DE19948473A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Messen an in einer flüssigen Umgebung befindlichen Zellen - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren und eine Vorrichtung dienen zum Messen an in einer flüssigen Umgebung (66) befindlichen Zellen (60), bei dem jede Zelle (60) mit einer Unterseite (68) ihrer Membran (62) auf einer Oberfläche (48) positioniert wird, wobei die Oberfläche (48) von einem Kanal (40) durchsetzt ist, in dem zum Ansaugen der Zelle (60) ein Unterdruck (70) eingestellt wird. Die Zelle (60) wird ferner über mindestens eine Elektrode (50) elektrisch abgefragt, die von der Zelle (60) beabstandet angeordnet ist. Der Unterdruck (70) wird vorzugsweise zum Aufreißen der Membran (62) pulsartig eingestellt, so, daß das von der Membran (62) umschlossene Zellinnere (64) mit dem Kanal (40) verbunden wird (Fig. 4).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen an in einer flüssigen Umgebung befindlichen Zellen, bei dem jede Zelle mit einer Unterseite ihrer Membran auf einer Oberfläche positio­ niert wird, wobei die Oberfläche von mindestens einem Kanal durchsetzt ist, in dem zum Ansaugen der Zelle an die Oberfläche ein Druckgefälle eingestellt wird und ferner die Zelle über mindestens einer Elektrode elektrisch abgefragt wird.

Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zum elektrischen Messen an in flüssiger Umgebung befindlichen Zellen, mit einem Substrat, das von einem Kanal durchsetzt ist, oberhalb dessen eine Zelle mit ihrer Unterseite ihrer Membran auf einer Ober­ fläche des Substrates positionierbar ist, wobei Mittel zum Er­ zeugen eines Druckgefälles entlang des Kanals vorgesehen sind und eine erste Elektrode zur elektrischen Abfragung der Zelle vorgesehen ist.

Ein Verfahren und eine Vorrichtung der vorstehend genannten Art sind aus der DE 197 12 309 A1 bekannt.

Es ist bekannt, zum Untersuchen von biologischen Zellen soge­ nannte Mikroelektrodenanordnungen einzusetzen. Die Mikro­ elektrodenanordnungen dienen dabei z. B. zum Stimulieren der Zellen oder zum Ableiten von Potentialen. Die Untersuchungen können dabei in einer biologischen Umgebung durchgeführt werden oder auch in einer artifiziellen Umgebung. Die Anordnungen um­ fassen hierzu in einem Trägerkörper eine Vielzahl von Mikro­ elektroden, deren Abmessungen etwa in der Größenordnung der Zellen liegen, also im Bereich von einigen µm bis einige zehn µm. Eine Mikroelektrodenanordnung dieser allgemeinen Art ist z. B. aus der WO 97/05922 bekannt.

Bei herkömmlichen Mikroelektrodenanordnungen ist man mehr oder weniger auf den Zufall angewiesen, ob die eine oder die andere Zelle sich auf einer bestimmten Elektrode niederläßt oder nicht. In der Praxis lassen sich die Zellen im allgemeinen nur unter teilweiser Überdeckung auf einer Elektrode nieder, so daß die Stimulation der Zelle bzw. die Ableitung eines Zellpotenti­ als auf diese Teilfläche beschränkt ist. Darüber hinaus sitzen die Zellen nur lose auf den Elektroden auf. Dies kann zu Problemen hinsichtlich des Abdichtwiderstandes zur Referenz­ elektrode führen. Auch können Zellen außerhalb des Bereichs ei­ ner Elektrode zu liegen kommen, so daß sie bei der Messung nicht erfaßt werden.

Bei der aus der eingangs genannten DE 197 12 309 A1 bekannten Mikroelektrodenanordnung werden diese Nachteile dadurch vermie­ den, daß die Zellen in Mikroküvetten eingefangen werden, an de­ ren Boden sich eine Elektrode befindet. Die Elektrode ist mit einem zentralen Kanal versehen, in dem über geeignete Verbin­ dungskanäle, die unterhalb der Elektroden verlaufen, ein Unter­ druck erzeugt werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, ein­ zelne Zellen zielgerichtet an die Elektroden heranzuziehen und sie unter einem gewissen Kontaktdruck auf den Elektroden zu fixieren. Es können dann Messungen an den Elektroden, jedoch nur von deren Außenseite her, durchgeführt werden.

Aus einem anderen Fachgebiet, der sogenannten Patch-Clamp- Technik, ist es bekannt, Zellen an einer Pipette mit Unterdruck anzusaugen (vgl. US-Z "NATURE", Vol. 260, Seiten 799-801, 1976). Bei der Patch-Clamp-Technik muß jedoch die Pipette ge­ zielt an eine einzelne Zelle herangeführt werden. Bei der Patch-Clamp-Technik werden die zu kontaktierenden Zellen nicht bewegt, da sie in der Regel an einem Substrat anhaften. Das herkömmliche Kontaktieren von Zellen mit Patch-Clamp-Pipetten hat jedoch den Nachteil, daß die Anzahl gleichzeitig kontak­ tierbarer Zellen äußerst beschränkt ist, da aus Platzgründen nicht beliebig viele Pipetten in die Kulturkammer eingeführt werden können.

Die Patch-Clamp-Technik hat andererseits gegenüber der weiter oben beschriebenen Technik, bei der lediglich von der Außen­ seite der Zelle her Messungen möglich sind, den Vorteil, daß das Zellinnere in die Messung mit einbezogen werden kann.

Bei der konventionell angewandten Patch-Clamp-Technik mit Ein­ zelpipetten wird dies unter mikroskopischer Beobachtung dadurch bewirkt, daß eine fragile Glaspipette mittels eines Mikro­ manipulators an eine auf einem Substrat haftende einzelne Zelle herangeführt und die Membran vorsichtig an die Pipettenöffnung angesaugt wird. Es besteht daher ein direkter Kontakt zwischen Glas- und Membranoberfläche. Dadurch wird ein Membranfleck gegenüber der umgebenden Flüssigkeit abgedichtet und elektrisch isoliert. Diese Isolation wird auch als "Gigaseal" bezeichnet. Von dieser "Cell-Attached-Konfiguration" gelangt man zur soge­ nannten "Whole-Cell-Konfiguration", indem man die abgedichtete Membran weiter angesaugt. Dies geschieht derart, daß das Mem­ branstück unterhalb der Pipette durchbrochen wird. Auf diese Weise entsteht ein hydraulisch und elektrisch abgedichteter Zu­ gang über die Pipettenöffnung zum Zellinneren. Die restliche Zellmembran ist damit als Ganzes elektrisch zugänglich (sogenannter "whole cell patch"). Die Anwendung dieser herkömm­ lichen Methode erfordert jedoch ein gehöriges Maß an Erfahrung und Fingerspitzengefühl. Mehrere Zellen können nur sequentiell bearbeitet werden. Diese Methode ist daher ungeeignet für Mas­ senuntersuchungen, wie sie z. B. im Bereich des Pharmascreening, des Substanzscreening und dergleichen erforderlich wären.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art dahingehend ei­ terzubilden, daß die vorstehend genannten Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll die Erfindung möglichst konsistente Messungen vorzugsweise parallel an einer Mehrzahl von Zellen ermöglichen, insbesondere wie es im Bereich des experimentellen und anwendungsorientierten Screenings der Wirkung von pharma­ zeutischen Wirkstoffen auf zellulärer Ebene gewünscht wird.

