DE2146429A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Züchtung von Kulturen - Google Patents

Vorrichtung und Verfahren zur Züchtung von Kulturen

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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/14Rotation or movement of the cells support, e.g. rotated hollow fibers

Description

DR. BERG DIPU-ING. STAPF . PAtENTANWXl-T« 9 1 A R A S MÜNCHEN »O, MAUiRKIRCHEReTR 49 fc I *♦ 0 *♦ A >J
Dr. B«g OJpi.Ang. Stopf, 8 MOndnwi 80, MoufHrth«rrtro8» 48 ·
lhrZ.idi.n Ihr Schreib« Uns.r Zeich« 21 544 Datum
Anwaltsakte 21 544
THB WELLCOME POUNDAiDION LIMITED, London, N.W. 1/Groß-Britannien
Vorrichtung und Verfahren zur Züchtung von Kulturen
Die Erfindung "betrifft eine Vorrichtung zur Züchtung von Zellen in flüssigen Nährmedien und ein Verfahren zur Züch tung von Zellen unter Verwendung dieser Vorrichtung.
Auf herkömmliche Weise werden Zellkulturen als Einschicht kulturen auf ebenen Glasflächen in stationären Gefäßen ge züchtet, wofür üblicherweise 50 ml bia 3 Liter-Flaschen verwendet werden.
Diese Flaschen sind jedoch für die Herstellung von beispielsweise biologischen Erzeugnissen in großtechnische«
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Maßstab nicht verwendbar, was eine Folge der erforderlichen Anzahl der Flaschen und der dadurch bedingten großen Platzbeanspruchung im Inkubator und Labor sowie der hohen Betriebskosten ist·
Aus diesem Grund wurden rotierende Zellkulturen entwickelt, bei denen zuerst Rundflaschen und später große, längliche Behälter in einem zylindrischen Rahmen fest angeordnet und durch mehrere Einlaß- und Ausflußrohre, Ventile und Zubehör untereinander verbunden sind und mit geringer Geschwindigkeit rotieren. Bei diesen Systemen wurde pro Gefäß eine etwas größere Fläche für den Zellenwuchs verfügbar und die Zellenkonzentration im Nährmedium konnte erhöht werden. Jedoch brachte jede einzelne Maßnahme oder Handhabung der einzelnen Teile oder des Zubehörs dieses Systems wie Einfüllen der Flüssigkeit oder Entleeren des Gefäßes oder die Zufuhr von Gas ins System die Gefahr einer Kontamination durch fremde Agentien in irgendeiner Einheit einer großen Produkt!onscharge mit eich. Die Verwendbarkeit bei der VirusZüchtung, bei der jede Kontamination ausgeschaltet werden muß, war somit begrenzt.
£a hat sich jetzt herausgestellt, daß die Verwendung eines KulturgefÄfles» das aus einer Mehrzahl von festgehaltenen und durch besondere Endplatten untereinander verbundenen Höhren besteht, wobei die Endplatten die Aufgabe eines Ver-
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teilers übernehmen und jeweils mit einem einzigen Einlaß-/ Ausfluß-Rohr versehen sind, die Gefahr einer Infektion unter Betriebsbedingungen eindeutig vermindert, wobei sie gleichzeitig stark vergrößerte Oberfläche für die Einschichtkultur bietet. So kann durch Veränderung der Länge und der Anzahl der Röhren die Oberfläche wunschgemäß von weniger als 95 bis über 13 ι 10 ei , d.h. bis zu etwa dem Zehnfachen des herkömmlichen einzelnen, rotierenden Kulturgefäßes verändert werden. Gleichzeitig kann das Gas/Flüssigkeit-Volumenverhältnis und das Verhältnis Nährbodenvolumen/Oberfläche unabhängig vom Produktionsmaßstab konstant gehalten werden und liefert somit gleichmäßige Bedingungen mit dementsprechender Zuverlässigkeit für die üblichen biologischen Verfahren.
