DE19943374A1 - Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase - Google Patents
Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine FestphaseInfo
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Abstract
Es wird ein Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase beschrieben, bei dem eine Nukleinsäure enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird, wobei die Nukleinsäure an die Oberfläche gebunden wird.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Anbinden bzw. Immobilisieren von
Nukleinsäuren an eine Festphase sowie zum Aufreinigen der gebundenen
Nukleinsäuren, wobei die Festphase mit hydrophilen und hydrophoben
Gruppen belegt ist.
Für viele Arbeitstechniken ist es erforderlich, daß die eingesetzten
Nukleinsäuren, insbesondere DNA, frei von störenden Begleitsubstanzen
sind. Mit herkömmlichen Verfahren erhaltene Nukleinsäuren müssen deshalb
vor einer Weiterverwendung in den meisten Fällen aufgereinigt werden.
Beispielsweise müssen vor einer Sequenzierung von PCR
(Polymerasekettenreaktion)-Produkten unerwünsche Nebenprodukte,
überschüssiger Primer, nicht eingebaute Nukleotide und Salze des
Reaktionspuffers abgetrennt werden, da sie die Sequenzierreaktion stören
könnten. Auch bei einer Vervielfältigung von DNA mit Hilfe von Zellen muß
vor der Weiterverarbeitung der gewünschten DNA eine Aufreinigung
erfolgen, bei der das Zelldebris nach einer Lyse abgetrennt wird. Die
gewünschte DNA muß dann vor der Verwendung, z. B. für einen
Restriktionsverdau oder eine Sequenzierreaktion, von Verunreinigungen, wie
RNA, Proteinen, Salzen und dgl. befreit werden. Auch für eine quantitative
Bestimmung von Nukleinsäuren, beispielsweise über UV-
Absorptionsmessungen, ist zunächst eine Aufreinigung erforderlich, da für
eine fehlerfreie Bestimmung die verwendete Nukleinsäurelösung frei von
anderen Bestandteilen sein muß, die im gleichen Wellenbereich wie das
gewünschte Produkt absorbieren, beispielsweise RNA, Primer, Nukleotide
und dgl. Auch bei einer Konzentrationsbestimmung durch fluorimetrische
Messungen müssen aufgereinigte Nukleinsäuren verwendet werden, damit
es nicht zu unspezifischer, das Ergebnis verfälschender Fluoreszenz kommt.
Bei massenspektrometrischen Untersuchungen von Nukleinsäuren,
insbesondere DNA, beispielsweise mit MALDI-MS (Matrix assisted Laser
Desorption/Ionisation-MassSpectrometry; Matrix-unterstützteLaserdesorp
tion/Ionisations-Massenspektrometrie) ist es nötig, daß die Probemoleküle
weitgehend frei von Begleitstoffen, wie etwa Puffersubstanzen, Metall
kationen, Primerüberschüssen, Peptiden, Lipiden, Detergentien und dgl.,
sind, welche die Analyse stören könnten. Weiterhin wird eine Nukleinsäure
zur Durchführung einer MALDI-MS-Analyse vorteilhafterweise in die
Ammoniumform überführt. Auf diese Weise lassen sich diskrete Analyt
signale und ein gutes Signal/Rausch-Verhältnis erreichen, und die Dis
kriminierung des Probensignals durch Begleitstoffe wird vermieden.
Bei der Aufarbeitung von wenigen Proben kann die Aufreinigung zwar
manuell mit aufwendigen Techniken erfolgen. Zur Bewältigung einer
größeren Anzahl von Proben ist es jedoch erforderlich, ein geeignetes,
technisch einfaches und kostengünstiges Aufreinigungsverfahren bereitzu
stellen, das automatisiert werden kann, um den geforderten Durchsatz zu
bewältigen.
Bisher sind verschiedene Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
bekannt. Bei der Reinigung über Säulen kommen unterschiedliche Techniken
zum Einsatz. Beispielsweise wird beim QIAquickPCR Purification Kit von
Qiagen DNA mit Hilfe eines speziellen Bindungspuffers an eine Silicamem
bran adsorbiert. Der Bindungspuffer bewirkt, daß nur DNA bestimmter
Länge adsorbiert wird und überschüssiger Primer und Nukleotide abgetrennt
werden können. Nach dem Waschen der DNA wird diese dann mit einem
geeigneten Elutionsmittel von der Säule eluiert.
Bei der Ausschluß-Chromatographie wird eine flüssige Phase, welche
gelöste DNA enthält, auf eine Gelmatrix gegeben, wobei die Makromoleküle
in Abhängigkeit ihrer Größe verschieden tief in das Netzwerk der Matrix
eindringen. Kleinere Moleküle dringen tiefer ein als größere Moleküle und
werden somit länger auf der Säule zurückgehalten. Moleküle, die größer als
die größten Poren der verwendeten gequollenen Gelmatrix sind, können die
Gelkörner nicht durchdringen und wandern an diesen vorbei, so daß sie die
Säule zuerst verlassen. Aufgrund der unterschiedlichen Größe von
gewünschter DNA auf der einen Seite und Primern und Nukleotiden auf der
anderen Seite, kann eine Aufreinigung erfolgen. Ein häufig verwendetes
Material für die Gelmatrix ist Sephacryl von Pharmacia.
Bei den Säulentechniken wird das Eluat üblicherweise durch Zentrifugation
erhalten, weshalb diese Techniken nur mit sehr hohem Aufwand automati
siert werden können. Damit sind Säulentechniken nicht für einen hohen
Probendurchsatz geeignet. Darüber hinaus ist die Aufreinigung über Säulen
mit einem komplexen apparativen Aufwand und damit mit hohen Kosten
verbunden.
Ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung von DNA ist die präparative
Isolierung mittels Gelelektrophorese. Dabei werden die Moleküle nach ihrer
Größe getrennt. Die gewünschte Bande mit den interessierenden Molekülen
wird ausgeschnitten, und diese werden dann direkt aus dem Gel eluiert.
Auch dieses Verfahren ist nur schwer zu automatisieren, wobei der
limitierende Schritt das Ausschneiden der gewünschten Bande ist. Diese
Methode konnte deshalb bisher nur für den manuellen Einsatz verwendet
werden.
Ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren ist die Magnet
separation mittels spezifischer Bindung der Nukleinsäuren an eine funktiona
lisierte Oberfläche. Bei einer spezifischen Bindung werden gezielt nur
bestimmte DNA-Fragmente über hochaffine Wechselwirkungen oder
kovalente Bindung an Partikel gebunden. Beispielsweise werden an mit
immobilisiertem Streptavidin ausgestattete Magnetpartikel über hochaffine
Wechselwirkungen biotinylierte Produkte gebunden. Neben der Verwendung
von Oberflächen, die einen Partner eines spezifischen Bindepaares tragen,
können auch Partikel verwendet werden, die an ihrer Oberfläche einen
Primer tragen. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen werden dann
nur Fragmente mit zu diesem Primer komplementärer Sequenz gebunden.
Diese Verfahren erfordern jedoch eine aufwendige Vorbereitung sowohl der
Festphasen als auch der aufzureinigenden Moleküle, beispielsweise durch
Derivatisierung und sind auf so vorbereitete Moleküle limitiert.