Bei einem Verfahren gemäß der eingangs genannten Art wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Unterseite der Membran durch eine Erhöhung des Druckgefälles aufgerissen wird und/oder die Membran durch Zugabe von porenbildenden Substanzen oder durch einen elektrischen Stromimpuls mikroporös und elek­ trisch niederohmig gemacht wird oder aufgerissen wird.

Bei einer Vorrichtung gemäß der eingangs genannten Art wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe dadurch gelöst, daß mindestens eine zweite Elektrode von der ersten Elektrode in Richtung des Kanals beabstandet angeordnet ist.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei­ se vollkommen gelöst.

Die Erfindung ermöglicht es, im Vergleich zu herkömmlichen Patch-Clamp-Techniken, auf das diffizile Manipulieren einer fragilen Glaspipette zu verzichten, da die Funktion der her­ kömmlichen Glaspipette durch den Kanal in einem Substrat ausge­ übt wird, an den ein Unterdruck angelegt wird, um eine Cell- Attached-Konfiguration einzustellen. Hat sich auf diese Weise ein Megaseal zwischen der Zellwand und der Oberfläche, an die die Zelle angesaugt wird, eingestellt, so wird erfindungsgemäß entweder die Unterseite der Membran durch eine Erhöhung des Un­ terdrucks aufgerissen, so daß nunmehr Messungen über den Kanal durch das von der Membran umschlossene Zellinnere durchgeführt werden können. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die Mem­ bran durch Zugabe von porenbildenden Substanzen mikroporös und elektrisch niederohmig gemacht werden. Durch die Zugabe solcher porenbildender Substanzen, wie etwa Nystatin oder Amphotericin B werden in der Membran Poren gebildet, so daß ein niederohmi­ ger Zugang zum Zellinnern ermöglicht wird, durch den jedoch keine größeren Moleküle diffundieren können. Somit können die resultierenden Membranströme gemessen werden, ohne daß hierzu die Unterseite der Membran zerstört werden muß. Alternativ kann die Membran in diesem Bereich auch durch einen kurzzeitigen elektrischen Impuls durchlässig gemacht werden oder aufgerissen werden.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß die Meße­ lektrode räumlich entfernt von der Membran angebracht werden kann, so daß die Zelle nicht mit ihrer Membran unmittelbar auf der Elektrode aufliegt, sondern die Messung über das intrazel­ luläre Medium erfolgt.

Während bei der bekannten Anordnung gemäß der DE 197 12 309 A1 nur extrazelluläre Messungen möglich sind, d. h. Messungen von durch Membranströme hervorgerufenen Potentialänderungen in un­ mittelbarer Umgebung der Zelle, können erfindungsgemäß intra­ zelluläre und extrazelluläre Messungen durchgeführt werden, d. h. es kann die über die Membran hinweg anliegende Spannung gemessen und kontrolliert werden. Bevorzugt wird zu diesem Zweck ein Strom in die Membran injiziert.

Die Erfindung eignet sich daher in besonderem Maße für Massen­ untersuchungen im Bereich des Pharmascreening und des Substanz­ screening, der Identifizierung von Klonen (CVO's) und im Rahmen von Substanzoptimierungen, wobei das Zytoplasma biologischer Zellen elektrisch gemessen wird, und zwar gleichzeitig oder un­ mittelbar sequentiell für eine Vielzahl derartiger Zellen. Die Erfindung eröffnet daher erstmalig die Möglichkeit, eine Tech­ nik mit denselben Vorteilen herkömmlicher Patch-Clamp-Techniken in vollautomatisierter Weise einzusetzen. Es können daher viele derartige Zellen parallel, automatisierbar und mit hohem Durch­ satz untersucht werden.

In bevorzugter Weiterbildung der Erfindung wird das Druckgefäl­ le zum Aufreißen der Membran pulsartig erhöht.

Durch diese Maßnahme wird es ermöglicht, auf kontrollierte Wei­ se von der Cell-Attached-Konfiguration zur Whole-Cell- Konfiguration zu gelangen.

Grundsätzlich ist es möglich, eine Mehrzahl von Kanälen in ei­ nem gemeinsamen Substrat vorzusehen und mit Hilfe des Unter­ druckes Zellen an die Oberfläche des Substrates an den Mündun­ gen der Kanäle anzusaugen.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird die Zelle jedoch auf dem Boden einer Mikroküvette positioniert.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß in kontrollierter Weise über jedem Kanal ein flüssiges Medium mit einer Pipette oder dergleichen eingebracht werden kann, daß die zu untersuchenden Zellen beinhaltet. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von Mikroküvetten, die sich in einem gemeinsamen Träger befinden, gleichzeitig über je einen einer Mikroküvette zugeordneten Ka­ nal und zumindest je eine Meßelektrode gemessen werden.

Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem als Meßgröße des elektri­ schen Signals der Strom (I_st) durch das Zellinnere der Zelle verwendet wird und/oder das elektrische Potential an den Elek­ troden gemessen wird.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens wird die Zelle über eine Elektrode, die in Richtung des Kanals von der Unterseite der Membran beabstandet ist, elek­ trisch abgefragt. Hierzu kann ein Strom in das Zellinnere inji­ ziert werden.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß ein direkter elektrischer Zugang nur in das Innere der Zelle hergestellt wird. Dadurch, daß die Zelle mit ihrer Außenmembran dicht auf dem Boden der Mikroküvette aufliegt und dort sogar mittels Unterdruck fixiert wird, entsteht in automatisierter Weise der aus der herkömm­ lichen Patch-Clamp-Technik bekannte Gigaseal, d. h. ein extrem hoher und daher die Messung wenig beeinflussender Leckwider­ stand zwischen Intrazellulär- und Extrazellulärmedium. Dadurch, daß die Elektrode sich räumlich entfernt vom Gigaseal befindet, ist ferner gewährleistet, daß die Zelle selbst nur mit elek­ trisch isolierenden Materialien in Verbindung kommt, so daß die Aufrechterhaltung des Gigaseals gewährleistet ist.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens wird in einer Anordnung mit einer Vielzahl von Kanälen der Druckimpuls oder der elektrische Stromimpuls gleichzeitig an alle Kanäle angelegt. Es ist jedoch alternativ auch möglich, die Druckimpulse bzw. Stromimpulse nacheinander an einzelne ausgewählte Kanäle anzulegen, sei es in beliebiger Reihenfolge oder in streng sequentieller Vorgehensweise.

Diese Maßnahmen haben den Vorteil, daß nahezu beliebige Experi­ mente an einer Vielzahl von Zellen automatisiert ausgeführt werden können, so daß sehr viele Meßergebnisse pro Zeit erzielt werden.

In bevorzugter Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zusammensetzung des intrazellulären flüssigen Mediums nach dem Öffnen der Membran oder der Erzeugung von Mikroporen durch Zugabe von Substanzen verändert oder das intrazelluläre flüssige Medium ausgetauscht. Hierzu kann der Kanal mit zwei oder mehr getrennten Verbindungskanälen verbunden werden, wobei einer mit Elektrolyt gefüllt wird, der sich in seiner Zusammen­ setzung derjenigen des Zytoplasmas (Intrazellulärflüssigkeit) ähnelt oder eine spezielle Flüssigkeit mit Wirkstoffzusätzen ist.