Ferner kann das Gefäß und das es enthaltende Gerät leicht für diskontinuierliche und kontinuierliche Durchströmung mit Gasen oder Lösungen oder Mischungen derselben eingerichtet werden; auf diese Weise (a) kann die Regelung des pH-Wertes im Vergleich zu verschlossenen Flaschen verbessert werden,
(b) kann die Hemmung des Zellenwachstums durch toxiscrie Metaboliten oder Fehlen des Nährbodens vermindert werden,
(c) können toxische Stoffe, Viren, erwünschte Metaboliten oder biochemische Produkte, die im Nährboden frei
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werden, durch Auswechseln des Nährbodens oder durch Spülen daraus entfernt bzw. abgezogen werden, oder
(d) kann das Gefäß oder das Gerät in ein automatisches System eingebaut werden, wobei alle Arbeitsgänge nacheinander in einer vorbestimmten Reihenfolge ausgeführt werden und jeder Arbeitsgang eine vorbestimmte Dauer einhält, wodurch Platz, Arbeitskräfte und Bedienungskosten eingespart werden.
Das Gefäß und das Gerät können somit für verschiedene Zwecke verwendet werden, von denen jeder besondere Betriebsbedingungen, Vorrichtungen und geeignete Zusatzgeräte erfordert. Neben Zellenzüchtungdn im Einschichtverfahren kann das Gefäß zum Arbeiten in Suspensionskulturen eingerichtet werden und ist zur Züchtung von Viren in Zellen geeignet, die in einem Zellenkulturnährboden gehalten werden.
Erfindungsgemäß ist daher ein Kulturengefäß vorgesehen, das mehrere, parallel angeordnete Kulturröhrchen von im wesentlichen gleicher Länge umfaßt, die durch an beiden Enden um eine zentrale Haltevorrichtung angeordnete Halteplatten festgehalten werden, wobei die Halteplatten einen axialen Druck auf die Röhrchen ausüben, damit diese an beiden Enden dicht verschlossen werden, wobei die beiden Platten: (a) Verbindungskanäle aufweisen, die so angeordnet sind» daß sie alle Röhrchen verbinden und in einer Endplatte eine
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gemeinsame erste Einlaß/Ausflußöffnung haben, die mit einem Zufuhrschlauch mit Mitteln zur Relegung des Durchflusses verbunden ist; ferner haben die "Verbindungskanäle der anderen Endplatte eine gemeinsame zweite Öffnung, die mit einem Filterrohr verbunden werden kann; (b) auf der Haltevorrichtung befestigt sind, und (c) so angeordnet sind, daß sie die Röhrchen in einer lage festhalten, daß diese ein geschlossenes Gefäß bilden, das aus der Gesamthaltevorrichtung entfernt und durch Antriebsmittel rotiert werden kann.
Die Kulturenröhrchen sollten vorzugsweise einen kreisförmigen Querschnitt mit einem Innendurchmesser von 1 bis 10 cm, vorzugsweise 4 cm, aufweisen und aus Metall oder Kunststoff oder vorzugsweise aus Glas bestehen, das schnelles Erhitzen und Abkühlen verträgt wie z.B. Pyrex-Glas. Ein Innendurchmesser von 4 cm und ein Volumen von 0,2 ml Nährboden/cm Oberfläche ergibt ein Gas/Plüssigkeits-Verhältnis von 4:1t was für die meisten Zwecke ohne kontinuierliche Gasregelung sehr zufriedenstellend ist. Erforderlichenfalls kann am Gefäß sehr leicht eine Gasregelung angebracht werden, um z.B. den Kohlendioxidgehalt der Luft innerhalb des Gefäßes zu regeln; in diesem Pail können andere Gas/Plüssigkeits-Verhältnisse günstiger sein·
Ein Merkmal der zentralen Haltevorrichtung, die herkömmlicherweise aus einem Stab mit quadratischem Querschnitt mit
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Mitteln zum Festhalten der Endplatten "besteht, ist seine inhärente Einfachheit, die einen gleichmäßigen Druck auf die Röhrchen und einen einfachen Zusammenbau und schnelle Bedienung gewährleistet. Ferner ermöglicht eine zentrale Haltevorrichtung beispielsweise eine leichte Inspektion der Röhrchen und ihres Inhalts, sofern die Röhrchen durchsichtig sind, so daß die Zellen durch das Glas hindurch mikroskopisch untersucht werden können, um das normale Wachstum und die Vermehrung der Viren in jedem Stadium der Herstellung des Impfstoffs zu überwachen. Hierdurch wird die Gefahr der Kontamination stark vermindert, da sich ein Öffnen des sterilen Systems für gewisse Tests erübrigt. Selbstverständlich kann an die Stelle der einfachen Haltevorrichtung eine Vielzahl von Strukturen treten, die beispielsweise ein Bündel von Haltern umfassen, das eine . gleichmäßige Druckverteilung gewährleistet, die Röhrchen W leicht zugänglich macht und eine leichte Überprüfung ihres Inhalts und einen einfachen Zusammenbau ermöglicht.