WO 94/11103 beschreibt solch ein Verfahren unter Verwendung von
magnetisierbaren Polymerpartikeln, die auf ihrer Oberfläche spezifische
Affinitätsliganden tragen.
EP 0 885 958 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von DNA unter
Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Magnetpartikeln, die
Partner eines spezifischen Bindepaares, beispielsweise Sonden, Biotin oder
Streptavidin tragen.
US-Patent 5,405,951 beschreibt ein Verfahren, bei dem DNA unter
Verwendung von chaotropen Salzen an Silicaoberflächen gebunden wird.
Chaotrope Salze sind jedoch gesundheitsgefährdend. Zudem ist bei dem im
US-Patent 5,405,951 beschriebenen Verfahren ein Arbeiten bei erhöhter
Temperatur erforderlich.
US-Patent 5,705,628 beschreibt ein Verfahren, bei dem DNA unter
Verwendung eines Bindepuffers an magnetische Mikropartikel gebunden
wird, die eine mit Carboxylgruppen ausgestattete Oberfläche aufweisen.
Allerdings werden dort aufgrund der geringen Ausbeute relativ viele Partikel
pro Probe benötigt und die Carboxylgruppen-Modifikation erlaubt nur die
Verwendung von wenigen, speziellen Partikelsorten.
Aufgabe der Erfindung war es somit, ein Verfahren zur Immobilisierung/An
bindung bzw. Aufreinigung von Nukleinsäuren bereitzustellen, welches die
Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zumindest
teilweise vermeidet und welches insbesondere eine einfache und kosteneffi
ziente Aufreinigung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum
Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase, welches dadurch gekenn
zeichnet ist, daß eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Fest
phase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist,
in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird,
wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden. Unter diesen
Bedingungen binden die Nukleinsäuremoleküle an besagte Oberfläche und
stehen somit für festphasengestützte Waschvorgänge bereit, während derer
störende Substanzen effektiv abgetrennt werden können und bei Bedarf die
Probenmoleküle in die für die Massenspektrometrie günstige Ammonium
form überführt werden können.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Nukleinsäuren aus Lösungen
isoliert werden, wobei unter dem Begriff Nukleinsäure auch deren Salze zu
verstehen sind. Die Bindung der Nukleinsäuren an die Oberfläche der
Festphase erfolgt bevorzugt reversibel und unspezifisch und ist somit nicht
durch spezielle hochaffine Bindepaare, wie etwa Streptavidin/Avidin, oder
auf Nukleinsäuren mit bestimmten Sequenzabschnitten begrenzt. Das
Verfahren ist technisch einfach durchzuführen und kann ohne großen
Aufwand automatisiert werden, so daß ein hoher Probendurchsatz bei
geringen Kosten möglich ist. Das Immobilisieren und auch das Eluieren der
Nukleinsäuren von der Oberfläche kann bei Raumtemperatur durchgeführt
werden. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß Nu
kleinsäuren mit hoher Ausbeute an besagte Oberflächen gebunden werden
können. Dies hat zur Folge, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
weniger Partikel pro Probe eingesetzt werden müssen als bei bekannten
Verfahren, wodurch eine weitere Vereinfachung und Kostenverringerung
erzielt werden kann.
Bevorzugt weist der mit der Lösung in Kontakt gebrachte Teil der ver
wendeten Festphase einen Anteil von ≧ 1%, insbesondere ≧ 5%
bevorzugt ≧ 10% und von ≦ 90%, insbesondere ≦ 50% und bevorzugt
≦ 30% an hydrophoben chemischen Oberflächengruppen auf. Dabei ist zu
beachten, daß ab einem gewissen Anteil an hydrophoben Oberflächengrup
pen, der für die jeweilige Festphase ohne weiteres vom Fachmann bestimmt
werden kann, ein Verklumpen von Festphasenpartikeln in wäßriger Lösung
auftritt, mit der Folge, daß die Festhase nicht mehr resuspendierbar ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden kleine, insbesondere magnetische
Partikel eingesetzt, die auf ihrer Oberfläche funktionelle, hydrophobe
Gruppen, wie etwa Alkyl- oder Arylgruppen tragen, verwendet, woran
Nukleinsäuren unspezifisch und reversibel gebunden werden können.
Günstigerweise werden aus der Umkehrphasenchromatographie bekannte
funktionelle Gruppen verwendet, da deren Immobilisierung und Handhabung
gut verstanden und etabliert ist.
Es ist auch möglich, eine Festphase mit mehreren, voneinander z. B. durch
inerte Bereiche abgegrenzten aktiven Oberflächenbereichen zu verwenden,
um mehrere räumlich voneinander abgegrenzte Reagenzfelder bereitzustel
len.
Besagte Oberfläche auf der Festphase kann, sofern nicht vorhanden, durch
Derivatisierung oder durch Beschichtung bereitgestellt werden. Diese
Verfahrensweise hat den Vorteil, daß das Material für die Festphase frei
wählbar ist. Die hydrophoben chemischen Gruppen sind vorzugsweise
organische Kohlenwasserstoff-enthaltende Gruppen und können cyclische,
lineare oder/und verzweigte Strukturen aufweisen. Bevorzugt trägt die
Oberfläche C1-C30-Alkylgruppen, oder C5-C30-Arylgruppen, insbesondere C6-
C24-Alkylgruppen als funktionelle, hydrophobe Gruppen. Besonders
bevorzugt werden die Alkylgruppen ausgewählt aus C8-Alkyl, C18-Alkyl und
Mischungen davon, wobei Octadecyl-Liganden am meisten bevorzugt sind.
Neben hydrophoben Gruppen weist die Oberfläche weiterhin hydrophile
chemische Gruppen, z. B. Hydroxyl- oder/und Oxidgruppen, auf, die ggf. bei
einer der unten genannten Vor- bzw. Zwischenbeschichtungen bereits
vorhanden sein können. Wie oben ausgeführt neigen insbesondere kleine
Partikel mit ausschließlich hydrophober Oberfläche zum Verklumpen in
wäßrigen Lösungen. Dieses Problem kann vermieden werden, indem den
funktionellen hydrophoben Gruppen hydrophile Gruppen, insbesondere
Hydroxylreste zur Seite gestellt werden. Die Hydroxylgruppen können
anorganische Hydroxylgruppen, z. B. Kieselsäuregruppen, oder/und
organische Hydroxylgruppen, z. B. Mono- oder Polysaccharide wie Agarose,
umfassen. Weitere geeignete hydrophile Gruppen umfassen Carbonyl-, Car
boxyl-, Ester-, Amino-, Thiol-, Sulfat-, Sulfonyl- und ähnliche Gruppen und
Kombinationen solcher Gruppen. Auch Polyolderivate, wie etwa Polyalkylen
glykolderivate können als hydrophile Gruppen eingesetzt werden.
