DE2164768B2

DE2164768B2 - Verfahren zum nachweis und zur bestimmung einer komponente der reaktion zwischen spezifischen bindeproteinen und bindefaehigen substanzen

Info

Publication number: DE2164768B2
Application number: DE19712164768
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus Wilhelmus Maria Dr. Oss Schuurs (Niederlande)
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1970-12-28
Filing date: 1971-12-27
Publication date: 1976-01-22
Also published as: JPS58117456A; ZA718332B; BE777309A; CH557030A; NL154599B; ES398372A1; JPS5834783B1; DK150690C; DE2164768A1; CA964560A; IT965020B; GB1348938A; JPS58117455A; US3839153A; BR7108553D0; EG11604A; AT320145B; DK150690B; AU3698671A; AU467394B2

Description

der zu bestimmenden Komponente. Vitamine.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- c) Systeme, die als spezifische Bindeproteine Prozeichnet, daß man die unlöslich gemachten Anti- ao teine enthalten, die im Körper als Rezeptor- oder körper gegen das spezifische Bindeprotein dem Transportmoleküle wirken, und als bindefähige Reaktionsgemisch als letztes Reagens zufügt. Substanzen Stoffe, die von solchen Proteinen ge-

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- bunden werden; diese Systeme sind z. B. geeignet zeichnet, daß man die bindefähige Substanz da- zur Bestimmung von Steroidhormonen, jedoch durch bestimmt, daß man der Probe zuerst das 25 auch von Thyrosin, Trijodthyronin und Vitamin spezifische Bindeprotein, dann das Kopplungs- B₁₂ sowie des Intrinsicfaktors und von adrenoprodukt aus bindefähiger Substanz und Enzym corticotropem Hormon.

und zum Schluß die unlöslich gedachten Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein zufügt. Am wichtigsten bei den beschriebenen Methoden

4. Verfahren nach einem der vorangehenden 30 ist, wie ersichtlich, die Verwendung einer Markierungs-Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die substanz und das Auftrennen der markierten Kompounlöslich gemachten Antikörper im Überschuß nente in eine Fraktion, die an die korrespondierende gegenüber der Menge an spezifischem Bindeprotein Komponente gebunden ist, und eine andere Fraktion, verwendet. die nicht an letztere gebunden ist.

5. Anwendung des Verfahrens nach einem der 35 Bei den meisten bisher in der Praxis angewandten Ansprüche 1 bis 4 auf ein System, in dem als Methoden werden zum Markieren nur radioaktive bindefähige Substanz ein Antigen oder ein Hapten Atome, z. E. 131j, 125j, 14c, 3h, 57co verwendet, und als spezifisches Bindeprotein ein Antikörper Diese Methoden zeichnen sich gewöhnlich durch gegen das betreffende Antigen bzw. Hapten vor- hohe Empfindlichkeit aus. Ihre Anwendung ist allerhanden ist. 40 dings beschränkt auf Institute, bei denen die notwendigen Spezialeinrichtungen verfügbar sind (siehe

H a y e s et al., »Radioisotopes in Medicin«, USAEC,

1968, S. 7).

Aus Bull. Soc. Chim. Biol., Bd. 50 (1968), S. 1169 ff., 45 ist ein Verfahren bekannt, bei dem zum Nachweis von

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Antikörpern an Stelle einer fluoreszierenden oder

Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente radioaktiven Substanz ein Kopplungsprodukt aus

der Reaktion zwischen einem spezifischen Binde- einem Antigen gegen den vermuteten Antikörper und

protein und der entsprechenden bindefähigen Sub- einem Enzym als Markierungssubstanz verwendet

stanz unter Ausnutzung der gegenseitigen Binde- 50 wird. Nach Elektrophorese werden die verschiedenen

affinität der beiden Komponenten. Proteinfraktionen getrennt, und man kann dann

Bekanntlich kann eine Komponente der Reaktion mittels Durchführung einer Enzymreaktion und ent-

zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der sprechender Einfärbung feststellen, ob der betreffende

entsprechenden, mit dem Protein kombinierbaren Antikörper vorhanden ist oder nicht. Eine über diesen

(bindefähigen) Substanz dadurch nachgewiesen und 55 rein qualitativen Nachweis hinausgehende quantitative

bestimmt werden, daß man die eine der beiden Bestimmung von Antikörpern ist mit dieser bekannten

Komponenten, nachdem sie mit einer Markierungs- Methode jedoch nicht möglich und ebensowenig ein

substanz markiert wurde, in einem Reaktionsgemisch, Nachweis bzw. eine Bestimmung von Haptenen und

das die andere Komponente enthält, bebrütet und Antigenen.

daraufhin eine Trennung bewirkt zwischen dem an 60 Die bekannten Trennungsmethoden können wie

den Bindungspartner gebunden und dem nicht daran folgt unterteilt werden:
gebundenen Teil der markierten Komponente, worauf

man zum Schluß in mindestens einer der beiden a) Methoden, die auf dem Unterschied in den physierhaltenen Fraktionen die Markierungssubstanz be- kaiischen Eigenschaften zwischen der nicht gestimmt. Die Verteilung der markierten Komponente 65 bundenen markierten Komponente und ihrem über die beiden Fraktionen gibt ein Maß für die in Komplex mit dem Bindepartner beruhen, z. B. der Probe anwesende Menge an zu bestimmender auf Gelfiltration, Elektrophorese, Salzausfällung Substanz. Es lassen sich drei verschiedene Systeme und Adsorption an mit Dextran überzogene Holz-

kohle (Journ. of Cha. Endocrin., 23 [1965], S. 1375);

fa) die sogenannten Feststoffphasen-Methoden, bei welchen die eine Komponente vorher bereits durch Vernetzung oder durch Kovalenzbindung oder physikalische Adsorption an einen festen Träger in unlösliche Form gebracht wurde;

c) die sogenannte doppelte Antikörpermethode, bei welcher der gebildete Komplex Antigen-(oder Hapten)-Antikörper mit Hilfe von Antikörpern gegen den im Komplex enthaltenen Antikörper ausgefällt wird; diese Methode ist nur bekannt für Systeme mit Antikörpern (zu b) und c) siehe »Nature«, Vol. 214 [1967], S. 1302, und Vol. 215 [1967], S. 1491, sowie »Methods in Immunology and Immunochemistry«, Vol. I).

