsäuren, die in Gegenwart von chaotropen Salzen nach EP 0 389 063 an das Silika binden und mit diesem Prinzip isoliert werden können.There are various methods for sample preparation in the literature PCR described, such. B. using inorganic Silicate surfaces as adsorber for nucleic acids in the presence of chaotropic salts according to EP 0 389 063 bind to the silica and with this Principle can be isolated.

Die US-PS 5,705,628 beschreibt als Adsorber für Nukleinsäuren Magnetpartikel, die Carboxylgruppen an der Oberfläche tragen. Die Verwendung solcher Partikel ist in einem Mehrschrittprozeß beschrieben, bei dem zunächst in einer zeitlich gestaffelten Abfolge zu einer Probe ein Lysepuffer zum Aufschluß der Probe, anschließend die Magnetpartikelsuspension und danach ein spezieller Puffer, der die Polarität und Hydrophobizität der resultierenden Lösung so einstellt, daß Nukleinsäuren an die Magnetpartikel reversibel binden, zugegeben wird. Es handelt sich dabei um einen hochviskosen Puffer, der Polyethylenglykol (20 %) zusammen mit 2,5 M Kochsalz enthält (im Folgenden PEG-Puffer genannt).US Pat. No. 5,705,628 describes adsorber for nucleic acids Magnetic particles carrying carboxyl groups on the surface. The Use of such particles is described in a multi-step process, in initially in a time-staggered sequence to a sample Lysis buffer to digest the sample, then the Magnetic particle suspension and then a special buffer, the polarity and hydrophobicity of the resulting solution adjusted so that Nucleic acids to the magnetic particles reversibly bind, is added. It is a highly viscous buffer containing polyethylene glycol (20 %) along with 2.5 M common salt (hereinafter PEG buffer called).

Nach ein- oder mehrmaligem Waschen der Magnetpartikel und Resuspension der Magnetpartikel in einem Elutionspuffer wird die Nukleinsäure desorbiert und kann nach Abtrennen der Magnetpartikel entnommen werden. Für eine Automatisierung ergeben sich aber aus diesem Prozeß drei Probleme:
After one or more washes of the magnetic particles and resuspension of the magnetic particles in an elution buffer, the nucleic acid is desorbed and can be removed after separation of the magnetic particles. For automation, however, three problems arise from this process:

  • a) Die in einer zeitlich gestaffelten Abfolge notwendigen Pipettierschritte sind für eine Automatisierung, z. B. mit einem Pipettierroboter, äußerst zeitaufwendig, so daß dieses Verfahren nicht für einen höheren Probendurchsatz geeignet ist.a) The pipetting steps required in a time-staggered sequence are for automation, z. B. with a pipetting robot, extremely time consuming, so this method is not for a higher Sample throughput is suitable.
  • b) Der Einsatz eines hochviskosen Puffers erfordert bei der Automatisierung einen erheblichen Aufwand, eine entsprechend notwendige Durchmischung zu erreichen. Da vor allem bei Automatisierungen 96-Well- Mikrotiterplatten als Reaktionsgefäße eingesetzt werden, muß durch eine entsprechende Schüttel- oder Rüttel-Apparatur oder andere mechanische Durchmischung dafür gesorgt werden, daß in allen Gefäßen eine gleichmäßige Mischung erfolgt.b) The use of a high-viscosity buffer requires in the Automation a considerable effort, a correspondingly necessary To achieve thorough mixing. Especially with automations 96-well Microtiter plates are used as reaction vessels, must by a appropriate shaking or vibrating apparatus or other mechanical Mixing be ensured that in all vessels one uniform mixture takes place.
  • c) Eine weitere Problematik ergibt sich aus der Tatsache, daß die Proben vielfältiger Natur sind. Die bekannten Methoden der Probenvorbereitung ließen für viele Proben im Hinblick auf ihre Effektivität zu wünschen übrig.c) Another problem arises from the fact that the samples diverse nature. The known methods of sample preparation left a lot to be desired for many samples in terms of their effectiveness.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Möglichkeit bereitzustellen, die Probenvorbereitung effektiver zu gestalten und dabei die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden. Insbesondere war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Möglichkeiten bereitzustellen, die Probenvorbereitung und gegebenenfalls auch die spätere PCR-Reaktion mit Hilfe des Einsatzes von Pipettierrobotern durchzuführen und hierfür eine Vereinfachung und Automatisierung der bisherigen Verfahren zu ermöglichen.Object of the present invention was therefore a possibility to make the sample preparation more effective and thereby the To avoid disadvantages of the prior art. In particular it was Object of the present invention to provide ways that Sample preparation and optionally also the later PCR reaction with To carry out the help of the use of pipetting robots and this one Simplification and automation of previous procedures too enable.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch einen Reagenzienkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er
This object is achieved by a reagent kit for the isolation of nucleic acids from a biological, nucleic acid-containing compartments containing sample, which is characterized in that it

  • a) negativ geladene Partikel aus einem Polymermaterial, a) negatively charged particles of a polymeric material,  
  • b) ein Reagenz I bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder/und ein Reagenz II, bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes, undb) a reagent I consisting of a mixture of a charged or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or / and a reagent II consisting of an aqueous solution at least a chaotropic salt, and
  • c) eine Proteinase-Lösungc) a proteinase solution

enthält.contains.

Der Begriff "biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Strukturen in zu untersuchenden Proben, aus denen Nukleinsäuren durch Lyse freigesetzt werden müssen. Insbesondere sind Zellen, einschließlich bakterieller oder Hefe-Zellen, sowie Viren von dieser Definition umfasst.The term "biological, nucleic acid-containing compartments" in the Within the scope of the present invention all structures to be investigated Samples from which nucleic acids must be released by lysis. In particular, cells, including bacterial or yeast cells, as well Includes viruses of this definition.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit beinhaltet als Reagenzien I oder/und II Zusammensetzungen mit überraschend einfachen Rezepturen, die für eine effektive Lyse der Proben, d. h. der biologischen, nukleinsäurehaltigen Kompartimente, eingesetzt werden können. Des weiteren ermöglichen die im erfindungsgemäßen Reagenzienkit enthaltenen Reagenzien I und II eine sofort nach der Lyse stattfindende Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an die Polymerpartikel, ohne daß der Puffer gewechselt bzw. Zugabe anderer Substanzen nötig ist. Durch Einsatz von neutralen kationischen oder anionischen Detergenzien in hohen Konzentrationen zusammen mit aliphatischen Alkoholen kann eine besonders effiziente und vollständige Lyse erreicht werden, was insbesondere auf Proben zutrifft, welche Hefezellen enthalten. Bei Verwendung des Reagenz II enthaltend eine wäßrige Lösung mindestens eines chaotropen Salzes kann eine besonders effektive Lyse von Proben enthaltend Vollblut bewirkt werden. Für alle anderen Anwendungsfälle sind die Reagenzien I und II ebenfalls geeignet, wobei für den jeweiligen Anwendungsfall die bessere Eignung des einen oder anderen Reagenz vom Fachmann vorab leicht bestimmt werden kann. The reagent kit according to the invention contains as reagents I and / or II compositions with surprisingly simple formulations, which are for a effective lysis of the samples, d. H. the biological, nucleic acid-containing Compartments, can be used. Furthermore, the Reagents I and II contained in the reagent kit according to the invention binding of the released nucleic acids immediately after lysis to the polymer particles, without the buffer changed or addition other substances is needed. By using neutral cationic or anionic detergents in high concentrations together with Aliphatic alcohols can be a particularly efficient and complete Lysis can be achieved, which applies in particular to samples, which Contain yeast cells. When using the reagent II containing a aqueous solution of at least one chaotropic salt may be a particularly effective lysis of samples containing whole blood can be effected. For all In other applications, reagents I and II are also suitable. whereby for the respective application the better suitability of the one or other reagent can be easily determined in advance by the skilled person.  