Die Anordnung und das Verhältnis von hydrophoben und hydrophilen
Gruppen in dem zur Anbindung der Nukleinsäuren vorgesehenen Bereich der
Oberfläche wird so eingestellt, daß die jeweiligen Partikel in wäßriger
Lösung gerade nicht mehr verklumpen, die Bindung der Nukleinsäure aber
noch wirksam stattfindet. Die funktionellen Gruppen sowie deren Anord
nung können vom Fachmann den jeweiligen Parametern, wie etwa der
Partikelgröße, der Partikeldichte, dem Analyten etc. angepaßt ausgewählt
werden. Es ist beispielsweise möglich, die hydrophilen Gruppen in von den
hydrophoben Gruppen abgegrenzten, separaten Mikrobereichen aufzubrin
gen. Bevorzugt ist jedoch eine "Mischoberfläche", in der die hydrophoben
und hydrophilen Gruppen nebeneinander vorliegen. Die hydrophilen Gruppen
können auch durch geeignet substituierte organische Moleküle, z. B.
Hydroxy-substituierte Alkyle eingebracht werden. Ein Beispiel für eine
bevorzugte Mischoberfläche ist eine Alkyl/OH-Oberfläche, insbesondere eine
C18-Alkyl/OH-Oberfläche.
Besagte Oberflächen können direkt oder mittels einer Vor- oder Zwischenbe
schichtung auf die Festphase aufgebracht sein. Geeignete Vorbeschichtun
gen sind beispielsweise eine Polykieselsäurematrix oder/und eine Monosac
charidmatrix. Andere geeignete Vorbeschichtungen sind Partner eines
spezifischen Bindepaares, beispielsweise Streptavidin/Avidin, auf die dann
die eigentliche aktive Schicht aufgebracht wird. Die Bindung der hydropho
ben oder/und hydrophilen Gruppen an die Festphase bzw. die Bindung der
hydrophoben oder/und hydrophilen Beschichtung an die Vorbeschichtung
und die Bindung der Vorbeschichtung an die Festphase kann z. B. kovalent,
z. B. durch Veresterung, adsorptiv oder über hochaffine Wechselwirkungen
erfolgen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine
Vorbeschichtung bestehend aus Polykieselsäure und Monosaccharid auf
eine Festphase, beispielsweise γ-Eisenoxidpartikel mit einem Durchmesser
im Nanometer- oder Mikrometerbereich aufgebracht. Diese Vorbeschichtung
wird dann mit hydrophoben Gruppen, insbesondere Alkylgruppen und ggf.
auch mit hydrophilen Gruppen, ausgestattet. Besonders gute Ergebnisse
wurden mit Partikeln erhalten, die 10 bis 15% Alkylgruppen, insbesondere
Octadecylgruppen pro Kieselsäure-Matrix (mol/mol) und 0,2‰ Octadecyl
gruppen pro Monosaccharid-Einheit (mol/mol) aufweisen.
Als Festphase kann jede dem Fachmann bekannte Festphase verwendet
werden, wie etwa Mikrotiterplatten, Gefäße, wie etwa Eppendorf-Gefäße,
Greiner tubes, Nung Röhrchen etc. Bevorzugt werden als Festphase
Feststoffpartikel mit einem Durchmesser ≧ 1 nm bis ≦ 1 mm eingesetzt,
wodurch eine günstige spezifische Oberfläche pro Gramm Partikel zugäng
lich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den Einsatz verschieden
ster Festphasenmaterialien. Bevorzugt wird als Festphasenmaterial Silica,
ein Kunststoff wie etwa Polystyrol, oder ein magnetisches oder magnetisier
bares Material verwendet und insbesondere γ-Eisenoxid.
Wenn eine magnetische Festphase verwendet wird, können weitere Vorteile
erhalten werden. Eine Magnetseparation ist relativ einfach durchzuführen
und kann leicht automatisiert werden. Wenn paramagnetische oder para-
und ferromagnetische Partikel als Festphase verwendet werden, kann
zudem ein Zusammenklumpen der Feststoffpartikel weiter vermindert
werden. Üblicherweise werden für die magnetische Partikeltechnologie (z. B.
der Firma Dynal, Oslo, Norwegen) kleine magnetische Partikel mit einem
Durchmesser im nm- oder µm-Bereich verwendet, bei welchen das Problem
des Verklumpens besonders stark ist. Die erfindungsgemäße Aufreinigung
kann aber ohne Verklumpen durchgeführt werden, da den hydrophoben
Gruppen in ausreichender Zahl hydrophile Gruppen, insbesondere Hydroxyl
gruppen zur Seite gestellt werden.
Die Anbindung von Nukleinsäuren bzw. deren Salzen an besagte Oberfläche
wird erfindungsgemäß durch einen Bindepuffer vermittelt. Dieser Bindepuf
fer enthält ein Salz sowie Polyethylenglykol. Als Salz wird bevorzugt ein
Alkali-, Erdalkali- oder/und Ammoniumsalz verwendet, welches als Kation,
insbesondere ein Li-, Na-, K-, Rb-, Cs-, Fr-, Be-, Mg-, Ca-, Sr-, Ba-, Ra-
oder/und NH4-Ion enthält. Als Anion enthält das erfindungsgemäß ver
wendete Salz bevorzugt ein Halogenidanion, insbesondere ein Chloridanion.
Das verwendete Polyethylenglykol (PEG) weist bevorzugt eine mittlere
Molmasse von 1000 bis 20000 g/Mol, insbesondere von 6000 bis
15000 g/Mol auf.
Da die Viskosität mit steigendem PEG-Gehalt zunimmt, wird dem Bindepuf
fer bevorzugt ein Alkohol, insbesondere Methanol, Ethanol, Propanol
und/oder Butanol, besonders bevorzugt Ethanol oder/und 2-Propanol
zugegeben. Der Alkoholgehalt im Bindungspuffer kann bis zu 50 Gew.-%
betragen, bevorzugt 30 bis 40 Gew.-%.
Im allgemeinen wird für das erfindungsgemäße Verfahren das Salz
bevorzugt in einer Konzentration von ≦ 5 mmol/l, insbesondere von 5
mmol/l bis 4 mol/l, insbesondere bis zu 3 mol/l und das Polyethylenglykol
bevorzugt in einer Konzentration von 5 bis 40%, eingesetzt. Die angegebe
nen Konzentrationen an Salz und PEG sind finale Konzentrationen und
beziehen sich auf die Bindungsbedingungen, d. h. auf das endgültige
Gemisch, das Probe und Bindungspuffer und ggf. weitere Verdünnungsmit
tel, wie etwa Wasser, umfaßt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, DNA über einen
großen Molmassenbereich zu immobilisieren und aufzureinigen. Es ist
sowohl möglich, nur wenige Basen große Einzelstrang-DNA aufzureinigen
als auch mehrere 100 kb große Doppelstrang-DNA, insbesondere BACs,
PACs und dgl.
Nukleinsäuren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigt
werden können, umfassen z. B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, RNA,
LNA sowie Nukleinsäure-Protein-, Nukleinsäure-PNA- und Nukleinsäure-
Zucker-Adukte oder Komplexe. Bevorzugt werden Nukleinsäuren immobili
siert, bei denen es sich um Amplifikationsprodukte, beispielsweise aus einer
PCR-Reaktion, handelt oder die durch Amplifikation mit Hilfe von Zellen, z. B.
mittels einer Übernacht-Kultur, erhalten wurden oder um Sequenzierreak
tionsprodukte, Primer-Extensionsreaktionsprodukte, Ligasekettenreaktions
produkte, Restriktionsendonukleaseverdauprodukte, etc. Es können aber
auch synthetisch hergestellte Nukleinsäuren gebunden werden.