Auf diese Weise wird eine gezielte und kontrollierte Beeinflus­ sung des intrazellulären Mediums ermöglicht und gleichzeitig das mögliche Spektrum von durchführbaren Messungen erheblich vergrößert.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist mindestens eine zwei­ te Elektrode von der ersten Elektrode in Richtung des Kanals beabstandet angeordnet.

In bevorzugter Weiterbildung sind Mittel zur Steuerung des Druckgefälles vorgesehen, sowohl zur Erzeugung eines statischen Druckgefälles zur Einstellung einer Cell-Attached-Konfigu­ ration, als auch zur pulsartigen Erhöhung des Druckgefälles zum Aufreißen der Unterseite der Membran.

Auf diese Weise kann einerseits die Einstellung des Megaseals auf zuverlässige und kontrollierte Weise erreicht werden und andererseits der Megaseal aufrechterhalten werden, während durch einen kurzen Druckimpuls die Unterseite der Membran auf­ gerissen wird und sich an die Kanalwandung anlegt. Dabei ist die Steuerung vorzugsweise so ausgelegt, daß der statische Unterdruck ständig aufrechterhalten wird (Offset-Druck), so daß der Megaseal auch bei der Whole-Attached-Konfiguration auf­ rechterhalten wird.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vor­ richtung ist die Elektrode an dem von der ersten Elektrode ab­ gewandten Ende des Kanals angeordnet.

Dabei kann die Elektrode das abgewandte Ende des Kanals ring­ förmig umgeben.

Diese Maßnahmen haben den Vorteil, daß die Elektrode in einfa­ cher Weise in eine Mikrostruktur integriert werden kann, indem sie auf der Unterseite der Schicht ausgebildet wird, in der der Kanal verläuft.

Bei einer anderen Variante der Erfindung ist die Elektrode hin­ gegen im Abstand vom abgewandten Ende des Kanals angeordnet.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die Elektrode, wie noch zu erläutern sein wird, gegenüber dem Kanal auch beweglich ange­ ordnet sein kann, so daß mit derselben Elektrode nacheinander mehrere Zellen vermessen werden können.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist der Kanal an seinem der ersten Elektrode abgewandten Ende über Ventile mit einer Mehrzahl von Kanälen verbunden, über die Flüssigkeit zu- oder abführbar ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß durch entsprechende Kon­ trolle der Druckverhältnisse in den Verbindungskanälen das Zellinnere nach Ausbildung der Whole-Cell-Konfiguration, d. h. nach Durchbrechen der Membran, mit Intrazellulär-Flüssigkeit in Kontakt kommt.

In zusätzlicher Weiterbildung der Erfindung ist über dem Substrat eine Mikroküvette angeordnet, in deren Boden eine Öff­ nung vorgesehen ist.

Auf diese Weise läßt sich die Flüssigkeit in einer insbesondere für Massenuntersuchung geeigneten Weise oberhalb des Substrates speichern, indem der Kanal oder die Kanäle vorgesehen sind. Hierbei können die Zellen durch eine geeignete trichterförmige Ausbildung der Mikroküvette unmittelbar bis in die Nähe einer Kanalmündung einer Substratoberfläche geführt werden. Auf al­ ternative Weise kann die Öffnung im Boden der Mikroküvette je­ doch auch einen deutlich größeren Durchmesser haben, so daß ei­ ne Führung der Zelle bis zur Mündung des Kanals im wesentlichen durch den angelegten Unterdruck erreicht wird. Dies erleichtert die Herstellung der erfindungsgemäßen Struktur.

Ferner ist es bevorzugt, eine Vielzahl von Kanälen in einem ge­ meinsamen Substrat anzuordnen.

Hierdurch ist eine kompakte Bauweise bei einfacher Herstellung erreichbar.

Dabei sind ferner bevorzugt eine Vielzahl von Mikroküvetten in einer Platte angeordnet.

Hierdurch ergibt sich der Vorteil, daß parallele oder sequenti­ elle Messungen an vielen Zellen in einfacher Weise vorbereitet werden können, weil sich alle Mikroküvetten in einer gemeinsa­ men Platte befinden.

Bei Ausführungsformen der Erfindung, die eine gemeinsame Platte für die Mikroküvetten verwenden, ist weiterhin bevorzugt, wenn die Platte mehrschichtig aufgebaut ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, den unterschiedlichen Anforde­ rungen an die verschiedenen Elemente der Platte durch geeignete Werkstoffwahl Rechnung tragen zu können.

Dies gilt insbesondere dann, wenn bei einer Fortbildung dieser Variante die Platte eine obere Schicht, eine mittlere Schicht und eine Unterschicht umfaßt, wobei in der oberen Schicht die Mikroküvetten angeordnet sind, die mittlere Schicht das Substrat mit den Kanälen bildet und in der Unterschicht Verbin­ dungskanäle, die zu den Kanälen führen, angeordnet sind, sowie in einer bevorzugten Ausführungsform elektrische Zuleitungen, die zu den Kanälen führen, und Mikroelektroden angeordnet sind.

Diese Dreiteilung der Platte hat den Vorteil, daß für die drei wesentlichen Funktionen jeweils einzelne Schichten unterschied­ licher Dicke und unterschiedlicher Materialien eingesetzt wer­ den können.

Gemäß einer weiteren Ausführung der Erfindung ist das Substrat mit einer Unterschicht verbunden, die aus einer oder mehreren Schichten aus photostrukturierbaren Materialien besteht, die eine räumliche Führung von Verbindungskanälen erlauben, die zu den Kanälen führen.

Hierbei kann die Unterschicht auf einen Glasträger aufgebracht sein.

Durch diese Maßnahmen wird eine besonders kompakte Bauweise und eine einfache Herstellung ermöglicht. Als photostrukturierbare Materialien sind bestimmte Polymere, aber auch bestimmte Gläser bekannt.

Es ist bevorzugt, wenn die Verbindungskanäle eine Breite zwi­ schen 10 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 20 µm aufweisen.

Die Kanäle selbst haben bevorzugt eine lichte Weite von weniger als 10 µm, vorzugsweise von weniger als 5 µm.

Diese Maße haben sich im vorliegenden Zusammenhang als optimal erwiesen. Insbesondere wird dadurch, daß die lichte Weite der Kanäle geringer als der Zelldurchmesser ist, die Positionierung je einer Zelle auf einem Kanal unterstützt.

Wie bereits weiter oben angedeutet wurde, ist bei diesen Aus­ führungsformen der Erfindung besonders bevorzugt, wenn die Elektroden auf der Unterseite der mittleren Schicht oder der Oberseite der Unterschicht angeordnet sind.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die Elektroden samt ihren Zuleitungen durch einfaches Aufdrucken, Abscheiden, Aufdampfen und nachfolgende Mikrostrukturierung durch bekannte Verfahren (Photolitographie, Ätzverfahren, lift-off etc.) ausgebildet werden können.

Es ist in diesem Fall weiter bevorzugt, wenn die Elektroden in Draufsicht als quadratische Fläche mit einer Kantenlänge zwi­ schen 20 µm und 60 µm, vorzugsweise etwa 40 µm ausgebildet sind.