Die Halteplatten mit Zufuhrkanälen können aus Stahl oder vorzugsweise aus einem Kunststoff ausgeführt sein, der so stark ist, daß er den erforderlichen Druck auf die Röhrchen ohne stärkere Verwerfung oder Verbiegung gewährleistet. Nylon oder Acetal-Copolymerisate wie beispielsweise "Kematol" bieten einen beträchtlichen Gewichtsvorteil und sind daher bevorzugt. Die Platten sind ein praktisches und
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einfaches Mittel zum Festhalten der Röhrchen an ihrem Platz mittels auf sie ausgeübten, axialen Drucks» Die Röhrchen können ferner an den Rändern zusätzlich Dichtungen enthalten, die der Abdichtung des ganzen Systems dienen. Beispielsweise wird weiches Dichtungsmaterial für die Röhrchen für diesen Zweck empfohlen, da es eine gute Abdichtung gewährleistet, ohne die Zerlegung des Gefäßes unnötig zu erschweren. "Rubazote" Typ X771 und X883, hergestellt von der Firma Expandes Rubber and Plastics Ltd., wurden für diesen Zweck als geeignet gefunden.
Falls die Platten aus zwei oder mehr feilen bestehen, können zwischen den Bestandteilen Dichtungen, beispielsweise aus Hartgummi oder ^ilikon, angebracht sein, um wasserdichte sterile Bedingungen zu gewährleisten.
Die Verbindungskanäle innerhalb der Halteplatten, durch welche die Nährflüssigkeit umlaufen und in die Röhrchen oder aus denselben fließen kann, ermöglichen es, daß mit einer einzigen Manipulation, beispielsweise Füllen oder Entleeren, gleichzeitig das ganze Sys1 tem bedient wird. Diese Kanäle können aus geeigneten Verbindungstunnels oder Zuführungen bestehen, die von den Röhrchen zu den gemeinsamen Öffnungen oder Mündungen führen, die mit Zufuhrleitungen bzw. Gasfiltermitteln in Verbindung stehen.
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Diese Kanäle können durch das Zusammensetzen der Platte aus beispielsweise zwei feilen gebildet werden, von denen jeder geeignete Nuten bzw. Aussparungen enthält, die geeigneterweise kreisförmig oder ringförmig ausgebildet sind und Öffnungen aufweisen, die zu den von den Rändern der Röhrchen eingeschlossenen Flächen führen und zusätzlich Querverbindungen aufweisen, und die so angeordnet sind, daß sie ™ die Zufuhrkanäle bilden, wenn di.e Halteplatten Fläche auf Fläche aufeinandergelegt werden. Vorzugsweise sind jedoch die Kanäle ganz in jenem Plattenteil enthalten,der die Röhrchen an Ort und Stelle festhält, beispielsweise in der Form von Nuten in der Oberfläche, die der Abdichtung zwischen den beiden Plattenteilen zunächst liegt. Die zusammengesetzte Platte hat vorzugsweise Scheibenform, die eine geeignete zylinderförmige Fläche zum Rotieren auf freien bzw. angetriebenen Rädern oder Rollen hat.
In der Oberfläche der Halteplatte sind an der dem parallelen Röhrchensystem zugewandten Seite geeignete Aussparungen zum Festhalten üedes Röhrchens angebracht. Diese Aussparungen sind üblicherweise kreisförmig oder ringförmig und können mit den Yerbindungskanälen durch eine oder mehrere Öffnungen, die entweder im Mittelpunkt oder näher zum Rand der Röhrchen angebracht sind, verbunden werden, um gegebenenfalls den kontinuierlichen oder zirkulierenden Fluß in waagerechter Lage zu gewährleisten. Die G-röße und die Lage
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dieser Öffnungen bestimmt das Luft/lPlüssigkeits-Verhältnis innerhalb des RÖhrehens, was mit Vorteil dazu verwendet werden kann, dieses Verhältnis für einen bestimmten Herstellungsprozeß zu regeln. Vorzugsweise wird die lage der Röhrchen in diesen Aussparungen ferner hilfsweise durch Mittel beim Zusammenbau beispielsweise in der Form eines Gitters, Rostes oder einer Lochplatte festgelegt, die zusätzlichen Halt gegen seitliche Bewegung oder Verschiebung bieten.