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ermöglicht die Durchführung der Lyse von Zellen oder Viren und Bindung der Nukleinsäuren an Partikel sowie die Abtrennung der Partikel von der Probenlösung in einem quasi Einschrittverfahren, in dem zu einer Mischung aus Partikeln, Reagenz I oder II und Proteinaselösung die Probensubstanz zugegeben wird, und nach entsprechender Inkubation die Probenlösung wieder abgetrennt werden kann unter Zurücklassung der aus den Zellen abgetrennten Nukleinsäuren in an die Polymerpartikel gebundener Form.The reagent kit according to the invention makes it possible to carry out the lysis of cells or viruses and binding of the nucleic acids to particles and the Separation of the particles from the sample solution in a quasi One-step method in which a mixture of particles, reagent I or II and proteinase solution, the sample substance is added, and after appropriate incubation, the sample solution can be separated again leaving the nucleic acids separated from the cells in the polymer particles bound form.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthält der Reagenzienkit zusätzlich noch Waschpuffer oder/und Elutionspuffer zur Abtrennung der Nukleinsäuren von den Polymerpartikeln.In preferred embodiments of the invention, the reagent kit contains additionally wash buffer and / or elution buffer for the separation of Nucleic acids from the polymer particles.

Der erfindungsgemäße Reagenziensatz beinhaltet damit in besonders bevorzugter Ausführungsform alle Reagenzien zur Durchführung einer Nukleinsäureisolierung aus Proben. Dabei besteht die Möglichkeit, die Reagenzien zunächst einzeln, also jeweils in separaten Flaschen, im Reagenziensatz vorzuhalten und erst unmittelbar vor der Anwendung eine stabile Arbeitslösung herzustellen. Dies hat den Vorteil, daß je nach Probe sehr unterschiedliche Lyseprinzipien angewandt werden können. So wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein Puffer mit Natriumdodecylsulfat zusammen mit Ethanol für die Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe besonders vorteilhaft ist, während ein Puffer mit Guanidiniumthiocyanat für den Aufschluß und die Isolierung von Nukleinsäuren aus Vollblut besser geeignet ist.The reagent kit according to the invention thus contains in particular Preferred embodiment, all reagents for performing a Nucleic acid isolation from samples. There is the possibility, the Reagents first individually, so each in separate bottles, in the Reagent set and only immediately before use produce stable working solution. This has the advantage that depending on the sample very different lysis principles can be applied. That's how it became Surprisingly found that a buffer with sodium dodecyl sulfate together with ethanol for the isolation of nucleic acid from yeast is particularly advantageous while a buffer with guanidinium thiocyanate for the digestion and isolation of nucleic acids from whole blood better suitable is.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit enthält daher in einer bevorzugten Ausführung in separaten Flaschen die Reagenzien A) Partikel, B) Reagenz I mit Detergenz/Alkohol-Gemisch, C) Reagenz II mit hochmolaren Salzen von chaotropen Verbindungen sowie D) eine Proteinaselösung. The reagent kit according to the invention therefore contains in a preferred Execution in separate bottles the reagents A) Particles, B) Reagent I with detergent / alcohol mixture, C) Reagent II with high molar salts of chaotropic compounds and D) a proteinase solution.  

Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße Reagenzienkit auch eine oder mehrere Arbeitslösungen, enthaltend Mischungen aus A, B und D sowie aus A, C und D gebrauchsfertig vorhalten.In addition, the reagent kit according to the invention can also be an or several working solutions containing mixtures of A, B and D and from A, C and D ready to use.

Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit, der sowohl Reagenz I als auch Reagenz II beinhaltet, ist geeignet für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer großen Vielzahl von Proben, wobei jeweils bezogen auf die Anwendung die letztendliche Herstellung der Arbeitslösung durch den Anwender erfolgt. Selbstverständlich ist auch ein Reagenzienkit im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt, welcher nur eines der beiden Reagenzien beinhaltet und daher besonders geeignet ist für z. B. die Isolierung von Nukleinsäuren aus Hefe-enthaltenden Proben bzw. Vollblut. Die Anwendung eines der Reagenzien bei anderen Proben soll durch diese bevorzugten Anwendungen nicht eingeschränkt sein.A reagent kit according to the invention which contains both reagent I and Reagent II is suitable for the isolation of nucleic acids a large variety of samples, each based on the Application the final production of the working solution by the User takes place. Of course, a reagent kit is also included of the present invention, which only one of the two Includes reagents and therefore is particularly suitable for z. B. the Isolation of nucleic acids from yeast-containing samples or whole blood. The application of one of the reagents to other samples is intended by this preferred applications are not restricted.

Wie bereits erwähnt, können weitere Komponenten des erfindungsgemäßen Reagenzienkits Waschlösungen für die Partikel sein, die in einer separaten Flasche abgefüllt sind. Zur Elution der Nukleinsäure von den Partikeln wird ein Elutionspuffer benötigt, der sich insbesondere durch niedrige Ionenstärke auszeichnen sollte. Diese Komponente kann ebenfalls ein Teil des erfindungsgemäßen Reagenziensatzes sein. Sowohl geeignete Waschlösungen als auch Elutionspuffer sind im Prinzip dem Fachmann bekannt.As already mentioned, further components of the invention Reagent Kits Wash solutions for the particles that are in a separate Bottle are bottled. To elute the nucleic acid from the particles is requires an elution buffer, in particular by low ionic strength should be distinguished. This component can also be a part of be reagent set according to the invention. Both suitable Wash solutions as well as elution buffers are in principle the expert known.

Die Funktionsweise der einzelnen Bestandteile des erfindungsgemäßen Reagenzienkits wird im Folgenden geschildert:
Eine Probe wird mit einer Arbeitslösung enthaltend die Bestandteile A, B, D oder A, C, D versetzt und inkubiert. Im Einzelfall kann die Inkubation bei höherer Temperatur stattfinden. Die Arbeitslösung bewirkt gleichzeitig den Aufschluß der Probe, die Freisetzung der Nukleinsäuren sowie die Bindung an die Partikel, die Bestandteil der Arbeitslösung sind. Die Partikel werden abgetrennt, der klare Überstand abgesaugt und verworfen. Die Partikel werden danach in einer geeigneten Waschlösung gewaschen, wobei sich alkoholische Lösungen wiederum aus Gründen der einfachen Mischbarkeit als besonders vorteilhaft erwiesen. Insbesondere Wasser/Ethanol- oder allgemein Wasser/aliphatischer Alkohol-Gemische im Verhältnis 70 bis 30 Teile Wasser mit 30 bis 70 Teilen Alkohol ergeben im Rahmen der Erfindung befriedigende Ergebnisse. Der Waschprozeß wird je nach Probe ein- oder mehrmals wiederholt und die gewaschenen und abgeschiedenen Partikel mit einem Puffer niedriger Ionenstärke aufgenommen, so daß die Nukleinsäuren desorbieren und in Lösung gehen. Danach kann eine Weiterverarbeitung z. B. für eine PCR-Amplifikation erfolgen.The mode of operation of the individual constituents of the reagent kit according to the invention is described below:
A sample is mixed with a working solution containing components A, B, D or A, C, D and incubated. In individual cases, the incubation may take place at a higher temperature. The working solution simultaneously causes the digestion of the sample, the release of the nucleic acids and the binding to the particles that are part of the working solution. The particles are separated, the clear supernatant is filtered off with suction and discarded. The particles are then washed in a suitable washing solution, again alcoholic solutions proved to be particularly advantageous for reasons of ease of miscibility. In particular, water / ethanol or generally water / aliphatic alcohol mixtures in a ratio of 70 to 30 parts of water with 30 to 70 parts of alcohol give satisfactory results within the scope of the invention. The washing process is repeated one or more times depending on the sample and the washed and deposited particles are taken up with a buffer of low ionic strength, so that the nucleic acids desorb and go into solution. Thereafter, a further processing z. B. for a PCR amplification.

In einer bevorzugte Ausführungsform der Erfindung enthält der Reagenzienkit als negativ geladene Partikel solche aus Polystyrol oder Polyvinylalkohol, wobei die Partikel aus Polyvinylalkohol eine besonders bevorzugte Ausführungsform darstellen.In a preferred embodiment of the invention contains the Reagent kit as a negatively charged particles such as polystyrene or Polyvinyl alcohol, wherein the particles of polyvinyl alcohol a particular represent preferred embodiment.

Obwohl es prinzipiell natürlich möglich ist, nicht magnetisch beeinflussbare Partikel zu verwenden, ist es bevorzugt, magnetisch beeinflußbare Partikel vorzusehen, welche bei der Isolierung der Nukleinsäuren besonders leicht über einen Magneten an einer Stelle im Reaktionsgefäß konzentriert werden können und von denen die verbleibende Probenlösung besonders einfach abgetrennt werden kann.Although it is of course possible in principle, not magnetically influenced It is preferred to use particles which can be influenced by magnetic particles provide, which in the isolation of the nucleic acids particularly easy be concentrated via a magnet at a point in the reaction vessel can and of which the remaining sample solution is particularly simple can be separated.