Während die unter a) und c) erwähnten Methoden in der Durchführung verhältnismäßig kompliziert sind, haben die unter b) erwähnten Methoden den Nachteil, so daß bei der in unlösliche Form gebrachten Reaktionskomponente die Affinität zum Reaktionspartner gewöhnlich nachläßt. Für ein empfindliches Testsystem ist jedoch eine hohe Affinität Grundbedingung. Es stellte sich daher die Aufgabe, die Verfahren der eingangs genannten Art so zu verbessern, daß die geschilderten, bei Anwendung der bekannten Markierungs- und Trennungsmethoden auftretenden Hindernisse überwunden werden können. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Gebrauch macht von einer bekannten Menge eines Kopplungsproduktes aus bindefähiger Substanz und einem Enzym und von in unlösliche Form gebrachten Antikörpern gegen das spezifische Bindeprotein und daß man nach Abschluß der Reaktion in der flüssigen oder festen Phase des Reaktionsgemisches die Enzymaktivität bestimmt, die ein Maß gibt für die Menge der zu bestimmenden Komponente.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich mit besonderem Vorteil anwenden, wenn in dem System als bindefähige Substanz ein Antigen oder ein Hapten und als spezifisches Bindeprotein ein Antikörper gegen das betreffende Antigen bzw. Hapten vorhanden sind.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten sind die folgenden:

gemachten Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein, einer Inkubation und dem Zentrifugieren und Messen. Die Dosierung ist oft leichter als bei den Feststoffphasen-Methoden, da es genügt, wenn man das unlöslich*; Material im Überschuß zugibt, während bei den Feststoffphasen-Meihoden das Material in genau abgemessener Menge verwendet werden muß. Außerdem ist die Affinität des Bindeproteins gegenüber der bindefähigen Substanz nicht dadurch beeinträchtigt, daß das Protein an ein Trägermaterial gebunden ist, wie dies bei der Feststoffphasen-Methode der Fall sein kann. Ein weiterer Vorteil gegenüber der letzteren Methode ist die rasche Einstellung des Gleichgewichtes der Reaktion zwischen dem spezifischen Bindeprotein und der bindefähigen Substanz (beide in Lösung). Noch ein weiterer Vorteil besteht darin, daß bei der DASP-Methode der unlöslich gemachte Antikörper, der im folgenden »Immunoadsorbens« genannt wird, in jedem beliebigen System verwendet werden kann, in dem Antikörper als spezifisches Bindeprotein verwendet werden, vorausgesetzt, daß diese Antikörper in der gleichen Tierart erzeugt worden sind. In Gegensatz dazu müssen die Antikörper für jedes mit der Feststoffmethode zu bestimmende Antigen oder Hapten unlöslich gemacht werden. Die Doppelantikörper-Methode ist sehr empfindlich gegenüber verhältnismäßig geringen Schwankungen in der Salzkonzentration, dem pH-Wert u. dgl., wodurch eine scharfe Kontrolle der Bedingungen notwendig wird. Außerdem muß bei dieser Methode ein »Träger«-Gammaglobulin und daher viel zweiter Antikörper zugefügt werden, um einen immunen Niederschlag zu erhalten. Abgesehen von der einfacheren Durchführung läßt sich bei der DASP-Methode, die kein »Trägere-Gammaglobulin benötigt, eine Materialeinsparung erreichen. Schließlich sei noch erwähnt, daß eine auf Transport- oder Rezeptorproteine angewandte doppelantikörperähnliche Trennung nicht möglich ist, da kein geeignetes »Trägere-Protein für diesen Zweck verfügbar ist. Das erfindungsgemäße Verfahren hat daher in dieser Hinsicht einmalige Vorteile.

c) Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht automatisiert werden.

a) Anstatt mit Radioisotopen kann man mit Enzymen arbeiten. Hierzu wird eine beträchtlich einfachere Laboratoriumseinrichtung benötigt, wobei die Mitarbeiter nicht so hoch qualifiziert sein müssen. Zu bedenken ist ferner, daß das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen durch gesetzliche Bestimmungen stark eingeschränkt ist. Außerdem halten sich die notwendigen Reagenzien über längere Zeit, und die Unfallgefahr ist wesentlich geringer.

b) Die kombinierte Methode, die sich zusammensetzt aus der »Doppel-Antikörper«- und der »Feststoffphasene-Methode (»Double Antibody« and »Solid Phase«-Methods) und hier der Einfachheit halber als »DASP-Methode« bezeichnet wird, hat gegenüber den bekannten Methoden verschiedene Vorteile. So ist die Durchführung der erfindungsgemäßen Methode sehr einfach, denn sie besteht einfach in der Zugabe der unlöslich Im folgenden wird die Erfindung an Hand von allgemeinen und speziellen Ausführungsbeispielen näher erläutert:

Die Ausdrücke »Conjugat« bzw. »Enzymconjugai« bezeichnen dabei das Kopplungsprodukt aus bindefähiger Substanz und Enzym.