Die Aussparungen in der Endplatte, die die Röhrchen aufnehmen, können so angeordnet sein, daß eine maximale Ausnutzung der Oberfläche gewährleistet ist. Beispielsweise können diese Aussparungen und mit ihnen die Röhrchen um die zentrale Haltevorrichtung in Gruppen angeordnet sein, die in konzentrischen Kreisen oder in einer Dreieckskonfiguration mit etwa gleichen Abständen zwischen benachbarten Röhrchen liegen.
Die Öffnungen oder Mündungen auf den Halteplatten sind vorzugsweise so ausgebildet, daß sie mit Mitteln versehen sind oder solche aufnehmen können, die mit Quellen oder Behältern flüssiger oder gasförmiger, zuzuführender Stoffe oder Produkte oder durch geeignete Gaefilter mit der äußeren Atmosphäre in Verbindung stehen. So kann beispielsweise eine öffnung mit einem kleinen Sohlauolrverbindungsetück
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versehen sein, das diese Öffnung mit einer Leitung zum Nachfüllen bze. Entleeren der Nährflüssigkeit bzw. der Zellensuspension verbindet. Die Öffnung an der anderen Endplatte kann zur Herstellung auf ähnliche Weise einer Verbindung mit einem Gasfilter verwendet werden, die einen Ausströmweg für überschüssiges Gas (beispielsweise Kohlenk dioxid) bildet bzw. das System mit der Luft im Gleichgewicht hält.
Obwohl es ein Vorzug der vorliegenden Erfindung ist, daß das Gerät durch eine einzige Zufuhr/Abflußöffnung oder -mündung und -leitung bei chargenweisem Arbeiten bedient werden kann, so kann man auch einen kontinuierlichen Durchfluß erzeugen mit den sich daraus ergebenden Vorzügen einer jPlüssigkeitsauswechslung während des Wachstums der ZeI-. len, wenn die Öffnungen gleichzeitig für das Einströmen an " einem Ende und für das Ausströmen durch die zweite Öffnung am anderen Ende eingerichtet werden. Diese Möglichkeit zeigt die Anpassungsfähigkeit und vielseitige Verwendungsmöglichkeit des Geräts für beide Betriebsarten und für Automation.
Der Speiseschlauch kann in der Form eines Speiserohrs oder einer Speiseleitung ausgebildet sein und besteht vorzugsweise aus einem biegsamen Rohrmaterial. Dickwandige Schläuche aus Silikon oder einem anderen sterilisierbaren Material
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wurden als geeignet zur Verwendung an beiden Enden befun den, wenn sie in geeigneter Weise, beispielsweise mit einem Ventil oder vorzugsweise mit einer Schlauchklemme, für einfache Handhabung versehen sind. Der Gasfilter kann in ein facher Ausführung aus einem Rohr mit Wattebauech bestehen, das an das Speiserohr angeschlossen wird, oder kann aus einem Tiefenfilter, z.B. einem Seitzfilter, oder einem Membranfilter bestehen, die ihrerseits in Halterungen befestigt sind.
Stativ-Druckglieder können zu beiden Seiten der zentralen Haltevorrichtung angebracht werden, die flach auf den Halteplatten aufliegen, um einen gleichmäßigen Druck auf die Platten auszuüben. Dieser Druck kann erzeugt werden durch Drehen der Mutter an der Außenseite der Druckglieder in die geeignete Stellung. Diese kann durch die Dicke der Dichtungen zwischen den feilen der Halteplatten angezeigt werden. Wenn beispielsweise die Dichtung aus Hartgummi besteht, kann ihre Dicke unter Druck geeigneterweise auf weniger als die Hälfte der ursprünglichen zurückgehen.
Das Kulturengefäß kann auf üblichen Trommelrollgeräten rotiert werden. Dieses Gerät kann ein Räderpaar an beiden Enden des Geräts aufweisen, das die Mantelflächen der zylindrischen Halteplatten trägt, und von denen eines oder mehrere üblicherweise betriebsmäßig mit einem Antrieb verbunden
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sind, während die übrigen Räder freilaufend sind und zum Tragen und Festhalten des sich drehenden Gefäßes dienen. Beide Arten von Rädern können· auf einer gemeinsamen Haltevorrichtung gelagert sein, wie beispielsweise auf einem Rahmen, einem Sockel oder einem beweglichen Karren.