Bevorzugt weisen die Partikel im Reagenzienkit einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 100 µm und insbesondere von 1 bis 10 µm auf. Partikel dieser Durchmesser erlauben eine gute und effektive Bindung von Nukleinsäuren.Preferably, the particles in the reagent kit have an average Diameter of 0.1 to 100 .mu.m and in particular from 1 to 10 .mu.m. Particles of this diameter allow a good and effective binding of Nucleic acids.

Die negative Ladung der Partikel beruht in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Partikel. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt einzusetzende Partikel sind z. B. in der EP 0 843 591 beschrieben.The negative charge of the particles is based on a preferred one Embodiment of the invention for the presence of carboxyl groups on the surface of the particles. In the context of the present invention  Particularly preferably used particles are z. In EP 0 843 591 described.

Bevorzugt enthält das Reagenz I des erfindungsgemäßen Reagenzienkits als Detergens Natriumdodecylsulfat oder Cetylammoniumbromid (CTAB), vorzugsweise jeweils in einer Menge von 1 bis 10% bezogen auf das Reagenzvolumen.The reagent I of the reagent kit according to the invention preferably contains Detergent sodium dodecyl sulfate or cetylammonium bromide (CTAB), preferably in each case in an amount of 1 to 10% based on the Reagent.

Als aliphatischer Alkohol ist in Reagenz I vorzugsweise Ethanol enthalten, wobei eine Konzentration von mindestens 40 Vol. % zu guten Ergebnissen führt und daher bevorzugt ist.As the aliphatic alcohol, reagent I preferably contains ethanol, with a concentration of at least 40 vol.% to good results leads and is therefore preferred.

Reagenz II enthält bevorzugt wässrige Lösungen von Guanidiniumhydrochlorid oder -thiocyanat, wobei wiederum Konzentrationen dieser Salze von 2 bis 8 M bevorzugt sind.Reagent II preferably contains aqueous solutions of Guanidinium hydrochloride or thiocyanate, again concentrations of these salts are preferred from 2 to 8M.

Die Reagenzien I und II enthalten ggf. weitere übliche und geeignete Puffer- und/oder Hilfssubstanzen. Beispielhaft für Puffersubstanzen sei TRIS/HCL genannt, Hilfssubstanzen können z. B. Komplexbildner wie EDTA sein. Der pH-Wert der Reagenzien wird vorzugsweise auf ungefähr den physiologischen pH eingestellt.Reagents I and II may contain other common and suitable buffering agents. and / or auxiliary substances. Exemplary for buffer substances is TRIS / HCL called, auxiliary substances may, for. B. complexing agents such as EDTA. The pH of the reagents is preferably about the physiological pH adjusted.

Die im erfindungsgemäßen Reagenzienkit enthaltene Proteinase dient zur Vermeidung von Störungen aufgrund der Anwesenheit von Proteinen nach Aufschluss der biologischen, nukleinsäurehaltigen Kompartimente. Bevorzugt wird hierzu im erfindungsgemäßen Reagenzienkit Proteinase K eingesetzt, wobei die Menge an eingesetzter Proteinase bei der Nukleinsäure-Isolierung von der Menge der vorhandenen Zellen und damit von der Menge der Proteine abhängig ist. Geeignete Konzentrationen von Proteinase kann der Fachmann leicht ermitteln. The proteinase contained in the reagent kit according to the invention serves for Avoidance of interference due to the presence of proteins after Digestion of the biological, nucleic acid-containing compartments. For this purpose, preference is given in the reagent kit according to the invention proteinase K. used, wherein the amount of proteinase used in the Nucleic acid isolation from the amount of cells present and thus depends on the amount of proteins. Suitable concentrations of Proteinase can easily be detected by a person skilled in the art.  

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ermöglicht eine leichte und schnelle Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben, insbesondere für die anschließende Durchführung einer PCR-Reaktion. Da lediglich Probe zu z. B. einer vorbereiteten Arbeitslösung enthaltend alle anderen notwendigen Komponenten zugegeben werden muß, nach Separierung der Partikel über einen z. B. einen Magneten leicht die verbleibende Probenlösung entfernt werden kann und nach ggf. nötigem Waschen eluiert werden kann unter Gewinnung der Nukleinsäuren, kann ein entsprechendes Verfahren leicht automatisiert werden. Lediglich ca. 4 Pipettierschritte sind nötig bis zur letztendlichen Probengewinnung.The reagent kit according to the invention allows an easy and fast Isolation of nucleic acids from samples, especially for the subsequent performance of a PCR reaction. Since only sample to z. B. a prepared working solution containing all the other necessary Components must be added, after separation of the particles over a z. For example, a magnet easily removes the remaining sample solution can be eluted and after any necessary washing can be eluted under Obtaining the nucleic acids, a similar procedure can easily be automated. Only about 4 pipetting steps are necessary until the final sample collection.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe mit negativ geladenen Partikeln aus einem Polymermaterial und einem Reagenz, bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes versetzt, die Partikel in geeigneter Weise von der überstehenden Lösung abtrennt, ggf. wäscht und die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Elutionspuffers von den Partikeln löst.Another object of the present invention is therefore a method for the isolation of nucleic acids from a biological, nucleic acid-containing Compartment containing sample, which is characterized that the sample with negatively charged particles from a Polymer material and a reagent consisting of a mixture of a charged or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic Salt, the particles in a suitable manner from the supernatant Separates solution, if necessary washes and bound to the particles Detaches nucleic acids from the particles by means of an elution buffer.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Prinzip unter Verwendung der oben bereits für den erfindungsgemäßen Reagenzienkit beschriebenen Komponenten durchgeführt, weshalb für eine nähere Beschreibung der Komponenten auf die obigen Ausführungen verwiesen wird. Es ist dabei bevorzugt, eine Proteinase, vorzugsweise Proteinase K zur Vermeidung von Störungen durch Proteine zuzusetzen. Die verwendeten Partikel und Reagenzien entsprechen den oben beschriebenen, ebenso wie geeignete Wasch- und Elutionspuffer, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird zum Waschen mindestens 60 %iges Ethanol eingesetzt. Es ist außerdem bevorzugt, zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben enthaltend Hefen, ein Reagenz enthaltend Detergens und Alkohol entsprechend Reagenz I zu verwenden, wogegen zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Vollblut insbesondere ein Reagenz enthaltend chaotrope Salze entsprechend Reagenz II eingesetzt wird.The inventive method is in principle using the already described above for the reagent kit according to the invention Therefore, for a more detailed description of the Components are referred to the above statements. It is included preferably, a proteinase, preferably proteinase K for the avoidance of Add disturbances by proteins. The used particles and Reagents are as described above as well as appropriate Washing and elution buffers, which are also in the process according to the invention be used. Particularly preferred for washing is at least 60 % ethanol used. It is also preferred for the isolation of  Nucleic acids from samples containing yeasts containing a reagent To use detergent and alcohol according to reagent I, whereas to Isolation of nucleic acids from whole blood, in particular a reagent containing chaotropic salts according to reagent II is used.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann prinzipiell zur Isolierung von DNA oder RNA angewandt werden, wobei allerdings die Isolierung von DNA bevorzugt ist.The inventive method can in principle for the isolation of DNA or RNA, although the isolation of DNA is preferred.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion, bei dem die zu amplifizierende Nukleinsäure aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe mit Hilfe des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. mit Hilfe des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Reagenzienkits isoliert wird. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist nämlich auch darin zu sehen, daß die Nukleinsäuren nach der Abtrennung von den Polymerpartikeln im Elutionspuffer unmittelbar zu einer PCR Reaktion eingesetzt werden können. Die PCR-Reaktion an sich oder/und die Identifizierung der Nukleinsäuren z. B. durch Sequenzierung können nach bekannten Methoden durchgeführt werden.Another object of the present invention is a method for Amplification and / or determination of nucleic acids by means of a Polymerase chain reaction in which the nucleic acid to be amplified from a biological, nucleic acid-containing compartments containing Sample using the method of the invention described above or with the aid of the above-described reagent kit according to the invention is isolated. A particular advantage of the invention is in fact too see that the nucleic acids after separation from the Polymer particles in the elution buffer immediately to a PCR reaction can be used. The PCR reaction itself or / and the Identification of the nucleic acids z. B. by sequencing can after be carried out known methods.