Wie bereits erwähnt, kann in diesem Fall vorgesehen sein, die zu den Elektroden führenden Leiterbahnen zwischen der mittleren und der unteren Schicht anzuordnen. Dies kann alternativ da­ durch geschehen, daß sie unten auf die mittlere oder oben auf die Unterschicht aufgetragen werden. Ein Auftrag auf die Unterseite der mittleren Schicht hat den Vorteil, daß die Lei­ terbahnen zusammen mit den Elektroden ausgebildet werden können, insbesondere auch mit demselben Werkstoff, insbesondere Edelmetall, vorzugsweise Gold.

Die Leiterbahnen haben dabei vorzugsweise eine Breite zwischen 5 µm und 30 µm, insbesondere etwa 10 µm.

Wie bereits erwähnt wurde, können bei einer mehrschichtigen Bauweise der Platte unterschiedliche Werkstoffe für die einzel­ nen Schichten verwendet werden.

Die verschiedenen Schichten können z. B. unabhängig voneinander aus Kunststoff, aus Polymethylmethacrylat (PMMA), Silikon, PTFE, Polyimid oder aus einem anorganischen Material, insbeson­ dere aus Glas, Keramik oder Silizium hergestellt werden.

Für das Substrat wird vorzugsweise Polyimid verwendet, das zu diesem Zweck als Folie eingesetzt wird, in der die Kanäle als Bohrungen ausgebildet sind. Das Substrat (die Folie) hat dann vorzugsweise eine Dicke zwischen 2 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 5 µm.

Für die untere Schicht wird vorzugsweise Glas verwendet. Im Glas, das in nahezu beliebiger Dicke zur Verfügung gestellt werden kann, um auf diese Weise auch die mechanische Stabilität sicherzustellen, können die notwendigen Verbindungskanäle und dergleichen in herkömmlicher Weise ausgebildet werden.

In zusätzlicher Weiterbildung der Erfindung ist es bevorzugt, das Substrat an der Unterseite einer Platte anzuordnen, in der eine Mehrzahl von Bohrungen als Mikroküvetten ausgebildet ist, in deren Boden Löcher vorgesehen sind, mit denen die Kanäle des Substrates zentriert sind.

Auf diese Weise läßt sich ein kombinierter Körper mit einer Vielzahl von Mikroküvetten, denen einzelne Kanäle und Elektro­ den zugeordnet sind, auf relativ einfache Weise herstellen.

Gemäß einer weiteren Ausführung der Erfindung ist eine Hydrau­ lik- und Meßeinheit vorgesehen, die eine zur Unterseite des Substrates hin offene Kammer aufweist, die an der Unterseite des Substrates derart positionierbar ist, daß die Kammer mit einem ausgewählten Kanal kommuniziert und nach außen abgedich­ tet ist, wobei die Kammer mindestens eine Elektrode enthält und mit mindestens einem Anschlußkanal verbindbar ist, der mit ei­ ner Unterdruckquelle verbunden ist.

Dabei kann ferner eine Verfahreinheit zum Verfahren und Posi­ tionieren der Platte und der Unterdruck- und Meßeinheit relativ zueinander vorgesehen sein.

Auf diese Weise kann eine einzige Meßeinheit zur sequentiellen Vermessung einer Vielzahl von Zellen verwendet werden, wodurch sich eine erhebliche Kostenersparnis ergeben kann.

Dabei können bevorzugt handelsübliche, herkömmliche Normraster­ platten (sogenannte "96-Loch-Platten", "384-Loch-Platten" oder ähnliche) verwendet werden. Diese brauchen lediglich nach unten hin durch das Aufbringen der mit Kanälen (Löchern) versehenen Folie abgeschlossen zu werden. Die Messungen an den vielen ein­ zelnen Zellen in den Bohrungen der Lochplatte werden nachfol­ gend sequentiell durch Verfahren der Unterdruck- und Meßeinheit oder umgekehrt durch Verfahren der Normrasterplatten in Bezug auf eine feststehende Unterdruck- und Meßeinheit durchgeführt. Diese erzeugt den Unterdruckimpuls zum Öffnen der Zelle und enthält auch die Elektrode, um die anschließende Messung durch das Zellinnere durchzuführen.

Hierbei kann wiederum, wie zuvor bereits erwähnt, die Kammer mit einer Mehrzahl von Anschlußkanälen über Ventile verbunden sein, um so das Zellinnere nach Ausbildung der Whole-Cell- Konfiguration mit Intrazellulärflüssigkeit in Kontakt zu bringen oder die Zusammensetzung der Intrazellulärflüssigkeit verändern zu können.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der bei­ gefügten Zeichnung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung darge­ stellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher er­ läutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine äußerst schematisierte perspektivische Ansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 2 einen Schnitt durch eine Mikroküvette der Anordnung gemäß Fig. 1, ebenfalls stark schematisiert;

Fig. 3 eine Draufsicht auf die Mikroküvette gemäß Fig. 2, in leicht verkleinertem Maßstab;

Fig. 4 einen Ausschnitt aus Fig. 2, in weiter vergrößertem Maßstab, zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens;

Fig. 5 eine Darstellung, ähnlich Fig. 3, darstellend den Stand der Technik;

Fig. 6 eine perspektivische Ansicht sowie einen vergrößer­ ten Ausschnitt daraus, eines weiteren Ausführungs­ beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; und

Fig. 7a) bis 7c) verschiedene Phasen beim Ansaugen einer Zelle, der Ausbildung einer Cell-Attached-Konfiguration und ei­ ner Whole-Cell-Konfiguration bei Verwendung von zwei Verbindungskanälen zu dem Kanal, in vereinfachter, schematischer Darstellung.

Beispiel 1

In den Fig. 1 bis 4 ist mit 10 eine Platte bezeichnet. In einer Oberfläche 11 der Platte 10 ist durch Abformen ein Raster von Mikroküvetten 12 ausgebildet. Die Mikroküvetten 12 sind dreidimensional und haben für die Kultur von Zellen geeignete Abmessungen. In einer Platte 10 können z. B. 8 × 12 = 96 Mikro­ küvetten 12 angeordnet sein.

Mit einem Pfeil 14 ist angedeutet, daß die Mikroküvetten 12 von oben befüllt werden können, und zwar mit einer Flüssigkeit, in der sich zu untersuchende Zellen befinden. Es ist dabei mög­ lich, die Mikroküvetten 12 jeweils individuell mit unterschied­ lichen Flüssigkeiten und Zellen zu befüllen.

Zum Ausführen der Messungen ist ein elektrisches Anschlußmodul 16 vorgesehen, das seitlich an die Platte 10 angedockt werden kann, wozu eine ausreichende Vielzahl von Steckern 18 vorgese­ hen ist. Die Stecker 18 stehen mit einem Netz von Leiterbahnen in Verbindung. Diese Leiterbahnen führen zu Elektroden, die im Bereich der Mikroküvetten 12 angebracht sind, wie dies noch er­ läutert werden wird. Vom elektrischen Anschlußmodul führt eine Datenleitung 20 zu einem Steuergerät 22.

Weiterhin ist ein hydraulisches Anschlußmodul 24 vorgesehen, das ebenfalls seitlich an die Platte 10 angedockt werden kann, und zwar mittels einer entsprechenden Vielzahl hydraulischer Stecker 26. Über das hydraulische Anschlußmodul 24 kann in vor­ bestimmter Weise, insbesondere individuell, unterhalb der Mikroküvetten 12 ein Unterdruck erzeugt werden, insbesondere mit gepulstem zeitlichem Verlauf, wie dies weiter unten noch ausführlich erläutert werden wird.