Bevorzugt ist jedoch eine Kombination aus Rollmaschine und Karren, die beispielsweise von einem Elektromotor angetrieben wird, mit entsprechend minimaler Handbetätigung. Im Betrieb kann das Kulturengefäß bei Einschichtkulturen mit Geschwindigkeiten zwischen 4 und 60 U/h rotiert werden: Außerhalb dieser Grenzwerte wird die Verteilung der Zellen auf der Oberfläche der Röhrchenwände bei weitem nicht gleichmäßig, was die Vorteile der Rotation zunichte macht. Als Rotationsgeschwindigkeit für eine optimale gleichmäßige Verteilung der Impfstoffe wurden 5 bis 20 U/h, vorzugsweise 10 bis 15 U/h, gefunden. Pur Kulturensuspensionen wird eine Rotationsgeschwindigkeit von 10 bis 30 U/h bevorzugt.
Eine bevorzugte Ausführung eines erfindungsgemäßen Geräts umfaßt ein Gefäß nach obiger BeschaeLbung mit einer Speiseleitung, die mit der ersten Öffnung verbunden ist, und/oder ein Gaafilterrohr, das mit der zweiten öffnung verbunden iet. Eine weitere Ausführung umfaßt auch allgemeine Halterungs- oder Antriebsmittel, die einen Rotationsmechanismus
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und eine Kraftquelle beinhalten. Die Halterungsmittel kön nen in der Form eines fahrbaren Karrens ausgebildet sein.
Der Eotationsteil des erfindungsgemäßen Geräts kann leicht aus dem allgemeinen Halterungs- und Antriebsmittelteil entfernt und in eine Lage gebracht werden, daß die Kulturenröhrchen senkrecht stehen. Auf diese Weise kann die Nährflüssigkeit durch die mit der Einlaß/Ausfluß-Öffnung in Verbindung stehende Speiseleitung in das Gerät eingeführt werden durch Pumpen der Flüssigkeit aus einem damit verbundenen Speisesiphon mittels Schwerkraft oder auf die Lufteinlaßöffnung des Siphons ausgeübtem Luftdruck. Die Entleerung der Flüssigkeit nach dem Züchtungsprozeß kann durch Stürzen des Geräts in die umgekehrte Lage erfolgen, wodurch die Flüssigkeit durch die Ausflußöffnung und damit verbundene Schlauchleitung in geeignete sterile Behälter abfließen kann.
Die Anwendung des Geräts bei der Produktion von Viren oder Virus-Antigenen in Einschichtkulturen kann an sich nach herkömmlichen Verfahren erfolgen.
Das Kulturgefäß mit einer Suspension von Zellen-Impfstoff in Bohrflüssigkeit wird mit langsamer Geschwindigkeit rotiert und das System wird bei 370C bebrütet, bis sich eine durchgehende Zellenschicht ausgebildet hat. Nach Entfernung
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des Nährbodens wird eine Suspension des Virenimpfstoffs in einem Erhaltungsmedium eingeführt und die Rotation wird fortgesetzt, wobei der Virus adsorbiert wird. Weiteres Unterhaltungsmedium wird eingeführt und das System wird weiterhin bebrütet, während die Rotation bei der für die Vermehrung der Viren erforderlichen Temperatur fortgesetzt wird. Das zellenfreie Virus bzw. Antigen kann geerntet werden, indem man das Medium und/oder das mit den Zellen "vergesellschaftete Virus bzw. Antigen abzieht durch Entfernen der Zellen von den Wänden durch herkömmliche physikalische oder chemische Verfahren.
Ein weiteres, erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel bietet ein Verfahren zur Züchtung von mikrobiologischem Material in flüssiger Suspension und umfaßt die folgenden Betriebsstufen:
1) Ohargenweise, diskontinuierliche oder kontinuierliche Einführung der ursprünglich eingesetzten flüssigen Suspension durch die erste Öffnung des Kulturengefäßes nach obiger Beschreibung und Einstellung und wunschgemäße Regelung des Gas/Flüssigkeitsverhältnisses,
Z) Rotieren des Kulturengefäßes um eine waagerechte Achse, bis die erforderlichen biologischen Verhältnisse hergestellt sind, und
3) Abführen oder Entfernen der entstehenden, veränderten flüssigen Suspension durch eine der beiden Öffnungen des Kulturengefäßes.
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Das mikrobiologische Material kann Zellensysteme, Zellenfamilien, Bakterien und dergl. enthalten. Im Sinne der vorliegenden Schrift und der Beschreibung gelten flüssige Suspensionen des mikrobiologischen Materials einschließlich der geeigneten Medien wie wäßrige Nährsysteme zusätzlich zu den Zellen.