Durch die erfindungsgemäßen Verfahren sowie den erfindungsgemäßen Reagenzienkit werden einfach und leicht automatisierbare Möglichkeiten zur Probenvorbereitung für die PCR bereitgestellt, die eine erhebliche weitere Vereinfachung bei der Analyse von Nukleinsäurehaltigen Proben darstellen.By the method according to the invention and the inventive Reagent kits become easy and easily automatable ways to Sample preparation for the PCR provided a significant additional Represent simplification in the analysis of nucleic acid-containing samples.

Die folgenden Beispiele sollen in Verbindung mit den Figuren die Erfindung weitere erläutern. The following examples are taken in conjunction with the figures of the invention explain further.  

BeispieleExamples 1. Bindung von λ-HindIII-Marker-DNA an Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung1. binding of λ-HindIII marker DNA to magnetic particles coated with Carboxyl groups, as adsorber and magnetic deposition

0,5 µg λ-HindIII-Marker-DNA in 10 µl bidest. Wasser wurden in einer Thermosprint-Platte [Fa. lnnova, Mannheim] mit einer Arbeitslösung hergestellt aus 250 µg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843 591) in 5 µl bidest. Wasser, 5 µl Proteinase K-Lösung [1 373 196, Fa. Roche, Mannheim] und 130 µl BILATEST-Lysepuffer 1 (SDS) bestehend aus 5% Natriumdodecylsulfat [L4390, Fa. Sigma, München], 100 mM Tris/HCl [T2584, Fa. Sigma, München], 10 mM EDTA [E5134, Fa. Sigma, München], 0% bis 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] versetzt.0.5 μg λ-HindIII marker DNA in 10 μl redistilled. Water was in one Thermosprint plate [Fa. lnnova, Mannheim] with a working solution made from 250 ug particles of polyvinyl alcohol (manufactured according to EP 0 843 591) in 5 μl bidistilled. Water, 5 μl proteinase K solution [1 373 196, Fa. Roche, Mannheim] and 130 μl BILATEST lysis buffer 1 (SDS) consisting of 5% sodium dodecyl sulfate [L4390, Sigma, Munich], 100 mM Tris / HCl [T2584, Sigma, Munich], 10 mM EDTA [E5134, Sigma, Munich], 0% to 80% ethanol [5054.1, Roth. Karlsruhe].

Anschließend werden die Partikel mit einem Magneten abgetrennt, der Überstand abgenommen und die Partikel mit 150 µl 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 150 µl BILATEST- Elutionspuffer bestehend aus 10 mM Tris/HCl pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65°C für 5 min inkubiert und mit einem Magneten wie zuvor abgetrennt. Die gereinigte Nukleinsäure wird im Überstand abgenommen. Die Analyse in einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8% Agarose [A9311, Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig. 1.Subsequently, the particles are separated with a magnet, the supernatant removed and the particles with 150 ul 80% ethanol [5054.1, Roth., Karlsruhe] in bidest. Washed water. This process is repeated once; Thereafter, the particles are resuspended in 150 μl of BILATEST elution buffer consisting of 10 mM Tris / HCl pH 7.0 [so] and 1 mM EDTA [see above], incubated at 65 ° C. for 5 min and separated with a magnet as before. The purified nucleic acid is removed in the supernatant. The analysis in a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [A9311, Sigma, Munich]) gives an image as in FIG. 1.

Fig. 1 Fig. 1

Spurtrack Inhaltcontent 1, 21, 2 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 0% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 0% ethanol 3, 43, 4 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 10% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 10% ethanol 5, 65, 6 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 20% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 20% ethanol 7, 87, 8 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 30% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 30% ethanol 9, 109, 10 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 40% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 40% ethanol 11, 1211, 12 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 50% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 50% ethanol 13, 1413, 14 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 60% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 60% ethanol 15, 1615, 16 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 70% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 70% ethanol 17, 1817, 18 Eluat aus Beispiel 1, Lysepuffer mit 80% EthanolEluate from Example 1, lysis buffer with 80% ethanol MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB

Die Bindung der DNA an die Magnetpartikel ist deutlich abhängig von der Ethanol-Konzentration, unter 50% Ethanolkonzentration ist kaum Bindung zu beobachten.The binding of the DNA to the magnetic particles is clearly dependent on the Ethanol concentration, below 50% ethanol concentration is hardly binding to observe.

2. Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mit Partikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Zentrifugation2. Isolation of nucleic acid from yeast with particles coated with carboxyl groups, as an adsorber and centrifugation

Zunächst wird für einen Testansatz eine Arbeitslöung hergestellt aus 250 µg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843 591) in 5 µl bidest. Wasser, 5 µl Proteinase K-Lösung [1 373 196, Fa. Roche, Mannheim] und 130 µl BILATEST-Lysepuffer I (SDS) bestehend aus 5% Natriumdodecylsulfat [L4390, Fa. Sigma, München], 100 mM Tris/HCl [T2584, Fa. Sigma, München], 10 mM EDTA [E5134, Fa. Sigma, München], 50% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe].First, a work solution is made from 250 for a test batch μg of particles of polyvinyl alcohol (prepared according to EP 0 843 591) in 5 μl dist. Water, 5 μl proteinase K solution [1 373 196, Roche, Mannheim] and 130 μl BILATEST lysis buffer I (SDS) consisting of 5% Sodium dodecyl sulfate [L4390, Sigma, Munich], 100 mM Tris / HCl [T2584, Sigma, Munich], 10 mM EDTA [E5134, Sigma, Munich], 50% ethanol [5054.1, Roth. Karlsruhe].

Für einen Testansatz werden 108 Hefe-Zellen (Saccharomyces cerevisiae) in 10 µl Volumen in einer Thermosprint-Platte [Fa. Innova, Mannheim] mit 140 µl dieser Arbeitslösung versetzt und 15 min. bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Partikel in einer Zentrifuge [Nr. 5810R; Fa. Eppendorf, Hamburg] für 2 min. 1000 rpm in einem Mikrotitrationsplattenrotor [Nr. A-4-62; Fa. Ependorf, Hamburg] zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Partikel mit 150 µl 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 150 µl BILATEST-Elutionspuffer bestehend aus 10 mM Tris/HCl pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65°C für 10 min inkubiert und durch Zentrifugation wie zuvor abgetrennt. Die gereinigte Nukleinsäure wird im Überstand abgenommen. Die Analyse in einem Standard- Agaroseflachbettgel (0,8% Agarose [A9311, Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig. 2.For a test batch 10 8 yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) in 10 .mu.l volume in a Thermosprint plate [Fa. Innova, Mannheim] with 140 ul of this working solution and 15 min. incubated at 37 ° C. Subsequently, the particles are collected in a centrifuge [No. 5810R; Eppendorf, Hamburg] for 2 min. 1000 rpm in a microtitration plate rotor [No. A-4-62; Fa. Ependorf, Hamburg] centrifuged, the supernatant removed and the particles with 150 ul 80% ethanol [5054.1, Roth. Karlsruhe] in bidest. Washed water. This process is repeated once; Thereafter, the particles are resuspended in 150 ul BILATEST elution buffer consisting of 10 mM Tris / HCl pH 7.0 [so] and 1 mM EDTA [see above], incubated at 65 ° C for 10 min and separated by centrifugation as before. The purified nucleic acid is removed in the supernatant. The analysis in a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [A9311, Sigma, Munich]) gives an image as in FIG. 2.

Fig. 2 Fig. 2

Spurtrack Inhaltcontent 11 Eluat aus Beispiel 2Eluate from Example 2 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1 MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB

3. Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung3. Isolation of nucleic acid from yeast by means of magnetic particles, coated with carboxyl groups, as an adsorber and magnetic deposition

Beispiel 2 wurde wiederholt, statt der Zentrifugation wurden die Partikel jedoch mit einem Dauermagnet [Fa. Rheinmagnet, Neunkirchen] abgetrennt.Example 2 was repeated, instead of the centrifugation, the particles but with a permanent magnet [Fa. Rheinmagnet, Neunkirchen].