Zu diesem Zweck sind die hydraulischen Stecker 26 über ein Netzwerk von Verbindungskanälen und Öffnungen 49 am Boden der Mikroküvetten mit den Mikroküvetten 12 verbunden. Wenn alle Mikroküvetten 12 mit demselben Unterdruck beaufschlagt werden sollen, sind alle Verbindungskanäle parallel geschaltet und werden im hydraulischen Anschlußmodul 24 mit einer zentralen, gesteuerten Unterdruckquelle direkt verbunden. Wenn jedoch die einzelnen Mikroküvetten 12 mit jeweils individuellem Unterdruck angesteuert werden sollen, kann ebenfalls eine zentrale Unter­ druckquelle verwendet werden, die an das Netzwerk von Verbin­ dungskanälen angeschlossen ist, wobei sich dann in diesen Ver­ bindungskanälen individuell steuerbare Ventile befinden. Alter­ nativ können aber in den Verbindungskanälen auch miniaturisier­ te Pumpen, insbesondere Miniatur-Membranpumpen, angeordnet sein, die individuell angesteuert werden. Die elektrische An­ steuerung der Ventile und/oder Miniaturpumpen kann entweder über das elektrische Anschlußmodul 16 oder das hydraulische An­ schlußmodul 24 erfolgen. In jedem Fall führt eine Leitung 28 zum Ansteuern der vorerwähnten Elemente vom hydraulischen An­ schlußmodul 24 zum Steuergerät 22.

Das Steuergerät 22 steht seinerseits mit einem Multiplexer 30 in Verbindung, um in vorbestimmter Weise mehrere Messungen gleichzeitig oder gegebenenfalls sequentiell durchführen zu können.

Wie man aus Fig. 2 erkennt, besteht die Platte 10 im wesentli­ chen aus drei Schichten. Auf der Unterschicht 32 befindet sich eine mittlere Schicht oder ein Substrat 34, das als Folie aus­ gebildet ist. Eine obere Schicht 36 ist als Mikro­ strukturschicht ausgeführt. Die Unterschicht 32 besteht dabei vorzugsweise aus Glas. Das Substrat 34 ist vorzugsweise eine Polyimidfolie. Die Mikrostrukturschicht 36 besteht demgegenüber vorzugsweise aus Polymethylmethacrylat (PMMA).

In der Oberseite der Unterschicht 32 ist ein Verbindungskanal 38 ausgeführt. Der Verbindungskanal 38 dient zum individuellen Ansteuern der in Fig. 2 dargestellten Mikroküvette 12. Der Ver­ bindungskanal 38 steht über einen vertikalen Kanal 40 im Substrat 34 mit einer Öffnung 49 am Boden 48 der Mikroküvette 12 in Verbindung. Die Mikroküvette 12 ist an ihrer Oberseite mit einem zylindrischen Abschnitt 42 versehen, der mit einer Referenzelektrode 44 ausgekleidet ist. Die Referenzelektrode 44 ist an einen ersten elektrischen Anschluß 46 angeschlossen. Dieser liegt vorzugsweise auf Masse.

Unten an den zylindrischen Abschnitt 42 schließt sich ein trichterförmiger Abschnitt an, der den Boden 48 bildet, in dem die Öffnung 49 vorgesehen ist.

Eine Elektrode 50 ist näherungsweise ringförmig um das untere Ende des vertikalen Kanals 40 herum angeordnet. Sie ist zu die­ sem Zweck auf die Unterseite des Substrates 34 aufgebracht. Die Elektrode 50 ist an eine Zuleitung 52 angeschlossen, die zwi­ schen Unterschicht 32 und dem Substrat 34 verläuft. Die Zulei­ tung 52 kann z. B. zusammen mit der Elektrode 50 auf die Unter­ seite des Substrates 34 aufgedruckt, aufgedampft, abgeschieden oder dergleichen sein. Die Zuleitung 52 ist mit einem zweiten elektrischen Anschluß 54 verbunden.

Die Elektroden 46 und 50 bestehen aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl). Derartige Elektroden werden in der Fachwelt als "reversibel" oder als "nicht polarisierbar" bezeichnet. Sie ha­ ben den Vorteil, daß an den Zellen nicht nur Wechsel­ spannungsmessungen, also Messungen der Potentialspitzen (sog. "spikes") sondern auch Gleichspannungsmessungen möglich sind. Sie können auch zur Strominjektion verwendet werden.

Zwischen den Elektroden 46 und 50 wird die Meßspannung U_amp ge­ messen. Ferner kann über den zweiten Anschluß 54 parallel zur Spannungsmessung ein Stimulationsstrom I_st eingespeist werden.

Dies wird weiter unten anhand von Fig. 4 noch näher erläutert werden.

Wie man aus der Draufsicht gemäß Fig. 3 erkennen kann, sind mehrere Elektroden 12 in der Platte 10 in Form eines Rasters angeordnet, wobei das Rastermaß d zwischen 0,1 und 10 mm, vor­ zugsweise bei etwa 9 mm liegt.

Die Mikroküvetten 12 haben im Bereich ihres zylindrischen Ab­ schnitts 42 einen Innenradius r zwischen etwa 1 und 9 mm, vor­ zugsweise von etwa 7 mm, was eine leichte Befüllung erlaubt. Die lichte Weite x des vertikalen Kanals 40 beträgt weniger als 10 µm, vorzugsweise weniger als 5 µm.

Die Leiterbahnen 52 haben eine Breite b₁ zwischen 5 µm und 30 µm, vorzugsweise etwa 10 µm. Die Elektroden 50 sind in Drauf­ sicht vorzugsweise quadratisch ausgebildet und haben eine Kan­ tenlänge a zwischen 20 µm und 60 µm, vorzugsweise etwa 40 µm. Die Verbindungskanäle 38 haben einen Breite b₂ zwischen 10 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 20 µm.

Das Substrat 34 bzw. die Folie ist zwischen 2 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 5 µm dick.

Der Abstand 1 der Mikroküvetten 12 vom Rand der Platte 10 be­ trägt vorzugsweise mindestens 2 cm, wodurch ein hoher Shunt­ widerstand, d. h. eine elektrische Entkopplung der einzelnen Elektroden erreicht wird.

Die Elektrode 50 und die Leiterbahnen 52 bestehen vorzugsweise aus Gold.

In Fig. 2 ist noch angedeutet, daß in den Verbindungskanal 38 eine Mikropumpe 56 integriert sein kann, die mittels eines dritten Anschlusses 58 ansteuerbar ist. Mittels der Mikropumpe 56 oder mittels einer zentralen Unterdruckquelle, gegebenen­ falls unter Einschaltung von Ventilen in den Verbindungskanälen 38, kann ein Unterdruck mit gezieltem zeitlichem Verlauf in den Verbindungskanälen 38 eingestellt werden.

Fig. 4 zeigt in weiter vergrößertem Maßstab die Situation, wenn sich eine Zelle 60 auf dem Boden 48 der Mikroküvette 12 abge­ senkt hat. Dies geschieht entweder durch Schwerkraft oder ge­ zielt dadurch, daß durch Anlegen eines vorzugsweise konstanten Unterdrucks im Kanal 40 die Zelle 60 gezielt angesaugt wird. Die trichterförmige Gestalt des Abschnittes am Hoden 48 der Mikroküvette 12 bewirkt darüber hinaus eine Vereinzelung der Zellen, so daß im Regelfall nur eine einzige Zelle 60 auf der Öffnung 49 am Boden 48 der Mikroküvette 12 über dem Kanal 40 liegen wird.