Zum Nachweis bzw. zur Bestimmung einer mit einem bestimmten Protein kombinierbaren (bindefähigen) Substanz bringt man die unbekannte Probe oder eine Verdünnungsserie davon zusammen mit einer bekannten Menge eines Conjugates aus der zu bestimmenden Substanz und einem Enzym und mit einer gewissen Menge an spezifischem Bindeprotein, wobei diese Menge abhängt von der jeweils zugefügten Menge an Enzymconjugat. Dann fügt man eine

gewisse Menge, vorzugsweise einen Überschuß, an unlöslich gemachten Antikörpern gegen das spezifische Bindeprotein zu, so daß das gesamte Enzymconjugat, das mit dem Bindeprotein reagiert hat, über

5 6

lieses Protein mit den unlöslichen Antikörpern ge- Enzym zu binden, vorausgesetzt, daß die eine Substanz :oppelt wird. Je mehr bindefähige Substanz in der eine oder mehrere Aminogruppen und die andere ^Jrobe vorhanden ist, um so weniger Enz>mconjugat eine oder mehrere Carboxylgruppen aufweist. Ist das eagiert mit dem spezifischen Bindeprotein und geht letztere nicht der Fall, so können die gewünschten iann schließlich in die unlösliche Phase über; es 5 Gruppen in das zu kuppelnde Molekül mit Hilfe von :rgibt sich daraus, daß in der flüssigen Phase mehr bekannten organochemischen Verfahren eingeführt nicht gebundenes Enzymconjugat übrigbleibt, das dori werden. Auch Verfahren zur Verbindung von Aminoauf einfache Art bestimmt werden kann. oder Carboxylgruppen, gegebenenfalls unter Einfüh-

Das spezifische Bindeprotein kann dadurch bestimmt rung einer Brücke, sind bekannt. Schließlich können werden, daß man die Probe selbst oder eine Verdün- io auch oft Verbindungen, wie Glutarsäurealdehyd, Dinungsserie davon mit einer bekannten Menge Enzym- fluordinitrodiphenylsulfon und Di- und Trichlorconjugat und einer gewissen Menge der unlöslich s-triazin für das in Frage kommende Kuppeln vergemachten Antikörper gegen das spezifische Binde- wendet werden. Gegebenenfalls müssen die hergestellprotein bebrütet. Die Enzymaktivität kann nur dann ten Enzymconjugate von den nicht umgesetzten in die unlösliche Phase übergehen, wenn das Conjugat 15 Substanzen oder von solchen, die inaktiv geworden mit dem spezifischen Bindeprotein reagiert hat. In der sind, abgetrennt werden. Dies kann mit Hilfe der Probe ist dann um so mehr spezifisches Bindeprotein bekannten biochemischen Methoden geschehen, z. B. vorhanden, je weniger gebundenes Enzymconjugat in durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln, der flüssigen Phase zurückbleibt. Gelfiltration oder Zentrifugieren, falls ein Dichte-

Die Empfindlichkeit des beschriebenen Tastsystems ao gefälle besteht.

kann dadurch variiert werden, daß man die Menge Die Wahl des Enzyms, das in das Kupplungsprodukt

der Reagenzien (entweder im gleichen Verhältnis oder aufgenommen werden soll, wird bestimmt durch eine nicht) ändert. Die Menge an Enzymconjugat, die an- Anzahl von Eigenschaften des betreffenden Enzyms. gewendet werden kann, ist jedoch nach unten begrenzt Wesentlich ist selbstverständlich, daß das Enzym durch die Forderung, daß seine Enzymaktivität noch 25 beständig ist gegenüber dem Kuppeln mit einem gut gemessen werden kann, so daß die Empfindlichkeit anderen Molekül, d. h. gegenüber einer Modifikation des Testsystems eine Grenze hat. Die geringste noch einer oder mehrerer Aminosäureseitenketten. Von meßbare Enzymaktivität hängt unter anderem ab von großer Wichtigkeit ist auch die spezifische Aktivität der Art des zum Koppeln verwendeten Enzyms und des Enzyms. Da zur Erreichung eines meßbaren von der Art des Substrates sowie von der Inkubations- 30 Enzymeffektes weniger Enzymconjugat zugegeben periode der Enzymreaktion. Außerdem beeinflußt die werden muß, wird das Testsystem empfindlicher. Affinität der spezifischen Bindeproteine stark die Außerdem sind diejenigen Enzyme bevorzugt, bei Empfindlichkeit der Bestimmung. Für ein hoch- denen die Bestimmung der Aktivität auf einfache empfindliches Testsystem müssen spezifische Binde- Weise durchgeführt werden kann. In Betracht kommen proteine mit höherer Affinität verwendet werden. 35 in erster Linie diejenigen Enzyme, die kolorimetrisch,

Die Mengen an je Bestimmung notwendigem Rea- spektrophotometrisch oder fluorimetrisch bestiirnit gens werden empirisch festgelegt. werden können. Diese Art der Bestimmung eignet sich

Zur Bestimmung der bindefähigen Substanz wird auch für die automatische Durchführung d?s Verfahdie Menge an Enzymconjugat mit Hilfe der Enzym- rens, die einen zusätzlichen Vorteil darstellt,
aktivität bestimmt; dann erfolgt die Inkubation dieser 40 Kolorimetrisch können diejenigen Eniyme bestimmt Menge mit einer Verdünnungsserie des spezifischen werden, die eine Reaktion katalysieren, bei der eat-Bindeproteins, um die notwendige Menge dieses weder in der primären oder in der sekundären Reak-Proteins zu bestimmen. Vorzugsweise wählt man das tion eine gefärbte Substanz auffitt bzw. verschwindet, spezifische Bindeprotein in einer Menge, die 50 bis Als enzymatisch aktive Komponente i 1 Coijugaten