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 3 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG .

Fig. 3 Fig. 3

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 11 Eluat aus Beispiel 3Eluate from Example 3 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1

4. Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung4. Isolation of Nucleic Acid from Yeast by Magnetic Particles, coated with carboxyl groups, as adsorber and magnetic deposition

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei die Elution nicht bei 65°C, sondern bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Example 3 was repeated, the elution not at 65 ° C, but at Room temperature was performed.  

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 4 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG .

Fig. 4 Fig. 4

Spurtrack Inhaltcontent 11 Eluat aus Beispiel 4Eluate from Example 4 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1 MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB

5. Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung5. Isolation of nucleic acid from yeast by means of magnetic particles, coated with carboxyl groups, as adsorber and magnetic deposition

Beispiel 3 und 4 wurden im direkten Vergleich wiederholt.Examples 3 and 4 were repeated in direct comparison.

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.]) analysiert und in Fig. 5 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG .

Fig. 5 Fig. 5

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 1, 21, 2 Eluat aus Beispiel 5, Elution bei RTEluate from Example 5, elution at RT 3, 43, 4 Eluat aus Beispiel 5, Elution bei 65°CEluate from Example 5, elution at 65 ° C

Die Elution bei RT führt zu einer geringeren Elution von kleineren Nukleinsäure-Molekülen, z. B. RNA (die unteren beiden Banden in Spur 3 und 4). Diese Selektivität kann zur Trennung von verschiedenen Nukleinsäuremolekülen ausgenutzt werden. Elution at RT results in less elution from smaller ones Nucleic acid molecules, e.g. B. RNA (the lower two bands in lane 3 and 4). This selectivity can be used to separate different Nucleic acid molecules are exploited.  

6. Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung6. Isolation of Nucleic Acid from Yeast by Magnetic Particles, coated with carboxyl groups, as adsorber and magnetic deposition

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei Lysepuffer mit SDS oder mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid, 9161.1, Fa. Roth, Karlsruhe) verglichen wurden, jeweils mit 50% Ethanol oder ohne Ethanol.Example 3 was repeated using lysis buffer with SDS or with CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide, 9161.1, Roth. Karlsruhe) compared each with 50% ethanol or without ethanol.

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.]) analysiert und in Fig. 6 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG .

Fig. 6 Fig. 6

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 1, 21, 2 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5% SDSEluate from Example 6, lysis buffer with 5% SDS 3, 43, 4 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5% SDS und 50% EthanolEluate from Example 6, lysis buffer with 5% SDS and 50% ethanol 5, 65, 6 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5% CTABEluate from example 6, lysis buffer with 5% CTAB 7, 87, 8 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5% CTAB und 50% EthanolEluate from example 6, lysis buffer with 5% CTAB and 50% ethanol

CTAB kann statt SDS eingesetzt werden, ohne Ethanol findet jedoch in beiden Fällen keine Bindung der genomischen DNA statt. In Kontrollversuchen wurde gezeigt, dass der Zellaufschluss auch ohne Ethanol erreicht wird, die geringe Ausbeute bei den Proben ohne Ethanol ist daher auf die geringe Bindung der DNA in Abwesenheit von Ethanol zurückzuführen.CTAB can be used instead of SDS, but without ethanol In both cases no binding of genomic DNA took place. In Control experiments have shown that the cell disruption also without ethanol is achieved, the low yield in the samples without ethanol is therefore on the low binding of DNA in the absence of ethanol due.

7. Isolierung von Nukleinsäuren aus EDTA-Kaninchenvollblut mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Guanidiniumthiocynat-Lösung7. Isolation of nucleic acids from whole rabbit EDTA rabbit by means of magnetic particles, coated with carboxyl groups, as adsorber and Guanidiniumthiocynat solution

Zunächst wird für einen Testansatz eine Arbeitslösung hergestellt aus 250 µg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843 591) in 5 µl bidest. Wasser, 5 µl Proteinase K-Lösung (1 373 196, Fa. Roche, Mannheim) und 130 µl BILATEST-Lysepuffer II (Gu-SCN) bestehend aus 6 M Guanidiniumthiocynat [G9277, Fa. Sigma, München], 100 mM Tris/HCl [T2584, Fa. Sigma, München], 1 mM EDTA [E5134, Fa. Sigma, München], 2,5% Natriumlaurylsulfat (L9150 Fa. Sigma, München), pH 7,0.First, a working solution is made from 250 for a test batch μg of particles of polyvinyl alcohol (prepared according to EP 0 843 591) in 5 μl dist. Water, 5 μl proteinase K solution (1 373 196, Roche, Mannheim) and 130 μl BILATEST Lysis Buffer II (Gu-SCN) consisting of 6 M guanidinium thiocynate [G9277, Sigma, Munich], 100 mM Tris / HCl [T2584, Sigma, Munich], 1 mM EDTA [E5134, Sigma, Munich], 2.5% sodium lauryl sulfate (L9150 from Sigma, Munich), pH 7.0.

10 µl EDTA-Kaninchenvollblut werden mit 140 µl der zuvor beschriebenen Arbeitslösung versetzt und 15 min bei 37°C verschlossen inkubiert. Anschliessend werden die Partikel mit einem Dauermagnet auf den Boden gezogen und der Überstand abgenommen. Die Partikel werden mit 150 µl 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 150 µl BILATEST-Elutionspuffer bestehend aus 10 mM Tris/HCl pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65°C für 10 min inkubiert, wie zuvor abgetrennt und die gereinigte Nukleinsäure im Überstand abgenommen. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8% Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 7.10 μl of EDTA rabbit whole blood are mixed with 140 μl of the previously described working solution and incubated for 15 min at 37 ° C. Subsequently, the particles are pulled onto the ground with a permanent magnet and the supernatant is removed. The particles are redistilled with 150 μl of 80% ethanol [5054.1, Roth. Karlsruhe]. Washed water. This process is repeated once; Thereafter, the particles are resuspended in 150 μl BILATEST elution buffer consisting of 10 mM Tris / HCl pH 7.0 [so] and 1 mM EDTA [see above], incubated at 65 ° C. for 10 min, separated as before, and the purified nucleic acid in Supernatant removed. The analysis in a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [Fa. Sigma, Munich] gives an image as in FIG. 7.

Fig. 7 Fig. 7

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 11 Eluat aus Beispiel 7 unverdünntEluate from Example 7 undiluted 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1 33 Eluat aus Beispiel 7 1 : 10 verdünntEluate from Example 7 1: 10 diluted 44 Wiederholung Spur 3Repeat track 3

8. Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch von EDTA- Kaninchenvollblut und Hefezellen mittels Magnetpartikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber8. Isolation of nucleic acids from a mixture of EDTA Whole rabbit and yeast cells using magnetic particles coated with Carboxyl groups, as adsorber

108 Hefezellen in 10 µl EDTA-Kaninchenblut wurden sowohl wie Beispiel 3 als auch wie Beipiel 7 behandelt. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8% Agarose [s.o]) ergibt ein Bild wie Fig. 8.10 8 yeast cells in 10 μl of EDTA rabbit blood were treated both as Example 3 and as Example 7. Analysis in a standard agar flatbed gel (0.8% agarose [so]) gives an image as in FIG. 8.

Fig. 8 Fig. 8

Spurtrack Inhaltcontent 11 Eluat aus Beispiel 8 mit Lysepuffer aus Beispiel 2Eluate from Example 8 with lysis buffer from Example 2 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1 33 Eluat aus Beispiel 8 mit Lysepuffer aus Beispiel 7Eluate from Example 8 with lysis buffer from Example 7 44 Wiederholung Spur 3Repeat track 3 MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB

Aus dieser Darstellung ergibt sich der Hinweis, dass sich die Hefezellen mit dem SDS-Lysepuffer aus Beispiel 1 und 2 selektiv lysieren lassen, während Vollblut sich selektiv mit dem Guanidin-Puffer aus Beispiel 4 lysieren lässt.From this representation, there is an indication that the yeast cells with selectively lysing the SDS lysis buffer of Examples 1 and 2 while Whole blood can be selectively lysed with the guanidine buffer of Example 4.