Anhand der Konzentration der Bestandteile, insbesondere von Salz und PEG,
läßt sich die selektive Anbindung der Einzel- und Doppelstrang-Nukleinsäu
ren an besagte Oberfläche einstellen. Dabei kann eine Selektivität ≧ 70%,
insbesondere ≧ 80% und besonders bevorzugt ≧ 90% erzielt werden. Bei
einer Konzentration an einwertigen Kationen von 0,5 bis 4 mol/l, zweiwerti
gen Kationen ≦ 5 mmol/l und PEG ≦ 15 Gew.-% binden selektiv ds-
Nukleinsäuren ≧ 80 bp auch in Gegenwart von ss-Nukleinsäuren. Die
Anbindung von ss-Nukleinsäuren gelingt durch Einstellen der Konzentration
zweiwertiger Kationen < 5 mmol/l und < 100 mmol/l und PEG von 10 bis
30 Gew.-%. Die Kombination beider Methoden ermöglicht die selektive
Aufreinigung von ss- und ds-Nukleinsäuren. Doppelstrang-Nukleinsäuren
lassen sich durch Einstellen der Salz- und PEG-Konzentrationen innerhalb der
zuvor genannten Bereiche auch nach Größe fraktionieren. Für kleine
Nukleinsäuren, insbesondere DNA, hat sich die Verwendung einer finalen
Kombination an PEG von 15-40% (Gew./Gew.) und einem Salzgehalt von
10 bis 1000 mmol/l als vorteilhaft erwiesen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren umfassend die Schritte
- a) Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung,
- b) Inkontaktbringen der Nukleinsäure enthaltenden Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberflä che aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykol, wobei die Nukleinsäure an die Oberfläche gebunden wird,
- c) Abtrennen der Festphase von der Lösung und
- d) gegebenenfalls Ablösen der Nukleinsäure von der Festphase.
Bei der bevorzugten Verwendung einer magnetischen Festphase ist das
Abtrennen der Festphase von der Lösung durch magnetische Mittel möglich
und kann somit leicht automatisiert werden.
Die Festphase wird bevorzugt einmal vor ihrem Einsatz gewaschen.
Abhängig von Anwendung und Oberfläche kann z. B. zum Waschen der mit
Wasser (bevorzugt 1 : 1) verdünnte Bindungspuffer (BP) verwendet werden.
Es kann auch eine Lösung von 0,5 mol/l EDTA pH 8-9 eingesetzt werden.
Wenn eine anschließende Analyse der Probe beabsichtigt ist, kann es
sinnvoll sein, die Festphase mit mehreren Puffern zu waschen, u. a. auch mit
einem Ammoniumacetat-Puffer.
Eine weitere Verbesserung der Aufreinigung kann dadurch erhalten werden,
daß die abgetrennte Festphase, an deren Oberfläche die Nukleinsäure
gebunden ist, mit einer Pufferlösung gewaschen wird, welche an die
Festphase gebundene Verunreinigungen, nicht aber an die Festphase
gebundene Nukleinsäure löst. Die Zusammensetzung der Waschlösung wird
in Abhängigkeit der Anwendung und der Oberfläche ausgewählt. Als
Waschlösung geeignet ist z. B. 50-70% (vol/vol) Ethanol oder 2-Propanol,
ggf. mit Zusätzen von EDTA, CDTA und TRIS in millimolaren Konzentratio
nen. Falls die Probe anschließend mit Massenspektrometrie analysiert
werden soll, ist die Verwendung einer Ammoniumacetat enthaltenden
Waschlösung in wenigstens einem Waschschritt bevorzugt, z. B. 0,05 bis
5 mol/l Ammoniumacetat in 60 bis 80% Ethanol. Oftmals ist es auch
vorteilhaft, zur Aufreinigung mehrere Waschschritte mit unterschiedlichen
Waschpuffern durchzuführen.
Die auf besagter Oberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle bzw. deren
Salze werden bevorzugt mittels einer Elutionslösung abgetrennt, wobei als
Elutionslösung jede Flüssigkeit verwendet werden kann, die die Nukleinsäure
wieder von der Festphase ablöst. Die Wahl der Elutionslösung hängt von der
Art der verwendeten Oberfläche und des Analyten sowie von der nachfol
genden Verwendung des Analyten ab. Bevorzugt werden als Elutionslösung
bidestilliertes Wasser, pH 7 bis 8, eine wäßrige TRIS Lösung mit einer TRIS-
Konzentration von 1 bis 100 mmol/l, bevorzugt mit einem pH-Wert von 7
bis 9, eine Formamidlösung, ein Loading Buffer für die Elektrophorese, eine
Matrixlösung, z. B. 3-Hydroxypicolinsäure in Wasser (1-200 mmol/l) für
MALDI-MS etc. verwendet.
Eine magnetische Festphase kann nach Ablösung der Nukleinsäure
wiederum mit magnetischen Mitteln abgetrennt werden, wodurch eine
vollständige Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht
werden kann.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren isolierten oder/und aufgereinigten
Nukleinsäuren können unmittelbar für eine weitere Analyse, z. B. eine
Massenspektrometrie (MS)-Analyse verwendet werden. Die bisherige
aufwendige manuelle Reinigung über Säulen ist nicht erforderlich. Vielmehr
ist es möglich, eine hohe Anzahl von Proben kostengünstig und schnell für
eine MS-Analyse, insbesondere eine MALDI-MS-Analyse oder eine ESI
(Elektrospray-lonisation)-MS-Analyse automatisch aufzureinigen. Dabei
können insbesondere Begleitstoffe, wie etwa Puffersubstanzen, Metall
kationen, Primerüberschüsse, Peptide, Lipide, Detergentien und dgl. entfernt
werden. Vorteilhafterweise wird die Nukleinsäure zur Durchführung einer
MALDI-MS-Analyse in die Ammoniumform übeführt, z. B. durch einen
Ionenaustausch Na+ gegen NH4 +, der durchgeführt werden kann, während
die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden sind. Die Art der erfindungs
gemäßen Anbindung ermöglicht also eine Reinigungsprozedur, d. h. die
Nukleinsäure liegt in zugänglicher Form und nicht als Präzipitat vor. Für eine
Analyse mit MALDI-MS sind insbesondere kleine DNA-Moleküle von
Interesse. Erfindungsgemäß ist die Aufreinigung von kleinen DNA Molekülen
oberhalb einer Mindestgröße von ca. 5 Nukleotiden, insbesondere ≧ 10
Nukleotiden möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die bei
der MALDI-MS-Analyse störenden Komponenten, wie etwa Puffersubstan
zen und Metallkationen sowie evtl. vorhandene Primerüberschüsse effektiv
abgetrennt. Die DNA-Moleküle werden zudem in die für eine MALDI-MS-
Analyse kompatible Ammoniumform überführt und können wahlweise in
reinem Wasser oder in einer wässrigen Matrixlösung eluiert werden und
somit direkt auf das MALDI-Target transferiert werden. Eine Modifikation
der Zusammensetzung der Bindungs- und Waschpuffer und der sequentielle
Einsatz von Partikeln erlaubt es auch, größere DNA-Moleküle von der
Aufreinigung auszuschließen, wodurch selektiv ein vorbestimmter Molmas
senbereich ausgewählt werden kann, z. B. ≧ 60 bp und ≦ 100 bp.