90% des Enzymconjugates bindet. Zum Schluß stellt 45 kommen unter anderem folgende Enzyme in Frage: man fest, ob die gewünschte Empfindlichkeit tatsäch- Katalase, Peroxidase, ß-G'ucoronidase, /3-D-Glucolich erreicht worden ist, indem man eine Verdünnungs- sidase, /3-D-Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidas;, serie der in dem System zu bestinimenden Substanz Galactose-Oxidase und alkalische Phosohatase.
testet. Für die Bestimmung des spezifischen Binde- Nach Beendigung der Reaktion zwischen den Kom-

proteins kommt hinsichtlich der Dosierung des Enzym- 50 ponenten des Systems kann die Enzymaktivität der conjugates weiterhin dessen Aktivität in Betracht, die flüssigen oder der festen Phase des Reaktionsgemisches im vernünftigen Umfang bestimmbar sein sollte. oder auch der beiden Phasen bestimmt werden. Am

Die unlöslich gemachten Antikörper gegen das einfachsten ist es jedoch, die Enzymaktivität der spezifische Bindeprotein werden bei beiden Bestim- flüssigen Phase zu bestimmen.

mungsarten vorzugsweise im Überschuß zugegeben; 55 Die unlöslich gemachten Antikörper gegen die ihre Dosierung wird durch Vorversuche bestimmt. spezifischen Bindeproteine können ebenfalls auf be-

Prinzipiell können die Reaktionskomponenten ge- kannte Art hergestellt werden. Die Herstellung der meinsam zusammen oder in beliebiger Reihenfolge Antikörper kann so erfolgen, daß man ein gereinigtes dem System zugefügt werden. Es hat sich jedoch Präparat des spezifischen Bindeproteins oder eines gezeigt, daß die Bestimmung empfindlicher wird, wenn 60 Proteins, das mindestens teilweise die gleichen Antigendas Immunoadsorbens erst nach der Inkubation der eigenschaften wie das spezifische Bindeprotein hat, anderen Komponenten zugegeben wird. herstellt und dieses auf bekannte Weise einer anderen

Das erfindungsgemäß notwendige Reagens, d. b Tierart als der, von der es erhalten wurde, injiziert, das Kupplungsprodukt aus Antigen, Hapten oder Das Serum des behandcltenTieres bzw. dessen Gammabindefähiger Substanz mit einem Enzym, kann auf 65 globulinfraktion kann dadurch unlöslich gemacht werbekannte Weise hergestellt werden. Diese Methoden den, daß man es mit Verbindungen, wie Glutarsäurekönnen auch verwendet werden, um ein Hapten oder aldehyd oder Chloroformsäureäthylester, vernetzt oder eine niedrigmolekulare bindefähige Substanz an ein daß man es an feste Trägerteilchen bindet, entweder

auf physikalische Weise durch Adsorption oder ehe- Gibt man eine gewisse Menge an Urin einer vermisch durch Bildung von Kovalenzbindungen. Als mutlich schwangeren Frau hinzu und inkubiert den feste Träger kommen Stoffe, wie Cellulose (die gege- Urin mit den Reagenzien, so bildet sich ein Gemisch benenfalls modifiziert sein kann), Agarose, vernetztes aus unlöslichen Stoffen, und die überstehende Flüssig-Dextran, Polystyrol u. dgl., in Betracht. Eine Kovalenz- 5 keit enthält das übrigbleibende lösliche HCG-Enzymbindung der Antikörper an diese Stoffe kann bewirkt conjugat. Die Menge des letzteren hängt von der werden mit Hilfe von Substanzen, wie Carbodiimiden, Menge an HCG in dem zu testenden Urin ab. Durch Di- und Trichlor-s-triazinen, Glutarsäurealdehyd, Bestimmung der Enzymaktivität dieses zurückbleiben-Cyanogenbromid und z. B. durch Diazotierung. den HCG-Enzymconjugates kann festgestellt werden,

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Bestimmungs- io ob der Urin von einer schwangeren Frau stammt oder

Verfahrens kommen voll zur Auswirkung, wenn die nicht.

Antikörper im Überschuß angewendet werden, so daß Ein vorteilhaftes Verfahren für die Bestimmung der

das spezifische Bindeprotein vollständig in die feste Enzymaktivität besteht darin, daß man die Probe in

Phase übergeht. Berührung bringt mit einem Indikatorpapier, das

Die Form, in der die Reagenzien verwendet werden, 15 imprägniert ist mit Enzymreagenzien, z. B., falls eine kann sehr verschieden sein; das Enzymconjugat als Peroxidase verwendet wurde, einer H₈O₂ abgebenden Bestandteil des Reaktionssystems kann durch Gefrier- Substanz, wie Harnstoff-HjC^, und einem Farbtrocknung erhalten oder in einem Puffer gelöst sein. reagens, wie o-Tolidin.

Es kann auch ein fester Träger verwendet werden, Wählt man die Reagenzien jeweils in richtiger

z. B. ein mit dem Conjugat getränkter Papierstreifen. 20 Menge, so läßt sich Schwangerschaft auch durch

Dies trifft ebenso zu für die notwendigen spezifischen ungeschultes Personal schon in einem sehr frühen

Bindeproteine. «gp Stadium und auf einfache, rasche und sehr zuver-

Die unlösliche Komponente kann in Form von lässige Weise feststellen. Teilchen verschiedener Dimension vorliegen, z. B. als

Körner, Flocken, Stäbchen oder in Form eines Strei- 25 B e i s ρ i e 1 1 fens aus Trägermaterial.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- Bestimmung von menschlichem Chorion-

fahrens erforderlichen Reagenzien sind: gonadotropin (HCG)

1. eine bekannte Menge eines Conjugates eines ^a) Herstellung von HCG-HRP Antigens, Haptens oder einer niedrigmolekularen ³° , _TT„_ . „„ ,, ^. , „ ., ,_TT^^ bindffähigen Substanz mit einem Enzym; 5mgHCG und 20mgMeerrett.ch-Peroxidase(HRP)