In Fig. 4 ist die Außenhaut oder Membran der Zelle 60 mit 62 und das Zellinnere mit 64 bezeichnet. Die Zelle 60 befindet sich in einer umgebenden Flüssigkeit 66, die vorzugsweise auch die Verbindungskanäle 38 und die Kanäle 40 ausfüllt. Sie liegt mit ihrer Unterseite 68 auf dem Boden 49 auf.

Sobald diese Position erreicht ist, wird im Verbindungskanal 38 ein Unterdruckimpuls erzeugt, wie in Fig. 4 mit einem Pfeil 70 angedeutet. Dieser Unterdruckimpuls 70 ist so bemessen, daß die Unterseite 68 aufgerissen und nach Art eines Kragens 72 in den Kanal 40 hineingestülpt wird. Das Zellinnere 64 steht dann direkt mit dem Kanal 40 bzw. der darin befindlichen Flüssigkeit in Verbindung. Alternativ kann auch auf einen Unterdruckimpuls verzichtet werden und die Unterseite der Membran durch Zugabe von porenbildenden Substanzen, z. B. Nystatin oder Amphotericin B, durchlässig gemacht werden, so daß ein niederohmiger Zugang zum Zellinnern entsteht, jedoch keine größeren Moleküle hin­ durch diffundieren können.

In Fig. 4 ist ferner das elektrische Ersatzschaltbild der Zelle 60 eingezeichnet.

Mit R_M und C_M sind der Widerstand und die Kapazität der Membran 62 bezeichnet. R_s ist der Sealwiderstand, d. h. der Isolations­ widerstand zwischen Zellinnerem 64 und Extrazellulärmedium 66 außerhalb der Zelle 60. R_p ist der Widerstand zwischen dem Zel­ linneren 64 und der Elektrode 50, während R_k der Widerstand zwischen Elektrode 50 und Referenzelektrode 44 ist.

Dadurch, daß der Kragen 72 sich in den Kanal 40 hineinstülpt und an der Wand 48 anliegt, ohne jedoch die relativ weit ent­ fernte Elektrode 50 zu erreichen, hat R_s einen sehr hohen Wert ("Gigaseal").

Im stromlosen Zustand, wenn also über den Anschluß 54 und durch den Verbindungskanal 38 kein Strom fließt, entspricht die Span­ nung U_amp der an der Zellmembran anliegenden Membranspannung U_M. Kann hingegen über den Verbindungskanal ein endlicher Strom fließen, gilt die Beziehung:

d. h. die Membranspannung U_M ist proportional zur Spannung U_amp.

Im Falle des Einleitens eines Stimulationsstromes I_ST in den zweiten Anschluß 54 gilt für die Membranspannung U_M im statio­ nären Zustand die Beziehung:

für den Fall, daß R_k << R_p + R_s R_m/(R_s + R_m) ist. Diese Bedingung wird erfindungsgemäß durch ausreichend lange Verbindungskanäle mit geringem Kanalquerschnitt erreicht.

Auf die vorstehend beschriebene Weise wird also die Zelle 60 am Boden 48 der Mikroküvette 12 sowohl hydraulisch als auch elek­ trisch kontaktiert, indem über die Elektrolytlösung der erfor­ derliche Unterdruck und - durch zusätzliches Erzeugen eines Un­ terdruckimpulses 70 - der Öffnungsvorgang an der Zelle 60 be­ wirkt wird.

Vergleichsbeispiel

Um den Unterschied der erfindungsgemäßen Vorgehensweise zum Stand der Technik gemäß DE 197 12 309 A1 zu illustrieren, ist in Fig. 5 eine Darstellung ähnlich Fig. 4 gezeigt, die der be­ kannten Anordnung entspricht. Gleiche Elemente sind dabei mit gleichen Bezugszeichen versehen, wobei jeweils ein "a" hinzuge­ fügt wurde.

Wie man aus Fig. 5 deutlich erkennt, liegt bei diesem Stand der Technik die Zelle 60a unmittelbar auf der Elektrode 50a auf. Die Zelle 60a wird daher von außen, d. h. von der Außenseite der Membran 62a, elektrisch beaufschlagt. Der Kanal 40a dient bei diesem Stand der Technik ausschließlich dazu, durch Anlegen eines gewissen, geringen Unterdrucks die Zelle 60a an den Boden 48a anzuziehen und dort zu fixieren, wobei der Boden 48a im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung bei diesem Stand der Tech­ nik durch die Elektrode 50a gebildet wird.

Selbst wenn man bei diesem Stand der Technik über den Kanal 40a einen Unterdruckimpuls an die Zelle 60a legen und die Membran 62a öffnen würde (wovon in diesem Stand der Technik keine Rede ist), so würde sich ein Kragen 72a auf der Unterseite 68a der Zelle 60a bilden, der die Elektrode 50a im Bereich des Kanals 40a überdeckt. Trotz des Öffnens der Zelle 60a würde die Elek­ trode 50a somit immer noch keine direkte Messung durch das Zellinnere 64a ermöglichen, sondern auch weiterhin nur an der Außenseite der Membran 62a anliegen. Es würden daher die Mes­ sungen bei dieser Vorrichtung nach dem Stand der Technik auch bei einem Öffnen der Unterseite 68a der Zelle 60a nicht anders ablaufen als dort für den Fall beschrieben, bei dem der Unter­ druck nicht zu einem Öffnen der Zelle 60a führt.

Beispiel 2

Schließlich zeigt Fig. 6 noch ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Mit 80 ist in Fig. 6 eine Platte bezeichnet, die von an sich herkömmlicher Bauart ist. Platten 80 dieser Art werden als "96- Loch-Platte" bezeichnet. Sie enthalten 96 im Raster angeordnete vertikale zylindrische Bohrungen 84. Diese Bohrungen 84 können als Mikroküvetten eingesetzt werden. Die Platte 80 kann, wie in Fig. 6 rechts oben durch eine gestrichelte Linie angedeutet, auch mehrschichtig, insbesondere zweischichtig, aufgebaut sein. Ein Boden 82 der zylindrischen Bohrungen oder Mikroküvetten 84 wird durch ein als Folie ausgebildetes Substrat 86 gebildet, das unten auf die Platte 80 geklebt, geschweißt oder sonstwie gebondet ist. Das Substrat 86 enthält jeweils im Zentrum des Bodens 82 einen Kanal 88, der als Loch ausgebildet ist.

Im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel gemäß den Fig. 2 bis 4 befindet sich unterhalb des Substrates 86 kein Träger mit einem System von Verbindungskanälen. Statt des­ sen ist eine verfahrbare Hydraulik- und Meßeinheit 90 vorgese­ hen, die individuell von unten an die Unterseite 91 der Folie 86 herangeführt werden kann.

Die Einheit 90 umfaßt eine topfförmige Kammer 92, die an ihrer oberen Stirnseite mit einer Ringdichtung 94 versehen ist. Auf diese Weise kann die Kammer 92 dicht an die Unterseite 91 ange­ setzt werden, und zwar derart, daß die Vertikalachse der Kammer 92 mit der Achse jeweils eines Lochs 88 fluchtet.