Durch Variation der Salz- und PEG-Konzentration ist es auch möglich, kleine
Oligonukleotide, wie etwa Primer (ssDNA), Primer-Extensionsprodukte,
effizient für eine Analyse mit MALDI-MS aufzureinigen.
Ein weiterer Vorteil ist der breite Volumenbereich, in dem mit dem
erfindungsgemäßen Verfahren gearbeitet werden kann. Es sind Volumina
von ml- bis zum oberen nl-Bereich möglich, insbesondere von < 10 ml,
bevorzugt < 1 ml und besonders bevorzugt < 100 µl und ≧ 100 nl,
bevorzugt ≧ 1 µl. Der Volumenbereich kann für die jeweilige Applikation
eingestellt werden, wobei bei kleinem Volumen eine konzentrierte Probe
erhalten wird.
Weiterhin ist es möglich, erfindungsgemäß angebundene Nukleinsäuren
nach bekannten Verfahren zu sequenzieren. Die Sequenzierungsbedingun
gen von bekannten Verfahren stellen oftmals Elutionsbedingungen dar, d. h.
während der eigentlichen Sequenzierung ist die Nukleinsäure dann nicht an
die Festphase gebunden. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, für die
Aufreinigung der Sequenzierprodukte nach Abschluß der Sequenzierreaktion
wieder Anbindungsbedingungen, insbesondere durch Zugabe geeigneter
Puffer einzustellen. Für die Sequenzierungsreaktion und anschließende
Aufreinigung braucht die Festphase, insbesondere Beads, nicht abgetrennt
werden. Es hat sich herausgestellt, daß die Festphasen, insbesondere
Partikel, oftmals das zur Sequenzierung oft verwendete Thermocycling nicht
unbeschadet überstehen. In einem solchen Fall werden nach der Sequenzier
reaktion neue, unverbrauchte Beads zugegeben.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Synthetisierung von
Nukleinsäuren, wobei erfindungsgemäß gebundene Nukleinsäuren nach
bekannten Verfahren um mindestens 1 Nukleotid verlängert werden. Ein
Beispiel für eine solche Reaktion ist die sog. Primer Extension Reaction, also
die Verlängerung eines Primers (ssDNA) um mindestens 1 Nukleotid. Die
Verlängerung kann durchgeführt werden, während die Nukleinsäure an die
Festphase gebunden ist. Da aber auch bei der Verlängerung von Nu
kleinsäuren oftmals Bedingungen eingestellt werden, die Elutionsbedingun
gen entsprechen, kann auch hier das Verlängern stattfinden, während die
Nukleinsäure nicht an die Festphase gebunden ist und die Anbindung der
verlängerten Nukleinsäure dann anschließend dadurch wieder erreicht
werden, daß nach der Verlängerungsreaktion Bindungsbedingungen,
beispielsweise durch Pufferzugabe eingestellt werden. Die Festphase
braucht während der gesamten Reaktion nicht abgetrennt zu werden.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten Nukleinsäu
ren können auch verwendet werden, um selektiv weitere, nachzuweisende
Moleküle, beispielsweise Nukleinsäuren oder DNA-bindende Proteine zu
binden und können deshalb in entsprechenden Assays eingesetzt werden.
Somit umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweis eines
Analyten in einer Probe, wobei man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung
mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile chemische Gruppen
aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt
bringt, wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden,
anschliessend die gebundene Nukleinsäure aufweisende Festphase mit der
Probe in Kontakt bringt und den Analyten über die Bindung an die gebunde
nen Nukleinsäuremoleküle nachweist.
Schließlich umfaßt die Erfindung auch einen Reagenzienkit zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens, der einen Salz und Polyethylenglykol
enthaltenden Bindepuffer und eine Festphase, deren Oberfläche hydrophobe
und hydrophile Gruppen aufweist. Bevorzugt enthält ein solcher Reagenzien
kit zusätzlich Wasch- und Elutionspuffer.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die beigefügten Figuren und
folgenden Beispiele weiter erläutert.
Fig. 1 (bestehend aus Fig. 1a und 1b) zeigt ein Agarosegel von
erfindungsgemäß aufgereinigten PCR-Produkten sowie von
PCR-Produkten, die unter Verwendung von COOH-beschichte
ten Partikeln aufgereinigt wurden:
Fig. 1a zeigt einen Ausbeutevergleich unter Verwendung eines NH4Cl-
Bindepuffers (links) sowie eines NaCl-Bindepuffers (rechts) für
erfindungsgemäß aufgereinigte PCR-Produkte (C18/OH-Beads)
sowie für PCR-Produkte, die unter Verwendung von COOH-
beschichteten Partilen aufgereinigt wurden (COOH-Beads).
Fig. 1b zeigt einen weiteren Ausbeutevergleich mit NH4Cl-Bindepuffer.
Fig. 2 (bestehend aus Fig. 2a, 2b und 2c) zeigt die Isolierung und
Aufreinigung von ssDNA und dsDNA mit dem erfindungsge
mäßen Verfahren für eine MALDI-MS-Analytik:
Fig. 2a zeigt das MALDI-Flugzeitmassenspektrum von erfindungs
gemäß aufgereinigten PCR-Produkten mit 47 bzw. 48 Basen
paaren.
Fig. 2b zeigt das MALDI-Flugzeitmassensepktrum eines erfindungs
gemäß aufgereinigten PCR-Produktes mit 80 bp.
Fig. 2c zeigt das MALDI-Flugzeitmassenspektrum eines erfindungs
gemäß aufgereinigten 24 Nukleotide langen DNA Einzel
strangs.
Bei MALDI werden bevorzugt einfach geladene Molekülionen der Spezies
(M + H)+, und daneben mit verringerter Häufigkeit auch doppelt geladene
Molekülionen der Spezies (M + 2H)2+ gebildet. PCR-Produkte werden bei der
MALDI-Massenspektrometrie, sofern nicht besondere Maßnahmen ergriffen
werden, aufgetrennt und in Form der Einzelstränge detektiert. Die Signale
zueinander komplementärer Einzelstränge werden oft aufgrund geringer
Massenunterschiede nur partiell aufgelöst. Die Größe der PCR-Produkte läßt
sich dennoch durch Vergleich der gemessenen mittleren Massen mit
abgeschätzten oder aufgrund von bekannten Sequenzen berechneten
Werten bestimmen. Die (M + H)+-Signale nicht abgetrennter Primer würden
in den Spektren an den mit den Pfeilen gekennzeichneten Positionen
registriert werden.
Magnetische Partikel, deren Oberfläche hydrophobe und hydrophile Gruppen
aufweist, werden zunächst dreimal mit 150 µl EDTA-Lösung (0,5 mol/l, pH
8) durch magnetische Separation der Partikel und Verwerfen des Überstan
des gewaschen. Nach dem letzten Waschen werden die Partikel in EDTA-
Lösung aufgenommen und vermischt. Die Massenkonzentration beträgt 20
mg/ml.