9. Isolierung von Nukleinsäuren aus humanem EDTA-Vollblut mittels Magnetpartikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Guanidiniumthiocynat-Lösung9. Isolation of Nucleic Acids from Human EDTA Whole Blood by means of magnetic particles, coated with carboxyl groups, as adsorber and Guanidiniumthiocynat solution

Beispiel 7 wurde mit humanem Vollblut wiederholt. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8% Agarose [Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig. 9. Example 7 was repeated with human whole blood. The analysis in a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [Fa. Sigma, Munich]) gives an image as in FIG. 9.

Fig. 9 Fig. 9

Spurtrack Inhaltcontent 11 Eluat aus Beispiel 9 mit Lysepuffer aus Beispiel 7Eluate from Example 9 with lysis buffer from Example 7 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1 MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 33 Eluat aus Beispiel 9 mit Lysepuffer aus Beispiel 2Eluate from Example 9 with lysis buffer from Example 2 44 Wiederholung Spur 3Repeat track 3

10. Isolierung von Nukleinsäuren aus der humanpathogenen Hefe Candida albicans mittels Magnetpartikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber10. Isolation of Nucleic Acids from the Human Pathogenic Yeast Candida albicans by means of magnetic particles coated with carboxyl groups, as adsorber

Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit 108 Zellen der humanpathogenen Hefe Candida albicans wiederholt. Diese Hefe zeichnet sich durch eine besonders starke und schwer zu lysierende Zellwand aus.The experiment of Example 4 was repeated with 10 8 cells of the human pathogenic yeast Candida albicans. This yeast is characterized by a particularly strong and difficult to lyse cell wall.

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 10 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG .

Fig. 10 Fig. 10

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 11 Eluat aus Beispiel 10Eluate from Example 10 22 Wiederholung Spur 1Repeat Track 1

11. Isolierung von Nukleinsäuren aus dem gram-positiven Bakterium Lactococcas lactis mittels Magnetpartikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber11. Isolation of nucleic acids from the gram-positive Bacterium Lactococcas lactis by means of magnetic particles, coated with Carboxyl groups, as adsorber

Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit dem gram-positiven Bakterium Lactococcus lactis wiederholt. Gram-positive-Bakterien besitzen ebenfalls eine besonders starke und schwer zu lysierende Zellwand. Es wurden Lysezeiten von 1 min bis 15 min verwendet.The experiment of Example 4 was carried out with the gram-positive bacterium Lactococcus lactis repeated. Gram-positive bacteria also possess  a particularly strong and difficult to lyse cell wall. There were Lysis times of 1 min to 15 min used.

Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 11 dargestellt.As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [so]) and shown in FIG. 11.

Fig. 11 Fig. 11

Spurtrack Inhaltcontent MM Marker (λ-HindIII): 23,1|9,4|6,6|4,4|2,3|2,0|0,56 KBMarker (λ-HindIII): 23.1 | 9.4 | 6.6 | 4.4 | 2.3 | 2.0 | 0.56 KB 1, 21, 2 Eluat aus Beispiel 10, Lyse 1 minEluate from Example 10, lysis 1 min 3, 43, 4 Eluat aus Beispiel 10, Lyse 5 minEluate from Example 10, lysis 5 min 5, 65, 6 Eluat aus Beispiel 10, Lyse 10 minEluate from Example 10, lysis 10 min 7, 87, 8 Eluat aus Beispiel 10, Lyse 15 minEluate from example 10, lysis 15 min

Der Aufschluss verläuft sehr schnell, bereits nach 1 min erhält man eine hohe DNA-Ausbeute. Dies entspricht auch den Beobachtungen bei unseren Versuchen mit den Hefen, die ebenfalls schon nach 1 min aufgeschlossen werden konnten.The digestion is very fast, already after 1 min you get one high DNA yield. This also corresponds to the observations in ours Try the yeasts, which are also digested after only 1 min could become.

12. Isolierung von Nuleinsäuren aus Hefe mittels Agarose-Partikeln beschichtet mit Glutaminsäure12. Isolation of Nuleinsäuren from yeast by means of agarose particles coated with glutamic acid

Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit Agarosepartikeln, beschichtet mit Glutaminsäure (G2759, Fa. Sigma, München) wiederholt. Das Ergebnis war ähnlich dem in Fig. 4 gezeigten Ergebnis von Besipiel 4, allerdings war die Ausbeute wesentlich geringer.The experiment of Example 4 was repeated with agarose particles coated with glutamic acid (G2759, Sigma, Munich). The result was similar to the result of Besipiel 4 shown in Fig. 4, but the yield was much lower.

13. PCR-Experimente13. PCR experiments a) Hefea) yeast

Mit der isolierten Hefe-DNA aus Beispiel 3 wird eine PCR (US 4 683 195) mit den Primern
KV80: 5'-GCG GAT CCT TAA GTC CAA TCG TCA AAA TT-3'
KV102: 5'-GCG AAT TCG TAT CTT CTT TGC CCA AGG AA-3'
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg bei München] durchgeführt. Mit diesen Primern wird ein 496 bp-Fragment aus dem BCYI-Gen der Hefe amplifiziert. Die PCR-Ansätze enthalten die folgenden Bestandteile:
0,5 µL Primer-Lösung 1 (50 µmol µL-1 in H2O bidest)
0,5 µL Primer-Lösung 2 (50 µmol µL-1 in H2O bidest)
2 µL dNTP-Lösung, Konzentration der Nukleotide je 5 mM (Eurogentec, Seraing, Belgien)
4 µL MgCl2-Lösung 25 mM (Eurogentec)
5 µL 10 × PCR-Puffer (Eurogentec)
0,5 u Taq-Polymerase (Eurogentec)
bis zu 30 µL DNA- oder Probenlösung
in einem Gesamtvolumen von 50 µL. Während des Ansatzes wird die PCR- Platte auf 4°C gekühlt. Nach Zugeben der letzten Lösung werden die Proben einmal mit einer Pipette gemischt. Die PCR wird in Thermosprint- Platten [Fa. Innova GmbH, Mannheim) im Primus 96 Plus [MWG Biotech AG, München] durchgeführt. Das Programm umfasst die folgenden Schritte:
Deckelheizung auf 110°C
3 min 94°C
27 Zyklen mit
-30 s 94°C
-30 s 50°C
-2 min 72°C
5 min 72°C
Kühlung auf 4°C With the isolated yeast DNA from Example 3 is a PCR (US 4,683,195) with the primers
KV80: 5'-GCG GAT CCT TAA GTC CAA TCG TCA AAA TT-3 '
KV102: 5'-GCG AAT TCG TAT CTT CTT TGC CCA AGG AA-3 '
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg near Munich]. These primers amplify a 496 bp fragment from the yeast BCYI gene. The PCR approaches contain the following components:
0.5 μL primer solution 1 (50 μmol μL -1 in H 2 O bidest)
0.5 μL primer solution 2 (50 μmol μL -1 in H 2 O bidest)
2 μL dNTP solution, nucleotide concentration of 5 mM each (Eurogentec, Seraing, Belgium)
4 μL MgCl 2 solution 25 mM (Eurogentec)
5 μL 10 × PCR buffer (Eurogentec)
0.5 u Taq polymerase (Eurogentec)
up to 30 μL DNA or sample solution
in a total volume of 50 μL. During the batch, the PCR plate is cooled to 4 ° C. After adding the last solution, the samples are mixed once with a pipette. The PCR is performed in Thermosprint plates [Fa. Innova GmbH, Mannheim) in Primus 96 Plus [MWG Biotech AG, Munich]. The program includes the following steps:
Cover heating to 110 ° C
3 min 94 ° C
27 cycles with
-30 s 94 ° C
-30 s 50 ° C
-2 min 72 ° C
5 min 72 ° C
Cool to 4 ° C

Nach der PCR werden die Proben mit 15-20% Gel-Ladepuffer mit EDTA [Sigma, München] versetzt. Die Amplifikate wurde auf einem Standardagarosegel (1,6%) analysiert (in Fig. 12 dargestellt).After the PCR, the samples are mixed with 15-20% gel loading buffer with EDTA [Sigma, Munich]. The amplicons were analyzed on a standard agarose gel (1.6%) (shown in FIG. 12).