Von der Kammer 92 führt eine Rohrleitung 96 zu einer nicht dar­ gestellten Unterdruckeinheit. Auf diese Weise kann in der Kam­ mer 92 ein Unterdruckimpuls erzeugt werden, wie mit einem Pfeil 98 angedeutet.

Am Boden der Kammer 92 ist eine Elektrode 100 angeordnet, die mit einem externen Anschluß 102 verbunden ist.

Mit 104 ist eine mehrachsige Verfahreinheit angedeutet. Die Verfahreinheit 104 gestattet es, die Hydraulik- und Meßeinheit 90 an der Unterseite 91 entlang zu führen, und zwar von Mikro­ küvette 84 zu Mikroküvette 84, um jeweils die Einheit 90 dann von unten dicht um das jeweilige Loch 88 herum an die Unter­ seite 91 anzupressen. Durch Beaufschlagen der Rohrleitung 96 mit einem Unterdruckimpuls 98 kann dann das gleiche Experiment durchgeführt werden, wie es weiter oben anhand Fig. 4 zum er­ sten Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wurde.

Das erste Ausführungsbeispiel der Erfindung gemäß den Fig. 2 bis 4 hat den Vorteil, daß eine kompakte Platte mit sämtlichen Verbindungskanälen zum Ansteuern der Mikroküvetten 12 zur Ver­ fügung steht, so daß ohne weitere Betätigungseinrichtungen, le­ diglich durch Ansteuern von Ventilen, Kontakten und dergleichen eine Vielzahl von Messungen sequentiell oder im Multiplex- Betrieb durchgeführt werden kann.

Das zweite Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 6 hat demgegenüber den Vorteil, daß eine handelsübliche Platte eingesetzt werden kann und daß der Aufwand für eine Unterschicht mit einer Viel­ zahl von Verbindungskanälen, Leiterbahnen und einzelnen Elek­ troden gespart wird.

Beispiel 3

In den Fig. 7a) bis c) ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung äußerst schematisch dargestellt, das im folgenden nä­ her erläutert wird.

Wiederum ist ein Substrat 110 vorgesehen, das beispielsweise aus einer Polyimid-Folie bestehen kann. In dem Substrat 110 ist eine Mehrzahl von Kanälen ausgebildet, von denen einer, der mit der Ziffer 122 bezeichnet ist, dargestellt ist. Oberhalb des Substrates 110 befindet sich eine Flüssigkeit, in der Zellen 112 vorhanden sind. Unterhalb des Kanals 122 ist eine Kammer 124 gebildet, die mit dem Kanal 122 kommuniziert und an deren Boden ähnlich wie bei der Ausführung gemäß Fig. 6 eine Elektro­ de 126 vorgesehen ist.

Im Unterschied zu den zuvor beschriebenen Ausführungen steht diese Kammer 124 jedoch nicht nur mit einem Verbindungskanal, sondern mit zwei Verbindungskanälen 130, 132, in Verbindung. Diese Verbindungskanäle 130, 132 sind über Ventile 118, 120 mit Flüssigkeitsreservoirs F₁ und F₂ verbindbar.

Es versteht sich, daß die Darstellung rein schematisch ist und daß die Verbindungskanäle 130, 132 z. B. in einer photopolimeri­ sierbaren Schicht ausgebildet sein können und daß die Ventile vorzugsweise an den äußeren Enden der Kanäle ausgebildet sind.

Ist nun, wie in Fig. 7a) dargestellt, das Ventil 120 geschlos­ sen und das Ventil 118 geöffnet, so führt das Anlegen eines Druckes P₁ an den Kanal 130, der geringer ist als der Druck P₀ in der Flüssigkeit 114 zur Ausbildung einer Strömung in Rich­ tung des Pfeiles 133 durch den Kanal 122 und den Zuführkanal 130. Dies führt dazu, daß die Zelle 112 angesaugt wird und sich auf die Oberfläche 128 des Substrates 110 oberhalb der Öffnung des Kanales 122 aufsetzt und bei Aufrechterhaltung des Unter­ druckes ein Megaseal ausbildet, so daß sich die Cell-Attached- Konfiguration einstellt.

Wird nunmehr gemäß Fig. 7b) das Ventil 120 geöffnet, wobei die Beziehung P₁ < P₂ < P₀ eingehalten wird, so füllt sich die Kam­ mer 124 mit intrazellulärem Medium aus dem Flüssigkeitreservoir F₂, während sich eine Strömung in Richtung des Pfeiles 134 aus dem Verbindungskanal 132 durch die Kammer 124 in den Zuführka­ nal 130 einstellt. Hierbei muß der Druck P₂ größer als der Druck P₁ sein, damit die Strömung in Richtung des Pfeiles 134 aus dem Verbindungskanal 132 zum Verbindungskanal 130 gerichtet ist; ferner müssen beide Drücke P₁ und P₂ geringer als der Druck P₀ in dem Extrazellulärmedium 114 sein, von dem die Zelle 112 umgeben ist.

Nunmehr wird in der nachfolgenden Phase gemäß Fig. 7c) das Ven­ til 118 geschlossen und ein pulsartiger Unterdruck an den Ver­ bindungskanal 132 angelegt, so daß P₂ sehr viel kleiner als P₀ wird (P₂ << P₀). Dadurch wird die Unterseite der Membran der Zelle 112, der Membranpatch, angesaugt und infolge der Unter­ druckstöße aufgebrochen, so daß sich nunmehr ein Whole-Cell- Patch-Clamp einstellt. Die Strömung erfolgt während dieser Pha­ se in Richtung des Pfeiles 135 durch den Kanal 122 und den Ver­ bindungskanal 132 zum Flüssigkeitsreservoir F₂ hin. Es wird nunmehr ein Zustand erreicht, in dem die Kammer 124 ausschließ­ lich mit Intrazellulärmedium 116 gefüllt ist. Anschließend kann über das Ventil 118 wieder mit einem anderen Medium gearbeitet werden, sofern dies für die durchzuführenden Messungen er­ wünscht ist.

Der Vorteil dieser Anordnung und dieses Verfahrens liegt darin, daß mit genau kontrolliertem Intrazellulärmedium gearbeitet werden kann, dessen Zusammensetzung beeinflußt werden kann oder daß sogar ein anderes Intrazellulärmedium verwendet werden kann.

Diese Ausführung mit zwei oder mehr Verbindungskanälen, die über Ventile steuerbar sind, ist grundsätzlich sowohl mit der Ausführung kombinierbar, die zuvor anhand der Fig. 1 bis 4 er­ läutert wurde, als auch mit der Ausführung gemäß Fig. 6.