Die zu untersuchenden Proben werden in einer Mikrotiterplatte (z. B. 96 well)
vorgelegt. Zu 40 µl Probevolumen werden 40 µl Bindungspuffer (2,5 mol/l
NaCl, 20% (Gew./Gew.) PEG6000) und 10 µl der Partikelsuspension
zugegeben, vermischt und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert.
Die Mikrotiterplatte mit den Proben wird anschließend für 2 min in eine
Magnethalterung gestellt, der Überstand verworfen und die Partikel zweimal
mit 150 µl Waschpuffer (40% Ethanol) gewaschen und anschließend an
Luft 2 bis 5 min getrocknet.
Schließlich wird die Mikrotiterplatte aus dem Magnethalter entnommen und
die Partikel in 20 ml Elutionspuffer (1 mmol/l Tris-HCL) resuspendiert und
5 min inkubiert. Die Mikrotiterplatte wird dann wiederum in die Magnethalte
rung gestellt und das Eluat nach 2 min abgenommen.
Die im Eluat enthaltene DNA konnte ohne weitere Aufreinigung für
Konzentrationsbestimmungen, zu DNA-Sequenzierung usw. verwendet
werden.
Zellen aus einer Übernachtkultur wurden pelletiert und der Überstand
verworfen. Das Zellpellet wurde in 40 µl Resuspendierungspuffer (50 mmol/l
Tris-HCl, pH 8,10 mmol/l EDTA, 100 µg/ml RNAse A) aufgenommen und
vermischt. Dann wurden 40 µl Lysepuffer (200 mmol/l NAOH, 1%
(Gew./Gew.) SDS) zugegeben und vermischt. Nach Zugabe von 40 µl
Neutralisierungspuffer (3 mol/l KOAc, pH 5,5) und Vermischen wurde 15
min bei 13.000 U/min zentrifugiert.
Der Überstand wurde in eine frische Mikrotiterplatte transferiert. Erfindungs
gemäße magnetische Partikel wurden dreimal mit 150 µl EDTA-Lösung (0,5
mol/l pH 8) durch magnetische Separation der Partikel und Verwerfen des
Überstandes gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden die Partikel in
EDTA-Lösung aufgenommen und vermischt. Die Massekonzentration betrug
20 mg/ml.
Zu 120 µl Probevolumen wurden 120 µl Bindungspuffer (2,5 mol/l NaCl,
20% (Gew./Gew.) PEG 6000) und 10 µl der Partikelsuspension zugegeben.
Nach M schen des Ansatzes wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Mikrotiterplatte mit den Proben wurde anschließend für 10 min in eine
Magnethalterung gestellt, der Überstand verworfen und die Partikel zweimal
mit 120 µl Waschpuffer (70% Ethanol, 10 mmol/l Tris-HCl, pH 8,1 mmol/l
EDTA) gewaschen und anschließend an der Luft 5 min getrocknet.
Die Mikrotiterplatte wurde dann aus dem Magnethalter genommen und die
Partikel in 50 µl Elutionspuffer (1 mmol/l Tris-HCL, pH 8) resuspendiert, 5
min inkubiert und die Platte dann wieder in den Magnethalter gestellt und
das Eluat nach 2 min abgenommen.
Die im Eluat enthaltene DNA konnte ohne weitere Aufreinigung für
Konzentrationsbestimmungen, DNA-Sequenzierung usw. verwendet werden.
Fig. 1 zeigt das Agarosegel von aufgereinigten 100 bp PCR-Produkten. Die
Aufreinigung wurde zum einen gemäß der Erfindung und zum anderen unter
Verwendung von COOH-beschichteten Partikeln (vgl. US-Patent 5,705,628)
durchgeführt. Den PCR-Produkten wurden vor der Aufreinigung 100 µmol
einer 32 Nukleotide großen ssDNA zugegeben. Wie man aus der Abbildung
des Agarose-Gels sehen kann, wurde die gewünschte Nukleinsäure in
gereinigter Form erhalten und unerwünschte Substanzen inklusive der 32
Nukleotide ssDNA abgetrennt. Weiterhin ist die Ausbeute beim erfindungs
gemäßen Verfahren deutlich höher als den COOH-beschichteten Partikeln.
Zur Aufreinigung von Doppelstrang DNA (vgl. Fig. 2a und 2b) wurden
PCR-Reaktionen jeweils in 40 µl Reaktionsvolumina in 96iger Titerplatten
durchgeführt. Magnetische Partikel wurden vor Gebrauch magnetisch
separiert, wobei überstehende Lösung abpipetiert und die Partikel in einem
Aliquot des Bindungspuffers resuspendiert wurden. Nach Abschluß der Am
plifikationsreaktion wurden zu jedem Reaktionsgefäß 5 µl der Suspension
der magnetischen Partikel zugegeben, gefolgt von 50 µl Bindungspuffer und
zwar für die PCR-Produkte mit 47/48 bp (vgl. Fig. 2a): 1,5 M
NH4Cl/40 mM MgCl2 in 40% (Gew./Gew.) PEG 6000/60% (Gew./Gew.)
H2O und für das PCR Produkt mit 80 bp: 2,5 M NH4Cl in 30% (Gew./-
Gew.) PEG 6000/70% (Gew./Gew.) H2O.
Die resultierende Suspension wurde gut durchmischt und 10 min stehenge
lassen. Danach wurden die Partikel magnetisch separiert, der Überstand
abpipetiert und durch 105 µl 65% (vol/vol) Ethanol/35% (vol/vol) H2O
(Waschlösung 1) ersetzt. Durch Umsetzen der Gefäße wurden die magneti
schen Partikel zweimal durch die Waschlösung bewegt. Anschließend wurde
der Überstand nacheinander durch 115, 125 und 135 µl 1,5 M Ammonium
acetat in 30% (vol/vol) H2O, 70% (vol/vol) Ethanol ersetzt, wobei die
Partikel jeweils fünfmal durch die neue Waschlösung 2 bewegt wurden. Die
Überstände wurden jeweils verworfen. Schließlich wurden die Partikel
zweimal mit 145 µl 80% (vol/vol) Ethanol/20% (vol/vol) H2O (Waschlö
sung 3) gewaschen, wobei die Partikel jeweils zweimal durch die Lösung
bewegt wurden. Nach Abpipettieren des letzten Überstandes wurden die
Partikel zum Abdampfen des verbliebenen Ethanols 10 min an Luft stehen
gelassen. Anschließend wurden die Partikel in 5 µl 1 mM Tris-HCl, pH 7,5
(Elutionslösung) resuspendiert. Nach 10 min wurden die Partikel magnetisch
abgetrennt und 0,5 µl des Überstandes auf einen frischgereinigten MALDI-
Probenträger überführt und dort mit 0,5 µl Matrixlösung (200 mM 3-
Hydroxypicolinsäure in 30% (vol/vol) Acetonitril/70% H2O (vol/vol))
vermischt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde die Probe in einen
Bruker Reflex II MALDI-Flugzeitmassenspektrometer analysiert.