2. eine entsprechende Menge eines spezifischen ^w«^r^ⁿ gelost in 2 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom Bindeproteins (Antikörper oder Transport- oder P^H ⁶'²^^{&ch Zn}&^h? ^v°^{n 4}^^{1 25} \^lge _o ^r Glutarsaure-RezeptorproteineV aldehydlosung wurde das Gemisch 2 Stunden bei

3. eine bekannte Menge an unlöslich gemachten ³⁵ Raumtemperatur geschüttelt. Nach 5 Minuten langem Antikörpern gegen das verwendete spezifische fentnfug.eren bei 25°C wurde die Flüsigkeit über Bindeprotein Sephadex G-200 in 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,2

fraktioniert. Die Fraktionen, von denen der höchs'e

Dazu kommen weiterhin die für die Enzymbestim- Prozentsatz an Enzymaktivität durch Antikörper

mungen notwendigen Reagenzien sowie die Hilfsmittel 40 gegen HCG gebunden war, wurden in dem Testsystem

zur Durchführung des Testes, wie Teströhrchen, Pi- verwendet.

petten und Gefäße mit Verdünnungsflüssigkeit. Bei ,,. _TT „ ... .. „„_

der Bestimmung eines spezifischen Bindeproteins wird ^b> Herstellung von Antikörpern gegen HCG

das spezifische Bindeprotein als Reagenz nicht benötigt. Antikörper gegen HCG wurden, wie beschrieben

Zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antigens 45 von S c h u u r s et al. in Acta Endocr. (Kbh.), 59,

oder Haptens werden benötigt: 120 (1968), in Kaninchen induziert.

a) eine bekannte Menge eines Conjugates aus dem _c) Herstellung von Antikörpern gegen Antigen bzw. Hapten und einem Enzym, Kaninchen-y-Globulin

b) eine entsprechende Menge an korrespondierenden . , _, , .. , , _T, Antikörpern or _5o Kaninchen-y-Globulin wurde aus normalem Ka-

c) eine bekannte Menge an unlöslich gemachten ninchenserum isoliert durch Ausfällen mit 18 GeAntikörpern gegen die verwendeten Antikörper. wcht^/Volumprozent festem Natriumsulfa Anti-

korper gegen dieses Globulin wurden hergestellt durch Zum Nachweis und zur Bestimmung von Anti- Immunisieren eines Schafes gemäß dem folgenden

körpern werden die α lter d) erwähnten Antikörper 55 Plan:

nicht benötigt.
Zur Bestimmung von gonadotropischen Hormonen

und insbesondere zur Bestimmung von HCG (Human Tag Menge Freunds- Injektionsweise

Chorionic Gonadotropin) zur Schwangerschaftsdia- Adjuvans

gnose schon in einem sehr frühen Stadium verwendet 60 ——

man z. B.: „_ . ^ , ,_

0 0,5 mg + intramuskulär

a) ein Conjugat von HCG mit einem Enzym, z. B. \* °>^{5 m}8 + intramuskulär

HCG-Peroxida, 28 1 mg + intramuskulär

b)Anti-HCG, 65« 1-g - intravenös

c) unlöslich gemachte Antikörper gegen Anti-HCG, ⁵⁶ ^l ^mg ~ intravenös

d) gegebenenfalls andere Ingredientien, wie einen

Puffer. Am Tag 70 wurde dem Schaf Blut entnommen.

O MJ*

υυ

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d) Herstellung des Immunoadsorbens [Schaf-anti-(Kanin-Gammaglobulin)]-Cel!ulose

Die Gammaglobulinfraktion des unter 1 c) beschriebenen Schafserums wurde hergestellt durch Ausfällen mit 16 GewichtS'/Volumprozent festem Natriumsulfat. Nach dem Waschen wurde der Niederschlag in so viel 0,05 M Boratpuffer vom pH 8,6 aufgenommen, daß die resultierende Proteinkonzentration auf 10 mg/ml anstieg.

350 mg m-Aminobenzyloxymethvlcellulose wurden suspendiert in 50 ml destilliertem Wasser und diazotiert durch Zugabe von 10 ml 36 %iger Salzsäure und tropfenweise Zugabe von 10 ml 10%iger NaNO₂-Lösung bei O⁰C. Die Suspension wurde zentrifugiert und gewaschen und der Niederschlag in 43 ml 0,05 M Natriumborat vom pH 8,6 resuspendiert. Dann wurden 7 ml der wie oben hergestellten Gammaglobulin-Das Gemisch wurde 26 Stunden

b) Herstellung von Antikörpern gegen Insulin

Zehn Guinea-Schweinen wurde wöchentlich eine intramuskuläre Injektion mit 1 mg Schweineinsulin in

vollständigem Freunds-Adjuvans über eine Periode von 4 bis 8 Wochen verabreicht. Nach 2 Wochen Ruhe wurde den Tieren zusätzlich 1 mg Insulin durch intravenöse Injektion ohne Adjuvans verabreicht. 2 Wochen später wurde den Tieren Blut entnommen. Zeitweise

auftretende Hypoglycaemie wurde durch intraperitoneale Verabreichung von Glucose bekämpft.

c) Herstellung von Antikörpern gegen Guinea-Schweine-Gammaglobulin

Durch Zugabe von 1 Volumen gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu 2 Volumen Guinea-Schweineserum wurde Guinea-Schweine-Gammaglobulin hergestellt. Der gebildete Niederschlag wurde zweimal gewaschen mit 33 %iger gesättigter Ammoniumsulfat-

lösung zugegeben.

bei 4°C gerührt, dann zentrifugiert und mit 0,02 M 10 lösung und dann in physiologischer Kochsalzlösung Phosphatpuffer vom pH 6,0 gewaschen. aufgenommen. Dann wurde ein Schaf mit Hilfe von

ansteigenden Dosen des hergestellten Gammaglobulins

e) Bestimmung von HCG (₀₅₍ _λ _und ₂ _mg) immunisiert. Die Injektionen wurden

Es wurde eine Verdünnungsserie (32-16-8-4-2-1-0,5- im Abstand von 2 Wochen verabreicht, wobei das 0 IU/ml) von HCG in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,0, 25 Immunogen vermischt war mit vollständigem Freundshergestellt, die 2 Volumprozent normales Schafserum Adjuvans. 2 Wochen nach der letzten Injektion wur-

enthiel .