Claims (34)

1. Verfahren zum Messen an in einer flüssigen Umgebung (66) befindlichen Zellen (60; 112), bei dem jede Zelle (60; 112) mit einer Unterseite (68) ihrer Membran (62) auf ei­ ner Oberfläche (48; 82; 128) positioniert wird, die von mindestens einem Kanal (40; 88; 122) durchsetzt ist, an dem zum Ansaugen der Zelle (60; 112) an die Oberfläche (48; 82; 128) ein Druckgefälle (70) eingestellt wird und die Zelle (60; 112) über mindestens eine Elektrode (44, 50; 100; 126) elektrisch abgefragt wird, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Unterseite (68) der Membran (62) durch eine Erhöhung des Druckgefälles aufgerissen wird und/oder die Membran (62) durch Zugabe von porenbildenden Substan­ zen oder durch einen elektrischen Stromimpuls mikroporös und elektrisch niederohmig gemacht wird oder aufgerissen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Druckgefälle zum Aufreißen der Membran (62) pulsartig erhöht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Positionierung der Zelle (60) ein Boden (48; 82) einer Mikroküvette (12; 84) verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Zelle (60; 112) über eine von der Unterseite (68) der Membran (62) in Richtung des Kanals (40; 88; 122) räumlich beabstandete Elektrode (50; 100; 126) elektrisch abgefragt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß ein Strom (I_st) durch das Zellinnere (64) geleitet wird oder eine Potentialmessung ausgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in einer Anordnung mit einer Vielzahl von Kanälen (40; 88; 122) der Impuls (70) zur Erhöhung des Druckgefälles oder der elektrischen Stromimpuls zum Öffnen der Membranfläche (68) gleichzeitig an allen Kanä­ len (40; 88; 122) erzeugt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in einer Anordnung mit einer Vielzahl von Kanälen (40; 88; 122) der Impuls (70; 98) zur Erhö­ hung des Druckgefälles oder der elektrische Stromimpuls zum Öffnen der Membranfläche (68) nacheinander an ausge­ wählten einzelnen oder mehreren Kanälen (40; 88; 122) er­ zeugt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung des intra­ zellulären flüssigen Mediums (116) durch Zugabe von Sub­ stanzen verändert wird oder daß das intrazelluläre flüs­ sige Medium (116) ausgetauscht wird.

9. Vorrichtung zum elektrischen Messen an Zellen (60; 112) in flüssiger Umgebung (66), mit einem Substrat (34; 86), das von einem Kanal (40; 88; 122) durchsetzt ist, ober­ halb dessen eine Zelle (60; 112) mit einer Unterseite (68) ihrer Membran (62) auf einer Oberfläche (49; 85; 128) des Substrates (34; 86) positionierbar ist, wobei Mittel (56) zum Erzeugen eines Druckgefälles (70) entlang des Kanals vorgesehen sind und eine erste Elektrode (44) zur elektrischen Abfragung der Zelle (60; 112) vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine zweite Elektrode (50; 100; 126) von der ersten Elektrode (44) in Richtung des Kanals (40; 88; 122) beabstandet angeordnet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (56, 58) zur Steuerung des Druckgefälles (70) vor­ gesehen sind, sowohl zur Erzeugung eines statischen Druckgefälles (70) zur Einstellung einer Cell-Attached- Konfiguration, als auch zur pulsartigen Erhöhung des Druckgefälles (70) zum Aufreißen der Unterseite (68) der Membran (62).

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich­ net, daß die zweite Elektrode (50) an dem von der ersten Elektrode (44) abgewandten Ende des Kanals (40) angeord­ net ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Elektrode (50) das abgewandte Ende des Kanals (40) ringförmig umgibt.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Kanal (122) an seinem der ersten Elektrode (44) abgewandten Ende über Ventile (118, 120) mit einer Mehrzahl von Kanälen (130, 132) verbunden ist, über die Flüssigkeit (F₁, F₂) zu- oder abführbar ist.

14. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Kanälen (40; 88; 122) in einem gemeinsamen Substrat (34; 86; 110) angeordnet ist.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Substrat (34; 86) eine Mikroküvette (12; 84) angeordnet ist, in deren Boden (48; 82) eine Öffnung (49; 88) vorgesehen ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Kanal (40; 88; 122) eine lichte Weite (x) von weniger als 10 µm, vorzugsweise weniger als 5 µm aufweist.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Mikroküvetten (12; 84) in einer Platte (10; 80) angeordnet sind.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (12; 80) mehrschichtig aufgebaut ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (10) eine obere Schicht (36), eine mittlere Schicht und eine Unterschicht (32) umfaßt, wobei in der oberen Schicht (36) die Mikroküvetten (12) angeordnet sind, die mittlere Schicht das Substrat (34) bildet, in dem die Kanäle (40) angeordnet sind und die Unterschicht (32) Verbindungskanäle (38) enthält, die zu den Kanälen (40) führen.

20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß das Substrat (34; 86) mit einer Unterschicht (32) verbunden ist, die aus einer oder meh­ reren Schichten aus photostrukturierbaren Materialien be­ steht, die Verbindungskanäle (38) aufweisen, die zu den Kanälen (40; 88; 122) führen.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschicht (32) auf einen Glasträger aufgebracht ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 19, 20 oder 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Verbindungskanäle (38) eine Breite (b₂) zwischen 10 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 20 µm aufwei­ sen.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (50) auf der Untersei­ te des Substrates (34) oder auf der Oberseite der Unter­ schicht (32) angeordnet sind.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (50) eine quadratische Fläche mit einer Kantenlänge (a) zwischen 20 µm und 60 µm, vorzugsweise etwa 40 µm aufweisen.

25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zu den Elektroden (50) führende Leiter­ bahnen (52) zwischen dem Substrat (34) und der Unter­ schicht (32) angeordnet sind.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Leiterbahnen (52) eine Breite (b₁) zwischen 5 µm und 30 µm, vorzugsweise etwa 10 µm aufweisen.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die obere Schicht (36), die Unterschicht (32) oder das Substrat (34) unabhängig von­ einander aus Kunststoff, insbesondere aus Polymethyl­ methacrylat (PMMA), Silikon, PTFE, Polyimid oder aus ei­ nem anorganischen Material, insbesondere aus Silizium, Keramik oder Glas bestehen.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat (34; 86) eine Schicht­ dicke von 2 µm und 40 µm, vorzugsweise etwa 5 µm auf­ weist.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat (34; 86) aus einer Folie besteht, in der eine Mehrzahl von Kanälen (40; 88) als Bohrungen ausgebildet ist.

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat (86) an der Unterseite einer Platte (80) an­ geordnet ist, in der eine Mehrzahl von Bohrungen als Mikroküvetten (84) ausgebildet ist, deren Boden (82) durch das Substrat (86) gebildet ist, in dem die Kanäle (88) als Löcher ausgebildet sind.

31. Vorrichtung nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Substrat (86) an der Unterseite einer Platte (36) angeordnet ist, in der eine Mehrzahl von Boh­ rungen als Mikroküvetten (12) ausgebildet ist, in deren Hoden (48) Löcher (49) vorgesehen sind, mit denen die Ka­ näle (40) des Substrates (34) zentriert sind.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydraulik- und Meßeinheit (90) vorgesehen ist, die eine zur Unterseite des Substrates (86; 110) hin offene Kammer (92; 124) aufweist, die an der Unterseite des Substrates (86; 110) derart positio­ nierbar ist, daß die Kammer (92; 124) mit einem ausge­ wählten Kanal (88; 122) kommuniziert und nach außen abge­ dichtet ist, wobei die Kammer (92; 124) mindestens eine Elektrode (100; 126) enthält und mit mindestens einem An­ schlußkanal (96; 130, 132) verbindbar ist, der mit einer Unterdruckquelle verbunden ist.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammer (124) mit einer Mehrzahl von Anschlußkanälen (130; 132) über Ventile (118, 120) verbunden ist.

34. Vorrichtung nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine Verfahreinheit (104) zum Verfahren und Positionieren der Platte (80) und der Hydraulik- und Meßeinheit (90) relativ zueinander vorgesehen ist.