Zur Aufreinigung der Einzelstrang-DNA (vgl. Fig. 2c) wurden 10 µmol eines
24 Nukleotide langen Oligodeoxyribonukleotids in 40 µl PCR-Reaktions
lösung vorgelegt und hierzu 5 µl der Suspension der magnetischen Partikel
(in Bindepuffer) gegeben, gefolgt von 50 µl Bindepuffer (1,5 M
NH4Cl/40 mM MgCl2 in 35% (Gew./Gew.) PEG 6000/30% (vol/vol)
Ethanol. Die Waschprozedur unterschied sich von der obigen darin, daß die
erste Waschung ausgelassen wurde und die Waschlösung 2 durch 100 mM
Ammoniumacetatin 30% (vol/vol) H2O/70% (vol/vol) Ethanol ersetzt wurde.
Die Elution und anschließende Analyse des aufgereinigten Produkts wurden
wie oben beschrieben durchgeführt.
Claims (26)
1. Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, die
hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in
Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht
wird, wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß besagte Oberfläche Alkyl- oder Arylgruppen als hydrophobe
Gruppen aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Alkylgruppen ausgewählt werden aus C8-Alkyl, C18-Alkyl und
Mischungen davon.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Oberfläche Hydroxylgruppen als hydrophile Gruppen
aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der Festphase um Festpartikel handelt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Festphase magnetisch ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem Salz um ein Alkali-, Erdalkali- oder/und Ammoni
umhalogenid handelt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Polyethylenglykol mit einer mittleren Molmasse von 1000 bis
20000 g/mol zugegeben wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Salz in einer finalen Konzentration von ≦ 5 mmol/l bis 4
mol/l verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß Polyethylenglykol in einer finalen Konzentration von 5 Gew.-% bis
40 Gew.-% verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der Nukleinsäure um Amplifikationsprodukte handelt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß selektiv Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäuren gebunden
werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure in einem Bereich von ≧ 5 Nukleotide bis ≦
1000 Nukleotide selektiv hinsichtlich der Größe gebunden wird.
15. Verfahren zur Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren
umfassend die Schritte
- a) Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung,
- b) Inkontaktbringen der Nukleinsäure enthaltenden Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Poly ethylenglykol, wobei die Nukleinsäure an die Oberfläche gebunden wird,
- c) Abtrennen der Festphase von der Lösung und
- d) gegebenenfalls Ablösen der Nukleinsäure von der Festphase.
16. Verfahren nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Festphase magnetisch ist und das Abtrennen der Festphase
von der Lösung durch magnetische Mittel erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß die in Schritt (c) abgetrennte Festphase mit einer Pufferlösung
gewaschen wird, welche an die Festphase gebundene Verunreinigun
gen, nicht aber an die Festphase gebundene Nukleinsäuren löst.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ablösen der Nukleinsäure in Schritt (d) mittels einer
Elutionslösung durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß von der Festphase abgelöste Nukleinsäure und die Festphase mit
magnetischen Mitteln getrennt werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß die gewonnene Nukleinsäure einer massenspektrometrischen
Analyse unterzogen wird.
21. Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure
umfassend die Schritte:
- a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 und
- b) Sequenzieren der Nukleinsäure nach bekannten Verfahren.
22. Verfahren nach Anspruch 21, weiterhin umfassend den Schritt
- a) Aufreinigung der Sequenzierungsprodukte.
23. Verfahren zur Synthetisierung von Nukleinsäuren umfassend die
Schritte
- a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 und
- b) Verlängern der Nukleinsäure um mindestens ein Nukleotid nach bekannten Verfahren.
24. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase,
die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist,
in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontrakt bringt,
wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden, an
schließend diese Festphase mit der Probe in Kontakt bringt und den
Analyten über die Bindung an die gebundenen Nukleinsäuren nach
weist.
25. Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 24 umfassend:
- a) einen Bindepuffer, der ein Salz und ein Polyethylenglykol enthält und
- b) eine Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist.
26. Reagenzienkit nach Anspruch 25,
weiterhin umfassend,
- a) einen Elutionspuffer, mit dem an diese Oberfläche gebundene Nukleinsäure abgelöst werden können,
- b) einen Waschpuffer, mit dem an die Festphase gebundene Verunreinigungen abgetrennt werden können.
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US10/069,974 US7022835B1 (en) | 1999-09-10 | 2000-09-08 | Method for binding nucleic acids to a solid phase |
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DE (2) | DE19943374A1 (de) |
WO (1) | WO2001019980A1 (de) |
Cited By (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10253351A1 (de) * | 2002-11-08 | 2004-05-27 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren |
EP1623039A2 (de) * | 2003-05-13 | 2006-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Verfahren zur schnellen reinigung von nukleinsäuren für die anschliessende massenspektrometrische analyse mittels lösungseinfang |
WO2006034294A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US7714275B2 (en) | 2004-05-24 | 2010-05-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7741036B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-06-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US7781162B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-08-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
US7956175B2 (en) | 2003-09-11 | 2011-06-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
US8026084B2 (en) | 2005-07-21 | 2011-09-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US8071309B2 (en) | 2002-12-06 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
US8097416B2 (en) * | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8158936B2 (en) | 2009-02-12 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
US8163895B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-04-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of orthopoxviruses |
US8182992B2 (en) | 2005-03-03 | 2012-05-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
US8298760B2 (en) | 2001-06-26 | 2012-10-30 | Ibis Bioscience, Inc. | Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent thereby |
US8407010B2 (en) | 2004-05-25 | 2013-03-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
US8563250B2 (en) | 2001-03-02 | 2013-10-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identifying bioagents |
US8871471B2 (en) | 2007-02-23 | 2014-10-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic DNA analysis |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
US9149473B2 (en) | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
WO2015188994A1 (de) | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur anreicherung und/oder aufreinigung von nukleinsäuren |
WO2016193490A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Qiagen Gmbh | Method for separating dna by size |
US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
US9890408B2 (en) | 2009-10-15 | 2018-02-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
US10745686B2 (en) | 2013-02-08 | 2020-08-18 | Qiagen Gmbh | Method for separating DNA by size |
CN112427027A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-03-02 | 南京瑞贝西生物科技有限公司 | 一种氨基化磁性微球的制备方法及应用 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0207975D0 (en) * | 2002-04-05 | 2002-05-15 | Genovision As | Isolating nucleic acid |
WO2004042058A2 (de) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren |
US20060240412A1 (en) * | 2003-09-11 | 2006-10-26 | Hall Thomas A | Compositions for use in identification of adenoviruses |
US20100035239A1 (en) * | 2003-09-11 | 2010-02-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
US20070190526A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-08-16 | Nexgen Diagnostics Llc | Methods of extracting nucleic acids |
CA2658105C (en) | 2006-08-01 | 2016-07-05 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nonspecific target capture of nucleic acids |
US20100204266A1 (en) * | 2007-03-23 | 2010-08-12 | Ibis Biosciences, INC | Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents |
US20090048439A1 (en) * | 2007-08-06 | 2009-02-19 | Weisburg William G | Isolation of nucleic acids molecules using modified solid supports |
US20110060135A1 (en) * | 2007-11-29 | 2011-03-10 | New England Biolabs, Inc. | Selective Purification of Small RNAs from Mixtures |
GB2455780A (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Zainulabedin Mohamedali Saiyed | Nucleic acid separation |