Von-jeder der HCG enthaltenden Proben wurden 0,5 ml inkubiert mit 0,1 ml Kanin-(anti-HCG)-Serum und 0,1 ml HCG-HRP-Conjugat, beide in entsprechender Verdünnung. Nach halbstündiger Inkubation wurden 0,3 ml des gemäß d) hergestellten Immunadsorbens (10 mg/ml) zugefügt und die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde in Rotation den zusätzlich noch 2 mg Gammaglobulin in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht, und 1 Woche später wurde dem Tier Blut entnommen.

d) Herstellung von unlöslichen Antikörpern gegen Guinea-Schweine-Gammaglobulin

10 g mikrokristalline Cellulose wurde aktiviert

_ _o ^ durch Zugabe von 400 ml 2,5 Gewichts-/Volumprozent

gehalten" Nach Zentrifugieren wurde in der über- 35 CNBr-Lösung unter Rühren, worauf der pH-Wert stehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität gemessen mit 1 n-NaOH-Lösung auf 10,5 gebracht und dabei - · · "' ' ' *-'■··—:-·-:- — ^:- 2 Minuten gehalten wurde. Dann wurde die Cellulose

mit Eiswasser und mit 0,1 M NaHCO₃ gewaschen.

, ₃ g

Zu 10 ml Schaf-AntHGuinea-Schweine-Gammaglobuli h

durch Vermischen von 0,5 ml der Flüssigkeit mit 1,5 ml Substrat (10 μΐ 30%iges H₂O₂ und 20 mg

5-Aminosalicylsäure in 150 ml 0,02 M Phosphat- Hg

puffer, pH 6,0); nach 30 Minuten bei 25°C wurde 40 lin)-Serum wurden 1,6 g Na₂SO₄ zugegeben. Nach die Extinktion bei 460 nm gemessen. einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der

Auf diese Weise war es möglich, in der Probe eine Nidhl bif i j 20 l

HCG-Konzentration von 0,5 bis 1 IU/ml festzustellen.

h Uib

HCGKo

Mit dieser Methode konnten auch Urinproben ge-

l Sh

g aumtemper

Niederschlag abzentrifugiert, zweimal mit je 20 ml 16 Gewichts-/VolumprozentNa₂SO₄-Lösunggewaschen

Mit dieser Metho p g und dann in 10 ml 0,1 M NaHCO₃ aufgenommen. Die

testet werden; der Test eignet sich also zum Schwan- 45 aktivierte Cellulose wurde vermischt mit 40 ml 0,1 M gerschaftsnachweis. Die Übereinstimmung mit einer NaHCO₃-Lösung und den 10 ml Gammaglobulinbekannten Testmethode, einem Haemagglutinations- lösung. Diese Suspension wurde 40 Stunden bei 4° C Inhibitionstest, war gut. Es erwies sich als möglich, in Rotation gehalten und daraufhin zweimal mit je durch Anwendung einer Vorinkubation die Empfind- 500 ml 0,5 M NaHCO₃, zweimal mit je 500 ml 0,05 M lichkeit des Systems zu steigern. Hierbei wurde zuerst 50 Citrat vom pH 1,1 und zweimal mit je 500 ml 0,05 M die Probe nur mit dem Antiserum inkubiert und Phosphat vom pH 6,2 gewaschen,
daraufhin das HCG-HRP-Conjugat zugefügt. _{e) Bestimmung yon Antikörpem gegen Insulin}

Beispiel 2

Bestimmung von Insulin und Antiinsulin a) Herstellung von Insulin-(glucoseoxidase)

5 mg Schweineinsulin und 25 mg Glucoseoxidase wurden gelöst in 2 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,5. Zu der Lösung wurden 5 μΐ 25 %ige Glutarsäurealdehydlösung zugegeben, worauf das Gemisch 90 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und dann über Sephadex G-200 in 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,5 fraktioniert wurde. Die Fraktionen, von welchen der höchste Prozentsatz an Enzymaktivität durch Antikörper gegen Insulin gebunden werden konnte, wurden in dem Testsystem verwendet.

0,1 ml Insulin-(glucoseoxidase) in geeigneter Verdünnung wurde 4 Stunden inkubiert mit 0,4 ml einer Verdünnungsserie eines Guinea-Schweine-Antiinsulinserums. Die Verdünnungsserie war hergestellt worden mit 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,0. Dann wurden 0,3 ml Immunoadsorbens (15 mg/ml) und 0,2 ml Puffer zugefügt und das Gemisch über Nacht bei 4° C in Rotation gehalten. Nach Zentrifugieren wurde die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, indem man 0,5 ml davon 30 Minuten mil 2,5 ml Substrat inkubierte und dann die Extinktiot bei 460 nm maß. Das Substrat enthielt 50 mg Glucose, 10 μg Peroxidase und 1 mg 5-Aminosalicylsäure je 2,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,0.