Das Kulturengefäß kann als geschlossene Einheit rotiert werden, es kann jedoch erforderlichenfalls auch eine kontinuierliche G-asregelung angewendet werden, wie beispielsweise zur Regelung des Kohlendioxidgehalts, und/oder chemische Agentien bzw. Nährstoffe können beigegeben werden oder entfernt werden, beispielsweise zur Regelung des pH-rfertes des Systems.
Im folgenden wird ein erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel anhand einer Zeichnung beschrieben. In dieser zeigen:
Fig. 1 einen Teilschnitt durch einen Sektor entlang der Längsachse des Kulturengefäßes;
Fig. 2 eine Draufsicht auf die innere Fläche einer Halteplatte;
Fig. 3 eine Seitenansicht des Geräts einschließlich der Schlauchverbindungen, Speiseleitungen und Zubehör;
Fig. 4 ein zusammengebautes Gerät mit Rollen und Antriebsmitteln auf einem beweglichen Karren;
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Fig. 5 ein Blockschaltbild eines kontinuierlichen, automatischen Systems unter Verwendung des obigen Gefäßes·
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis 4 besteht das Gerät aus achtzehn genormten Kulturenröhrchen 1 aus Borsilikatglas (von denen in der Zeichnung zwei dargestellt sind) von im wesentlichen gleichmäßigem Durchmesser und gleicher Länge von 4 bzw. 6 cm, die in Gruppen zu sechs bzw. zwölf Stück
in zwei konzentrischen Kreisen um eine Verbindungsstange mit quadratischem Querschnitt angeordnet und durch eine Halteplatte 3, bestehend aus zwei dicht aneinanderliegenden Teilen, von denen Teil 3a aus Monocast Nylon 901 und Teil 3b aus Stahl besteht, festgehalten und untereinander verbunden sind.
Die Kulturenröhrchen 1 werden in kreisförmigen Aussparungen 4 auf einer Fläche des Plattenteils 3a aufgenommen und ψ durch eine auf Plattenteil 3a aufliegende Aluminiumplatte mit in ihrer Lage gehalten. Die Röhrchen 1 werden durch Löcher 6 in der Aluminiiimplatte 5 in ihrer Lage festgehalten und gegen seitliche Bewegungen geschützt.
Das Verbindungskanalsystem innerhalb des Endplattenteils 3a besteht aus ringförmigen Aussparungen 7» die mit den Kulturenröhrchen 1 durch die Röhrchenöffnungen 8 in Verbindung stehen und durch eine Dichtung 9 aus Hartgummi (Belldamm
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Rubber Co.) abgedeckt werden, die durch Plattenteil 3b auf die Oberfläche der Platte 3a aufgepreßt wird, um wasserdichte und sterile Bedingungen zu gewährleisten, wobei die inneren und äußeren Kanäle durch die Durchführung 10 in Verbindung stehen·
Die Durchführung 10 steht andererseits mit einer Speiseleitung 11 (Pig. 3) durch eine einzige Einlaß/Ausflußöffnung 12a in Verbindung und auf der anderen Endplatte mit einer Gasfilteröffnung 12b mittels Schlauchverbindung oder Zwischenstücken 13 in Verbindung. Eine weiche Dichtung zum Verschluß der Röhrchen liegt zwischen den Rändern der KuI-turenröhrchen und dem Boden der Aussparung 4»um das System völlig dicht zu verschließen.
Die Verbindungsstange 2 liegt in einer zentralen Durchführung 14 der Baugruppe, die so dimensioniert ist, daß die Stange dicht und fest in ihrer lage festgehalten wird. Die Stange trägt an ihrem Ende ein Stativ-Druckglied 15f das flach auf dem Endplattenteil 3b aufliegt, sobald das Gerät zusammengebaut ist. Eine Mutter 16, die auf dem mit Gewinde versehenen äußeren Ende der Verbindungsstange 2 sitzt, drückt gegen das äußere Ende des Seils 15 und kann so eingestellt werden, daß sie den zur wirksamen Abdichtung erforderlichen Druck erzeugt. Das Stativ-Druckglied am anderen Stangenende kann auf das Stangenende geschweißt sein·
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In Pig. 3 wird gezeigt, daß die Zufuhr/Abflußöffnung 12a durch die Schlauchverbindung 13 mit einer dickwandigen Silikon-Speiseleitung 11 in Verbindung steht, die durch ein (nicht gezeigtes) Speisesiphon und durch eine Schlauchklemme 17 zur Regelung des Zuflusses ergänzt wird. Die zweite öffnung 12b steht ebenfalls über eine Schlauchverbindung 13 mit einer Gasfilteranordnung 18 in Verbindung, die Wattebausch-Piltergläser und angeschlossene, kurze, dickwandige Silikonschläuche enthält.