WO2011041695A1 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Determination of methylation status of polynucleotides |
TWI407994B (zh) | 2009-10-22 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 分離核酸的方法、試劑及套組 |
US9587263B2 (en) | 2014-03-26 | 2017-03-07 | General Electric Company | Isothermal amplification under low salt condition |
US10143220B2 (en) | 2014-08-15 | 2018-12-04 | Corn Products Development, Inc. | Pet food having modified waxy cassava starch |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993025709A1 (en) * | 1992-06-09 | 1993-12-23 | Medical Research Council | Preparation of nucleic acids |
US5705628A (en) * | 1994-09-20 | 1998-01-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | DNA purification and isolation using magnetic particles |
WO1999058664A1 (en) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8302483L (sv) | 1983-05-02 | 1984-11-03 | Pharmacia Ind | Forfarande vid rening av biologiskt aktiva substanser |
NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
ATE184879T1 (de) * | 1992-07-02 | 1999-10-15 | Edge Biosystems Inc | Verfahren und material für reinigung von nukleinsäuren |
US5668268A (en) * | 1995-11-27 | 1997-09-16 | Hybridon, Inc. | Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis |
-
1999
- 1999-09-10 DE DE19943374A patent/DE19943374A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-09-08 US US10/069,974 patent/US7022835B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-08 WO PCT/EP2000/008807 patent/WO2001019980A1/de active IP Right Grant
- 2000-09-08 EP EP00958528A patent/EP1214406B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-08 AT AT00958528T patent/ATE406440T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-08 DE DE50015331T patent/DE50015331D1/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993025709A1 (en) * | 1992-06-09 | 1993-12-23 | Medical Research Council | Preparation of nucleic acids |
WO1993025912A2 (en) * | 1992-06-09 | 1993-12-23 | Medical Research Council | Automated preparation of nucleic acids |
US5705628A (en) * | 1994-09-20 | 1998-01-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | DNA purification and isolation using magnetic particles |
WO1999058664A1 (en) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Chem.Abstr. 110 (1989) 227883d * |
Chem.Abstr. 124 (1996) 77645a * |
Chem.Abstr. 125 (1996) 137219x * |
Cited By (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8017322B2 (en) | 2001-03-02 | 2011-09-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US8268565B2 (en) | 2001-03-02 | 2012-09-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identifying bioagents |
US8563250B2 (en) | 2001-03-02 | 2013-10-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identifying bioagents |
US8802372B2 (en) | 2001-03-02 | 2014-08-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US8265878B2 (en) | 2001-03-02 | 2012-09-11 | Ibis Bioscience, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US9752184B2 (en) | 2001-03-02 | 2017-09-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US8214154B2 (en) | 2001-03-02 | 2012-07-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US8815513B2 (en) | 2001-03-02 | 2014-08-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7741036B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-06-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US7781162B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-08-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8017743B2 (en) | 2001-03-02 | 2011-09-13 | Ibis Bioscience, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US8017358B2 (en) | 2001-03-02 | 2011-09-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US9416424B2 (en) | 2001-03-02 | 2016-08-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8298760B2 (en) | 2001-06-26 | 2012-10-30 | Ibis Bioscience, Inc. | Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent thereby |
US8921047B2 (en) | 2001-06-26 | 2014-12-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent thereby |
US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US8380442B2 (en) | 2001-06-26 | 2013-02-19 | Ibis Bioscience, Inc. | Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent thereby |
DE10253351A1 (de) * | 2002-11-08 | 2004-05-27 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren |
DE10253351B4 (de) * | 2002-11-08 | 2007-02-22 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren |
US9725771B2 (en) | 2002-12-06 | 2017-08-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8822156B2 (en) | 2002-12-06 | 2014-09-02 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8071309B2 (en) | 2002-12-06 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
JP2012132924A (ja) * | 2003-05-13 | 2012-07-12 | Ibis Biosciences Inc | 後の質量分析法を用いた分析のために、溶液捕獲によって核酸を迅速に精製する方法 |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
EP1623039A2 (de) * | 2003-05-13 | 2006-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Verfahren zur schnellen reinigung von nukleinsäuren für die anschliessende massenspektrometrische analyse mittels lösungseinfang |
US8476415B2 (en) | 2003-05-13 | 2013-07-02 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
EP1623039A4 (de) * | 2003-05-13 | 2006-04-12 | Isis Pharmaceuticals Inc | Verfahren zur schnellen reinigung von nukleinsäuren für die anschliessende massenspektrometrische analyse mittels lösungseinfang |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
JP2007516425A (ja) * | 2003-05-13 | 2007-06-21 | アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 後の質量分析法を用いた分析のために、溶液捕獲によって核酸を迅速に精製する方法 |
US7956175B2 (en) | 2003-09-11 | 2011-06-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8013142B2 (en) | 2003-09-11 | 2011-09-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
US8097416B2 (en) * | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8163895B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-04-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of orthopoxviruses |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8187814B2 (en) | 2004-02-18 | 2012-05-29 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US9447462B2 (en) | 2004-02-18 | 2016-09-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
US7714275B2 (en) | 2004-05-24 | 2010-05-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US8987660B2 (en) | 2004-05-24 | 2015-03-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US9449802B2 (en) | 2004-05-24 | 2016-09-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US8173957B2 (en) | 2004-05-24 | 2012-05-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US8407010B2 (en) | 2004-05-25 | 2013-03-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
US9873906B2 (en) | 2004-07-14 | 2018-01-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
WO2006034294A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
US8182992B2 (en) | 2005-03-03 | 2012-05-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
US8026084B2 (en) | 2005-07-21 | 2011-09-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
US8551738B2 (en) | 2005-07-21 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for rapid identification of nucleic acid variants |
US9149473B2 (en) | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
US8871471B2 (en) | 2007-02-23 | 2014-10-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic DNA analysis |
US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8252599B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-08-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US9023655B2 (en) | 2008-09-16 | 2015-05-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
US9027730B2 (en) | 2008-09-16 | 2015-05-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
US8609430B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-12-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
US8158936B2 (en) | 2009-02-12 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
US8796617B2 (en) | 2009-02-12 | 2014-08-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
US9165740B2 (en) | 2009-02-12 | 2015-10-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
US9890408B2 (en) | 2009-10-15 | 2018-02-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
US10745686B2 (en) | 2013-02-08 | 2020-08-18 | Qiagen Gmbh | Method for separating DNA by size |
DE102014211221A1 (de) | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren |
WO2015188994A1 (de) | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur anreicherung und/oder aufreinigung von nukleinsäuren |
WO2016193490A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Qiagen Gmbh | Method for separating dna by size |
CN112427027A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-03-02 | 南京瑞贝西生物科技有限公司 | 一种氨基化磁性微球的制备方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7022835B1 (en) | 2006-04-04 |
DE50015331D1 (de) | 2008-10-09 |
ATE406440T1 (de) | 2008-09-15 |
WO2001019980A1 (de) | 2001-03-22 |
EP1214406A1 (de) | 2002-06-19 |
EP1214406B1 (de) | 2008-08-27 |
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