Fig. 12 Fig. 12

Spurtrack Inhaltcontent 11 30 µl DNA-Lösung30 μl of DNA solution 22 Wiederholung von Spur 1Repeat of track 1 33 10 µL DNA-Lösung10 μL DNA solution 44 Wiederholung von Spur 3Repeat of track 3 55 1 µL DNA-Lösung1 μL DNA solution 66 Wiederholung von Spur 5Repetition of track 5 77 0,1 µL DNA-Lösung0.1 μL DNA solution 88th Wiederholung von Spur 7Repetition of track 7 99 0,01 µL DNA-Lösung0.01 μL DNA solution 1010 Wiederholung von Spur 9Repeat of track 9 1 l1 l 0,001 µL DNA-Lösung0.001 μL DNA solution 1212 Wiederholung von Spur 11Repetition of track 11

b) Humanblutb) human blood

Mit der isolierten Human-DNA aus Beispiel 9 wird eine PCR (US 4 683 195) mit den Primern
β-Af: 5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3'
β-Ar: 5'-CTA GAA GCA TTT GCC GTG GAC GAT GGA GGG-3'
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg bei München] durchgeführt. Mit diesen Primern wird ein 600 bp-Fragment aus dem β-Actin-Gen des Menschen amplifiziert.The isolated human DNA from Example 9 is a PCR (US 4,683,195) with the primers
β-Af: 5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3 '
β-Ar: 5'-CTA GAA GCA TTT GCC GTG GAC GAT GGA GGG-3 '
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg near Munich]. With these primers, a 600 bp fragment from the human β-actin gene is amplified.

Die PCR-Ansätze werden wie unter a) beschrieben vorgenommen. Nach der PCR werden die Proben mit 15-20% Gel-Ladepuffer mit EDTA [Fa. Sigma, München] versetzt. Die Amplifikate wurde auf einem Standardagarosegel (1,6%) analysiert (in Fig. 13 dargestellt). The PCR approaches are carried out as described under a). After the PCR, the samples with 15-20% gel loading buffer with EDTA [Fa. Sigma, Munich]. The amplificates were analyzed on a standard agarose gel (1.6%) (shown in FIG. 13).

Fig. 13 Fig. 13

Spurtrack Inhaltcontent 11 30 µL DNA-Lösung30 μL DNA solution 22 Wiederholung von Spur 1Repeat of track 1 33 10 µL DNA-Lösung10 μL DNA solution 44 Wiederholung von Spur 3Repeat of track 3 55 1 µL DNA-Lösung1 μL DNA solution 66 Wiederholung von Spur 5Repetition of track 5 77 0,1 µL DNA-Lösung0.1 μL DNA solution 88th Wiederholung von Spur 7Repetition of track 7 99 0,01 µL DNA-Lösung0.01 μL DNA solution 1010 Wiederholung von Spur 9Repeat of track 9 1111 0,001 µL DNA-Lösung0.001 μL DNA solution 1212 Wiederholung von Spur 11Repetition of track 11 MM Marker 100 bp-LeiterMarker 100 bp conductor

Claims (25)

1. Reagenzenkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass er
  • a) negativ geladene Partikel aus einem Polymermaterial,
  • b) ein Reagenz I bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder/und ein Reagenz II, bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes, und
  • c) eine Proteinase-Lösung
enthält.1. Reagent kit for the isolation of nucleic acids from a sample containing biological, nucleic acid-containing compartments,
characterized in that it
  • a) negatively charged particles of a polymeric material,
  • b) a reagent I consisting of a mixture of a charged or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or / and a reagent II, consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic salt, and
  • c) a proteinase solution
contains. 2. Reagenzienkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er negativ geladene Partikel aus Polystyrol oder insbesondere aus Polyvinylalkohol enthält.2. reagent kit according to claim 1, characterized in that it comprises negatively charged particles Contains polystyrene or in particular of polyvinyl alcohol. 3. Reagenzienkit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel magnetisch beeinflußbar sind.3. reagent kit according to claim 1 or 2, characterized in that the particles are magnetic can be influenced. 4. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 100 µm und insbesondere von 1 bis 10 µm aufweisen.4. reagent kit according to one of claims 1 to 3, characterized in that the particles have a average diameter of 0.1 to 100 microns and in particular from 1 to 10 microns. 5. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel Carboxylgruppen an der Oberfläche aufweisen. 5. reagent kit according to any one of the preceding claims, characterized in that the particles to carboxyl groups have the surface.   6. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz I als Detergens Natriumdodecylsulfat oder DTAB, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10% enthält.6. Reagent kit according to one of the preceding claims, characterized in that the reagent I as a detergent Sodium dodecyl sulfate or DTAB, preferably in an amount from 1 to 10%. 7. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz I als aliphatischen Alkohol Ethanol, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 40 Vol. % enthält.7. Reagent kit according to one of the preceding claims, characterized in that the reagent I as aliphatic Alcohol Ethanol, preferably in a concentration of contains at least 40% by volume. 8. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenz II als chaotrope Salze Guanidiniumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, vorzugsweise in Konzentrationen von 2 bis 8 M enthält.8. reagent kit according to any one of the preceding claims, characterized in that reagent II as chaotropic salts Guanidinium hydrochloride or guanidinium thiocyanate, preferably in concentrations of 2 to 8 M contains. 9. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Proteinase K-Lösung enthält.9. reagent kit according to any one of the preceding claims, characterized in that it comprises a proteinase K solution contains. 10. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien I oder/und II weitere Puffer- oder/und Komplexbildungssubstanzen enthalten.10. Reagent kit according to one of the preceding claims, characterized in that the reagents I or / and II other buffering and / or complexing substances contain. 11. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien I und II einen pH- Wert von 6 bis 8 aufweisen.11. Reagent kit according to one of the preceding claims, characterized in that the reagents I and II have a pH Value from 6 to 8. 12. Reagenzienkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich
  • a) Waschpuffer oder/und
  • b) Elutionspuffer zur Ablösung der an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren
enthält.12. Reagent kit according to one of the preceding claims, characterized in that it additionally
  • a) washing buffer and / or
  • b) Elution buffer for detachment of the nucleic acids bound to the particles
contains. 13. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit negativ geladenen Partikeln aus einem Polymermaterial und einem Reagenz, bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes versetzt, die Partikel in geeigneter Weise von der überstehenden Lösung abtrennt, ggf. wäscht und die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Elutionspuffers von den Partikeln löst.13. A method for isolating nucleic acids from a containing biological, nucleic acid-containing compartments Sample, characterized in that the sample is negative charged particles of a polymeric material and a Reagent consisting of a mixture of a charged or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic salt, the particles in a suitable manner separated from the supernatant solution, if necessary washes and the Nucleic acids bound to the particles by means of a Elution buffer dissolves from the particles. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu dem Reagenz eine Proteinase, vorzugsweise Proteinase-K, zusetzt.14. The method according to claim 13, characterized in that in addition to the reagent a proteinase, preferably proteinase K added. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Partikel aus Polymermaterial Polystyrol oder insbesondere Polyvinylalkoholpartikel einsetzt.15. The method according to claim 13 or 14, characterized in that as a particle Polymer material polystyrene or in particular Polyvinyl alcohol particles used. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man magnetisch beeinflußbare Partikel verwendet und diese mit Hilfe eines Magneten von der überstehenden Lösung separiert. 16. The method according to any one of claims 13 to 15, characterized in that one magnetically influenced Particles are used and these with the help of a magnet from the separated supernatant solution.   17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 100 µm und insbesondere von 1 bis 10 µm verwendet.17. The method according to any one of claims 13 to 16, characterized in that one particles with a average diameter of 0.1 to 100 microns and used in particular from 1 to 10 microns. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man Partikel mit Carboxylgruppen an der Oberfläche verwendet.18. The method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that particles with Carboxyl groups used on the surface. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben enthaltend Hefezellen ein Reagenz enthaltend Natriumdodecylsulfat oder DTAB, vorzugsweise in Mengen von 1 bis 10% verwendet.19. The method according to any one of claims 13 to 18, characterized in that one for the isolation of Nucleic acids from samples containing yeast cells a reagent containing sodium dodecyl sulfate or DTAB, preferably in Quantities used from 1 to 10%. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz als aliphatischen Alkohol Ethanol, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 40 Vol.% verwendet.20. The method according to claim 19, characterized in that the reagent is aliphatic Alcohol Ethanol, preferably in a concentration of used at least 40% by volume. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus Vollblut ein Reagenz enthaltend Guanidiniumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, vorzugsweise jeweils in Konzentrationen von 2 bis 8 M, verwendet.21. The method according to any one of claims 13 to 18, characterized in that one for the isolation of Nucleic acids in particular from whole blood a reagent containing guanidinium hydrochloride or Guanidinium thiocyanate, preferably in each case Concentrations of 2 to 8 M, used. 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reagenzien weitere Puffersubstanzen und/oder Komplexbildner zusetzt.22. The method according to any one of claims 13 to 21, characterized in that the reagents more Buffer substances and / or complexing agents added. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die separierten mit Nukleinsäuren beladenen Partikel mit einem Waschpuffer enthaltend mindestens 60% Ethanol wäscht.23. The method according to any one of claims 13 to 22,  characterized in that the separated with Nucleic acid loaded particles with a wash buffer containing at least 60% ethanol washes. 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man es unter Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 1 bis 12 durchführt.24. The method according to any one of claims 13 to 23, characterized in that it is using a Reagent kits according to one of claims 1 to 12 performs. 25. Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), dadurch gekennzeichnet, daß man die zu amplifizierenden Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 13 bis 24 gewinnt und die Amplifikationsreaktion sowie ggf. die Bestimmung nach an sich bekannten Methoden bewirkt.25. A method for the amplification and / or determination of Nucleic acids by means of a polymerase chain reaction (PCR), characterized in that the to be amplified Nucleic acids from a biological, nucleic acid-containing Compartment-containing sample by a method according to one of claims 13 to 24 wins and the Amplification reaction and, if appropriate, the determination according to causes known methods.
DE19937607A 1999-08-09 1999-08-09 Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported Withdrawn DE19937607A1 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19937607A DE19937607A1 (en) 1999-08-09 1999-08-09 Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported
AU62812/00A AU6281200A (en) 1999-08-09 2000-08-08 Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
EP00949475A EP1203240A2 (en) 1999-08-09 2000-08-08 Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
PCT/EP2000/007711 WO2001010554A2 (en) 1999-08-09 2000-08-08 Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19937607A DE19937607A1 (en) 1999-08-09 1999-08-09 Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19937607A1 true DE19937607A1 (en) 2001-02-15