Mittels dieses Systems konnte der Anfikörpergehali

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der verschiedenen Sera verglichen werden. Als Bezugs- _Freunds_ _{Injektionsweise}

ptnkt. wurde diejenige Serumverdunnung gewählt, bei Adjuvans

welcher 50% der gesamten kombinierbaren Enzymaktivität gebunden ist. _{5 0 200(ig +} intramuskulär

14 400 ag + intramuskulär

f) Bestimmung von Insulin _{28 800} ^ ₊ intramuskulär

Je 0,2 ml aus einer Verdünnungsserie von Insulin ^{42 800}W? ~ intravenös wurden 2 Stunden mit 0,4 mi Antiinsulinserum inkubiert, wobei das Serum so weit verdünnt war, daß es io Die Blutentnahme erfolgte 2 Wochen nach der 60% des zuzugebenden Enzymconjugates binden letzten Injektion, konnte. Dann wurde 0,1 ml lnsulin-(glucoseoxidase)

in entsprechender Verdünnung zugegeben und 4 Stun- _e) Herstellung des Immunoadsorbens

den inkubiert. Zum Schluß wurden noch 0,3 ml [Kanin-anti-(Schaf-Gammaglobulin)]-CeIlulose

Immunoadsorbens (15 mg/ml) zugefügt. Das Gemisch 15

wurde über Nacht bei 4°C in Rotation gehalten. Die Gammaglobulinfraktion des unter d) beschrie-

Nach Zentrifugieren wurde in der überstehenden benen Antiserums wurde hergestellt durch Ausfällen

Flüssigkeit die Enzymaktivität auf die unter e) be- mit 18 Gewichts-/Volumprozent Na₂SO₄. Das erhal-

schnebene Weise gemessen. tene Produkt wurde gemäß der Gurvich-Methode

Die Empfindlichkeit der Bestimmung, die von dem »o (beschrieben im Beispiel 1) mit Cellulose gekuppelt, verwendeten Antiserum abhängt, liegt im Nano-

gramm-Bereich von 20 bis 100 ng/ml, d. h. 0,5 bis f) Bestimmung von östradiol 2,5 mU/ml.

Die Immunreaktion wurde durchgeführt in 0,02 M

B e i s ρ 1 e 1 3 25 Phosphatpuffer, pH 6,0, der 2% BSA enthielt:

Bestimmung von östradiol Eine Probe von 0,5 ml wurde vermischt mit 0,1 ml

„ . . _un_ des Schafantiöstradiol-Serums in der gewünschten

a) Herstellung von östradiol-17-succinyl-HPR Verdünnung. Nach einer Inkubation von 30 Minuten 50 mg östradiol-17-hemisuccinat und 0,08 ml Tri- bei Raumtemperatur wurde 0,1 ml östradiol-17-succi-

n-butylamin wurden gelöst in 2,5 ml Dioxan. Zu der 30 nyl-HRP in geeigneter Verdünnung zugegeben, worauf kalten (2° C) Lösung wurden 15 μΐ Isobutylchlor- eine weitere Inkubation von 30 Minuten bei Raumcarbonat zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die temperatur folgte. Dann wurden 0,3 ml Immuno-Lösung vermischt mit 100 mg Meerrettichperoxidase adsorbenssuspension (30 mg/ml) zugefügt und das (HRP) in 7,5 ml eines Gemisches aus Dioxan und Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur in Rotation Wasser (2: 3), das mit Natronlauge auf ein pH von 35 gehalten. Die flüssige und die feste Phase wurden dann 9,5 eingestellt worden war. Die Lösung wurde 4 Stun- durch Zentrifugieren getrennt. Die Enzymaktivität in den bei 2° C gerührt und dann 18 Stunden dialysiert. der überstehenden Flüssigkeit wurde gemäß Beispiel 1 Der Niederschlag, der sich abschied, nachdem der gemessen. Das Schafantiöstradiol-Serum konnte verpH-Wert des Dialysats auf 4,6 gebracht worden war, wendet werden in Verdünnungen von 1:1600 bis wurde abzentrifugiert, gewaschen und in 5 ml destil- 4° 1:12 800 je nach der Qualität des verwendeten östraliertem Wasser, das auf ein pH von 8 eingestellt diol-17-succinyl-HRP. Bei einer Verdünnung des worden war, aufgenommen. Zur weiteren Reinigung Antiserums von 1:12800 konnte in der Probe eine wurde zweimal mit 10 ml Aceton umgefällt. Das ge- östradiolkonzentration von 10 mg/ml nachgewiesen reinigte Produkt wurde in 10 ml 0,05 M Phosphat- werden, östriol und Östron zeigten in diesem System puffer vom pH 7,8 aufgenommen. 45 eine kreuzweise Reaktion.

b) Herstellung von östradiol-17-succinyl-BSA " B e i s ρ i e 1 4

Das Präparat wurde hergestellt mit Hilfe der im Bestimmung von Cortisol-und Corticoid-

Beispiel3a) beschriebenen Misch-Anhydrid-Methode, 50 Bindeglobulin

ausgehend von 100 mg Östradiol-17-hemisuccinat und _a) Herstellung von Cortisol-21-(galactoseoxidase) 150 mg Rinderserumalbumin (BSA).

„ 50 mg CortisoWl-hemisuccinat und 100 mg Galac-

c) Herstellung von Antikörpern gegen Östradiol toseoxidase wurden mit Hilfe der Mischanhydrid-

Einem Schaf wurden in Abständen von 4 Wochen 55 technik (s. Beispiel 3 a) gekuppelt,

je 4 mg Östradiol-17-succinyl-BSA in vollständigem b) Corticoid-Bindeglobulin (CBG) wurde aus mensch-

Freunds-Adjuvans injiziert. In regelmäßigen Inter- lichem Serum mit Hilfe von aufeinanderfolgendei

vallen wurde dem Schaf Blut entnommen. Das Serum Chromatographie über DEAE-Cellulose und Hydroxyl·

war absorbiert von BSA, das vorher unlöslich gemacht apatit isoliert.

worden war. ^6o Antikörper gegen dieses Globulin wurden hergestellt

indem Kaninchen in Intervallen von 14 Tagen mi

d) Herstellung von Antikörpern gegen _5(χ) _μζ _{CBG in vol}'_ständigem Freunds-Adjuvans inji

Schaf-Gammaglobulin _nat _wurden. _Nach 3 Monaten wurde den Tierei

Gammaglobulin vom Schaf wurde gemäß Beispiel 1, 1 mg CBG injiziert, und 2 Wochen später wurdi jedoch in diesem Fall mit 16 Gewichts-/Volumprozent 65 ihnen Blut entnommen.