Unter Bezugnahme auf Pig. 4 besteht der Karren mit der Rollmaschine, der das allgemeine Trage- und Antriebsmittel für das obige Gerät darstellt, aus einem starren Rahmen aus Stahlstäben mit quadratischem Querschnitt mit einer flachen oberen Auflage 20 aus Stahl, dem Rollmechanismus, der unterhalb der Auflage 20 so angeordnet ist, und Räder auf beiden Seiten der Auflage antreibt, und einem Motor Die Gefäße des Geräts liegen beim Rotieren quer über der Auflage oder stehen bei der Bedienung senkrecht auf der Auflage.
Pig. 5 zeigt, wie dii zur Produktion eines Impfstoffs erforderlichen Einzelgeräte mit dem Kulturengefäß zu einem automatischen System nach obiger Beschreibung zusammengestellt werden können. Die Behälter mit der Zellkultur (A), dem Nährmedium (B), der Viruebeschickung (0), dem Erhaltungs-
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medium (D) und dem Enzym (E) sind mit sterilen Ventilen ausgerüstet, die vom Regelsystem (P) automatisch betätigt werden, das so programmiert ist, daß gewisse Zuflüsse zu vorherbestimmten Zeiten stattfinden. Ein Abfallflammelgefäß (H) zur Aufnahme von Überschuß und Abfallprodukten kann zwischen dem Kulturengefäß (G.) und dem Speicherbehälter für das Endprodukt eingeschaltet werden (i).
Die Arbeitsweise des Geräts wird im folgenden anhand eines Beispiels beschrieben.
Beispiel
7 ι 10 Hühnerembryozellen werden unter sterilen Bedingungen in einer herkömmlichen Flasche in 2,7 1 Eagles Medium, das Kalbsserum enthält, suspendiert (eagle H. Science 1955, 122, 501). Ein Kulturengefäß mit einer Oberfläche von
13 572 cm wird senkrecht auf den Karren gesetzt, wobei die Einlaß/Ausflußöffnung an die Vorderseite der Grund-, platte kommt und der Luftfilter freibleibt. Die Flasche wird dann mit einem Speisesiphon verbunden, das seinerseits mit dem Zufuhr/Abflußrohr verbunden wird. Die Suspension wird sodann unter Einwirkung der Schwerkraft in das Kulturengefäß überführt und die Flußgeschwindigkeit durch eine Schlauchklemme geregelt. Eine Zellenkonzentration von
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5 χ 10 in einem Volumen von 0,2 ml Nährboden/cm und 1/5 Kolonnenlänge der Flüssigkeit ist hierbei vorgesehen,
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wodurch, das "bevorzugte Gas/Flüssigkeits-Verhältnis 4:1 hergestellt wird.
Das Gerät wird dann schnell um 90° gekippt und in waagerechter Lage mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 5 U/h, der optimalen Umdrehungsgeschwindigkeit für eine gleichmäßige Adsorption dieser Zellen, rotiert, während das Gerät vier "bis fünf Tage lang bei 37° bebrütet wird.
Dabei bildet sich eine durchgehende Einzelschicht, wie man unter mikroskopischer Beobachtung mit Hilfe eines Mikroskops mit eingebauter Beleuchtung und Haltevorrichtung für Röhrchen mit 4 cm Durchmesser feststellen kann. Das Kulturengefäß wird sodann senkrecht gestellt und das Wachstumsmedium unter Schwerkraft aus dem Gefäß in die Siphonflasche entfernt und die Zelleneinzelschicht mit einer ausgewogenen Salzlösung abgewaschen«,
Newcastle Virus-Impfstoff bei 10 TCID50 (Gewebskultur-Infektionsdosis; 50%) wird in 150 ml "Maintenance Medium 199" (Morton et al., Proc.Soc.Bxp.Miol.Med., 1950, 73, 1) suspendiert und in das Kulturengefäß überführt (im Verhältnis von etwa 0,01 ml/cm ), und das Gefäß wird in waage rechter lage etwa 1 bis 3 Stunden rotiert, bis das Virus adsorbiert ist. Die Einzelschicht wird dann mit dem gleichen Medium gespült, weitere 2,7 1 Erhaltungemedium werden wie
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oben eingefüllt, und das Rollgerät wird "bei der für die Virusvermehrung erforderlichen Temperatur "bebrütet.