Family

ID=7917769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19937607A Withdrawn DE19937607A1 (en) 1999-08-09 1999-08-09 Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19937607A1 (en)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090539A2 (en) * 2000-11-28 2002-11-14 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
EP1349951A2 (en) * 2001-01-09 2003-10-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
WO2003095646A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Qiagen As Isolating nucleic acid
WO2009016110A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Qiagen Gmbh Process for separating nonproteinaneous biomolecules, in particular nucleic acids, from proteinaneous samples
US7527929B2 (en) 2004-07-30 2009-05-05 Agencourt Bioscience Corporation Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers
EP3286325B1 (en) * 2015-04-23 2022-07-13 IST Innuscreen GmbH Method and test kit for rapid isolation of nucleic acids using rough surfaces

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988006633A1 (en) * 1987-03-02 1988-09-07 Arnold Lyle John Jr Polycationic supports for nucleic acid purification, separation and hybridization
US5187083A (en) * 1990-11-13 1993-02-16 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
WO1994014824A2 (en) * 1992-12-16 1994-07-07 Hybridon, Inc. Analytical technique for oligonucleotide analogs
WO1996041811A1 (en) * 1995-06-08 1996-12-27 Boehringer Mannheim Gmbh Magnetic pigment
US5658548A (en) * 1993-08-30 1997-08-19 Promega Corporation Nucleic acid purification on silica gel and glass mixtures
WO1998031840A1 (en) * 1997-01-21 1998-07-23 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
WO1998059076A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Promega Corporation Method of isolating rna
WO1999016781A2 (en) * 1997-10-01 1999-04-08 Roche Diagnostics Gmbh Automatable method for preparing samples which can be universally applied
WO1999029840A1 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 The Perkin-Elmer Corporation Methods of nucleic acid isolation

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988006633A1 (en) * 1987-03-02 1988-09-07 Arnold Lyle John Jr Polycationic supports for nucleic acid purification, separation and hybridization
US5187083A (en) * 1990-11-13 1993-02-16 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
WO1994014824A2 (en) * 1992-12-16 1994-07-07 Hybridon, Inc. Analytical technique for oligonucleotide analogs
US5658548A (en) * 1993-08-30 1997-08-19 Promega Corporation Nucleic acid purification on silica gel and glass mixtures
US5658548C1 (en) * 1993-08-30 2001-07-24 Promega Corp Nucleic acid purification on silica geland glass mixtures
WO1996041811A1 (en) * 1995-06-08 1996-12-27 Boehringer Mannheim Gmbh Magnetic pigment
WO1998031840A1 (en) * 1997-01-21 1998-07-23 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
WO1998059076A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Promega Corporation Method of isolating rna
WO1999016781A2 (en) * 1997-10-01 1999-04-08 Roche Diagnostics Gmbh Automatable method for preparing samples which can be universally applied
WO1999029840A1 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 The Perkin-Elmer Corporation Methods of nucleic acid isolation

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090539A2 (en) * 2000-11-28 2002-11-14 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
WO2002090539A3 (en) * 2000-11-28 2003-08-07 Applera Corp Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
US6762027B2 (en) 2000-11-28 2004-07-13 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
US7001724B1 (en) 2000-11-28 2006-02-21 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
US7303876B2 (en) 2000-11-28 2007-12-04 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
EP1349951A2 (en) * 2001-01-09 2003-10-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
EP1349951A4 (en) * 2001-01-09 2005-08-24 Whitehead Biomedical Inst Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
WO2003095646A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Qiagen As Isolating nucleic acid
US7527929B2 (en) 2004-07-30 2009-05-05 Agencourt Bioscience Corporation Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers
WO2009016110A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Qiagen Gmbh Process for separating nonproteinaneous biomolecules, in particular nucleic acids, from proteinaneous samples
EP3286325B1 (en) * 2015-04-23 2022-07-13 IST Innuscreen GmbH Method and test kit for rapid isolation of nucleic acids using rough surfaces

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69533317T2 (en) ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS
EP1851313B1 (en) Method for isolating nucleic acids, wherein the nucleic acids are immobilised on a matrix at elevated temperatures
EP2501811B1 (en) Method for selective enrichment and isolation of microbial and optional additionally of viral nucleic acids
DE69836587T2 (en) NUCLEIC COLLECTION
DE602005001331T2 (en) Adsorption of nucleic acids to a solid phase
DE60316660T2 (en) USE OF A SILICA MATERIAL IN AMPLIFICATION
DE60210621T2 (en) UNIVERSAL METHOD AND COMPOSITION FOR THE FAST LYSING OF CELLS FOR THE RELEASE OF NUCLEIC ACIDS AND THEIR DETECTION
DE69534886T2 (en) Method for isolating cell components
DE19743518A1 (en) Automated, universally applicable sample preparation method
DE60316642T2 (en) Improved process for bisulfite treatment
DE19512369A1 (en) Device for isolating nucleic acids
EP1146049A2 (en) Process for separating double-stranded/single-stranded nucleic acid structures
WO2000024927A1 (en) Methods and means for isolating and purifying nucleic acids on surfaces
DE3639949A1 (en) METHOD FOR SEPARATING LONG CHAIN NUCLEIC ACIDS
DE69813848T2 (en) Process for the lysis of microorganisms
EP1123980B1 (en) System for simple nucleic acid analysis
DE10201084A1 (en) Magnetic particles containing silicon, process for their production and use of the particles
DE112009001513B4 (en) Stable lysis buffer mixture for the extraction of nucleic acids
DE102006019650A1 (en) Formulations and methods for isolating nucleic acids from any complex starting materials and subsequent complex gene analysis
DE19937607A1 (en) Laboratory robot, useful for automated isolation of nucleic acid, includes orientation device to ensure proper alignment between robotic arm and unit being transported
DE19912799A1 (en) Super-paramagnetic adsorbent comprising super-paramagnetic iron oxide or ferrite particles in silica gel, especially for separating nucleic acids from liquids e.g. blood
EP1203240A2 (en) Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
EP3064944B1 (en) Layering for separating particles
EP1165579B1 (en) Method for producing endotoxin-free nucleic acids
DE60133708T2 (en) A method of analyzing non-protein components using a protease from a Bacillus strain

Legal Events

Date Code Title Description
OM8 Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law
8139 Disposal/non-payment of the annual fee