Natriumsulfat, hergestellt. Mit dem so gewonnenen c) Die Gammaglobulinfraktion von Anti-CBG-Seruc

Schafglobulin wurden Kaninchen nach folgendem wurde gemäß Beispiel 3 mit m-Aminobenzyloxymethy]

Plan immunisiert: cellulose gekuppelt.

9 MJl

d) Bestimmung von Cortisol

0,5 ml einer Cortisol enthaltenden Probe (Standardlösung) wurde extrahiert mit 2 χ 3 ml Methylenchlorid. Die vereinigten Extrakte wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,2 aufgenommen, mit 0,1 ml einer Lösung von CBG im gleichen Puffer in der entsprechenden Konzentration vermischt und 30 Minuten bei 4° C inkubiert. Dann wurden 0,1 ml Cortisol-21-(galactoseoxidase), ebenfalls in geeigneter Verdünnung, und 0,3 ml des unter c) hergestellten Immunoadsorbens mit einer Konzentration von 5 mg/m! zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 4° C in Rotation gehalten und dann zentrifugiert, worauf in der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität gemessen wurde.

Zu diesem Zweck wurden zu 1,5 ml Substrat, bestehend aus 100 mg D-Galactose, 20 mg 5-Aminosalicylsäure und 10 μg Peroxidase in 150 ml 0,02 M Phosphatpuffer vom pH 6,0, 0,5 Liter der Flüssigkeit zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Extinktion bei 460 nm gemessen. Bei Anwendung einer CBG-Konzentration von O^g/ml und so viel Cortisol-21-(galactoseoxidase), daß ohne Zugabe von Steroiden 80% des Enzymconjugates an das Immunoadsorbens gebunden waren, erwies es sich als möglich, Mengen von 3 bis 30 ng Cortisol zu bestimmen.

e) Mit den oben beschriebenen Reagenzien war auch eine Bestimmung von CBG möglich.

Aus einer Verdünnungsserie von Transcortin, die von 0 bis 1280 ng/ml reichte, wurden je 0,5 ml 15 Minuten mit 0,5 ml Cortisol-21-(galactoseoxidase) in ge-

eigneter Verdünnung inkubiert. Dann wurden 0,3 ml Immunoadsorbens-Suspension (5 mg/ml) zugefügt und das Gemisch 15 Minuten in Rotation gehalten. In beiden Fällen wurde die Inkubation bei 4° C durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurde nun die Enzymaktivität wie oben unter d) gemessen. Es erwies sich, daß die Empfindlichkeit des Testsystems bei 50 ng/ml lag.

Beispiel 5

In einem Fläschchen wurden die folgenden Reagenzien nacheinander in getrennten Schichten lyophilisiert:

1. 0,3 ml der im Beispiel la beschriebenen Immunoadsorbens-Suspension (10 mg/ml),

2. 0,1 ml einer 1 %igen Mannitollösung,

3. 0,1 ml HCG-HRP, wie beschrieben im Beispiel la),

4. eine zweite Schicht von 0,1ml einer l%igen Mannitollösung,

5. 0,1 ml Kanin-(Anti-HCG)-serum wie beschrieben im Beispiel Ib).

Zu diesem lyophilisierten Gemisch wurden 0,5 ml einer Urinprobe und daraufhin 0,5 ml destilliertes Wasser zugegeben. Nach 10 Minuten wurde in der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität mit

Hilfe eines mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid und

o-Tolidin imprägnierten Papierstreifens gemessen.

Stammte die Urinprobe von einer schwangeren Frau (>2 IU HCG/ml), so trat innerhalb 5 Minuten eine Blaufärbung auf, während im Urin von nicht schwangeren Frauen innerhalb der gleichen Zeit keine Färbung zu beobachten war.

2

Claims

Ά - 1 ^:: A . ² ■■■

beschreiben, bei welchen die obige Methode angewen-■:V-;. Patentansprüche: det wird:

!,Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung a) Systeme, die als spezifische Bindeproteine Anti-

einer Komponente der Reaktion zwischen einem 5 körper und als bindefähige Substanzen die ent-

spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden sprechenden Antigene enthalten; substanzen, die

bindefähigen Substam unter Ausnutzung der mit diesem System bestimmt werden können, sind

gegenseitigen Bindeaffinität der beiden Kompo- unter anderem Proteinhormone und ihre Anti-

nenten, dadurch gekennzeichnet, daß körper sowie Virusantigen und deren Antikörper,

man bei der Bestimmung Gebrauch macht von io b) Systeme, die als spezifische Bindeproteine Anti-

einer bekannten Menge eines Kopplungsproduktes körper und als bindefähige Substanzen Haptene

aus bindefähiger Substanz und einem Enzym und (Halbantigene) enthalten; die Haptene sind dabei

von in unlösliche Form gebrachten Antikörpern definiert als proteinfreie Substanzen, die mit Anti-

gegen das spezifische Bindeprotein und daß man körpern reagieren können, ohne daß s,e fähig

nach Abschluß der Reaktion in der flüssigen oder 15 sind, diese zu beeinflussen. Substanzen, die in

festen Phase des Reaktionsgemisches die Enzym- einem derartigen System bestimmt werden kön-

aktivität bestimmt, die ein Maß gibt für die Menge nen, sind unter anderem Steroidhormone und