Das zellenfreie Virus wird in bestimmten Zeitabständen geerntet durch Entfernung des Nährbodens aus dem Gefäß und Einfüllen desselben in einen sterilen Behälter und bedarfsweisem Nachfüllen von frischem Nährboden in das Kulturengefäß, das dabei jedesmal in senkrechte lage gebracht wird. Das mit den Zellen vergesellschaftete Virus wird durch Einführen von Trypsin/Versene (ED7A)-Lösung und fiotieren des Gefäßes während einiger Minuten gewonnen, worauf sich die Zellen von den Wänden des Gefäßes lösen.
- Ansprüche -
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Claims (1)

  1. Ansprüche :
    1, Vorrichtung zum Züchten -von mikrobiologischen Kulturen, "bestehend aus einer Mehrzahl von parallelen KuIturenröhrchen von im wesentlichen gleicher Länge, die mit Hilfe von Endplatten jeweils am Ende der Röhrchen, die einen axialen Druck auf die Röhrchen ausüben, um sie dicht zu verschließen, um eine zentrale Haltevorrichtung angeordnet sind, wobei die zwei Platten (a) Verbindungskanäle aufweisen, die so ausgebildet sind, daß sie alle Röhrchen untereinander verbinden und mit einer gemeinsamen ersten Einlaß/Ausfluß-Öffnung an einer der Endplatten, die mit einer Speiseleitung versehen sind, verbunden werden kann, sowie mit einer gemeinsamen zweiten Öffnung an der anderen Endplatte, die mit einem Filterrohr verwendet werden kann, mit Mitteln zur Regelung des Zuflusses, (b) auf der Haltevorrichtung befestigt sind und (c) so eingerichtet sind, ψ daß sie die Röhrchen an ihrem Platz festhalten und zusammen mit diesen ein geschlossenes Gefäß bilden, das aus der allgemeinen Halterung entfernt und von einem Rollmechanismus rotiert werden kann.
    2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endplatten aus zwei oder mehr Teilplatten zusammengesetzt aind.
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    3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskanäle ganz in dem Plattenteil geführt sind, der unmittelbar an die Röhrchen anliegt.
    4· Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 "bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die unmittelbar an die Röhrchen anliegenden Oberflächen der Endplatten mit Aussparungen zum Pesthalten der einzelnen Röhrchen versehen sind.
    5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lochplatte vorgesehen ist, die dazu beiträgt, die Röhrchen an ihrem Platz in den Aussparungen der Endplatten festzuhalten.
    6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltevorrichtung aus einer einzelnen Verbindungsstange von vorzugsweise quadratischem Querschnitt besteht·
    7· Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Röhrchen einen Innendurchmesser von 1 bis 10 cm, vorzugsweise 4 cm, haben.
    8. Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 umfaßt, wobei eine Speiseleitung mit der ersten Öffnung und/oder ein Gasfilterrohr mit der zweiten Öffnung verbunden sind·
    20 9 813/1148 -24-
    2H6429
    9. · Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine allgemeine Haltevorrichtung "bzw. Antriebsmittel aufweist.
    10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die allgemeine Haltevorrichtung aus einem fahrbaren Untersatz besteht.·
    (i 1) Verfahren zur Züchtung mikrobiologischer Kulturen in flüssiger Suspension, dadurch gekennzeichnet, daß man die ursprünglich eingesetzte, flüssige Suspension
    a) chargenweise, diskontinuierlich oder kontinuierlich durch die erste Öffnung der Vorrichtung nach Anspruch einleitet, das Gas/Flüssigkeits-Verhältnis nach Bedarf einstellt oder steuert,
    b) das Kulturgefäß um eine waagerechte Achse bis zur Einstellung der gewünschten biologischen Bedingungen rotieren läßt, und
    c) die entstandene, veränderte, flüssige Suspension durch eine der Öffnungen des Kulturgefäßes abführt.
    12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturengefäß mit einer Geschwindigkeit von 4- bis 60 U/h, bei einer Einschichtkultur vorzugsweise 5 bis 20 U/h, rotiert wird.
    209B13/1U8
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